Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ Х- И У-ВИРУСОВ КАРТОФЕЛЯ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ Х- И У-ВИРУСОВ КАРТОФЕЛЯ"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

НАЦВЛИШВИЛИ Нателла Михайловна

УДК 576.858 : 632.937 : 635.24

ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ Х- И У-ВИРУСОВ КАРТОФЕЛЯ

06.01.11 —защита растений от вредителей и болезней

Автореферат "диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1988

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель — член-корр. АН СССР; академик ВАСХНИЛ, доктор биологических наук, профессор И. Г. Атабеков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник С. К. Завриев, кандидат биологических наук, доцент В. А. Шмыгля.

Ведущая организация—-Научно-производственное объединение по картофелеводству Госагропрома РСФСР.

Защита состоится « в .'¿У. часов на заседании специализированного совета К 120.35.03 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « . » . \ 19^ Г-

Ученый секретарь

специализированного совета — кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

Н. К. Торянская

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■ Актуальность" темы. Практически все сельскохозяйственные культуры поражаются вирусами. Ежегодный ущерб, наносимый вирусными болезнями уронаю картофеля составляет не менее 25%. Кроме того, степень зараженности вирусами является одним из основных факторов, определяющих долговечность сортов картофеля. В связи с этим борьба с вирусными болезнями картофеля приобрела в настоящее время важнейшее значение. Эффективность всех зацитных мер обусловлена, возможностью достоверной диагностики и идентификации - .. вирусных болезней растений, позволяющей своевременно проводить агротехнические и фитосанитарные мероприятия.-Важное значение. .■ приобретает диагностика:вирусов в производстве безвирусного семенного материала^ в селекции картофеля при испытании новых сортов и гибридов на вирусоустойчивость, а также:в-работе карантинной сдужбы. Таким образом, диагностика является одной из актуарных задач в общей.системе:мероприятий по защите растений от вирусов. Методы диагностики, применяемые в фитовирусологии должны V обладать специфичностью и высокой чувствительностью, позволяющей определять вирусы, находящиеся в.тканях растений в низкой концентрации. Кроме: того^ эти методы должны быть высокопроизводительны ' и подлежать автоматизации, поскольку часто возникает необходимость проведения массовых анализов.

;. : м Традиционными методами выявления вирусных инфекций растений являются тест на индикаторных растениях,капельный метод диагностики и иммунодиффузионные тестыЛесмотря на высокую чувствитель- *

• ,;>.■ •>■ В руководстве данной работой.принимала участие к.б.н., ст.н.о. кафедры вирусологии ЬТУ А.Ф.Бобкоза. : .

ность индикаторный тест обладает весьма низкой производительностью. В отличие от него два других теста не требуют больших затрат времени, однако имеют низкую чувствительность,,что не позволяет использовать их для достоверной ранней диагностики.

Одним из наиболее эффективных методов диагностики вирусных заболеваний является иммуноферментный анализ (1®А), используемый в настоящее время в медовой;практике. ; ,.у7"-; •

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в разработке, оптимизации и сравнительной оценке различных вариантов иммуноферментного анализа Х- и У-вирусов картофеля (ХБЕС и УШ) и подготовке на этой основе рекомендаций по практическому использованию ИФА в качестве метода массовой диагностики в системе оздоровления и первичного семеноводства картофеля.

В задачи исследований входило: '

1. Определить оптимальные условия тестирования ХВК и УВК . наиболее распространенными в вирусологии растений прямым,. непрямым и Исэндвич"-вариантами ИФА; провести сравнительные испытания этих вариантов и выбрать наиболее удобный для практики..

2. Изучить возможность использования коммерческих антисывороток для диагностики вирусных болезней картофеля . методом ИФА. ..-. :. ■ - .-у;:;

8. С целью дальнейшего.усовершенствования практической диагностики вирусных болезней, картофеля:

-разработать непрямой "сэндвич"-метод ИФА о использованием ГСав'^-Зрагментов иммуноглобулинов для тестирования ХВК и увк; ' ' у;-;' ■„;■■.. .У-.--. "V

. - разработать метод немеченых, антител с использованием комплекса "пероксидаза - антипероксидаза" для тестирования ХВК.

4. Изучить возможность индикации ХВК методом ИФА с исполь-

зовенкем коноклонаяьншс антител.

л" Нпучнпя новизна. Впервые в нсгей стране были:отработаны и оптимизированы различные варианты И1А для .тестирования Х- и У-вирусов картофеля. С делью1 применения в практической диагностике . - было" проведено сравнение этих мод5фжашй и рекомендовано использовать "сэндвич "-вариант в качестве метода1 массовой диагностики.

•■ • При изучении возможности применения'коммерческих онтисыво-роток для диагностики вирусных болезней.картофеля методом 1К>А по: казана необходимость использования высокоочкленних в::русншс пре- . паратов для приготовления диагностических антисывороток; рекомендована новая технология-выделения и очистки препаратов ХЕК и УБК . > у.: В целях.-далыкйгего-совершенствования методов,массовой диагностика разработан непрямой "сэщшич-вариан* 1ВА о использованием

> 4 I < ч- . *

Р(ев* )2-<5рагментов иммуноглобулинов для определения ХВК и УБК, ■ 5'. Важными преимуществами этого метода являются .возможность использования универсального конъигата для диагностики различных виру->сов картоне ля и чрезвычайно низкая "фоновая -реакция"; •

- • ? Впервые-для'тестирования ХВК разработан метод немечешшх . ;антител,, основанный на использовании комплекса "дерокстааза-вяти-нПераксЕдаза"., заменяющего специфический иммуноперонсгдазный , ; конъогатг■последнее значительно упрощает.технология производстве • диагностических ^едстз; , * --

Показана принципиальная возможность использования монокдо-, , снальных антител'для':тестирования различных изолятов ХЕК с помокьо * - , \ - -.. Прпктичрская знячтаость-работы. Полученные,результаты поз-.■вояиля рекомендовать *"сэндвич"-варианг -ИСА"в качество метода мао-совой диагноотЕкп ХВК-ц УЕК в системе, оздоровления я первичного ,-.семеноводства'картофеля.' На основе 'проведенных, разработок в науч-

но-произв одотв енн ом объединении по картофелеводству впервые в . СССР организован выпуск дЕагносготескпх когалекгов для тестирования вирусов картофеля методом 'КЬА. Использозанкз И1А позвояяве проводить иядаяаци» вкусов не только в листьях, но ив клубнях картофеля, что значительно сокращает затраты на вкрааиваяие растений для индексации посевного материала. : .

Рекомендована новач технология получения очщенных препаратов ХЕК ц УЕК, предназначенных для приготовления диагностических . 'высокосвешфэтишс' антисывороток, используемых в ПСА. После перехода на згу технолог™ качество коммерческих антисквороток значительно повысилось. ^

Непрямой "сэндв::ч"-варкант ИГА и метод немеченных антител могут в перспективе найти применение в практической диагностике вирусов картофеля.

Материалы исследований использованы при составлении "Мето-. дических рекомендаций по применению иммуно*ерментного анализа для диагностики вкусов картофеля", изданных ВАСХШЯ в 1985 г.

Апробация роДотч. Основные положения диооертащп!. были доложены на Всесоюзном сове-дении "Теория и 1фактика иу.\згнитета сельскохозяйственных культур к вирусным болезням (Вильнюс, 1934), на 8-ом Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ЩР (Рига, 1935), на 5-ом Воесоюзном-симпозиуме по инженерной энзимоло-: гии (Кобулети,1985), на заседалга кафедры вирусологии Биологического факультета МУ ем.МЛ.Ломоносова 07.12.8?, и на объединенном (заседании кафедры сельскохозяйственной фитопатологии Московской . сельскохозяйственной академии им.К.А.Тимирязева 13.05.83.

Публикация результатов исследований. По теме диссертация опубликовано 9 работ.

. Структура и объем диссертанту. Диссертация.изложена на \

- 5 - '

стран щах казкнописного текста (без: списка литера туры) и состоит из введения,- обзора литературы,; описания материалов п мето-, дов, результатов экспериментов,- обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций,■списка.литературы и прилохенш, содержащего акты об использовании результатов. Список .цитируемой литературы включает 132 наименования, в том числе 165 на иностранных языках.'Текст-иллюстрирован 2 таблицами и 35 рисунками.

ССДЕРКАШЕ РАБОТЫ

Введение

Во введении приведена краткая характеристика соотояния ; проблемы ранней диагностики вирусных болезней картофеля, показана актуальность исследований, определена цели и задачи работы. .

Обзор литературы .■■•-■'...'.-■ Обсуздается роль диагностики » общей системе.мер борьбы о вирусами картофеля. Основное внимание при этом уделяется необхо? -димооти применения надежных и аффективных диагностических средств в системе оздоровления и.первичного семеноводства картофеля. Рас- -сматртзаются методы серологического анализа вирусов: реакции пре-ципитации^ агглютинации,иммунная электронная микроскопия, тесты, -основанные на использовании меченых антител. Приведена краткая- , ■:. характеристика. новых нешл^нологическпх - способов диагностики. > : Представлена ¡подробная информация: о методе -гиммуноферментного анализа и его практическом прш/.енении-для:тестировшия вирусов растений : изложен ■ пршцип,■ метода,: приведены- сведения об основных модификациях' ïiiA и рассмотрены данные о.факторах, влияющих на эффек- . тивность анализа фитопатогешшх вирусов; ■ ,

,'.'дгрр1»алч и уетоды ' _ - ' *

■ . • • -Для получешш високоочщешшх-препаратов ХВК и УВК использовали следующие- приемы: осветление экстрактов тритоном Х-ХОО, -

концентрирование вирусного материала в, присутствии полиэтиленгли- ; коля 6000, дифференциалыIое центрифугирование и ценгркфупфование через слой сахарозы; иногда применялось улътрацентри£угирование в градиенте плотности хлорвда цезия (Новиков и др.-,1982). Чистоту; полученных препаратов определяли спектрофотометрически и с по-. мощью электронной микроскопии. Диагностические антисыворотки получали при иммунизации кроликов. Срюодю пкмуноглобулкюв из ен-: тисыворотки выделяли с использованием полкэтиленгликоля 6000 и .. хроматогра$ячески с применением целлюлозы ДЕ-52. Конъюгат:иммуноглобулинов с перокспдазой хрена под/чали методом периодатного . , окисления ( Р/акалй , Ка^ао/ , 19УУ) •; • . / : •

В работе использовались следующие варианты И5А:

1. Прямой .метод. На порвой.стадии лунки полистирольных .микроплат покрывают исслеяуемым антигеном; избыток"антигена.уда-■ ' ляют и добавляют, иммунопероксидазный коншгат. После инкубация ;. лунки отмывают и добавляет субстратную смесь, содержащую перекись водорода и б-амхыосалицидсвую кислоту. Оптическую плотность про-, дукта ферментативной реакции измеряют на:вертикальном абсорбцио- ; метре ка-500 {®//га/ес£, Швейцария) при длине волны 450нм. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству антигена.

2. Непрямой метод. Первую стадмэ (сорбцио-вкруса на поверх-; •ности лунок полистирольных' плат) проводят так же, как ив прямом методе. Затем добавляя! специфическую ентисыворотку (кммуногяо- , йуяины). После отмывки образовавшийся комплекс 'антиген-антитело ■выявляется ентивидовым иммуноперокспдазным коныогатом - меченными : 'иероксвдазой ослиными антителами, полученными протиа 'им.ууноглобу->шнов кролика. Затем в лунки вносят, субстратную смесь и регистрируют результаты ферментативной реакщш как описано визе;:" ' ?.

3. -"Сэндвич могод* Луикц микропиа? покршзбюх спсдифлческго.иг

иммуноглобулинами. Затем,4удаляв несвязозшиеся антитела, вносят тестируемый штиген.-После .образования иммунного комплекса добав- . ляюг специфический иммунопероксиаазный кшъагаг. На следящей стадии в лунки вносят .субстрат п регистрируют ферментативную реакцию.

4. Непрямой "сэндвич''-ворпаит. На первой • стадии в лунки микроплат вносят ав' ^-фрагменты иммуноглобулинов;: подученные в условиях протеолиза специфических иммуноглобулинов пепсином •. . свиньи ( Ваг£ага, СвагЬ,/$¿>2) затем лунки отмлзают и добавляют тестируемый материал; содержащий вирус; После.удаления не- .■■;■. прореагировавших компонентов в лунки вносят.интактные специфические им^уноглобужаш, которые впоследсгаил:вцявлявт о использовр-:нием универсального конютата протеина А золотистого стафилококка о пероксадазой- (протеин А взаимодействует только с Рс-учасзком • интактных антител* не реагируя с ав• ^-фрагментами, ■пспользуе-••ыыми для сенсибилизации микроплат). Затем добавляют субстрат и измеряют; оптическую, плотность продукта ферментативной; реакции.:■ . V к . •.' 5. Метод немеченннх антител. На" микроплате; сорбируют анти-. . тела кролика;;подученные к анализируемому антигену. Затем добавляют. тестируемый -образец-(антиген)..После удаления; непрореапфо---, вавших компонентов,в лунки вносят .мышиные антитела, специфичные •..■. • в отношении. антигена ¿' Затем добавляют кроличьи антимышаше ■ июу- • •ноглобулины, причем;они вносятся в избытке о тем, чтобы один/из -двух активных центров молекулы оставался свободным и способным к

■ реакции с мышиными. антителами к: пероксидазе, которые добавляют

■ на следующем;этапе..Наконец в лунки вносят/перонсидазу и.субстрат

* ' 4 С * V1*1

для определения "ее-активности.-Для" ускорения анализа пероксидазу. »и антитела:к-ней.можно вносить не.на резных стадиях; 'а одновре-- \ •менно-в-виде•иммунного комплекса, полученного предварительно. . -

Коноклснальные антитела к ХВХ," кспользссвшпше в настоящей

работе, были получены в секторе молекулярной.генетики Иютитута химической:! биологической физики АН ЗССР (заведующий сектором -д.б.н. МЛ).Сасрма).

В работе для .тестирования использовали лис тоз ой. материал и клубни картофеля сортов: Домодедовский, Лорх, Раменский, Сотка, Дружный и Заречный! ■

Результаты экспериментов и их обсуждение • • I. Тестирование ХЕК и УБК прямым. нещщмым ц "сэндвич"-вариантами ПСА. Сравнение этих иарппнтов. Наиболее широкое распространение в вирусологии растений по лучили прямой, непрямой и: N исэндвЕч"-варкаити 1У.А. Для подготовки рекомендаций по-использо-; вадию'Н£А в качестве метода массовой диагностики ХБ1{ : и УВК в системе оздоровления и первичного;семеноводства картофеля били про-' ведены, отработка, оптимизация. и сравнительные -испытания.- указанных вариантов анализа. ■■'■;":•''-

Определены-оптимальные концентрации иммуноглобулинов . (2-5 мкг/мл) и иммунопероксцаазных конюгатсв (2-5 мкг/мл) для тестирования ХВК и УВК разными модификациями И4А; установлена продолжительность всех стадий,анализа, обеспечивающая получение . достоверных результатов. , . .•■• '•.-.- • '•: .

Одним из достоинств И£А является возможность как автоматизированного (фотометрического), так и визуального учета результатов тестирования вирусов. В связи о этим ниже приводятся данные' по сравнению различных вариантов Ш'А для обоих способов оценки результатов. ..-'.-" '' •

На рио.Х представлены результаты сравнения чувствительно- ' оти трех;методов И£А при определении УВК в очиаенных "препаратах, порченные фотометрически. Прямой вариант И5А позволяет выявить УВК при концентрациях не ниже 100 нг/мл (рис.1," тсбл;1). Низкая

Таблица I

Минимальная' концентрация УЕК, выявляемая различными методами иммунодиагностики -Л

Метод . Концентр,сция УМ, нг/мл

■ Вариант 1!5А фотометрическая оценка ' .прямой ' • 100

непрямой, г-':'«' 2

"сэндвич" .v. 4 10

визуальная • оценка прямой ' 250

непрямой -- 5-Ю

"сэндзпч'\ - 2Ь

Капельный метод диагностики > 1 1000

АЕВ-тест (Чирков,1983) 100-400

•чувствительность существенно ограничивает; возможности применения :: этого метода для диагностики УВК. Высокая; чувствительность опре- • -деления УВК достигается при постановке непрямого варианта ИГА, Этот метод.позволяет определить;УБК в очшденных:препаратах при • ¡ концентрации 2 нг/мл(рисЛ;, табл.1). -Чувствительность метода при .визуальной оценке.составляет в этом случае'5-Ю йг/мл (таблД),

* » " -Г-

Ваяно также, что непрямой метод позволяет использовать универсал*-•ний иммуноперокоядазный кояьпгат для диагностики различных виру-. ;сов картофеля,- что значительно.облегчает, проблем производства ■■■>■ -•.'реагентов для В, то же время .следует отметить, что результаты ;непрямого ■ методаI- так же как' и прямого варианта 1ИА, вклпчтпзтх . сорбцию вирусов иа. полистироле трудно-поддаются количественной ■ оцегае; - особенно при •'анализе рг.стптельшос . экстрактов, , так. кск за; висят от степени заполнения поверхности полистрола .частицами • -"

1 г к

.вируса и сорбциотшх.-свойств других .'компонентов пробы .Кроме того,

Ц.--и—-»- 1 —

10 * 10 • 1С" 10 • • I ; . ' I концентрация вируса (иг/мл)

Рис.1. Сравнение чувствительности прямого (I), непрямого (3)

и "сэндвичУТЬариаитов И2А' при определении УВК в очи-'

■ ценных препаратах. 4 - контроль к прямому и "сэндвичГ-

методу (ХВК); 5 - контроль к непрямому методу (ХВК)

•V . ли - .. А и

степень разведется экстракта

'Рио.2. Индикация ХВК в листьях и клубнях картофеля с помощью : "оендаич"-варианта ®А. Анализ экстрактов из листьев, зараженных ХВК,(1); здоровых (контрольных) лиотьев(2); , "глазков" (3); приростков (4) и мякоти (5) зараженных."

' ХВК клубней; здоровых (контрольных) клубней (6)

применение этих вариантов 1&А ллхптчфуется длительностью сорбции вируса, которая достигает I2-IS.часов,.Необходимо'также отметить высокий уровень, ". .- фоновой реакции" для .непрямого метода в случае очсденного вируса (рис.I), который есе более возрастает при анализе экстрактов из растений,

... Чувствительность "сэтавич"-метода.при.опредолешш УВЗС (Ю нг/мл),'хотя и несколько икжо чувствительности непрямого во-рионта И5А, все же значительно превышает возможности ряда других методов иммунодиагностики (табл.1) и вполне достаточна для тесп»-■ ровгаия вируса в разлэтних частях растеши (см.ниже). Одним из достоинств "сэндвич"-метода является такне-низкие значения оптической плотности (0;I o.e.) при фотометряровании контрольных проб с участием антигенно-неродственного вируса-(рис.1). Это обстоятельство создает.преимущества при необходимости визуальной оценки результатов анализа,, чувствительность которого в денном случае достаточно высока и достигает 25 нг/мл (табл.1). Более того, . "сэндвич "-вариант KSA позволяет проводить - объективную количест- ' венную оценку содержания вируса в соке растений п дает возможность использовать сенсибилизированные антителами мжроплаты.. последнее значительно сокращает время проведения анализов (до . 2,5-3 часов) и повышает их производительность. .-. - • . . • Принципиально сходные результаты были получены при сравнительной оценке чувствительности определения ХБК прямым, непрямым и "сэндвич"-вариантами 1ЯА. , '1 -<_

■ . .Таким образом; достаточно высокая чувствительность, низкая "фоновая реакция",.возможность применения сенсибилизированных микроплат и достоверность количественного .определения вирусов . : позволили предположить, что из всех описанных выге вариантов ¡ЯА • наиболее удобным для,практической.диагностики является "сэндяич"-метод. - - '

' ■'.'■- 12'-; .'уу' "." ■'■'■ у '

2. Применение "сэндв1гч"-ваокангя HvA для диагностики ХВК .

и УВК в листовом материале и клубнях картофеля. На рис.2 и 3 представлены результаты анализа экстрактов in листьев.зараженных рас- . тений в'период бутонизации. ХВК и УВК хорошо вдентифицкруются в инфицированных листьях "сэндвич"-вариантом ¡НА, причем максимальное раэв'еяение экстрактов из листьев,позволяющее фотометрическую-регистрацию реакции,- достигает 1:5000 для ХВК'и 1:600 для УВК.

• Чувствительность "сэндвич"-варяанта .IftA достаточно высока и позволяет выявлять ХВК и УВК непосредственно в клубнях:больных растений, даже в случае первичной инфекции (рпс.2, 3); причем разница в результатах при сравнительном анализе экстрактов из зара- , . хенного и контрольного (здорового) материала настолько значительна (рис.2, 3), что позволяет надежно диагностировать зараженные клубни не только фотометрически, но й визуально. С другой стороны, капельный метод диагностики как и ряя других тестов не позволяет обнаружить присутствие вирусов в клубнях вследствие кх.крайне, низкой концентрации. Таким образом, 1ЙА имеет важное экономичес-' кое преимущество, позволяя проводить индикацию.вирусов в клубнях без затрат на выращивание растений для индексации посевного материала. . ., У - у:.. :;.'.:-.

Полученные данные позволили рекомендовать "сэндвич"-вариант ИЗА в"качестве метода массовой иммунодиагностики в системе оздоровлении и первичного семеноводства картофеля. В настоящее время & НПО по картофелеводству организовано производство диагностичес- , кйх комплектов для тестирования вирусов картофеля на основе Исэндвичи-вариакта И1А. '.' ,, у;: .'.:у

3. Характеристика отечественных коммерческих антисывороток К вирусам картофеля. Эффективность диагностикифктовкрусов серо-;, логическими методами, ив частности II5A, зависит от качества кс-'

¿0 40 lb ¿10 ' IG240" степень разведения экстракта

Рис.3. Кйдикация УШ в листьях и клубнях картофеля с помоаью "сэндвич"-варканта:ША. Анализ зкстрактоа из листьев зараженных УВК (I); здоровых (контрольных) листьев.(2); . .; "глазков" клубней зараяенных УВК в условиях первичной

(3) и вторичной (4) ¡¡нфекции; здоровых (контрольных) :;:: : клубней (5)

степень разведения экстракта

Рис.4. Шдикация ХЕК в листьях и клубнях картофеля с помощью непрямого "сэндвич"-варианта ISA. Анализ экстрактов ' из листьев, зараженных ХЕК (I), клубней больных рас-чтений (2) и здоровых (контрольных) растений (3)

пользусмзс антивирусных сывороток. При отсм; чем большей потен- .

- 'V - I < *:

циальной чувствительностью обладает метод,- тем более жесткие тре-> бовсния предъявляются к. антиснворотксм: ,

••• -.В данной работе били-изучены свойства .коммерческих анти-у; сывороток, выпускаемых рядом.научных ненаучно-производственных организаций нашей страны, с целью установления возможности,их-исполь 30ВИ1ЕЯ в ИйА. Для этого определяли как- сяещтфическкИ'титр актисы-воротки в ИСА, характеризующий концентрацию,антител к гомологично-' му вирусу, так и■ иеспсшфгаескиЯ' титр^: то есть "концентрация антител иной специфичности, главным образом антител к-антигенам рас- "" тения-хозяина (тсбл;2). • Антлсыворотки;. полученные к внсскоочищен-ным:препаратам вирусов картофеля и.использованные нами в качестве стандарта, иуеяи достаточно высокие специфические титры (табл,2);; неспецифическг.е. титры зтих сывороток были близки к нулю. С другой стороны, типичные коммерческие снтисыворотки, выпускавшиеся" до--.*; проведения данной работы.и предназначаемые для капельной диагностики вирусов картофеля,' имели весьма высокие :'неспецифические титры в реакциях 1!:А;'с экстрактами;из здоровых растений (табл.2).-Послед нее, по-видимому,- связано'с недостаточной, степенью очистки вярус-; ных препаратов, используемых' для • получения коммерческих. антисыво-' роток. Совершенно очевидно^..что. высокий уровень реакции со здоровым материалом в случае использовсния-ксмморческих.сывороток затрудняет достоверную оценку' зараженности растений при постановке ..л 1ВА. Таким образом, было установлено, , что коммерческие антисыво- : ротки, выпускавшиеся по устаревшей технологии и, содержащие .-антитела к клеточным компонентам растения-хозяина,,не могут-эффектив-: но использоваться при/диагностике.вирусов'картофеля методом ^КЕА.;;; , После перехода ряда, организаций (НПО по картофелеводству,-1^ Би

о лого-почв енн ый институт ДВНЦ-АН СССР) на* новую усовершенство-*--?

Таблица 2

Характеристика антисывороток к вирусом ' .картофеля :

Тип антисыворотки ,.: Вирус Специфический титр в Неспецифический титр в КСА2'

Стандартные антисы- X . ' 2*Ю5 с _3)

воротки ■ У ' м • ¿V 2-10 2 -Ю5 2-Ю5 -

х :: ' . 1-Ю5 ЫО4

Типовые коммерческие • У 1.5-Ю^ 2.10й. 1.10®

антисыворотки , . • м . ■ 2*ЮЬ

1,5.ЮЬ 1.8-104

Антисыворотки нового X : 1,2-Ю5 ' : 1,5*10;? 1,5*10 ' -

поколения • У ... м ... -

Примечания: ^ Специфический титр определялся непрямым методом

И4А при использовании в качестве антигена очвцен-., ; кого вируса; за титр принимали разведение антисы-•

;;„■ V .■ воротки, дающее сигнал, равный максимальной вели. .чине сигнала отрицательного контроля (фоновой ре-.акции); •.'"''■';"

,■■-....-.',.■ 2)

Неопецифический титр оценивали как и специфический

титр, используя в качестве антигена сок здорового

-." ■'/ '' растения картофеля; '•'

■ - ' 3)

• ' Знаком (-) отмечены титры, близкие к нулю.

ванную технологию выделения и очистки вирусов.картофеля качество антисывороток значительно возросло (неспецифический титр приблизился к нулю) (табл.2) и они успешно используются в настоящее-время в массовой ИФА-диагностике.

; , '4. Использование непрямого "спнквич "-методо ЮА для' тесэт^-роппнкя ХЬК и УБК. В:условиях производства диагностических к'омп-,';

• лектов для тестирования вирусов картофеля,на основе; "сэндвич"-ва-• рианта И-А возникает необходимость - приготовлена специфических* им-мунопероксияазных конаогатов.к кавдому вирусу. С-целью у совершенств овен кя процессов иммунодиагностики:и'приготовления диагности-■ чееккх средств нами был разработан непрямой ■"сзндвич"-вариант ч ? И2А, позволяющий исполъзовать'универсальный конъюгат'для определе-нпя любого виру са.Д-качестве-такого конмгота может:применяться:-

: меченный ферментом■протеин:А: золотистого стафилококка, специфи-"-:-. чески взаимодеЯствувхгД; с > ?с-фрагментом антител. Как уже упомина-. лось,' непрямой "сондвич"-варизнг предполагает сорбцию.на полисти-

• роле ?(ав' )о-<1рагментов' специфических- им.куноглобул;иов. Затем вно-. сятся вирус и интекпше антивирусные иммуноглобулины, которые" * * впоследствии виявляятся с помощы) :конъюгата. Чувствительность не-^-

*• прямого "сэндвич"-м.етода. ША при определении-ХЕК, и УВК весьма -вы—* ■сока и достигает I нг/мл..Прп'этом важно-отметить крайне низкий-.-уровень "фоновой реакции",** обычно,не превышающей 0,02 о.е. Рис.4: ' , иллюстрирует результаты применения. непрямого псэндвич"-варианта .-.■/■ для• гсщЕкацкл ХЕКлистьях и:клубнях зараженных растений карго-Vх; - феля. ХЕК хорошо цдёнткфшвфовался в.экстрактах' из, листьев» зера-генного картофеля,дпри этом.положпгешгая реакция регистрировалась при разведенки сока до 5*10^.* В случае клубней'зеражеяшпграсте-^ ней положительная реакция наблмдалась до.разведения.экстрактагг 5«Ю-4 (рис.'У. Предельное разведенке экстракта из листьев,- инфи-Щфовшшых УВК, составляло 2-10 ^. Чрезвычайно низкие значения-.-"г* „"фоновой реакция*! - дают возможность гвизуально2. оценки результатов^^ , анализов. -В услов1Мх проведения.массовой диагностики микроплаты>■•

V • < . - /;

'могут, быть заранее сенсибилизированы ав'_)з-?рог!.:ент8МИ, < что зна-

О"-'V'-1? -". .

читеяыш ускоряет: процесс она лаз сю. Непрямой "соидв:м"-®врйтге. _ позволяет проводить качественное л количественное определение вирусов в листьях я клубнях больных 'растения, объединяя преимукест-,ва двух вариантов ]}2А. Такт, образам»' этот метод является, по-ви-димоцу, одним из наиболее привлекательных в;двагиостихе вирусов растений и, вероятно, в перспективе на'.'дёт применение в практике ' беззирусного семеноводства картофеля.

6. Использование метода номечекта антител для теотиронпнкя ХНК; Необходимость подготовления специфических пммунопероксндаз-• ных'конъюгатов для 'тестирования вирусов картофеля можно избегать и путем замены синтезированных коньягатов ферментов с'молекулами 'антител тгмунн'ыми комплексами фермента. с антителами. В медицине нашел применение метод немеченых антител, основанный на применении иммунного комплекса пер'оксвдазы. о антителами к перохсодизе ("пероксидаза - антшероксидаза" - ПАП). Назой целью было оценить возможность применения о того метода для диагностики вирусов картофеля. '• ••"•

^"; Схема постановки реакции описана' в разделе "Материалы и методы". Чувствительность определения ХЗК методом немеченых антител в каких' опытах составила 5 нг/мл; "фоновая реакция" при отом практически отсутствовала. При тестировании ХВК-в клубневом материале максимальное разведение экстракта из клубней больных растений картофеля, при котором еще была возможна фотометрическш регистрация реакции, состевлило (рис.5).'

Таким образом, универсальный иммунный комплекс (ПАП) может ,» бить попользован в качестве высокоспещфгческого и эффективного реагента для диагностики вирусных заболеваний картофеля.Это может значительно упростить процесс приготовления диагностических средств.

10 10г IO3 IO4 IO5 степень разведения экстракта*

.Рис.5..Индикация ХЗК в клубнях картофеля методомнемеченых.' .; - i- антител: I -клубни зараженных.растений; 2 -. здоровые:

. - . клубни

4*10 6,4'Ю2' I04 1,6'Ю5 ' г , > степень розредения экстракта, * V. '

Рио ;6 * ■ Индикация ЗШК в: растительном • материале в. моно-: и;"./-'

• полкклональной,системах ;"сзндвичи-вариантЬм г JffiA.:':

• "Анализ экстроктов -из .тастьевЕзаражегаых-растений: с

применением moho- (I) -и поликлонольных антител(2).- > ,■ -/Анализ экстрактов'из листьев здоровых растений-ст-:^ использованием моно- .(3) к полек локальных (4),; =' . ■„ - антител - %. г ,* ;

>_л.... -19 -

6. Использование моноклоналышх антител цля тестирования , ХЕК« Наиболее трудоемким этапом производства иммунодипгностичео-' ких средста: для тестирования вирусов, требующим значительных затрат, является приготовление антисызороток, включающее накопление биологически чистого инфекционного материала, получение высокоочи-щенных вирусных препср&тов (антигенов) и иммунизацга лабораторных животных. Принципиально новый подход к получен™ диагностических антител открывает гибртаомная технология. При слиянии лимфоцитов, выделенных из иммунизированных животных, с опухолевыми клетками, ■способными бесконечно долго'делиться, образуются гибридные клетки,: "увековечивающие" способность лимфоцитов синтезировать антитела. Клетки каядого клона идентичны мевду собой и синтезируют одинаковые (моноклональные) молекулы антител. Гибрхсаше клетки могут достаточно долго размножаться как в культуре /// vitro , так и в привитых животных >п //'so , что обеспечивает длительную продукцию антител, значительно снижая трудовые и материальные затраты.

.Следует,однако, отметить, что для практической диагностики вирусов пригодными могут оказаться только такие моноклональуые .антитела, которые были получены к обзнм антигенным детерминантам для всех Етамков данного вируса. Молю также использовать смесь антител разной.штаммовой специфичности.

В-работе были использованы клоны антител к ХЕК, получетше в Институте химической и биологической физики АН ЭСС?. с применением. "сэндвичи-в8рпанта ША нами были отобраны клоны, имеющие наибольший специфический титр и, что весьма вайю, реагирующие о изо-лятами ХЕК, распространозшымя в различных географических зонах ншей страны. На рис.6 предотавлены результаты сравнения Тестирования ХЕК в растительном материале в моноклональной и обычной (по-ликлональной) системах "сэндвич"-варигштом ША. Кривые титрования

в обоих случаях были.сходны,и незначительно.отличались поабсолюг-нш пс«азатоля£:. - -

• . Таким обрезом, проведенный анализ "показа л (на прпаере.ХЬК).,::. возможность использования моноклоналышх'антител-при диагностике вкусов кертофеля. методом.И^А;:В»дальнейдем'колхозом Ярва-Яани-. * . (ЭССР) били выпушены- дгагноскиеские ПХА-когдлекты к ■ вирусам кар-' : тсх^еля на основе коноклональнцх антител. *

Б Ы В О Д Ы

- - I. Отработонн и оптимизированыразличные'веряантн--тфно~<;л«' г ферментного анализа, (прямой;. непрямой; "ссндвкч!') для тестирова-5 -. нет Х- и У-впрусов картофеля СХЁ6С- и'УВК)-. в листьях и клубнях кар- >, •тофеля..Проведен сравнительный:анализ этих ворШ1«®>1КА,-;позвог?.-•* •.'•лившая рекомендовать "сондвич"-ВЕриант5в качестве метода массовой иммунодиагностики вирусных болезней в■ системе оздоровления • и первичного семеноводсгга картофеля.* * ■

; 2. Показано;I что отечественные комкерческве онтисыворотки,

• выпускавшееся по устярсви:еЯ - технологии: к недостаточно/очищенным..."

■■ вирусным препаратом содержат, антитела к,'антигенам".здоровых растегД

> г 3 у ^ * '

• ний и не могут быть использованы1для ¡КА-дпагностики.'После.пере-■ хода на новую-технолог;® получения внеокоочгсценных вирусных.пре-

• паратов качество коилерчеекга^антпестороток-значительно возросло;--' :и они успешно .используются в нгстояцее время*,вмассовой' диагносг. тике методом 1КА. - , . 1 * '

3. С целью дальиейсего.усовергеистаовагаи.-производства ддаг-г.

о • * • • • - * , ■ .

ностических средств для тестирования ¡.н УЕК отработан непрямой '

;"езцдвич'-метод'Н1А с использованием ?(ав»-^-Ярегментов■:имчуногло-

. булинов, позволямай-применять :унизерсалышй -тл.уноперокспдазныЯ«%

конхагат для диагностики рпзпяных Т11"руссв карго?сля. '

• '■■'..■':• - 2i -

4. Разработан метод немеченых англ те л с использованием ■

• иммунного комплекса "перокспдпза-анткперокс'идаза" для тестирова- '

. ния ХВК в очинённых препаратах и растительном материале. Этот

• . метод лдпен отадки приготовления клунопероксвдозного кониогага,

что значительно облегчает производство диагностических средств.

5. Отработан "сондвпч"-вереткт ИЗА' с использованием коно- ' клональных антител, порченных в 1Ьютитуте х:г. ческой и бпологи-

, ; ческой физики All ЭСС?, для тестирования ХВК. Отобршш клони антител, имеюкие высокий специфический тктр и реагирующие с из о ля-тами ХЕК, распространенными в различных географических зонах СССР.

. nP^KTiriZCKIE PEKG^CLAiyCI '

.1, Для массовой диагностики ХЕК ц УВК в системе оздоровления и первичного оеменоводствп картофеля может быть рекомендовано ' применение Исзндвкч*,-вариента ИГА.

2. С целью повышения качества коммерческих антисывороток, применяемых для диагностики вирусов картофеля методом HIA, било рекомендовано усовершенствовать технология вцзеления и очис.тки вирусных препаратов, используемых для получения антисывороток.

По материалам диссертации опубликованы . следующие работы:

X. Бобкова А.О., .Нацвлкввшш Н.М., Сорокина Н.В., Егоров A.M., Атабеков 11.Г. Диагностика Х-внруса картофеля в растениях и клубнях с помогцью имлуноферментного ачадлза.- Сельскохозяйственная биологет, 1983. -Я 7. - С.

2, Нацвлювиу'ш Н.М., Бобкова А.Ф., Борисова О.В. Ранняя диагностика вирусных заболеваний картофеля методом иммунофермент-^ого айализа. - Тезисы 8-го Всесоюзного совещания" "Теория и прак- .

- 22 - ■

'^Л:-;''"г.* • V-iV-v A-H'iv-.'íi^;"^.']"^^innata иммунитета сельскохозяйотвашкх культур к:вирусным.болез-

ням", 1984, Вильнюс. - С.248-250. • г . / ' :

3. Войковаf Нсцвиспзшж• Н»U;»' Дзантиев Б.Б; Различные4/ "' модификации USA для тестирования Х-вируса-картофеля.ч- Тезисы-.'^f. 8-го Всесоюзного совещания "Теория н практика иммунитета сельско- .• хозяйственных культур к вирусным болезням",-'1984,--Вильнюс; v.;/ С.193-197. ., ' ' ' t 1

4. Бобкова A.Ö., Нацзлигвили K.M., Новиков В.К.,'Дзан- ' • ч тиев Б.Б., Егоров-А.'.'.Атобеков И.Г; Диагностзка.У-впруса-кйр-' ■ . гофеля- методом ивдуноферментного .>анализа;;—Известия АН: СССР, л. ctr

*' - .1 л " ' * *

сер.биологическая, 1935. - ¡i I. - с.128-133. , 1 -

5. Бобкова А.О., Нацвлигвпли Н.М., Дзантиев Б.Б., Атпбо- V ' ков Н.Г. Количественное. определение двух -вирусов картофеля- =-¿; v v" ~-

í (ХЕК и УВК) методом ПСА.-- Тезисы'8-го Объединенного симпозиума биохилнсскас обгестз СССР - ЬР; 1935, Рига. - C.I59. .. "'«V б.-Нааветвпяи Н.М;,' Бобкова\'А.Ф..Прилунение конкурентного .у,-метода им.^уно$ерментного1 анализа для ,тестирования Х-вируса карто- 1 -фаля. - Тезисы докладов-5-го Всесоюзного симпозиума;по инженерной,,' энзимологии (Кобулетл, май 1985 г.), Олайне, 1985. - C.I74Í -. ' -у-: . 7. Бобкова А.О.,\Ноцвл123или Н.М.,:,Чирков СЛ.,ЛЗро$шець* - В .Н., Атабеков И.Г., Кадшенко. С .И.',-, Новиков ;BÄi; Методические ' рекомендации по пркленетаэ ишуноферх!ентного анализа для диагностики вирусов картофеля. - BACXHIK, М., 1985.• - -■•. ' " i ' ' „ * ' ' »

. 8. Бобкова А.О.', Нацвлкпзили Н.К., Чирков С.Н., Сургучева ,

H.A., Воркцев'Ю;А.,-.АтабоксвМ1.Г,.Характеристика отечественных-¿. Y коммерческих антисывороток-к вирусам "кортофеля в АЕВ-тесго и.им-. 4'

* V- * ' * ^ 1 5. i. " ! ' \ *

муноферментном анализе. - Нзвеогш^АН СССР,,сер.биологическая^ v 1987. -SI.- C.28-G4. ' ц .-„ч'^ ' " - '

9. Нацвлишвили Н.М., Наср Эль Чамех, Бобкова А.Ф., Атабе-ков И.Г. Иммуноферментная диагностика Х- й У-вирусов картофеля о ■ использованием Р( ев,^-фрагментов имиуноглобулинов. - Сельскохозяйственная биология, 1987. - 3. - С.114-117.

Л 40119 12.07.88 г. Объем 1'/2 п. л. Заказ 1873. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К- А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44