Прикладные аспекты структурной и функциональной геномики растений (на примере родов Vicia L. и Hordeum L.)

Потокина, Елена Кирилловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Прикладные аспекты структурной и функциональной геномики растений (на примере родов Vicia L. и Hordeum L.)
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Прикладные аспекты структурной и функциональной геномики растений (на примере родов Vicia L. и Hordeum L.)"

На правах рукописи

Потокина Елена Кирилловна с

ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ СТРУКТУРНОЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ГЕНОМИКИ РАСТЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ РОДОВ У1С1А Ь. И НОШЕиМЬ.)

Специальности- 03 01 15-генетика 03.00.05 - ботаника

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2008

о 4 АБГ20СЗ

003445947

Работа выполнена в Государственном научном центре РФ Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства имени НИ Вавилова (г Санкт-Петербург) и Институте генетики культурных растений (Гатерслебен, Германия) в 1997-2007 гг.

Научный консультант: доктор биологических наук Чесноков Юрий Валентинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

член-корреспондент РАСХН Яковлев Александр Федорович доктор биологических раук Борисов Алексей Юрьевич доктор биологических наук Родионов Александр Викентьевич

Ведущая организация

Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится "15 " октября 2008 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 006 041 01 при Государственном научном центре Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И Вавилова по адресу. 190000, г.Санкг-Петербург, ул Большая Морская, 44, тел/факс +7(812)571-8728

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им Н И Вавилова

Автореферат разослан " // " г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

В А Гаврилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нуклеотидные вставки, делеции, а также нуклеотидные замены определяют разнообразие аллелей большинства генов В этой связи главным объектом исследований генетики и прикладной ботаники становится разнообразие генетических ресурсов растений, выявляемое на уровне ДНК Полиморфизм ДНК в масштабе целого генома можно изучать, опираясь на информацию о нуклеотидной последовательности всей геномной ДНК (полное секвенирование геномов) или, используя альтернативную технологию молекулярного маркирования

В большинстве случаев молекулярные маркеры, используемые для анализа внутривидового и межвидового разнообразия у растений (RFLP, RAPD, AFLP, SSR), представляют собой анонимные ДНК-фрагменты, отражающие полиморфизм участков генома, выбранныхг случайным образом (Varshney et al, 2004) Репрезентативное количество идентифицированных с их помощью полиморфных геномных локусов и относительная простота лабораторных процедур позволяют эффективно использовать эти маркеры при оценке геномного сходства близкородственных таксонов культивируемых видов и решении вопросов таксономии. В настоящей работе возможности методов молекулярного маркирования при решении спорных вопросов систематики культурных растений и оптимизации коллекций генных банков проанализированы на примере видов Vicia L, представляющих практический интерес как кормовые травы и зернобобовые культуры

Для целей прикладной генетики и селекции более эффективным является использование не анонимных, а функциональных молекулярных маркеров, которые идентифицируют полиморфизм в транскрибируемых кодирующих последовательностях ДНК - генах (Andersen, Lübberstedt, 2003) Базовым ресурсом для исследований функциональной геномики являются коллекции EST (Expressed Sequence Tags), представляющие собой секвенированные неполные копии генов, точнее фрагменты кодирующих последовательностей ДНК длиной 500-700 н п. (Сойфер, 2000) Создание коллекций EST обусловило также развитие чип-технологий, основной задачей которых является сравнительный мониторинг уровня генных транскриптов в экспериментальных образцах Анализ экспрессии генов с использованием чип-технологий, называют также транскриптомным анализом По аналогии с геномом, подразумевающим совокупность всех генов организма, говоря о транскриптоме, имеют ввиду совокупность всех генов, которые транскрибируются в данной ткани, на данном этапе развития организма (Spellman et al, 1998). Потенциальное значение транскриптомного анализа для генетико-селекционных

исследований очевидно транскрипция генов является ключевым этапом для последующего белкового синтеза, поэтому изменения в генной экспрессии могут непосредственно влиять на биохимические и физиологические процессы и, как следствие, отражаться на фенотипе

Среди объектов современных транскриптомных исследований особое место принадлежит ячменю Усилиями лабораторий разных стран к концу 2002 года были созданы 84 библиотеки кДНК из разных тканей растений ячменя на разных этапах онтогенеза, в результате чего было получено около 350 тысяч EST (Close et al, 2004) На этой базе был создан геночип яменя (Affymetrix 22К Barley GeneChip), позволяющий анализировать экспрессию практически всех известных на сегодняшний день кодирующих последовательностей ячменя Накопленная обширная научная информация и современные исследовательские ресурсы позволяют перейти к разработке новых методологических подходов для выявления генетических факторов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков, на основе новых технологий функциональной геномики

Цель исследования. Выявить возможные пути использования достижений современной структурной и функциональной геномики для решения прикладных проблем генетики и ботаники, на примере представителей родов Vicia и Hordeum

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Изучить возможности методов молекулярного маркирования для систематики культурных растений, оценив с их помощью геномное сходство видов Vicia subgenus Vicia и, сравнив полученные результаты с существующими версиями филогенетической системы подрода

2 Разработать метод оптимизации обширных коллекций ex situ с применением молекулярных маркеров на примере генофонда культурного вида Vsativa

а) в качестве первого этапа создать экспериментальную базу для транскриптомного анализа генотипов ячменя различного пивоваренного качества, сконструировав библиотеки кДНК из тканей прорастающего ячменного семени и, создав на их основе кДНК-макрочип (EST на нейлоновом фильтре),

б) изучить ткане- и стадийно-специфичную активность генов в прорастающем семени ячменя, используя кДНК-макрочип В ходе исследований получить экспериментальное подтверждение воспроизводимости результатов применяемой кДНК-чип технологии, путем использования альтернативных молекулярно-биологических методов (Нозерн-блотгинг)

в) используя кДНК-макрочип, осуществить транскриптомный анализ генотипов ячменя, различающихся по параметрам солодования и протестировать гипотезу о том, что наблюдаемые различия по пивоваренному качеству могут обуславливаться изменчивостью уровня экспрессии определенных генов-кандидатов

4 Разработать метод картирования генетических локусов, регулирующих уровень экспрессии возможных генов-кандидатов с использованием техники Real-Time PCR

5 Разработать стратегию создания функциональных молекулярных маркеров-помощников селекции, выявляющих желательную повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата, детерминирующего изменчивость хозяйственно-ценного признака, для использования селекционной практике

6 Проанализировать общегеномные закономерности регуляции экспрессии генов ячменя, картировав генетические факторы (eQTL), влияющие на уровень транскрипции генов, используя Aflyraetnx 22К Barley GeneChip

Научная новизна. Предложен оригинальный метод классификации внутривидового разнообразия возделываемого вида, сохраняемого ex situ, по результатам молекулярного маркирования генома путем расчета коэффициентов генетической оригинальности образцов (КТО) по Смирнову (1969)

Впервые предложен метод, позволяющий на основе кДНК-чип технологий идентифицировать спектр генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков В качестве примера идентифицированы возможные гены-кандидаты, влияющие на формирование пивоваренного качества у ячменя

Разработана методика поиска молекулярного маркера-помощника селекции, выявляющего желательную повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата

Создана коллекция 27512 EST (секвенированных фрагментов кодирующих последовательностей ДНК), выделенных из тканей семени ячменя на разных этапах прорастания Нуклеотидные последовательности созданных EST и их функциональные аннотации доступны для пользователей через Интернет (http //pgrc îpk-gatersleben de/cr-est/mdex php).

Впервые с использованием микрочипа Affymetrix 22К Barley GeneChip на генетической карте ячменя установлено местоположение 3029 транскрибируемых генов, а также картированы регуляторные локусы для 12987 генов

Впервые экспериментально показано, что естественный нуклеотидный полиморфизм, существующий между двумя генотипами ячменя, может достоверно влиять на уровень экспрессии более 80% транскрибируемых генов

Получено экспериментальное подтверждение наличия в геноме ячменя транс-регуляторных локусов, влияющих на транскрипцию не одного, а целого кластера генов Установлено, что позиции этих транс-регуляторных локусов на генетической карте совпадают с позициями некоторых QTL для параметров пивоваренного качества

Впервые на примере генома ячменя экспериментально показано, что эффект унаследованных цис-регуляторных мутаций, заключающийся в активировании или ингибировании транскрипции гена, может быть ограничен конкретной тканью или проявляться у потомства по достижении организмом определенной физиологической стадии

Теоретическая и практическая значимость. Предложенный метод расчета КГО применим к анализу генетического разнообразия возделываемых видов растений, генофонд которых представлен преимущественно местными сортами, сорнополевыми и дикорастущими популяциями, с привлечением любого типа молекулярных маркеров Практическим результатом его применения является классификация образцов коллекций генбанков по 5-бапльной шкале, которая может быть отражена в дескрипторах паспортных баз данных и использована для оптимизации коллекций ex situ

Метод выявления генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков, основан на гипотезе, что наблюдаемые различия в фенотипе могут обуславливаться вариациями в уровне экспрессии определенных генов Метод приложим к анализу любого количественного признака, не требует создания экспериментальных популяций, необходимых для рекомбинационного анализа Метод лишь анализирует генетическое разнообразие, выявляемое среди существующих селекционных линий и сортов, используя возможности кДНК-чип технологий.

Экспериментально показано, что повышенная/пониженная экспрессия гена-кандидата в результате цис-регуляторной мутации, может быть ассоциирована с присутствием определенных аллелей в структурной части гена Это дает возможность упростить работу селекционера, создав молекулярный маркер, выявляющий желательную повышенную или пониженную экспрессию

гена-кандидата для диагностики и скрининга генетического разнообразия, а также маркерной помощи отбору

Созданная коллекция EST была использована при разработке микрочипа Affymetrix 22К. Barley GeneChip, позволяющего анализировать экспрессию практически всех известных на сегодняшний день кодирующих последовательностей ячменя По результатам экспериментов с Affymetrix 22К Barley GeneChip создан каталог, содержащий информацию о линейной последовательности 3029 транскрибируемых генов на хромосомах ячменя и генетических расстояниях между ними. Полученная генетическая карта Hordeum vulgare является самой насыщенной на сегодняшний день, она позволяет детально изучить синтению хромосом ячменя и риса - вида с секвенированным геномом Информация о последовательностях генов в соответствующем блоке на физической карте генома риса значительно облегчает задачу клонирования генов у ячменя

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1 Классификацию внутривидового разнообразия возделываемого вида, сохраняемого ех situ, можно осуществлять при помощи коэффициентов генетической оригинальности образцов по Смирнову, рассчитанными по результатам молекулярного маркирования генома

2 Используя современные методы функциональной геномики (кДНК-чип технологии), можно идентифицировать спектр генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков

3 Желательную с точки зрения селекционной практики повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата в результате цис-регуляторной мутации можно маркировать с помощью полиморфных сайтов в структурной части гена

4 Используя подход «генетической геномики» с применением микрочипа Affymetrix 22К Barley GeneChip, можно локализовать на генетической карте ячменя более 15% генов, транскрибируемых в конкретной ткани Одновременно, в рамках того же эксперимента можно картировать регуляторные локусы для 80% транскрибируемых генов

5 Общегеномное картирование регуляторов экспрессии генов ячменя с помощью Affymetrix позволяет локализовать транс-регуляторные локусы, регулирующих транскрипцию целого кластера генов, среди которых могут оказаться также гены, определяющие важные фенотипические характеристики.

Конкурсная поддержка работы Исследования были поддержаны международными грантами Vavilov-Frankel Fellowship, 1999 (IPGRI, Италия), Science and Technology Agency of

Japan, 1999 (Цукуба, Япония), BMBF, №0312282, 2001 (GABI-SEED, Германия), BBC5030971, 2005 (BBSRC, Англия)

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Х-ой, ХИ-ой и XV-ой Международных Конференциях "Plant & Animal Genomes" (San-Diego, 2002, 2004, 2007), 3rd UK Cereal Genetics and Genomics Workshop (Norwich, 2006), III-м Съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004), 9th International Barley Genetics Symposium (Kromenz, 2004), Plant Genomics European Meetings (Lyon, 2004, BerJm, 2002); 9th International Symposium on Plant Seeds Seeds in the -omics Era (Meisdorf, 2004), VIII European Society for Agronomy Congress (Copenhagen, 2004), XI-ом Делегатском Съезде Русского Ботанического Общества (Барнаул, 2003), XI-ой Международной конференции "Plant Reproduction- From Mendel to Molecular Biology" (Brno, 2003), 6th Gatersleben Research Conference (Gatersleben, 2002), XVIth EUCARPIA Congress (Edinburgh, 2001), International Symposium "Rudolf Mansfeld and Plant Genetic Resources" (Gatersleben, 2001), 3rd International Crop Science Congress (Hamburg, 2000), 7th MAFF International Workshop on Genetic Resources (Tsukuba, 2000) Результаты диссертации обсуждались на заседании кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного Университета, на семинаре лаборатории кариологии и молекулярной систематики Ботанического института им В JI Комарова РАН, а также на Вавиловском семинаре ВНИИ растениеводства им Н И Вавилова

Публикации По теме диссертации опубликованы 32 работы, в том числе в зарубежных изданиях - 25

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 265 страницах, содержит 35 таблиц и 57 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), 4-х глав экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы, включающего 285 источников, и приложения

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Филогенетический анализ подрода Vtcia осуществлялся с использованием 54 образцов 29 видов Vicia, относящихся к секциям Alossa, Hypechusa, Peregrmae, Wiggersia, Vicia, Bithymcae, Narbonensis и Faba sensu Maxted (1995) Образцы получены из коллекций Всероссийского Института растениеводства (ВИР), Института генетики культурных растений Гатерслебена (IPK, Gatersleben, Germany), а также собственных сборов автора, выполненных в период экспедиционных работ 1987-1993 по Кавказу, Крыму и Средней Азии Возможности методов

молекулярного маркирования при идентификации предковой формы возделываемого вида V faba L анализировались на материале 46 местных популяций бобов коллекции ВИР, собранных в 1916-1928 годах экспедициями НИ Вавилова и его коллег Методология применения молекулярного маркирования для оптимизации работы с обширными коллекциями генбанков изучена на примере мирового генофонда культурного вида Vsativa (1122 образца)

Суммарные препараты ДНК из листьев Via а получали стандартным методом СТАВ (Williams et al, 1993) Полимеразиую цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартному протоколу с использованием Taq ДНК-полимеразы (MBI Fermentas, США) Для RAPD анализа видов Vicia использовали 20 декамерных олигонуклеотидных праймеров Полиморфизм генов хлоропластной ДНК (rbcL, rpoB, 16S, psaA, IrnK) анализировался по протоколу Tsumura et al (1995) Дм обнаружения нуклеотидных замен в хлоропластных генах у видов Vicia, амплифицированная ДНК обрабагывалась отдельно одной из 11 рестриктаз (BamHl, В gill, Dral, EcoRl, EcoKW, HaeIII, Msp\, Pstl, Rsal, Xbal, Xhol) Процедура AFLP проводилась по методу Vos et al (1995) с использованием 6 наиболее полиморфных комбинаций праймеров (Е37-М52, Е38-М53, Е39-М49, Е40-М56, Е40-М58, Е41-М57) Филогенетический анализ подрода Vicia по результатам RAPD и RFLP-PCR хлоропластных генов осуществлялся методом невзвешенного парно-группового кластерного анализа с арифметическим усреднением (UPGMA) программного пакета NTSYS-pc (Rholf, 1992), а также методом максимальной экономии (Phylogenetic Analysis Using Parsimony, Swofford, 1991) и методом максимального правдоподобия (Restriction Sites Maximum Likelihood Program, Phylip 3 5, Felsenstein, 1992) При анализе внутривидового разнообразия Vsativa L. по результатам AFLP частота встречаемости AFLP-фрагментов в региональных выборках была подсчитана с помощью опции FREQ программы NTSYS-pc (Rholf, 1992) Генетические дистанции между выборками расчитаны по Nei (1972) Структура внутривидового разнообразия Vfaba L анализировалась методом главных координат (Principal Coordinates Analysis, РСоА) с помощью опций DOUBLE CENTER и EIGENVECTOR пакета NTSYS-pc (Rholf, 1992), а также с использованием факторного анализа (Statistica 5 0)

Для создания экспериментальной базы транскриптомного анализа у ячменя, библиотеки кодирующих последовательностей ДНК (кДНК) конструировались из РНК, выделенной из тканей семян ярового пивоваренного сорта ячменя Барке (Barke) на четырех стадиях прорастания (библиотеки HS,HT,HU,HV, http //pgrc ipk-gatersleben de/cr-est/index php) Суммарная РНК выделялась с помощью кита Gentra RNA Isolation Kit (Biozym) Поли(А)-последовательности РНК экстрагировались из суммарной РНК с помощью олиго(Т)-парамагнитных корпускул

(Dynal). Для конструирования библиотек кДНК выделенная иРНК использовалась для синтеза первой цепи кДНК реакцией обратной транскрипции с помощью pBluescnpt II XR cDNA Library Construction Kit (Stratagene), позволяющем встраивать и размножать молекулы кДНК в гошмвдном векторе pBluescnpt II SK При создании кДНК-макрочипа вставки кДНК амплифицировались из плазмидной ДНК с помощью универсальных праймеров и наносились на нейлоновые мембраны (BiodyneB, Pall, Germany) с помощью робота Biogrid иглами нанесения диаметром 0 4 мм (Biorobotics, Cambridge, UK) Анализ экспрессии генов у сортов ячменя разного пивоваренного качества осуществлялся путем гибридизации проб кДНК, выделенных из семян каждого сорта на кДНК-микрочип Для приготовления проб синтез первой цепи кДНК проводился с помощью обратной транскриптазы (Superscript II, Gibco), вторая цепь синтезировалась с использованием радиоактивно-меченых нуклеотидов (33Р) (Megapnme Labeling Kit, Amersham) Гибридизация радиоктивио меченых проб кДНК на мембраны проводилась в течении 14ч при 65°С Время экспозиции для оценки интенсивности свечения радиоактивных сигналов составило З-бч Имиджи фотопластин анализировались с помощью Fuji BAS2000 (Fuji Photo Film) и импортировались программой Array Vision (Imaging Research) для идентификации сигналов и оценки их интенсивности Нозерн-блоттинг проводился с использованием мембран HybondN+ (Amersham) Мембраны гибридизовались с радиоактивно меченой пробой (32Р) выделенной для индивидуальной кДНК Мечение пробы проводилось с использованием рандомных праймеров Rediprime (Amersham). Сигнал инспектировался с помощью фосфо-имиджера Fuji BAS2000 (Fuji Photo Film)

Методические подходы идентификации генов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков, разрабатывались на примере признаков пивоваренного качества у ячменя Параметры солодования и уровень экспрессии генов анализировались для 10 генотипов, полученных от семенной компании Cebeco Seeds B.V (Нидерланды) Компания предоставила информацию о показателях шести параметров солодования у генотипов Уровень экспрессии 1440 генов у тех же генотипов анализировался с использованием кДНК-макрочипа Маитель-тест (Mantel, 1967) использовался для оценки корреляции между двумя матрицами попарных расстояний по Манхеттену, описывающими одну и ту же выборку 10 генотипов Одна из матриц была рассчитана по данным экспрессии генов, другая - по данным параметров солодования Для оценки достоверности корреляции между матрицами использовался калькулятор Мантель-теста (Mantel Nonparametric Test Calculator for Windows, version 2 00, Liedloff, 1999)

Оценку уровня транскрипции гена-кандидата Cxpl (Асс Y09603), в прорастающих семенах дигаплоидных линий от скрещивания генотипов Steptoe/Morex проводили методом количественной ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR) в термоциклере GeneAmp 5700 Sequence Detection System (SDS, Applied Biosystems) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I Праймеры для проведения RT-PCR были сконструированы таким образом, чтобы хотя бы один из них «перекрывал» интрон-экзонную границу в нуклготидной последовательности гена Оценку стартового количества кДНК в экспериментальных образцах проводили методом калибровочного графика, как описано в User Bulletin #2 for ABI Prism 7700 SDS (http //docs appliedbiosystems com/pebiodocs/04303859 pdf) CAPS маркер для картирования гена-кандидата Cxpl был разработан на основе одиночной нуклеотидной замены (SNP, Single Nucleotide Polymorphism), выявленной при сравнении последовательностей геномной ДНК у генотипов Steptoe и Могех с помощью программы RestrictionMapper (http //www restrictionmapper org/) Картирование генов и QTL проводилось в популяциях дигаплоидных линий от скрещивания Steptoe/Morex (Kleinhofs et al, 1993) и Oregon Wolfe Dom/Ree (Costa et al, 2001) с использованием программ MAPMAKER v 2 (Lander et al, 1987), QGENE v3 0 (Nelson, 1997) и Windows QTL Cartographer 2 5 (http //statgen ncsu edu/qtlcart/WQTLCart htm)

Общегеномное картирование регуляторов транскрипции генов ячменя с использованием Affymetrix 22К Barley GeneChip (Affymetnx product #900515 GeneChip® Barley Genome Array) проводилось на материале проб РНК, выделенных из трех биологических повторностей родительских генотипов Steptoe и Могех и из одной повторности каждой дигаплоидной линии от их скрещивания. В исследование были включены два типа ткани, соответствующие также двум разным последовательным стадиям развития растения 1) ткани зародыша прорастающего семени (9бч после намокания) и 2) листья 12-и дневных проростков РНК, выделенная из листьев проростков анализироваласть только для 30 дигаплоидных линий РНК, выделенная из тканей зародыша, анализировалась для 139 дигаплоидных линий Процедура выделения РНК и гибридизации на микрочип описана Caldo et al (2004) Приготовление тканевых проб, и выделение РНК проводилось в Институте культурных растений в Данди (Scottish Crop Research Institute, SCRI, Dundee) Мечение проб, гибридизация и сканирование геночипов проводилось в университете Йова, США (Iowa State University, USA, http //www biotech íastate edu/ facilities/genechip/Genechip htm) Анализ результатов гибридизаций (CEL files) осуществлялось

нами с помощью пакета статистических программ Bioconductor (www bioconductor org), доступного в системе программирования R (www r-project org)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Возможности методов молекулярного маркирования при решении проблем прикладной ботаники и оптимизации коллекций еде situ (на примере Vicia L.)

С помощью методов RAPD и RFLP-PCR хлоропластных генов проанализирована степень геномного сходства 29 видов подрода Vicia и по результатам исследования очерчен круг возможных близкородственных таксонов для важнейших культивируемых видов вики Полученные результаты не подтвердили традиционной точки зрения многих систематиков о том, что современные культивируемые бобы (V/aba) филогенетически более всего близки к видам секции Narbonensis (Ball, 1968, Phtmann, 1970, Maxted, 1992) По полученным данным, в пределах подрода Vicia, Vfaba филогенетически более всего близка к Vbithynica, и эти два вида могут иметь общего предка с видами секции Peregrmae Результаты также показали, что Vfaba, имея определенную степень родства с ныне существующими видами подрода Vicia, не может считаться одомашенной формой одного из них

Для дальнейшего исследования вопроса о происхождении культуры бобов методом RAPD было проанализировано генетическое разнообразие местных популяций бобов, собранных в 1916-1928 годах экспедициями ВИР в разных частях света во времена, когда современные аграрные технологии еще не заместили традиционных местных способов ведения сельского хозяйства Обнаружено, что образцы культурных бобов, собранные в начале прошлого века в горах Алжира и Морокко, на уровне ДНК демонстрируют явную генетическую дивергенцию от остального внутривидового разнообразия Vfaba Из тех же географических пунктов североафриканского побережья ранее был описан вид V Plimana (Trabut)Murat, незначительно отличающийся от современных форм Vfaba, и рассматриваемый монографом культуры бобов Муратовой (1931) в качестве возможного предка этой культуры Приняв во внимание гипотезу Cubero (1974), который объясняет отсутствие дикорастущих растений бобов тем, что в районах своего произрастания они непосредственно переводятся человеком в культивируемое состояние, выдвинуто предположение, что генетически обособленные северо-африканские популяции бобов могут представляют собой сравнительно недавно окультуренные формы дикорастущей Vfaba, которую ботаники прошлого века описывали как V Plimana. Результаты проведенного исследования позволяют предположить, что дикорастущий предок культурных бобов, очень

незначительно отличающийся морфологически от современных форм Vfaba, в историческое время был широко распространен в Средиземноморье и на Ближнем Востоке В этой связи сделан вывод о том, что видовое и формовое разнообразие Vicia в горах Алжира и Западного Морокко заслуживает специального подробного исследования для получения более точной информации о феномене V Phmana, возможно имеющем непосредственное отношение к дикорастущему предку культивируемых бобов

Коэффициенты генетической оригинальности образцов коллекций генбанков по

результатам молекулярного маркирования Для рациональной организации и практического использования коллекций ex situ необходимо оценить генетические различия многочисленных образцов местных сортов и сорнополевых форм, собранных из одного эколого-географического региона и сходных по своим морфолого-физиологическим характеристикам На примере образцов вики посевной (Vicía sattva L) коллекции ВИР нами разработан математический алгоритм, позволяющий оценить степень генетической оригинальности образца в системе местного генофонда с использованием результатов молекулярного маркирования Алгоритм был разработан по результатам анализа 1122 образцов мирового генофонда вики посевной методом AFLP Установлено, что 65 AFLP-фрагментов, полиморфных внутри вида, могут быть обнаружены практически во всех точках ареала вики посевной, но с разной частотой встречаемости Одна и та же аллель могла быть распространенной в одном регионе, встречаясь в 90% популяций, и очень редкой в другом районе видового ареала, встречаясь лишь в 10% популяций, однако, как правило, никогда не исчезая совсем (табл 1) Показано, что различия в частотном соотношении AFLP-фрагментов между различными участками ареала пропорциональны их географической удаленности

Если отдельные части ареала вида различаются частотным соотношением аллелей, то для каждого конкретного региона появляется возможность различать редкие и широко встречающиеся аллели На основе частоты их встречаемости становится возможным проводить процедуру "взвешивания" аллепей, выявленных у образцов с помощью молекулярного маркирования по методу Смирнова (Смирнов, 1969) Чем больше в составе образца генотипов с редкими аллелями, маркируемыми AFLP, тем выше степень его оригинальности (специфичности) в системе популяций региона В интерпретации генофонда это может означать, что в одном образце собраны генотипы наиболее характерные для данной местности, а в другом образце удалось «поймать» редкие генотипы, нехарактерные для местной среды обитания, но тем не менее сохраняемые популяцией в качестве резерва изменчивости Как следствие, каждый образец

Частота встречаемости AFLP-фрагмептов (Е41-М57) в образцах Vsativa из 22 географических районов видового ареала

Размер AFLP-фрагментов (н п )

Кол-во 108.68 109.86 113 117.11 161 178 180 202 268.9 293 319 368 369

Прибалтика 98 0 938 0 255 1 000 0 684 0 061 0 765 0.877 0 071 0 633 0.020 0.786 0 020 0 245

Белоруссия 34 0911 0.471 1000 0 706 0 147 0 912 0 824 0 147 0 735 0 058 0 882 0 0 294

Центр Украина 54 0 926 0 296 0 963 0 833 0 167 0 833 0 907 0 333 0 592 0 018 0.778 0 0259

Запад Украина 45 0 956 0 378 0 956 0 844 0 156 0 756 0 933 0200 0689 0 022 0 822 0 022 0356

Кавказ 89 0 876 0 618 0 640 0 528 0 124 0 876 0 584 0 022 0 427 0011 0 449 0011 0101

Россия-Север 37 0 889 0 278 0.944 0 861 0 167 0 944 0 833 0 028 0 694 0 056 0 972 0 0 209

Россия-Центр 105 0 962 0 429 0 895 0 829 0 152 0 886 0 867 0 105 0 610 0 028 0 857 0 038 0.209

Россия-Черноз 106 0 915 0 387 0 821 0 802 0 123 0 868 0 802 0. .151 0 557 0 028 0 839 0 0 321

Россия-Поволжье 43 0 860 0 419 0 744 0 605 0 349 0 860 0 697 0 186 0 628 0 0 744 0 023 0 326

Россия-Урал 34 1 000 0 441 0 676 0 765 0 206 0 882 0 852 0 059 0 676 0 029 0 853 0 0 441

Росиия-Сибирь 30 0 933 0 200 0 933 0 700 0 133 0 867 0 867 0 0 733 0 0 867 0 0 267

Польша 23 0.782 0130 0 652 0 522 0 130 0 696 0 783 0 0 261 0 435 0 565 0 0 478

Германия 21 0 900 0150 0 700 0 450 0 150 0 800 0 950 0 0 500 0 0 700 0 0.300

Чехословакия 26 0 846 0 269 0 615 0615 0 077 0 538 0 692 0 0 692 0 192 0 808 0 0038

Греция 107 0604 0405 0 707 0113 0 038 0 915 0 906 0 0.717 0 018 0 585 0 235 0160

Испания 61 0 836 0 689 0 919 0 081 0 049 0 984 0 984 0 0 885 0 0 819 0 082 0 065

Италия 27 0 815 0 629 0815 0 407 0 074 0 926 0 778 0 0 815 0 037 0 852 0.074 0

Болгария 26 0 880 0 200 0 600 0 280 0 280 1 000 0 440 0 0 760 0 0 200 0120 0

Югославия 9 1 000 0 0 889 0.555 0 0 889 0 333 0 0 667 0111 0 889 0 222 0111

Венгрия 13 1000 0 461 0 615 0 615 0 154 0 461 0 692 0 0 769 0 231 0 923 0 0 231

Турция 19 0 842 0 526 0 210 0 368 0 .052 0 684 0 632 0 0 737 0 0 579 0 0 105

Иран 22 0 454 0 955 0 909 0 727 0 045 0 773 0 364 0 1 000 0 0.273 0 591 0

в пределах конкретного региона может быть охарактеризован с точки зрения пропорции редких и обычных аллелей в виде рассчитанного коэффициента генетической оригинальности (КТО) в системе местного генофонда Разработана пятибалльная шкапа, согласно которой каждому образцу, в соответствии с его КГО, может быть присуждена градация от 1 до 5, отражающая долю редких для региона аллелей в конкретном образце Алгоритм продемонстрирован на примере классификации 677 образцов посевной вики коллекции ВИР, собранных из 11 эколого-географических регионов России и проанализированных методом AFLP

2. Стратегия идентификации генов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков на основе транскриптомного анализа

Разработан метод, позволяющий соотнести изменчивость уровня экспрессии генов с изменчивостью хозяйственно-ценного признака на основе транскриптомного анализа Метод продемонстрирован на примере идентификации генов-кандидатов, вовлеченных в формирование признаков пивоваренного качества у ячменя. Для проведения транскриптомного анализа генотипов ячменя различного пивоваренного качества было необходимо сконструировать библиотеки кДНК из тканей прорастающего ячменного семени 2.1. Создание библиотек кодирующих последовательностей ДНК ячменя

Из иРНК, выделенной из тканей прорастающего ячменного семени на разных этапах прорастания, нами были созданы 4 библиотеки кДНК Эти 4 библиотеки, вместе с другими 18 библиотеками кДНК из разных тканей и стадий развития ячменя, были использованы для создания обширной коллекции секвенированных фрагментов кодирующих последовательностей ДНК, насчитывающей 110981 EST и сохраняемой в настоящее время Институтом генетики культурных растений (IPK, Gatersleben) Созданная коллекция EST является базовым ресурсом геномных исследований у ячменя и составляет примерно одну треть от всего количества EST ячменя (~380000), опубликованных на сегодняшний день (Zhang et al, 2004) Всего из сконструированных нами библиотек прорастающего семени было секвенировано 27512 EST Длина EST варьировала от 426 до 547 нуклеотидов, средняя длина составила 495. Примерно 50% EST показали достоверное сходство с аннотированными генами, кодирующими белки известных функций 24% оказались сходными с генами, кодирующими белки с неизвестными функциями, 26% EST не имели достоверных аналогов в опубликованных базах данных Нуклеотидные последовательности всех EST и их

функциональные аннотации доступны для пользователей (httpy/pgrc.ipk-gatersleben de/cr-est/mdex php)

На основе полученных EST был создан кДНК-макрочип ячменя (1400 EST на нейлоновом фильтре) Получив возможность анализировать уровень экспрессии сотен генов в рамках одного эксперимента, мы использовали кДНК-макрочип для того, чтобы установить как меняется характер экспрессии генов в зависимости от стадии прорастания семени, и насколько уровень экспрессии специфичен для определенной ткани Рис 1 в качестве примера иллюстрирует один из дифференциально-экспрессируемых генов карбоксипептидазу I (Cxpl, EST HY02B16), специфически транскрибируемый в щитке семени ячменя спустя 12-36 ч после намокания. Тканеспецифичная экспрессия этого гена может быть выявлена как с помощью кДНК-макрочипа, так и с помощью Нозерн-блоттинга Преимущество кДНК микрочипа состоит в выявлении сразу несколько десятков дифференциально-экспрессируемых генов

Среди 154 дифференциально-экспрессируемых генов 69 показали наивысший уровень активности в эндосперме, 58 преимущественно транскрибировались в зародыше и щитке, 11 только в зародыше и 16 только в щитке 70% генов были аннотированы в соответствии с их предполагаемыми функциями Гены, преимущественно экспрессируемые в зародыше и щитке, кодировали белки клеточного цикла, процессов трансляции, нуклеотидного метаболизма, углеводного обмена и транспортных функций Гены, активные в алейроновом слое эндосперма, в основном определяли процессы гидролиза угеводов и метаболизма аминокислот Было установлено, что результаты с использованием кДНК-макрочипа воспроизводимы и подтверждаются результатами альтернативных молекулярно-биологических методов (Нозерн-блоттинг) При условии соблюдения фиксированной экспериментальной ситуации можно проводить сравнение уровня транскрипции генов в прорастающем семени не только между тканями и возрастными стадиями одного и того же индивидуального организма, но и между различными генотипами

2.2. Выявление корреляции между экспрессионными профилями EST и профилями варьирования признаков пивоваренного качества у ячменя

Для того чтобы идентифицировать гены, вовлеченные в детерминацию хозяйственно-ценного признака, невозможно сравнивать уровень транскрипции генов у двух генотипов, контрастных по определенным фенотипическим характеристикам (например, по принципу

НУ05С21 ♦

НУ02В16*

1000

НУ08Р07

10 ЩИТОК 100

1000

10 100 щиток

1000

Рис Л. I - Схематическое изображение органов семени ячменя, использованных для выделения РНК и последующего транскриптомного анализа; П - Тканеспецифичная экспрессия гена карбоксипептидазы (Схр1) (НУ02В16) в щитке зерновки ячменя, выявленная с помощью Нозерн-блоггинга (А) после 4, 12, 36 и 54 часов проращивания семени. Количество нанесенной РНК контролировалось параллельной гибридизацией с пробой рибосомальной ДНК (268 гОЫА) (В); Ш - IV Сравнение экспрессии 1440 генов в тканях семени с помощью кДНК-макрочипа (Ш - в щитке по сравнению с зародышем; IV - в щитке по сравнению с эндоспермом). Логарифмированное значение интенсивности сигнала отображено на двухмерном графике разброса для двух сравниваемых тканей. Диагонали отражают границы разницы в уровне экспрессии генов в 3 раза. НУ02В16 (карбоксипептидаза 1) показывает высокий уровень экспрессии в щитке, однако в зародыше и эндосперме ген не транскрибируется (сигнал неотличим от "экспериментального шума").

"высокое - низкое пивоваренное качество") В этом случае разница в экспрессии генов будет отражать общее генетическое несходство сортов, вызванное и другими факторами, например, происхождением сорта Поэтому, предлагаемый функционально-ассоциативный подход предполагает анализ уровня экспрессии генов не у двух контрастных сортов, а у репрезентативной выборки сортов, среди которых наблюдается существенная вариация изучаемого признака, Далее, из всего множества дифференциально-экспрессируемых генов необходимо выбрать только те, варьирование уровня экспрессии которых между сортами коррелирует с изменчивостью изучаемого признака между теми же сортами

Для десяти сортов ячменя, полученных от семенной компании Cebeco Seeds В V (Нидерланды), были проанализированы шесть параметров солодования Для тех же 10 сортов с помощью кДНК-макрочипа был проанализирован уровень экспрессии 1440 генов в прорастающих семянах Было выявлено 100 дифференциально-экспрессируемых генов, уровень экспрессии которых отличался более чем в 2 раза при сравнении хотя бы двух сортов Далее, для 10 сортов были рассчитаны две матрицы попарных расстояний по Манхетгену (Average Manhattan distances) Первая матрица (табл2а) была основана на показателях одного из параметров солодования, обозначенного в анализе как VZ 45°С, а вторая матрица (табл2б) - на показателях уровня экспрессии 100 дифференциально-экспрессируемых генов Достоверность корреляции между двумя матрицами устанавливалась с помощью Мантель-теста (Mantel, 1967) Первоначально, значение Мантель теста составило g=-0 8027, означая, что корреляция между матрицами не является достоверной, так как 5% уровень достоверности достигается при (g=1.645). Можно предположить, что не все 100 генов, по разному экспрессируемых у 10 сортов, имеют отношение к анализируемому признаку пивоваренного качества Поэтому, из их числа необходимо элиминировать EST, негативно влияющие на корреляцию матриц Для этого была применена следующая процедура, первый EST в списке 100 EST (EST 1) был удален, и на основании показателей экспрессии оставшихся 99 EST была составлена новая матрица расстояний, которая была сравнена с матрицей пивоваренного параметра (VZ 45°С) Показатель Мантель-теста составил g= -0 7499, что превышает начальный показатель (-0 7499 > -0 8027) Был сделан вывод, что EST 1 негативно влияет на корреляцию, так как при его отсутствии показатель Мантель-теста повышается EST 1 был возвращен в список, вместо него EST 2 был исключен, и процедура пересчета экспрессионной матрицы и ее сравнения с фенотипической матрицей была повторена с результатом g= -0 8499 EST 2 положительно влияет на

корреляцию, так как его отсутствие понижает начальный показатель (-0 8499 < -0.8027) Действуя таким образом поэтапно со всеми 100 EST изначального списка, мы выявили 30 EST, позитивно влияющих на искомую корреляцию, показатели экспрессии которых формировали матрицу, достоверно (р<0 05) коррелирующую с матрицей, рассчитанной на основе признака пивоваренного качества С помощью той же процедуры кандидатные гены были идентифицированы и для остальных пяти параметров солодования

Таблица 2

Корреляция матриц попарных расстояний между 10 сортами ячменя, рассчитанных (а) на основе параметра солодовенного качества VZ 45° и (б) на основе экспрессионных профилей 100 генов Значение Мантель-теста составило g = -0 8027, означая отсутствие достоверной корреляции между матрицами Корреляция считается достоверной при g> 1 645 (р < 0 05)

Сорта 005 008 009 134 137 145 147 157 158 159

005 0

008 0 91 0

009 1.42 155 0

134 1 11 0 64 1 61 0

137 0 78 0 78 1 06 1 02 0

145 101 I 06 2 22 1 23 1.41 0

147 1 60 1 58 0 71 1 74 1 20 2 35 0

157 1 10 0 73 163 0 84 0 89 128 1 53 0

158 0 92 0 88 1 00 0 88 0 57 145 1 18 0.90 0

159 0 96 0 76 136 0.97 0 78 1 36 1.19 0 67 0 73 0

Сорта 005 008 009 134 137 145 147 157 158 159

005 0

008 179 0

009 1 14 0 65 0

134 0 28 1 51 0 86 0

137 0 30 149 0 84 0 02 0

145 1 74 0 05 0 60 1 46 1 44 0

147 2 50 0 71 136 2.22 2 20 0 76 0

157 2 93 1 14 1 79 2 65 2 63 1 19 0 43 0

158 2 20 0 41 1 06 1 92 1 90 0 46 0 30 0 73 0

159 1 69 0 10 0 55 141 1 39 0 05 0 81 124 051 0

Помимо генов, задействованных в процессах гидролиза крахмала и запасных белков, роль которых в процессе солодования у ячменя хорошо изучена, были выявлены дополнительные гены-кандидаты, чья возможная роль для солодования ранее не обсуждалась. Большинство из них кодирует ферменты, связанные с защитой клеток от

дегидратации и теплового шока Защитная функция этих ферментов действительно может иметь отношение к эффективности пивоваренного процесса на этапе сушки зеленого солода при высоких температурах В случае, если термостабильность гидролитических ферментов могла бы быть повышена за счет более активного синтеза шаперонов (в том числе белков теплового шока), производственные потери при сушке зеленого солода были бы значительно сокращены. Полученные результаты свидетельствуют о том, что пивоваренные и белковые сорта ячменя могут различаться не только по своему гидролитическому потенциалу, но также и по активности генов, кодирующих белки-шапероны, защищающие гидролазы от денатурации при высоких температурах в процессе пивоварения

Для дальнейшей проверки выявленные гены-кандидаты были локализованы на генетической карте Для этого была использована картирующая популяция дигаплоидных линий от скрещивания двух сортов ячменя Steptoe (белковый сорт) и Могех (пивоваренный сорт) (Kiemhofs et al., 1993) Эта популяция широко используется для картирования QTL пивоваренных качеств у ячменя (Hayes et al, 1993, Han et al, 1997) Изменчивость биохимических параметров солода среди дигаплоидных линий популяции детально документирована, и информация доступна через интернет

(http //wheat pw usda gov/ggpages/SxM/) Располагая информацией о позиции гена-кандидата на генетической карте Steptoe/Morex и данными о варьировании параметров солода среди дигаплоидных линий той же самой картирующей популяции, мы провели QTL анализ для параметров солода, чтобы оценить, совпадают ли позиции идентифицированных генов-кандидатов с позициями QTL для параметров пивоваренного качества на одной и той же генетической карте.

Для позиций 7 из 9 генов, картированных в популяции Steptoe/Morex, было зафиксировано совпадение с позициями QTL различных параметров пивоваренного качества. Это свидетельствовало о том, что хромосомные участки, где были локализованы гены-кандидаты, достоверно влияют на изменчивость солодовенного фенотипа Такое совпадение объяснимо, если предположить наличие полиморфизма в промоторном участке гена-кандидата между Steptoe и Могех в результате цис-регуляторной мутации, которая может повышать или понижать экспрессию гена, и если ген действительно имеет отношение к формированию пивоваренных свойств, то как следствие, повышается или понижается значение соответствующего параметра солодования В результате, в локусе, где был картирован ген-кандидат, QTL анализ фиксирует достоверную связь между полиморфизмом

локуса и варьированием признака пивоваренного качества - выявляется достоверный пик QTL для параметров солодования Чтобы проверить это предположение для одного из генов-кандидатов, взятого в качестве примера, были выявлены генетические факторы, определяющие уровень его экспрессии, путем картирования eQTL (expressedQTL) в популяции дигаплоидов от скрещивания Steptoe/Morex с использованием техники Real Time PCR (RT-PCR)

2.3. Идентификация геномных локусов, регулирующих экспрессию генов-кандидатов, на примере гена Cxpl

Ген-кандидат, выбранный в качестве примера, кодирует протеолитический фермент карбоксипептидазу 1 (senne carboxypeptidase I, Cxpl), играющую важную роль в расщеплении запасных белков в прорастающем семени и, следовательно, в формировании солода (Wmspear et al, 1984, Mikola, 1983) В наших экспериментах ген Cxpl (EST HY02B16) был идентифицирован как ген-кандидат, так как изменчивость уровня его экспрессии между 10 сортами ячменя коррелировала с характером изменчивости пивоваренных параметров, такими как вязкость (VZ45°) и экстрактивность

Относительный уровень экспрессии гена Cxpl был измерен с использованием RT-PCR, как у родительских генотипов Steptoe и Могех, так и среди 134 рекомбинантных потомков этого скрещивания в двух повторностях (в прорастающих семянах 2000 и 2001 годов репродукции) Родительские генотипы Steptoe и Могех показали стабильное, воспроизводимое различие в экспрессии Cxpl Экспрессия этого гена у пивоваренного сорта Могех достоверно превышала таковую у белкового сорта Steptoe, независимо от года репродукции семян, или повтора опыта проращивания Уровень экспрессии Cxpl в дигаплоидных линиях соответствовал нормальному распределению, и был подвергнут QTL анализу Коэффициент наследуемости количественного признака "уровень экспрессии Cxpl", определяющий долю генотипической изменчивости в наблюдаемых вариациях составил 21% Единственный достоверный eQTL (expressed QTL) для гена Cxpl был картирован на длинном плече хромосомы ЗН, в позиции непосредственно совпадающей с локусом, где ранее был картирован сам ген Cxpl (рис 2)

Совпадение позиций гена Cxpl и его eQTL на генетической карте свидетельствует о том, что различие в уровне экспрессии гена Cxpl у Steptoe и Могех вероятнее всего

определяется полиморфизмом в регуляторной части самого гена (цис-регуляторной мутацией) Иными словами, картированный е(}ТЬ представляет собой цис-еОТЬ

LOD

ол ш

Рис 2 Картирование eQTL для гена Cxpl интервальным методом в популяции 134 дигаплоидных линий, полученных от скрещивания Steptoe и Могех Кривые значений LOD показаны для двух повторов эксперимента (семена репродукции 2000 и 2001 гг) Семь хромосом ячменя обозначены как 1Н-7Н Числа под хромосомами обозначают наивысшее значение LOD, зафиксированное для данной хромосомы Горизонтальная линия обозначает местоположение гена Cxpl на генетической карте, где ген Cxpl был картирован с помощью SNP-маркера, выявленного в структурной части гена.

Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена Cxpl среди 90 сортов ячменя позволил выявить шесть полиморфных локусов, в которых могут происходить нуклеотидные замены (SNP) В зависимости от аллелей SNP в этих шести полиморфных локусах, проанализированные 90 сортов ячменя формируют четыре гаплотипа (табл 3) 24 сорта относились к гаплотипу I (аллель Могех в локусе Те945) и 66 сортов показали гаплотип II (аллель Steptoe в локусе Те945), причем второй гаплотип может быть далее подразделен на На (27 сортов), Ив (14 сортов) и Не (25 сортов), в зависимости от того, какой нуклеотид они несут в локусах Те931, Ui208 и Ui218

Три SNP (Til05, Те945 and Uil43) показали абсолютно неравновесное сцепление в наследовании (linkage disequilibrium, LD) с коэффициентом корреляции равным единице (табл 4) в произвольной выборке 90 генотипов ячменя Один из них, Те945, ранее использованный нами как молекулярный маркер для картирования гена Cxpl, оказался ассоциированным с уровнем экспрессии гена В зависимости от аллели в этом локусе, вся

Таблица 3

Нуклеотидные замены (БЫР) и гаплотипы (комбинации выявленные в локусе Схр1 по результатам сравнительного секвенирования локусау 90 сортов ячменя

Сорта

Позиции нуклеотидных замен (SNP)

Mo r ex

Madonna Pasadena

Krona

Alexis

Stexna

Henni.

Othira

Sally

Steptoe Extract Angora

Ti 105 (Я/С)

- TCAAAACTG$AAGCTC_ _ TCAAAACTG$AAGCTC_ .. TCAAAACTGgAAGCTC-

-TCAAAACTGCAAGCTC.. -TCAAAACTGCAAGCTC-_ TCAAAACTGCAAGCTC-

TCAAAACTGCAAGCTC.. T CAAAACTGCAAGCTС_ -TCAAAACTGCAAGCTC-.

-TCAAAACTGCAAGCTC-

- TCAAAACTGCAAGCTC-. TCAAAACTGCAAGCTC-

Te931 (G/Tl

Te9iStC/T)

. cggacttaacattt atgacat^cttg

cggacttaacattt atgacatgcttg -

cggactgaacattt atgacattcttg.

-CGGACTTAACATTT ATGACATTCTTG-

—CGGACTTAACATTT ATGACATTCTTG

.CGGACTTAACATTT ATGACATTCTTG

CGGACTTAACATTT ATGACATTCTTG-

CGGACTTAACATTT ATGACATTCTTG.

-CGGACTTAACATTT ATGACATTCTTG-

-CGGACTgAACATTT ATGACATTCTTG..

-CGGACTJ^AACATTT ATGACATTCTTG _

CGGACTgAACATTT ATGACATTCTTG-

Oil*3lG/&)

-tttggacaga-_ttt|gacaga_ „ttt|gacaga_

_tttagacaga_ _tttagacaga_

-tttagacaga.-

. tttagacaga.-tttagacaga— tttagacaga-

-tttagacaga. . tttagacaga-tttagacaga.

Ui2D8 (G/A)

-СТАТТТТТЙТАААТА -СТАТТТТТЙТАААТА CTATTTTTGTAAATA

. CTATTTTTGTAAATA CTATTTTTGTAAATA -CTATTTTTGTAAATA

„CTATTTTTGTAAATA . CTATTTTTGTAAATA CTATTTTTGTAAATA

-CTATTTTTGTAAATA -CTATTTTTGTAAATA —CTATTTTTGTAAATA

Ul218 (A/C)

AGCTfjCTTTTCTAA.

AGCT6CTTTTCTAA-

AGCT§CTTTTCTAA._

AGCTACTTTTCTAA-AGCTACTTTTCTAA-AGCTACTTTTCTAA-

AGCTACTTTTCTAA-AGCTACTTTTCTAA-AGCTACTTTTCTAA.

AGCTBCTTTTCTAA-AGCTACTTTTCTAA. AGCTACTTTTCTAA.

(a g с с a g)

Ila

(с t.t.a g a)

Jib

(C G T A G.A)

lie

(C.G T A A G)

Таблица 4

Коэффициент корреляции в попарных сравнениях г2 аллелей в шести полиморфных локусах гена Cxpl Достоверность корреляции оценена по критерию Фишера (Fisher's exact test) р<0 001

Позиции SNP Tfl05(A/Q

Te931(G/T) Tc94S(C/T) U/143(G/A) U/208(G/A)

Te931(G/T) Те945(САГ) U/143(G/A) U/208(G/A) U/218(A/C)

0 1196 1 1

0 2264 0 2529

01160 0 1120 04220 0 3716

02289 0 2553

0 2204 0 2903

0 8300

картирующая популяция может быть подразделена на две подгруппы дигаплоидные линии несущие аллель от Могех (С) и линии несущие аллель от Steptoe (Т) Подгруппа линий с аллелью Могех характеризуется значительно и достоверно (р<0 0001) более высоким уровнем экспрессии Cxpl, чем подгруппа Steptoe в двух повторах эксперимента.

Таким образом, стало возможным предположить, что аллели регуляторного локуса, определяющего экспрессию гена Cxpl, сцепленно наследуются с тремя вышеупомянутыми SNP в структурной части гена Если это предположение верно, тогда присутствие Могех-подобных аллелей (A/Til05, С/Те945, G/Uil43) в структурной части гена Cxpl должно быть ассоциировано с повышенным уровнем экспрессии гена Cxpl по сравнению со Steptoe-подобными генотипами (все разновидности гаплотипа II) в случайной выборке сортов ячменя. Чтобы проверить эту гипотезу, уровень экспрессии гена Cxpl был измерен среди уже упоминавшихся 90 сортов ячменя с помощью RT-PCR. Сравнение экспрессии гена Cxpl в прорастающих семенах этих сортов показало достоверное (р=0,005) различие уровня экспрессии в зависимости от гаплотипа структурной части гена Как и в популяции рекомбинантов от скрещивания Steptoe и Могех, сорта Могех-подобного гаплотипа I характеризовались более высоким уровнем экспрессии Cxpl по сравнению с сортами Steptoe-подобного гаплотипа II

В картирующей популяции Steptoe/Morex eQTL гена Cxpl позиционно совпадает с QTL одного из параметров солодования «диастатическая энергия» (Diastatic Power, DP) (рис 3) Этот параметр характеризует общую ферментную активность в прорастающем семени и позволяет оценить эффективность энзимной атаки на крахмал и запасные белки семени при прорастании По показаниям DP судят насколько быстро и эффективно запасные вещества семян деполимеризируются и становятся доступными для последующего дрожжевого брожения

Позиционное совпадение картированного eQTL гена Cxpl и одного из QTL для диастатической энергии, свидетельствует о том, что уровень экспрессии гена-кандидата Cxpl действительно может вносить определенный вклад в изменчивость этого селекционно-важного признака пивоваренного качества Для успешного гидролиза крахмала необходима деполимеризация протейного матрикса, в который заключены крахмальные зерна, так как матрикс препятствует доступу гидролаз (Bethke et al 1999) Карбоксипептидазы, включая Cxpl, играют важную роль в этом процессе, расщепляя протеиновый матрикс От их активности, в конечном итоге, может зависеть эффективность процесса гидролиза, которую и отражает диастатическая энергия

LOO

Рис 3. Сравнение позиций eQTL гена Cxpl (сплошная линия) и QTL для параметра солодования DP (эффективность гидролиза крахмала и запасных белков в прорастающем семени ячменя, пунктир), i Верхняя часть рисунка: кривые LOD-оценок, пороговое значение достоверности для eQTL (LOD=2,9), 1 для DP QTL (LOD=2,7). Нижняя часть рисунка: аддитивный эффект аллелей Steptoe, рассчитанный как пропорция от стандартного отклонения соответствующего признака. Позиция eQTL гена Cxpl на хромосоме ЗН совпадает с позицией QTL для параметра солодования DP (обозначено стрелкой).

Проведенный анализ свидетельствует о том, что повышенная экспрессия Cxpl 1 коррелирует с более высокими показателями качества солодования у ячменя и ассоциирована с присутствием определенных аллелей в структурной части гена (гаплотип I). Однако такой ^ признак как пивоваренное качество имеет сложную природу, и, помимо гена Cxpl, его формирование зависит от вклада множества других генетических факторов. Как следствие, не все пивоваренные сорта ячменя относятся к гаплотипу I по гену Cxpl (например, немецкий сорт | Barke). Кроме того, гаплотип I встречается у некоторых типичных высокобелковых непивоваренных сортов (Golf). Тем не менее, пивоваренный фенотип может быть усовершенствован в сортах, селектируемых для пивоваренных целей, путем замещения в К локусе Cxpl аллелей гаплотипа И на гаплотип I.

Для этого в качестве маркера-диагноста и помощника селекции может быть применен ; выявленный нами SNP (Те945), который был конвертирован в более удобный для ' использования CAPS маркер. Использование CAPS маркера избавляет от необходимости трудоемкой процедуры секвенирования локуса Cxpl. Достаточно провести обычную

1 25

полимеразно-цепную реакцию с последующей обработкой продукта амплификации рестрикционным ферментом Fok\. Рестриктаза подобрана так, чтобы участок цепи ДНК, j который Fok\ „узнает" в качестве мишени, совпадал с участком нуклеотидной замены. Аллель Могех формирует рестрикционный сайт для данного фермента, в случае же аллели Steptoe рестриктаза не разрезает нуклеотидную цепь. Вследствие этого, генотипы ячменя с Steptoe-подобной и Могех-подобной аллелью Cxpl легко различить на агарозном геле (рис.4). Предложенный CAPS может быть непосредственно использован в селекции, так как маркирует присутствие в генотипе растения Могех-подобной аллели гена Cxpl, что означает высокую вероятность повышенной экспрессии этого гена, а следовательно, более интенсивный процесс протеолиза запасных белков семян и более эффективное солодование.

Рис.4. Дигаплоидные линии потомства от скрещивания сортов Steptoe и Могех, несущие разные аллели гена Cxpl: S - аллель, унаследованная от Steptoe, M - аллель, унаследованная от Могех. Полиморфизм визуализирован с помощью CAPS маркера.

3, Сопряженное картирование генов ячменя и регуляторов их транскрипции с помощью геночипа Affymetrix 22К Barleyl GeneChip

Современные технологии транскриптомного анализа позволяют сравнить уровень экспрессии десятков тысяч генов между двумя различными генотипами. Если дополнительно проанализировать уровень экспрессии генов среди потомства от их скрещивания, становиться возможным картировать полиморфные локусы (eQTL), определяющие варьирование уровня экспрессии генов между двумя генотипами в масштабе всего генома. Этот прием, получил название генетической геномики („genetical genomics"; Jansen, Nap, 2001). Мы применили подход генетической геномики для картирования регуляторов транскрипции генов ячменя в популяции дигаплоидных линий от скрещивания Steptoe и Могех с помощью олигонуклеотидного микрочипа Affymetrix 22К Barleyl GeneChip.

Микрочип Affymetrix представляет собой миниатюрную матрицу, на которую в определенном порядке нанесены 25-мерные олигонуклеотидные последовательности - пробы (probes). Пробы соответствуют определенным фрагментам кодирующих последовательностей ДНК (генов) того организма, для которого микрочип был создан. Для каждого гена предусмотрен набор из одиннадцати проб (probe-set), почти полностью покрывающий

- . ** -- ' ■ Ф^ тт , — —». —

зясзз?-'?^ wkkssz^ аиг SSS^bésibs» ec.st

' -" • .. ... ' Ч-£. • ' ..Ь-w'. V- -- - ' ■ ' ' * -V V S S M. M. ЛI s. ,Д I M M S- MVS : S M M. M s M' M

конкретную кодирующую последовательность ДНК На геночипе ячменя (Afiymetrix 22К Barley 1 GeneChip) представлены 22840 таких пробо-сетов (probe-sets), каждая из одиннадцати проб, образующих пробо-сет, представляет собой короткую нуклеотидную последовательность, «списанную» с определенного участка кодирующей части гена Нуклеотидные последовательности проб доступны из сети http //www plexdb org/modules/ PD_probeset/ annotation php,genechip=Barleyl Для гибридизации с микрочипом, иРНК, выделенная из анализируемого тканевого образца, конвертируется сначала в одноцепочечную, а затем в двуцепочечную кДНК Последняя используется как матрица для транскрипции кРНК m vitro, в процессе которой 5' конец кРНК метится биотиновой меткой Полученный пул синтезированных кРНК тестируемого организма, помеченных флюоресцентной меткой, гибридизуется с комплементарными олигонуклеотидными последовательностями микрочипа Интенсивность сигнала гибридизации оценивается с помощью лазерного сканирования

При вычислении сигнала, значения интенсивности пикселей для каждой пробы преобразуются в числовое значение Эти значения суммируются в файле, имеющим стандартное расширение «CEL» С результатами гибридизаций, записанными в CEL файлах, можно работать на двух уровнях а) анализируя уровень сигналов 11 отдельных проб для каждого гена (Probelevel analysis), и б) анализируя уровень обобщенного сигнала для каждого гена (Gene Abundance Estimates).

3.1. Принцип генотипирования сегрегантов картирующих популяций с помощью олигонуклеотидных микрочипов Affymetra

Структура и дизайн олигонуклеотидных микрочипов Affymetrix позволяет не только проводить одновременное тестирование уровня транскрипции нескольких тысяч генов, но и параллельно выявлять полиморфные участки в последовательностях кРНК, синтезированных в процессе анализа in vitro с матричных кДНК Так, если сравнивать результаты гибридизации на микрочип кРНК двух родительских генотипов Steptoe и Могех, можно выявить весьма значительную фракцию всех нуклеотидных замен, существующих между этими двумя генотипами ячменя При этом два типа информации (уровень экспрессии тысяч генов и наличие в их нуклеотидной последовательности полиморфных локусов) могут быть получены одновременно, при обработке результатов одного и того же эксперимента Уровень транскрипции каждого гена рассчитывается как взвешенная средняя сигналов всех 11 проб, представляющих на микрочипе данную кодирующую последовательность ДНК Поиск

полиморфизма между двумя генотипами, для которых проводится гибридизация на микрочип (генотипирование), имеет в виду анализ сигналов на уровне отдельных проб для каждого гена

На примере гена Contig5061_at, рис 5 демонстрирует числовые значения сигналов для трех повторностей гибридизаций Steptoe и Могех для всех 11 проб данного гена Если нуклеотидная последовательность гена у обоих сортов полностью комплементарна 25-мерному олигомеру (пробе), закрепленному на микрочипе, для обоих сортов данная проба покажет сигнал примерно одинаковой интенсивности (например, сигналы первой пробы Contig506l_at_l у повторностей Steptoe и Могех) Однако, любая нуклеотидная замена, вставка или делеция у одного из родительских генотипов в участке гена, "охваченным" пробой Affymetrix, нарушат комплементарность, что отразится на кинетике гибридизации, и сигнал этой пробы для «некомплементарного» генотипа будет существенно ниже При сравнении сигнала седьмой пробы Contig5061_at_7 для двух генотипов можно заметить, что сигнал Steptoe на порядок ниже, чем сигнал Могех Отсюда делается заключение, что в кодирующей последовательности Contig5061_at в районе, комплементарном последовательности

ATTCGTCCAGTCGTACTGCATATAC (седьмая проба Cont¡g5061_at_7), у генотипа Steptoe имеет место нуклеотидная замена, которой нет у генотипа Могех После установления факта полиморфизма отдельного гена между родительскими сортами, становится возможным «вычислить» какую именно родительскую аллель Steptoe или Могех унаследовала каждая дигаплоидная линия для гена Contig5061_at (рис 5) Даже визуально можно установить, что линия DH116 унаследовала аллель Могех (сигнал пробы Contig5061_at_7 равен 405.9), a DH12 -аллель Steptoe (сигнал пробы Contig5061_at_7 равен 26.1)

Описанный тип полиморфизма, определяемый на основании разницы сигнала одной пробы в пробо-сете, получил название SFP (Single Feature Polymorphism) (Rostoks et al., 2005) В дополнение к SFP, был предложен еще один класс маркеров, названный Gene Expression Markers (GEMs) (West et al, 2006) Этот класс маркеров основан на качественном различии в уровне экспрессии гена между двумя генотипами, причем уровень экспрессии рассчитывается как обобщенный сигнал всех 11 проб. GEMs продемонстрированы на нашем материале с генотипами ячменя Steptoe, Могех и дигаплоидными линиями от их скрещивания. Рис 5 показывает, что сигнал любой пробы гена Contigl0883_at, а значит и общий суммарный уровень экспрессии гена, в гибридизациях Могех на порядок ниже, чем в гибридизациях Steptoe Эта разница является воспроизводимой в картирующей популяции дигаплоидов линия DH116 унаследовала аллель Могех,a DH12 - аллель Steptoe (рис 5)

Q I-

Contig5061_atl Contig5061_at2 Contig5061 at3 Contig5061_at4 Contig5061_at5 Contig5061_at6 /Contig5061_at7 Contig5061_at8 Contig5061_at9 Contig506!_atl0 Contig5061 atll

Contigl0883 _atl ^ Contig 10883_at2 Contigl 0883_at3 \Contigl0883_at4 )Contigl0883jit5 , Contigl0883_at6 i Contigl 0883_at7 I Contigl0883_at8 I ContlgI0883_at9 rContigl0883_atl0 Contigl0883_atl 1

ш ш т S1 S2 S3

545.1 432.6 544.9 431.1 350.9 434.9

480.9 614.5 729.4 604.0 606.4 834.6

314.2 213.3 289.4 301.4 226.3 286.8

277.3 151.0 284.0 348.1 244.0 273.5

910.4 787.2 819.0 547.1 384,7 595.0

884.9 781.1 1039.4 684.1 683.4 506.8

ш IP # 25.8 28.1 25.3

1142.4 1403.1 1183.0 1083.5 985.3 1187.0

480.9 303.9 537.0 420.5 346.9 411.9

623.6 334.9 600.9 601.0 385.2 551.5

813.5 479.9 765.0 942.7 652.6 775.4

Dltil 6 DH12 оЩг ОШ38 slti5 DH...

397.2 369.4 460.6 450.5 593.0

423.6 479.2 691.9 728.1 767.2

311.0 298.4 411.7 258.0 451.6

160.1 143.8 410.1 214.7 307.2

719.6 601.7 655.5 588.9 1009.8

1052.4 753.0 866.0 886.7 1290.7

4(15.4 26.1 зЦ> ш 466.1

990.5 890.7 1150.2 1163.6 1247.5

470.9 341.1 472.4 442.4 612.7

538.1 538.9 665.6 549.2 635.1

640.0 650.5 813.0 719.0 730.0

ОНИ 6 DH12 гниз DH130 DH135 DH...

21,0 ш 285.9 16.2 136.9 233.7

252.8 18.1 211.8 156.1

21.0 247.4 22.1 291.6 266.4

1Q.7 41.4 10.8 38.9 22.7

22.2 50.3 116.7 162.9 44.2 64.6 80.7 193.1 90.1 147.2

17.4 169.2 52,5 127.1 153.3

12.2 67.9 10.5 66.5 37.6

68.8 501.4 99.4 369.1 372.8

3.4,2 155.9 83.0 182.4 205.8

72:о 611.1 щ 645.0 517.8

Рис.5. Транскрипционные маркеры TDMs как комбинация полиморфизма одиночной пробы (Single Feature Polymorphism, SFP, Contig5061_at7) и полиморфизма общего уровня экспрессии гена (Gene Expression Markers, GEMs, пробы Contig 10883_at). Нормализованные значения для двух генов (Contigs506i at и Contigsl0883_at) отражают интенсивность сигнала каждой из одиннадцати проб. М1-МЗ и S1-S3 обозначают три повторное™ гибридизации с родительскими генотипами Могех и Steptoe, за ними следуют дигаплоидные линии. Визуально различаемая аллель Могех выделена тенью.

3.2. Принцип выделения транскрипционных маркеров (Transcript Derived Markers, TDM) из экспрессионных профилей

В нашей работе предлагается новый способ эффективного извлечения генетических маркеров из экспрессионных профилей, такие маркеры получили название Transcript Derived Markers (TDMs) Под транскрипционным маркером (TDM) подразумевается одна из одиннадцати проб данного гена, демонстрирующая 1) неперекрывающуюся разницу в уровне сигнала между двумя родительскими генотипами и 2) позволяющая разделить всю совокупность дигаплоидных линий данной расщепляющейся популяции на два класса, каждый из которых несет одну из родительских аллелей Для практической идентификации TDM поочередно анализируется каждая из 250811 проб (22801 генов на микрочипе, каждый имеет по 11 проб, 22801 х 11 = 250811), и отбираются лишь те пробы, которые позволяют разделить все дигаплоидные линии популяции на два неперекрывающихся, обособленных кластера, как например, проба 7 в случае гена Contig5061_at или любая из проб гена Contigl0883_at (рис 5) Очевидно, что в случае SFPs (Contig5061_at, проба 7) только одна или две-три пробы могут соответствовать этому критерию, в случае же GEMs (Contigl0883_at) все пробы продемонстрируют явную разницу в сигнале между двумя кластерами В случае, если несколько проб для одного гена удовлетворяют критериям TDM, из их числа выбирается одна, наиболее достоверная

Для выяснения вопроса, насколько достоверным является генотипирование на основе

TDMs, нами были использованы данные сиквенса 203 генов ячменя для генотипов Steptoe и

Могех и дигаплоидов от их скрещивания После сравнения последовательностей Steptoe и Могех

были выявлены нуклеотидные замены (SNP), и далее для каждого SNP в популяции

дигаплоидов было установлено, SNP-аллель Steptoe или Могех унаследовала каждая

дигаплоидная линия Те же самые дигаплоидные линии были независимо генотипированы с

помощью TDMs Таким образом, мы имели возможность сравнить точность генотипирования

TDMs с результатами генотипирования SNP для 30 дигаплоидных линий Из 30 возможных

случаев был подсчитан процент совпадений, при которых результаты секвенирования (SNP) и

рассчитанные TDMs совпали в прогнозировании родительской аллели данного гена для

конкретной дигаплоидной линии. Результаты верификации TDMs показали, что в 95% случаев

все 30 линий были генотипированы правильно, или с ошибкой для одной-двух линий из

тридцати Вероятность ошибки при генотипировании с помощью TDMs, когда из тридцати

дигаплоидных линий родительская аллель была ошибочно предсказана для более чем двух

линий, составила не более 5% Описанный выше принцип был использован для идентификации

TDM и картирования генов ячменя с помощью Aflymetrix 22К Barley 1 GeneChip по результатам гибридизации на микрочип препаратов РНК, выделенных из 30 дигаплоидных линий для ткани зародыша семени и листьев проростков Для двух этих типов тканей было идентифицировано 2449 и 3858 TDMs соответственно Две этих совокупности TDMs перекрывались между собой примерно на 40% Идентифицированные TDMs были картированы в популяции рекомбинантов от скрещивания Steptoe и Могех, в результате чего 3029 транскрибируемых генов были локализованы на генетической карте ячменя

3.3. Построение генетической карты скрещивания Steptoe и Могех на основе маркеров TDM и общегеномное картирование eQTL

При анализе гибридизаций на микрочип 139 дигаплоидных линий для тканей зародыша семени были выявлены 1596 TDM маркеров, которые были картированы на семи хромосомах ячменя Общая длина карты составила 1017 сМ Полученная генетическая карта включала 512 рекомбинационных бинов и была использована для картирования eQTL Картирование eQTL проводилось только для генов, уровень транскрипции которых достоверно отличался от гибридизационного шума по крайней мере для двух из трех повторов гибридизаций одного из родителей (Steptoe или Могех) Таким образом, из 22801 генов ячменя, представленных на микрочипе Aflymetrix, картирование регуляторов транскрипции осуществлялось для 15967 генов (70%) Для каждого из этих 15967 генов было проведено картирование eQTL методом CIM (Compositive Interval Mapping, Zeng, 1993) Всего, при картировании регуляторов транскрипции 15967 генов ячменя было зафиксировано 23738 достоверных eQTL Табл5 обобщает полученную информацию ни одного достоверного eQTL не было выявлено для 19% проанализированных генов, для остальных 81% (12987 генов) было зафиксировано до шести достоверных eQTL

Таблица 5.

Число достоверных eQTLs (Р<0 05) обнаруженных для каждого из 15967 генов

Число достоверных (Р<0 05) eQTLs на один ген Сколько генов выявлено Процент генов от общего числа

0 2980 18 7%

1 5764 36 1%

2 4515 28 3%

3 1997 12 5%

4 616 3 8%

5 83 0 5%

6 12 0 1%

Всего генов 15967

3.4. Сгущения (hotspots) eQTL на генетической карте скрещивания Steptoe и Могех

Установлено, что распределение выявленных 23738 eQTL на генетической карте Steptoe/Morex не является равномерным Для каждого из 512 бинов было расчитано относительное число картированных eQTL, приходящихся на один сантиморган В результате были идентифицированы 14 бинов из начального числа 512, где число картированных eQTL достоверно превышало ожидаемое в случайном процессе Идентифицированные участки генома со сгущениями eQTL представляют интерес в смысле выявления транс-регуляторных локусов, определяющих активность не одного, а сразу большого числа генов С наибольшей вероятностью такие транс-регуляторы, влияющие на уровень транскрипции сразу нескольких генов, могут быть локализованы в сгущениях eQTL с более низким процентом объясненной фенотипической изменчивости (R2) (таблб, выделено жирным шрифтом) При подобном анализе геномов у секвенированных организмов отмечалось, что транс-eQTL, как правило, ассоциированы с более низкими R2 (Hughes et al, 2006, West et al., 2007) В таких сгущениях eQTL было также обнаружено преобладание одной из родительских аллелей с позитивным эффектом

Таблица 6

Сгущения eQTL, выявленные в картирующей популяции ячменя от скрещивания Steptoe и Могех Хи-квадрат (%2) оценивает достоверность преобладания позитивного эффекта от одного родителя по сравнению со вторым родителем для всех eQTL, картированных в данном сгущении Сгущения eQTL, отличающиеся преобладанием eQTL с низким процентом объясненной фенотипической изменчивости (R2), подчеркнуты и выделены жирным шрифтом

Is 55 ёй а

«* S? —. а ° «t- >s ц>

§ I «£ а §0§е »g р. | § ?

§ а I® О id a S (3 1 1 t3 i S lis - 1д 8

i i it I If ii lib ill in ml

2H 12 33 9 134 23 40% 60% 0 0237 0 270

2H 26 52 9 136 08 72% 28% <0 0001 0.190

2H 32 61 9 191 07 50% 50% 0 9436 0340

2H 37 65 5 197 07 41% 59% 0 0084 0 320

5H 1 00 236 29 17% 83% <0 0001 0 200

5H 5-6 51 453 66 9% 91% <0 0001 0.160

5H 41-42 58 1 105 1 5 62% 38% 0 0147 0 300

5H 44 62 5 384 22 50% 50% 0 8384 0 300

7H 26-29 351 685 58 4% 96% <0 0001 0180

Рис.6. Ассоциация между фенотипическими pQTL для параметров солодования и сгущениями eQTL, картированных для уровня транскрипции генов. Непрерывные кривые, выделенные серым цветом, соответствуют значениям LOD-оценки в соответствующем локусе генетической карты для пивоваренных параметров: содержание белка (GP), активность альфа-амилазы (АА), диастатическая энергия (DP), и экстрактивность (М£). Ось ординат справа отражает шкалу LOD-оценки для pQTL пивоваренных признаков. Горизонтальные линии соответствуют пороговому уровню LOD, выше которого pQTL рассматриваются как достоверные (Р<0.05). Вертикальные черные линии соответствуют 14 сгущениям eQTL (табл.6). Высоты черных вертикальных линий оцениваются по шкале на оси ординат слева, которая отражает количество eQTL, зафиксированных в соответствующем сгущении. Стрелками обозначены позиции совпадений pQTL со сгущениями eQTL.

3.5. Сопоставление локусов сгущений eQTL с позициями QTL для важнейших параметров солодования у ячменя

Выявленные сгущения регуляторных локусов, в которых нуклеотидный полиморфизм

между Steptoe и Могех влияет на уровень транскрипции нескольких сотен генов, могут также

иметь отношение к различиям по пивоваренному качеству между двумя этими сортами,

которое селектировалось в разных направлениях: пищевой сорт Steptoe на высокое содержание

белка, пивоваренный сорт Могех - на пониженное содержание белка. Используя

опубликованные данные (Hayes et al., 1993) по изменчивости параметров солода для тех же

самых 139 дигаплоидных линий, с помощью которых проводилось картирование eQTL, мы

провели картирование QTL для четырех параметров солодования. Требовалось установить,

совпадают ли локусы сгущений еСПХ с позициями ОТЬ для фенотипических признаков (рЬеп^уре (}ТЬ, рОТЬ) Результаты представлены на рис б Для всех четырех проанализированных параметров солодования был картирован хотя бы один достоверный рС)ТЪ, который совпал по позиции на генетической карте хотя бы с одним из локусов сгущений е(?ТЬ на хромосомах 2Н, 5Н или 7Н Обнаружено, что локус сгущения е(ЗТЬ на хромосоме 2Н влияет на изменчивость всех четырех проанализированных параметров солода

3.6. Ограниченная плейотропия цис-регуляторных мутаций

Ограниченная плейотропия цис-регуляторных мутаций вперые была исследована нами в общегеномном масштабе на примере ячменя Для этого было проведено сравнительное картирование 2081 цис-еСЗТЬ в двух типах ткани, соответствующим также двум разным последовательным стадиям развития растения - зародыша прорастающего семени и листьям 12-дневных проростков Таким образом было проанализировано наследование 2081 цис-регуляторных мутаций дигаплоидными линиями от скрещивания 51ер1ое и Могех, и кроме того, мы сравнили эффект, оказываемый такими мутациями на уровень транскрипции генов в двух разных тканях Было обнаружено, что для многих генов наследование определенной родительской аллели ферШе или Могех) может влиять на регуляцию транскрипции самым критическим образом Однако обнаружить это влияние можно было только при определенных условиях Так, для 30% проанализированных цис-регуляторных мутаций их эффект на уровень транскрипции гена проявлялся в одной ткани, но не обнаруживался в другой. Например, в случае Соп^13784_а1 (рис 7А) ген активно транскрибировался как в зародыше семени, так и в листьях, однако эффект цис-регуляторной мутации проявлялся лишь в одной ткани, то есть обладал ограниченной плейотропией.

Мы также наблюдали примеры когда в одной ткани повышенная экспрессия гена определялась присутствием, например, аллели Могех, а в другой ткани - повышенная экспрессия фиксировалась у линий с аллелью 8(ерЮе, то есть имел место обратный эффект родительской аллели, влияющий на уровень экспрессии гена в двух разных тканях Так, в примере Соп^4374_з_а1 (рис 7В) у дигаплоидных линий, унаследовавших аллель 81ер1ое, уровень транскрипции гена оставался неизменным в зародыше семени и в листьях Однако, у линий, унаследовавших аллель Могех, уровень транскрипции гена повышался в тканях зародыша, но понижался в листьях Наблюдаемые результаты можно объяснить, если предположить в случае 81ер1ое мутацию в участке энхансера, ответственного за тканеспецифичную регуляцию экспрессии гена Мутации в участке энхансера могли иметь

место еще для 34 генов, у которых в анализе был выявлен противоположный эффект

родительской аллели на уровень транскрипции генов в разных тканях.

Рис.7. Ограниченная плейотропия цис-регуляторной мутации (А) и обратный эффект родительской аллели на уровень транскрипции гена в двух разных тканях (В). Уровень транскрипции, оцениваемый по логарифму интенсивности сигнала на микрочипе Aflymetrix, соответствует шкале на оси ординат. I Черным цветом обозначены уровень экспрессии гена в зародыше семени, серым - в листьях. Первые 6 столбиков на диаграммах для каждой ткани соответствуют 3 повторам Могех (М) и 3 повторам Steptoe i (S), за которыми следуют 30 дигаплоидов от их скрещивания А - Contigl 3784—at, ген активно транскрибируется в обоих типах ткани, однако эффект цис-регуляторной мутации (аллель Steptoe повышает уровень транскрипции гена по сравнению с аллелью Могех) ! проявляется лишь в зародыше семени (ограниченный плейотропный эффект).

В - Coiltig4374_s_at, аллель Steptoe (S) определяет одинаковый уровень транскрипции гена в тканях I зародыша семени и листьев, в то время как аллель Могех (М) повышает уровень транскрипции в зародыше семени и понижает в листьях.

ВЫВОДЫ

i I, По результатам анализа филогенетических взаимоотношений 29 видов Vicia subgenus Vicia методами RAPD, AFLP и рестрикционного анализа хлоропластных генов очерчен круг - ближайших родственных таксонов для культивируемых видов вики, а также выдвинута гипотеза о возможной предковой форме культурного вида V.faba.

I 2. По результатам анализа генофонда культурного вида V.sativa (1122 образцов из коллекций двух генбанков) методом AFLP предложен оригинальный метод классификации генетического 1 разнообразия возделываемых видов на основе расчета коэффициентов генетической оригинальности образцов по Смирнову.

3. Создана коллекция 27512 EST, представляющая собой набор фрагментов кодирующих ) последовательностей ДНК, выделенных из тканей семени ячменя на разных стадиях 1 прорастания. Нуклеотидные последовательности EST и их функциональные аннотации доступны для пользователей (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/cr-est/index.php). На основе коллекций EST создан инструмент для транскриптомного анализа ячменя - кДНК-макрочип.

4 Впервые проанализирована динамика экспрессии генов в процессе прорастания семени ячменя с использованием кДНК-макрочипа Установлено, что гены, преимущественно экспрессируемые в зародыше и щитке, кодируют белки клеточного цикла, процессов трансляции, нухлеотидного метаболизма, углеводного обмена и транспортных функций Гены, активные в алейроновом слое эндосперма, в основном определяют процессы гидролиза углеводов и метаболизма аминокислот На примере запасных белков и ингибитора трипсина было показано, что эндосперм прорастающего семени ячменя может содержать значительное количество деградирующих транскригггов, синтезированных на предыдущих этапах развития и созревания семени

5 По результатам экспрессионного анализа с использованием кДНК-макрочипа десяти сортов ячменя, различающихся по параметрам солодования, разработан функционально-ассоциативный подход для выявления корреляции между изменчивостью экспрессионных профилей и изменчивостью признаков пивоваренного качества В результате идентифицированы 19 генов-кандидатов, чья экспрессия, возможно, определяет пивоваренные качества у проанализированных сортов ячменя

6 На примере одного из идентифицированных генов-кандидатов карбоксипептидазы 1 (Cxpl) продемонстрирована стратегия картирования генетического локуса, определяющего уровень экспрессии гена-кандидата, с последующим созданием молекулярного маркера-помощника селекции, позволяющего проводить отбор генотипов с желательной повышенной или пониженной экспрессией гена-кандидата

7 Впервые проанализирован уровень транскрипции 22801 генов в прорастающих семенах двух генотипов ячменя Могех и Steptoe, а также у 139 дигаплоидных линий от их скрещивания с использованием микрочипа Affymetnx 22К Barley 1 GeneChip На основе полученных данных разработан новый тип молекулярных маркеров - транскрипционные маркеры (Transcript Derived Markers, TDM) С их помощью на генетической карте ячменя впервые установлено местоположение 3029 транскрибируемых генов Создан каталог, содержащий информацию о линейной последовательности этих генов на хромосомах и генетических расстояниях между ними В рамках того же эксперимента на карте скрещивания Steptoe/Morex локализованы генетические локусы (eQTL), от полиморфизма которых зависит уровень транскрипции 12987 генов

8 Установлено, что картированные с помощью геночипа Affymetnx генетические локусы,

достоверно влияющие на уровень транскрипции генов у ячменя (eQTL), неравномерно

распределены на генетической карте На хромосомах 2Н, 5Н и 7Н выявлены сгущения eQTL

(eQTL hotspots), которые могут указывать на присутствие транс-регуляторных локусов, влияющих на транскрипцию не одного, а сразу большого числа генов Позиции выявленных сгущений eQTL совпадают с позициями некоторых QTL для признаков пивоваренного качества

9 Результаты транскриптомного анализа с использованием Affymetnx 22К Barleyl GeneChip показали, что нуклеотидный полиморфизм, существующий между двумя сортами ячменя, может достоверно влиять на уровень экспрессии более 80% транскрибируемых генов Уровень транскрипции более половины из этих генов зависит от не одного, а нескольких полиморфных генетических локусов (eQTL)

10 Полиморфные генетические локусы, определяющие уровень транскрипции генов (eQTL), с самыми высокими показателями LOD, позиционно совпадают с положением самих генов на генетической карте Это свидетельствует о том, что причиной наиболее существенных изменений в уровне экспрессии гена могут служить цис-регуляторные мутации, нарушающие взаимодействие регуляторных участков гена с РНК-полимеразой и транскрипционными факторами

11 Ограниченная плейотропия цис-регуляторных мутаций вперые исследована в общегеномном масштабе на примере ячменя Для этого было проведено сравнительное картирование 2081 цис-eQTL для генов в двух типах ткани, соответствующим также двум разным последовательным стадиям развития растения Эффект 30% цис-регуляторных мутаций, выявленных при транскриптомном анализе популяции дигаплоидных линий от скрещивания двух генотипов (Steptoe и Могех), ограничивался конкретной тканью или возрастной стадией

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК1

1 Potokina Е. Gene expression quantitative trait locus analysis of 16,000 barley genes reveals a

complex pattern of genome wide transcriptional regulation / E Potokina, A. Druka, Z Luo, R Wise, R Waugh, M J Kearsey // Plant Journal - 2008 - V 53 - P 90-101

2 Потокина EK. Внутривидовое разнообразие Vicia /aba L и вопрос о происхождении

возделываемых бобов по результатам молекулярного маркирования генома / Е. К Потокина, С В Булынцев, H Томоока, Д Воган // Сельскохозяйственная биология -2008 - № 3 - С 47-58

3 Potokina E SFP genotyping from Affymetnx arrays is robust but largely detects cis-acting

regulatory genes / Z W Luo, E. Potokina, A Druka, R Wise, R Waugh, M J Kearsey // Genetics -2007 -V 176 -P 789-800

4. Потокнна Е.К. Современные методы геномного анализа в исследованиях генетики количественных признаков у растений / ЕК, Потокина, ЮВ. Чесноков// Сельскохозяйственная биология -2006 - № 3 - С 3-18 5 Potokina Е Large-scale analysis of the barley transcriptome based on Expressed Sequence Tags / H N Zhang, N Sreenivasulu, W Weschke, N Stein, S Rudd, V Radchuk, E Potokina, U Scholz, P Schweizer, U. Zierold, P Langridge, R K. Varshney, U Wobus, A Graner // Plant Journal -2004 -V40 -P 276-290 6. Potokina E Functional association between malting quality trait components and cDNA array based expression patterns m barley (Hordeum vulgare L) / E Potokina, M Caspers, M Prasad, R Kota, H Zhang, N Sreenivasulu, M Wang, A Graner // Molecular Breeding -2004 -V 14 -P 153-170

7 Potokina E. AFLP diversity in common vetch (Vicia sativa L) on the world scale / E Potokina,

F R Blattner, T Alexandrova, К Bachmann // Theoretical and Applied Genetics - 2002. -V 105 -P 58-67

8 Потокина E К Перекрестник или самоопылитель? Электрофорез запасных белков семян как

метод определения способа опыления видов бобовых / Э Э Егги, Е.К. Потокина // Ботанический журнал - 1998 -Т 83_№12 - С 77-83

9 Потокина Е.К. Особенности опыления однолетних видов рода Vicia (Fabaceae) / ЕК.

Потокина, Т Г Александрова//Ботанический журнал - 1996 -Т81 -С 74-79.

10 Потокнна Е.К. Коэффициенты генетической оригинальности образцов коллекции вики

посевной (Vicia sativa L) по результатам молекулярного маркирования / Е К. Потокина, Т Г Александрова // Генетика - 2008 - № 11 (в печати) Статьи в рецензируемых журналах'

11 Potokina Е. Expression genetics and haplotype analysis reveal cis regulation of serine

carboxypeptidase I (Cxp\), a candidate gene for malting quality in barley (Hordeum vulgare L.) / E Potokina, M Prasad, L Malysheva, MS Roder, A Graner // Functional and Integrative Genomics -2006 - V6№l.-P25-35.

12 Potokina E cDNA array analysis of stress-induced gene expression in barley androgenesis /

S D.F Maraschin, M Caspers, E. Potokina, F Wulfert, A Graner, HP. Spamk, M. Wang // Physiologia Plantarum -2006 -V 127 №4 -P 535-550 13. Potokina E Der steinige molekulare Weg zu besserem Malz / M Roder, E. Potokina, L Malysheva-Otto, I Matthies, A Graner //VorMge Pflanzenzilchtung - 2006 - V 69 - P. 8385

14 Potokma E Molecular mapping m barley shifting from the structural to the functional level / A

Graner, T Thiel, H Zhang, E Potokma, M Prasad, D Perovich, R Kota, R К Varshney, U Scholz, I Grosse, N Stein //Czech Journal of Genetics and Plant Breeding - 2005 -V41 №3 -P 81-88

15 Potokma E A simple hybridization-based strategy for the generation of non-redundant EST

collections - a case study in barley (Hordeum vulgare L) / R К Varshney, H N Zhang, E. Potokma, N. Stein, P. Langndge, A Graner // Plant Science - 2004 - V 167 №3 - P 629634

16 Potokina E. Electrophoretic patterns of seed proteins in the East Asian Vicia species

(Legummosae) and their systematic utility / E Potokina, Y Endo, E Eggi, H Ohashi // The Journal of Japanese Botany. - 2003 - V 78 №1. - P,29-37

17 Potokina E Differential gene expression during seed germination in barley (Hordeum vulgare

L) / E Potokina, N Sreenivasulu, L Altschmied, W Michalek, A Graner // Functional and Integrative Genomics -2002. - V2№l-2 -P 28-39

18 Potokina E. Functional Genomics bei Gerste Vom Erkenntnisgewinn zur zilchtenschen Nutzung

/ E Potokina, M Caspers, N. Sreenivasulu, M Wang, L Altschmied, A Graner // Vortrage Pflanzenziichtung -2002 - V 173 -P 173-181

19 Potokina E. Population diversity of the Vicia sativa agg (Fabaceae) in the flora of the former

USSR deduced from RAPD and seed protein analyses / E Potokma, D Vaughan, E Eggi, N Tomooka//Genetic Resources and Crop Evolution -2000 -V47 -P 171-183

20 Potokina E. Phytogeny of Vicia subgenus Vicia (Fabaceae) based on analyses of RAPDs and

RFLP of PCR-amplified chloroplast genes / E Potokina, N Tomooka, D A Vaughan, T Alexandrova, R Q Xu//Genetic Resources and Crop Evolution - 1999 -V46 -P 149-161

21. Potokina E. Vicia sativa aggregate (Fabaceae) in the flora of former USSR / E Potokina //

Genetic Resources and Crop Evolution - 1997 -V44 -P 199-209

22. Потокина E.K. Электрофорез запасных белков семян в решении проблем систематики

Vicia sativa agg / Е К Потокина, Э Э Егги // Труды по прикл бот, ген и селекц -1991 -Т 139 С 112-123 Материалы всероссийских и международных конференций 23 Potokina Е Towards the functional basis of malting quality in barley cis regulation of the Cxpl gene / E Potokma, M. Prasad, H Zhang, D Perovich, N Stem, A Graner // Proceedings of 9th International Symposium on Plant Seeds -2004 -P 53

24 Potokina E. Malting quality in barley cultivars using genomic approach / M. Caspers, E.

Potokina, A Graner, M Wang // European Society for Agronomy, VIII ESA Congress -2004 -P 971

25 Потокина E.K. Функционально-ассоциативный подход для выявления связи генной

экспрессии с изменчивостью фенотипического признака у ячменя (Hordeum vulgare L) / ЕК. Потокина, М Касперс, М Ванг, М Прасад, Р Кота, X Цанг, А Гранер // Материалы III Съезда ВОГиС "Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития" - Москва, 2004 - С 253

26 Потокина Е.К. Оптимизация коллекций генетических ресурсов растений с помощью

методов ДНК-фингерпринтинга / Е К Потокина, Т Г Александрова // XII делегатский съезд русского ботанического общества - 2003 - Р 53

27 Potokina Е Study of androgenesis induced gene expression in barley by cDNA array approach /

S F. Maraschin, E. Potokina, M Caspers, A Graner, H P Spaink, M Wang // Proceedings of XI International Conference of Plant Embryology -2003 -P 41

28 Potokina E. Malting quality of barley cultivars in terms of gene expression / E Potokina, M

Caspers, N Sreenivasulu, M Wang, A Sorensen, A. Graner // Proceedings of 6th Gatersleben Research Conference -2002 -P 44

29 Potokina E. Functional genomics of seed germination in barley 1 E Potokina, M Wolf, N

Sreenivasulu, W Weschke, W Michalek, L Altschmied, A Graner // Abstracts of the XVIth EUCARPIA Congress, Edinburg, Scotland, 2001 - http //www eucarpia org/03pubhcations/ abstractsxvi/ XVI_006 html

30 Potokina E. Vicia faba L and related species genetic diversity and evolution / E Potokina, D A

Vaughan, N Tomooka, S Bulyntzev // Proceedings of the 7th Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries (MAFF), Japan International Workshop on Genetic Resources Parti. Wild Legumes -2000 -P. 125-143.

31 Potokina E Exploration and collection of wild Vicia species in Nagano and Nngata Prefectures,

Japan 17Л-19Л October 1999/D Vaughan, N Tomooka, E. Potokina, N Maxted.D Jarvis, M S Yoon, A Kaga, M Akiba, Y. Tsubokura // Annual report of exploration and introduction of plant genetic resources - 2000 -V16 -P 59-65

32 Potokina E. Genetic diversity of landraces and local cultivars of common vetch (Vicia sativa L)

in the area of former USSR / E Potokina, F R Blattner, T Alexandrova, K. Bachmann // Proceedings of 3rd International Crop Science Congress -2000 -P 126

Подписано в печать 23 05 2008 Объем 2,0 п л. Тираж 100 экз Заказ №132 Отпечатано в типографии ООО «КОПИ-Р», СПб, пер Гривцова 6 Б Лицензия ПЛД № 69-338 от 12 02 99г

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Потокина, Елена Кирилловна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СТРАТЕГИЯ И МЕТОДЫ ГЕНОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ РАСТЕНИЙ (обзор литературы).

1.1. Значение генетических ресурсов растений для процесса устойчивого развития сельского хозяйства.

1.2. Полиморфизм нуклеотидной последовательности молекул ДНК как источник генетического разнообразия растений и методы его анализа.

1.3. Использование молекулярных маркеров в работе с коллекциями генетических ресурсов растений.

1.4. Использование молекулярных маркеров в генетике и селекции.

1.5. Методы функциональной геномики для анализа изменчивости агрономических признаков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Прикладные аспекты структурной и функциональной геномики растений (на примере родов Vicia L. и Hordeum L.)"

Нуклеотидные вставки, деледии, а также нуклеотидные замены определяют разнообразие аллелей большинства генов. В этой связи главным объектом исследований генетики и прикладной ботаники становится разнообразие генетических ресурсов растений, выявляемое на уровне ДНК. Полиморфизм ДНК в масштабе целого генома можно изучать, опираясь на информацию о нуклеотидной последовательности всей геномной ДНК (полное секвенирование геномов) или, используя альтернативную технологию молекулярного маркирования.

В большинстве случаев молекулярные маркеры, используемые для анализа внутривидового и межвидового разнообразия у растений (RFLP, RAPD, AFLP, SSR), представляют собой анонимные ДНК-фрагменты, отражающие полиморфизм участков генома, выбранных случайным образом (Varshney et al., 2004). Репрезентативное количество идентифицированных с их помощью полиморфных геномных локусов и относительная простота лабораторных процедур позволяют эффективно использовать эти маркеры при оценке геномного сходства близкородственных таксонов культивируемых видов и решении вопросов таксономии. В настоящей работе возможности методов молекулярного маркирования при решении спорных вопросов систематики культурных растений и оптимизации коллекций генных банков проанализированы на примере видов Vicia L., представляющих практический интерес как кормовые травы и зернобобовые культуры.

Для целей прикладной генетики и селекции более эффективным является использование не анонимных, а функциональных молекулярных маркеров, которые идентифицируют полиморфизм в транскрибируемых кодирующих последовательностях ДНК - генах (Andersen, Lubberstedt, 2003). Базовым ресурсом для исследований функциональной геномики являются коллекции EST (Expressed Sequence Tags), представляющие собой секвенированные неполные копии генов, точнее фрагменты кодирующих последовательностей ДНК длиной 500-700 н.п. (Сойфер, 2000). Создание коллекций EST обусловило также развитие чип-технологий, основной задачей которых является сравнительный мониторинг уровня генных транскриптов в экспериментальных образцах. Анализ экспрессии генов с использованием чип-технологий, называют также транскриптомным анализом. По аналогии с геномом, подразумевающим совокупность всех генов организма, говоря о транскриптоме, имеют ввиду совокупность всех генов, которые транскрибируются в данной ткани, на данном этапе развития организма (Spellman et al., 1998). Потенциальное значение транскриптомного анализа для генетико-селекционных исследований очевидно: транскрипция генов является ключевым этапом для последующего белкового синтеза, поэтому изменения в генной экспрессии могут непосредственно влиять на биохимические и физиологические процессы и, как следствие, отражаться на фенотипе.

Среди объектов современных транскриптомных исследований особое место принадлежит ячменю. Усилиями лабораторий разных стран к концу 2002 года были созданы 84 библиотеки кДНК из разных тканей растений ячменя на разных этапах онтогенеза, в результате чего было получено около 350 тысяч EST (Close et al., 2004). На этой базе был создан геночип яменя (Affymetrix 22К Barley GeneChip), позволяющий анализировать экспрессию практически всех известных на сегодняшний день кодирующих последовательностей ячменя. Накопленная обширная научная информация и современные исследовательские ресурсы позволяют перейти к разработке новых методологических подходов для выявления генетических факторов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков, на основе новых технологий функциональной геномики.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить возможности методов молекулярного маркирования для систематики культурных растений, оценив с их помощью геномное сходство видов Vicia subgenus Vicia и, сравнив полученные результаты с существующими версиями филогенетической системы подрода.

2. Разработать метод оптимизации обширных коллекций ex situ с применением молекулярных маркеров на примере генофонда культурного вида V.sativa L.

3. Разработать метод идентификации генов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных фенотипических признаков, на примере признаков пивоваренного качества у ячменя, с помощью транскриптомного анализа. Для этого: а) в качестве первого этапа создать экспериментальную базу для транскриптомного анализа генотипов ячменя различного пивоваренного качества, сконструировав библиотеки кДНК из тканей прорастающего ячменного семени и, создав на их основе кДНК-макрочип (EST на нейлоновом фильтре); б) изучить ткане- и стадийно-специфичную активность генов в прорастающем семени ячменя, используя кДНК-макрочип. В ходе исследований получить экспериментальное подтверждение воспроизводимости результатов применяемой кДНК-чип технологии, путем использования альтернативных молекулярно-биологических методов (Нозерн-блоттинг). в) используя кДНК-макрочип, осуществить транскриптомный анализ генотипов ячменя, различающихся по параметрам солодования, и протестировать гипотезу о том, что наблюдаемые различия по пивоваренному качеству могут обуславливаться изменчивостью уровня экспрессии определенных генов-кандидатов.

4. Разработать метод картирования генетических локусов, регулирующих уровень экспрессии возможных генов-кандидатов с использованием техники Real-Time PCR.

5. Разработать стратегию создания функциональных молекулярных маркеров-помощников селекции, выявляющих желательную повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата, детерминирующего изменчивость хозяйственно-ценного признака, для использования селекционной практике.

6. Проанализировать общегеномные закономерности регуляции экспрессии генов ячменя, картировав генетические факторы (eQTL), влияющие на уровень транскрипции генов, используя Affymetrix 22К Barley GeneChip.

Впервые предложен метод, позволяющий на основе кДНК-чип технологий идентифицировать спектр генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков. В качестве примера идентифицированы возможные гены-кандидаты, влияющие на формирование пивоваренного качества у ячменя.

Разработана методика поиска молекулярного маркера-помощника селекции, выявляющего желательную повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата.

Создана коллекция 27512 EST (секвенированных фрагментов кодирующих последовательностей ДНК), выделенных из тканей семени ячменя на разных этапах прорастания. Нуклеотидные последовательности созданных EST и их функциональные аннотации доступны для пользователей через Интернет (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/cr-est/index.php).

Получено экспериментальное подтверждение наличия в геноме ячменя транс-регуляторных локусов, влияющих на транскрипцию не одного, а целого кластера генов. Установлено, что позиции этих транс-регуляторных локусов на генетической карте совпадают с позициями некоторых QTL для параметров пивоваренного качества.

Теоретическая и практическая значимость. Предложенный метод расчета КГО применим к анализу генетического разнообразия возделываемых видов растений, генофонд которых представлен преимущественно местными сортами, сорнополевыми и дикорастущими популяциями, с привлечением любого типа молекулярных маркеров. Практическим результатом его применения является классификация образцов коллекций генбанков по 5-балльной шкале, которая может быть отражена в дескрипторах паспортных баз данных и использована для оптимизации коллекций ex situ.

Метод выявления генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков, основан на гипотезе, что наблюдаемые различия в фенотипе могут обуславливаться вариациями в уровне экспрессии определенных генов. Метод приложим к анализу любого количественного признака, не требует создания экспериментальных популяций, необходимых для рекомбинационного анализа. Метод лишь анализирует генетическое разнообразие, выявляемое среди существующих селекционных линий и сортов, используя возможности кДНК-чип технологий.

Экспериментально показано, что повышенная/пониженная экспрессия гена-кандидата в результате цис-регуляторной мутации, может быть ассоциирована с присутствием определенных аллелей в структурной части гена. Это дает возможность упростить работу селекционера, создав молекулярный маркер, выявляющий желательную повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата для диагностики и скрининга генетического разнообразия, а также маркерной помощи отбору.

Созданная коллекция EST была использована при разработке микрочипа Affymetrix 22К Barley GeneChip, позволяющего анализировать экспрессию практически всех известных на сегодняшний день кодирующих последовательностей ячменя. По результатам экспериментов с Affymetrix 22К Barley GeneChip создан каталог, содержащий информацию о линейной последовательности 3029 транскрибируемых генов на хромосомах ячменя и генетических расстояниях между ними. Полученная генетическая карта Hordeum vulgare является самой насыщенной на сегодняшний день, она позволяет детально изучить синтению хромосом ячменя и риса — вида с секвенированным геномом. Информация о последовательностях генов в соответствующем блоке на физической карте генома риса значительно облегчает задачу клонирования генов у ячменя.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Классификацию внутривидового разнообразия возделываемого вида, сохраняемого ex situ, можно осуществлять при помощи коэффициентов генетической оригинальности образцов по Смирнову, рассчитанными. по результатам молекулярного маркирования генома.

2. Используя современные методы функциональной геномики (кДНК-чип технологии), можно идентифицировать спектр генов-кандидатов, определяющих изменчивость хозяйственно-ценных признаков.

3. Желательную с точки зрения селекционной практики повышенную или пониженную экспрессию гена-кандидата в результате цис-регуляторной мутации можно маркировать с помощью полиморфных сайтов в структурной части гена.

4. Используя подход «генетической геномики» с применением микрочипа Affymetrix 22К Barley GeneChip, можно локализовать на генетической карте ячменя более 15% генов, транскрибируемых в конкретной ткани. Одновременно, в рамках того же эксперимента можно картировать регуляторные локусы для 80% транскрибируемых генов.

5. Общегеномное картирование регуляторов экспрессии генов ячменя с помощью Affymetrix позволяет локализовать транс-регуляторные локусы, регулирующих транскрипцию целого кластера генов, среди которых могут оказаться также гены, определяющие важные фенотипические характеристики.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Х-ой, ХП-ой и XV-ой Международных Конференциях "Plant & Animal Genomes" (San-Diego, 2002, 2004, 2007); 3rd UK Cereal Genetics and Genomics Workshop (Norwich, 2006); III-m Съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004); 9th International Barley Genetics Symposium (Kromeriz, 2004); Plant Genomics European Meetings (Lyon, 2004; Berlin, 2002); 9th International Symposium on Plant Seeds: Seeds in the -omics Era (Meisdorf, 2004); VIII European Society for Agronomy Congress (Copenhagen, 2004); XI-ом Делегатском Съезде Русского Ботанического Общества

Барнаул, 2003); XI-ой Международной конференции "Plant Reproduction: From Mendel to Molecular Biology" (Brno, 2003); 6th Gatersleben Research Conference (Gatersleben, 2002); XVIth EUCARPIA Congress (Edinburgh, 2001); International Symposium "Rudolf Mansfeld and Plant Genetic Resources" (Gatersleben, 2001); 3rd International Crop Science Congress (Hamburg, 2000); 7th MAFF International Workshop on Genetic Resources (Tsukuba, 2000). Результаты диссертации обсуждались на заседании кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного Университета, на семинаре лаборатории кариологии и молекулярной систематики Ботанического института им. В.Л.Комарова РАН, а также на Вавиловском семинаре ВНИИ растениеводства им.Н.И.Вавилова.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 32 работы, в том числе в зарубежных изданиях - 25.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны международными грантами Vavilov-Frankel Fellowship, 1999 (IPGRI, Италия); Science and Technology Agency of Japan, 1999 (Цукуба, Япония); BMBF, №0312282, 2001 (GABI-SEED, Германия); BBC5030971,2005 (BBSRC, Англия).

Автор выражает искреннюю благодарность доктору биологических наук, профессору Гончаровой Эльзе Андреевне, доктору биологических наук Анисимовой Ирине Николаевне, кандидату биологических наук Егги Элли Эвертовне, доктору биологических наук Чеснокову Юрию Валентиновичу за помощь при подготовке диссертации, а также коллективу отдела зернобобовых культур ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова за содействие в выполнении полевых и лабораторных работ.'

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Потокина, Елена Кирилловна

выводы

1. По результатам анализа филогенетических взаимоотношений 29 видов Vicia subgenus Vicia методами RAPD, AFLP и реетрикционного анализа хлоропластных генов очерчен круг ближайших родственных таксонов для культивируемых видов вики, а также выдвинута гипотеза о возможной предковой форме культурного вида V.faba.

2. По результатам анализа генофонда культурного вида V.sativa (1122 образцов из коллекций двух генбанков) методом AFLP предложен оригинальный метод классификации генетического разнообразия возделываемых видов на основе расчета коэффициентов генетической оригинальности образцов по Смирнову.

3. Создана коллекция 27512 EST ячменя (Expressed Sequence Tags), представляющая собой набор фрагментов кодирующих последовательностей ДНК, выделенных из тканей семени ячменя на разных стадиях прорастания. Сиквенсы EST и их функциональные аннотации доступны для пользователей (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/cr-est/index.php). На основе коллекций EST создан инструмент для транскриптомного анализа ячменя - кДНК-макрочип.

4. Впервые проанализирована динамика экспрессии генов в процессе прорастания семени ячменя с использованием кДНК-макрочипа. Среди 154 дифференциально экспрессируемых генов 69 показали наивысший уровень активности в эндосперме, 58 преимущественно транскрибировались в зародыше и щитке, 11 только в зародыше и 16 только в щитке. 70% генов были аннотированы в соответствии с их предполагаемыми функциями. Гены, преимущественно экспрессируемые в зародыше и щитке, кодировали белки клеточного цикла, процессов трансляции, нуклеотидного метаболизма, углеводного обмена и транспортных функций. Гены, активные в алейроновом слое эндосперма, в основном определяли процессы гидролиза угеводов и метаболизма аминокислот.

5. По результатам экспрессионного анализа с использованием кДНК-макрочипа десяти сортов ячменя, различающихся по параметрам солодования, разработан функционально-ассоциативный подход для выявления корреляции между изменчивостью экспрессионных профилей и изменчивостью фенотипического признака. В результате идентифицированы 19 генов-кандидатов, чья экспрессия, возможно, определяет пивоваренные качества у проанализированных сортов ячменя.

6. На примере одного из идентифицированных генов-кандидатов карбоксипептидазы 1 (Cxpl) проанализированы ключевые этапы предлагаемой стратегии использования методов функциональной геномики для целей прикладной генетики и селекции: а) идентификация генов-кандидатов, уровень транскрипции которых определяет фенотипический признак, с использованием кДНК-микрочипа, б) картирование генетического локуса, определяющего уровень экспрессии гена-кандидата, с использованием Real-Time PCR, в) разработка молекулярного маркера, с помощью которого в селекционных программах можно проводить отбор генотипов с желательной повышенной или пониженной экспрессией гена-кандидата.

7. Впервые проанализирован уровень транскрипции 22801 генов в прорастающих семенах ячменя у пивоваренного сорта Могех, белкового сорта Steptoe, а также у 139 дигаплоидных линий от их скрещивания с использованием геночипа ячменя Affymetrix 22К Barley 1 GeneChip. На основе полученных данных разработан новый тип молекулярных маркеров -транскрипционные маркеры (Transcript Derived Markers, TDM). С их помощью на генетической карте ячменя впервые установлено местоположение 3029 транскрибируемых генов. Создан каталог, содержащий информацию о линейной последовательности этих генов на хромосомах и генетических дистанциях между ними. В рамках того же эксперимента на карте скрещивания Steptoe/Morex локализованы генетические локусы (eQTL), от полиморфизма которых зависит уровень транскрипции 12987 генов.

8. Установлено, что картированные с помощью геночипа Affymetrix генетические локусы, достоверно влияющие на уровень транскрипции генов у ячменя (eQTL), неравномерно распределены на генетической карте. На хромосомах 2Н, 5Н и 7Н выявлены сгущения eQTL (eQTL hotspots), которые могут указывать на присутствие транс-регуляторных локусов, влияющих на транскрипцию не одного, а сразу большого числа генов. Позиции выявленных сгущений eQTL совпадают с позициями некоторых QTL для признаков пивоваренного качества.

9. Результаты транскриптомного анализа с использованием Affymetrix 22К Barley 1 GeneChip показали, что нуклеотидный полиморфизм, существующий между двумя сортами ячменя, может достоверно влиять на уровень экспрессии более 80% транскрибируемых генов. Уровень транскрипции более половины из этих генов зависит от не одного, а нескольких полиморфных генетических локусов (eQTL).

10. Полиморфные генетические локусы, определяющие уровень транскрипции генов (eQTL), с самыми высокими показателями LOD, позиционно совпадают с положением самих генов на генетической карте. Это свидетельствует о том, что причиной наиболее существенных изменений в уровне экспрессии гена могут служить цис-регуляторные мутации, нарушающие взаимодействие регуляторных участков гена с РНК-полимеразой и транскрипционными факторами.

11. Ограниченная плейотропия цис-регуляторных мутаций вперые исследована в - общегеномном масштабе на примере ячменя. Для этого было проведено сравнительное картирование 2081 цис-eQTL для генов в двух типах ткани, соответствующим также двум разным последовательным стадиям развития растения. Эффект 30% цис-регуляторных мутаций, выявленных при транскриптомном анализе популяции ди-гаплоидных линий от скрещивания двух сортов (Steptoe и Могех), ограничивался конкретной тканью или возрастной стадией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ резерва изменчивости, выявляемого на уровне ДНК в масштабе целого генома можно осуществлять, опираясь на информацию о нуклеотидной последовательности всей геномной ДНК (полное секвенирование геномов) или используя альтернативную технологию молекулярного маркирования. Эта альтернативная возможность сравнительного геномного анализа с помощью молекулярных маркеров и составляет предмет проведенного исследования. В большинстве случаев молекулярные маркеры (RFLP, RAPD, AFLP) представляют собой анонимные ДНК-фрагменты, отражающие полиморфизм участков генома, выбранных случайным образом. Тем не менее, большое количество выявляемых с их помощью полиморфных геномных локусов и относительная простота в использовании сделала эти маркеры незаменимыми для сравнительного анализа внутривидового и межвидового разнообразия у растений.

На примере анализа филогенетических взаимоотношений видов Vicia subgenus Vicia методами RAPD, AFLP и RFLP-PCR хлоропластных генов, была продемонстрирована общая стратегия использования молекулярного маркирования при решении вопросов систематики культурных растений и поиска возможной предковой формы возделываемого вида. Исследования в этой области знания проводились по устоявшимся методикам, эффективность которых была подтверждена многочисленными исследованиями. Полученные результаты позволили очертить круг возможных близкородственных таксонов для культивируемых видов вики в целях эффективного подбора родительских пар для экспериментов по межвидовому скрещиванию, а также переосмыслить выдвинутые ранее гипотезы о возможной предковой форме культурного вида V.faba.

Результаты показали, что некоторые методы, традиционно используемые для анализа и классификации генетического разнообразия на уровне вида и таксонов более высокого ранга, не могут также эффективно использоваться для классификации внутривидового разнообразия. Наш вклад в развитие молекулярно-генетических подходов для решения задач прикладной ботаники состоит в разработке оригинального метода классификации внутривидового разнообразия возделываемого вида в соответствии с рассчитанными коэффициентами генетической оригинальности образцов по Смирнову (Смирнов, 1969). На примере анализа мирового генофонда вики посевной (V.sativa) с использованием маркеров

AFLP было показано, что частота встречаемости аллелей по ареалу может варьировать весьма значительно, от 5% до 95% (Potokina et al., 2002). Это дает возможность выделять редкие и широко встречающиеся аллели для конкретного региона, и на основе частоты их

237 встречаемости проводить процедуру "взвешивания" аллелей, выявленных с помощью молекулярного маркирования. Таким образом, каждый образец может быть охарактеризован с точки зрения пропорции редких и обычных для данного региона аллелей, в виде расчитанного коэффициента генетической оригинальности. Алгоритм продемонстрирован на примере классификации 677 образцов посевной вики коллекции ВИР, собранных из 11 эколого-географических регионов России и проанализированных с помощью AFLP. Предложенный метод может быть осуществлен для любого возделываемого вида, с привлечением любого типа молекулярных маркеров. Практическим результатом его применения является классификация образцов коллекций по 5-бальной шкале, которая может быть отражена в дескрипторах паспортных баз данных и использована для оптимизации работы с коллекциями генбанков.

Несмотря на то, что анонимные молекулярные маркеры имеют неоспоримые преимущества при широкомасштабном анализе генетического разнообразия возделываемых и дикорастущих видов, для целей сравнительного картирования геномов и картирования важнейших агрономических признаков предпочтение отдается так называемым функциональным маркерам (Andersen, Liibberstedt, 2003), маркирующим полиморфизм в транскрибируемых кодирующих последовательностях ДНК - генах. В этой связи, обширные коллекции EST (Expressed Sequence Tags), представляющие собой короткие фрагменты кодирующих последовательностей ДНК, созданы в настоящее время для большинства возделываемых видов растений. Мы принимали непосредственное участие в создании коллекции EST для ячменя - одной из ведущих-зерновых сельскохозяйственных культур с несеквенированным геномом. Наш вклад состоит в создании 25% коллекции EST, сохраняемой в настоящее время Институтом генетики культурных растений (IPK, Gatersleben), насчитывающей 110981 секвенированных клонов и являющейся базовым ресурсом геномных исследований у ячменя (Zhang et al., 2004). Сиквенсы всех полученных EST и их функциональные аннотации доступны для пользователей (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/cr-est/index.php).

Созданная коллекция EST для ячменя позволила перейти к разработке главного инструмента транскриптомного анализа - кДНК-микро и макрочипам, позволяющих анализировать межсортовые различия на уровне транскриптома. В частности, кДНК макрочип (1400 EST на нейлоновом фильтре) был использован нами для сравнения уровня транскрипции 1400 генов у десяти сортов ячменя, различающихся по признакам пивоваренного качества. Основываясь на гипотезе, что наблюдаемые различия в фенотипе

238 могут обуславливаться вариациями в уровне экспрессии определенных генов, мы разработали методический подход для выявления корреляции между изменчивостью экспрессионных профилей генов и изменчивостью фенотипического признака (Potokina et al., 2004). В результате были идентифицированы гены-кандидаты, экспрессия которых, возможно, определяет пивоваренные качества у проанализированных сортов ячменя. Разработанный нами функционально-ассоциативный подход может быть приложим к анализу любого фенотипического признака. Он базируется на случайной выборке генотипов и не требует создания затратоемких экспериментальных популяций, например ди-гаплоидных или изогенных линий, которые необходимы для рекомбинационного анализа. Метод лишь анализирует генетическое разнообразие, выявляемое среди существующих селекционных линий и сортов, используя возможности современных кДНК- чип технологий.

На примере одного из выявленных генов-кандидатов Cxpl мы показали, каким образом можно установить, является ли наблюдаемая межсортовая изменчивость уровня экспрессии гена-кандидата следствием цис-регуляторной мутации в промоторном участке самого гена, или зависит от полиморфизма удаленного генетического локуса, кодирующего транскрипционный фактор (транс-регуляторная мутация) (Potokina et al., 2006). Для этого мы картировали соответствующий eQTL (expressedQTL), обозначающий на карте позицию генетического локуса, определяющего уровень экспрессии гена Cxpl. Позиция картированного eQTL совпала с позицией самого гена на генетической карте и одновременно с позицией QTL для фенотипического пивоваренного параметра «диастатическая энергия». Это дало основание считать, что именно полиморфизм в промоторном участке гена-кандидата в результате цис-регуляторной мутации, может повышать или понижать экспрессию гена-кандидата, и, как следствие, повышается или понижается значение пивоваренного параметра. Был сделан вывод, что уровень экспрессии гена-кандидата Cxpl (карбоксипептидаза 1) действительно может вносить определенный вклад в изменчивость солодовенных качеств ячменя. Ранее сообщалось, что карбоксипептидазы участвуют в деполимеризации протейного матрикса, в который заключены крахмальные зерна в прорастающем зерне (Bethke et al. 1999). От их активности, в конечном итоге, зависит эффективность процесса гидролиза, которую и отражает диастатическая энергия.

Далее, на примере Cxpl было показано, что повышенная экспрессия гена-кандидата, коррелирующая с более высокими показателями качества солодования у ячменя, может быть ассоциирована с присутствием определенных аллелей SNP в структурной части гена в

239 случайной выборке генотипов. Следовательно, достаточно разработать маркер для таких аллелей в структурной части гена, чтобы выявлять генотипы ячменя с желательным повышенным (пониженным) уровнем экспрессии гена-кандидата. В качестве примера, такой молекулярный маркер (CAPS) повышенного уровня экспрессии был разработан для гена-кандидата Cxpl. CAPS-маркер выявляет присутствие в генотипе растений ячменя аллели гена Cxpl, ассоциированной с повышенной экспрессией гена, и как следствие, определяющей более интенсивный процесс протеолиза запасных белков семян и более эффективное солодование. CAPS может быть использован в целях диагностики и скрининга генетического разнообразия ячменя, а также для маркерной помощи отбору.

Таким образом, на конкретных примерах были проанализированы все ключевые этапы предлагаемой нами стратегии использования современных методов функциональной геномики в целях прикладной генетики и селекции, начиная от идентификации генов-кандидатов, детерминирующих изучаемый фенотипический признак, до разработки молекулярного маркера, который своим присутствием будет обозначать, „маркировать" генетический фактор определяющий желательную повышенную или пониженную экспрессию выявленного гена-кандидата.

Квинтэссенцией развития технологий транскриптомного анализа у ячменя является олигонуклеотидный микрочип Affymetrix 22К Barley 1 GeneChip, созданный на базе накопленных коллекций EST. Геночип Affymetrix предоставляет возможность анализа практически всех кодирующих последовательностей генома ячменя, секвенированных на сегодняшний день. Структура и дизайн олигонуклеотидных микрочипов Affymetrix позволяет не только проводить одновременное тестирование уровня транскрипции 23 тысяч генов, но и параллельно выявлять полиморфные участки в сиквенсе кРНК, синтезированных в процессе анализа in vitro с матричных последовательностей кДНК. Эта особенность технологии

Affymetrix позволила нам разработать новый тип молекулярных маркеров (Transcript Derived

Markers, TDM), которые могут быть выявлены при анализе гибридизаций на микрочип

Affymetrix кРНК двух родительских генотипов и рекомбинантных линий от их скрещивания

Potokina et al., 2008). Анализ популяции ди-гаплоидных линий от скрещивания двух генотипов (Steptoe и Могех) с применением TDM позволил локализовать на генетической карте 3300 транскрибируемых генов ячменя (Luo, Potokina et al., 2007). На сегодняшний день это самая насыщенная генетическая карта Hordeum vulgare, позволяющая детально изучить синтению хромосом ячменя и риса - вида с секвенированным геномом. В рамках того же эксперимента на полученной генетической карте нами были локализованы 23738 локусов,

240 полиморфизм которых между Steptoe и Могех достоверно влиял на уровень транскрипции 15967 генов (Potokina et al., 2008).

Обнаружено, что выявленные полиморфные локусы, достоверно изменяющие уровень транскрипции генов у Steptoe по сравнению с Могех (eQTL), неравномерно распределены на генетической карте. На хромосомах 2Н, 5Н и 7Н выявлены так называемые «горячие точки» или сгущения eQTL (eQTL hotspots), которые могут указывать на присутствие транс-регуляторных локусов, влияющих на транскрипцию не одного, а сразу большого числа генов. Позиции выявленных сгущений eQTL совпадают с позициями некоторых QTL для признаков пивоваренного качества. Дальнейшее изучение этих возможных транс-регуляторов широкого спектра действия, могло бы послужить ключем к манипулированию активности целого кластера генов, среди которых могли бы оказаться также гены, определяющие важные фенотипические характеристики.

Проведенное нами исследование с использованием геночипа Affymetrix позволило сделать несколько общих заключений об уровне генетической изменчивости, выявляемой на-уровне транскриптома:

1) Впервые получено экспериментальное свидетельство того, что естественный нуклеотидный полиморфизм, существующий между двумя генотипами ячменя, может" достоверно изменять уровень экспрессии более 80% транскрибируемых генов.

2) Результаты показали, что причиной наиболее существенных (в несколько раз) изменений в уровне транскрипции генов служат цис-регуляторные мутации, которые могут происходить в регуляторных участках самого гена, нарушая взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. При сравнении генотипов Steptoe и Могех, такие цис-регуляторные мутации были картированы для 2081 транскрибируемых генов. Для 34 из этих генов получено экспериментальное свидетельство о возможной мутации в участке энхансера, благодаря которому обеспечивается ткане-специфичная регуляции экспрессии гена.

3) Мы впервые применили сравнительное картирование цис-регуляторных мутаций в одной и той же картирующей популяции, но для двух разных тканей, соответствующих также двум разным последовательным стадиям развития растения. Для 30% проанализированных генов активность цис-регуляторных мутаций оказалась тканеспецифичной, проявляясь только в одном из двух проанализированных типов ткани (ограниченная плейотропия).

Результаты показали, что тканеспецифичная активизация цис-регуляторных мутаций выявляется преимущественно у генов, обеспечивающих главный функциональный процесс соответствующей ткани или органа. Полученные результаты также свидетельствуют о том,

241 что эффект унаследованной родительской цис-регуляторной мутации может не проявляться у потомства до момента достижения организмом определенной физиологической стадии развития. Выявленные характерные особенности цис-регуляторных мутаций представляют интерес не только для геномных исследований у растений, но и для медицины, так как могут иметь отношение к наследственным возрастным болезням или к болезням, поражающим определенные типы тканей у человека.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Потокина, Елена Кирилловна, Санкт-Петербург

1. Антонов А.С. Основы геносистематики высших растений / А.С. Антонов. — 2000. -М.: Наука/Интерпериодика. 136 с.

2. Барулина Е.И. Чечевицы СССР и других стран / Е.И. Барулина // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. 1930.- Т.40.

3. Вавилов Н.И. Географическая изменчивость растений/ Н.И. Вавилов // Научное слово. -1928. -№1. — С. 23-33.

4. Гвоздев В.А. Механизмы регуляции активности генов в процессе транскрипции/ В.А. Гвоздев // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. - № 2. - С. 22-31.

5. Глуховцев В.В. Об оценке пивоваренных качеств ячменя/ В.В. Глуховцев // Вестник РАСХН. 2004. - №4. - С. 84-86.

6. Драгавцев В.А. Модель эколого-генетического контроля количественных признаков растений / В.А. Драгавцев, П.П. Литун, Н.М. Шкель, Н.Н. Нечипоренко // Докл. АН СССР. -1984. Т.274.№ 3. - С. 720-773.

7. Егги Э.Э. Перекрестник или самоопылитель? Электрофоретическое разделение полипептидов семян для определения способа опыления у бобовых/ Э.Э.Егги, Е.К.Потокина// Ботанический журнал. 1998. - Т.83.№12. - С.77-83.

8. Конарев А.В. Белки семян как маркеры в решении проблем генетических ресурсов растений, селекции и семеноводства / А.В. Конарев // Цитология и генетика. 2000. - Т.34. №2.-С. 91-104.

9. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры / В.Г. Конарев М. - 1983.

10. Кулаева О.Н. Карликовые мутанты и их роль в "зеленой революции"/ О.Н. Кулаева // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т.6.№8. - С. 18-23.

11. П.Леокене Л.В. Эколого-географическая классификация возделываемых сортов вики посевной (Vicia sativa L. subsp. sativa)/ Л.В. Леокене // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. 1978. -Т.63.В.1.- С. 108-122.

12. Муратова B.C. Бобы (Vicia faba L.) / B.C. Муратова // Тр. по прикл. бот., ген. и сел.1931.- Т.50. — С. 1-285.j

13. Потокина Е.К. Особенности опыления у однолетних видов рода Vicia (Fabaceae)/ Е.К.Потокина, Т.Г.Александрова// Ботанический журнал. 1996. - Т.81.№1. - С.74-79.

14. Репьев С.И. Вика / Б.С. Курлович, С.И. Репьев //Генофонд и селекция зерновых бобовых культур 1995. - СПб: ВИР. - 423 с.

15. Репьев С.И. Теоретические вопросы селекции вики посевной / С.И. Репьев // Бюлл. ВИР. 1989. - В.190. - С. 3-6.

16. Серебровский А.С. Генетика и животноводство // Классики советской .246генетики. 1968. - Л. - С. 325-353.

17. Смирнов Е.С. Таксономический анализ / Смирнов Е.С.— 1969. — М.: Наука. — 187 с.

18. Смирнов Е.С. О кодировании признаков для таксономического анализа / Е.С. Смирнов // Журн. общ. биол. 1971. - Т.32. № 2. - С. 224-228.

19. Сойфер В.Н. Исследования геномов к концу 1999 года/ В.Н. Сойфер // Соросовский Образовательный Журнал. 2001. - Т.6. № 1. - С. 15-22.

20. Станкевич А.К. К систематике политипного вида Vicia sativa L.s.l./ А.К. Станкевич // Бюллетень ВИР. 1978. - Т.81. - С. 3-11.

21. Станкевич А.К. Вика / А.К. Станкевич, С.И. Репьев // Культурная флора- 1999. -СПБ: ГНЦ-ВИР. — 490 с.

22. Тимофеев-Ресовский Н.В. Очерк учения о популяции/ Н.В.Тимофеев-Ресовский, А.В. Яблоков, Н.В. Глотов. 1973. - М.: Наука. - 277 с.

23. Туликова А.С. Вика / А.С. Туликова // Растениеводство СССР. 1999. - JL, М. - С. 451—463.

24. Федченко Б.Ф. Vicia L. / Федченко Б.Ф. // Флора СССР. 1948. - Т.13. - С. 460^165.

25. Цвелев Н.Н. Vicia L. / Н.Н. Цвелев // Флора Европейской части СССР. 1987. - Т.6. -С. 127-147.

26. Шмидт В.М. Математические методы в ботанике / В.М. Шмидт Л.: Изд-во Ленингр. Ун-та. - 1984.-288 с.

27. Abbo S. Tracing the wild genetic stocks of crop plants/ S. Abbo, S. Lev-Yadun, G. Ladizinsky //Genome. 2001. - V.44. - P. 309-310.

28. Aharoni A. DNA microarrays for functional plant genomics / A. Aharoni, O.Vorst // Plant Mol. Biol.-2001.- V.48. P. 99-118.

29. Akkaya M.S. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean / M.S. Akkaya, A.A. Bhagwat, P.B. Cregan //Genetics. 1992. - V.132. - P. 1131-1139.

30. Analytica EBC // Methods of Analysis. Nurnberg: EBC Analysis Committee. - 1998.

31. Andersen J.R. Functional markers in plants / J.R. Andersen, T. Lubberstedt // Trends in Plant Science. 2003. - V.8. - P. 554-560.

32. Asada К. The role of ascorbate peroxidase and monodehydroascorbate reductase in H2O2 scavenging in plants / Scandalios J.G. // Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses. 1997. - New York: Cold Spring Harbor Laboratoiy Press.

33. Ashikari M. Rice gibberellin-insensitive dwarf mutant gene Dwarf 1 encodes the alpha-subunit of GTP-binding protein/ M. Ashikari, J. Wu, M. Yano, T. Sasaki, A. Yoshimura // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1999. - V.96.№18. - P. 10284-10289.

34. Badr A. On the origin and domestication history of barley (Hordeum vulgare) / A. Badr, K. Miiller, R. Schafer-Pregl, H. El Rabey, S. Effgen, H.H. Ibrahim, C. Pozzi, W. Rohde, F. Salamini // Mol. Biol. Evol. 2000. - V. 17. - P. 499-510.

35. Ball P.W. Vicia L. / P.W. Ball // Flora Europaea. 1968. - V.2. - P. 129-134.

36. Bamforth C.W., Barclay A.H.P. Malting Technology and the Uses of Malt / MacGregor A.W., Bhatty R.S. // Barley: Chemistry and Technology. 1993. - St. Paul, Minnesota: American Association of Cereal Chemists. - P. 297-355.

37. Baudry E. Species and recombination effects on DNA variability in the tomato genus / E. Baudiy, C. Kerdelhue, H. Innan, W. Stephan // Genetics. 2001. - V.158.No.4 - P. 1725-35.

38. Benjamini Y. Controlling the false discovery rate in behavior genetics research/ Y. Benjamini, D. Drai, G. Elmer, N. Kafkafi, I. Golani //Behavioural Brain Research. 2001. -V.125. - P. 279-284.

39. Benjamini Y. Controlling the False Discovery Rate: a practical and powerful approach to multiple testing/ Y. Benjamini, Y. Hochberg // J Royal Stat Soc Ser. B. 1995. - V.57. - P. 289300.

40. Bennet S.J. An ecogeographical analysis of the Vicia narbonensis complex/ S.J. Bennet, N. Maxted //Genet. Res.Crop Evol. 1997. - V.44. - P. 411-428.

41. Bethke P.C., Jacobsen J.V., Jones R.L. Barley biotechnology /Black M., Bewley J.D. // Seed technology and its biological basis. 2000. - Sheffield: Sheffield Academic. - P. 184-225.

42. Bethke P.C. Cell death of barley aleurone protoplasts is mediated by reactive oxygen species /P.C. Bethke, R.L. Jones//Plant J.-2001.- V.25.- P. 19-29.

43. Bewley J.D. Seeds. Physiology of development and germination/ J.D. Bewley, Black M. -1994. New York : Plenum Press.

44. Botstein D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms / D. Botstein, R.L.White, M. Skolnick, R.W. Davis // Am. J. Hum. Genet. 1980. -V.32.-P.314-331.

45. Breddam K. Isolation of carboxypeptidase-III from malted barley by affinity-chromatography/ K. Breddam, S.B. Sorensen // Carlsberg Res Commun. 1987. - V.52.No.4. -P.275-283. '

46. Brem R.B. Genetic dissection of transcriptional regulation in budding yeast / R.B. Brem, G.Yvert, R. Clinton, L. Kruglyak // Science. 2002. - V.296. - P.752-755.

47. Briggs D.E. Barley germination: biochemical changes and hormonal control / P.R. Shewry // Barley: genetics, biochemistry, molecular biology and biotechnology. 1992. - Wallingford: CAB International.

48. Brown L.R. Nature's limits. / L.R. Brown // State of the World. New York. - 1995. - P.332.

49. Buckler E.S. Plant molecular diversity and applications to genomics / E.S. Buckler, J.M. Thornsberry // Current Opinion in Plant Biology. 2002. - V.5. - P.107-111.

50. Buckler E.S. Molecular diversity, structure and domestication of grasses /E.S. Buckler, J.M. Thornsberry, S. Kresovich//Genet Res.-2001.- V.77. №3. -P. 213-218.

51. Burger W.C., LaBerge D.E. Malting and Brewing Quality / D.G. Rasmusson // Barley. -1985. Wisconsin: Publishers Madison. - P. 367-401.

52. Burke D.T. Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors / D.T. Burke, G.F. Carle, M.V. Olson // Science. 1987. - V.236. - P.806-812.

53. Burr B. Recombinant inbreds for molecular mapping in maize: theoretical and practical considerations/ B. Burr, F.A. Burr // Trends Genetics. 1991. - V.7. - P. 55-60.

54. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays / S.A. Bustin // J. Mol. Endocrinol. 2000. - V.25. - P.169-193.

55. Caldo R.A. Interaction dependent gene expression in Ma-specified response to barleypowdery mildew/R.A. Caldo, D. Nettleton, R.P. Wise // Plant Cell. 2004. - V.16. - P. 25142492528.

56. Carlson J.E. Segregation of random amplified DNA markers in F1 progeny of conifers/ J.E. Carlson, L.K. Tulsieram, J.C. Glaubitz, V. Luk, C. Kauffeld R. Rutledge //Theor. Appl. Genet. -1991.- V.83.-P. 94-200.

57. Carroll S.B. Evolution at two levels: on genes and form/ S.B. Carroll // PLoS Biol. 2005. -V.3.№7. - e245.

58. Cheng Y. PcTGD, a highly expressed gene in" stem, is related to water stress in reed {Phragmites communis Trin.) / Y. Cheng, T. Pu, Y. Xue, C. Zhang // Chinese Science Bulletin. -2001.- V.46. P. 850-854.

59. Churchill G.A. Empirical threshold values for quantitative trait mapping/ G.A. Churchill, R.W. Doerge // Genetics. 1994. - V.138. - P. 963-971.

60. Cubero J.L On the evolution of Vicia faba L./ J.I. Cubero //Theor.Appl.Genet. 1974. -V.45. - P. 47-51.

61. Curtin F. Multiple correlations and bonferroni's correction/ F. Curtin, P. Schulz // Biological Psychiatry. 1998. - V.44. - P. 775-777.

62. Darvasi A. Genomics: Gene expression meets genetics/A. Darvasi // Nature. 2003. -V.422.№6929. - P.269-270.

63. DeCook R. Genetic regulation of gene expression during shoot development in Arabidopsis / R. DeCook, S. Lall, D. Nettleton, S.H. Howell //Genetics. 2006. - V.172. № 2. - P.l 155-1164.

64. Degan F. The expression of serine carboxypeptidases during maturation and germination of the barley grain / F. Degan, A. Rocher, V. Cameron-Mills, D. Wettstein // Proc Natl Acad Sci USA. -1994,- V.91. P. 8209-8213.

65. Dice L.R. Measures of the amount of ecologic association between species/L.R. Dice // Ecology. 1945. - Y.26. - P. 297-302.

66. Doan N.P. The A- and B-chains of carboxypeptidase I from germinated barley originate from a single precursor polypeptide / N.P. Doan, G.B. Fincher // J Biol Chem. 1988. - V.263. -P.l 106-1110.

67. Doebley J. Mapping the genes that made maize/J. Doebley//Trends Genet. 1992. — V.8.№9.~ P. 302-307.

68. Dominguez F. A germination related gene encoding a serine carboxypeptidase is expressed during the differentiation of the vascular tissue in wheat grains and seedlings/ F. Dominguez, M.C. Gonzalez, F.J. Cejudo // Planta. 2002. - V.215. - P. 727-734.

69. Doss S. Cis-acting expression quantitative trait loci in mice / S. Doss, E.C. Schadt, T.A. Drake, A.J. Lusis // Genome Res. 2005. - Y.15. - P. 681-691.

70. Druka A. An atlas of gene expression from seed to seed through barley development / A.

71. Druka, G. Muehlbauer, I. Druka, R. Caldo, U. Baumann, N. Rostoks, A. Schreiber, R. Wise, T.

72. Close, A. Kleinhofs, et al. // Funct Integr Genomics.-2006. Y.6.-P. 202-211.251

73. Eckstein P. Allele-Specific Markers within the Barley Stem Rust Resistance Gene (Rpgl)l P. Eckstein, B. Rossnagel, G. Scoles//Barley Genetics Newsletter. -2005.- V.33.- P. 9-21.

74. Edwards KJ. A simple sequence repeat-based linkage map of barley/ K.J. Edwards, S. Tuvesson, M. Morgante, A. Massari et al. II Genetics. 2000. - V.156. - P. 1997-2005.

75. Edwards M. RFLPs for rapid recurrent selection. / M. Edwards, L. Johnson // Proc of Symposium on Analysis of Molecular Marker Data. Am. Soc. Hort. Sci. and Crop Sci. Soc. Am. — 1994.-Corvallis. P.33-40.

76. Eisen M.B. Cluster analysis and display of genomewide expression patterns / M.B. Eisen, P.T. Spellman, P.O. Brown, D. Botstein // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. - P.14863-14868.

77. Eshed Y. Introgressions from Lycopersicon pennellii can improve the soluble-solids yield of tomato hybrids/ Y. Eshed, D. Zamir // Theor. Appl. Genet. 1994. - V.88. - P.891-897.

78. Fath A. Enzymes that scavenge reactive oxygen species are down-regulated prior to gibberellic acid-induced programmed cell death in barley aleurone/A. Fath, P.C. Bethke, R.L. Jones//Plant Physiol.-2001.- V.126.- P.156-166.

79. Felsenstein J. Phytogenies from restriction sites, a maximum likelihood approach/ J. Felsenstein//Evolution.-1992.- V.46.- P.159-173.

80. Fisher R.A. Statistical methods for research workers / Fisher R.A. 1985. - Edinburgh: Oliver and Boyd.

81. Franckowiak J. Revised linkage maps for morphological markers in barley, Hordeum vulgare / J. Franckowiak // Barley Genetics Newsletter. 1997. - V.26. - P. 9-21.

82. Frary A.fw2.2: a quantitative trait locus key to the evolution of tomato fruit size / A. Frary, T. Nesbitt, S. Grandillo, E. Van der Knaap, B. Cing, J. Liu, J. Meller, R. Elber, K. Alpert, C. Tanksley // Science. 2000. - V.289. - P. 85-88.

83. Gachon C. Real-time PCR: what relevance to plant studies? / C. Gachon, A. Mingam, B. Charrier // J Exp Bot. 2004. - V.55.№.402. - P. 1445-1454.

84. Gaut B.S. Nucleotide polymorphism in the Adhl locus of pearl millet ('Pennisetumglaucum) СPoaceae) / B.S. Gaut, M.T. Clegg // Genetics. 1993. - V.135.№.4. - P. 1091252

85. Gibson G. The quantitative genetics of transcription/ G. Gibson, B. Weir // Trends Genet. -2005.- V.21. P. 616-623.

86. Gibson S. Isolating plant genes / S. Gibson, C. Somerville //Trends Biotech. 1993. -V.11.-P.306-313.

87. Goff S.A. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica)/ S.A. Goff, D. Ricke, Т.Н. Lan, G. Presting, R. Wang, M. Dunn, J. Glazebrook, A. Sessions, P. Oeller, H. Varma et al. II Science. 2002. - V.296. - P.92-100.

88. Graner A. Construction of an RFLP map of barley / A. Graner, A. Jahoor, J. Schondelmaier, H. Siedler, K. Pillen, G. Fischbeck, G. Wenzel, G. Herrmann // Theor. Appl. Genet.- 1991. V.83. - P.250-256.

89. Grossi M. Characterization of two barley genes that respond rapidly to dehydration stress / M. Grossi, M. Gulli, A.M. Stanca, L. Gattivelli // Plant Sci. 1995. - V.109. - P. 71-80.

90. Gupta P.K. Molecular markers from the transcribed expressed region of the genome in higher plants / P.K. Gupta, S. Rustgi // Funct Integr Genomics. 2004. - V.4.№3. - P.139-162.

91. Halterman D.A.Powdery mildew-induced Mia mRNAs are alternatively spliced and contain multiple upstream open reading frames/ D.A. Halterman, F. Wei, R.P.Wise // Plant Physiol. 2003.- V.131.№2. P.558-567.

92. Hamrick J.K., Godt M.J.W. Allozyme diversity in plant species / A.H.D. Brown, M.T. Clegg, A.L. Kahler, B.S. Weir // Plant population genetics, breeding, and genetic resources. -Sunderland, MA: Sinauer Associates Inc.- 1990. P.43-63.

93. Han F. Fine structure mapping of the barley chromosome-1 centromere region containing malting-quality QTLs / F. Han, S.E. Ullrich, A. Kleinhofs, B.L. Jones, P.M. Hayes, D.M. Wesenberg // Theor. Appl. Genet. 1997. - V.95. - P. 903-910.

94. Hanelt P. Zur Geschichte des Anbaues von Vicia faba L. und ihrer verschidenen Formen / P. Hanelt // Kulturpflanze. 1972. - V.20. - P. 75-128.

95. Hanelt P. Cytosystematische Untersuchungen in der Artengruppe um Vicia sativa L. / P. Hanelt, D.Mettin//n. Kulturpflanze.-1966.- V.14.- P.137-161.

96. Hanelt P. Die Stellung von Vicia faba L. .in der Gattung Vicia L. und Betrachtungen zur Entstehung dieser Kulturart / P. Hanelt, H. Schafer, J. Schultze-Motel //Kulturpflanze. 1972. -V.20. - P. 264-275.

97. Harada J.J. Spatially regulated genes expressed during seed germination and postgerminative development are activated during embryogeny / J.J. Harada, C.S. Baden, L. Comai // Mol Gen Genet. 1988. - V.212. - P. 466-473.

98. Harlan J. R. Distribution of wild wheats and barley/ J. R. Harlan, D. Zohary // Science. -1966. V.153. №3740. - P.1074 - 1080.

99. Harlan J.R. Gene centers and gene utilization in American agriculture. / C.W. Yeatman, D. Kafton, G. Wilkes // Plant Genetic Resources: A Conservation Imperative AAAS Selected Symposium 87. Boulder: Westview Press. - 1984. - P. 111-129.

100. Harushima Y. A high-density rice genetic linkage map with 2275 markers using a single F2 population/ Y. Harushima, M. Yano, A. Shomura, M. Sato, T. Sasaki // Genetics. 1998. - V.148. -P. 479-494.

101. Hayes P.M. Malting quality from a QTL perspective/ P.M. Hayes, B.L. Jones //8th International Barley Genetics Symposium. 2000. - Adelaide. - P. 99-105.

102. Hodgkin T. Core Collections of Plant Genetic Resources/ T. Hodgkin, A.H.D. Brown, T. van Hintum, E. Morales. John Wiley &Sons: Chichester. - 1995.

103. Holstege F.C. Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome/ F.C. Holstege, E.G. Jennings, J.J. Wyrick, T.I. Lee, C.J. Hengartner, M.R. Green, T.R. Golub, E.S. Lander, R.A. Young//Cell. 1988.-V.95.- P. 717-728.

104. Horak C.E. Global analysis of gene expression in yeast / C.E. Horak, M. Snyder // Funct Integr Genomics. 2002. - Y.2. - P.171-180.

105. Huang L. Map-based cloning of leaf rust resistance gene Lr21 from the large and polyploid genome of bread wheat/ L. Huang, S.A. Brooks, W. Li, J.P. Fellers, H.N. Trick, B.S. Gill // Genetics. 2003. - V.164.№2. - P.655-664.

106. Huen M. Site of einkorn domestication identified by DNA fingerprinting/M. Huen, R. Schafer-Pregl, D. Klawan, R. Castagna, M. Accerbi, B. Borghi, F. Salamini // Science. 1997. -V.278.-P. 1312-1314.

107. Hughes K.A. Segregating variation in the transcriptome: cis regulation and additivity254of effects/ K.A. Hughes, J.F. Ayroles, M.M. Reedy, J.M. Drnevich, K.C. Rowe, E.A. Ruedi, C.E. Caceres, K.N. Paige // Genetics. 2006. - V.173. - P. 1347-1355.

108. Jaaska V. Isoenzyme diversity and phylogenic affinities in Vicia subgenus Vicia (Fabaceae)/V. Jaaska//Genet. Res. Crop Evol. 1997. - V.44.- P. 557-574.

109. Jabs T. Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals / T. Jabs // Biochem Pharmacol. 1999. - V.57. - P.231-245.

110. Jaccard P. Nouvelles rescherches sur la distribution florale/ P. Jaccard // Bull. Soc. Vaud. Sci. Nat. 1908. - V.44. - P. 223-270.

111. Jackson M. Conservation of rice genetic resources: the role of the International Rice Genebank at IRRI /М. Jackson // Plant Molecular Biology. 1997. - V.35. - P.61-67.

112. Jansen R.A. Genetical genomics: the added value from segregation/ R.A. Jansen, J.P. Nap // Trends Genet.-2001.- V.17.- P. 388-391.

113. Jeffreys A.J. Individual-specific 'fingerprints'of human DNA/ A.J. Jeffreys,-V.Wilson, S.L.Thein //Nature.- 1985.- V.316.-P.76-79.

114. Jordan M. Identifying regions of the wheat genome controlling seed development by mapping expression quantitative trait loci / M. Jordan, D.J. Somers, T.W. Banks // Plant Biotechnol. J. 2007. - V.5. - P. 442^153.

115. Kane M.D. Assessment of the sensitivity and specificity of oligonucleotide (50mer) microarrays / M.D. Kane, T.A. Jatkoe, C.R. Stumpf, J. Lu, J.D. Thomas, S.J. Madore // Nucl. Acids Res. 2000. - V.28. - P. 4552^1557.

116. Kearsey M.J. The genetical analysis of quantitative traits/ M.J. Kearsey, H.S. Pooni 1998.л- Birmingham: Stanley Thornes LTd. 381 c.

117. Kearsey M.J. QTL analysis in plants: where are we now? / M.J. Kearsey, A.G. Farquhar // Heredity. 1998. - V.80. - P. 137-142.

118. Kleinhofs A., Graner A. An integrated map of the barley genome / R.L. Phillips, I.K. Vasil //DNA-Based Markers in Plants. 2001. - Kluwer Academic Publishers: Dordrecht. - P. 187-199.

119. Kleinhofs A., Han F. Molecular mapping of the barley genome / J.C. Slafer,255

120. J.L. Araus, R. Savin, I. Romagosa // Barley Science: Recent Advances from Molecular Biology to Agronomy of Yield and Quality. 2001. - New York: Food Product Press. - P.31-45.

121. Kobrehel K. Specific reduction of wheat storage proteins by thioredoxin h / K. Kobrehel, J.H. Wong, A. Balogh, F. Kiss, B.C. Yee, B.B. Buchanan // Plant Physiol. 1992. - V.99. - P. 919-924.

122. Kosambi D.D. The estimation of map distances from recombination values/ D.D. Kosambi //Ann. Eugen. 1944. - V.12. - P.172-175.

123. Kota R. Application of denaturing high-performance liquid chromatography for mapping of single nucleotide polymorphisms in barley (Hordeum vulgare L.)/ R. Kota, M. Wolf, W. Michalek, A. Graner // Genome. 2001. - V.44. - P. 1-6.

124. Kunzel G. Cytologically integrated physical restriction fragment length polymorphism maps based on translocation breakpoints/ G. Kunzel, L. Korzun, A. Meister //Genetics. 2000. -V.154. — P.397-412.

125. Kupicha F.K. The infrageneric structure of Vicia / F.K. Kupicha // Not. Royal Bot. Gard. Edinburg. 1976. - V.34.- P. 287-326.

126. Ladizinsky G. Consequences of hybridization in Vicia sativa aggregate / G. Ladizinsky // Heredity.-1981.- V.47.- P.431-438.

127. Ladizinsky G. Seed protein electrophoresis of the wild and cultivated species of section Faba of Vicia / G. Ladizinsky // Euphytica. 1975. - V.24". - P. 785-788.

128. Lane B.G. Cellular desiccation and hydration: developmentally regulated proteins, and the maturation and germination of seed embryos / B.G. Lane //FASEB J. 1991. - V.5.No.l4 - P. 2893-901.

129. Larson S.R. Backcross gains for six-rowed grain and malt qualities with introgression of a feed barley yield QTL / S.R. Larson, D.K. Habernicht, Т.К. Blake, K. Adamson // J Am Soc Brew Chem. 1997. - V.55. - P. 52-57.

130. Lee J.M., Williams M.E., Tingey S.V., Rafalski J.A. DNA array profiling of gene expression changes during maize embiyo development / J.M. Lee, M.E. Williams, S.V. Tingey, J.A. Rafalski//Funct Integr Genomics. 2002. - V.2. - P. 13-27.

131. Lewin B. Genes/ B. Lewin. 1997. - Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press.

132. Leyser O., Chang C. Chromosome walking / G.D. Foster, D. Twell // Plant Gene Isolation. 1996. - John Wiley and Sons Ltd:Chichester. - P. 248-271.

133. Liston A. Variation on the chloroplast genes rpoCl and rpoC2 of the genus Astragalus (Fabaceae): evidence from restriction site mapping of the PCR-amplified fragment / A. Liston // Am. J.Bot. 1992. - V.70. - P. 953-961.

134. Liu B.H. Statistical Genomics: Linkage, Mapping and QTL Analysis/ B.H. Liu. 1998. -CRC Press, Boca Raton: FL. - 612 pp.

135. Lockhart D.J. Genomics, gene expression and DNA arrays/ D.J. Lockhart, E.A. Winzeler // Nature. 2000. - V.405.№6788. - P. 827-836.

136. Loi L. Survival of barley 1-3, 1-4-glucanase isoenzymes during kilning and mashing/ L. Loi, P.A. Barton, G.B. Fincher // J.Cereal Sci. 1987. - V.5. - P. 45-50.

137. Maire R. Contribution a l'etude de la flore l'Afrique du Nord/ R. Maire // Bui. De le Soc. D'Hist.Nat. de l'Afrique. 1929. - V.20.

138. Mantel N.A. The detection of disease clustering and a generalized regression approach / N.A. Mantel //Cancer Res. 1967. - V.27. - P. 209-220.

139. Maxted N. A phenetic investigation of Vicia L. subgenus Vicia (Leguminosae, Viciae)/ N. Maxted // Bot. J. Linnean Soc. 1993. - V.l 11. - P. 155-182.

140. Maxted N. An ecogeographical study of Vicia subgenus Vicia II Systematics and Ecogeographic Studies on Crop Genepools. 1995. - IPGRLRome - V.8. - 184 pp.

141. Maxted N. Towards a Faba bean progenitor/ N. Maxted //FABIS Newsletter. 1992. -V.31.- P. 3-7.

142. Maxted N. The newly discovered relatives of Vicia faba L. do little to resolve the enigma of its origin/N. Maxted, A.M.A.Khattab, F.A. Bisby//Bot. Chron. 1991. - V.10. - P. 435-465.

143. Medawar P.B. An Unsolved Problem in Biology/ P.B. Medawar. 1952. - London: HK Lewis.

144. Mettin D. Cytosystematische Untersuchungen in der Artengruppe um Vicia sativa L. / D. Mettin, P. Hanelt // Kulturpflanze. 1964. - V.12. - P. 163-225.

145. Mettin D. Uber Speziationsvorgange in der Gattung Vicia L. / D. Mettin, P. Hanelt //Kulturpflanze. 1973. - V.21. - P. 25-54.

146. Mikola L. Germinating barley grains contain 5 acid carboxypeptidases with complementary substrate specificities / L. Mikola // Biochim Biophys Acta. 1983. - V.747.No.3. - P. 241-252.

147. Milkowski C. Serine carboxypeptidase-like acyltransferases / C. Milkowski, D. Strack // Phytochemistry. 2004. - V.65.No.5. - P. 517-524.

148. Molina-Cano J.L. Further evidence supporting Morocco as a centre of origin of barley / J.L. Molina-Cano, M. Moralejo, E. Igartua, I. Romagosa // Theor. Appl. Genet. 1999. - V.98. - P. 913-918.

149. Morgante M. From plant genomics to breeding practice / M. Morgante, F. Salamini // Current Opinion in Biotechnology. 2003. - V.14. - P. 214-219.

150. Morton N.E. Logarithm of odds (lods) for linkage in complex inheritance / N.E. Morton // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93. №8. - P. 3471-3476.

151. Miyashita N.T. DNA variation in the 5' upstream region of the Adh locus of the wild plants Arabidopsis thaliana and Arabis gemmifera / N.T. Miyashita // Mol Biol Evol. 2001. - V.18. №2. -P. 164-71.

152. Murphy D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects/ D. Murphy // Advances in physiology education. 2002. - V.26. - P. 256-270.

153. Nei M. Genetic distance between populations / M. Nei // Amer. Naturalist. 1972. -V.106.- P. 283-292.

154. Nei M. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases / M. Nei, W.H. Li // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V.76. - P. 5269-5273.

155. Nelson J.C. QGENE: software for marker-based genomic analysis and breeding/J.C. Nelson // Mol Breed. 1997. - V.3. - P. 239-245.

156. Nguyen L. Cloning and characterisation of cytochrome P456 genes from barley (Hordeumvulgare) / L. Nguyen, A. Delves, P. Bundock, T.A. Holton // Proceedings of the 10th258

157. Australian Barley Technical Symposium. 2001. - Canberra, ACT, Australia: 16-20 September 2001.

158. Parsons B.L., Heflich R.H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations //Mutat Res. 1997. - V.387.№2. - P. 97-121.

159. Paterson A.H. Molecular dissection of quantitative traits: progress and prospects / A.H. Paterson // Genome Res. 1995. - V.5. - P.321-333.

160. Perrino P. Contrbution to the taxonomy of Vicia species belonging to the section Faba / P. Perrino, D. Pignone // Kulturpflanze. 1981. - V.29.- P. 311-319.

161. Plitmann U. Vicia L ./ P.H. Davis // Flora of Turkey. 1970. - Edinburgh University Press. -V.3.- P. 274-325.

162. Plucknett D.L. / D.L. Plucknett, N.J.H. Smith, J.T. Williams, N. Murthi-Anishetty // Gene banks and the world's food. — 1987. —New Jersey : Princeton Univ. Press.

163. Polignano G.B. Protein polymorphism among genotypes of faba bean from Afganistan and Ethiopia / G.B. Polignano, R. Solendido, R. Uggenti //Fabis Newsletter. 1991. - V.28-29. - P. 811.

164. Potokina E.K. Vicia sativa L. aggregate (Fabaceae) in the flora of former USSR / E.K. Potokina// Genet. Resour. Crop. Evol. 1997. - V.44. - P.l99-209.

165. Przybylska, J. Electrophoretic seed albumin patterns and species relationships in Vicia sect.

166. Faba СFabaceae)/ J. Przybylska, Z. Zimniak- Przybylska // Pi. Syst. Evol. 1995. - V.198.259- P. 179-194.

167. Ptashne M. Transcriptional activation by recruitment / M. Ptashne, A. Gann // Nature. -1997. Y.368. - P. 569-577.

168. Rafalski A.J. Novel genetic mapping tools in plants: SNPs and LD-based approaches // Plant Science. 2002.- V.162. - P.329-333.

169. Raina S.N. Chloroplast DNA diversity in Vicia faba and its close wild relatives: implications and reassessment/ S.N. Raina, Y. Ogihara // Theor. Appl. Genet. 1994. - V.88. - P. 261-266.

170. Ramsay G. Interspecific hybridization between Vicia faba and other species of Vicia: Approaches to delayed embryo abortion/ G. Ramsay, B. Pickersgill // Biol. Zentrlbl. 1986. -V.105. - P. 171-179.

171. Ranki H. Secretion of carboxypeptidase-I by the scutellum of germinating barley grain / H. Ranki, T. Sopanen, I. Mikola // Plant Physiol. 1983. - V.81. - P. 901-906.

172. Reif J.C. Wheat genetic diversity trends during domestication and breeding/ J.C. Reif, P. Zhang, S. Dreisigacker, M.L. Warburton, D. van Ginkel, M. Hoisington, M. Bohn, A.E. Melchinger //Theor Appl Genet. 2005. - V.l 10. - P.859-864.

173. Reiter R. RCR-based marker systems/ R.L. Phillips, I.K. Vasil // DNA-based markers in plants. Kluver Academic Publishers: Dordrecht.- 2001,- P. 9-29.

174. Reiter W.D. Molecular genetics of nucleotide sugar interconversion pathways in plants / W.D. Reiter, G.F. Vanzin // Plant Mol. Biol. 2001. - V.47. - P. 95-113.

175. Rensink W.A. Microarray expression profiling resources for plant genomics/ W.A. Rensink, C.R. Buell // Trends Plant Sci. 2005. - V.l0. - P.603-609.

176. Rholf F.J. NTSYS-pc, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System/ F.J. Rholf.- 1992. Exter Publ. Ltd., NY

177. Richmond T. Chasing the dream: plant EST microarrays / T. Richmond, S.C. Somerville // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. - V.3. - P. 108-116.

178. Ronald J. Simultaneous genotyping gene-expression measurement and detection of260allele-speciflc expression with oligonucleotide arrays / J. Ronald, J.M. Akey, J. Whittle, E.N. Smith, G. Yvert, L. Kruglyak // Genome Res. 2005. - V. 15. - P. 284-291.

179. Ronning C.M. Comparative analysis of potato expressed sequence tag libraries /С.М. Ronning // Plant Physiology. 2003. - V.131. - P. 419-429.

180. Rudd S. PlantMarkers a database of predicted molecular markers from plants / S. Rudd, H. Schoof, K. Mayer // Nucleic Acids Res. - 2005. - V.33. - P. 628-632.

181. Russell J.R. A retrospective analysis of spring barley germplasm development fromfoundation genotypes' to currently successful cultivars / J.R. Russell, R.P. Ellis, W.T.B. Thomas,i

182. R.Waugh, J. Provan, A. Booth, J. Fuller, P. Lawrence, G. Young, W. Powell // Molecular Breeding. -2000. V.6. - P. 553-568.

183. Ruuska S.A. Contrapuntal networks of gene expression during Arabidopsis seed filling / S.A. Ruuska, T. Girke, C. Benning, J.B. Ohlrogge // Plant Cell. 2002. - V.14. - P. 1191-1206.

184. Saiki R.K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase/ R.K. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K.B. Mullis, H.A. Erlich//Nature. 1988. - V.239. - P.487-497.

185. Salamini F. Comment on "AFLP data and the origins of domesticated crops"/ F. Salamini, M. Heun, A. Brandolini, H. Ozkan, J. Wunder // Genome. 2004. - V.47. - P. 615-620.

186. Sax K. The association of size differences with seed coat pattern and pigmentation in Phaseolus vulgaris L. / K. Sax // Genetics. 1923. - V.8. - P.552-560.

187. Scadsen R.W. Molecular cloning, characterization and expression analysis of two catalase isozyme genes in barley / R.W. Scadsen, P. Schulze-Lefert, J.M. Herbst // Plant Mol Biol. 1995. -V.29. - P. 1005-1014.

188. Seradilla J.M. Geographic dispersion and varietal diversity in Vicia faba L. / J.M. Seradilla, T. D. Mora, M.T. Moreno // Genet. Res. Crop Evol. 1993. - V.40. - P.l43-151.

189. Serrato A.J. Characterization of two thioredoxins h with predominant localization in thenucleus of aleurone and scutellum cells of germinating wheat seeds/ A.J. Serrato, J.L. Crespo, F J.

190. Florencio, F.J. Cejudo // Plant Mol. Biol. 2001.- V.46.- P. 361-371.261

191. Shimada H. Fine structural features of the chloroplast genome comparison of the sequenced chloroplast genomes / H. Shimada, M. Sugiura //Nucleic Acids Res. 1991. - V.19. - P. 983-995.

192. Shutov A.D. Degradation of storage proteins in germinating seeds/ A.D. Shutov, I.A. Vaintraub // Phytochemistry. 1987. - V.26. - P. 1557-1566.

193. Sokal R.R. Principles of Numerical Taxonomy/ R.R. Sokal, P.H.A. Sneath San Francisco. - 1963. - 359pp.t

194. Sorensen S.B. Primary structure of carboxypeptidase-I from malted barley / S.B. Sorensen, K. Breddam, I. Svendsen // Carlsberg Res Commun. 1986. - V.51. №.7. - P. 475-485.

195. Sorensen S.B. Primary structure of carboxypeptidase-II from malted barley / S.B. Sorensen, I. Svendsen, K. Breddam // Carlsberg Res Commun. 1987. - V.52.No.4. - P. 285-295.

196. Stein N., Graner A. Map-based gene isolation in cereal genomes / P. Gupta, R. Varshney // Cereal Genomics. 2004. - Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. - P.331-360.

197. Stern D.L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation / D.L. Stern // Evolution. 2000. - V.54. - P. 1079-1091.

198. Storey J.D. A direct approach to false discovery rates / J.D. Storey //J. R. Stat. Soc. B. -2002. V.64. - P. 479-498.

199. Storey J.D., Tibshirani R. Statistical significance for genome wide studies/ J.D. Storey, R. Tibshirani // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003. - V.100. - P. 9440-9445.

200. Stuber C. Breeding multigenic traits/ R.L. Phillips, I.K. Vasil // DNA-based markers in plants. 2001. - Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. - P.l 15-137.

201. Swofford D.L. PAUP: Phylogenetic analysis using parsimony. Version 3.0s. Computer program distributed by the Illinois Natural History Survey/ D.L. Swofford. 1991. - Illinois: Champaign.

202. T.A.G. Initiative, Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana II Nature. 2000. - V.408. - P.796-815.

203. Tanksley S.D. Mapping polygenes / S.D. Tanksley // Annu. Rev. Genet. 1993. - V.27. -P.205-233.

204. Tanksley S.D. Seed banks and molecular maps: unlocking genetic potential from the wild / S.D. Tanksley, S.R. McCouch // Science. 1997. - V.22.№277. - P. 1063-1066.

205. Tanksley S.D. Use of naturally-occurring enzyme variation to detect and map genes controlling quantitative traits in an interspecific backcross of tomato/ S.D. Tanksley, H. Medina-Filho, C.M. Rick // Heredity. 1982. - V.49. - P. 11-25.

206. Tanksley S.D. Advanced backcross QTL analysis: a method for the simultaneous discovery and transfer of valuable QTLs from unadapted germplasm into elite breeding lines / S.D. Tanksley, J.C. Nelson // Theor. Appl. Genet. 1996. - V.92. - P. 191-203.

207. Tanksley S.D. Isozymes in plant genetics and breeding // S.D. Tanksley, T.J. Orton. -Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V. 1983.

208. Tanksley S.D. Isozymic gene linkage map of the tomato: applications in genetics and breeding / S.D. Tanksley, C.M. Rick // Theor. Appl. Genet. 1980. - V.57. - P. 161-170.

209. Thoday J.M. Location of polygenes / J.M. Thoday II Nature. 1961. - V.191.2631. Р.368-370.

210. Thomas T.L. Gene expression during plant embryogenesis and germination: an overview / T.L. Thomas // Plant Cell. 1993. - V.5. - P. 1401-1410.

211. Thomas W.T.B. Prospects for molecular breeding of barley / W.T.B. Thomas // Annals of Applied Biology. 2003. - V.142. - P. 1-12.

212. Trabut L. L'indigenat de la Flore en Algerie / L. Trabut // Bui. De la Soc. Nat. De l'Afrique. — 1911.— No.7.- P. 1-7.

213. Tsumura Y. Molecular phylogeny of conifers using RFLP analysis of PCR-amplified specific chloroplast genes / Y. Tsumura, K. Yoshimura, N. Tomaru, K. Ohba //Theor. Appl. Genet.- 1995.- V.91. P. 1222-1236.

214. Urano J. Molecular cloning and characterisation of a rice dehydroascorbate reductase/ J. Urano, T. Nakagawa, Y. Maki, T. Masumura, K. Tanaka, N. Murata, T. Ushimaru // FEBS Letters. -2000.- V.466. P.107-111.

215. Van de Ven M. Restriction fragment length polymorphism as genetic markers in Vicia / M. Van de Ven, W. Powell, G. Ramsey, R. Waugh // Heredity. 1990. - V.65. - P. 329-342.

216. Varshney R., Korzun V., Borner A. Molecular maps in cereals: methodology and progress/Gupta P., Varshney R. / Varshney R., Korzun V., Borner A. //Cereal Genomics. 2004. — Kluwer Academic Publishers: Dordrecht. - P. 35-82.

217. Virk P.S. The use of RAPD for the study of diversity within plant germplasm collections / P.S. Virk, B.V. Ford-Lloyd, M.T. Jackson, H.J. Newbury //Heredity. 1995. - V.74. - P.170-179.

218. Vos P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Rijans, T. Van der Lee, M. Homes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper, M. Zabeau //Nucleic Acids Res. 1995. - V.91. - P. 4407-4414.

219. Wainwright T. Effect of barley and malt lipids on beer properties / T. Wainwright // Monogr. Eur. Brew. Conv. 1988. - V.6. - P. 118-128.

220. Wang M. Spatial and temporal regulation of DNA fragmentation in the aleurone ofgerminating barley / M. Wang, B.J. Oppedijik, M.P.M. Caspers, G.E.M. Lamers, M.J. Boot, D.N.G.

221. Geerlings, B. Bakhuizen, A.H. Meijer, B. Duijn // J Exp Bot. 1998. - V.49. - P.1293-1301.264

222. Wang Z. Polymorphism and phylogenetic relationships among species in the genus Oryza as determined by analysis of nuclear RFLPs / Z. Wang, G. Second, S. Tanksley // Theor. Appl. Genet.-1992.-V. 83.-P. 565-581.

223. Weising K. DNA fingerprinting in plants and fungi/ Weising K., Nybom H., Wolff K., Meyer W. CRC Press. - 1995. - P. 322.

224. Welsh J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers/ J. Welsh, M. McClelland //Nucleic Acids Res. 1990. - V.18. -P. 7213-7218.

225. Wiley E.O. The complete cladist / E.O. Wiley, D. Siegel-Causey, D.R. Brooks, V.A. Funk // The University of Kansas Museum of Natural History Special Publication. 1991. - V.l 9. - P. 1-158.

226. Williams J.G.K. Genetic analysis using randomly amplified polymorphic DNA markers / J.G.K. Williams, M.K. Hanafey, J.A. Rafalski, S.V. Tingey // Methods Enzymol. 1993. - V.218. - P. 704-740.

227. Williams J.G.K. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski, S.V. Tingey // Nucleic Acids Res.- 1990.- V.18.-P. 6531-6535.

228. Winspear M.J. Comparison of peptide-hydrolase activities in cereals / M.J. Winspear, K.R. Preston, V. Rastogi, A. Oaks // Plant Physiol. 1984. - V.75. №.2. - P. 480-482.

229. Wray G.A. The evolutionary significance of c/s-regulatory mutations / G.A. Wray // Nat Rev Genet. 2007. - V.8. № 3. - P. 206-216.

230. Xiao J. Genes from wild rice improve yield / J. Xiao, S. Grandillo, S. Nag Ahn, S. McCouch, S. Tanksley//Nature. 1996. - V.384. № 21. -P.223-224.

231. Yamamoto K. Interspecific hybridization among Vicia narbonensis and its related species/ K. Yamamoto//Biol. Zbl.- 1986.- V.l05.- P. 181-197.

232. Yamashita S. Expression quantitative trait loci analysis of 13 genes in the rat prostate265

233. S. Yamashita, К. Wakazono, Т. Nomoto, Y. Tsujino,T. Kuramoto // Genetics. 2005. - V.171. — P. 1231-1238.

234. Yano M. Genetic and molecular dissection of quantitative traits in rice/ M. Yano, T. Sasaki // Plant Molecular Biology. 1997. - V.35. - P. 145-153.

235. Young N.D. A cautiously optimistic vision for marker-assisted breeding/ N.D. Young // Molecular Breeding. 1999. - V.5. - P. 505-510.

236. Yu J. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica) / J. Yu, S. Hu, J. Wang, G.K. Wong, S. Li, B. Liu, Y. Deng, L. Dai, Y. Zhou, X. Zhang et al. // Science. 2002. -V.296. - P.79-92.

237. Yu J. The genomes of Oryza sativa: a history of duplications / J. Yu, J. Wang, W. Lin, S. Li, H. Li, J. Zhou, S. Ni, W. Dong, S. Hu, C. Zeng et al. II PLoS Biol. 2003. - V.3. - e38, doi:10.1371/journal.pbio.0030038.

238. Zelenin A.V. Introduction into plant genomics/ A.V. Zelenin, E.D. Badaeva, O.V. Muravenko // Molecular biology. 2001. - V.35. №3. - P.285-293.

239. Zeng Z.B. Theoretical basis for separation of multiple linked gene effect in mapping quantitative trait loci / Z.B. Zeng // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. - V.90. - P. 10972-10976.

240. Zohary D. Monophyletic vs. polyphyletic origin of the crops on which agriculture was founded in the Near East / D. Zohary // Genet. Res. Crop. Evol. 1999. - V.46. - P. 133-142.

241. Zohary D. Domestication of pulses in the Old World / D. Zohary, M. Hopf // Science. -1973.- V.182. P. 887-894.

242. Zohary D. Chromosome polymorphism, hybridization and colonization in the Vicia sativa group (Fabaceae)/ D. Zohary, U. Plitman // Plant Syst. Evol. 1979. - V.31. - P. 143-156.

Информация о работе

Потокина, Елена Кирилловна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Прикладные аспекты структурной и функциональной геномики растений (на примере родов Vicia L. и Hordeum L.) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы