Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Применение иммунофана и модифицированного полиаргинином углеродного сорбента для коррекции иммунотоксических эффектов неостомозана

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Применение иммунофана и модифицированного полиаргинином углеродного сорбента для коррекции иммунотоксических эффектов неостомозана"

На правах рукописи

ШИТИКОВ ВИТАЛИЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФАНА И МОДИФИЦИРОВАННОГО ПОЛИАРГИНИНОМ УГЛЕРОДНОГО СОРБЕНТА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ИММУНОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ НЕОСТОМОЗАНА

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

1 9 ДЕК 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Троицк-2013

005544019

005544019

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет имени П.А.Столыпина»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор ветеринарных наук, профессор Герунова Людмила Карповна

Лыкасова Ирина Александровна,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины», кафедра товароведения продовольственных товаров и ветеринарно-санитарной экспертизы, заведующая

Грибовский Юрий Геннадьевич,

доктор ветеринарных наук, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии; Уральский филиал, директор

ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет»

Защита состоится

<м>

- - / ¡г

tjL'W^-cu-- 2013 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 220.066.01 при ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 457100, Челябинская область, г. Троицк, ул. Гагарина, 13, тел. 8 (35163) 2-48-88; факс 8 (35163) 2-04-72; E-mail: tvi_t@mail.ru, официальный сайт: www.usavm.ac.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан JcC-^Q/-2013г.

2

Ученый секретарь ^_^

диссертационного совет:

Ърисенко Елена Валерьевна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. XXI век отмечен стремительным ростом наукоемких технологий во всех сферах деятельности человека. При этом безусловно важными являются отрасли мировой пищевой промышленности и их сырьевая база - сельское хозяйство, интенсификация которого предусматривает все более широкое использование химических средств защиты растений и животных. Являясь приоритетными экотоксикантами, пестициды приводят к глобальным нарушениям в мировой экосистеме, тем самым способствуя возникновению различных заболеваний у животных и человека (H.H. Мельников, Г.М. Мельникова, 1997). Отдаленные эффекты пестицидных препаратов предугадать чрезвычайно сложно. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что они могут вызывать тератогенные, эмбриотоксические, мутагенные, канцерогенные и другие нежелательные эффекты (A.A. Соловьева, O.E. Лебедева, 2007, Т.Ю. Кузнецова, Е.В. Демчук, И.В. Пак, 2009). В патогенезе острых и хронических отравлений все большее внимание уделяют иммунной системе организма как основному связующему механизму реактивности и отправному звену формирования различных нарушений (А.Б. Полетаев, С.Г. Морозов, И.Е. Ковалев, 2002). Действие пестицидов носит иммунотоксический характер и заслуживает особого внимания (П.Г. Жминько, 2001). Экологическая иммунология рассматривает пестициды как один из факторов снижения продуктивности и сохранности животных (С.Н. Магер, П.Н. Смирнов, 2001). В связи с этим изучение иммунотоксичности пестицидов и изыскание рациональных методов и средств иммунокоррекции является актуальной задачей ветеринарной медицины.

Степень разработанности проблемы. В настоящее время имеется определенный объем данных по исследованию токсических свойств синтетических пиретроидов и неостомозана в частности (О.В. Харламова, 2003; C.B. Чернигова, 2008; Т.В. Герунов, 2009; Э.К. Папуниди, 2009). Кроме того, имеются данные по применению иммунофана в определенных клинических ситуациях (C.B. Овчинников, 2003; О.Г. Степанов, 2004; М.А. Староселов, 2008; П.Ф. Забродский, 2012), а также углеродных сорбентов (Л.Г. Пьянова, В.Ф. Суровикин, Л.С. Лузянина, 2002). Однако не описано действие иммунофана при иммунотоксических эффектах пестицидов, а также модифицированный полиаргинином углеродный сорбент пока проходит этап клинических испытаний, что свидетельствует об актуальности проведенных исследований.

Цель h задачи исследования. Цель исследования - обосновать возможность применения иммунофана и модифицированного полиаргинином углеродного сорбента для коррекции иммунотоксических эффектов неостомозана при противопаразитарной обработке животных. Для достижения цели были определены следующие задачи:

1. Уточнить характер гемато- и иммунотропного действия иммунофана на организм лабораторных и сельскохозяйственных животных.

2. Выявить изменения биохимических показателей, гемограммы и неспецифической резистентности у лабораторных животных и крупного рогатого скота при обработке неостомозаном.

3. Провести цито- и гистологическое исследование органов иммунной системы при обработке неостомозаном и фармакокоррекции на примере лабораторных животных.

4. Оценить возможность использования иммунофана и модифицированного полиаргинином углеродного сорбента для коррекции иммунотоксических эффектов неостомозана.

5. Разработать рекомендации для специалистов ветеринарной службы «Применение иммунофана для коррекции иммунотоксических эффектов синтетических питретроидов»

Предмет и объект исследования. Объектом исследования являлись белые беспородные лабораторные крысы и крупный рогатый скот черно-пестрой породы (3/4 кровности по голштино-фризской породе) — коровы и телята. Предмет исследования - иммунотоксические свойства неостомозана, иммунотропные и корригирующие эффекты иммунофана и модифицированного полиаргинином углеродного сорбента.

Научная новизна результатов исследования. В отличие от проведенных ранее исследований по применению иммунофана были установлены его иммунокорригирующие эффекты при обработке неостомозаном - препаратом из группы синтетических пиретройдов, что расширяет спектр показаний к его применению. В экспериментальных условиях доказано, что стимуляция гемопоэза и повышение неспецифической резистентности животных при введении иммунофана выражены в большей степени при их угнетении. Патоморфологические изменения в печени и органах иммунной системы в меньшей степени выражены при введении на фоне интоксикации неостомозаном модифицированного полиаргинином сорбента, однако в мазках-отпечатках тимуса при введении иммунофана больше макрофагов и плазматических клеток.

Теоретическая значимость работы. В результате проведенных исследований расширены сведения по фармако- и токсикодинамике синтетического пиретроида неостомозана, иммунофана и модифицированного полиаргинином углеродного сорбента. Доказано, что противопаразитарная обработка неостомозаном снижает иммунную реактивность животных. Показаны новые возможности использования иммунофана и модифицированного полиаргинином углеродного сорбента в клинической практике.

Практическая значимость работы. На основании экспериментальных данных установлено, что противопаразитарная обработка животных неостомозаном снижает иммунную реактивность организма, поэтому

возникает необходимость в применении иммунокорригирующих средств. Доказано, что иммунофан в дозе 0,375 мкг/кг при однократном внутримышечном введении и модифицированный полиаргинином углеродный сорбент в дозе 0,4 г/кг при введении внутрь в течение 5 дней приближают показатели крови к референтным значениям, при этом иммуностимулирующий эффект более выражен при введении иммунофана, а сохранность гистоструктуры печени и органов иммунной системы - при введении сорбента с полиаргинином. Для специалистов ветеринарной службы изданы методические рекомендации " Применение иммунофана для коррекции иммунотоксических эффектов синтетических пиретроидов", которые одобрены секцией Центра научного обеспечения АПК при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области (протокол № 8 от 14.10.2013).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Выполненная диссертация соответствует паспорту научной специальности 06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией по следующим областям исследования: 1. Механизм действия лекарственных веществ на организм животных, его отдельные системы и функции (фармакодинамика); 8. Токсичность лекарственных веществ для животных и характер их побочного действия, разработка показания и противопоказания для применения в ветеринарной практике, а также методов устранения побочных эффектов; 9. Изучение токсичности пестицидов, токсичных элементов, микотоксинов, полибромированных бифенилов, хлордиоксинов и других опасных контаминантов окружающей среды и объектов ветеринарного надзора; 12. Разработка методов диагностики, профилактики и антидотной терапии при отравлении животных пестицидами, токсичными элементами и другими опасными химическими веществами.

Апробация и реализация результатов научных исследований. Апробация. Основные материалы диссертационной работы были доложены и одобрены на международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию СибНИВИ-ВНИИБТЖ (г. Омск, 2011), XI Сибирской ветеринарной конференции "Актуальные вопросы ветеринарной медицины" (г. Новосибирск, 2012), международной научно-практической конференции "Экологические проблемы использования природных и биологических ресурсов в сельском хозяйстве" (г. Екатеринбург, 2012), научно-практической конференции аспирантов "Достижения молодых ученых -аграрному производству" (г. Омск, 2012), IV Съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России " Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации" (г. Москва, 2013) и международной научной конференции " Научное и кадровое обеспечение инновационного развития агропромышленного комплекса" (г. Казань, 2013).

Реализация. Результаты научно-исследовательской работы внедрены в ООО «Комплекс «Таврический» Таврического района Омской области и учебный процесс в ФГБОУ ВПО ОмГАУ имени П.А.Столыпина.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе три из них - в журналах, рекомендованных ВАК. В совместных публикациях 80% материала принадлежит автору.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Противопаразитарная обработка животных синтетическим пиретроидом неостомозаном вызывает гемато- и иммунотоксические эффекты.

2. Иммунофан и модифицированный полиаргинином углеродный сорбент оказывают стимулирующее действие на иммунную реактивность животных, при этом степень выраженности гематокорригирующего действия выше у иммунофана, а гепато- и иммунопротекторные свойства - у сорбента с полиаргинином.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах компьютерного текста и включает разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы, практические рекомендации, приложение. Работа иллюстрирована 21 таблицей, 46 рисунками. Список литературы включает 138 источников, в том числе иностранных авторов - 53.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследования

Тема диссертации является разделом плановой научно-исследовательской работы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет имени П.А.Столыпина» (ФГБОУ ВПО ОмГАУ имени П.А.Столыпина) «Фармакотоксикологическая оценка новых лекарственных средств и пестицидов» с номером государственной регистрации 01201158552. Лабораторные эксперименты выполнены на базе кафедры диагностики, внутренних незаразных болезней, фармакологии, хирургии и акушерства ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А.Столыпина в период с 2010 по 2013г.г. Производственные опыты на крупном рогатом скоте проводили в СПК «Сибирь» с. Увало-Ядрино Омской области с мая по июнь 2011г. и ООО «Комплекс Таврический » Таврического района Омской области с июня по август 2012 г. Схема исследований представлена на рисунке 1.

В лабораторных экспериментах использовали иммуномодулятор иммунофан (0,005 % - ный раствор, серия № 1850810), в производственных опытах - иммунофан серии № 1750810 (НПО "Бионокс", Россия, г. Москва), а также были использованы синтетический пиретроид неостомозан (концентрат в 1л: трансмикса — 50 г, тетраметрина — 5 г и наполнители) производства «СЕВА Санте Анималь» (Франция) . и углеродный

энтеросорбент, модифицированный полиаргинином (ИППУ СО РАН, Россия, г. Омск).

В лабораторных опытах в качестве экспериментальной модели использовали 112 беспородных белых крыс в возрасте 4-6 месяцев с массой тела 230-280 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. В производственном эксперименте опытной моделью служил крупный рогатый скот черно-пестрой породы - 40 коров в возрасте 4-5 лет с массой тела 400500 кг и 10 телят в возрасте 2-х месяцев с массой тела 80-100 кг. Все исследования на лабораторных животных осуществляли согласно требованиям Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и для других научных целей (2005).

Рисунок 1 - Схема исследований

7

\

Для оценки неспецифической резистентности организма (НРО) и гемограммы крупному рогатому скоту и крысам вводили внутримышечно 0,005%-ный раствор иммунофана однократно в рекомендуемых профилактических дозах - 0,375 мкг/кг для крупного рогатого скота и 13 мкг/кг для крыс, через 14 дней определяли следующие показатели: НСТ-тест (спонтанный и активированный) по методу Б.С. Нагоева, М.Г. Шубича, (1981), ФАЛ - фагоцитарную активность лейкоцитов с латексом (В.Н. Блиндарь, Г.Н. Зубрихина, Н.Б. Круглова и др., 1996). Кроме того, в сыворотке крови определяли содержание ЦИК - циркулирующих иммунных комплексов по методу Digeon (М. Digeon, J.F. Bach, 1977; И. Лефковитс, Б. Пернис, 1981). Гемограмму оценивали по 22 параметрам на гемоанализаторе Sysmex XT-2000I (Япония). Для выявления нежелательных эффектов неостомозана определяли ГГТ (у-глутаматгрансферазу), АсАТ и АлАТ (аспартат-аминотрансферазу и аланин-аминотрансферазу) на биохимическом анализаторе "Screen Master" производства фирмы "Hospitex" (Швейцария, Италия), а также ФМСМ (фракции молекул средней массы) -спектрофотометрическим методом. Мазки-отпечатки органов иммунной системы крыс окрашивали по Романовскому. Для гистоисследования патматериал фиксировали в 4%-ном нейтральном растворе формальдегида, срезы получали с парафиновых блоков и окрашивали гематоксилином и эозином. Все данные, полученные в ходе экспериментов, подвергали статистической обработке с использованием программы STATISTIC А 6.1 rus (StatSoft, USA), при этом сравнение средних проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для зависимых выборок и непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок.

2.2. Гемограмма и показатели неспецифической резистентности организма крупного рогатого скота и крыс при введении иммунофана

Для оценки иммунотропного действия иммунофана определяли гематологические показатели и неспецифическую резистентность у крупного рогатого скота и крыс при однократном введении иммунофана в дозах 0,375 мкг/кг и 13 мкг/кг соответственно. Через 14 суток после введения у животных опытных групп достоверно повышалось количество эритроцитов и гемоглобина, отмечали как абсолютную, так и относительную эозинофилию, однако количество лейкоцитов снижалось. Выявленные закономерности были характерны для обоих видов животных (табл. 1, 3).

На неспецифическую резистентность организма иммунофан оказывал стимулирующие действие, что подтверждало увеличение показателей НСТ-теста у крыс, а также фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса у всех животных опытных групп (табл. 2,4).

Таблица 1 - Гематологические показатели крыс при введении иммунофана в _дозе 13 мкг/кг через 14 суток__

Группы животных М±ш: п=Ю Контрольная группа Опытная группа до введения препарата Опытная фуппа после введения препарата

Концентрация эритроцитов, х10'7л 7,94±0,53 8,20±0,85 10,28±0,87'

Концентрация гемоглобина, г/л 99,21 ±2,27 9б,00±1,13 117,00±2,44'

Среднее содержание гемоглобина в эритроците, *1012/г 13,39±1,55 11,80±1,02 15,29±1,72"

? Концентрация лейкоцитов, *109/л 12,12±1,01 11,70±0,74 9,67±0,61

н га tn га Количество нейтрофилов, хЮ'/л 2,37±0,18 2,58±0,11 2,34±0,14

о С Количество лимфоцитов, хЮ'/л 7,92±1,19 7,22±0,81 6,86±0,72"

Количество эозинофилов, *109/л 0,24±0,07 0,16±0,05 1,Ю±0,16"

Процент нейтрофилов ,% 24,88±0,35 22,60±0,26 21,06±0,33

Процент лимфоцитов, % 67,72±0,98 65,31 ±0,91 58,75±0,24"

Процент эозинофилов, % 1,77±0,66 1,34±0,78 4,52±1,14"

Примечание: * отр< 0,05 до р < 0,01, **от р <0,0! до р < 0,001, достоверно по отношению к контрольной группе и опытной группе до введения препарата.

Таблица 2 - Показатели неспецифической резистентности организма крыс

Группы животных М±ш п=10 Показатели

НСТ-тест (спон.), усл. ед. НСТ-тест (актив.), усл. ед. ЦИК по Дижону, усл.ед. ЦИК по Дижону, размер Фагоцитарное число, усл. ед. Фагоцитарный индекс, %

Контрольная группа 0,32±0,27 1,23±0,44 310,02±11,70 средний 4,21 ±0,41 90,65±0,89

Опытная группа до введения препарата 0,47±0,28 1,33±0,63 317,09±14,90 средний 4,98±0,54 92,61 ±0,91

Опытная группа после введения препарата 0,92±0,48 2,77±0,66* 409,61±15,22" малый 5,36±0,6l" 98,81 ±1,02"

Примечание; * от р< 0,05 до р < 0,01, **от р < 0,01 до р < 0,001, достоверно по отношению к контрольной группе и опытной группе до введения препарата.

Таблица 3 - Гематологические показатели коров через 14 суток после _введения иммунофана в дозе 0,375 мкг/кг _

Группы ЖИВОТНЫХ М±т: п=5 Контрольная группа Опытная группа до введения препарата Опытная группа после введения препарата

Концентрация эритроцитов, х10|2/л 5,58±0,04 6,37±0,25 6,73±0,43*

Концентрация гемоглобина, г/л 101,40*4,01 109,60±2,94 121,00±6,45'

Среднее содержание гемоглобина в эритроците, х 10~|2/г 17,26±0,43 17,1 ±0,2 17,52±0,21"

s Концентрация лейкоцитов, * 109/л 9,72±1,27 10,70±1,84 7,74±0,49

я Количество нейтрофилов, * 10'/л 1,90*0,15 2,08±0,18 2,28±0,15

к о С Количество лимфоцитов, х 10'/л 6,32±1,31 4,53±0,33 4,00±0,28*

Количество эозинофилов.х ю'/л 0,32±0,06 0,11 ±0,05 0,68±0,13"

Процент нейтрофилов ,% 21,80±2,41 31,70±0,45 30,02±1,37

Процент лимфоцитов, % 65,70±3,98 57,60±0,83 51,7±1,2"

Процент эозинофилов, % 2,70±0,53 1,10±0,87 8,74±1,27*

Примечание: * от р< 0,05 до р < 0,01, **от р < 0,01до р < 0,001, достоверно по отношению к контрольной группе и опытной группе до введения препарата.

Таблица 4 - Показатели неспецифической резистентности организма коров

Группы животных М±ш п=5 Показатели

HCT - тест (спон.), усл. ед. HCT - тест (актив.), усл. ед. ЦИК по Дижону, усл. ед. ЦИК по Дижону, размер Фагоцитарное число, усл. ед. Фагоцитарный индекс, %

Контрольная группа 0,80±0,37 1,80±0,66 387,00± 15,79 средний 6,83±0,55 96,60±0,92

Опытная группа до введения препарата 1,60±0,24 2,40±0,24 31б,20± 16,30 средний 6,15±0,52 84,60±1,72

Опытная группа после введения препарата 1,60±0,40 2,40±0,60 418,60±3,78" малый 7,86±0,53* 97,80±1,И"

Примечание; * от р< 0,05 до р < 0,01, "от контрольной группе и опытной группе до

р < 0,01до р < 0,001, достоверно по отношению к введения препарат

2.3. Биохимические показатели сыворотки крови крупного рогатого скота н крыс при обработке неостомозаном с последующей коррекцией иммунофаном и сорбентом, модифицированным полиаргинином

Для данного эксперимента было сформировано по 4 группы крупного рогатого скота и крыс (по 5 голов в группах крупного рогатого скота и по 9 особей в группах крыс): 1 - интактные животные (контроль); 2 - животные, обработанные неостомозаном; 3 -животные, обработанные неостомозаном с последующей коррекцией модифицированным полиаргинином углеродным сорбентом; 4 - животные, обработанные неостомозаном с последующей коррекцией иммунофаном. Неостомозан вводили крысам подкожно в профилактической дозе 2 мг/кг двукратно с интервалом 7 дней. Крупный рогатый скот обрабатывали неостомозаном в разведении 1:1000 путем опрыскивания всего волосяного покрова животного также двукратно с интервалом 7 дней. После второй инъекции (у крупного рогатого скота -обработки) животным третьей группы в течение 5 суток вводили перорально модифицированный полиаргинином углеродный сорбент в дозе 0,4 г/кг, а животным четвертой группы был введён иммунофан однократно в дозе 0,375 мкг/кг крупному рогатому скоту и 13 мкг/кг крысам в форме 0,005%-ного раствора. Биохимическое исследование сыворотки крови проводили на 2-е, 7-е и 14-е сутки. Уже на 2-ой день у животных опытных групп отметили повышение уровня МСМ, которое постепенно спадало к 14 дню. При этом показатели у животных после коррекции быстрее снижались до уровня контроля при введении иммунофана (рис.2, 3).

0.22

020

0.18

0.16

| о..«

г 0.12 1

\ ою

| 0 08 I

Ч о.оо

0,04 0.02 0.00

0.02 ■*>" 238 216 2И 262 270 278 286 291 302" '

2л1 250 258 266 2Т4 282 290 295 .ш...^...

— «"т.пиие «.мшио

Рисунок 2 - Содержание фракций МСМ в сыворотке крови крупного рогатого скота, обработанного неостомозаном с последующей коррекцией иммунофаном и модифицированным полиаргинином сорбентом ( 14-е сутки после введения препаратов)

0.18 0,16 0.14

I 0.12 5 0,10 * 0.08 \ 0,06 | 0,04 0.02 0,00

■0.02 -о- и»»авж->л»

238 246 254 262 270 278 286 294 302 3«Ч-í««« 242 250 258 265 274 282 290 ZS8 ¡¡¡^Г*""

Рисунок 3 - Содержание фракций МСМ в сыворотке крови крыс, обработанных неостомозаном с последующей коррекцией иммунофаном и модифицированным полиаргинином сорбентом ( 14-е сутки после введения препаратов)

При исследовании трансфераз регистрировали повышение уровней данных ферментов у животных опытных групп, при этом корригирующие эффекты иммунофана и сорбента были отмечены уже на 7-ой день после начала эксперимента (рис. 4, 5).

Рисунок 4 — Содержание АлАТ в сыворотке крови крыс, обработанных неостомозаном с последующей коррекцией иммунофаном и модифицированным полиаргинином сорбентом ( 7-е сутки после введения препаратов)

Рисунок 5 — Содержание АсАТ в сыворотке крови крыс, обработанных неостомозаном с последующей коррекцией иммунофаном и модифицированным полиаргинином сорбентом ( 7-е сутки после введения препаратов)

Рисунок 6 - Содержание АлАТ в сыворотке крови крупного рогатого скота, обработанного неостомозаном с последующей коррекцией иммунофаном и модифицированным полиаргинином сорбентом ( 7-е сутки после введения препаратов)

Рисунок 7 - Содержание АсАТ в сыворотке крови крупного рогатого скота, обработанного неостомозаном с последующей коррекцией иммунофаном и модифицированным полиаргинином сорбентом ( 7-е сутки после введения препаратов)

Полученные данные свидетельствуют о том, что неостомозан в дозе 2 мг/кг вызывает признаки интоксикации. Иммунофан и модифицированный полиаргинином углеродный сорбент снижают содержание фракций МСМ и уровень трансфераз в сыворотке крови животных.

2.4. Показатели крови и неспецифическая резистентность крупного рогатого скота и крыс при обработке неостомозаном с коррекцией иммунофаном и модифицированным полиаргинином углеродным

сорбентом

Взятие крови для исследования гематологических показателей и факторов НРО проводили на 7-е и 14-е сутки после введения препаратов. На 7-ой день регистрировали уменьшение количества эритроцитов в группе крыс, обработанных неостомозаном, на 38% по сравнению с контролем, при этом уровень гемоглобина также понизился на 25%, в группах с фармакокоррекцией аналогичные показатели были выше: в группе с коррекцией сорбентом количество эритроцитов больше на 17%, гемоглобина - на 6%, в группе с иммунофаном - на 21% и 12% соответственно в сравнении с группой животных, обработанных неостомозаном. Количество лейкоцитов снизилось на 15%, содержание нейтрофилов - на 51%, лимфоцитов - на 23% в группе, обработанной неостомозаном, в сравнении с группой контроля. В группах с коррекцией данные показатели были выше. Особого внимания заслуживает увеличение количества эозинофилов в группе с неостомозаном на 87% относительно контроля, при введении иммунофана данный показатель возрос еще на 25% (табл. 5).

Таблица 5 — Гематологические показатели крыс при обработке неостомозаном с коррекцией иммунофаном и модифицированным _полиаргинином углеродным сорбентом через 7 суток_

Группы животных М±ш: п=9 Контрольная группа Н н+с Н+И

Концентрация эритроцитов, х1012/л 6,84±0,21 4,21 ±0,19* 4,94±0,43' 5,11±0,83'

Концентрация гемоглобина, г/л 112,42±1,18 83,64±0,65" 89,34±0,98* 93,87±1,17*

Концентрация лейкоцитов, х109/л 10,29±1,08 8,72±0,71" 9,02±1,27* 9,34±1,07"

Количество нейтрофилов, х109/л 2,64±0,61 1,28±1,01" 1,64±0,42' 1,6б±0,18

1 Количество лимфоцитов, хЮ'/л 6,81±0,17 5,21±0,38" 5,53±0,97 5,41±0,48

У ьй о Г Количество моноцитов, х109/л 1,84±0,01 0,97±0,08 1,19±0,11 1,02±0,22

Количество эозинофилов, х109/л 0,25±0,09 1,97±0,22* 1,28±0,47* 2,47±0,29'

Процент нейтрофилов, % 29,21±0,66 19,72±0,73" 21,42±0,29* 22,34±1,27"

Процент лимфоцитов, % 66,6 Ш,32 54,38±1,52* 58,42±0,79* 56,37±1,82*

Процент эозинофилов, % 0,75±0,10 3,92±0,19" 2,73±1,13' 4,35±0,28"

Примечание: * от р< 0,05 до р < 0,01, "от р < 0,01до р < 0,001, различия достоверны относительно контроля и группы Н.

Анализируя НРО, мы отметили у обработанных неостомозаном крыс увеличение показателей НСТ-теста спонтанного и активированного на 20% и 88%, уровня ЦИК - на 33%, снижение фагоцитарного числа и индекса - на 48% и 15% соответственно по сравнению с группой контроля. В опытных группах с коррекцией данные показатели были несколько выше по сравнению с группой, обработанной неостомозаном, при этом в группе с сорбентом достоверно больше был фагоцитарный индекс (на 5%), в группе с коррекцией иммунофаном - выше значение НСТ-теста активированного на 18%, а также ЦИК - на 22%, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс -на 36% и 11% соответственно (табл. 6).

Таблица 6 - Показатели неспецифической резистентности организма крыс

при обработке неостомозаном с коррекцией иммунофаном и модифицированным полиаргинином углеродным сорбентом через 7 суток

Группы животных М±ш п=9 Показатели

НСТ-тест (спон.), усл. ед НСТ-тест (актив.), усл. ед. ЦИК по Дижону, усл. ед. ЦИК по Дижону, размер Фагоцитарное число, усл. ед. Фагоцитарный индекс, %

Контрольная группа 1,19±0,20 2,18±0,74 257,22±21,79 средний 5,98±0,16 94,28±0,72

Н 2,62±0,93 4,11±1,25 343,07± 17,81 малый 3,08±0,55* 80,07±1,27*

Н+С 2,28±|,11 3,68±0,58 327,34± 15,87 малый 3,87±0,49 84,11 ±0,98*

Н+И 2,73±0,71 4,89±1,48 419,56±25,88 малый 4,21 ±1,02' 89,28±1,35'

Примечание: * от р< 0,05 ло р < 0,01, "от р < 0,01до р < 0,001, различия достоверны относительно контроля и группы Н.

У крупного рогатого скота на 7-ой день отмечали аналогичные изменения: угнетение эритроидного ростка кроветворения при обработке неостомозаном, что подтверждает достоверное уменьшение количества эритроцитов и уровня гемоглобина в группе без коррекции на 40% и 16% в сравнении с контролем. Кроме того, достоверно понизился гематокрит и среднее содержание гемоглобина в эритроците на 29% и 20% соответственно. В группе с коррекцией сорбентом уровень эритроцитов выше на 12%, гемоглобина - на 3%, в группе с коррекцией иммунофаном -на 18% и 7% соответственно в сравнении с группой, где был применен только неостомозан. Лейкопения у животных, обработанных неостомозаном, проявлялась в уменьшении количества лейкоцитов на 30%, нейтрофилов - на 51% и лимфоцитов - на 44% по сравнению с интактными животными. Данные показатели в группах с коррекцией были выше (табл. 7).

Таблица 7 - Гематологические показатели коров при обработке неостомозаном с коррекцией иммунофаном и модифицированным _полиаргинином углеродным сорбентом через 7 суток_

Группы животных М±гп: п=5 Контрольная группа Н Н+С Н+И

Концентрация эритроцитов, х10|2/л 7,19±0,12 4,89±0,19" 5,48±0,31" 5,79±0,66*

Концентрация гемоглобина, г/л 105,30±3,11 88,34±2,П" 91,42±2,78" 95,01 ±4, Г

Гематокрит % 31,91 ±0,98 22,41 ±0,28' 26,38±0,12 27,29±1,02

Среднее содержание гемоглобина в эритроците, х10"12/г 18,11 ±0,67 14,34±0,12" 16,21±0,19 16,76±0,27

Р га Концентрация лейкоцитов, хЮ'/л 8,97±1,41 6,21 ±0,78' 7,01 ±0,8 Г 7,67±0,14*

У * о а Количество нейтрофилов, х109/л 2,01 ±0,12 0,98±0,1 Г 1,08±0,15 1,61 ±0,54'

Количество лимфоцитов, хЮ'/л 6,56±1,45 3,67±0,32" 4,21±0,79* 3,56±0,90

Количество эозинофилов, х)09/л 0,16±0,09 1,42±0,14' 1,15±0,23* 1,49±0,49*

Процент нейтрофилов, % 23,75±2,31 19,62±1,34" 21,19±0,48" 22,11 ±0,77'

Процент лимфоцитов, % 67,31±2,73 61,23±2,17' 63,28±0,91* 64,22±1,21*

Процент эозинофилов, % 1,55±0,31 6,86±0,92" 4,19+0,17' 7,83±1,12*

Примечание: * от р< 0,05 до р < 0,01, **от р < 0,01до р < 0,001, различия достоверны относительно контроля и группы Н.

Таблица 8 - Показатели неспецифической резистентности организма коров

при обработке неостомозаном с коррекцией иммунофаном и модифицированным полиаргинином углеродным сорбентом через 7 суток

Группы животных М±т п=5 Показатели

НСТ-тест (спон.), усл. ед. НСТ-тест (актив.), усл. ед. ЦИК по Дижону, усл. ед. ЦИК по Дижону, размер Фагоцитарное число, усл. ед. Фагоцитарный индекс, %

Контрольная группа 1,10±0,44 2,90+0,78 355,21 + 13,81 средний 7,10+0,33 85,50±0,61

Н 3,91 ±1,22' 5,27+2,11' 472,57± 15,30 малый 3,23+0,13' 66,71+0,55'

Н+С 3,24±0,79 4,74+1,93' 448,30+8,71' малый 4,64+0,22' 73,77±1,11*

Н+И 4,01±1,34 5,35±1,14' 489,31 ±10, ] 6 малый 5,41 ±0,4 7* 81,11±0,99"

Примечание: * от р< 0,05 до р < 0,01, "от р < 0,01до р < 0,001, различия достоверны относительно контроля и гриппы Н .

На 7-ой день после фармакокоррекции сорбентом отмечено снижение показателей НСТ-теста спонтанного и активированного, а также ЦИК на фоне повышения их значений при обработке неостомозаном, увеличение фагоцитарной активности лейкоцитов (табл. 8). При введении иммунофана все отмеченные показатели повышались.

2.5. Цитологическая характеристика мазков-отпечатков органов

иммунной системы крыс, обработанных неостомозаном, иммунофаном и модифицированным полиаргинином углеродным

сорбентом

При микроскопическом исследовании мазков-отпечатков тимуса крыс было установлено увеличение количества зрелых тимоцитов у животных, обработанных неостомозаном, относительно интактных крыс. Количество пролимфоцитов при этом снижалось, что указывает на замедление миграции зрелых лимфоцитов из тимуса и снижение пролиферативной активности лимфоидных клеток в нем.

Введение иммунофана после обработки неостомозаном приводит к повышению пролиферативной активности лимфоцитов в органе, что характеризуется увеличением количества лимфобластов, пролимфоцитов, макрофагов и плазматических клеток (табл. 9). Достоверное снижение количества зрелых тимоцитов у животных, обработанных неостомозаном и иммунофаном, указывает на возможность активной миграции их из органа. Морфологически зрелые тимоциты в мазках-отпечатках крыс всех исследуемых групп располагались разрозненно и в виде скоплений, имели округлую форму и малые размеры. Ядра характеризовались четким контуром и гиперхромной окраской.

Таблица 9 - Цитологические особенности мазков-отпечатков тимуса крыс в условиях обработки неостомозаном и иммунофаном, по данным световой _микроскопии на 1000 клеток (Ме (Р25; Р75)), п=5_

Показатели Контроль Неостомозан Иммунофан + Неостомозан

Зрелые тимоциты 775,00 (769,00; 777,00) 842,00 (841,00; 844,00) ** 639,00 (624,00; 645,00) **

Пролимфоциты 218,00(215,00; 228,00) 149,00(147,00; 152,00) ** 320,00 (310,00; 331,00) **

Лимфобласты 2,00(1,00; 2,00) 3,00 (3,00; 3,00) ** 10,00 (8,00; 13,00) **

Плазматические клетки 0,00(0,00; 1,00) 2,00(1,00; 2,00) ** 4,00 (3,00; 4,00)

Макрофаги 4,00 (3,00; 6,00) 4,00 (3,00; 4,00) 32,00 (28,00; 34,00) **

Примечание: достоверность различий определяли между группами, контроль и неостомозан, неостомозан и неостомозан+иммунофан * - р<0,05; **-р<0,01

Пролимфоцитарные элементы характеризовались округлой формой и более светлым окрашиванием ядер. Располагались пролимфоциты в препаратах разрозненно и в плотных скоплениях.

Единичные незрелые лимфоидные элементы, по структуре и размерам напоминающие лимфобласты, были более крупных размеров по сравнению с пролимфоцитами. Цитологические препараты селезенки крыс, обработанных неостомозаном, характеризовались меньшей клеточностью относительно контрольных животных.

Пятидневная фармакокоррекция углеродным сорбентом, модифицированным полиаргинином, после обработки неостомозаном приводила к снижению количества зрелых тимоцитов до 377,00 (373,00; 389,00) против 842, 00 (841,00; 844,00), регистрируемых без коррекции (р<0,01). Количество пролимфоцитов при этом увеличивается до 500,00 (480,00;530,00) против 149,00 (147,00; 152,00) без коррекции (р<0,01). Возрастало также количество лимфобластов до 93,00 (81,00; 96,00) против 3,00 (3,00; 3,00) без коррекции (р<0,01). Таким образом, применение пятидневного курса энтеросорбции с углеродным сорбентом, модифицированным полиаргинином, нормализует миграцию зрелых лимфоцитов из органа, снижение которой отмечается при обработке неостомозаном, и повышает пролиферативную активность лимфоцитов в тимусе.

2.6. Патоморфологические изменения в органах иммунной системы и печени крыс при обработке неостомозаном и фармакокоррекции

При интоксикации животных неостомозаном отмечали разрастание междольковой соединительной ткани в тимусе и активизацию образования телец Гассаля. В селезенке были увеличены лимфатические фолликулы и расширены их маргинальные зоны, хорошо выражены периартериальные лимфоидные муфты. В печени прослеживались признаки водяночной дистрофии и очагового некроза гепатоцитов.

При применении сорбента значительно увеличена площадь коркового вещества в тимусе, периартериальные муфты селезенки еще более расширены, фолликулы увеличены. Балочная структура печени сохранена, признаки дистрофии меньше выражены, очаги некроза минимизированы. При введении иммунофана соотношение коркового и мозгового веществ в тимусе на уровне контрольных животных, но ярче выражены признаки обеднения лимфоцитами мозгового вещества. Муфты в селезенке менее выражены, чем при интоксикации неостомозаном. В печени по-прежнему присутствовали безъядерные клетки с вакуолями, признаки некроза отдельных гепатоцитов сохранены, что позволяет считать гепатопротекторное действие иммунофана менее выраженным, чем у сорбента с полиаргинином.

выводы

1. Иммунофан при введении в однократной дозе (0, 375 мкг/кг для крупного рогатого скота и 13 мкг/кг для крыс) повышает у крупного рогатого скота количество эритроцитов до 6,73±0,43><1012/л и уровень гемоглобина до 121,00±6,45 г/л против 5,58±0,04хЮ12/л и 101,40±4,01 г/л (р<0,05), у крыс количество эритроцитов возрастает до 10,28±0,87><1012/л по сравнению с контролем 7,94±0,53*1012/л (р<0,05), концентрация гемоглобина - до 117,00±2,44 г/л против 99,21±2,27 г/л в контроле (р<0,05). При этом у всех животных опытных групп происходит повышение эритроцитарных индексов.

2. При введении иммунофана у крупного рогатого скота повышаются фагоцитарное число и фагоцитарный индекс до 7,86±0,53 ед. и 97,80±1,11 % соответственно в сравнении с 6,83±0,55 ед. и 96,60±0,92 % в контроле (р<0,01 и р<0,05), у крыс увеличиваются показатели НСТ - теста до 2,77±0,66 ед. против 0,92±0,48 ед. в контроле, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс - до 5,36±0,61 ед. и 98,81±1,02 % по сравнению с 4,21±0,41 ед. и 90,61±0,89 % в контроле (р<0,01), при этом препарат стимулирует образование циркулирующих иммунных комплексов малых размеров у крыс и крупного рогатого скота.

3. Введение иммунофана стельным коровам в третьем триместре беременности способствует повышению количества эритроцитов, гемоглобина и фагоцитарной активности нейтрофилов у потомства.

4. При подкожном введении неостомозана крысам в дозе 2 мг/кг и обработке крупного рогатого скота в разведении 1:1000 двукратно с интервалом 7 суток отмечается достоверное увеличение уровня фракций молекул средней массы, а также аминотрансфераз и ГГТ. Однократное введение иммунофана в дозе 0,375 мкг/кг крупному рогатому скоту и 13 мкг/кг крысам и модифицированного полиаргинином сорбента в дозе 0,4 г/кг в течение 5 суток, приводит к снижению интоксикации и стабилизирует показатели на уровне значений контрольных групп, при этом у крыс стабилизация биохимических показателей происходит быстрее.

5. Через 7 суток после обработки животных неостомозаном происходит угнетение процессов кроветворения, что проявляется в эритро- и лейкопении со снижением абсолютного количества нейтрофилов, развитии эозинофилии у крыс опытных групп и крупного рогатого скота. Через 14 суток изменения минимизируются, что позволяет считать их обратимыми. Применение иммунофана и модифицированного полиаргинином углеродного сорбента ускоряет процессы восстановления.

6. Профилактическая обработка неостомозаном характеризуется стимуляцией НСТ-теста спонтанного и активированного, увеличением уровня ЦИК, угнетением фагоцитарной активности нейтрофилов. Коррекция иммунофаном и модифицированным полиаргинином углеродным сорбентом нивелирует отмеченные изменения фагоцитарной активности, однако

показатели НСТ-теета под воздействием иммунофана возрастают в большей степени, чем при обработке неостомозаном.

7. В мазках-отпечатках органов иммунной системы крыс, обработанных двукратно неостомозаном в дозе 2 мг/кг, отмечается снижение пролиферативной активности клеток лимфоидного ряда и накопление зрелых тимоцитов в тимусе, снижение количества молодых клеток лимфоидного ряда в брыжеечных лимфатических узлах, а также достоверное снижение количества лимфоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов и макрофагов в селезенке. Однократное введение крысам 0,005%-ного раствора иммунофана в дозе 13мкг/кг или углеродного сорбента, модифицированного полиаргинином, в дозе 0,4 г/кг в течение 5 суток сглаживает отмеченные цитологические изменения и стимулирует пролиферативную активность клеток лимфоидного ряда в органах иммунной системы.

8. При введении неостомозана крысам в дозе 20 мг/кг снижается плотность лимфоцитов в тимусе, активизируется образование телец Гассаля, происходит разрастание соединительной ткани. В селезенке увеличиваются лимфатические фолликулы, расширяются их маргинальные зоны. В печени развивается водяночная дистрофия, появляются очаги некроза гепатоцитов.

9. Иммунофан и модифицированный полиаргинином сорбент увеличивают количество лимфоцитарных инфильтратов в печени, при этом иммунофан вызывает обеднение лимфоцитами мозгового вещества тимуса и менее выраженную пролиферативную реакцию периартериальных лимфоидных муфт в селезенке.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуем при использовании неостомозана для противопаразитарной обработки животных контролировать показатели гемограммы и иммунной реактивности животных.

2. Для коррекции иммунотоксических эффектов неостомозана целесообразно вводить крупному рогатому скоту иммунофан в дозе 0,375 мкг/кг внутримышечно однократно или задавать перорально сорбент, модифицированный полиаргинином, в дозе 0,4 г/кг в течение 5 суток.

3. Разработаны методические рекомендации для специалистов ветеринарной службы "Применение иммунофана для коррекции иммунотоксических эффектов синтетических пиретроидов"

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК

1. Шитиков В. В. Изменение гематологических показателей и факторов неспецифической защиты организма глубокостельных коров при воздействии иммунофана / В. В. Шитиков // Омский научный вестник. -2011.-№ 1 (104). - С. 162-165.

2. Шитиков В.В. Гематотропные эффекты препаратов на основе синтетических пиретроидов при острой и хронической интоксикации крыс / В.В. Шитиков, Т.В. Герунов // Ветеринария и кормление. - 2012,- № 5.- С. 14-15.

3. Шитиков В.В., Гемограмма телят при воздействии иммунофана на организм стельных коров / В. В. Шитиков, Т.В. Герунов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2013. - Т.214. - С. 493 - 496.

В научных изданиях

4. Шитиков В.В. Неспецифическая резистентность глубокостельных коров при введении иммунофана / Шитиков В.В. // Инфекционная патология животных: материалы междунар. науч.-практ. конф. - Омск, 2011. - С. 207 -209.

5. Шитиков В.В. Иммуностимуляция коров и неспецифическая резистентность потомства /В.В. Шитиков // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: материалы XI Сибирской ветеринарной конф,-Новосибирск, 2011. - С. 182 - 183.

6. Герунова Л.К., Шитиков В.В. Спектр молекул средней массы сыворотки крови крыс при воздействии неостомозана с коррекцией модифицированным углеродным сорбентом и иммунофаном / JI.K. Герунова, В.В. Шитиков // Современные проблемы и инновационные подходы к диагностике, лечению и профилактике болезней животных и птиц: материалы междунар. науч.-практ. конф. - Екатеринбург, 2012. - С. 271 - 274.

7. Шитиков В.В. Цитологические особенности мазков-отпечатков тимуса крыс в условиях обработки неостомозаном и коррекции углеродным сорбентом, модифицированным полиаргинином / В.В. Шитиков, A.A. Вовк // Материалы IV съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России: сб. науч. тр. — Воронеж: Истоки, 2013 - С. 641 - 643.

8. Применение иммунофана для коррекции иммунотоксических эффектов синтетических пиретроидов: метод, рекомендации / В.И. Околелов, Л. К. Герунова, В.В. Шитиков, Т.В. Герунов - Омск: ИПК Макшеев Е.А., 2013. -15 с.

Подписано в печать 22.11.2013 г. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman. Усл.печ.л. 1,16. Печать оперативная. Тираж 100 экз. Заказ № 38. Отпечатано с оригинал-макета в ООО «Эверест» 457100, Челябинская обл., г.Троицк, ул.Гагарина, 74. Тел/факс: 8(35163)2-38-18

ШИТИКОВ ВИТАЛИЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ НММУНОФАНА Н МОДИФИЦИРОВАННОГО ПОЛИАРГИНИНОМ УГЛЕРОДНОГО СОРБЕНТА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ИММУНОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ НЕОСТОМОЗАНА

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук