Поверхностные белки кератиноцитов, участвующие в транспорте нуклеиновых кислот

Челобанов, Борис Павлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поверхностные белки кератиноцитов, участвующие в транспорте нуклеиновых кислот
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Поверхностные белки кератиноцитов, участвующие в транспорте нуклеиновых кислот"

На правах рукописи

ЧЕЛОБАНОВ БОРИС ПАВЛОВИЧ

ПОВЕРХНОСТНЫЕ БЕЛКИ КЕРАТИНОЦИТОВ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ТРАНСПОРТЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

03.00.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2005 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (бывший Новосибирский инсгит>1 биоорганической химии СО РАН)

Научный руководитель.

к.б н. Лактионов Павел Петрович

Официальные оппоненты.

д.х н , профессор Лаврик Ольга Ивановна

к.б.н Тарани» Александр Владимирович

Ведущая организация.

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита состоится » АПРЕЛЯ 2005 г. в КО часов на заседании диссертационного совета Д 003 045.0] при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Невосибирск-90, пр Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАИ Автореферат разослан марта 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Федорова О.С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Регуляция экспрессии генов за счет воздействия на нуклеиновые кислоты клетки интенсивно исследуется в последнее время. В частности, для регуляции экспрессии генов было предложено использовать антисмысловые олигонуклеотиды и их химические аналоги. В экспериментах на культурах тканей было показано, что антисмысловые олигонуклеотиды ингибируют экспрессию генов за счет комплементарных взаимодействий, препятствуя процессу транскрипции или трансляции. Комплементарные олигонуклеотиды были успешно использованы для коррекции точечных мутаций и ошибок сплайсинга. В последнее время для ингибирования экспрессии генов используется явление РНК интерференции - избирательного подавления экспрессии генов под действием двуцепочечных РНК, строго гомологичных мРНК мишени.

Исследование взаимодействия нуклеиновых кислот с клетками различных тканей, выявление механизмов естественного транспорта нуклеиновых кислот в клетки позволит разработать универсальные подходы к борьбе с инфекционными, онкологическими и наследственными заболеваниями. Кроме того, исследование природных механизмов транспорта нуклеиновых кислот представляет огромный интерес в связи с открытием внеклеточных нуклеиновых кислот, роль и функции которых в настоящее время практически неизвестны.

Центральную роль в транспорте молекул через биологические мембраны занимают белки, которые, собственно, и осуществляют рецепцию и транспорт. В настоящее время описаны клеточные белки, экспонированные на плазматической мембране и участвующие в связывании нуклеиновых кислот. Однако в силу того, что для выявления и идентификации белков были использованы клетки различных тканей, использованы различные подходы к визуализации белков и различные по последовательности и химическому строению олигонуклеотиды, до сих пор не ясно, насколько выявленные белки универсальны и какова их роль в рецепции и транспорте нуклеиновых кислот. Таким образом, вопрос о механизмах транспорта нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих и белках, принимающих участие в этом процессе, до сих пор остается открытым.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С. Петербург

Цель работы. Целью настоящей работы было исследование поверхностных белков клеток различного тканевого происхождения и в том числе кератиноцитов, участвующих в узнавании и транспорте нуклеиновых кислот в клетки. В процессе выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Выяснить, являются ли олигонуклеотид-связывающие белки универсальными или же различные клетки экспрессируют различные олигонуклеотид-связывающие белки.

- Определить, какие факторы могут влиять на модификацию белков производными олигонуклеотидов и транспорт олигонуклеотидов в клетки.

- Разработать метод выделения поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков, участвующих в транспорте нуклеиновых кислот в клетки.

- Выделить и идентифицировать данные белки.

- Получить против идентифицированных белков антитела и с их помощью исследовать локализацию этих белков в клетке и их роль в транспорте нуклеиновых кислот.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые было показано, что клетки различного тканевого происхождения экспрессируют одинаковый набор поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков. Было продемонстрировано, что наиболее приемлемым методом выявления и выделения поверхностных белков клеток, связывающих нуклеиновые кислоты, является аффинная модификация живых клеток реакционноспособными олигонуклеотидами. Разработан метод выделения поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков при помощи аффинной модификации интактных клеток производным олигонуклеотида Р1и-1уз-р(>016-с^-и, содержащим на одном конце реакционноспособную группу (окисленный гЦ), а на другом - гаптен (флуоресцеин), с последующим выделением комплексов олигонуклеотид-белок аффинной хроматографией на Ультрагеле А2 с иммобилизованными антителами против флуоресцеина. При помощи этого метода были выделены олигонуклеотид-связывающие белки с молекулярной массой 68 кДа. Белки идентифицированны масс-спектроскопическим методом как альбумин, кератин К1, кератин К10 и кератин К2е. Было продемонстрировано участие этих белков в транспорте олигонуклеотидов. Полученные данные важны для понимания механизмов транспорта нуклеиновых кислот.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Материалы диссертации были доложены на международных конференциях:

1. XIV International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides, and Their Biological Applications. San-Francisco September 2000.

2. Опыт введения новейших достижений супрамолекулярной химии в учебные программы средних и высших учебных заведений. Новосибирск 6-11 августа 2001.

3. RNA as therapeutic target Novosibirsk, Russia, 30 august - 2 September 2001.

4. The Third International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS'2002), Novosibirsk, Russia, July 14-20,2002.

5. XV International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides, and Their Biological Applications. Leuven (Belgium) September 11-14, 2002.

6. "Фундаментальная наука медицине", Москва, Ноябрь, 2002.

7. International conference "Targeting RNA: Artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference". Workshop "Biology and biochemistry of extracellular nucleic acids", Novosibirsk, Russia, June 2003.

8. Circulating Nucleic Acids in Plasma & Serum III and Serum Proteomics 2003. Santa Monica, CA. November 9-11, 2003

9. Chemical & Biological Problems of Proteomics (CBPP-2004), Novosibirsk, Russia, July 5-9, 2004.

10. The Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS'2004) Novosibirsk, Russia, July 25-30, 2004.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 136 страницах, содержит 24 рисунка и 5 таблиц. Библиография включает 246 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Модификация поверхностных белков клеток различного происхождения

Для выяснения универсальности/специфичности поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков клеток методом аффинной модификации были исследованы поверхностные олигонуклеотид-связывающие белки клеток различного тканевого происхождения: А431 (эпидермальная карцинома), HeLa (карцинома шейки матки), KB (карцинома эпителия ротовой полости человека), MCF-7 (карцинома груди), Нер-2 (человеческая карцинома гортани), ЛЭЧ (первичные клетки легочного эпителия человека), К562 (человеческая миелогенная лейкемия), Cos-7 (клетки почки зеленой мартышки), СПЭВ (клетки почки эмбриона свиньи) и NIH/3T3 (фибробласты мыши).

В качестве реакционноспособной группы для синтеза аффинного реагента был выбран 4-[(М-2-хлорэтил-М-метил)амино] бензиламин (C1R), ранее неоднократно использовавшийся для аффинной модификации белков и нуклеиновых кислот.

При помощи аффинной модификации было показано, что при инкубации клеток с алкилирующим производным CIRpCAGTAAATATCTAGGA (ClRp(N)16) в PBS основными белками, связывающими нуклеиновые кислоты, являются белки с молекулярными массами 68, 38 и 28 кДа (рис. 1).

г- _ f-

« а. А ». гч г- Й 3

3 i « 5 S s i б Б

Рис. 1. Аффинная модификация мембранно-цитозольных белков, связывающих нуклеиновые кислоты, интактных клеток различных линий алкилирующим

производным олигонуклеотида [32P]-CIRp(N)16 в PBS

Клетки инкубировали 1 час с 1 мкМ [32Р]-CIRp(N)16 в PBS при 37 °С Белки анализировали при помощи SDS-

дискэлектрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ с последующей радиоавтографией

При инкубации с алкилирующим производным в культуральной среде увеличивается интенсивность модификации всех белков, кроме белка 38 кДа, степень модификации которого не изменяется, и наблюдается аффинная модификация белка 46 кДа и ряда минорных белков (рис. 2).

Рис. 2. Аффинная модификация

мембранно-цитозольных белков,

связывающих нуклеиновые кислоты, интактных клеток различных линий алкилирующим производным

олигонуклеотида [32P]-CIRp(N)i6 в среде ДМЕМ.

Клетки инкубировали 1 час с 1 мкМ [32Р]-CIRp(N)i6 в среде ДМЕМ при 37 °С. Белки анализировали при помощи SDS-дискэлектрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ с последующей радиоавтографией.

Следует отметить, что интенсивность модификации белков различна для клеток различного происхождения, что может бьггь связано с различным уровнем экспрессии этих белков в разных клетках. При этом в клетках кератиноцитарного происхождения выявляются те же белки, что и в других исследованных клетках. Таким образом, данные аффинной модификации клеток реакционноспособными производными олигонуклеотидов свидетельствуют об универсальности поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков.

Для выяснения специфичности взаимодействия олигонуклеотидов с клетками, клетки инкубировали с производными олигонуклеотида в присутствии потенциальных конкурентов. Было показано, что немеченые олигонуклеотиды, оц-ДНК, дц-ДНК и poly 1С уменьшали степень модификации белков производным ClRp(N)ie (рис. 3) и транспорт родамин-меченых производных олигонуклеотидов (Rh-ОДН) в клетки (Рис. 4), а гепарин и декстран сульфат ингибируют транспорт олигонуклеотидов в клетки, но только частично ингибируют модификацию белков.

Рис. 3. Специфичность связывания производного CIR-p(N)16 с клеточными белками. Клетки линии А431 инкубировали 1 час с 1 мкМ производными олигонуклеотида в PBS при 37 °С в присутствии потенциальных конкурентов: АТФ (100 мкМ), оц-ДНК (150 мкг/мл), дц-ДНК (150 мкг/мл), poly 1С (50 мкг/мл), декстрансульфат (10 мкг/мл), гепарин (50 мкг/мл), p(N)16 (50 мкМ), p(T)i6 (50мкМ).

Белки анализировали при помощи SDS-дискэлектрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ с последующей радиоавтографией.

Следует отметить, что полоса 68 кДа состоит, по меньшей мере, из двух белков близкой молекулярной массы, а гепарин и декстран сульфат по-разному связываются с белками, составляющими полосу 68 кДа. По-видимому, для транспорта олигонуклеотидов необходимы, оба белка из полосы 68 кДа, модификацию которых и нарушают гепарин и декстран сульфат. Полученные данные свидетельствуют о специфичности взаимодействия олигонуклеотидов с белками клеточной поверхности и дают возможность предположить участие этих белков в транспорте олигонуклеотидов в клетки.

Рис. 5. Влияние потенциальных ингибиторов на транспорт родамин-меченых олигонуклеотидов в клетки линии А431.

Клетки линии А431 инкубировали с 1мкМ родамин-меченым производным олигонуклеотида Ш1-1уз-р(М)16-с^-и 1 час при 37°С в среде ДМЕМ в присутствии потенциальных конкурентов: р(М)1б (50 мкМ), р(Т)16 (50 мкМ), оц-ДНК (150 мкг/мл), гепарина (50 мкг/мл), декстрансульфата (10 мкг/мл) и АТФ (100 мкМ). В контроле клетки инкубировали со свободным родамином (отрицательный контроль) и ЯЫуя-р(>Г)|6-<^-и без добавления конкурентов (положительный контроль). После инкубации клетки отмывали средой ДМЕМ, фиксировали 3.7% раствором формалина в РВ8, окрашивали ядра раствором ОАР1 и анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии.

Исследование локализации модифицированных белков

Поскольку модификация производным олигонуклеотида может происходить не только на поверхности клетки но и в различных клеточных компартментах, мы исследовали клеточную локализацию выявленных белков. Для разделения клеток на фракции была использована пермеабилизация клеток сапонином. Как известно, сапонин, встраиваясь в мембрану, формирует поры с эффективным радиусом, равным эффективному радиусу белков с мол. массой ~200 кДа. Через эти поры из клеток диффундируют компоненты цитозоля. Обработка сапонином была использована для получения цитозольной фракции (Ц), после чего пермеабилизованные и отмытые клетки разделяли на мембранную (МС) и ядерную (Я) фракции.

При обработке клеток ClRp(N)ie в PBS было показано, что модифицированные белки 68 и 28 кДа локализованы большей частью в мембранной фракции, присутствуют в незначительных количествах в ядерной и практически полностью отсутствуют в цитозольной. В то время как белок 38 кДа локализован в основном в цитозольной фракции, а, кроме того, присутствует в мембранной фракции и в небольших количествах в ядерной фракции (Рис. 6).

а $ А в 5 -> ">

f 1§11

of S 5 S вГ ts

Рис. 6. Исследование клеточной локализации белков, связывающих нуклеиновые кислоты. Клетки линии А431 инкубировали с 1 мкМ [32P]ClRp(N)i6 в PBS или ДМЕМ. Модифицированные в PBS клетки обрабатывали трипсином (0.25%, 5 мин.) или сапонином (40 мкг/мл, 20 мин.). Супернатант после обработки клеток сапонином собирали в качестве цитозольной фракции, а оставшиеся клетки разделяли на мембранно-цитозольную и ядерную фракции, как описано в «Материалах и методах».

Таким образом, все выявленные нами белки присутствуют, хотя бы частично, в цитоплазматической мембране клеток, однако не известно, экспонированы ли они наружу или внутрь мембраны. Для решения этого вопроса мы использовали мягкую обработку трипсином модифицированных клеток. Было показано, что часть модифицированного белка 68 кДа при

обработке трипсином деградирует до полипептида 60 кДа, что говорит об экспонировании белка на наружной поверхности клеток (Рис. 6) и подразумевает его участие в первичном узнавании и связывание олигонуклеотидов.

Влияние состояния клеточной мембраны на аффинную модификацию олигонуклеотид-связывающих белков и транспорт олигонуклеотидов в клетки

Ранее было показано, что обработки клеток, нарушающие целостность мембраны, могут приводить к усилению доставки олигонуклеотидов в клетки. Мы исследовали влияние различных предобработок клеток, нарушающих целостность клеточной мембраны, на модификацию белков реакционноспособным производным олигонуклеотида. Было показано, что обработка клеток сапонином и соскабливание клеток скрепером приводят к уменьшению аффинной модификации белков С1Кр(Ы)16 (Рис- 7) и уменьшению накопления олигонуклеотидов в клетках. Частичное нарушение клеточной поверхности соскабливанием скрепером было предложено МакНеилом и использовано в работе для доставки в клетки морфолиновых олигонуклеотидов. Однако в этой же работе было показано, что морфолиновые олигонуклеотиды проникают в клетки только в первую минуту после их соскабливания, а клетки, обработанные трипсином, не накапливают олигонуклеотиды. Мы показали, что предобработка клеток трипсином (Рис. 7) уменьшает аффинную модификацию белков С1Лр(~М)|6 и транспорт олигонуклеотидов в клетки.

Рис. 7. Влияние факторов, нарушающих целостность клеточной мембраны на модификацию белков, связывающих нуклеиновые кислоты, производным олигонуклеотида [32P]CIRp(N)16. Интактные клетки, трипсинизированные клетки, клетки, обработанные сапонином или снятые с подложки скрепером, инкубировали 1 час с 1 мкМ [32P]CIRp(N)16 при 37 °С в PBS. Белки анализировали при помощи SDS-дискэлектрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ с последующей радиоавтографией.

Таким образом, обработки клеток, нарушающие функциональную целостность клеточной мембраны, уменьшают аффинную модификацию белков и уменьшают проникновение олигонуклеотидов в клетки.

В ряде работ для выявления и выделения белков, участвующих в связывании и транспорте нуклеиновые кислоты, было использовано взаимодействие олигонуклеотидов или ДНК с клеточными фракциями. Клетки содержат огромное количество белков, связывающих нуклеиновые кислоты, участвующих в процессах транскирипции, трансляции, репликации, репарации, и, таким образом, при взаимодействии олигонуклеотидов с клеточными фракциями должно выявляться большое число белков, не имеющих отношения к транспорту нуклеиновых кислот в клетки.

Для того чтобы оценить возможность выделения поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков из предварительно приготовленных фракциях клеток мы исследовали аффинную модификацию клеток и клеточных фракций реакционноспособным производным СШр^)^

Было показано, что обработка СШ.р(М)16 мембранно-цитозольной, цитозольной и ядерной фракций приводит к аффинному мечению большого количества белков, в отличие от модификации интактных клеток (Рис. 8). При этом во фракциях белки, связывающие нуклеиновые кислоты в интактных клетках, не выявляются или обнаруживаются, но как минорные компоненты.

Фракции

Рис. 8. Аффинная модификация клеточных фракций и живых клеток линии А431 [32Р]С1Кр(1\т)|6. Клетки и клеточные фракции инкубировали 1 час с 1 мкМ [32Р]СЖр(Ъ1)16. Белки анализировали при помощи ЯПЯ-

дискэлектрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ с последующей радиоавтографией.

Поскольку обработки клеток, нарушающие функциональную целостность клеточной мембраны, предотвращают аффинную модификацию белков, а аффинная модификация клеточных фракций олигонуклеотидным реагентом приводит к модификации значительного количества дополнительных олигонуклеотид-связывающих белков, по сравнению с олигонуклеотид-связывающими белками, выявляемыми аффинной модификацией живых клеток то наиболее приемлемым методом выявления и выделения поверхностных белков клеток, связывающих нуклеиновые кислоты, является аффинная модификация живых клеток реакционноспособными олигонуклеотидами.

Исследование эффективности модификации поверхностных белков *

клеток линии А431 различными производными олигонуклеотидов.

Олигонуклеотидный реагент, пригодный для аффинной модификации ,

поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков клеток, с целью *

последующего выделения ковалентных олигонуклеотид-белковых комплексов должен содержать реакционноспособную группу для эффективной модификации белков и гаптенную группу для связывания с аффинным сорбентом.

В качестве гаптена было предложено использовать молекулу флуоресцеина (Flu), поскольку против флуоресцеина можно получить специфические антитела и с помощью флуоресцентной микроскопии следить за распределением в клетке модифицированных флуоресцеином олигонуклеотидов. Флуоресцеин присоединяли через лизиновый (lys) или диаминопентановый (DAP) линкеры. В качестве реакционных групп были исследованы C1R, малеимид (МаМ) и окисленный рибоуридин, присоединенный через диэтиленгликолевый (deg) линкер.

Для выяснения специфичности связывания полученных аффинных yi

реагентов с клеточными белками клетки инкубировали с реакционноспособными производными олигонуклеотидов в присутствии потенциальных конкурентов: немодифицированного олигонуклеотида, дц-ДНК и флуоресцеина (Рис. 8).

Было показано, что немодифицированный олигонуклеотид и ДНК эффективно ингибируют аффинную модификацию белков, связывающих нуклеиновые кислоты, реакционноспособными производными

олигонуклеотидов. При этом флуоресцеин не влияет на аффинную модификацию белков.

Таким образом, модификация белков реакционноспособными производными олигонуклеотидов является специфичной и связывание с белками определяется олигонуклеотидным компонентом аффинного реагента.

Рис. 8. Специфичность связывания реакционноспособных производных

олигонуклеотида p(N)16degU с клеточными белками

Клетки линии А431 инкубировали 1 час с

1 мкМ производными олигонуклеотида в среде ДМЬМ при 37 °С в присутствии потенциальных конкурентов 150 мкг/мл плазмидной ДНК, 50 мкМ p(N)16degU, 50 мкМ Flu и, в контроле, без добавления конкурентов.

Белки анализировали при помощи SDS-дискэлектрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ с последующей радиоавтографией

В качестве аффинного реагента был выбрано производное олигонуклеотида Р1и-ВАР-рСЫ)1б-(1ед-и, содержащее на З'-конце окисленный г11 в качестве реакционной группы, а на 5'-конце -флуоресцеин в качестве гаптена.

Выделение белков, связывающих нуклеиновые кислоты Для выделения ковалентных комплексов Flu-DAP-p(N)l6-deg-U с белками методом аффинной хроматографии было необходимо получить АТ против флуоресцеина. В предварительных экспериментах было обнаружено, что антитела против флуоресцеина с низкой эффективностью взаимодействуют с этим производным, однако, при замене диаминопентанового линкера на лизиновый не менее 95% производного олигонуклеотида Р1и-1у5-р(К)16-с^-и связывалось с иммобилизованными на сорбенте антителами против флуоресцеина. Данное производное было использовано для выделения белков.

Клетки (109) линии А431 модифицировали в среде ДМЕМ олигонуклеотидным реагентом Р1и-1у8-р(>016-ёе£-ио и выделяли модифицированные белки из мембранно-цитозольной клеточной фракции на

аффинном сорбенте, содержащем антитела против флуоресцеина. Для доказательства того, что при помощи аффинной хроматографии мы выделили искомые белки, часть специфического элюата после диск-электрофореза переносили на нитроцеллюлозную мембрану и окрашивали одну серию коллоидным серебром, другую - анти-Р1и-антителами. Было показано, что кроличьи анти-р] и -антитела специфично связывают те же олигонуклеотид-белковые комплексы, которые выявляются на радиоавтографе и при окраске нитроцеллюлозного фильтра коллоидным серебром (Рис. 9). Следует отметить, что модификация производным олигонуклеотида увеличивает молекулярную массу белка на ~ 5 кДа и уменьшает его электрофоретическую подвижность. Таким образом, модифицированные белки обнаруживаются на электрофореграмме существенно выше, чем те же самые белки, не модифицированные аффинным реагентом.

Рис. 9. Выделение поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков при помощи аффинной модификации клеток линии А431 производным олигонуклеотида [32P]F1u-lys-p(N)i6-deg-rU с последующей аффинной хроматографией на сорбенте с иммобилизованными антителами против флуоресцеина.

Белки разделяли при помощи SDS-дискэлектрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и окрашивали одну серию коллоидным серебром, другую - антителами против флуоресцеина.

Оставшуюся после аналитического исследования часть специфического элюата с аффинной хроматографии разделяли диск электрофорезом, окрашивали гель Coomasi- G250 и вырезали полосу геля, соответствующую белкам 68 кДа.

Идентификация выделенных белков с молекулярными массами ~ 68 кДа проводилось масс-спектрометрическим методом в лаборатории профессора Мейера (Бохум, Германия). Было обнаружено, что полоса 68 кДа содержит 4 белка - альбумин и кератины Kl, К10 и К2е.

Исследование клеточной локализации выделенных белков

Для доказательства достоверности идентификации выделенных олигонуклеотид-связывающих белков, исходя из литературных данных были выбраны иммуногенные пептиды из структуры кератинов К1 и К2е. Против этих пептидов и альбумина были получены поликлональные кроличьи антитела.

Клеточную локализацию выделенных белков исследовали с помощью полученных антител методом флуоресцентной микроскопии. Клетки линии А431, фиксированные метанолом, инкубировали с антителами против альбумина, кератина К1 и кератина К2е. В качестве положительного контроля использовались антитела против глицеральдегид-З'-фосфатдегидрогеназы (ГЗФД), а в качестве отрицательного клетки инкубировали только со вторыми антителами, мечеными флуоресцеином (контроль на конъюгат).

Кератин К2е обнаруживался в основном в перинуклеарном пространстве и в ядре, а кератин К1 в цитоплазме. ГЗФД была обнаружена в значительных количествах в цитоплазме, что соответствует ее основной функции как фермента гликолиза. Аналогичная картина наблюдалась и для клеток линий HeLa и HaCat (данные не представлены). При этом альбумин обнаружить не удалось (Рис. 10).

Кератин К1 Кератин К2е ГЗФД

Рис. 10. Флуоресцентно-микроскопическое исследование клеточной локализации кератинов и ГЗФД в кератиноцитах линии А431.

Клетки фиксировали метанолом, инкубировали с кроличьими антителами против пептидов из состава исследуемых белков и затем с флуоресцеин-мечеными антителами против кролика.

При обработке антителами клеток, предварительно инкубированных с родамин-меченым олигонуклеотидами (рис. 11) картина клеточной локализации белков изменялась: кератины К1 и К2е обнаруживались в основном в ядре, причем были колокализованы вместе с олигонуклеотидами, что говорит об участии этих белков в транспорте олигонуклеотидов. Более того, в ядрах клеток был обнаружен альбумин, колокализованный с олигонуклеотидами, что дает возможность предположить транспорт олигонуклеотидов в комплексе с альбумином с клеточной поверхности в ядро.

Таким образом, данные флуоресцентной микроскопии о колокализации в клетках альбумина и кератинов К1 и К2е с флуоресцентномечеными олигонуклеотидами свидетельствуют об участии этих белков в транспорте олигонуклеотидов в клетки.

Кроличьи антитела против альбумина Кроличьи антитела против кератина К1 Кроличьи антитела против кератина К2е

Rh-lys-pN l6-degU ■1 ■1

Коньюгат флуоресцеина с антитела против IgG кролика ■1

Окраска ядер раствором DAP1 Ц ■ ■1

Рис. 11. Колокализация родамин-меченых олигонуклеотидов с кератинами и альбумином в клетках линии А431.

Клетки линии А431 инкубировали с 1мкМ родамин-меченым производным олигонуклеотида Rh-Iys-p(N) 16-deg-U 1 час при 37°С в среде ДМЕМ. После инкубации клетки отмывали средой ДМЕМ, фиксировали 3.7% раствором формалина в PBS, пермеабилизовали 0.02% раствором Triton Х-100 в PBS и инкубировали 2 часа с антителами против альбумина, кератина К1 или кератина К2е в среде ДМЕМ. После чего клетки отмывали средой ДМЕМ и инкубировали 2 часа с антителами против IgG кролика, меченными флуоресцеином. После инкубации клетки отмывали средой ДМЕМ, фиксировали 3.7% раствором формалина в PBS, окрашивали ядра раствором DAPI и анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии.

Выводы

1. При помощи аффинной модификации реакционноспособным производным олигонуклеотида ClR-p(N),6 показано, что клетки различного тканевого происхождения (А431 (эпидермальная карцинома), HeLa (карцинома шейки матки), KB (карцинома эпителия ротовой полости человека), MCF-7 (карцинома груди), Нер-2 (человеческая карцинома гортани), ЛЭЧ (первичные клетки легочного эпителия человека), К562 (человеческая миелогенная лейкемия), Cos-7 (клетки почки зеленой мартышки), СПЭВ (клетки почки эмбриона свиньи), NIH/3T3 (фибробласты мыши)) экспрессируют одинаковый набор поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков. Показано, что предобработка клеток трипсином уменьшает проникновение олигонуклеотидов в клетки и предотвращает модификацию белков с молекулярной массой 68 кДа реакционноспособными производными олигонуклеотидов, а обработка аффинно модифицированных клеток трипсином приводит к частичному гидролизу белков с молекулярной массой 68 кДа. Эти данные свидетельствует о том, что белки с молекулярной массой 68 кДа экспонированы на поверхности клеток и участвуют в связывании олигонуклеотидов с клетками.

2. Показано, что, любые обработки клеток, нарушающие функциональную целостность клеточной мембраны, предотвращают аффинную модификацию белков и уменьшают проникновение олигонуклеотидов в клетки. Кроме того, аффинная модификация клеточных фракций олигонуклеотидным реагентом приводит к модификации значительного количества дополнительных олигонуклеотид-связывающих белков, по сравнению с олигонуклеотид-связывающими белками, выявляемыми аффинной модификацией живых клеток. Таким образом, наиболее приемлемым методом выявления и выделения поверхностных белков клеток, связывающих нуклеиновые кислоты, является аффинная модификация живых клеток реакционноспособными олигонуклеотидами.

3. Разработан метод выделения поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков при помощи аффинной модификации интактных клеток производным олигонуклеотида Flu-lys-p(N)16-deg-U, содержащим на одном конце реакционноспособную группу (окисленный rU), а на другом - гаптен (флуоресцеин), с последующим выделением комплексов олигонуклеотид-

белок аффинной хроматографией на Ультрагеле А2 с иммобилизованными антителами против флуоресцеина. Выделены олигонуклеотид-связывающие белки с молекулярной массой 68 кДа. Белки идентифицированны масс-спектроскопическим методом как альбумин, кератин К1, кератин К10 и кератин К2е.

4. Исследована клеточная локализация выделенных олигонуклеотид-связывающих белков и флуоресцентно меченых олигонуклеотидов. Показано, что локализация флуоресцентно меченых олигонуклеотидов в клетках линии А431 совпадает с локализацией альбумина и кератинов К1 и К2е что подтверждает участие этих белков в транспорте олигонуклеотидов.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Laktionov Р, Chelobanov В, Rykova Е, Vlassov V. Interaction of oligonucleotides with cellular proteins. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001, 20(4-7), 859862.

2. Челобанов Б.П., Лактионов П.П., Харькова M. В., Рыкова Е.Ю., Пышный Д.В, Пышная И.А., Сильников В.Н., Власов В.В. Исследование поверхностных олигонуклеотид-связывающих белков эукариотических клеток при помощи аффинной модификации реакционноспособными производными олигонуклеотидов. Известия Академии Наук. Серия Химическая. 2002,7,1113-1119.

3. Laktionov Р.Р., Chelobanov В.Р., Kharkova M.V., Rykova E.Yu., Pyshnyi D.V., Pyshnaya I.A., Marcus K., Meyer H.E., and Vlassov V.V. Cell surface oligonucleotide-binding proteins of human squamous carcinoma A431 cells. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2003,22(5-8), 1715-1719.

4. Б. П. Челобанов, П. П. Лактионов, М. В. Харькова, Е. Ю. Рыкова,

Д. В. Пышный, И. А. Пышная, К. Маркус, Г. Е. Мейер, В. В. Власов. Кератин у

К1 связывает нуклеиновые кислоты на поверхности клеток. Биохимия. 2003, 68(11), 1540-1549.

5. Boris P. Chelobanov, Pavel P. Laktionov, Maria V. Kharkova, Elena Y. Rykova, and Valentin V. Vlassov. Isolation of Nucleic Acid Binding Proteins: An Approach for Isolation of Cell Surface, Nucleic Acid Binding Proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 2004,1022,239-244.

Подписано к печати "21" марта 2005г. Формат бумаги 00x84 1/16. Объём 2,0 печ. л. Тираж 100 л«. Заказ № 1411. Отпечатано "Докумеит-Ссрвис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 356-600

РНБ Русский фонд

2005-4 45456

Г- JF i

•з m л m

22 ДПР 2005

1365

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Челобанов, Борис Павлович

ВВЕДЕНИЕ.

1. Литературный обзор.

1.1. Транспорт нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. ф 1.1.1. Механизмы транспорта нуклеиновых кислот в клетки.

1.1.2. Методы изучения транспорта нуклеиновых кислот в клетки.

1.1.3. Проблемы, связанные с использованием флуоресценции для изучения транспорта нуклеиновых кислот в клетки.

1.1.3.1. Тушение флуоресценции.

1.1.3.2. Использование реагентов, предотвращающих выгорание флуорохрома.

1.1.3.3. Флуоресценция флуорохрома в составе нуклеиновых кислот.

1.1.4. Транспорт флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов в клетки.

1.2. Участие белков в транспорте нуклеиновых кислот в клетки.

1.2.1. Выявление белков, участвующих в транспорте нуклеиновых кислот.

1.2.2. Идентификация белков, участвующих в транспорте нуклеиновых кислот.

1.2.2.1. Связывание нуклеиновых кислот с глицеральдегид-З'-фосфатдегидрогеназой

1.2.2.2. Связывание нуклеиновых кислот с альбумином.

1.2.2.3. Белки, ответственные за транспорт нуклеиновых кислот в сперматозоиды.

1.2.2.4. Связывание й-богатых олигонуклеотидов с нуклеолином.

1.2.2.5. Эзрин и моезин - компоненты транспортной системы.

1.2.2.6. ЫАСЬ - мембранный канал, транспортирующий короткие одноцепочечные нуклеиновые кислоты.

1.2.2.7. Каналы для транспорта нуклеиновых кислот могут формироваться из факторов транскрипции.

1.2.3.8. МЫАВ - мембранный белок, связывающий нуклеиновые кислоты.

1.2.2.9. Гепарин-связывающий интегрин Мас-1.

1.2.2.10. Белки, участвующие в реализации иммуностимулирующего действия Срй ДНК.

1.2.2.11. Участие скавенджер-рецептора в связывании и транспорте нуклеиновых кислот.

1.2.2.12. Заключение.

2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Получение и очистка 32Р — меченых олигонуклеотидов.

2.3. Синтез модифицированных олигонуклеотидов.

2.4. Клетки и условия их культивирования.

2.5. Приготовление слайдов и микроскопия.

2.6. Аффинная модификация белков, связывающих нуклеиновые кислоты.

2.7. Исследование специфичности аффинной модификации белков.

2.8. Исследование локализации белков, связывающих нуклеиновые кислоты.

2.9. Влияние целостности клеточной мембраны на модификацию белков, связывающих нуклеиновые кислоты, и внутриклеточный транспорт олигонуклеотидов.

2.10. Определение констант диссоциации комплексов олигонуклеотид-белок и определение количества олигонуклеотид-связывающих белков на клетках.

2.11. Получение и характеризация антител против флуоресцеина.

2.12. Иммуноферментное окрашивание.

2.13. Аффинная хроматография олигонуклеотид-связывающих белков, модифицированных Р1и-1уз-р(М)1б-с^-ио на ультрагеле А2 с иммобилизованными антителами против флуоресцеина.

2.14. Синтез пептидов и изготовление конъюгатов этих пептидов с бычьим сывороточным альбумином.

2.15. Приготовление человеческого сывороточного альбумина для иммунизации кроликов.

2.16. Синтез сорбентов для выделения специфических антител против пептидов и человеческого сывороточного альбумина.

2.17. Получение и характеризация антител против К1, К2е и альбумина.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Аффинная модификация реакционноспособными производными олигонуклеотидов поверхностных белков клеток различного тканевого происхождения.

3.2. Влияние условий инкубации аффинных реагентов с клетками на аффинную модификацию олигонуклеотид-связывающих белков.

3.3. Влияние ингибиторов активного транспорта на модификацию белков.

3.4. Исследование локализации модифицированных белков.

3.5. Влияние состояния клеточной мембраны на аффинную модификацию олигонуклеотид-связывающих белков и транспорт олигонуклеотидов в клетки.

3.6. Оценка количества олигонуклеотид-связывающих белков на поверхности клетки.

3.7. Реакционноспособные олигонуклеотидные реагенты.

3.8. Исследование транспорта флуоресцентно-меченых производных олигонуклеотидов в клетки различных линий.

3.9. Исследование эффективности модификации поверхностных белков клеток линии А431 различными производными олигонуклеотидов.

3.10. Исследование модификации клеток линии А431 реакционноспособными производными флуоресцентно-меченого олигонуклеотида.

3.11. Получение антител против флуоресцеина и их взаимодействие с флуоресцеин-содержащими олигонуклеотидами.

3.12. Оптимизация условий выделения модифицированных белков, связывающих нуклеиновые кислоты, на сорбенте с антителами против флуоресцеина.

3.13. Выделение белков, связывающих нуклеиновые кислоты.

3.14. Идентификация олигонуклеотид-связывающих белков.

3.15. Изготовление конъюгатов и сорбентов на основе пептидов.

3.16. Получение и тестирование антител против альбумина и пептидов р19ир13.

3.17. Исследование клеточной локализации выделенных белков.

3.18. Компьютерный анализ структуры альбумина.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поверхностные белки кератиноцитов, участвующие в транспорте нуклеиновых кислот"

Регуляция экспрессии генов за счет воздействия на нуклеиновые кислоты клетки интенсивно исследуется в последнее время [1, 2]. В частности, для регуляции экспрессии генов было предложено использовать антисмысловые олигонуклеотиды и их химические аналоги [3, 4, 5]. В экспериментах на культурах тканей было показано, что антисмысловые олигонуклеотиды ингибируют экспрессию генов за счет комплементарных взаимодействий [6, 7, 8, 9, 10], препятствуя процессу транскрипции [11] или трансляции [12]. Комплементарные олигонуклеотиды были успешно использованы для коррекции точечных мутаций [13] и ошибок сплайсинга [14]. В последнее время для ингибирования экспрессии генов используется явление РНК интерференции - избирательного подавления экспрессии генов под действием двуцепочечных РНК [15], строго гомологичных мРНК мишени [16]. РНК интерференция стала мощным механизмом исследования роли определенных генов не только у простейших организмов, но и у млекопитающих [17]. Молекулы ДНК также могут вносить вклад в регуляцию экспрессии генов, поскольку могут выступать в качестве кодирующих последовательностей для синтеза белков. Продемонстрирована способность генноинженерных конструкций экспрессировать в клетках организма чужеродные белки, что позволяет корректировать генетические дефекты [18] и создавать генноинженерные вакцины для защиты организма от инфекционных заболеваний [19]. В ряде работ отмечены такие эффекты нуклеиновых кислот, как активация иммунной системы под действием рибонуклеиновых кислот, Срй богатых ДНК [20, 21] и олигонуклеотидов [22, 23], а также влияние фосфоротиоатных олигонуклеотидов на гемопоэз, сердечный ритм и артериальное давление [24].

Очевидно, что для специфического взаимодействия с нуклеиновой кислотой — мишенью - антисмысловые олигонуклеотиды или интерферирующая РНК должны попасть в клеточные компартменты, в то время как другие эффекты могут быть вызваны специфическим связыванием нуклеиновых кислот - аптамеров - с рецепторами клеточной поверхности. Поскольку кератиноциты способны поглощать олигонуклеотиды в значительных количествах и накапливать их в ядре [25], эти клетки представляют собой прекрасную модель для изучения природных механизмов транспорта нуклеиновых кислот и белков, отвечающих за их рецепцию и транспорт.

Целью настоящей работы было исследование поверхностных белков клеток различного тканевого происхождения и в том числе кератиноцитов, участвующих в узнавании и транспорте нуклеиновых кислот в клетки.

В процессе выполнения поставленной цели необходими было решить следующие задачи:

- Выделить и идентифицировать данные белки.

1. Литературный обзор

В настоящее время достоверно выявлен один из белков, участвующий в передаче ингибирующего действия дцРНК от клетки к клетке. При изучении линии нематод, в которой иРНК не передавались от клетки к клетке, был выявлен локус, отвечающий за экспрессию белка 8ГО-1, необходимого для системного действия иРНК [27]. Было показано, что 8ГО-1 представляет собой трансмембранный белок, осуществляющий транспорт иРНК в клетки не только СаепогЪаЪ(Ий$ еЫцат, но и БгозорИПа [28]. Однако последние данные свидетельствуют о том, что для системного действия иРНК необходим еще ряд белков [29], а сам механизм транспорта иРНК остается до сих пор до конца не выясненным. Роль 8ГО-1 в транспорте ДНК и олигонуклеотидов также не исследована. Что касается транспорта нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих, то, несмотря на огромное число работ, единого мнения относительно механизмов транспорта и белков-переносчиков нуклеиновых кислот в настоящее время не выработано. Некоторые авторы утверждают, что транспорт нуклеиновых кислот рецептор опосредован и энергетически зависим, другие, напротив, демонстрируют данные о энергонезависимости транспорта нуклеиновых кислот. То же самое относится и к белкам, поскольку разными исследовательскими группами идентифицированы различные белки. Таким образом, вопрос о механизмах транспорта нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих и белках, принимающих участие в этом процессе, до сих пор остается открытым.

Различные механизмы транспорта олигонуклеотидов в клетку не отрицают необходимость связывания олигонуклеотидов с клеточной поверхностью. Основными кандидатами на роль связывающего агента в составе клеточной мембраны принадлежит олигонуклеотид-связывающим белкам. Всвязи с этим, исследование, выделение и идентификация белков, взаимодействующих с ДНК, олигонуклеотидами и их аналогами, изучение механизмов этих взаимодействий обеспечит базу для конструирования эффективно доставляемых в клетки олигонуклеотидов и создания на их основе нового поколения терапевтических препаратов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Челобанов, Борис Павлович

1.2.2.12. Заключение

Следует отметить, что история со скавенджер-рецептором - это далеко не единственный случай, когда сделанное открытие впоследствии не подтверждается другими работами. В области исследования белков, осуществляющих рецепцию и транспорт нуклеиновых кислот в клетки, это становится правилом. Так, например, Diesbach и соавторы выделили клеточный белок с мол. массой 66 кДа из гепатоцитов линии HepG2 (карцинома печени человека) при помощи фотоаффинной модификации биотинилированным конъюгатом олигонуклеотида с бензофеноном. Было показано, что связывание олигонуклеотидного реагента с выделенным белком является насыщаемым и конкурентно ингибируется немеченой ДНК. Практически весь модифицированный белок с мол. массой 66 кДа находился в мембранной фракции. Около половины связанного с олигонуклеотидом белка подвергалось поверхностному протеолизу, что предполагает локализацию этого белка как на клеточной поверхности, так и в везикулярных цитоплазматических структурах. Сиквенирование выделенного пептида методом деградации по Эдману не выявило гомологии с известными белками человека [191]. Впоследствии авторами было показано, что олигонуклеотиды проникают в клетки HepG2 двумя различными путями и накапливаются в эндосомоподобных структурах двух типов, сильно отличающихся от обычных эндосом или лизосом [192], что противоречило данным других авторов. Впоследствии все эти данные получили простое объяснение -выяснилось, что линия клеток HepG2, с которой работали авторы, была заражена Mycoplasma hyorhinis, которая, как было показано, изменяла картину проникновения олигонуклеотидов в клетки. Более того, белок 66 кДа, ранее выделенный из клеток HepG2 как мембранный рецептор для нуклеиновых кислот, оказался инвариантным мембранным белком из Mycoplasma hyorhinis [193].

Таким образом, использование исследователями олигонуклеотидов различных последовательностей, различных реакционноспособных групп и способов их присоединения к олигонуклеотидам, отличающихся друг от друга условий модификации и клеточных моделей, а также различные экспериментальные ошибки привели к описанию большого количества белков, связывающих нуклеиновые кислоты. Некоторые из этих белков были идентифицированы, однако до сих пор не ясно, являются ли белки, связывающие нуклеиновые кислоты, универсальными, или различные типы клеток экспрессируют различные специфические белки. Неизвестно, какие именно из обнаруженных белков, связывающих нуклеиновые кислоты, осуществляют транспорт олигонуклеотидов в клетки.

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

В работе были использованы следующие материалы: акриламид, N,N-метиленбисакриламид, аммоний над сернокислый, глицин, трис-гидроксиметил аминометан, диметилсульфоксид, додецилсульфат натрия, перхлорат лития, дипиридилдисульфид, трифенилфосфин, среда ДМЕМ, трипсин, глицерин, формалин, 4-хлоро-1-нафтол, диаминобензидин (ДАБ), полный и неполный адъювант Фрейнда, бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, США); NP-40, ЭДТА, тритон Х-100 (LKB,

Швеция); Ultrogel А2, Sepharose CL-4B, Sephadex G-25 (Pharmacia, Швеция); фенилметилсульфонилфторид (PMSF), боргидрид натрия (Serva, Германия); нитроцеллюлозные фильтры с размером пор 0,2 мкм и 0.45 мкм (Schleicher & SchuII, Германия); ДЕ-52-целлюлоза (Whatman, Англия); ТЕМЕД, человеческий сывороточный альбумин (Reanal, Венгрия); Ы-ацетил-Ы,-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид (EdaC) (Aldrich); центриконы-50 (Amicon, США), рентгеновская пленка Kodak Х-ОМАТ (Kodak, США); рентгеновская пленка AGFA CP-BU (AGFA, Бельгия); у-[32Р] ATP с удельной активностью 5'103 Ки/мМоль, лактоферрин из человеческого молока, IgG мыши, лизоцим, козьи антитела против IgG кролика (GAR) (БИОСАН, Россия); флуоресцеинизитиоционат, родаминизитиоционат, периодат натрия, PBS, эмбриональная телячья сыворотка (ISN, США); 1,4-диазабицикло-[2.2.2]октан (DABCO), DACO® Fluorescent mounting medium (DACO Corporation, США); Hoechst 33258 (Sigma, США), N-метилимидазол (Fluka, Швейцария); пероксидаза хрена, мочевина, аммоний сернокислый (НПО Биохимреактив, Россия). Неуказанные реактивы являются препаратами отечественного производства с квалификацией осч или хч.

2.2. Получение и очистка 32Р - меченых олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды р(Т),6, 5'-pCAGTAAATATCTAGGA (p(N)16) и 5'-pTACAGTAAATATCTAGGAATG (p(N)2i) были синтезированы на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-700 (Биоссет, Новосибирск, Россия) по стандартному фосфитамидному протоколу. В синтезе олигонуклеотидов p(N)2i-deg-rU и p(N)i6-deg-rU использовали [[[4,4'-диметокситритил]-окси]-диэтиленокси]-(Р-цианэтил)-(М,Ы-диизопропиламино)-фосфит, полученный согласно методу [194]. В качестве носителя для синтеза p(N)2i-deg-rU и p(N)i6-deg-U был использован 2'-OMe-U-RNA-CPG («Glen Research», США). Олигонуклеотиды (N)i6-NH и p(N)i6-NH были синтезированы с использованием в качестве носителя З'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research», США).

Радиоактивную метку [32Р] вводили в олигонуклеотиды переносом концевого фосфата с [у-32Р] АТФ в 5'-положение олигонуклеотида при помощи полинуклеотидкиназы фага Т4 [195]. Удельная радиоактивность полученных олигонуклеотидов составляла 30-50 Ки/ммоль. После мечения олигонуклеотид очищали от продуктов реакции электрофорезом в 20% ПААГ (1/20 бис-акриламид), содержащим 7 М мочевину, в буфере ТБЕ (0,05 М Трис рН 8,4, 0,05 М Н3ВО3, 1 мМ ЭДТА). Электроэлюцию олигонуклеотида из геля на ДЕАЕ-целлюлозу проводили в буфере 1/20 ТБЕ в течение 1 часа, при напряженности электрического поля 20 V/см. Олигонуклеотид элюировали с ДЕАЕ-целлюлозы 3 М перхлоратом лития в НгО, осаждали 10-ю объемами 2% перхлората лития в ацетоне (5 мин; 10000 g), промывали осадок ацетоном, высушивали, растворяли в НгО и определяли концентрацию олигонуклеотида спектрофотометрически. Молярные коэффициенты поглощения были вычислены по методу [196], исходя из литературных данных е260 для моно- и динуклеотидов [197].

2.3. Синтез модифицированных олигонуклеотидов

Реакционные и гаптенные группы, которые вводили в состав олигонуклеотидов, представлены в таблице 3. Все синтезированные производные олигонуклеотидов представлены в таблице 4.

Алкилирующую группировку, 4-[(Ы-2-хлорэтил-Ы-метил)-амино]бензиламин (таблица 3), присоединяли к 5'-концевой фосфатной группе олигонуклеотида согласно [198]. Олигонуклеотид переводили из литиевой соли в цетавлоновую. Для этого к литиевой соли Р-меченого олигонуклеотида в НгО добавляли аликвотами 8% раствор цетавлона до прекращения выпадения осадка. Образующийся осадок цетавлоновой соли олигонуклеотида отделяли центрифугированием в течение 30 секунд при 10000 g. Количество осажденного олигонуклеотида составляло не менее 90%. Осадок цетавлоновой соли олигонуклеотида растворяли в 50 мкл метанола и упаривали под вакуумом. После высушивания цетавлоновую соль олигонуклеотида растворяли в 50 мкл ДМСО и добавляли, в порядке перечисления, следующие реагенты: 6,6 мг 2,2-дипиридилдисульфида, предварительно растворенного в 25 мкл ДМСО; 7,8 мг трифенилфосфина в 25 мкл ДМСО; 4,8 мкл N-метилимидазола. Реакционную смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре, после чего добавляли 4 мкл триэтиламина и 4 мг сухого 4-[(К-2-хлорэтил-Ы-метил)-амино]бензиламина. После дополнительной инкубации в течение 15 мин модифицированный олигонуклеотид

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Челобанов, Борис Павлович, Новосибирск

1. Knorre D.G., Vlassov V. V., andZarytova V.F. in Oligodeoxynucleotides: Antisense inhibitors of gene expression (Cohen, J.S., ed.). // CRC Press. 1989. P. 173-196.

2. Bennett C.F. Antisense oligonucleotides: Is the glass half full or half empty? // Biochem. Pharmacol. 1998. V. 55. P. 9-19.

3. Dias N. Stein C.A. Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms. // Mol Cancer Ther. 2002. V. 1. N. 5. P. 347-55.

4. KurreckJ. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. // Eur J Biochem. 2003. V. 270. N. 8. P. 1628-1644.

5. Dagle J.M., Weeks D.L. Oligonucleotide-based strategies to reduce gene expression. // Differentiation. 2001. V. 69. N. 2-3 P. 75-82.

6. Stein C.A, Cohen J.S. Oligodeoxynucleotides as inhibitors of gene expression: a review. // Cancer Res. 1988. V. 48. N. 10. P. 2659-2668.

7. Zamechnik P.C., Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligonucleotide. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1978. V. 75. N. l.P. 280-284.

8. Akhtar S., Juliano R.L. Cellular uptake and intracellular fate of antisense oligonucleotides. // Cell. Biol. 1992. V. 2. P. 139-144.

9. Watson P.H., Pon R.T., and Shin R.P.S. Inhibition of c-myc expression by phosphorothioate antisense oligonucleotide identifies a critical role for c-myc in the growth of human breast canser. //Cancer Res. 1991. V. 51. P. 3996-4000.

10. Blake K.R., Murakami A., Miller P.S. Inhibition of rabbit globine mRNA translation by sequence-specific oligodeoxyribonucleotides.//Biochem. 1985. V. 24. N. 22. P. 6132-6138.

11. Yoon K., Cole-Strauss A., Kmiec E.B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNA-DNA oligonucleotide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 2071-2076.

12. Schmajuk G., Sierakowska H., Kole R. Antisense oligonucleotides with different backbones. Modification of splicing pathways and efficacy of uptake. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 21783-21789.

13. Fire A., Xu S„ Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. //Nature. 1998. V. 391. N. 6669. P. 806-811.

14. Hamilton A. J., Baulcombe D.C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. // Science. 1999. V. 286. N. 5441. P. 950-952.

15. Sharp P.A. RNAi and double-strand RNA. // Genes Dev. 1999. V. 13. N. 2. P. 139-141.

16. Halpern M.D., Kurlander R.J., Pisetsky D.S. Bacterial DNA induces murine ifn-gamma production by stimulation of IL-12 and TNF-alpha. // Cell. Immunol. 1996. V. 167. P. 72-78.

17. Cowdery J.C., Chace J.H., YiA.-K., KriegA.M. Bacterial DNA induces NK cells to produce IFN-gamma in vivo and increases the toxicity of lipopolysaccharides. // J. Immunol. 1996. V. 156. P. 4570-4575.

18. Sarmiento U.M., Perez J.R., Becker J.M. and Narayanan R. In vivo toxicological effects of rel A antisense phosphorothioates in CD-I mice. // Antisense Res. Dev. 1994. V. 4. P. 99-107.

19. Noonberg S.B., Garovoy M.R., Hunt C.A. Characteristics of oligonucleotide uptake in human keratinocyte cultures. // J. Invest. Dermatol. 1993. V. 101. P. 727-731.

20. Lichtenstein A.V., Melkonyan H.S., Tomei L.D., Umansky S.R. Circulating nucleic acids and apoptosis. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001. V. 945. P. 239-249.

21. Winston W.M., Molodowitch C., Hunter C.P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. // Science. 2002. V. 295. N. 5564. P. 2456-9245.

22. Feinberg E.H., Hunter C.P. Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1. // Science. 2003. V. 301. N. 5639. P. 1545-1547.

23. Tijsterman M., May R.C., Simmer F., Okihara K.L., Plasterk R.H. Genes required for systemic RNA interference in Caenorhabditis elegans. // Curr. Biol. 2004. V. 14. N. 2. P. 111116.

24. Д M. Фаллер, Д. Шилдс. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. М.: БИНОМ-Пресс, 2003, С. 272.

25. Wang L.X., Yang D.C., Lu Y.Y., Takagi Y., Taira K„ Li T„ Zhang L.H. The synthesis and biological activities of oligodeoxynucleotides that are covalently linked to psoralen at their 5' ends.//Drug Des. Discov. 1995. V. 13. N. 2. P. 109-121.

26. Saison-Behmoaras T.E., Duroux I., Nguyen T.T., Asseline U., Helene C. Antisense properties of end-modified oligonucleotides targeted to Ha-ras oncogene. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. N. 4. P. 361-368.

27. Laktionov P.P., Dazard J.E., Fives E., Rykova E.Y., Piette J., Vlassov V.V., Lebleu B. Characterisation of membrane oligonucleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes. //Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. N. 11. P. 2315-2324.

28. Rappaport J., Hanss B., KoppJ.B., Copeland T.D., Bruggeman L.A., Coffman T.M., Klotman P.E. Transport of phosphorothioate oligonucleotides in kidney: implications for molecular therapy. //Kidney Int. 1995. V. 47. N. 5. P. 1462-1469.

29. Lamaze C., Schmid S.L. The emergence of clathrin-independent pinocytic pathways. // Curr. Opin. Cell Biol. 1995. V. 7. N. 4. P. 573-580.

30. Keller G.A., Siegel M.W., Caras I.W. Endocytosis of glycophospholipid-anchored and transmembrane forms of CD4 by different endocytic pathways. // EMBO J. 1992. V. 11. N. 3. P. 863-874.

31. Parton R.G., Joggerst B., Simons K. Regulated internalization of caveolae. // J. Cell Biol. 1994. V. 127. N. 5. P. 1199-1215.

32. Ceruzzi M., Draper K. The intracellular and extracellular fate of oligodeoxyribonucleotides in tissue cultural systems. // Nucleosides and Nucleotides. 1989. V. 8. P. 815-819.

33. Kreig A.M., Gmelig- Meyling F., Gourley M.F., Kisch W.J., Chrisey L.A., Steinberg A.D. Uptake of oligodeoxyribonucleotides by lymphoid cells is heterogenous and inducible. // Antisense Res. Dev. 1991. V. l.P. 161-167.

34. Hawley P., Gibson I. Interaction of oligodeoxynucleotides with mammalian ctlls. // Antisense & Nucleic acid drug development. 1996. V. 6. P. 185-195.

35. Jaroszewski J.W., Cohen J.S. Cellular uptake of antisense oligodeoxynucleotides. // Advanced Drug Del. Reviews. 1991. V. 6. P. 235-239.

36. Guy-Caffey J.K., Bodepudi V., Bishop J.S. Novel polyaminolipids enhance the cellular uptake of oligonucleotides. // J. Biol. Chem. 1995. V. 5. P. 31391-31396.

37. Iversen P.L., Zhu S., Meyer A. Cellular uptake and subcellular distribution of phosphorothioate oligonucleotides into cultured cells. // Antisense Res. Dev. 1992. V. 3. P. 211222.

38. Lui X-X., Li B-L., Li S.W. Measurement of a receptor for (2'-5')- oligoadenilate (trimer) on macrophages. // Methods in Enzymology. 1986. V. 119. P. 351-356.

39. Bennett R.M. As nature intended? The uptake of DNA and oligonucleotides by eukaryotic cells. //Antisense Res. Dev. 1993. V. 3. P. 235-241.

40. Wu-Pong S., Weiss T.L., Hunt C.A. Antisense c-myc oligonucleotide cellular uptake and activity. //Antisense Res. Dev. 1994. V. 4. P. 155-163.

41. Pasquali C., Fialka /., Huber L.A. Subcellular fractionation, electromigration analysis and mapping of organelles. // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 1999. V. 722. P. 89-102.

42. Pasquali C., Fialka I., Huber L.A. Preparative two-dimensional gel electrophoresis of membrane proteins. // Electrophoresis. 1997. V. 18. P. 2573-2581.

43. Li E.L., Perdue J.F. An airfuge centrifugation procedure for the measurement of ligand binding to membrane-associated and detergent-solubilized plasma membrane receptors. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1980. V. 3. P. 207-217.

44. Fialka I., Pasquali C., Lottspeich F., Ahorn H, Huber L.A. Subcellular fractionation of polarized epithelial cells and identification of organelle-specific proteins by two-dimensional gel electrophoresis. // Electrophoresis. 1997. V. 18. N. 2582-2590.

45. Gruenberg J., Howell K.E. Fusion in the endocytic pathway reconstituted in a cell-free system using immuno-isolated fractions. // Prog. Clin. Biol. Res. 1988. V. 270. P. 317-331.

46. Howell K.E., Devaney E., Gruenberg J. Subcellular fractionation of tissue culture cells. // Trends Biochem. Sci. 1989. V. 14. P. 44^7.

47. Fleischer B., Zambrano F., Fleischer S. Biochemical characterization of the Golgi complex of mammalian cells. // J. Supramol. Struct. 1974. V. 2. P. 737-750.

48. Wandinger-Ness A., Bennett M.K., Antony C., Simons K. Distinct transport vesicles mediate the delivery of plasma membrane proteins to the apical and basolateral domains of MDCK cells. // J. Cell Biol. 1990. V. 111. P. 987-1000.

49. Pertoft H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2000. V. 44. N. 1-2. P. 1-30.

50. Fleischer S., Kervina M. Subcellular fractionation of rat liver. // Methods Enzymol. 1974. V. 31. P. 6-41.

51. Gruenberg J., Howell K.E. Fusion in the endocytic pathway reconstituted in a cell-free system using immuno-isolated fractions. // Prog. Clin. Biol. Res. 1988. V. 270. P. 317-331.

52. Lappalainen K., Miettinen R., Kellokoski J., Jaaskelainen I., Syrjanen S. Intracellular distribution of oligonucleotides delivered by cationic liposomes: light and electron microscopic study. J. Histochem. Cytochem. 1997. V. 45. N. 2. P. 265-274.

53. Cavatorta P., Favilla R., Mazzini A. Fluorescence quenching of tryptophan and related compounds by hydrogen peroxide. // Biochim Biophys Acta. 1979. V. 578. N. 2. P. 541-546.

54. Bieri KG., Wallach D.F. Fluorescence quenching in lecithin and lecithin/cholesterol liposomes by parmagenetic lipid analogues. Introduction of a new probe approach. // Biochim Biophys Acta. 1975. V. 389. N. 3. P. 413-427.

55. Winkler M.H. A fluorescence quenching technique for the investigation of configuration of binding sites for small molecules. // Biochemistry. 1969. V. 8. N. 6. P. 2586-2590.

56. Lehrer S.S. Solute perturbation of protein fluorescence. The quenching of the tryptophyl fluorescence of model compounds and of lysozyme by iodide ion. // Biochemistry. 1971. V. 10. N. 17. P. 3254-3263.

57. Eftink M.R., Zajicek J.L., Ghiron C.A. A hydrophobic quencher of protein fluorescence: 2,2,2-trichloroethanol. // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 491. N. 2. P. 473-481.

58. Lakowicz J.R., Anderson C.J. Permeability of lipid bilayers to methylmercuric chloride: quantification by fluorescence quenching of a carbazole-labeled phospholipid. // Chem. Biol. Interact. 1980. V. 30. N. 3. P. 309-323.

59. Sterner R.F., Kirby E.P. The interaction of the ground and excited states of indole derivatives with electron scavengers. // J. Phys. Chem. 1969. V. 73. N. 12. P. 4130-4135.

60. Eftink M.R., Ghiron C.A. Fluorescence quenching studies with proteins. Anal. Biochem. 1981. V. 114. N. 2. P. 199-227.

61. Shinitzky M., Rivnay B. Degree of exposure of membrane proteins determined by fluorescence quenching. // Biochemistry. 1977. V. 16. N. 5. P. 982-986.

62. Lakowicz J.R., Weber G. Quenching of fluorescence by oxygen. A probe for structural fluctuations in macromolecules. // Biochemistry. 1973. V. 12. N. 21. P. 4161-4170.

63. Markham J., Conchello J.A. Artefacts in restored images due to intensity loss in three-dimensional fluorescence microscopy. // J. Microsc. 2001. V. 204(Pt 2). P. 93-98.

64. Johnson G.D., Davidson R.S., McNamee K.C., Russell G., Goodwin D., Holborow E.J. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. // J. Immunol. Methods. 1982. V. 55. P. 231-242.

65. Hirschfeld T. Fluorescence background discrimination by prebleaching. // J. Histochem. Cytochem. 1979. V. 27. N. 1. P. 96-101.

66. Fukuda M„ Tsuchihashi Y., Takamatsu T., Nakanishi K., Fujita S. Fluorescence fading and stabilization in cytofluorometry. // Histochemistry. 1980. V. 65. N. 3. P. 269-276.

67. Abuknesha R.A., al-Mazeedi H.M., Price R.G. Reduction of the rate of fluorescence decay of FITC- and carboxyfluorescein-stained cells by anti-FITC antibodies. // Histochem. J. 1992. V. 24. N. 2. P. 73-77.

68. Piatt J.L., Michael A.F. Retardation of fading and enhancement of intensity of immunofluorescence by p-phenylenediamine. // J. Histochem. Cytochem. 1983. V. 31. N. 6. P.840.842.

69. Giloh K, Sedat J. W. Fluorescence microscopy: reduced photobleaching of rhodamine and fluorescein protein conjugates by n-propyl gallate. // Science. 1982. V. 217. N. 4566. P. 12521255.

70. Bock G„ Hilchenbach M„ Schauenstein K, Wick G. Photometric analysis of antifading reagents for immunofluorescence with laser and conventional illumination sources. // J. Histochem. Cytochem. 1985. V. 33. N. 7. P. 699-705.

71. Values K., Brandtzaeg P. Retardation of immunofluorescence fading during microscopy. // J. Histochem. Cytochem. 1985. V. 33. N. 8. P. 755-761.

72. Krenik K.D., Kephart G.M., Offord K.P., Dunnette S.L., Gleich G.J. Comparison of antifading agents used in immunofluorescence. // J. Immunol. Methods. 1989. V. 117. N. l.P. 91-97.

73. Longin A., Souchier C., Ffrench M„ Bryon P.A. Comparison of anti-fading agents used in fluorescence microscopy: image analysis and laser confocal microscopy study. // J. Histochem. Cytochem. 1993. V. 41. P. 1833-1840.

74. Florijn R.J., Slats J., Tanke H.J., Raap A.K. Analysis of antifading reagents for fluorescence microscopy. // Cytometry. 1995. V. 19. N. 2. P. 177-182.

75. Ono M., Murakami 71, Kudo A., Isshiki M., Sawada H., Segawa A. Quantitative comparison of anti-fading mounting media for confocal laser scanning microscopy. // J. Histochem. Cytochem. 2001. V. 49. N. 3. P. 305-312.

76. Takizawa 71, Robinson J.M. Analysis of antiphotobleaching reagents for use with FluoroNanogold in correlative microscopy. II J. Histochem. Cytochem. 2000. V. 48. N. 3. P. 433-436.

77. Grimwood R.E., Proffer L.H. Long-term preservation of direct immunofluorescence staining in slides stored at room temperature. // J. Cutan. Pathol. 2000. V. 27. N. 5. P. 224-227.

78. Dikicioglu E., Meteoglu I., Okyay P., Culhaci N., Kacar F. The reliability of long-term storage of direct immunofluorescent staining slides at room temperature. // J. Cutan. Pathol. 2003. V. 30. N. 7. P. 430-436.

79. Horn.T., Chang,C.A. and Urdea.M.S. Chemical synthesis and characterization of branched oligodeoxyribonucleotides (bDNA) for use as signal amplifiers in nucleic acid quantification assays. //Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4842^849.

80. Kurata S., Kanagawa 71, Yamada K., Torimura M., Yokomaku 71, Kamagata Y, Kurane R. Fluorescent quenching-based quantitative detection of specific DNA/RNA using a BODIPY® FL-labeled probe or primer. // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. N. 6. P. E34.

81. Nazarenko I., Pires R., Lowe B., Obaidy M., Rashtchian A. Effect of primary and secondary struciErc of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. N. 9. P. 2089-2195.

82. Sjoback R., Nygren J., Kubista M. Characterization of fluorescein-oligonucleotide conjugates and measurement of local electrostatic potential. // Biopolymers. 1998. V. 46. N. 7. P. 445-453.

83. Walker G.T., Linn C.P., Nadeau J.G. DNA detection by strand displacement amplification and fluorescence polarization with signal enhancement using a DNA binding protein. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. N. 2. P. 348-353.

84. Randolph J.B., Waggoner A.S. Stability, specificity and fluorescence brightness of multiply-labeled fluorescent DNA probes. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. N. 14. P. 2923-2929.

85. Larramendy M.L., El-Rifai W., Knuutila S. Comparison of fluorescein isothiocyanate- and Texas red-conjugated nucleotides for direct labeling in comparative genomic hybridization. // Cytometry. 1998. V. 31. N. 3. P. 174-179.

86. Giachetty C, Chin D. J. Increased oligonucleotide permeability in keratinocytes of artificial skin correlates with differentiation and altered membrane function. // J. Invest. Dermatol. 1996. V. 106. P. 412-418.

87. White P.J., Fogarty R.D., Liepe I.J., Delaney P.M., Werther G.A., Wraight C.J. Live confocal microscopy of oligonucleotide uptake by keratinocytes in human skin grafts on nude mice. // J. Invest. Dermatol. 1999. V. 112. N. 6. P. 887-892.

88. Brand R.M., Haase K., Hannah T.L., her sen P.L. An experimental model for interpreting percutaneous penetration of oligonucleotides that incorporates the role of keratinocytes. // J. Invest. Dermatol. 1998. V. 111. N. 6. P. 1166-1171.

89. Maszewska M., Kobylanska A., Gendaszewska-Darmach E., Koziolkiewicz M. Bromodeoxyuridine-labeled oligonucleotides as tools for oligonucleotide uptake studies. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. N. 6. P. 379-391.

90. Helin V., Gottikh M., Mishal Z., Subra F., Malvy C., Lavignon M. Cell cycle-dependent distribution and specific inhibitory effect of vectorized antisense oligonucleotides in cell culture. // Biochem. Pharmacol. 1999. V. 58. N. 1. P. 95-107.

91. Pichon C., Monsigny M., Roche A.C. Intracellular localization of oligonucleotides: influence of fixative protocols. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1999. V. 9. N. 1. P. 89-93.

92. Gabor G., Bennett R.M. Biotin-labelled DNA: a novel approach for the recognition of a DNA binding site on cell membranes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. V. 122. N. 3. P. 1034-1039.

93. Bennett R.M., Gabor G.T., Merritt M.M. DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of DNA. // J. Clin. Invest. 1985. V. 76. N. 6. P. 2182-2190.

94. Bennett R.M., Hefeneider S.H., Bakke A., Merritt M., Smith C.A., Mourich D., Heinrich M.C. The production and characterisation of murine monoclonal antibodies to a DNA receptor on human leucocytes. //J. Immunol. 1988. V. 140. P. 2937-2942.

95. Yakubov L.A., Deeva E.A., Zarytova V.F, Ivanova E.M., Ryte A.S., Yurchenko L.V., Vlassov V. V. Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: involvement of specific receptors? // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989. V. 86. P. 6454-6459.

96. Власов B.B., Иванова E.M., Нечаева M.B., Рыкова Е.Ю., Якубов JI.A., Зон Г. Аффинная модификация белков, связывающих нуклеиновые кислоты в клетках млекопитающих, алкилирующими производными олигонуклеотидов. // Биохимия. 1993. Т. 58. N. 6. С. 962966.

97. Власов В.В., Нечаева М.В., Байбородин С.И., Шестова O.E., Сафронов И.В., Кошкин A.A., Якубов JI.A. Поглощенные клеткой олигонуклеотиды быстро накапливаются в ядре. // Докл. РАН. 1995. Т. 345. N. 1. С. 123-126.

98. Якубов JI.A., Шестова O.E., Андреева А.Ю., Власов В.В. Участие специфических белков клеточной поверхности в транспорте нуклеиновых кислот в клетки. // Докл. РАН. 1998. Т. 361. N. 4. С. 550-553

99. Шестова O.E., Андреева А.Ю., Власов В.В., Якубов JI.A. Транспорт комплексов олигонуклеотидов с белками клеточной поверхности в клеточное ядро. // Докл. РАН. 1999. Т. 368. N. 2. С. 264-267.

100. Chan Т.М., Frampton G., Cameron J.S. Identification of DNA-binding proteins on human umbilical vein endothelial cell plasma membrane. // Clin. Exp. Immunol. 1993. V. 91. N. 1. P. 110-114.

101. Chan T.M., Cheng I.K. Identification of endothelial cell membrane proteins that bind anti-DNA antibodies from patients with systemic lupus erythematosus by direct or indirect mechanisms. // J. Autoimmun. 1997. V. 10. N. 5. P. 433-439.

102. Loke S.L., Stein C.A., ZhangX., Mori K., Nakanishi M., Subasinghe C.,'Cohen J.S., Neckers L.M. Characterisation of oligonucleotide transport into living cells. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989. V. 86. P. 6474-6479.

103. Gasparro F.P., Dall'Amico R., O'Malley M., Heald P.W., Edelson R.L. Cell membrane DNA: a new target for psoralen photoadduct formation. // Photochem. Photobiol. 1990. V. 52. N. 2. P. 315-321.

104. Geselowitz A.D., Neckers L.M. Analysis of oligonucleotide binding, internalization and intracellular trafficking utilizing a novel radiolabeled crosslinker. // Antisense Res. Dev. 1992. V.2. P. 17-25.

105. Hawley P., Gibson I. Interaction of oligodeoxynucleotides with mammalian ctlls. //Antisense & Nucleic acid drug development. 1996. V. 6. P. 185-195.

106. Hawley P., Nelson J.S., Fearon K.L., Zon G.Gibson I. Comparison of binding ofN3'—> P5' phosphoramidate and posphorothioate oligonucleotides to cell surface proteins of cultured cells. // Antisense & Nucleic acid drug development. 1999. V. 9. P. 61-69.

107. Yao G-Q., Corrias S., Cheng Y-C. Identification of two oligodeoxyribonucleotide binding proteins on plasma membranes of human cell lines. // Biochem. Phormacol. 1996. V. 51. P. 431436.

108. Лактионов П.П., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Участие поверхностных иммуноглобулинов в активации лимфоцитов плазмидной ДНК. // Молекулярная биология. 1997. Т. 31. N. 3. С. 506-514.

109. Rykova Е„ Laktionov P., Vlassov V. Activation of spleen lymphocytes by plasmid DNA. // Nucleosides Nucleotides. 1999. V. 18. N. 6-7. P. 1693-1695.

110. Rykova E.Y., Laktionov P.P., Vlassov V.V. Activation of spleen lymphocytes by plasmid DNA.//Vaccine. 1999. V. 17. N. 9-10. P. 1193-200.

111. Laktionov P., Dazard J.E., Piette J., Vives E., Rykova E., Vlassov V, Lebleu B. Uptake of oligonucleotides by keratinocytes. // Nucleosides Nucleotides. 1999. V. 18. N. 6-7. P. 16971699.

112. Ryazanov A.G. Glyceraldehyde-3-phosophate dehydrogenase is one of the three major RNA-binding proteins of rabbitase is one of the three major RNA-binding proteins of rabbit reticulocytes. //FEBS Lett. 1985. V. 192. P. 131-134.

113. Nagy E., Rigby W.F.C. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AUrich RNA in the NAD+-binding region (Rossman Fold). // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 27552763.

114. Schultz D.E., Hardin C.C., Lemon S.M. Specific interaction of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with the 5 P -nontranslated RNA of hepatitis A virus. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 14134-14142.

115. Singh R„ Green M.R. Sequence-specificity binding of transfer RNA by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. // Science. 1993. V. 259. P. 365-368.

116. Liu Q.S., Jin Y.X., Jiang D.S., Liu J.H., Wang T.P. Isolation and identification of two novel transfer RNA binding proteins from yeast membrane. // 18th tRNA workshop "tRNA 2000". Cambridge, UK. 8-12 April, 2000.

117. Grifoni C., Spisni E., Orlandi M., Santi S., Riccio M., Tomasi V. A 38 kDa nuclear protein is involved in the retention of an antisense oligonucleotide directed against cytosolic phospholipase A2 //Nucleosides Nucleotides. 1999. V. 18. P. 1673-1676.

118. Geselowitz D.A., Neckers L.M. Bovine serum albumin is a major oligonucleotide-binding protein found on the surface of cultured cells. // Antisense Res. Dev. 1995. V. 5. P. 213-217.

119. Tiruppathi C„ Finnegan A., Malik A.B. Isolation and characterization of a cell surface albumin-binding protein from vascular endothelial cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. N. l.P. 250-254.

120. Wang J., Ueno //., Masuko Т., Hashimoto Y. Binding of serum albumin on tumor cells and characterization of the albumin binding protein. // J. Biochem. (Tokyo). 1994. V. 115. N. 5. P. 898-903.

121. Лактионов П.П., Брыксин А.В., Рыкова Е.Ю., Власов В.В. Исследование олигонуклеотид-белковых взаимодействий в крови in vivo. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. Т. 127. N. 6. С. 654-657.

122. Arnedo A., Irache J.M., Gonzalez Gaitano G„ Valganon M., Espuelas S. Bovine serum albumin modified the intracellular distribution and improved the antiviral activity of an oligonucleotide. //J. Drug Target. 2003. V. 11. N. 4. P. 197-204.

123. Arnedo A., Espuelas S., Irache J.M. Albumin nanoparticles as carriers for a phosphodiester oligonucleotide. // Int. J. Pharm. 2002. V. 244. N. 1-2. P. 59-72.

124. Wartlick H., Spankuch-Schmitt B., Strebhardt K., Kreuter J., Longer K. Tumour cell delivery of antisense oligonuclceotides by human serum albumin nanoparticles. // J. Control. Release. 2004. V. 96. N. 3. P. 483-495.

125. Arnedo A., Irache J.M., Merodio M., Espuelas Millan M.S. Albumin nanoparticles improved the stability, nuclear accumulation and anticytomegaloviral activity of a phosphodiester oligonucleotide. // J. Control. Release. 2004. V. 94. N. 1. P. 217-227.

126. Wu G.M., Nose K., Mori E., Mori T. Binding of foreign DNA to mouse sperm mediated by its MHC class II structure. // Am. J. Reprod. Immunol. 1990. V. 24. N. 4. P. 120-126.

127. Yakubov L., Khaled Z, Zhang L.M., Truneh A., Vlassov V., Stein C.A. Oligodeoxynucleotides interact with recombinant CD4 at multiple sites. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. N. 25. P. 18818-18823.

128. Lavitrano M., French D., Zani M., Frati L„ Spadafora C. The interaction between exogenous DNA and sperm cells. // Mol. Reprod. Dev. 1992. V. 31. N. 3. P. 161-169.

129. Zani M., Lavitrano M., French D., Lulli V., Maione B., Sperandio S., Spadafora C. The mechanism of binding of exogenous DNA to sperm cells: factors controlling the DNA uptake. // Exp. Cell Res. 1995. V. 217. N. 1. P. 57-64.

130. Carballada R., Esponda P. Regulation of foreign DNA uptake by mouse spermatozoa. // Exp. Cell Res. 2001. V. 262. N. 2. P. 104-113.

131. Ishikawa F., Matunis M.J., Dreyfuss G„ Cech T.R. Nuclear proteins that bind the pre-mRNA 3' splice site sequence r(UUAG/G) and the human telomeric DNA sequence d(7TAGGG)n. // Mol. Cell Biol. 1993. V. 13. N. 7. P. 4301-4310.

132. Weidner D.A., Valdez B.C., Henning D., Greenberg S., Busch H. Phosphorothioate oligonucleotides bind in a non sequence-specific manner to the nucleolar protein C23/nucleolin. //FEBS Lett. 1995. V. 366. N. 2-3. P. 146-150.

133. Bates P.J., KahlonJ.B., Thomas S.D., Trent J.O., Miller D.M. Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides correlates with protein binding. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. N. 37. P. 26369-26377.

134. Tschakarjan E., Trappmann K., Immler D., Meyer H., Mirmohammadsadegh A., Hengge U.R. Keratinocytes take-up naked plasmid DNA: Evidence for DNA binding proteins in keratinocyte membranes. // International conference, Israel, Jerusalem. 1999.

135. Rappaport J., Hanss B., Kopp^J.B., Copeland T.D., Bruggeman L.A., Coffman T.M., Klotman P.E. Transport of phosphorothioate oligonucleotides in kidney: implications for molecular therapy. // Kidney Int. 1995. V. 47. N. 5. P. 1462-1469.

136. Leal-Pinto E., Hanss B., Klotman P.E. Calcium regulation of a cell surface nucleic acid channel. // Kidney Int. Suppl. 1996. V. 57. P. 4-10.

137. Hanss B., Leal-Pinto E., Bruggeman L.A., Copeland T.D., Klotman P.E. Identification and characterization of a cell membrane nucleic acid channel. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V. 95. P.1921-1926.

138. Hanss B., Leal-Pinto E., Teixeira A., Christian R.E., Shabanowitz J., Hunt D.F., Klotman P.E. Cytosolic malate dehydrogenase confers selectivity of the nucleic acid-conducting channel. // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2002. V. 99. N. 3. P. 1707-1712.

139. Tosteson M.T., Kim J.B., Goldstein D.J., Tosteson D.C. Ion channels formed by transcription factors recognize consensus DNA sequences. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 7801 l.P. 209-218.

140. Benimetscaya L., Loike J.D., KhakledZ., Loike G., Silverstein S.C., Cao L., Elkhoury R.Y., Cai J., Stein C.A. Mac-1 (CDllb/CD18) is an oligodeoxynucleotide-binding protein. // Nature Med. 1997. V. 2. P. 414-420.

141. Wagner H. Bacterial CpG DNA activates immune cells to signal infectious danger. // Adv. Immunol. 1999. V. 73. P. 329-368.

142. Yamamoto S., Yamamoto T., Tokunaga T. The discovery of immunostimulatory DNA sequence. // Springer Semin. Immunopathol. 2000. V. 22. N. 1-2. P. 11-19.

143. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. // Annu. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 709-760.

144. Chu W, Gong X., Li Z., Takabayashi K, Ouyang H., Chen Y., Lois A., Chen D.J., Li G.C., Karin M., Raz E. DNA-PKcs is required for activation of innate immunity by immunostimulatory DNA. // Cell. 2000. V. 103. N. 6. P. 909-918.

145. Hemmi H„ Kaisho T., Takeda K, Akira S. The roles of Toll-like receptor 9, MyD88, and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit in the effects of two distinct CpG DNAs on dendritic cell subsets. // J. Immunol. 2003. V. 170. N. 6. P. 3059-3064.

146. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T„ Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M„ Hoshino K, Wagner H., Takeda K, Akira S. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. // Nature. 2000. V. 408. N. 6813. P. 740-745.

147. Wagner H. Bacterial CpG DNA activates immune cells to signal infectious danger. // Adv. Immunol. 1999. V. 73. P. 329-368.

148. Shimazu R., Akashi S., Ogata H„ Nagai Y., Fukudome K, Miyake K, Kimoto M. MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4. // J. Exp. Med. 1999. V. 189. N. 11. P. 1777-1782.

149. Yang R.-B., Mark M.R., Gurney A.L., Godowski P.J. Signaling events induced by lipopolysaccharide-activated Toll-like receptor 2. // J. Immunol. 1999. V. 163. P. 639-643.

150. VisintinA., Mazzoni A., Spitzer J.H., Wyllie D.H., Dower S.K., Segal D.M. Regulation of Toll-like receptors in human monocytes and dendritic cells. // J. Immunol. 2001. V. 166. N. l.P. 249-255.

151. Under hill D.M., Ozinsky A., Hajjar A.M., Stevens A., Wilson C.B., Bassetti M., Aderem A. The Toll-like receptor 2 is recruited to macrophage phagosomes and discriminates between pathogens.//Nature. 1999. V. 401. N. 6755. P. 811-815.

152. Pearson A.M., Rich A., Kriger M. Polinucleotide binding to macrophage scavenger receptors depends on the formation of base-quarted-stabilized four-stranded helices. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. N. 5. P. 3546-3554.

153. Suzuki K, Doi T., Imanishi T., Kodama T., Tanaka T. Oligonucleotide aggregates bind to the macrophage scavenger receptor. // Eur. J. Biochem. 1999. V. 260. N. 3. P. 855-860.

154. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. "Мир". 1984. С. 132-134.

155. Cantor C.R., Tinoco I. Absorption and optical rotatory dispersion of seven trinucleotide diphosphates. //J. Mol. Biol. 1965. V. 13. P. 65.

156. Fasman Т.Е. Nucleic Acids. // In: Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. (FasmanT. E. ed) Cleveland. CRCPress. 1975.

157. Амирханов H.B., Зарытова В.Ф. Реакционноспособные производные фосфоротиоатных аналогов олигонуклеотидов. // Биоорганическая химия. 1995. Т. 21. С. 365-375.

158. Власов В.В., Рыкова Е.Ю., Паутова JI.B., Якубов Л. А. Ваимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки крови. // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 1247-1253.

159. Остерман J1.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М. Наука. 1981.

160. Haralambidis J., Chai М., Tregear G.W. Preparation of base-modified nucleosides suitable for non-radioactive label attachment and their incorporation into synthetic oligodeoxyribonucleotides. //Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 4857-4876.

161. O'Sullivan M.J., Gnemmi E., Morris D„ Chieregatti G., Simmons M, Simmonds A.D., Bridges J. W„ Marks V. A simple method for the preparation of enzyme-antibody conjugates. // FEBS Lett. 1978. V. 95. N. 2. P. 311-313.

162. Rykova E.Yu., Pautova L.V., Yakubov L.A., Karamyshev V.N., Vlassov V.V. Serum immunoglobulins interact with oligonucleotides. // FEBS Lett. 1994. V. 344. N. 1. P. 96-98.

163. Ullrich O., Horiuchi H., Alexandrov K., Zerial M. Use of Rab-GDP dissociation inhibitor for solubilization and delivery of Rab proteins to biological membranes in streptolysin O-permeabilized cells. // Methods Enzymol. 1995. V. 257. P. 243-253.

164. Иммунологические методы. Под ред. X. Фримеля. 1979. Мир, Москва.

165. Kohn J., Wilchek М. A new approach (cyano- transfer) for cyanogen bromide activation of sepharose at neutral pH, which yields activated resins, free of interfering nitrogen derivatives. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 107. P. 878-884.

166. Scopsi L., Larson L.-I. Increased sensitivity in peroxidase immunocytochemistry. //Histochemistry. 1986. V. 84. P. 221-230.

167. Shoji Y, Akhtar S, Periasamy A, Herman B, Juliano RL. Mechanism of cellular uptake of modified oligodeoxynucleotides containing methylphosphonate linkages. // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. N. 20. P. 5543-5550.

168. Wu-Pong S., Weiss T.L., Hunt C.A. Calcium dependent cellular uptake of a c-myc antisense oligonucleotide. // Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 1994. V. 40. N. 6. P. 843-850.

169. Wu-Pong S. Calcium-dependent oligonucleotide cellular uptake. // Biochimie. 1996. V. 78. N. LP. 33-38.

170. Wu-Pong S. The role of multivalent cations in oligonucleotide cellular uptake. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. V. 39. N. 3. P. 511-519.

171. Budker V.G., Knorre D.G., Vlassov V.V. Cell membranes as barriers for antisense constructions. // Antisense Res. Dev. 1992. V. 2. N. 2. P. 177-184.

172. McNeil P.L., Steinhardt R.A. Loss, restoration, and maintenance of plasma membrane integrity. // J. Cell. Biol. 1997. V. 137. N. 1. P. 1-4.

173. McNeil P.L., Murphy R.F., Lanni F., Taylor D.L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. //J. Cell Biol. 1984. V. 98. N. 4. P. 1556-1564.

174. Hedman K.J. Intracellular localization of fibronectin using immunoperoxidase cytochemistry in light and electron microscopy. // Histochem. Cytochem. 1980. V. 28. P. 12331241.

175. Fechheimer M., Boylan J.F., Parker S., Sisken J.E., Patel G.L., Zimmer S.G. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987. V. 84. N. 23. P. 8463-8467.

176. Waldman A.S., Waldman B.C. Stable transfection of mammalian cells by syringe-mediated mechanical loading of DNA. // Anal. Biochem. 1998. V. 258. N. 2. P. 216-222.

177. Farrell C.L., Bready J.V., Kaufman S.A., Qian Y.X., Burgess T.L. The uptake and distribution of phosphorothioate oligonucleotides into vascular smooth muscle cells in vitro and in rabbit arteries. //Antisense Res. Dev. 1995. V. 5. N. 3. P. 175-183.

178. Partridge M., Vincent A., Matthews P., Puma J., Stein D., Summerton J. A simple method for delivering morpholino antisense oligos into the cytoplasm of cells. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996. V. 6. N. 3. P. 169-175.

179. Wilchek M., Bayer E.A. Avidin-biotin technology ten years on: has it lived up to its expectations?//Trends Biochem. Sci. 1989. V. 14. N. 10. P. 408-412.

180. Mahdi F., Shariat-Madar Z., Todd III R.F., Figueroa C.D., Schmaier A.H. Expression and colocalization of cytokeratin 1 and urokinase plasminogen activator receptor on endothelial cells. // Blood. 2001. V. 97. N. 8. P. 2342-2350.

181. Shariat-Madar Z, Mahdi F., Schmaier A.H. Mapping binding domains of kininogens on endothelial cell cytokeratin 1. //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. N. 11. P. 7137-7145.

182. Shariat-Madar Z., Schmaier A. H. Kininogen-cytokeratin 1 interactions in endothelial cell biology. //Trends Cardiovasc. Med. 1999. V. 9. N. 8. P. 238-244.

183. Steinert P.M. The dynamic phosphorylation of the human intermediate filament keratin 1 chain. //J. Biol. Chem. 1988. V. 263. N. 26. P. 13333-13339.

184. Hembrough T.A., Kralovich K.R., Li L., Gonias S.L. Cytokeratin 8 released by breast carcinoma cells in vitro binds plasminogen and tissue-type plasminogen activator and promotes plasminogen activation. // Biochem. J. 1996. V. 317. N. 3. P. 763-769.

185. Gonias S.L., Hembrough T.A., Sankovic M. Cytokeratin 8 functions as a major plasminogen receptor in select epithelial and carcinoma cells. // Front Biosci. 2001. V. 6. P. 1403-1411.

186. Ramirez P., Del Razo L.M., Gutierrez-Ruiz M.C., Gonsebatt M.E. Arsenite induces DNAprotein crosslinks and cytokeratin expression in the WRL-68 human hepatic cell line. // Carcinogenesis. 2000. V. 21. N. 4. P. 701-706.

187. Ohneda A., Watanabe K., Wakimatsu M., Fujino M. Production of a specific antiserum by synthetic C-terminal fragment of glucagon. // Horm. Metab. Res. 1979. V. 11. N. 8. P. 463-468.

188. Carter D.C., Ho J.X. Structure of serum albumin. // Adv. Protein Chem. 1994. V. 45. P. 153-203.

189. Sudlow G., Birkett D.J., Wade D.N. The characterization of two specific drug binding sites on human serum albumin. // Mol. Pharmacol. 1975. V. 11. N. 6. P. 824-832.

190. Kragh-Hansen U. Evidence for a large and flexible region of human serum albumin possessing high affinity binding sites for salicylate, warfarin, and other ligands. // Mol. Pharmacol. 1988. V. 34. N. 2. P. 160-171.

191. Ivanisenko V.A., Pintus S.S., Grigorovich D.A., Kolchanov N.A. PDBSiteScan: a program for searching for active, binding and posttranslational modification sites in the 3D structures of proteins. //Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. W549-554.

192. Власов В.В., Паутова Jl.В., Рыкова Е.Ю., Якубов Л.А. Взаимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки крови. // Биохимия. 1993. Т. 58. N. 8. С. 12471251.

193. Kragh-Hansen U„ Chuang V.T., Otagiri M. Practical aspects of the ligand-binding and enzymatic properties of human serum albumin. // Biol. Pharm. Bull. 2002. V. 25. N. 6. P. 695704.

194. Curry S., Mandelkow H., Brick P., Franks N. Crystal structure of human serum albumin complexed with fatty acid reveals an asymmetric distribution of binding sites. // Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. N. 9. P. 827-835.

Информация о работе

Челобанов, Борис Павлович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Поверхностные белки кератиноцитов, участвующие в транспорте нуклеиновых кислот - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы