Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных полипептидов

Степаненко, Василий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных полипептидов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных полипептидов"

РАН

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им, академиков М М. ШЕМЯКИНА и Ю. А. ОВЧИННИКОВА Российской академии наук (ИБХРАН)

На правах рукописи

СТЕПАНЕНКО Василий Николаевич

Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных

полипептндов.

03. 00. 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -

2006

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Института биоорганической химии им, акад. М. М. Шемякина и Ю, А, Овчинникова РАН

Научный руководитель: академик РАН

А. И. Мирошников

Официальные оппоненты: д.х.н., член-корр. РАН, д.б.н.

В. И. Цетлин И, Г, Шемякин

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) Защита состоится «22» ноября 2006 г. на заседании

Диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан «_» октября 2006 г.

Ученый секретарь Диссертации ""п™ гппртл Доктор химических наук

Характеристика работы

Актуальность темы.

Получение рекомбинантных полипептидов 1-7 кДа в прокариотических системах, как правило, является довольно сложной задачей. Небольшие полипептиды являются доступной мишенью для клеточных протеаз ввиду отсутствия жесткой третичной структуры. Существуют способы избежать протеолитического расщепления: секреция целевого полипептида в культуральную среду и экспрессия в составе гибридного белка. В случае секреции целевого полипептида в культуральную среду возникает проблема полного отщепления лидерного пептида и концентрирования целевого полипептида из большого объема. В случае экспрессии целевого полипептида в составе гибридного белка основной проблемой становится селективное расщепление пептидной связи с отделением целевого пептида от белка носителя. В настоящее время разработан ряд схем, позволяющих решать эту задачу, в частности с использованием энтерокиназы, фактора X или ТЕУ протеазы. Но это значительно увеличивает затраты на технологию и делает масштабирование экономически нецелесообразным.

Цель работы. Целью данной работы являлась разработка биотехнологических методов получения биологически активных полипептидов с использованием структур интеинов. В качестве объектов нами были выбраны полипептиды медицинского назначения: тимозин-ось глюкагон, оксинтомодулин и эпидермальный фактор роста человека. Конкретные задачи состояли в следующем:

- химико-ферментативный синтез генов целевых полипептидов;

- создание штаммов-продуцентов гибридных белков (ГБ), представляющих

собой гибрид интеина (мини-интеина) и целевого полипептида;

- выделение и очистка рекомбинантных ГБ;

- подбор условий эффективного автокаталитического расщепления ГБ;

- выделение целевых полипептидов с чистотой не менее 98 %;

Научная новизна. В результате выполненной работы были получены высокоэффективные штамм-продуценты ГБ, представляющих собой гибриды интеина (мини-интеина) и тимозина-аь глюкагона, оксинтомодулина и эпидермального фактора роста человека. Разработан эффективный способ

переключения сплайсинга интенна See VMA на авто каталитическое расщепление за счет действия ионов цинка. Минн-интеин Ssp DnaB модифицирован для получения белков (пептидов) содержащих N-концевой серин. Исследовано влияния интеиновой части гибридного белка на рефолдинг целевого полипептида на примере эпидермального фактора роста человека. Осуществлено масштабирование получения глюкагона человека.

Практическая ценность работы. В настоящее время в медицинской практике все большее применения находят полипептидные препараты. Практически все эти препараты получают методами полного химического синтеза. Как следствие, возникают трудности, связанные с необходимостью многократного использования защитных групп, применения сложных хроматографыческих методов очистки и утилизации отходов химического производства, а тенденции развития современной биоиндустрии требуют создания высокоэффективных экологически безопасных современных технологий производства.

Разработанный нами подход с использованием интеиновых систем экологически безопасен, т.к. в технологической схеме отсутствуют высоко токсичные и трудно утилизируемые реагенты. Такой подход является высоко эффективным, он позволяет получать до 11 мг субстанции с литра культуры. Отсутствие в технологической схеме стадии аффинной сорбции и протеолитического расщепления обусловливают низкую себестоимость конечного продукта.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на: Московской Международной Конференции «Биотехнология и Медицина» (Москва, 2006), III Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Всероссийской конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2005), 12-ом Европейском Биотехнологическом Конгрессе (Копенгаген, 2005), Международной конференции по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, поданы 3 заявки на получение патентов РФ.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, списка цитированной литературы (124 ссылки).

Диссертация изложена на 126 страницах, включает 4 таблицы и 44 рисунка.

Содержание работы

При разработке биотехнологических методов получения биологически активных полипептидов медицинского назначения с использованием структур интеинов нами в качестве объектов были выбраны: тимозин-сК|, глюкагон, оксинтомодулин и эпидермальный фактор роста человека.

1. Использование ннтеиновых систем для получения рекомбинантных поли пептидов с 1^-концевым серином на примере тимозина-а1

Белковый сплайсинг представляет собой посттрансляционный процесс, в результате которого из белка-предшественника удаляется внутренний фрагмент полипептидной цепи (интеин), а последовательности, фланкирующие интеин с обеих сторон (экстеины), лигируются с образованием пептидной связи (рис. 1). Процесс является авто каталитическим и не требует присутствия каких-либо кофакторов или ферментов.

Х-экси-инЗ

Х-экси-ин

О-Ы пороги рнфи КЛ ШI я, гидролиз сукшшимида

Рис. 1 Схема механизма белкового сплайсинга.

Механизм белкового сплайсинга выглядит следующим образом (на примере See

VMA-интеина):

1) Образование линейного эфирного интермидиата за счет N-0 или N-S ацильноП перегруппировки на N-конце сплайсируемой области.

2) Формирование разветвленного эфирного интермедиата посредством нуклеофильной атаки остатка Cys (Ser, Thr) С-концевой области расщепления на линейный эфирный интермедиат.

3) Циклизация С-концевого остатка аспарагина, сопряженная с отщеплением разветвленного эфирного интермедиата и вырезанием интеина.

4) Спонтанный гидролиз аминосукцинимидного остатка и перегруппировка межэкстеиновой эфирной связи в более стабильную амидную связь.

Применение векторных систем на основе интеина See VMA. Искусственный ген тимозина-al синтезировали химико-ферментативным способом из перекрывающихся олигонуклеотидов с последующей амплификацией при помощи ПЦР.

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-TCC-GAT-GCT-GCG-GTG-GAC-ACA-TCC-TCT-GAA-ATT-ACA-ACG-AAA-

Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH

GAT-CTG-AAA-GAA-AAG-AAA-GAA-GTT-GTG-GAA-GAG-GCT-GAG-AAC

ТИМОЭИН-Oi

Синтетический ген клонировали в экспрессионныЙ вектор pTYBl 1, находящийся под контролем Т7 промотора. В результате был получен продуцент ER2566/pERThyml. Клетки продуцента культивировали при 37°С, затем после добавления ИПТГ культивирование продолжали еще 14-16 ч. при 14°С. В таких условиях роста продуцента гибридный белок (ГБ) выделялся в растворимой форме. Однако в лнзате клеток при этом обнаруживали также еще один продукт - интеин, в количестве до 40% от ГБ (рис. 1 и 2). Процесс сплайсинга ГБ происходил не только в процессе роста продуцента, но и в ходе дальнейшего выделения цитоплазматической фракции, при последовательной ультразвуковой обработке. При этом доля продуктов сплайсинга возрастала до 50-70% от ГБ (рис. 2).

Процесс белкового сплайсинга представляет собой каскад обратимых реакций переэтерификации, а на последнем этапе циклизацию Asn и высвобождение разветвленного интермедиата. Изменение скорости одной из реакций переэтерификации способно привести к автокаталитическому расщеплению, исключая реакцию лигирования экстеинов. Из литературных данных известно, что соли Zn2+ ингнбируют ферментативные реакции, в частности транс сплайсинг

интеина Ssp DnaE. В связи с этим мы решили изучить влияние солей Zn2+ на цис-сплайсинг интеина See VMA.

Исследование влияния различных концентраций хлорида цинка (1 - 10 мМ) на степень преждевременного расщепления гибридного белка в процессе роста клеток продуцента показало, что оптимальной является концентрация 2-4 мМ (рис 2). Увеличение концентрации хлорида цинка приводило к резкому снижению плотности культуры и количества ГБ, уменьшение же концентрации приводило к значительному увеличению количества продуктов сплайсинга.

Рис. 2 Влияние концентрации ZnCh на уровень биосинтеза гибридного белка и колнчествво продуктов сплайсинга в процессе культивирования продуцента.

Р1 - процентное отношение количества продукта сплайсинга (интеина) к исходному гибридному белку.

Р2 — процентное отношение продукции гибридного белка к суммарному белку клетки.

Чтобы избежать преждевременного расщепления ГБ в буферах при разрушении клеток, а также растворах для хроматографии и инициации расщепления мы использовали 1-2 мМ хлорид цинка, причём рН всех буферов не превышал 7,5 во избежание выпадения гидрооксида цинка (рис. 3).

1 2345« 7 89

•к»

А Б

Рис. 3 SDS-электрофорез в 10% ПААГ.

А - гибридный белок, представляющий собой N-конце вой экстеин-Зсе VMA интеин-тимозин-cti Б — продукт автокаталитического расщепления (сплайсинга) интеин See VMA, остальные продукты детектировали при помощи ВЭЖХ 1 - стандарты молекулярных масс 10-200кДа

2 - 4 - тотальные лизаты клеток продуцента Е, coli ER2566/pERThyml, индуцированных ИПТГ в присутствии различных концентраций ZnCh. 2 - в присутствии 10 мМ ZnCh. 3- в присутствии 1-3 мМ ZnCh. 4 - в отсутствие ZnCh.

5- б - объединенный супернатант после ультразвуковой дезинтеграции клеток продуцента Е. coli ER2566/pERThyml, индуцированных ИПТГ в присутствии 1-3 мМ ZnCh. 5 - сначала в буфере А2 (50 мМ Трис-НС1, 200 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, pH 10,0) и затем, в буфере A4 (буфер А2, содержащий 1% Тритон Х-100). 6 - сначала в буфер>е A3 (50 мМ Трис-НС1, 200 мМ NaC), 2 мМ ZnCb, pH 10,0) и затем, в буфере А5 (буфер A3, содержащий 1% Тритон Х-100).

7 - 9 - продукты расщепления на колонке с хитиновым сорбентом в буфере Б1 (50 мМ Трис-НС1, 200 мМ NaCl, 0,5 мМ ZnCh, pH 7,0), содержащем 0.5 мМ ZnCh. 7 - нулевой момент времени. 8 - инкубация 18 ч при 25°С, 9 - инкубация 18 ч при 25°С в буфере Б2 (буфер Б1, содержащий 50 мМ ДТТ).

При изучении авто каталитического расщепления показано, что максимальный выход целевого пептида и минимальный - продуктов сплайсинга наблюдается при отсутствии в буфере для расщепления ДТТ и наличии 0,5 мМ хлорида цинка (рис. 4). В то же время, если в растворе присутствовали одновременно ДТТ и хлорид цинка, то происходило постепенное накопление продукта сплайсинга (рис. 4).

л Б , Рис. 4 Хроматограф« чески и анализ

полнпептидмых продуктов

автокаталнтнческого расщепления

гибридного белка IntThym.

А - Анализ продуктов расщепления в буфере Б2. Б - Анализ продуктов расщепления в буфере Б1. 1 — тимозин-aj. 2 - N-экстеиновый фрагмент. 3 - продукт сплайсинга. Хроматографию проводили на колонке Prosphere С18 300А 5a (Alltech) в градиенте 1080% ацетонитрила с 0,1% ТФУ со скоростью 0,5 мл/мин.

И а и i* * » " я

ц » и_^ р_к_

Отрицательный эффект ДТТ можно объяснить исходя из механизма белкового сплайсинга. Образующийся на первой стадии реакции интермедиат - тиоэфир N-экстеина и первого Cys интеина - атакует ДТТ и образующийся при этом активированный эфир взаимодействует с гидроксильной группой N-концевого Ser тимозина-cí] с образованием разветвленного интермедиата, претерпевающего дальнейшую внутримолекулярную перегруппировку в продукт сплайсинга.

Схема с использованием интеина See VMA и авто каталитическим расщеплением в присутствии хлорида цинка позволяет получить в лабораторных условиях до 2-3 мг тимозина-ct]. Основным недостатком данной схемы является необходимость очистки целевого полипептида от продукта сплайсинга и N-концевого экстеина.

Применение векторных систем на основе мутантного интеина Cys(l)/Ala(l) See VMA. В интеине See VMA Cys(l) играет ключевую роль на первом этапе белкового сплайсинга. Сульф гидр ильная группа Cysl атакует карбонильный атом углерода предыдущей аминокислоты. Образуется тетраэдрический интермедиат, содержащий тиазол иди новое кольцо. Последующая транс-этирификация и циклизация последнего Asn интеина приводят к образованию продукта сплайсинга. Замена Cysl на Alai должна полностью предотвратить сплайсинг при сохранении способности к С-терминальному автокаталити чес кому расщеплению. Поэтому, мы осуществили сайт-направленный мутагенез Cys(l) на А!а(1) интеина See VMA.

Замену Cys(l) на А1а(1) в интеине See VMA вводили при помощи ПЦР с олигонуклеотидами ThymAla и ThymTer. Амплифицированные гены были клонированы по сайтам рестрикции Xho\ и ¿scoRI в экспрессионный вектор рЕТ23а+ (рис. 5).

5'- GGTGGTGAATTCTCCCTGGAGGGTGCCtTTGCCAAGGOT Thjrm Ala

5'- GATCCGAATTCTCCCTGGAGGGTTGCTTTGCCAAGGGThCChA. . . TTTTGTTTAACTTTAAGAAGG

AGATATACTTATGAAAATCGAAGAAGGT- SceVMA «нтекн- GCTTGGATCCCAGGTTGTTGTACAGAAC

TCCGAT\3CTGCGGTGGACACATCCTCTGAAATTACAACGAAAGATCTGAAAGAAAAGAAAGAAGTT GTGGAAGAGGC

CACCTTCTCCG

TGAOAACTAAGAATTCCTCGAGCCCGGGTG . . -3'

ACTCTTGATTGAGCTCGCC -5' ThyittT«r

Рис. 5 Схема сайт-направленного мутагенеза интеина See VMA, Жирным шрифтом показан ген тимозина- а ь курсивом - место мутации.

Продуцент Е. coli ER2566/pERThym2 культивировали при 37°С до оптической плотности культуры Deoo 0,6-0,7, затем, после добавления ИПТГ, культивирование продолжали еще 14-16 ч. при 14°С. Такие условия роста продуцента позволили получить гибридный белок в растворимой форме и без продуктов сплайсинга (рис. 6). После ультразвуковой дезинтеграции супернатант наносили на хитиновый сорбент и индуцировали авто каталитическое расщепление сменой буфера^/ (50 мМ Трис-НС1, 200 мМ NaCl, pH 10,0) на буфер БЗ (50 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 10 мМ ДТТ, pH 7,0). Степень расщепления ГБ при этом не превышала 10% тогда как для исходного интеина степень расщепления достигала 70% (рис. 6).

КДа \ ^ ^ ^ ® Рис. 6 Зов-электрофорез в 10% ПААГ.

^рр ч- А - гибридный белок, представляющий собой Ы-

концевой экстеин-(А1а(1))5се УМА интеин-тимозин-а[ 60 ^ д.. ; Б — продукт авто каталитического расщепления

гп ^НР 4Яр ' А1а(1)5с-е УМА интеин, остальные продукты

детектировали при помощи ВЭЖХ 40 . 1 - стандарты молекулярных масс 10-200кДа; 2-5

Б продукты расщепления на колонке с хитиновым 30 сорбентом: 2 — нулевой момент времени при 37 °С в

буфере Б4, содержащем 50 мМ ДТТ; 3 - инкубация 24 ч 25 — в буфере Б4 при 37 °С; 4 — инкубация 48 ч в буфере Б4

при 37 °С; 5 - инкубация 48 ч в буфере Б4 при 50 °С.

Следовательно, наличие Суэ1 в интеине играет существенную роль на стадии

циклизации Азп. Отсутствие цистеина могло бы заменить наличие в буфере для

расщепления повышенной концентрации тиольного реагента (ОТТ или МЕБЫД). Но

по экспериментальным данным увеличении концентрации тиольного реагента до

50мМ (буфер Б4\ 50 мМ Трис-НС1, 200 мМ КаС1, 50 мМ ДТТ, рН 7,0) не привело к

значительному увеличению степени расщепления. Повышение температуры в ходе

автокаталитического расщепления до 50°С вместе с 50мМ тиольного реагента

позволили увеличить степень расщепления до 15-20%. По-видимому, увеличение температуры увеличивает количество степеней свободы молекулы ГБ и как следствие обеспечивает доступ тиольного реагента в каталитический домен.

Схема с использованием интеина Ala(l) See VMA, несмотря на отсутствие продукта сплайсинга и N-концевого экстеина, не оправдала наших ожиданий т.к. степень расщепления оказалась крайне низкой. По-видимому, это связано с особенностью структуры интеина See VMA,

Создание и применение модифицированного мнни-ннтеина Ssp DnaB.

Мини-интеин Ssp DnaB в отличие от интеина See VMA обладает меньшим размером (~ ЗОкДа) из-за отсутствия эндонуклеазного домена. В мини-интеине SspdrtaB имеется также мутация Cysl/Alal, предотвращающая отщепление N-концевого экстеина и, как следствие, сплайсинг, но не оказывающая существенного влияния на отщепление С-концевого экстеина, причем авто каталитическое расщепление значительно ингибируется при pH > 8. Поэтому в дальнейшей работе в качестве белка носителя для тимозина-al мы использовали мини-интеин ÄpDnaB.

Ген тимозина-al амплифицнровали при помощи ПЦР с олигонуклеотидами DnaBl и DnaB2 и клонировали в экспрессионный вектор pTwinl, находящийся под контролем Т7 промотора. Продуцент Е. coli ER2566/pERThym3 культивировали при 37°С до оптической плотности культуры Обоо 0.6-0.7, затем после добавления ИПТГ культивирование продолжали еще 14-16 ч. при 14°С. Такие условия роста продуцента позволили получить гибридный белок в растворимой форме, но при этом он полностью претерпевал автокаталитическое расщепление. Предотвратить белковый сплайсинг можно, создав условия для агрегации ГБ в виде телец включения. Тем не менее, культивирование после индукции при 37 и 42 °С, а также смена штамма хозяина Е. colt ER2566 на Origami(DE3) дефектный по тиоредоксинредуктазе и глутатионредуктазе, не привели к накоплению ГБ в виде телец включения.

По литературным данным, в процессе белкового сплайсинга существенную роль при переносе протона на стадии циклизации аспарагина выполняет предпоследний His, замена которого может полностью ингибировать расщепление с С-конца интеина.

Поэтому мы осуществили сайт-направленный мутагенез предпоследнего His в интеине Ssp drtaB на Gin с олигонуклеотидами PrimDnaB и DnaBGln. Так же был введен сайтэндонуклеазы рестрикции £coRI (рис. 7).

5 *-GGTGGTTCTAGAAATAATTTTGTTTAAC PrimBnaB

TCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGAC AAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAG ACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGC TTCAAAACAACGGTAACAACGGTCTCGAACTGCGAGr- DnaB юшя-кнтвнн ~ AGACTGGAG TCGAAGAGGTTTTTGATTTGACTGTGCCAGGACCACATAACTTTG TCGC GAATGACATCATTGTACACAACGGA

CTTACTGTAGTAACAT GTCrTAAGG

AGAGCCATGGGCGGCCGCGAATTCC TCGAGGGCTCTTCС CTAGACCTAGGCGC - S ' Dn&BGln

Рис. 7 Схема сайт-направленного мутагенеза ннтеина Ssp (hiail.

Курсивом показано место мутации; сайты эндонуклеаз рестрикции подчеркнуты.

Амплифицированный ген модифицированного интеина Ssp dna В был клонирован по сайтам рестрикции ХЬа\ и BamYW в экспрессионный вектор рЕТ23Ь+. Затем в этот вектор был клонирован ген тимозина-al человека. Продуцент Е. coli ER2566/pERThym4 культивировали при 37°С до оптической плотности культуры Döoo 0.6-0,7, затем после добавления ИПТГ культивирование продолжали еще 6 ч. при 20°С. Такие условия роста продуцента позволили получить гибридный белок в растворимой форме, при этом в лизате клеток не наблюдалось продуктов автокаталитического расщепления. После ультразвуковой дезинтеграции супернатант наносили на хитиновый сорбент и уравновешивали буфером Б7 (50 мМ Трис-HCI, 200 мМ NaCl, pH 6,5), индуцируя автокаталитическое расщепление. После инкубации при 37°С 48 часов степень расщепления составила ~ 50%. Дальнейшее инкубирование не привело к значительному увеличению степени расщепления. Поэтому провести расщепление в растворе т.к при аффинной сорбции на хитиновом сорбенте возможно возникают стерические затруднения снижающие эффективность автокаталитического расщепления. Для чего ГБ предварительно очищали при помощи ионообменной хроматографии (рис 8). Затем фракции, содержащие очищенный ГБ объединяли и индуцировали авто каталитическое расщепление снижением pH до 7.0 и введением 2мМ MESNA. После инкубации при 37°С 48 часов степень расщепления составила ~ 70-75%.

Рис. 8 SDS-электрофорез в 13% ПААГ.

А - гибридный белок, представляющий собой (His/Gin) Ssp DnaB интеин-тимозин-Cti

Б - продукт автокаталитического расщепления (His/Gin) Ssp DnaB интеин, остальные продукты детектировали при помощи ВЭЖХ

1 - стандарты молекулярных масс 10-200кДа; 2 — 4 продукты расщепления на колонке с хитиновым сорбентом: 2 — нулевой момент времени при 37 °С, 3 -инкубация 12 ч при 37 °С, 4 - инкубация 48 ч при 37 °С, 5 —продукты расщепления в растворе, инкубация 48 ч при 37 °С

При сравнении трех способов получения тимозина-al (таблица 1) очевидно, что наиболее эффективным является последний способ с применением модифицированного мини-интеина Ssp DnaB. Такой подход применим для получения пептидов и белков с N-концевым серином или цистеином, что невозможно при использовании обычной TWIN системы вследствии сплайсинга ш vivo.

ER2566/ pERThyml ER2566/ pERThym2 ER2566/ pERThym4

% гибридного белка по отношению к суммарному белку клетки 30 30 45

% отношение продукта сплайсинга к гибридному белку при культивировании продуцента 5 • -

эффективность автокаталитического расщепления % 70 20 75

выход тимозина-а1 (% от теоретического) 30 5 40

выход тимозина-а1 (мг/(л культуры)) 3 0.5 11

Табл. 1 Сравнение эффективности штамм-продуцентов тимозина-а 1

2. Использование минп-ннтеина 55/? ОпаВ для получения рекомбииантных полипептидов с М-концевым гистидином

а. Получение рекомби на итого глюка гона. Искусственный ген глюкагона

синтезировали химико-ферментативным способом из перекрывающихся

олигонуклеотидов с последующей амплификацией при помощи ПЦР.

Н13-5ег-С1п-С1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-Зег-АБр-Туг-Зег-Ьуз-Туг-Ьеи-АБр-САТ-ТСТ-САС-ССС-АСС-ТТТ-АСС-АСС-САТ-ТАТ-АСС-ААА-ТАС-СТС-САС-

Зег-Агд-Агд-А1а-а1п-Агр-РЬе-Уа1-с1п-Тгр-Ьеи-Ме1:-Азп-ТЬг ТСТ-ССТ-ССС-ССС-САС-САТ-ТТС-СТа-САС-ТСС-СТС-АТС-ААС-АСС

глюкагон

Синтетический ген затем клонировали в экспрессионный вектор рТШ1Ы1, находящийся под контролем Т7 промотора, в результате был получен продуцент ВЬ21 (ОЕЗУрЕЯв!.

Для получения глюкагона человека были опробованы три различных способа.

По первому способу гибридный белок (ГБ), чтобы исключить стадию ренатурации (солюбилизации), получали в растворимой форме, для чего продуцент

E. coli BL21(DE3)/pERGl культивировали при 37°С до оптической плотности культуры Dóoo 0.6-0.7, затем добавляли ИПТГ и выращивали 14-16 ч. при 14°С. При этом до 30% ГБ агрегировало в виде телец включения, а растворимая часть ГБ претерпевала in vivo автокаталитическое расщепление на 25-35%.

В данном случае добавление в культуральную среду ZnCl2 вплоть до концентрации 5 мМ привело лишь к незначительному уменьшению степени расщепления in vivo. Ослабленное влияние ионов Zn+2 в случае модифицированного интеина DnaB возможно связано со значительно меньшей хелатирующей способностью аминокислотных остатков в области, ответственной за автокаталитическое расщепление, т.к. в отличие от интеина See VAL4, в этой структуре отсутствуют остатки Cys и Ser в этой области.

Затем растворимую фракцию наносили на хитиновый сорбент, изменив в буферах для разрушения и нанесения pH с рекомендованных 8 до 10-11, что позволило избежать автокаталитического расщепления в процессе нанесения на сорбент. После промывки 30 объемами буфера Al, расщепление индуцировали снижением до pH 5-6 за счет промывки 10 объемами буфера Б5 (50 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 2 мМ MESNA, pH 6,5).

Анализ пептидной фракции посредством обращено-фазовой хроматографии показал наличие посторонних пиков, не превышающих 3% от основного пика в области близкой к глюкагону. Дальнейший масс-спектрометрический анализ и С-концевое секвенирование показали, что эти пики обусловлены продуктами деградации глюкагона с С-конца, происходящей, по видимому, in vivo в процессе культивирования. Основным продуктом деградации является глюкагон без двух С-концевых аминокислот.

Чтобы минимизировать этот нежелательный эффект нами был проведен сравнительный анализ ряда штаммов Е. coli (BL21(DE3), JM109, ER2566, Origami(DE3), в условиях обеспечивающих эффективную экспрессию гибридного белка в тела включения (37 °С 4-6 часов). Оказалось, что наименьшее образование продуктов деградации (менее 0,2%) происходит в штаммах ER2566 и Origami (в штамме Origami несколько ниже, чем в штамме ER2566). Продуктивность штаммов ER2566 и BL21(DE3) была почти в 2 раза выше, чем Origami, и составила в среднем 150 мг ГБ на 1 литр культуры, к тому же из ER2566 удаётся получить более чистые тельца включения (Рис. 9), поэтому, для наработки глюкагона мы использовали штамм Е. coli ER2566.

□ Колмчес тво гцодухтоя деградации тюийгона С С-КОНЦА ■~"Отнодмгт<тьно —основного пина

продуктов деградации глкжагона в различных штаммах Е. coli

Рис. 9 Количество гибридного белка и

Таким образом, чтобы избежать преждевременного расщепления ГБ и снизить количество продуктов деградации, нами был разработан второй способ, согласно которому продуцент Е. coli ER2566/pERGl культивировали при 37°С до оптической плотности культуры D600 0.6-0.7, затем добавляли ИПТГ и выращивали 4 ч. при 37°С. При этом почти весь ГБ агрегировал в виде телец включения, а его суммарное количество возросло в 2 раза по сравнению с первой схемой. Это позволило практически полностью избежать преждевременного авто каталитического расщепления.

Последовательной промывкой телец включения сначала 2 раза буфером AI, а затем 2 раза буфером A4, удалось получить практически чистый гибридный белок. Солюбилизацию телец включения проводили буфером Г (50 мМ трис-HCl, pH 12,5, 2 М мочевина, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF), при этом тельца включения полностью растворялись. Затем разбавляли буфером AI, до концентрации детергента 0,1 - 0,5 М, наносили на хитиновый сорбент и индуцировали авто каталитическое расщепление аналогично первому способу (рис. 10). Анализ пептидной фракции посредством обращено-фазовой хроматографии показал наличие посторонних пиков, не превышающих 0.2 % от основного пика в области близкой к глюкагону.

Считается, что тиольные реагенты не оказывают влияния на С-концевое расщепление модифицированного интеина DnaB, однако в ходе экспериментальной работы нами было показано, что максимальный выход целевого пептида наблюдается при наличии в буфере небольшого количества тиольного реагента (MESNA, DTT и др.) порядка 1 мМ (рис. 10). Причем его влияние сводится как к увеличению скорости, так и степени расщепления. Температура не вносит существенного вклада в степень расщепления, но влияет на время автокаталитического процесса.

М)а

Я)

30 ¡5 10

12345678 9 10 11

4ЙИ.

Гнс. 10 Электрофоре грамма продуктов автокаталитнческого расшсплсния гибридного белка 1тС1 в различных условиях.

А - гибридный белок 1п1С1

Б - продукт автокаталитического расщепления белка 1шС1; остальные продукты детектировали при помощи ВЭЖХ

1 — стандарты молекулярных масс 10-200 кДа .

2 - 4 - автокаталитнческое расщепление гибридного белка на хитиновом сорбенте: 2- 12 ч после нндукцнп расщепления, 3- 24 ч, 4- 36 ч.

5 - 7 - автокаталитическое расщепление гнбридного белка на хитиновом сорбенте в присутствии 2мМ МЕЭЫА: 5- 12ч после индукции расщепления, б- 24 ч, 7- 36 ч.

8-9 автокаталитическое расщепление гибридного белка в растворе: 8 - 8-12 ч после индукции расщепления, 9 - 9-24 ч,

10 - И автокаталитнческое расщепление гнбридного белка в растворе в присутствии 2 мМ МЕ5ЫА: Ю-12 ч после индукции расщепления, 11-24 ч.

Проведение автокаталитического расщепления по первым двум способам проводилось непосредственно на хитиновом сорбенте и ни в одном эксперименте не позволило добиться выхода превышающего 70%. Это побудило нас провести расщепление в растворе, по третьему способу, а именно после солюбилизацни телец включения буфером Г> при котором тельца включения полностью растворялись мы снизили концентрацию детергента до 0,1-0,5 М (за счет разбавления) и изменили рН до 6,5. Такие условия проведения реакции позволили добиться 75-80% расщепления, в отличие от расщепления на хитиновом сорбенте, возможно благодаря снятию конформационных затруднений (рис.11).

На основе третьего способа нами был разработан лабораторный регламент получения субстанции глюкагона с выходом 20,6 мг на 1 литр культуры (36% от теоретического) чистотой не менее 98 % (рис. 10).

Рис. 11. Хроматографнческий анализ

полипептидных продуктов автокаталнтнческого расщеплення гибридного белка после очистки с помощью ВЭЖХ. 1 - глкжагон. Хроматографию проводили на колонке Prosphere С18 ЗООА 5u (Alltech) в градиенте 10-80% ацетонитрила с 0,1% ТФУ со скоростью 0,5 мл/мин.

Ч И II и и ы ы и я .11 И1| |и »I.

б. Получение рекомби на итого океннтомодулиня. Искусственный ген оксинтомодулина синтезировали химико-ферментативным способом из перекрывающихся олигонуклеотидов с последующей амплификацией при помощи ПЦР.

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala~ CAT-TCT-CAG-GGC-ACG-TTT-ACC-AGC-GAT-TAT-AGC-AAA-TAC-CTG-GAC-TCT-CGT-CGC-GCG-

Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-Ile~Ala-Ter CÄG-GAT-TTC-GTG-CAG-TGG-CTG-ATG-AAC-ACC-AAA-CGC-AAC-AAA-AAC-AAC-ATT-GCG-TAA

оксннтомодулнн

Синтетический ген клонировали в вектор pTWINl, находящийся под контролем Т7 промотора, в результате был получен продуцент ER2566/pEROxm.

Продуцент Е. coli ER2566/pEROxm культивировали при 37°С до оптической плотности культуры Döoo 0,6-0,7, затем добавляли ИПТГ и выращивали 4 ч. при 37°С. При этом почти весь ГБ агрегировал в виде телец включения. Последовательной промывкой телец включения сначала 2 раза буфером AI, а затем 2 раза буфером A4, удалось получить практически чистый гибридный белок. Солюбилизацию телец включения проводили буфером Г, при котором тельца включения полностью растворялись снижали концентрацию детергента до 0,1-0,5 М (за счет разбавления) и изменили pH до 5-6. Такие условия проведения реакции позволили добиться - 90% расщепления, в отличие от расщепления на хитиновом сорбенте (рис. 12).

кИа1 2 3

100

50 40

5 6 7 8

в?

Рис. 12. Электрофореграмма продуктов автокаталнтнческого расщеплении гнбрндного белка 1пЮхт в различных условиях.

А - гибридный белок 1пЮхт

Б - продукт автокаталитического расщепления белка 1пЮхт; пептидный продукт (оксинтомодулии) детектировали при помощи ВЭЖХ.

1 - стандарты молекулярных масс 10-200 кДа. 2 - тотальный клеточный лизат клеток продуцента культивируемых по первой схеме. 3 - тотальный клеточный лизат клеток продуцента, культивируемых по второй и третьей схемам. 4 - тельца включения после вссх стадий отмывки. 5 - 6 - автокаталитнческое расщепление гибридного белка иа хитиновом сорбенте: 5- 24 ч после индукции расщепления; 6 - 36 ч. 7 - 8 - автокаталитнческое расщсплснпе гибридного белка в растворе: 7-12 ч после индукции расщепления; 8 - 24 ч.

В результате был получен оксинтомодулии человека с выходом до 6% относительно суммарного белка клетки и чистотой более 95% (рис. 13).

Рис. 13 Хроматограф н чсскнй анализ поли пептидных продуктов

автокаталнтического рлсшсмлсини

гибридного белка 1п)Охш

1 — оксинтомодулии. Хроматографию проводили на колонке РгоэрЬсге С18300А 5и (АШесЬ) в градиенте 10-80% ацетоннтрнла с 0,1% ТФУ со скоростью 0,5 мл/мни.

,„ а л... а* ...л

3. Применение мннн-интеина Язр РпаВ для получения рекомбннаитого эпидермлльного фактора роста человека и исследование влияния интеиновой части гибридного белка на рефолдинг целевого поли пептида.

Ген эпидермального фактора роста человека был ранее синтезирован в нашей лаборатории. В настоящей работе он был амплифицирован с вектора pETEgf при помощи ПЦР с праймерами ИЕСРмт и ЬЕСР-1ег,

5'-ССТССТТССТСТТССААСААТТСТСАСТСТСААТССССА Ь£вГ-1гЛ

5'-вСТРСТСйАТССТСААСССАСТТСССАССАТТТС ЬЕвР-Ьег

Синтетический ген клонировали в экспрессионный вектор рТиЧЬИ, находящийся под контролем Т7 промотора, по соответствующим сайтам

рестрикции. Таким образом, был создан штамм-продуцент Е. coli ER2566/pER-hEGF в котором при индукции образуется гибридный белок (Int-hEGF), содержащий на N-конце модифицированный интеин DnaB, включающий хитин-связывающий домен, а на С-конце - hEGF, При экспрессии такого гибридного гена большая часть белка агрегировала в виде тел включения. На рис. 14 представлена электрофореграмма продуктов биосинтеза гибридного белка Int-hEGF и его авто каталитического расщепления.

Рис. 14 Электрофореграмма гнбрндного белка Int-hEGF.

1 - стандарты молекулярных масс 10-100 кДа. 2 - Тотальный лизат клеток продуцента Е. coli ER2566/pER-hEG F. 3 - Супернатант после отделения телец включения. 4 - Элюат после сорбции гибридного белка на хитиновом сорбенте. 5 - Гибридный белок, сорбированный на хитиновом сорбенте. 6 - Продукты расщепления гибридного белка. А - гибридный белок Int-hEGF. В - интеин Ssp DnaB (Int).

Далее нами были испробованы две схемы получения целевого продукта, приведенные на рис. 15 Принципиальное отличие, между которыми, заключается в разделении (1-ая схема) или совмещении (2-ая схема) следующих процессов: рефолдинга гибридного белка и ренатурации hEGF с образованием правильных S-S-связей за счет окисления свободных SH групп кислородом воздуха. Под термином рефолдинг в данном случае подразумевается образование растворимого гибридного белка, способного к автокаталитическому расщеплению, а под термином ренатурации белка - образование правильно свернутого, с замкнутыми S-S-связями hEGF, как в составе гибридного белка, так и в свободном состоянии.

luu

3U 3S 2Ü

W * ■> t .

Тела включения

I I

СВП1

Пнтгнн

Хитин

АН 73

^и ^н ^н ^н Ингенн | ЬЕвГ т ¿н..... зи

,?м . . Г ?н г

МЕСГ

. ... I ... 4

Аап 229 а к Дм

X 2а ч

1 т— ?

Иптсин ьеср

А>п 226 ^-1

Им 11-мн

1б

а«п г» 1а !

: 26

ЭН ^н ЬЕОР :

Хшнм

II 1111-М II

—^ . Г—I

ьеор

Лап 22« Ь-4

»Н

1г

ИГ

ХМТНМ :

ИнП'ни

2а

"'1 + Дал 22«

I „

—?..... Т"

песр

1—4 '

ЬЕвГ |

*-4........

—! ' ?—?

ЬЕОР '

I-1

Рис. 15 Схемы превращения гибридного белка 1п(-ЬЕСГ, исиользоваиныс для получении И Ев Г.

I - солюбилизация гибридного белка. 1а - аффннноя сорбция на хитиновом сорбенте. 16 -расщепление на хитиновом сорбенте. 1в - элюироваппе восстановленного иЕСР, 1г - релатурацня (с образованием Э-З- связей) целевого продукта. 2а - ренатурацня (с образованием правильных Б-5-е в язей в ЬЕСР) гибридного белка в растворе. 26 - нанесение па хитиновый сорбент. 2в -расщепление на хитиновом сорбенте. 2г - элюироваппе целевого продукта ЬЕСР.

Первой стадией процесса для обеих схем была отмывка тел включения от небелковых примесей и солюбилизация гибридного белка в буфере ВЗ, содержащем 6 М мочевину и 50 мМ МЕ5ЫА (рис. 15.1).

По первой схеме (рис. 15) сначала осуществлялся рефолдинг гибридного белка за счет снижения концентрации солюбилизирующего агента (мочевины) на фоне высокого содержания тиольного реагента (МЕБЫА). Затем следовало нанесение на хитнновый сорбент (рис. 15, 1а) и рН-индуцируемое авто каталитическое расщепление, так же на фоне высокой концентрации тиольного реагента (рис, 15, 16). Элюция с колонки (рис. 15, 1в) и ренатурацня в растворе с образования Б-Б-связей целевого продукта — рекомбинантного эпидерм ал ьного фактора роста (рис. 15, 1г). Оказалось, что при ренатурации совмещенной с автокаталитическим расщеплением на хитиновом сорбенте образуется два основных продукта - нативный ЬЕСР и неправильно замкнутый ЬЕОР (рис. 16 I). После их элюирования с колонки при добавлении в смесь тиольного реагента до концентрации 1 мМ происходил медленный и неполный

переход неправильно замкнутой формы целевого полипептида в нативную (рис. 16, II), в то время как при денатурации элюата с восстановлением дисульфидных связей (рис. 16, III) и последующей ренатурацией на фоне 0,25 мМ МЕ5ИА наблюдалось образование только нативного полипептида (рис. 16, IV-V).

Рис. 16 Хроматограф и чес кий анализ и нтермед патов ЬЕСР.

I - интермедиа™ ЬЕвР полученные при элюировании с колонки после инкубации гибридного белка в буфере О, II - интермедиаты ЬЕвР после инкубирования в присутствии 1 мМ МЕЗЫА в течении 24 ч, III -восстановленный ре ком би н антн ы й ЬЕйР после колонки РБЮ, IV- рефолдинг ЬЕОР в буфере Е в течении 12 ч., V - рефолдинг ЬЕСР в буфере Е в течении 24 ч. А - нативный ИБОЕ. В - промежуточный и нтермед и ат ЬЕйР, С - восстановленный ЬЕОР. Хроматографию проводили на колонке РгозрЬеге С18 ЗООА 5и (А1ИесЬ) в градиенте 10-80% ацегонитрила с 0,1% ТФУ со скоростью 0,5 мл/мин.

По второй схеме перед нанесением на хитиновый сорбент осуществляли полную ренатурацию гибридного белка. При этом полное окисление БН-групп ЬЕСР кислородом воздуха происходило за 48 ч. Чтобы ингибировать авто каталитическое расщепление гибридного белка рефолдинг проводили при рН 10 и 4 °С (рис. 15, 2а). Увеличение температуры, независимо от значения рН раствора, приводило к автокаталитическому расщеплению гибридного белка. Затем следовало нанесение на хитиновый сорбент (рис. 15, 26) и рН-индуцируемое автокаталитическое расщепление в отсутствие тиольного реагента (рис. 15, 2в). Элюируемый целевой продукт представлял собой нативный ЬЕСР (рис. 15, 2г).

Учитывая результаты, полученные при выделении рекомбинантного ЬЕСР по двум схемам, можно предположить, что интеиновая часть (&р с1паВ) гибридного белка не влияет на рефолдинг ЬЕСР, а образование стабильного интермедиата с неправильно замкнутой формой при ренатурации на аффинном колонке возникает из-за стеричеких затруднений, вызванных хитиновым сорбентом.

Таким образом, вторая схема представляется более целесообразной, поскольку обеспечивает полную ренатурацию ЬЕОР в составе гибридного белка 1М-ЬЕСР и прямое выделение нативного полипептида с колонки с хитиновым сорбентом. Первая схема является более общей и может быть использована в случае негативного влияния последовательности интеина на рефолдинг целевого продукта в составе гибридного белка, при этом авто каталитическое расщепление

можно проводить не только на фоне высокой концентрации тиольного реагента, но и в присутствии денатурирующего агента (мочевины вплоть до 2 М).

Рис. 17 Хроматографичсскнн

¡»нализ фракции после хитинового сорбента по второй схеме.

I- рекомбинантпый hEGF.

| Хроматографию проводили на колонке

Prosphere С18 300А 5u (Alltecli) в градиенте 10-80% ацетонитрила с 0,1 % ТФУ со скоростью 0,5 мл/мпн.

Результатом работы явилось получение ЬЕвР (рис. 17) с выходом до 5% относительно суммарного белка клетки и чистотой более 98%.

Идентификацию полипептидных продуктов, получаемых при выделении тимозина-а1, глюкагона, оксинтомодулина и эпидерм ал ьно го фактора роста человека проводили с помощью МАЬОГ-масс-спектрометрии (табл. 2). Структура рекомбинантных пептидов была подтверждена определением С-концевой последовательности аминокислот.

Объект Расчетное значение массы Экспериментальное значение массы

Тимозин-а1 3065 3064

Оксинтомодулин 4421 4424

Глюкагон 3482 3481

Полностью восстановленный эп ядер мал ьный фактор роста человека 6222 6223

Эпидермальный фактор роста человека после ренатурации 6216 6217

Табл. 2 Данные MALDI-масс-спектрометрпческого анализа.

Выводы

1. Осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование в E.coli в составе экспрессионных векторов pTYB 11, TWIN1 искусственных ДНК, кодирующих пептиды медицинского назначения: тимозин-al, глюкагон, оксинтомодулин и эпидермальный фактор роста человека.

2. Разработаны подходы к получению рекомбинантных полипептидов содержащих N-концевой серин (гистидин) с использованием систем белкового сплайсинга.

3. Созданы штамм-продуценты ER2566/pER-Thym 1; ER2566/pER-Thym2; ER2566/pER-Thy m 3; ER2566/pER-Gl; ER2566/pER-Oxm; ER2566/pER-hEGF и оптимизированы условия ферментации, обеспечивающие высокий уровень продукции следующих рекомбинантных белков: гибриды интеинов See VMA, See VMA(Cys/Ata) и Ssp DnaB(GIn) с тимозином-al человека, гибриды интеина Ssp DnaB с глюкагоном, оксинтомодулином и эпидермальным фактором роста человека.

4. Разработан Zn-зависимый способ переключения сплайсинга See VMA интеина на автокаталитическое расщепление с получениемтимозина-al,

5. Исследован процесс ренатурации эпидермального фактора роста человека в составе гибридного с интеином Ssp DnaB белка. Показана независимость этого процесса от структуры интеиновой части.

6. Разработан лабораторный регламент получения рекомбинантного глюкагона человека.

7. Получены опытные партии тимозина-al, глюкагона, оксинтомодулина и эпидермального фактора роста человека.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1) Roman S. Esipov, Vasilv N. Stepanenko. Alexandr I. Gurevich, Larisa A. Chupova and Anatoly I. Miroshnikov / Production and purification of recombinant human glucagon overexpressed as intein fusion protein in Escherichia coli / PEPT Lett., 2006, 13(4), 343347.

2) Бейрахова K.A., Костромина M.A.. Степаненко B.H., Есипов P.C. / Использование системы белкового сплайсинга для одностадийного выделения рекомбинантного ЭРФ / Московская Международная Конференция Биотехнология и Медицина, тезисы докладов и стендовых сообщений, 2006, С. 60

3) Костромина М.А., Бейрахова К.А., Степаненко В.Н., Есипов P.C. / Рекомбинантный оксинтомодулин - потенциальный препарат для лечения ожирения / Московская Международная Конференция Биотехнология и Медицина, тезисы докладов и стендовых сообщений, 2006, С. 613

4) Степаненко В.Н. / Получение рекомбинантных полипептидов с использованием системы белкового сплайсинга / Ш Московский Международный Конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития, тезисы докладов и стендовых сообщений, 2005, т.1,С. 150

5) Степаненко В.Н.. Чувиковский Д.В., Есипов P.C., Гуревич А.И., Мирошннков А.И. / Биотехнология рекомбинантных полипептидных препаратов медицинского назначения / Всероссийская конференция «Фундаментальные науки — медицине» 4-8 сентября 2005, тезисы докладов и стендовых сообщений, С, 54

6) Roman S. Esipov, Vasilv N. Stepanenko. Anatoly I, Miroshnikov / Production recombinant human thymosin-al overexpressed as intein fusion protein in E. coii / J. Biotech. Abstracts 12. European Congress on Biotechnology, 2005, S38

7) Есипов P.C., Гуревич А.И., Степаненко В.Н.,. Чупова Л.А., Чувиковский Д.В., Мирошников А.И. / Рекомбинантный тгшозин-al / Биоорган, химия, 2004, Т.30, №5, С.481-486.

8) Есипов P.C., Степаненко В.Н.. Чупова J1.A., Чувиковский Д.В., Гуревич А.И., Мирошников А.И. / Рекомбинантный тимозин-al / Международная конференция по физико-хшшческой биологии, посвященная 70-летию со дня рождения Ю.А. Овчинникова, тезисы докладов и стендовых сообщений, 2004, С.35.

Заказ N9 151/10/06 Подписано в печать 17.10,2006 Тираж 100 экз. Усл. п.л, 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 \vww.cfr.ra ; е-пшИ: ¡п/о@с/г. г и

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степаненко, Василий Николаевич

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Глава 1.

Интеины: механизм, распространение, эволюция и применение.

1.1. Введение.

1.2. Особенности первичной структуры интеинов.

1.3 Механизм белкового сплайсинга.

1.3.1 Канонический механизм белкового сплайсинга.

1.3.2 Белковый транс-сплайсинг.

1.3.3 Автопроцессинг белков Hedgehog семейства.

1.3.4 Белковый сплайсинг в интеинах, содержащих нетипичные аминокислоты в консервативных доменах.

1.4 Факторы, влияющие на реакцию белкового сплайсинга.

1.5 Эндонуклеазные домены интеинов. 28 1.5.1 Особенности первичной структуры. 28 1.5.2. Хоуминг интеинов.

1.6 Распространение и эволюция интеинов.

1.7 Применение белкового сплайсинга в биотехнологии.

1.7.1 Экспрессионные системы на основе интеинов для очистки и модификации рекомбинантных белков.

1.7.2 Реакция лигирования синтезированных белков.

1.7.3 Белковый транс-сплайсинг и применение составных интеинов в биотехнологии.

1.7.4 Применение интеинов для посттрансляционной активации белков. 47 1.7.5. Перспективы применения интеинов для очистки рекомбинантных белков и пептидов в промышленных масштабах.

Глава 2.

Применение интеиновых систем для получения рекомбинантных полипептидов.

2.1 Введение.

2.2 Использование интеиновых систем для получения рекомбинантных полипептидов с N-концевым серином на примере тимозина-al.

2.2.1 Применение векторных систем на основе See VMA интеина.

2.2.2 Применение векторных систем на основе мутантного Cys(l)/Ala(l) See VMA интеина.

2.2.3 Создание и применение модифицированного Ssp DnaB мини-интеина.

2.3 Использование Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантных полипептидов с N-концевым гистидином. 69 2.3.1. Применение Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантого глюкагона. 69 2.3.2 Оптимизация третьего способа получения глюкагона.

2.3.3 Применение Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантого оксинтомодулина. 82 2.4 Применение Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантого эпидермального фактора роста человека и исследование влияния интеиновой части гибридного белка на рефолдинг целевого полипептида.

Глава 3.

Материалы и методы.

3.1. Реактивы.

3.2. Ферменты.

3.3. Материалы.

3.4. Препараты.

3.5. Олигодезоксирибонуклеотиды.

3.6. Бактериальные штаммы.

3.7. Плазмидные вектора.

3.8. Лабораторное оборудование.

3.9. Буферы и растворы.

3.10. Методы.

3.10.1. Электрофорез белков в ПААГ.

3.10.2. Приготовление компетентных клеток и их трансформация.

3.10.3. Определение концентрации белка.

3.10.4. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.

3.10.5. Отбор рекомбинантов при помощи гибридизации на нитроцеллюлозных мембранах.

3.10.6. Секвенирование плазмидной ДНК по методу Сенгера.

3.10.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

3.10.8. Амплификация ДНК in vitro.

3.10.9. Извлечение ДНК из геля.

3.10.10. Молекулярное клонирование.

3.10.11. Выделение гибридного белка в растворимой форме.

3.10.12. Расщепление гибридного белка на хитиновом сорбенте.

3.10.13. Получение гибридного белка в виде телец включения.

3.10.14. Солюбилизация телец включения.

3.10.15. Расщепление гибридного белка в растворе.

3.10.16. Препаративное получение глюкагона.

3.10.17. Ренатурация и автокаталитическое расщепление hEGF. 110 Первая схема: 110 Вторая схема: 112 Выводы. 113 Благодарности. 114 Список литературы.

Список сокращений

Amp - антибиотик ампициллин

АТР - аденозин-5'-трифосфат

БисАА (BisAA) - бисакриламид

БСА (BSA) - бычий сывороточный альбумин

ГБ - гибридный белок

ТА1, Та1 -тимозин альфа

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия

ДТТ (DTT) - 1,4-дитиотриэтол

Ssp DnaB - DnaB геликаза из штамма РСС6803 Synechocystis sp.

See VMA - субъединица А вакуолярной АТФазы из Saccharomyces cerevisiae dNTP - 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат ddNTP - 2',3'-дидезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат

ИПТГ (IPTG) - изопропилтио-Р-Б-галактозид

MESNA - 2-меркаптоэтансульфоновая кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль pGEM-5Zf(") - неэкспрессионная плазмида pTYBl 1 - экспрессионная плазмида, содержащая интеин See VMA pTWINl - экспрессионная плазмида, содержащая интеин Ssp DnaB

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТЕМЕД - К,К,К',Ы'-тетраметилэтилендиамин

Трис - трис(гидроксиметил)метиламин ц-АМФ - циклический аденозин-5'-монофосфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ТВ - тела включения

МВР - мальтозо-связывающий белок

Hh - белки Hedgehog семейства

А.К. - аминокислота

А.О. - аминокислотный остаток

EPL - метод лигирования синтезированных белков

X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактопиранозид

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных полипептидов"

Получение рекомбинантных полипептидов 1-7 кДа в прокариотических системах, как правило, является довольно сложной задачей. Небольшие полипептиды являются доступной мишенью для клеточных протеаз ввиду отсутствия жесткой третичной структуры. Существует два способа избежать протеолитического расщепления: секреция целевого полипептида в культуральную среду и экспрессия в составе гибридного белка. В случае секреции целевого полипептида в культуральную среду возникает проблема полного отщепления лидерного пептида и концентрирования целевого полипептида из большого объема. В случае экспрессии целевого полипептида в составе гибридного белка основной проблемой становится селективное расщепление пептидной связи с отделением целевого пептида от белка носителя. В настоящее время разработан ряд схем, позволяющих решать эту задачу, в частности с использованием энтерокиназы, фактора X или TEV протеазы. Но это значительно увеличивает затраты на технологию и делает масштабирование экономически нецелесообразным.

Альтернативным решением является использование структур интеинов в составе гибридного белка. Интеины - это белки, способные к автокаталитическому выщеплению из структуры белка-предшественника и сопутствующему лигированию N- и С-фланкирующих белковых фрагментов, так называемых экстеинов [1, 2]. В настоящее время ряд интеинов коммерчески доступен, например, See VMA из Saccharomyces cerevisiae и Ssp DnaB из Synechocestis sp., используемых в настоящей работе.

Целью данной работы являлась разработка биотехнологических методов получения биологически активных полипептидов с использованием структур интеинов.

В качестве объектов нами были выбраны биологически активные полипептиды: тимозин-аь глюкагон, оксинтомодулин и эпидермальный фактор роста человека.

Глава 1.

Интеины: распространение, эволюция, автокаталитический механизм и применение.

1.1. Введение.

Белковый сплайсинг представляет собой посттрансляционный процесс, в результате которого из белка-предшественника удаляется внутренний фрагмент полипептидной цепи (интеин), а последовательности, фланкирующие интеин с обеих сторон (экстеины), лигируются с образованием пептидной связи (рис. 1) [2]. Внутренняя часть полипептида, удаляемая в результате белкового сплайсинга, получила название интеина, а наружные N- и С-концевые части - экстеинов.

Процесс является автокаталитическим и не требует присутствия каких-либо кофакторов или ферментов. Это отличает белковый сплайсинг от посттрансляционного процессинга.

Явление белкового сплайсинга было открыто более 10 лет назад практически случайно при исследовании экспрессии дрожжевого гена vmal, кодирующего субъединицу VMA1 вакуолярной АТФазы. Исследование степени гомологии данного гена у различных микроорганизмов неожиданно показало, что у других видов ген vmal кодирует белок с молекулярной массой около 70 кДа, тогда как у дрожжей - это белок с молекулярной массой 119 кДа. При этом для концевых последовательностей дрожжевого гена vmal была характерна высокая степень гомологии с аналогичными последовательностями в генах других микроорганизмов, а в центральной части гомология нарушалась. Частичная делеция в гене vmal у дрожжей приводила к прекращению синтеза полипептида с молекулярной массой 69 кДа, но не 119 кДа. Было выдвинуто предположение о том, что внутренняя аминокислотная последовательность из предшественника с молекулярной массой 119 кДа отщепляется на уровне синтезированного полипептида. Дальнейшие исследования полностью подтвердили эту гипотезу. Так, сдвиг рамки считывания в сегменте гена vmal, кодирующего центральную часть полипептида и отсутствующую в зрелом белке, приводил к прекращению синтеза белка на рибосомах из-за возникновения в мРНК новых терминирующих кодонов трансляции. Подобное не происходило, если бы центральная часть про-мРНК гена vmal удалялась в результате сплайсинга. Кроме того, скрининг клеточных лизатов антителами к центральной части полипептида, отсутствующей в зрелой субъединице, показал наличие белкового продукта с предсказанной молекулярной массой 50 кДа. Он присутствовал в количественном соотношении 1:1 к функционально активному УМА -полипептиду с молекулярной массой 69 кДа. Это указывало на то, что последовательность РНК центральной части гена транслируется на рибосомах и соответствующая часть полипептида-предшественника удаляется уже посттрансляционно. Эти, а также ряд других результатов, позволили утверждать - помимо альтернативного сплайсинга ДНК и сплайсинга мРНК существует третий вариант сплайсинга - белковый [1,3].

Изучение механизма белкового сплайсинга раскрыло чрезвычайно сложный автокаталитический процесс, который не требует ни кофакторов, ни вспомогательных ферментов. Важным аспектом белкового сплайсинга является то, что реакции лежащие в его основе встречаются и в других формах белкового процессинга: от расщепления пептидной связи до связывания с небелковыми субстратами. Некоторые из этих особенностей могут быть результатом сходящейся эволюции, но, по крайней мере, автопроцессинг белков семейства Hh является, бесспорно, эволюционно родственным белковому сплайсингу. Особо стоит отметить, что элементы белкового сплайсинга обнаружены только в одноклеточных организмах, где их распространение имеет все признаки паразитических генетических элементов, тогда как близко родственные белки семейства Hh обнаружены только у животных, где они выполняют крайне необходимую регуляторную функцию в раннем эмбриональном развитии. Понимание эволюции и функции интеинов осложняются тем, что большинство интеинов включает в себя эндонуклеазы рестрикции, что превращает интеины в своего рода паразитические элементы за счет горизонтального переноса интеин-кодирующих областей, возможно - даже между видами [2].

Хотя обнаружено только около 100 потенциальных случаев белкового сплайсинга (и множество интеиноподобных последовательностей, как способных, так и не способных к белковому сплайсингу), они встречаются на всех трех уровнях жизни (археа, бактерии и эукариоты) наводя на мысль о эволюционно древнем происхождении этих доменов [3].

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Степаненко, Василий Николаевич

Выводы

1. Осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование в E.coli в составе экспрессионных векторов pTYBll, TWIN1 искусственных ДНК, кодирующих пептиды медицинского назначения: тимозин-al, глюкагон, оксинтомодулин и эпидермальный фактор роста человека.

3. Созданы штамм-продуценты ER2566/pER-Thyml; ER2566/pER-Thym2; ER2566/pER-Thym3; ER2566/pER-Gl; ER2566/pER-Oxm; ER2566/pER-hEGF и оптимизированы условия ферментации, обеспечивающие высокий уровень продукции следующих рекомбинантных белков: гибриды интеинов See VMA, See VMA(Cys/Ala) и Ssp DnaB(Gln) с тимозином-al человека, гибриды интеина Ssp DnaB с глюкагоном, оксинтомодулином и эпидермальным фактором роста человека.

4. Разработан Zn-зависимый способ переключения сплайсинга See VMA интеина на автокаталитическое расщепление с получением тимозина-al.

6. Разработан лабораторный регламент получения рекомбинантного глюкагона человека.

7. Получены опытные партии тимозина-al, глюкагона, оксинтомодулина и эпидермального фактора роста человека.

Благодарности

Автор благодарен Р. С. Есипову за обучение методам молекулярной биологии и генной инженерии, плодотворные обсуждения и помощь в написании диссертации, А. И. Гуревичу за ценные советы, JI. А. Чуповой и Т. И. Муравьевой за помощь в проведении экспериментов, A. JI. Каюшину и М. Д. Коростелевой за синтез олигонуклеотидов. Отдельная благодарность академику А. И. Мирошникову за научное руководство.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степаненко, Василий Николаевич, Москва

1. Xu М., Southworth М. W., Mersha F. В., Hornstra L. J., Perler F. B. / In vitro protein splicing of purified precursor and the identification of a branched intermediate. / Cell, 1993, 75, 1371-1377.

2. Starokadomskii P. L. / Protein splicing. / Ukr Biokhim Zh., 2005, Jul-Aug, 77(4), 14-29

3. Pietrokovski S. / Modular organization of inteins and C-terminal autocatalytic domains. I Protein Sci., 1998, 7, 64-71.

4. Kawasaki M., Nogami S., Satow Y., Ohya Y., Anraku Y. / Identification of three core regions essential for protein splicing of the yeast Vmal Protozyme. / J. Biol. Chem. 1997, 272, 15668-15674.

5. Jurica M. S., Stoddard B. L. / Homing endonucleases: structure, function and evolution. / Cell. Mol. Life Sci., 1999, 55, 1304-1326.

6. Butler M. I., Gray J., Goodwin T. J., Poulter R. T. / The distribution and evolutionary history of the PRP8 intein./ BMC Evol Biol., 2006, May, 31, 6-42.

7. Belfort M., Roberts R. J. / Homing endonucleases: keeping the house in order. / Nucleic Acids Res., 1997, 25, 3379-3388.

8. Stoddard B. L. / Homing endonuclease structure and function. / Q Rev Biophys., 2005, Feb, 38(1), 49-95

9. Chong S., Xu M. Q. / Protein splicing of the Saccharomyces cerevisiae VMA intein without the endonuclease motifs. / J. Biol. Chem., 1997, 272, 15587-15590.

10. Southworth M.W., Benner J., Perler F.B. / An Alternative Protein Splicing Mechanism for Inteins Lacking an N-terminal Nucleophile. / 2000, EMBOJ. 19, 5019-5026.

11. Telenti A., Southworth M., Alcaide F., Daugelat S., Jacobs W. R., Perler, F. B. / The Mycobacterium xenopi GyrA protein splicing element: characterization of a minimal intein. / 1997, J. Bact. 179, 6378- 6382.

12. Perler F. B. / InBase: the Intein Database. / 2002, Nucleic Acids Res. 30, 383-384.

13. Xu M., Perler F. В., / The mechanism of protein splicing and its modulation by mutation. / EMBO J. 1996,15, 5146 -5153

14. Noren С J., Wang J., Perler F. B. / Dissecting the Chemistry of Protein Splicing and its Applications. / 2000, Angewandte Chemielnt. Ed. 39, 450-466.

15. Xu M., Paulus H., Chong S. / Fusion to Self-Splicing Inteins for Protein Purification. / Methods Enzymol., 2000, 326, 376-418.

16. Klabunde Т., Sharma S., Telenti A., Jacobs W. R., Sacchettini, J. C. / Crystal structure of gyrA intein from Mycobacterium xenopi reveals structural basis of protein splicing. / 1998, Nature Struct. Biol. 5, 31-36.

17. Duan X., Gimble F.S., Quiocho P. / Crystal structure of Pl-Scel, a homing endonuclease with protein splicing activity. / Cell, 1997, 89, 555-564.

18. Kawanishi Y., Iwai K., Ando T. / Determination of C-terminal arginine and asparagines of proteins by catalytic hydrozinolysis. / JBiochem (Tokyo), 1964, 56,314-24.

19. Shao Y., Xu M.-Q., Paulus H. / Protein splicing: Evidence for an N-0 acyl rearrangement as the initial step in the splicing process. / Biochemistry, 1996,35,3810-3815.

20. Paulus H. / Protein Splicing and Related Forms of Protein Autoprocessing. / Annu. Rev. Biochem., 2000, 69,447-496.

21. Shao, Y., Paulus H. / Protein splicing: estimation of the rate of O-N and S-N acyl rearrangements, the last step of the splicing process. / J. Pept. Res., 50, 193-198.

22. Perler F. В., Xu M-Q., Paulus H. / Protein splicing and autoproteolysis mechanisms. / Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1, 292-299.

23. Kawasaki M., Satow Y., Ohya Y., Anraku Y. / Protein splicing in the yeast Vmal protozyme: evidence for an intramolecular reaction / FEBS Lett., 1997,412,518-520.

24. Fodor K., Harmat V., Neutze R., Szilagyi L., Graf L., Katona G. / Enzyme:substrate hydrogen bond shortening during the acylation phase of serine protease catalysis. I Biochemistry, 2006, 45(7), 2114-2121.

25. Bobofchak К. M., Pineda A. O., Mathews F. S., Di Cera E. / Energetic and structural consequences of perturbing Gly-193 in the oxyanion hole of serine proteases J JBiol Chem., 2005, 280(27), 25644-25650.

26. Carter P., Abrahmsen L., Wells J. A. / Probing the mechanism and improving the rate of substrate-assisted catalysis in subtilisin BPN'. / Biochemistry, 1991, 30(25), 6142-6148.

27. Fersht A. R. / Enzyme Structure and Mechanism / W. H. Freeman, Reading, 1977

28. Chong S., Williams K. S., Wotkowicz, C., Xu M. Q. / Modulation of protein splicing of the Saccharomyces cerevisiae vacuolar membrane ATPase intein. I JBiol Chem, 1998, 273,10567-10577.

29. Gorbalenya A. E. / Non-canonical inteins. / Nucleic Acids Res. 1998, 26, 1741-1748.

30. Wu H., Hu Z., Liu X. Q. / Protein trans-splicing by a split intein encoded in a split DnaE gene of Synechocystis sp. PCC6803. / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998,95,9226-9231.

31. Liu X. Q., Yang J. / Split-dnaE genes encoding multiple novel inteins in Trichodesmium erythraeum. / J. Biol. Chem., 2003, 278(29), 26315-26318.

32. Caspi J., Amitai G., Belenkiy O., Pietrokovski S. / Distribution of split DnaE inteins in cyanobacteria. / Mol. Microbiol., 2003, 50(5), 1569-1577.

33. Sun W., Yang J., Liu X. Q. / Synthetic two-piece and three-piece split inteins for protein trans-splicing. I J. Biol. Chem., 2004, 279(34), 35281-35286.

34. Shingledecker K., Jiang S., Paulus, H. / Molecular dissection of the Mycobacterium tuberculosis RecA intein: design of a minimal intein and of a trans-splicing system involving two intein fragments. / Gene, 1998, 207, 187195.

35. Southworth M. W., Adam E., Panne D., Byer R., Kautz R., Perler F. B. / Control of Protein Splicing by Intein Fragment Reassembly. / EMBO J., 1998, 17,918-926.

36. Mills К. V., Lew В. M., Jiang S., Paulus H. / Protein splicing in trans by purified N- and C-terminal fragments of the Mycobacterium tuberculosis RecA intein. I Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 3543-3548.

37. Dalgaard J. Z., Moser M. J., Hughey R., Mian I. S. / Statistical modeling, phylogenetic analysis and structure prediction of a protein splicing domain common to inteins and hedgehog proteins. / J. Computational Biol., 1997, 4, 193-214.

38. Koonin E. V. / A protein splice-junction motif in hedgehog family proteins. / Trends Biochem. Sci, 1995, 20,141-142.

39. Porter J. A. et al. / Hedgehog Patterning Activity: Role of a lipophilic modification mediated by the carboxy-terminal autoprocessing domain. / Cell,1996, 86, 21-34.

40. Bumcrot D. A., Takada R., McMahon A. P. / Proteolytic processing yields two secreted forms of sonic hedgehog. / Mol Cell Biol., 1995, 15(4), 22942303. Erratum in: Mol. Cell Biol, 1995, May; 15(5), 2904.

41. Jeong J., McMahon A. P. / Cholesterol modification of Hedgehog family proteins. !J. Clin. Invest., 2002, 110(5), 591-596.

42. Wang S., Liu X. Q. / Identification of an Unusual Intein in Chloroplast ClpP Protease of Chlamydomonas eugametos. / J. Biol. Chem. 1997, 272, 11869-73.

43. Chen L., Benner J., Perler, F. B. / Protein splicing in the absence of an intein penultimate histidine. / J. Biol. Chem., 2000, 275, 20431-20435.

44. Amitai G., Dassa В., Pietrokovski S. / Protein Splicing of Inteins with Atypical Glutamine and Aspartate C-terminal Residues. / J. Biol. Chem., 2004, 279(5), 3121-3131.

45. Pietrokovski S. / Identification of a virus intein and a possible variation in the protein-splicing reaction. / Curr. Biol., 1998, 8, R634-635.

46. Xu M., Comb D. G., Paulus H., Noren C. J., Shao, Y., Perler F. B. / Protein splicing: an analysis of the branched intermediate and its resolution by succinimide formation. / EMBO J. 1994, 13, 5517-5522.

47. Poland B. W., Xu M. Q., Quiocho F. A. / Structural Insights into the Protein Splicing Mechanism of Pl-Scel. / J Biol Chem, 2000, 275(22), 1640816413.

48. Ghosh I., Sun L., Xu M. Q. / Zinc Inhibition of Protein Trans-splicing and Identification of Regions Essential for Splicing and Association of a Split Intein. / J. Biol. Chem., 2001, 276, 24051-24058.

49. Nichols N. M., Benner J. S., Martin D. D., Evans Т. C. / Zinc Ion Effects on Individual Ssp DnaE Intein Splicing Steps: Regulating Pathway Progression. !Biochemistry, 2003,42(18), 5301-5311.

50. Perler F. B. / Protein Splicing of inteins and hedgehog autoproteolysis: structure, function and evolution. / Cell, 1998, 92, 1-4.

51. Cooper A. A., Stevens Т. H. / Protein splicing: Excision of intervening sequences at the protein level. / BioEssays, 1993, 15, 667-674.

52. Guhan N., Muniyappa K. / Structural and functional characteristics of homing endonucleases. / Crit Rev Biochem MolBiol., 2003, 38(3), 199-248

53. Brett S. Chevalier, Barry L. Stoddard / Homing endonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility. / Nucleic Acids Res., 2001,29(18), 3757-3774.

54. Hodges R. A., Perler F. В., Noren C. J., Jack W. E. / Protein splicing removes intervening sequences in an archaea DNA polymerase. / Nucleic Acids Res., 1992,20, 6153-6157.

55. Ichiyanagi K., Ishino Y., Ariyoshi M., Komori K., Morikawa K. / Crystal Structure of an Archaeal Intein-encoded Homing Endonuclease PI-PfuL / J. Mol. Biol, 2000,300, 889-901.

56. LaVallie E. R., McCoy J. M. / Gene fusion expression systems in Escherichia coli. / Curr Opin Biotechnol. 1995, 6, 501-506-120

57. IMPACT-CN System: Instructional manual #E6900S. New England Biolabs, Beverly, MA, 2004.

58. Cantor E. J., Chong S. / Intein-mediated rapid purification of Cre recombinase. / Protein Expr. Purif., 2001, 22(1), 135-40.

59. Grzybowska В., Szweda P., Synowiecki J. / Cloning of the thermostable alpha-amylase gene from Pyrococcus woesei in Escherichia coli: isolation and some properties of the enzyme. Mol. Biotechnol., 2004, 26(2), 101-10.

60. Szweda P., Pladzyk R., Kotlowski R., Kur J. / Cloning, expression, and purification of the Staphylococcus simulans lysostaphin using the intein-chitin-binding domain (CBD) system. / Protein Expr. Purif., 2001, 22(3), 467-71.

61. Sun Z., Chen J., Yao H., Liu L., Wang J., Zhang J., Liu J. N. / Use of Ssp dnaB derived mini-intein as a fusion partner for production of recombinant human brain natriuretic peptide in Escherichia coli. / Protein Expr. Purif., 2005, 43(1), 26-32.

62. Hong S., Toyama M., Maret W., Murooka Y. / High yield expression and single step purification of human thionein/metallothionein. / Protein Expr. Purif., 2001, 21(1), 243-50.

63. Ma J., Cooney C. L. / Application of vortex flow adsorption technology to intein-mediated recovery of recombinant human alpha 1-antitrypsin. / Biotechnol. Prog., 2004, 20(1), 269-76.

64. Humphries H. E., Christodoulides M., Heckels J. E. / Expression of the class 1 outer-membrane protein of Neisseria meningitidis in Escherichia coli and purification using a self-cleavable affinity tag. / Protein Expr. Purif, 2002, 26(2), 243-8.

65. Dawson P. E., Muir T. W., Clark-Lewis I., Kent S. B. / Synthesis of proteins by native chemical ligation. / Science, 1994, 266, 776-779.

66. Dawson P. E., Kent S. B. / Synthesis of native proteins by chemical ligation. / Annu. Rev. Biochem., 2000, 69, 923-960.

67. IMPACT-TWIN System: Instructional manual #E6950S. New England Biolabs, Beverly, MA, 2004.

68. David R., Richter M. P., Beck-Sickinger A. G. / Expressed protein ligation. Method and applications. / Eur. J. Biochem., 2004, 271, 663-677.

69. Alexandrov K., Heinemann I., Durek Т., Sidorovitch V., Goody Roger S., Waldmann H. / Intein-mediated synthesis of geranylgeranylated Rab7 protein in vitro. / J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 5648-5649.

70. Macmillan D., Bertozzi C. R. / New directions in glycoprotein engineering. / Tetrahedron, 2000, 56, 9515-9525.

71. Steven M. Berry, Matt D. Gieselman, Mark J. Nilges, Wilfred A. van der Donk, Yi Lu / An Engineered Azurin Variant Containing a Selenocysteine Copper Ligand. I J. Am. Chem. Soc., 2002, 124(10), 2084-2085.

72. Ulrich Arnold, Matthew P. Hinderaker, Bradley L. Nilsson, Bayard R. Huck, Samuel H. Gellman, Ronald T. Raines. / Protein Prosthesis: A

73. Semisynthetic Enzyme with a , /^-Peptide Reverse Turn. / J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 8522-8523.

74. Xu R., Ayers В., Cowburn D., Muir T. W. / Chemical ligation of folded recombinant proteins: segmental isotopic labeling of domains for NMR studies. /Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 388-393.

75. Wu W., Wood D. W., Belfort G., Derbyshire V., Belfort M. / Intermediated purication of cytotoxic endonuclease ITevI by insertional inactivation and pH-controllable splicing. / Nucleic Acids Res., 2002, 30, 4864-4871

76. Evans Т. C. Jr., Benner J., Xu M. Q. / Semisynthesis of cytotoxic proteins using a modified protein splicing element. / Protein. Sci, 1998, 7, 2256-2264.

77. Evans Т. C. Jr., Benner J., Xu, M. Q. / The cyclization and polymerization of bacterially expressed proteins using modified self-splicing inteins. / J. Biol. Chem., 1999,274, 18359-18363.

78. Xu M. Q., Evans Т. C. Jr. / Intein-mediated ligation and cyclization of expressed proteins. / Methods, 2001, 24, 257-277.

79. Scott C. P., Abel-Santos E., Wall M., Wahnon D. C., Benkovic S. J. / Production of cyclic peptides and proteins in vivo. / Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 13638-13643.

80. Iwai H., Lingel A., Pluckthun A. / Cyclic Green Fluorescent Protein Produced in Vivo Using an Artificially Split Pl-Pful Intein from Pyrococcus furiosus. I J.Biol. Chem. 2001, 276,16548-16554.

81. Horswill A. R., Bencovic S. J. / Cyclic Peptides, a Chemical Genetics Tool for Biologists. / Cell cycle 2005, 4(4), 552-555.-123

82. Ozawa Т., Nogami S., Sato M., Ohya Y., Umezawa Y. / A fluorescent indicator for detecting protein-protein interactions in vivo based on protein splicing. I Anal Chem., 2000, 72(21), 5151-7

83. Paulmurugan R., Umezawa Y., Gambhir S. S. / Noninvasive imaging of protein-protein interactions in living subjects by using reporter protein complementation and reconstitution strategies. / PNAS, 2002, 99(24), 15608-15613.

84. Zeidler M. P., Tan C, Bellaiche Y., Cherry S., Hader S., Gayko U., Perrimon N. / Temperature-sensitive control of protein activity by conditionally splicing inteins. I Nat. Biotechnol., 2004, 22(7), 871-876.

85. Mootz H. D., Blum E. S., Tyszkiewicz А. В., Muir T. W. / Conditional Protein Splicing: A New Tool to Control Protein Structure and Function in Vitro and in Vivo./J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 10561-10569.

86. Buskirk A. R, Ong Y. C., Gartner Z. J., Liu D. R. / Directed evolution of ligand dependence: Small-molecule-activated protein splicing. / PNAS, 2004, 101(29), 10505-10510.

87. Gill R. Т., Delisa M. P., Valdes J. J., Bentley W. E. / Genomic analysis of high cell density recombinant Escherichia coli fermentation and "cell conditioning" for improved recombinant protein yield. / Biotechnol Bioeng., 2001, 72, 85-95.

88. Sharma S. S., Chong S., Harcum S. W. / Intein-mediated protein purification of fusion proteins expressed under high-cell density conditions in E. coli. /J. Biotechnol, 2006, 20, 125(1), 48-56

89. McPherson D. Т., Morrow C., Minehan D. S., Wu J., Hunter E., Urry D. W. / Production and purification of a recombinant elastomeric polypeptide, G-(VPGVG) 19-VPGV, from Escherichia coli. / Biotechnol Prog., 1992, 8(4), 347-352.

90. Meyer D. E., Chilkoti A. / Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. / Nat. Biotechnol., 1999, 17(11), 1112-1115.

91. Banki M. R., Feng L., Wood D. W. / Simple bioseparations using selfcleaving elastin-like polypeptide tags. / Nat. Methods, 2005, 2(9), 659-662.

92. Potter M., Madkour M. H., Mayer F., Steinbuchel A. / Regulation of phasin expression and polyhydroxyalkanoate (PHA) granule formation in Ralstonia eutrophaH16. / Microbiology, 2002, 148, 2413-2426.

93. Banki M. R., Gerngross T. U., Wood D. W. / Novel and economical purification of recombinant proteins: intein-mediated protein purification using in vivo polyhydroxybutyrate (PHB) matrix association. / Protein Sci., 2005, 14(6), 1387-1395.

94. Srinivasan S., Barnard G. C., Gerngross T. U. / A Novel High-Cell-Density Protein Expression System Based on Ralstonia eutropha. / Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68(12), 5925-5932.

95. Barnard G. C., McCool J. D., Wood D. W., Gerngross T. U. / Integrated Recombinant Protein Expression and Purification Platform Based on Ralstonia eutropha. I Appl Environ. Microbiol., 2005, 71(10), 5735-5742.

96. Di L., Zhang H. W., Xu L. L. / Use of Ssp dnaB mini-intein as a fusion partner for preparation of recombinant human brain natriuretic peptide. / Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao., 2006 Mar, 22(2), 180-186

97. Hooper J. A., McDaniel M. C., Thurman G. В., Cohen С. H., Schullof R. S., Goldstein A. L. / Purification and properties of bovine thymosin. / Ann.N. Y.Acad.Sci.,\915, 24, 125-127.

98. Ancell C. D., Phipps J., Young L. / Thymosin alpha-1. / Am. J. Health-Syst. Pharm. 2001, 58, 879-885.

99. Коробко В. Г., Болдырева Е. Ф., Филиппов С. А., Беркова Н. П., Добрынин В. Н., Шмелев В. А., Попов С. Г., Евсегнеев С. И., Носова JI. ЮЛ Биоорган .химия. 1992. Т.18. С. 646-659.

100. Wen С., Gan R., Zhu S. / Construction of secretory expression system suitable to express glucagon under the control of PL promoter. / Curr. Microbiol, 2003,47, 180-185

101. Oh G. H., Hahm M. S., Chung В. H. / Use of carboxypeptidase Y propeptide as a fusion partner for expression of small polypeptides in Escherichia coli. I Protein Expr. Purif., 1999, 17, 428-434.

102. Okamoto H, Iwamoto H, Tsuzuki H, Teraoka H, Yoshida N. / An improved method for large-scale purification of recombinant human glucagon. / J Protein Chem., 1995, 14, 521-526.

103. Egel-Mitani M, Andersen AS, Diers 11, Hach M, Thim L, Hastrup S, Vad K. / Yield improvement of heterologous peptides expressed in ypsl-disrupted Saccharomyces cerevisiae strains. / Enzyme Microb Technol, 2000, 26, 671677.

104. Cohen M. A., Ellis S. M., Le Roux C. W., Batterham R. L., Park A., Patterson M., Frost G. S., Ghattei M. A., Bloom S. R. / Oxyntomodulin suppresses appetite and reduces food intake in humans / J. Clin.EndocrinolMetab., 2003, 88, 4696-4701.

105. Dakin C., Gunn I., Small C. J., Edwards С. M., Hay D. L., Smith D. M., Ghattei M. A., Bloom S. R. / Oxyntomodulin inhibits food intake in the rat / Endocrinology, 42, 4244-4250.

106. Hoist J. J. / Enteroglucagon / Annu.Rev.Physiol, 1997, 59, 257-271.

107. Bloom S. R, Polak J. M. / Gut hormones. / Adv.Clin.Chem., 1980, 21, 177-244.

108. Medical World News. 1986 13, № 10, 3589-3593-126

Информация о работе

Степаненко, Василий Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных полипептидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы