Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поверхностные антигены дрожжеподобных грибов рода Candida как диагностически ценные аллергены

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Поверхностные антигены дрожжеподобных грибов рода Candida как диагностически ценные аллергены"



Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

На правах рукописи УДК 579.8:616-056.3

ЕРМОЛАЕВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ПОВЕРХНОСТНЫЕ АНТИГЕНЫ ДРОЖЖЕПОДОБИЫХ ГРИБОВ РОДА САДГОША КАК ДИАГНОСТИЧЕСКИ ЦЕННЫЕ АЛЛЕРГЕНЫ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

- Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова.

Научный руководитель — доктор медицинских наук — М. В. Далин.

Официальные оппоненты: заслуженный, деятель науки Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Р. Н. Реброва; лауреат Государственной премии, доктор медицинских наук, профессор М. М. Дыхно.

Ведущее учреждение — Институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского.

Защита диссертации состоится / 1993 г. в _час. на заседании Специализиро-

ванного совета Д.074.05.10 при Московской медицинской академии им. И: М. Сеченова по адресу: Б. Пироговская, д, 2/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова по адресу: Зубовская пл., д. 1.

Автореферат разослан ^¿/я^ 1993 г.

' Учёный секретарь Специализированного совета кандидат медицинских наук

А, Ю. МИРОНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В современной промышленной микробиологии производство биомасс кормового назначения ведется путем бискои-ворсии непищевого снрья с использованием ярокжеподобньгх грибов (ДПР) родп Candida. Извеотно, однако, что некоторые вида ЯПГ, п частности* 0.albicans, С,tropicalis и др. широко распространены в составе ценозов окрукакцеЯ cj. зда и иор?/альноЯ микрофлоры человека, Большинство из ¡nix взаимодействуют с макроорганизмом по типу ком-ыенсзло-парэзиткгма, и при определенных условиях способны оказызэтъ на последний выраженное сенсибилизирующее действие (РоЯрова Р.Н,, 1989), но связанное с патогонностыа ДПГ и часто 'наблюдающееся при клинически бессимптомном кандидоносктельстБе.

На предприятиях микробиологического синтеза для биоконвэрсйй нёгпздбвого сирья используют только те, получение путем промшлен-иоЛ селекции атакку ДПГ, которые лишены факторов патогешюстй. Такие продуцента на вызывают длительной колонизация и не бпособнм индуцировать развитие специфического заболевания. Будучи, однако, из-за несовершенства систем экологической безопасности, выброжеш со внешнюю среду из техкогешшх экологических юна, аидае клеткй продуцента и шлъ готового продукта, при попадании в организм чоло-века через органы дыхания, желудочно-кишечного тракта, кояшюиву глаз и кожу (.»огут при. определенных условиях оказывать плАоргизяруй-щее действие как на рабочих, занятых в биотехнологическом производстве, так и на жителей селитебных зон, располскеюшх в непосредственной близости от таких предприятия.

Виявленйа н дифференциация кандндосаиснбклиэацки, обусловленной техногенными иаолятами ДПГ, предусматривает презде всего прямое лолик-гашичеокое обследование рабочих с использоввггибм аллорготасти-рованип и требует наличии чувствительных и шсокоспецифических ад-

лэргенов, полученных из ттадаов-продуцентов биомасс кормового назначения. Необходимость высокой специфичности тест-препарата диктуется отмеченной выше широкой распространенностью ДПГ рода Candida е составе цэнозов окружающей среда и нормальной микрофлоры человека, что ставит перед врачом задачу дифференциальной диагностики этиологии кандидосенсибилизации у каждого конкретного обследуемого.

Попытки получения антигенноактивных компонентов промышленно-ценных ДПГ на основе экстрактов клеточного детрита, биополимеров, выделенных из цитоплазматического пула клеточной оболочки и сухого порошка готового продукта, предпринимались рядом коллективов Минздрава СССР и Минздрава РФ. Были предложены различные антигенные препарата для определения степени загрязненности атмосферного воздуха специфическим белком в районам расположения микробиологических заводов, равно как и для оценки влияния газовоздушных выбросов последних на иммунологическое состояние рабочих и кителей селитебных зон.

Во всех этих случаях, однако, использованные авторами способы выделения р очистки препаратов приводили к получению образцов, которые были либо малоактивны, либо содержали общие и серологически родственные антигены с комменсало-паразитическими штаммами дпг, такими как Candida 'albicans. В некоторых случаях препараты проявляли побочное цитотоксическоэ действие.

Анализ публикаций зарубежных авторов также свидетельствует о том, что проблема поиска и разработки специфичных аллергенных препаратов для диагностики сенсибилизации, вызванной ДПГ рода Candida, до сих пор остается нерешенной.

Таким образом, актуальность работы'определяется как необходимостью расширения.и углубления знаний об антигенной структуре ДИГ. рода Canlirta, так. и возникающими при. культивироьэщтн отдельных

фодставителей этого рода в промышленных масштабах проблемам, свя-1анными с сенсибилизирующим воздействием клеток гриба и продуктов (ГО биосинтетической активности на организм человека.

Исходя из вышеизложенного, цвдью_настдящ9й_рабдтд било: изучить и дать научное обоснование возможности использования поверх-:остных антигенов, выделяемых из производственных штаммов ДИГ рода andida, в качества диагностически ценных аллергенов, поя болящих дфбераиидровать кандидосенсиОшшзацяю, обусловленную техногенными таммами, от микогенной сенсибилизации, вызванной естествещшм но-ительством комменсало-паразитических штаммов ДПР.

По ходу достижения этой цели последовательно решались , .следую-иэ оснощше_задачи_иссле£ования:

1.Выделить поверхностные гликсконъюгата ДПГ рода Candida утем бездеструкционной обработки нативной биомассы тиоловим реа-гштом - (З-меркытго этанолом.

2. Виде лить антигвнноактиьныв биополимеры, накапливаемые .культуральной жидкооти(КЖ) в процессе выращивания ДПГ p.Candida условиях интенсивного перемешивания.

"'3.Оценить антигенный состав получеышх комплексных препаратов поучить их иммунохимические свойства.

4 .Отработать метода очистки и фракционирования препаратов' и адолить активные фракции.

5.Изучить реактогеяность и разрешающую способность комплексах npenápSlx® и счищыишх фракций.

6. Подучить , фрикпии с максамашюй видоепэцифичоской. октив-юч'ью при постановке кожных {-еакиий на морских свинках, оснсвСшш-фовадаы* ^¿гоьрлогичиой, так и гмторолосичной культурами.

' tteywe*-.цащсага,- Ьаорвыи ь- опытах а.илрготьстироьанил изуч'ыш ¡áft|ái3BHH:iaTft и раа£&#ай«ья ай'гиьноеть ¡юверхшстних; антиганои

производственных штаммов Д11Г рода Candida, извлеченных бездестру-кционными методами воздействия.

Выделены и охарактеризованы ло иммунохимическим, иммунобиологическим свойствам антигены, накаплиаакщиесл в й и процесса реакторного культивирования дат рода Candida.

Разработаны методические подходы к получению аллергенноактив-WX фрокшш ДОГ, обладающие ъисокой ввдоьой специфичностью, позволяющей использовать их в качество диагностически г.енних аллергенов для дифференцированного выявления кандидосенсибилизации, вызвашой штаммами-продуцентами биомасс кор»мового назначения.

Практическая, значимость, Результат» исследования обосновывают возможность использования поверхностна антигенов ДПГ рода Candida в качестве диагностически ценных аллергенов. Полусотне препараты использованы для оценки сонсиоилизируищ1 х свойств штаммов-продуцентов биомасс кормового назначения, при паспортизации штаммов, предназначенных к использованию в производстве, а также при обосновании медико-гигиенического норматива - ГШК клоток производственных idt/jmmob C.maltosa, C,troplcalle, C.rugosa.

Положения вьносикио на защиту;

1.Поверхностные антигены ДТГ p. Candida ( полученные методом бездеструкциоиного воздействия на клетку) или антигены, накапливаемые в средэ культивирования, представляют собой комплексные препараты, которыо могут быть использованы для выявления кандидосенсиби-лизации.

2.Комплексные препараты при слабой реактогашости обладают высокой разрешающей активность» в аллерготестах и способны выявлять как ПЗТ, так и ШТ. Эти препараты составлены биополимерами гли-копротеиновоЯ природа и несут как общие для рода, так и вндоспеци-фичэсхие антигенные детер¡шюцти,

исоледошля результата

'З.йрзквдонированкз и очистка комплекскнх препаратов с исполь-ованаем молекулярной мембранной фильтрации, ионообменной и гель-роиикакийй хроматографии позволяют существенно повысить их вкдо-. пвцифи,ащв"~хврактеристики. ~

' 4'.Очжтшшв фракгуш концентрата ШС и JÏÏ1A с молекулярной мэссЬй fljiaa 200 кД обладает спаци£шкши детерминантами и в ойределетцх ятервалах доа способны дифференцированно диагносьйровзть квндвдо-висибклазацн», обусловленную техногекннми цташшй! ДПГ p. CariAiûa i отяичиэ от таковсй, вызванной "дакика". кошансало-поразлтичвсгаад iTBMMBsra, в частности, вида G.albicans.

Апробация работы. По ходу выполнения [ре дотащились для обсуждения на:

- Ивздународном симпозиуме "Миту а дыша вопроси медюяясксй. ¡ккодогни", 1987, Лешшград.

- Отраслевых конференциях ш охране окрукаэдэ'й среди, 1983, Ьаоподоцк; 1988, Таакйнг. • "

- Заседании биолопнесиой секции Ученого совета. Всесоюзного |аучно-исследова7'»льского института биосинтеза беякових веществ ШйГсщдазЗз.кск':, 1990, Москва-.- Hayчно-практнчасикх конференциях лаборатории иымунохиши а

(анагарно-гигиеничвских исслэдоЕанкй 'Видабиотэхнйлогин, 1968 и 1Ш

Ш ША им.И.М.Сеченова, I9'yO, 1991.

i

Публикации.По материалам -диссертации-' опубликовано 13 работ, ispeïOHb которых продотававн ъ гсшцъ.е автореферата.

Ослш и структура работы. Диссертация изломана на /3, S~ стр. юсшолйсного токста и состоит из введения, обзора литература, опи-:атш материалов и мотодов исследования, 3-х. разделов изложения юлучешпи результатов, их обсуждзшм, еыводой и .библиографического 'казателя, ввдачаююго Мб источников. Работа иллпстрировзна 19 .

6 t

рисунками и 24 таблицами., • .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали техногенные штаммы ДПГ видов С.maltosa ' (Зштамма) , C.tropicallB (I штамм),С .rugosa (I иташ) и С.valida (I штамм).. При оценке диагностических свойств аллергенов ДПГ производственных, штаммов' в качестве культуры сравнения использовали Cralbicana штамм 846.

С целью получения исходного сырья (биомассы и .культуральной жидкости - КМ) для выделения антигенноактивных компонентов (ААК) штаммы культивировали на установках Blolaîltte (Франция) или Фер-мус-1 ' (НЩблоавтоштика* г.Горький) стерильно в циклическом объем-но-доливном роишо, в аппаратах емкостью 5 литров.

Реши культивирования ограничивали определенными технологическими условиями (уровень аэрации? кислотность среды, содержание ис-

! -

точникя углерода и др.), что обеспечивало в процессе накопления биомассы как сохранение целостности клеточной стенки ДПГ, так и максимальную секрецию ААК в культуральную жидкость. Биомассу отбирали в конце логарифмической фазы.роста.,.отделяли от культуральной жидкости центрифугированием й- использовали для получения препарата поверхностных антигенов (ГО1А). ППА получали обработкой нативной или лиофшшзировакной биомассы тиоловым реагентом - (Э-меркаптоэтанйлом, с последующим осаждением экстракта этанолом.

AÀK извлекали из КЖ концентрированием на.установке,.Amlcon (полые волокна тип iïJPO ) с последующим освобождением концентрата от низкомолекулярных компонентов ультрафильтрацией на мембране Dlaflo . марки РМ-10 в ячейках системы Amlcon. .

Оценку химического состава исследуемых препаратов проводили, определяя белок'по Яоури и углеводы фенол-серным методам.

Исследовали Ш серий IIÍ1A из клеток Щ1Г промвдленных штаммов и .

3 образцов ААК 1Ш. ч

Ишунохишческиэ свойства препаратов исследовали в реакции двойной иммунодаффузии по Оухтерлони (РДЦ) и в иммуноалоктрофорезе (ИЭФ)д применяя в качестве специфических реагентов кроличьи иммун- . яыэ сиворотки против отмытых швих клеток и ААК М! гомологичных маммов, а также кроличьи сиворотки против убитых формалином клеток j.albicans штамма 846. для получения антисывороток служили 60 кро-яиков породы Шишшла. В ряде опытов при постановке ИЭФ в качестве «специфического манифэстатора использовали конканавалин-А.

Фракционирование ГШ и ААК КЖ проводили методами мембранной . £ильтрацш (мембраны фирмы Amlcon марок ХМ-300, РМ--30, FM-IO и UM-I), гэль-хроматографии на колонках, заполненных сефакрнлом . S-200 (Pharmacia lins Cheri&cals Швеция), и ионообменной хроматографии на {олонкэ заполненной ДЭАЕ-целлюлозой 23SS (Serva ФРГ) в градиенте teci. '

Анализ фракционного состава антигенноактивных препаратов, про--зодили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)' на солонках Ultropack: TSKG 3000 (голубых) фирмы Ш (Швеция).

Исследование диагностической ценности аллергенных препаратов, крученных при разных способах очистки и фракционировании. ППА и ААК Ж проводили в "опытах внутршсошого титрования на 1400 морских ¡винках пестрой масти и альбиносах массой 220-260 г. ■

. Реактогенность препаратов определяли путем внутрикожнога * введения их интактшш морским свинкам. Реакцию учитывали через 24 часа [ считали положительной при появлении в '.места введения препарата юны гиперемии диаметром не менее Б мм.

-.Разрешающую активность оценивали в. кожногаллорголагическом ■есте на морских свинках» сенсибилизированных ¡за 12 дней до начала (Шта живыми клетками гомологичного штата ДПГ или С.albicans штам-

ма BGB 846 в смеси с полным адъювантом Фрейндэ. Смесь,' ссдерааэд 190 млн, клеток ДПГ, вводили по 0,1 мл суОплантарно в кавдю задтс конечность и по 0,3 мл подкожно в облаот£ спины. Разрешающие доа препёратов варьировали от 10 миг- до 0,03 мкг белке. ¡Сотую реакця учитывали через 0,5, 1,5, 24 и 48 часов и рассчитывал» средаеразрэ шааду» доэу (ЕЯ60) препарата (Беленький М.Л., 1963 г.).

Исследование способности ППА выявлять гиперчувсгвительност немедленного типа проводили на модели анафилактического шока н морских сшаквк, сенсибилизированных живой культурой ДПР >за 21 сут ки до внутрисердечной инъекции разрешающей дозы ГШ, полученного и Ьультурн сбогветствувдегЬ штамма. За животными наблюдали в течение 50-40 минут после разрешения. Регистрировали стадаи развития обще; аннфилактйЗеской реакции и количество летальных исходов.

Оценку роли поверхностных структур ДПГ рода Candida в развитш тгандйдосвйсибилизации вели в тесте . пассивной кожной анафаШксм <НКА) по Овери. Для этого двукратные разведения сыворотки, полученной от сенсибилизированных морских овинок и содержащей гомоцито-трошмв антитела (НЦ) (в контрольной1 группе), вводили . Штактшм MopcKtSd сванкам внутрикожно в объеме.0,1 нл, а через 18-24 чве; внутрисердечно вводили А.Г в дозе 2 мг. в 0,5 мл физиологического раствора с синькой Эванса. Через 25-20 минут учитывали появление окрашенного пятна в месте введения сыворотки. В опытной группе сыворотку, содержащую П1А перед внутрикожной инъекцией адсорбировал* целой культурой ДПГ.

Для статистической обработки полученных результатов применяли метод пробит-анализа с расчетом -сродноэффектившх или среднеаллер-генных доз БЯГП (Беленький М.Л., 1963 г.)•.

результаты и Обсуждение На первом этапе работы оценивав.роль, поверхностных структур ДПГ p.Candida в развитии кандадосенсибилизации. Использовали тест пассивной ксмюй анафилаксии (ПКА). Оказалось, что'титр 1Щ зависит от штамма, взятого для сенсибилизации, и времени экспозиции. Адсорбция' сыворотки, содержащей ГЦА, целыми клеткам» приводила либо к частичному, либо к полному удалению антител, из сыворотки, в зависимости от исходной ее активности в ПКА и условий обработки, опрэделящих полноту, связывания антител клеточной поверхностью. Тагам,... образом выяснииось, что структуры, формирующие поверхностный глико-*/., .калике клетки дпг, содержат антигенные детерминанты, индуцирувзда у морских свинок кандйдосаисибилизацив. Удаление гца из сыворотки крови сенсибилизиро^кшх животных после адсорбции, ее целыми клэт-, ками дпг указывает па поверхностную локализацию этих детерминант.

Основываясь на атих результатах, мы получали поверхностные антиге1ш щадящим, бездеструкционным воздействием. Лри обработке, нативной биомассы (i-маркапгозтанолом получено 13 образцов препаратов производствошшх штаммов ДПГ рода Candida (два .образца Ш1А получали из лиофилизировьнной биомассы ДПГ). '•".

Хроматографаческое исследование экстрактов методом ВЭЖС показало, что препараты «з всех штаммов готерогенщ и содержат по . 6-6 отчетливо'идентифицируемых фракций с молекулярными массами от I . .до >300'кД.■При исследовании в РДД, комплексные.препараты ' формировали с гомологичной аитисывороткой по 3-4 полосы прецщштации,. а при, иимуноэлектрофорозе гомологичная антнеиворатка выявляла в .них .3 малоподвижных компонента, слегка мигрирующих В сторону анода.

В результате 6-онигор,циклического объемно-доливного культиви- • рования ДПГ бали.получены г/ре пираты концентрата культуральцой жид-. кости ■ (KIOK): "O.lnaHoaa - 3 образца,. C.troplcalia. - 3. образца. Каж- .

ДЫЙ из них представлял собой... общий пул концентратов разных циклов одной серий ферментации.

Изучение фракционного состава КЮК методом ВЭЖХ свидетельствует о гетерогенности этих образцов и наличие в них как минимум 7 компонентов с молекулярными массами от <1 кД до >300- кД. Хроматографи-' ческий анализ ККЖ в сравнении с Ш1А выявил в первых группу высокомолекулярных и низкомолекулярных фракций, общих с Ш1А, и группы биополимеров о молекулярной массой от 50 кД.до 200 кД, отсутствующих в ППА. Частичная идентичность антигенов КЮК и ПГ1А выявлена также при Их иммунохимическом сравнении в РИД с антисывороткой против Целых клеток ДПГ штамма C.maltosa. Антисыворотка к ККЖ того и:е штамма, напротив, взаимодействовала в РДД только с этим же препаратом и не образовывала полос преципитации с ППА. Таким образом анти-геннозктившге компоненты ККЖ включают как поверхностные маннолрога-ийа, так и специфические для КЖ ("метаболические ) ААК ДПГ. Послед-нив, по-видимому, обладают более выраженными иммуногвшшми свойствами, чем [1ПА и индуцируют у кроликов выработку специфических антител; не вэоикодейсгвуицих. с антигенами ПШ.

При Иммуноэлектрофорэтиче'ском анализе ААК из КЖ C.tropicalia с • Использованием антисыворотки к ККЖ того ¡¡¡е штамма обнаружено, что часть компонентов остается на старте, а один смещается в сторону аноде/ . Малоподвижные компоненты ККЖ проявлялись также и аншсывороткой к целым клеткам ДПГ и были идентифицированы как ком- • шненты ЯЛА.

Изучение в кокноаллергологичесКом тесте способности ППА и КЮК выявлять сенсибилизацию,, обусловленную попаданием в организм целых клеток гриоа-продуцонта показало. ( таблиц;! I), что вое omi выявляй, в зтдм. случае. только ПЗТ, причем их срэднеразрешающие дозы ьо много раз-ниже, чем срвдйереглссогемйч, 'минимальная яз' которых со.;-

тавляла 370 мкг Оелка в 0,1 мл. Кожная реакция развивается не ранее 8-го часа и сохраняется в течение 48 часов. При сравнении величин ЕД50 оказалось, что ППА G.troplcalla со среднеразрешиющай дозой-0,28 мкг белка, равен по активности ППА С.maltosa, ГД50 которого Составляла 0,26 мкг белка. В то ш время, КЮК C.maltooa и C.tropl-calla имели несколько меньшую активность: ВДБ0 составляла соответственно 0,70 и 0,80 мкг белка.

Таблица I

Разрешающая активность препаратов ППА и ККЖ при аллерготести-ровадавд в опытах внутриколсного введения образцов морским свинкам - в вариантах гомо- и гетерологичного тестирования

• а Образец Среднеразрешащая доза препарата ¡UÍcq мкг белка пои сенсибилизации

C.maltoaa С. tropicalis 0.albicans

ППА- С. mal tosa ППА с.tropicalis И01 С.maltosa КЮК С.tropicalis • 0,26(0,18-0,34) 6,6(3,3-13,2) 0,70(0,20-2,24) 3,2(1,6-5,5) 2,6(1,4-4,7) /0,28(0,15-0,50) 5,9(2,11-18,1) 0,8(0,5-1,1) . более 10 более 10 более 10 4,6(3,0-6,2

Дополнительно исследовали.способность ППА выявлять гиперчувст-вительносгь немедленного типа (ГНТ) у морских свинок.- Оказалось, что внутрис&рдзчное введение максимальной ареактогенной дозы ' ТПА сенсибилизированным животным приводит к развитию у большинства из шх торпидиой фазы анафилактического шока.

Оценка разрешающей способности препаратов при аллорготестиро-вании в гомо- и гетерологичной системах показало, что и ППА и КЮК имеют перекрестно-реагирующие .антигены, чтоукпзывает на частичную общность последних у двух исследуемых.штаммов'как между собой, так и по отношению к штамму сравнения (С.albicans!). Б то же время, от-

М9чаются значительно более низкие ввмгшт для ШЛ и ААК M при аллерготестирований в, Гомологичных системах, что свидетельствует и о развитии специфической реакции при сенсибилизации этими культурами. •

• Фракционирование, комплексных препаратов. Исходя из получешшх результатов, вторым этапом работы была попытка выделить из кокилек-сннх -препаратов ГШ и МК ЮГ наиболее .активные и специфичные фракции. . .

Двухступенчатое.фракционирование ППА С.mal tosa на мембранах Amicon й колонках Sephacryl S-2QÖ позволило получить насколько фракций гликопротеинов с. молекулярной массой более 250 кД, а также - в пределах 160-200 кД, 9-10 кД и 1-6 кД.

При изучении антигенного состава фракций в РДЦ, оказалось, что компоненты разной молекулярной массы содержат одинаковые антигешшо детерминанты. В то же время выяснилось, что наиболее выраженными серологическими свойствам^,обладали компоненты с молекулярной массой Оолеэ 250 КД.

Сравнительная . оценка -разрешающей способности фракций ППЛ 0.maltosa при внутрикожном аллерготестированми показала, что активность ППА как аллергена связана преимущественно с этой же фракцией. По величине ЕД50, выраженной в мкг белка, эта фракция существенно не отличалась от целого препарата. ВД50 осталь!ШХ Фракций была значительно выше, чем целого ГША (таблица 2).

■ Таким образом результаты аллерготестирования, также как и данные иммунохимического анализа, показали, что поверхностно биополимеры С.maltosa, имеющие Молекулярную массу более 200 кД, содержат антигенные, детерминанты с выраженными серологическими свойствами и способностью выявлять у морских свиток ■ ГОТ при снши&ической ка 11-дидосенсибилиз ацш.

Таблица 2

Разрешающая способность фракций ПГ1А С.maltosa в опытах внутрикожного аллерготэстирования на морских свийкйх

Наименование фракции Молекулярная масса (кД) Средиеразремающая доэа . (мкг ■ Gema)

Целый ППА - 0,26(0,18-0*34)

Фракция I более 250 0,20(0,12-0,45) ••

Фракция 2 150-200 3,20(1,50-6,60)

Фракция 3 9-10 более 1,60

Фракция 4 1-6 более 1,60

Для очистки МК КЖ С.ШаНо'аа первоначально использовали метод мембрашой фильтрации. При двухступенчатом разделении биополимеров ГОН по молекулярной массе (сначала на мембране ХМ-300 АяИсоп, с исследующим концентрированием диализата на мембране 1Ш-2). получен ряд фракций, из которых одна, содержащая компоненты с молекулярной мад-сой 150-200 кД и более, имела ВД50 равную 0,16(0,11-0.23) мкг белка, и была значительно активней, чем комплексный КГОК и остальные относительно низкомолекулярные Фракции.

Ориентируясь на результаты, полученные при фракционировании ППА и ААК КЖ С.шаиоза, при разделении первых двух образцов концентрата ЮК С.ггор1са11з использовали как и ранее филЬтрацяю на мембранах МЛ-300, им-2 и дополнительно на Ш-30. • , • .

Анализируя количественные характеристики выхода фракций и йх ' компонентный состав обнаружили значительные потери материала .на этой стадии очистки аллергена, по-видимому, за счет адсорбции биополимеров КЖ на мембранах. Аллёрготестирование этих фракций . На животных* сенсибилизированных гомологичной культурой, показало, -хотя и недостоверное, но все же снижение ЕЦдд у концентрата РМ-30

по сравнению с исходным im и остальными фракциями.

. Использование Sephacryl S^SOO для разделения 2-го .образца ККЖ штамма.О-tropicalis позволило идентифицировать в его составе 4 фракции о молекулярной массой ~ 300 кД, 130-160 КД, 50-70 кД и 20 кД соответственно.

При орашенш в РДД выявлены общие антигенные компоненты фракций, но идентифицированы они там, однако, в разных парциальных соотношениях. При иммуноалектрофорезэ (ИЭФ) с помощью антисыворотки к , концентрату КЖ и целым клеткам гомологичного штамма ДПГ выяснилось, что в каждой фракции присутствуют от 4 до 6 дискретных по электрофоре тической иодвикности компонентов, часть из которых остается в области старта, а другие мигрируют с разной скоростью к. аноду. При атом малоподвижные и неподвижные компоненты фракций взаимодейство вали T0KJK3 конкшавалином А, что позволило говорить о них как о поверхностных маннопратеинах.

При внутршсогном -титровании на интактных морских свинках ни одаа из рассматриваемых фракций в дозе 10 мкг белка (максимальная . дозаJиспользуемая при еллерготесгировании) не индуцировала кожной гиперемии в течение 48 часов наблюдения. Результаты внутрикожного титрования фракций на сенсибилизированных животных представлены в таблице 3, откуда видно, что наибольшей активность» в гомологичной системе (сенсибилизация Candldö tropicalis) обладают фракция I с молекулярной массой ~ 300 кД и фракция 3 массой 50-70 кД.

Срвднеразрешающие дозы этих фракций оказались ниже (активность выйе), чем аналогичная величина ^сходного ККЖ и двух других фракций КЖ. При использовании этих.фракций для постановки внутрикокных проб морским свинкам, сенсибилизированным 0.albicans, выяснилось, что их среднеразрешавщие дозн в 12-13 раз бшно, чем при аллерг&тесгирова--нии на животных, сенсибилизированных гомологичной культурой ДПГ.

Две остальные фракции (2 и 4) выявляли ГЗТ к антигенам О.аШсапв ташке как и к гомологичному штампу. Рассматривая результаты адлер-готестирования с учетом данных иммунохимяческого анализ», свидетельствующих о частичной идентичности фракций, можно предположить, что биополимеры КЖ разной молекулярной массы,- но превышающей 10-30 КД, содержат одинаковые антигенные детерминанты ДПГ, выявляющие у подопытных животных специфическую сенсибилизацию и развитие ГЭТ. •,'.

- • Таблица 5

Разрэшаюцая способность фракций КЖ СЛгор1са11с, полученных гель-хроматографией на БерЬасгу! 5-200

Наименование препарата Мол.Масса (кД) 'Щ50 в мкг белка прй сенсибилизации

0Лгор1са11з С.аШсапв

Фракция I ~ 300 . 0,23(0,14-0,38) 3,1(1,77-6,42)

Фракция 2 130-160 3,70(1,60-6,40) 3,1(1,82-6 »27)

Фракция.3 Б0-70 0,30(0,17-0,52) 3,5(1,40-8,7&)

Фракция 4 20 0,82(0,47-1,56) 1,1(0,59-2,03)

Учитывая результата иммуно электрофоре тиче ского исследования относительно видоспецифичных.фракций концентрата ХМ-300 И концент-. рата Ш-2 КЖ, которое выявило нзЛичио в них на фоне нескольких Малоподвижных компонентов гак же и компонента с высокой электрофоре-тичвской подвижность», мигрирующие в сторону анода, с целью усовершенствования метода получении диагностического аллергена, дальнейшую очистку ААК КЖ проводили методом ионообменной хроматографии -на колонке ДЭАЕ-целлюлозн в градиенте ИаС1, позволяющим дифференцировать молекулы по их поверхностному заряду. Проводили ионообменную хроматографию-как концентрата, так и диализата ХМ-300. Прй разделении концентрата ХМ-300 ККЖ оылЬ выделено. 3 фракции, одна из которых

выходила с фронтом стартового буфера, а два другие при концентрации , НаС1. соответственно 0,09 М м о;23 компоненты- даалийата XM-3QQ ' ЛАК ЮК также выходили о колонки тремя пиками при концентрации liaGl ооответствйшю 0,04 М, 0,13 М и 0,26 М. При шлмуноэлёктрофоратичес-ком исследовании образцов, очищенных методом ионообменной хромато-грйфии, оказалось, что фракции концентрата ХМ-300 и диализата ХМ-300 состоят из' 3-6 компонентоЕ-с разной электрофоретической подвик-костью..Высо'коподвиишй компонент ККЕ -выявлялся как в 1-ой фракции концентрата ЗШ-ЗОО, гак и во 2-ой и 3-й фракциях диализата ХМ-300. Во 2-ой же фракции концентрата ХМ-300 и 1-11 фракции диализата ХМ-300 атот компонент не обнаружили. При доследовании этих' фракций в алперготестах на морских свинках (табл.4), сенсибилизированных гомологичной культурой ДПГ и 0.albicans шт.846 оказалось, что все фракций концентрата ХМ-300 и 1-я фракция диализата ХМ-300 по разре-днащей, способности в гомологичной системе не отличаются существенно от исходного препарата, а фракции 2 и 3 диализата в использованном интервале доз практически не выявляли I3T к антигенам ДПГ. Изследо-"вашШе' фракции однако отличались по способности выявлять ГЗГ к ан-. тигеном С.albicans. Удалось выявлть 2.фракции; одну, из концентрата ХМ-300, выходящую при концентрации fiaCl 0,09 М, а другу« из. диализата ХМ-300 кк, выходящую с фронтом .стартового буфера -. которые выявляли гаТ к антигенам С.albicans мт.84Б и дозах более, чем в 20 раз превышающих дозы, выявляющие ГЗГ к антигенам гомологичной культуры ДПР.

■ Поскольку выход фракции из-диализата'ХМ-300 был значительно выше, чем выход фракции из концентрата. КЖ ХМ-300, было сделано. заключениечто первая представляет больший'интерес в плане ее использования как диагностического аллергена.

. Таблица 4

Разреваю&ая способность Фракций концентрата' и' диализата ХМ-300 101 СДгор1са11о, полученных датодом ионоизШанноЙ Хроматографии

Наименование Е%д (мкг Сэлка) при сенсибилизации

с. 1,гор1са11з 0.а1Ь1сапз

Концентрат Ш (нсх) Концентрат ХЙ-300 1 фракция 2 фракция 3 фрэкийя 0,85(0,40-1,20) 0,60(0,30-1,22) '0,50(0,35-0,90) 0,56(0,36-0,90) 0,5Э(0,30-1,20) бо^еэ 10 ^ 2, С£> (0,50-В, 00)

Дйатэа*. 5Й-ЗСЮ 1 фракция 2 фракция • & 3 фрзкцйя 0,50(0,40-0,85) более 10 более 10 более Ю-более 10 более 10

Относительная специфичность в аллерготестах у фракций 2 диализата ХМ-ЗОТ ККЖ, полученный ионообменной хроматографией, оказалась ваше,.чем У фракция I диализата ХМ-300 ЮТ и фракций 1 и 3 целого~ ККЖ, очищенных гель-хроматографией на БерЬасгу! 3-2ГО.

Анализ фракции I даалйзата 554-300 ККЖ методом ШЮС вняВйл Гетерогенность составляющих ее компонентов по молекулярной кассе щ в частности, наличие биополимеров с молекулярной массой >2О0 кД, 150 кД, 45 кД, 3 кД и менее I кД. Эта фракция также "содержала компоненты с разной электрофоретической подвижностью, однако (как было сказано выше) в ней отсутствовал "высокоподвизшнй" компонент, идентифицируемый ранее в "относительно специфичннх" фракциях, полученных' методом мембранной фильтрации и гель-хроматографш. Учитывая Это, мн предположили, что "высокоподвижный" компонент содержит антйген нне детерминанты, общие* для разных представителей" ДПГ и более высокая специфичность препарата, полученного методом ионообменной хро-

матографш связана с удалением этого компонента в нроцьссе очистки. Вышесказанное предположение было подтверждено результатами аллерго-теотирования, когда очищенный "шсокоподшшнй" компонент использовали для разрешения морских свинок, сенсибилизированных культурой гомологичного.штамма ДОГ или О.albicans, и при этом "его активность была идентична как в гомологичной, так и а гетерологичных системах.

Таким Образом, используя целые клетки и среду культивирования промышленных штаммов ДП1' - C.maltoßa и с.tropicalis наш получены аллергенные препараты, которые содержат компоненты, отличающиеся по молекулярной массе, антигенной активности и электрофоретичаской подвижности. Исследования диагностической ценности показали, что и ППА и ААК НЖ способны в дозах, составляющие десятые доли миг, выявлять гиперчувствительносгь к антигенам егих промышленных штаммов. При значительно более высоких дозах ети~*препараты выявляют также, .гиперчувствительность и к антигенам С.albicans. Последнее обстоятельство обусловлено, по-видимому, высокой степенью антигенного родства разных представителей ДПГ рода Candida-.и присутствием в полученных препаратах некоторого количества перекрестно-реагирующих антигенных детерминант, имеющихся в наличие у С.albicans. Различие (более чем в 20 раз) в количественных характеристиках активности ' одних и тех жэ препаратов при титровании в гомо- и гетерологичных системах свидетельствует все жа о достаточно высокой специфичности полученных аллергенов.

.' Для повышения эффективности анализа специфической ' кандидосен-сибилизации у рабочих микробиологического производства необходимо, на нага- взгляд, использовать на ряду с диагностическим алларгеном из штамма продуцента .также аллерген из С.albicans. Правильная оценка и. сравнит«, результатов Ьллэрготестировг>иия с дамоаыо такого набора аллергенов позволит более точно устадаг тевэтч- природу специфической

_J9

кандадосенсибилиэации. .

Полученные нами препараты были исшльвовани в работе Рижского медицинского института МЗ Латв.ССР по гигиеническому нормированию штаммов - продуцентов ширина,используемых в настоящее время (или используемых .ранее) на предприятиях микробиологического синтеза. По результатам этой работы Минздравом ССОР установлены и утверждены ПДК живых клеток втаммов - продуцентов паприна в воздухе.. рабочей зоны (Таблица.Б}. . ' .

Таблица б

Характеристика штаммов ДОГр. Candida - продуцентов, паприйв

Штамм Завод БВК ГЪд применения ПДК ветвых клеток в воздуха рабочей зоны (список МЗ ССОР)

(город) начало окончание

ВСЕ 5G9 Кириши 1974 1987 I х I 03

ВСЕ 777 Светлнй Яр 1976 гэаэ • 5 х IQ2

BOB 899 Новополоцк Кстово . Кременчуг Мозырь 1982.-^ по н&от.вр. I х I03 ,

ВСЕ 928 Светлый Яр 1983 по наст.вр. 3 x10й

ВСЕ 925 подсев в летн время - : ■ - 3 X I02

ВЫВОДЫ .

X.Разработаны методические подходы к выделений антигенноактив-ных компонентов как из клеток ДОГ бээдэструкцяоНным способом* так и из культуральной яидкости. Г1 ■ '

2.Установлено, что ППА и ААК ЮК представляют собой комплексные биополимеры, компоненты которых различаются по молекулярным массам, электрофоретической подвикности, антигенной активности и способны в микродозах выявлять гиперчувствительностъ, к антигенам ■ гомологичного промышленного штамма.

3.Показано, «до стушзкчат&я очистка и фракционирование комплексного препарата, существенно пошшает содервшша в активных фракциях специфического компонента.

4.Предложены б качестве диагностического аллергена для дифференцированного выявления кандидосеьсибилизации, обусловленной промышленными шташами ДПГ очищенные фракции ППА. и КЖ с молекулярной массой более 200 кД и слабой элекгрофоретичеекой1 иодшщюстью, несущие .специфичные антигенные детераашанты и в модельных опытах на животных в определенном интервале доз специфично выявлякщие гиперчувствительность к антигенам гомологичного иташа-продуцента щщрд-

' на.

--------б .Для' повышения -ьЗфактевнооти анализа на сшцифлческуй канди-

досенсиОшшзациш, индуцированную введением техногенного и?шт ДПГ, на ряду с диагностическим аллергеном на гомологичного продуцента целесообразно так» использовать аллерген из С.albicans. Правильная оценка н сравнение результатов аялерготестирования с помощью такого набора,аллергенов позволило бы наиболее точно установить природу кандидосенсибилизацни у обследованных людей.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

I.Выделение поверхностных антигенов грибов p.Candida, их им-мунохнмическая харктерисгика и оценка пригодности для аплергстести-рования //Лабораторные методы и их применение для диагностики проф-аллергозов, обусловленных аллергенами химической и биологической природы:; Сб^науч. трудов'НИИ гигиены,им.Ф.Ф.Эрисмана.-Москва, 1986, c.7G-82.T В соавт.

' ^.'Сравнительная оценка сенсибилизирующей активности дрожкшо-■ дойных грибов рода Candida, предполагаемых к внедрению в производство кормового;, бйлка'' //МотодиЧоскве рекомендации• -Ыооша;' 1985, VC.3-;I'2.- В со-шт. '' ,

3.ЕнД' ленио поверхностных антигенов С.maltosa, ответстветшй зи квндил сенсибилизацию и их иммунохимичоская характеристика / '.опросы ¡••■едацинской химии. - 1984, & 4, с.42-46. - В соавт.

4.Сра: нительная оценка сенсибилизирующей способности дроюкапо-д 'ных гри 'ов рода Candida, используемых э производстве кордового бита //Гй-'ненэ труда и профессиональная патология; Сб.науч.тр. Рижского мед.ин-та. - 1987, с.81-84. - В соавт.

5.Определение иммунохимическими методами д^о^йввого белка в воздухе //Биотехнология.- 1983, 'г.4, Я 3, с.373-376. - В соавт.

6.Апробация пригодности ккмуноглобулянового эритроцитарного диагностикума для оценки содержания балка папринэ в воздухе селитебных зон, прилегающих к заводам Оелково-влтвмикшх концентратов //Гигиенические аспекты изучения биологического загрязнения объектов окружающей среда: Тез. X Всесовз.конф,- Ташкент,- 1988, ч.2, с.13-15. - В соавт.

7,К вопросу об установлении показателя относительной аллергенной активности штаммов продуцентов кормового белка //Охрана окружающей среды на предприятиях медицинской и микробиологической промышленности СССР //Тез.науч.техн.конф, - Новополоцк. - 1988, с.GOBS. - В соавт. •

8.Оценка степени серологического родства поЕорхкостных струк-

I

тур Candida maltosa и С.albicans //ЖМЭИ.- 1989, Л 10, с.77-80. - В соавт.

9. Имму но химическое изучение поворхностшх глмкоконыогатов дрожженодобных грибов рода Candida //Прикладная бяоигмия и микробиология. - 1989, Т.23, Л I, С.46-51. - В CoásT.

10.Экспериментальное изучение пшерчувстштельности немедленного типа, развивающейся после введения клеток и антигенных субстанций С.maltosa и С.rugosa //Микология Я флтопатолопш. - 1939,

т.23, № I, с.46-51. - В'соавт.

■II.Исследование севсибилизирувдей способности дрокжеподобньх грибов родь Candida, используемых в производстве кормового редка //Гигиена и санитария; ~ I98S, Л 6, с.77-79. - В соавт.

12.Выделение антигекшактивных биополимеров культуральной жидкости Candida maltosa с целью получения диагностически ценных аллергенов для обследования работах микробиологических производств //Гигиана труда и профессиональные заболевания. - 1991, КЗ, с .3334, - В соавт.

13.Подходы к разработке диагностических аллергенов для обследования рабочих, занятых в производстве микробных биомасс кормового назначения, и населенйя селитебных зон в регионах расцолоиения ыик-

- робиологических производств //Пшнща труда и профессиональные заболевания. - 1991, Jf6, с.32-35. - В соавт.