Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поведение экзогенных доноров NO в организме животных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Поведение экзогенных доноров NO в организме животных"

На правах рукописи

БРАЖНИКОВА НАДЕЖДА ВЛАДИЛЕНОВНА

ПОВЕДЕНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ДОНОРОВ N0 В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ

Специальность 03.00.02 - биофизика Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических .наук

Москва, 2004

Работа выполнена в Институте химической физики им. Н.Н.Семенова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

А.Ф.Ванин

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Э.Г.Розанцев

Е.Б.Манухина

Ведущая организация:

Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Диссертационного Совета Д 002.039.01 в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской Академии Наук по адресу: 119991 ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН.

Защита состоится

в 11 часов на заседании

Антореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

М.А. Смотряева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. За последние 15 лет было показано, что в организме животных и человека практически во всех органах и тканях ферментативным путем непрерывно продуцируется простейшее химическое соединение - оксид азота (N0). Оказалось, что в качестве универсального регулятора это соединение управляет многочисленными биохимическими процессами. Оксид азота необходим для установления нормального тонуса кровеносных сосудов, для нормального функционирования секреторных тканей. Продуциру-ясь в нервных окончаниях вегетативной нервной системы, оксид азота участвует в регуляции функционирования желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы. Оксид азота продуцируется и в центральной нервной системе, обеспечивая установление длительных связей между нейронами мозга (долговременная память), так что N0 необходим для обучения и творческой деятельности человека.

Синтез N0 осуществляется так называемыми NO-синтазами (NOS), в качестве единственного субстрата NOS выступает аминокислота L-аргинин (L-Arg.).

Стационарный уровень N0, определяемый .скоростями его синтеза и гибели, в норме не превышает нескольких микромолей. Именно при этих концентрациях N0 оказывает регуляторное действие на метаболические процессы. Вместе с тем, стационарный уровень N0 может повышаться до сотни микромолей. Эта ситуация характерна для активированных иммучо-компетентных клеток - макрофагов и нейтрофилов.

N0, генерируемый в больших концентрациях иммунокомпетентными клетками, оказывает цитотоксическое действие, что позволяет ему функционировать в качестве одного из основных эффекторов системы клеточного иммунитета. Предполагается, что это оружие используется иммунной сисге-

. --С. НАЦИОНАЛЬНАЯ I

1 библиотека I

1 rare

мой для защиты организма, как от бактериальной, так и злокачественной инвазии.

В настоящее время становится все более очевидным, что функционирование N0 в организме как свободно диффундирующей между клетками и тканями молекулы, малоэффективно. В свободном состоянии молекула N0 быстро погибает в различных реакциях, приводящих к его окислению в нит-ррты и нитраты. Есть основание полагать, что реализация действия N0, как правило, обеспечивается включением N0 в некоторые соединения, защищающие его от быстрой гибели. В качестве таких соединений предположительно выступают S-нитрозотиолы (RS-NO) или динитрозильные комплексы негемового железа (ДНКЖ). Эндогенное происхождение этих соединений, по крайней мере на клеточных культурах, в настоящее время доказано; - их образование связано с ферментативной генерацией N0 из L-аргинина и оно подавляется ингибиторами NO-синтаз. Оба типа соединений легко синтезировать in vitro, что позволяет использовать эти соединения для детального исследования их поведения в организме животных. Очевидно, что в этом случае перед исследователем встают три основные проблемы: во-первых, какие превращения совершают указанные соединения в клетках и тканях; во-вторых, какое действие они могут оказывать на системы и на организм в це-лом1; в-третьих, какие вещества могут влиять на время их жизни в клетках, тканях и т.д. Изучению этих проблем и посвящена настоящая диссертационная работа. Кроме того, понимание особенности поведения S-нитрозотиолов и ДНКЖ в организме животных может способствовать установлению механизмов биологического действия лекарственных соединений, активным началом которых выступает N0. К таковым относятся, например, органические нитраты, наиболее известным представителем которых является нитрогли-цеэин.

Сейчас происходит усиленный поиск и синтез NO-доноров, которые могут составить основу будущих лекарственных средств. Не исключено, что

метаболизм этих лекарственных средств сопряжен с синтезом из них RS-NO иДНКЖ.

Цель работы состоит в изучении факторов, влияющих на образовав ие ДНКЖ в организме животных по L-аргинин-зависимому пути. Ранее та вое образование было обнаружено только на клеточных культурах. Единственным методом, позволившим зарегистрировать в них эндогенные ДНКЖ, является спектроскопия ЭПР: ДНКЖ характеризуются специфическим сигналом ЭПР с gq, = 2,03 (сигналом 2,03).

В связи с этим в задачи исследования входит:

1. Проверка способности экзогенных спиновых ловушек - желе:ю-дитиокарбаматных комплексов - образовывать в организме животных парамагнитные мононитрозильные комплексы, регистрируемые методом ЭПР.

2. Изучение методом ЭПР поведения экзогенных ДНКЖ в организме животных.

3. Проверка возможности образования ДНКЖ в организме животных при участии экзогенных S-нитрозотиолов.

4. Изучение влияния железа, как компонента ДНКЖ, на образование ск-сида азота в организме животных.

5. Изучение влияния разнообразных агентов (восстановителей, желеча, тиолов и т.д.) на образование ДНКЖ в организме животных.

Материалы и методы исследования. В работе использованы методы электронного парамагнитного резонанса и оптической спектрофотометрии. Эксперименты проведены на белых беспородных мышах-самцах (18—20 г) и крысах-самцах линии Вистар (100—150 г). Дня улавливания оксида азота в тканях животных использована его способность образовывать с Fe2+ и ди-этилдитиокарбаматом (ДЭТК) парамагнитные мононитрозильные комплексы железа (МНКЖ), регистрируемые методом ЭПР.

Спектры ЭПР. изолированных тканей регистрировались при 77 К на радиоспектрометрах "Radiopan" (Польша), "Bruker" (Германия) и ЭПР-В в X-диапазоне при СВЧ-мощности 5 мВт, амплитуде модуляции магнитного поля 0,5 мТ или при комнатной температуре, при СВЧ-мощности 1 мВт и ВЧ модуляции поля 0,5 мТ. В экспериментах были использованы липополисаха-риц из E.coli (serotype 005 :В5) ("Sigma", США), диэтилдитиокарбамат натрия ("Serva", США), FeSO4 ("Fluka", Швейцария), глутатион восстановленный ("Reanal", Венгрия), L-цистеин ("Sigma", США), тиосульфат натрия (хл.), нигро-Ь-аргинин (NLA) ("Sigma", США). ДНКЖ с L-цистеином, глутатио-ном, тиосульфатом натрия или фосфатом натрия были получены обработкой газообразным N0 в сосуде Тунберга при давлении NO 150-200 мм рт.ст. при молярном соотношении FeS04 к вышеперечисленным реагентам 1:2 или 1:20, как описано ранее /Vanin et al, 1996/. Для количественной оценки концентрации МНКЖ-ДЭТК, возникающих в печени мышей, их сигналы сопоставляли с сигналами аналогичных комплексов с известной концентрацией, синтезированных в растворе диметилсульфоксида по методике, разработан-ноя профессором Ваниным А.Ф. /Vanin, 1998/. Оценивались средняя величина и среднеквадратичное отклонение (М±м) для 10-25 измерений на различных животных. Научная новизна.

1. Впервые обнаружено образование ДНКЖ в тканях животных при участии NO, продуцируемого ферментативным путем из L-аргинина. Показано, что для этого необходимо вводить животным тиосульфат, ослабляющий действие супероксида на ДНКЖ.

2. Показано, что использование железо-дитиокарбаматных комплексов позволяет обнаруживать методом ЭПР в организме животных оксид азота, образующийся по L-аргинин-зависимому пути. АВС-модификация метода, устраняющая влияние супероксида на уровень парамагнитных нитрозо-аддуктов железо-дитиокарбаматных комплек-

сов, резко повышает количество регистрируемого таким образом оксида азота в организме животных. 3. Показано, что введение животным железа вместе с ДЭТК повышает уровень МНКЖ в печени. Предполагается, что в ответ на проокси-дантное действие железа в клетках быстро активизируется антиокси-дантная защита (например, генерация восстановленного глутатиона), что и приводит к снижению уровня супероксида и повышению уроння МНКЖ.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для создания нового класса фармакологических средств — доноров N0, ионов нитрозония (NO"1) и групп Fe+(NO+)2, которые могут выступать в качестве сердечно-сосудистых и антитромботических лекарств. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции «Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве», Казань, 1988; Международной конференции "EPR-spectroscopy of nitric oxide in biological systems", Суздаль, 1996; Всероссийской конференции «Физика.и химия элементарных химических процессов», Черноголовка, 1997; The 5 International Conference of Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes, Moscow, 1997; International Symposium on Nitric Oxide in Health and Diseases. Kumamoto, Japan, 1997.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 научные статьи и 5 тезисов докладов. Основные положения, выносимые на защиту:

— комплексы железа с диэтилдитиокарбаматом (ДЭТК) способны выступать в качестве ловушки оксида азота. .

— динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ), вводимые в организм животных, разрушаются ДЭТК с образованием парамагнитных МНКЖ-ДЭТК.

— ЛПС резко усиливает образование МНКЖ-ДЭТК, что обусловлено усилением синтеза N0, осуществляемого iNOS.

— введение железа (II) усиливает синтез N0 в организме животных.

— введение тиосульфата в организм животных, обработанных ЛПС, приводит к стабилизации эндогенных ДНКЖ и возможности их регистрации методом ЭПР.

— проведенные исследования показывают, что ДНКЖ могут возникать в

организме животных при участии оксида азота, образующегося по L-аргинин-зависимому пути.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 106 страницах текста, содержит 3 таблицы, 15 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, списка литературы (14р источника).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Железо, как индуктор образования оксида азота в организме животных.

В 80-х годах в лаборатории А.Ф. Ванина /Ванин и др., 1984/ было предложено использовать для улавливания оксида азота в организме животных комплексы двухвалентного железа с диэтилдитиокарбаматом (ДЭТК). Нитроз о-аддукты этих комплексов - мононитрозильные комплексы железа с ДЭТК (МНКЖ-ДЭТК) - парамагнитны и регистрируются методом ЭПР. Из-за своей гидрофобности комплексы локализуются в клеточных мембранах.

Проведенные нами исследования показали, что комплексы Ре2+-ДЭТК способны улавливать эндогенный оксид азота, как постоянно образующийся ферментативным путем из L-аргинина, так и стимулируемый введением жи-вслным липополисахарида (ЛПС) бактериального происхождения. В обоих

случаях ингибитор NO-синтаз - N-HHTpo-L-аргинин практически полностью подавлял образование МНКЖ-ДЭТК.

Образование МНКЖ-ДЭТК наблюдалось у контрольных животных - у крыс и мышей - через 20-30 минут после введения им ДЭТК без железа. В печени этих животных при 77К регистрировался триплетный сигнал ЭПР при g ~ 2,04, характерный для МНКЖ-ДЭТК (рис.1б,в). Его интенсивность соответствовала включению в эти комплексы в среднем 3,0 ± 1,0 нм и 1,0 ± 0,4 им оксида азота на 1 г влажной ткани у мышей и крыс (п = 80 и 10, р<0,05), соответственно. В других органах (почки, сердце, селезенка, легкие) интенсивность этих сигналов была в 5-10 раз ниже. При одновременном введении животным ДЭТК и цитратного комплекса железа образование МНКЖ-ДЭТК в печени резко усиливалось, достигая в среднем уровня, соответствующего включению в эти комплексы 9,0± 1,6 и 15±7 нм оксида азота на 1 г влажной ткани у мышей и крыс (п=130 и 10, р<0,05) (рис.1д), соответственно.

На образование МНКЖ-ДЭТК у мышей не влияло валентное состояние вводимого железа — замена Fe2+ на Fe3+ или смесь Fe2+/Fe3+ (1:1) в нх цитратных комплексах. Для предотвращения осаждения комплексов желез а-ДЭТК их компоненты вводили раздельно: железо в форме цитратного комплекса вводили внутримышечно в бедро, а ДЭТК - внутрибрюшинно.

Вариация дозы железа в пределах 1-30 мг Fe на 1 кг веса существенно не сказывалась на количестве МНКЖ-ДЭТК, образующихся в печени мн-шей. При большой концентрации железа

начиналась гибель животных. Поэтому мы остановились на промежуточной концентрации железа - 6,0 мг/кг (~100 мкМ на 1кг), для которой и была проведена оценка уровня образующегося МНКЖ- ДЭТК у мышей. Крысам вводили 40 мг Fe в расчете на 1 кг веса.

Усиление образования МНКЖ-ДЭТК у животных после введения им цитратного комплекса железа могло быть обусловлено возникновением в тканях животных большего количества ловушек NO - комплексов Fe2+-ДЭТК. Последнее могло оказать влияние на образование МНКЖ-ДЭТК

д=2,01 г, в и? щ

мм

Рис. 1.

Спектры ЭПР печени крыс и мышей: а - печень интактной мыши; б,в - печень контрольных животных - крысы и мыши, обработанных ДЭТК без железа; д - печень мыши, обработанной ДЭТК + Бе; г -сигнал ЭПР комплексов Си2+ - ДЭТК в диметилсульфоксиде. 015 Р, у, о' - компоненты СТС при ^ в сигнале Си2+ - ДЭТК. Запись при 77К.

том случае, когда этот процесс лимитировался бы в тканях не содержав ем в них оксида азота, а количеством его ловушек - комплексов Ре2+-ДЭТК. Для проверки такой возможности контрольным и подопытным животным вводили водный раствор продуцента оксида азота - 0,2 мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия. Это приводило к резкому усилению образования МНКЖ-ДЭТК, У контрольных животных их количество в печени повышалось более чем в 10 раз (30 ± 5 нм на 1 г влажной ткани), у опытных (с введением железа) - в 3 раза (30 ± 5 нм на 1 г влажной ткани). Существенно, что у первых количество МНКЖ- ДЭТК в печени было примерно в 3 раза выше, чем в печени мышей, которым вводили Fe-цитрат+ДЭТК без нитрита. Это означает, что у контрольных животных одного введения ДЭТК достаточно, чтобы при участии эндогенного железа в печени возникло такое количество комплексов Ре2+-ДЭТК, которое не лимитировало бы образование в этой ткани МНКЖ-ДЭТК. Таким лимитирующим компонентом у контрольных животных » отсутствие нитрита был оксид азота, образующийся из эндогенных источников. После введения животным нитрита образование МНКЖ-ДЭТК лимитировалось уже количеством ловушек - комплексов Ре2+-ДЭТК. Таким образом, усиление образования МНКЖ-ДЭТК у подопытных животных, инициированное введением цитратного комплекса железа, было обусловлено только усилением образования в организме этих животных оксида азота, возникавшего из эндогенных источников.

Образование оксида азота в организме мышей резко усиливалось с введением им индуктора воспалительных процессов - бактериального липо-полисахарида (ЛПС). Это усиление наблюдалось через 3-4 часа после введения ЛПС, что, по современным данным, соответствовало окончанию синтеза у животных индуцибельной изоформы NOS - iNOS. Концентрация МНКЖ-ДЭТК в печени через 30 минут после введения Fe и ДЭТК возрастала до 200 нм на 1г влажной ткани. В других органах она была в 5-10 раз ниже. Характерно, что и в этих опытах наблюдалась 5-10кратная разница между урозня-

м i МНКЖ-ДЭТК, возникавших у мышей при введении им только ДЭТК или ДЭТК и Fe. Ингибитор NOS - нитроаргинин в 5-10 раз снижал уровень МНКЖ-ДЭТК у мышей, обработанных Л ПС.

Таким образом, комплексы ДЭТК с железом могут выступать как чувствительные индикаторы оксида азота в организме животных. Экзогенное железо усиливает образование нитрозо-аддуктов, обеспечивая усиление синтеза N0.

Fe-ДЭТК как ловушки экзогенного N0 в организме животных.

Комплексы железа с ДЭТК эффективно превращались в МНКЖ-ДЭТК при введении животным экзбгенных доноров N0 - нитрита, ДНКЖ с цистеином или глутатионом и различных S-нитрозотиолов. Концентрация вводимых доноров N0 равнялась концентрации ловушки N0 - 100 мкМ на 1п\ Концентрация образующихся МНКЖ-ДЭТК в печени достигала 70-80 MICM на 1кг (70-80 нм на 1 г влажной ткани) и этот уровень не изменялся, если доноры NO вводили в концентрации в 2 раза большей. Этот результат означает, что эффективность улавливания NO комплексами Fe2+- ДЭТК лимитировалась содержанием этих комплексов.

Поведение экзогенных S-нитрозотиолов (S-нитрозоцистеина, S-нитрозоглутатиона) и ДНКЖ с цистеином или глутатаионом в организме мышей

При внутрибрюшинном введении мышам свежеприготовленного рас-lEopa Cys-NO (200 мкМ на 1кг) через 30 минут в крови и печени животных регистрировали интенсивный сигнал ЭПР нитрозогемоглобина (рис.2а). Его интенсивность соответствовала включению в эти комплексы 40 нм NO на 1 г влажной ткани как в крови, так и в печени. В печени наблюдался также сигнал ЭПР ДНКЖ (сигнал 2,03) с концентрацией 1 нм на 1г влажной ткани (рис.2в), в крови этот комплекс не обнаруживался (рис.2а, табл.1).

— и —

2,012 2,012 1.94 2,0 2,037 2,0 2,037 1,94 2,0 2,037

Рис. 2.

Сигналы ЭПР нитрозильного комплекса гемоглобина (№-N0) (а), комплекса 2,03 (б) и их суммарный сигнал (в), регистрируемые в печени и крови. Запись сигналов при 77К и амплитуде модуляции 0,5 мТ.

Таблица 1.

Концентрация NO, включившегося в комплексы 2,03 и Hb-NO (нмоль/г влажной ткани) в крови и печени мышей через 30 мин после в/б введения им Cys-NO (0,2 ммоль/кг), его смеси с Fe-цитратом (0,1 ммоль/кг) и Cys (4 мкмоль/кг), а также ДНКЖ-Cys 1:20 (0,1 ммоль/кг) или ДНКЖ-Cys 1:2 (0,1 ммоль/кг).

Кровь Печень

Введение №-N0 Комплекс 2,03 №-N0 Комплекс 2,03

СуБ-Ю 40±10 0 40±10 1±1

Суз-Ш+ре-цитрат 40±10 8±2 40±10 3+1

Суэ-МО+Суэ 40110 8±2 40±10 4±2

Суз-ЫО+Ре-цитрат +Суэ 100±30 100+10 100±20 50±5

ДНЮК-Суэ 1:20 110±20 110±30 100±20 60±10

ДНКЖ-Суз 1:2 50±5 60±10 50±10 30±5

Приведены средние значения и среднеквадратичные

отклонения по результатам измерений на 5-7 животных.

Предполагается, что в гемоглобин включено 4 молекулы N0.

При раздельном введении мышам Сув^О (внутрибрюшинно) и цитратного комплекса железа 100 мкМ на 1 кг (в мышцу бедра) интенсивность сигнала 2,03 в печени возрастала в 3 раза. Сигн.зл 2,03 регистрировался и в крови животных с концентрацией 8 нм на 1 мл ]срови (табл.1). Комплексы 2,03 возникали также в печени и крови мышей' при внутрибрюшинном введении раствора Сув^О + Сув (4 мкМ на 1 кг) (табл.1). При одновременном введении с Сув^О + Сув цитратного комплекса железа уровень ДНКЖ в крови и печени резко возрастал, соответственно, до 100 и 50 нм на 1 г ткани, т.е. в этих комплексах обнаруживались 10% и 5% «веденного железа (табл.1). Аналогичный уровень ДНКЖ обнаруживался в крови и печени в том случае, когда цитратный комплекс Fe смешивали с раствором Сув^О + Сув до его введения животным. При этом раствор менял окраску от розовой до зеленой, что было обусловлено распадом Сув^О с сопутствующим образованием ДНКЖ с цистеином (табл.1). О последнем свидетельствовала регистрация сигнала 2,03 в растворе, интенсивность которого соответствовала включению в ДНКЖ с цистеином всего введенного железа (100 мкМ). Характерно, что сигнал 2,03 обнаруживался в растворе Сув^О + Сув и без добавления железа. Интенсивность сигнала ЭПР соответствовала 1 нМ комплексов, что было равно количеству примесного железа (1 мкМ). Концентрация последнего определялась обработкой газообразным N0 4 мМ раствора цистеина. В этом растворе возникали ДНКЖ с концентрацией 1 мкМ. Аналогичные концентрации ДНКЖ были получены в крови и печени при введении животным растворов парамагнитных мономерных ДНКЖ с Сув (1:20) в дозе 100 мкМ на 1кг. При введении животным диамагнитных (димерных) ДНКЖ с Сув (1:2) концентрация ДНКЖ в крови и печени снижалась в 2 раза. Форма и параметры сигнала 2,03, регистрируемого в крови и печени мышей в этих опытах, не изменялась при изменении температуры записи спектра от 77К до комнатной.

Влияние тиосульфата на уровень ДНКЖ в организме животных

Приведенные выше данные показывают, что введение животным Cys-NO, как донора оксида азота, в особенности вместе с железом, приводит к заметному повышению уровня ДНКЖ в тканях животных. Аналогичный результат был получен при выдерживании животных на питьевой диете с нитритом. В соответствии с ранее опубликованными данными /Ванин и др., 1977, Vanin et al, 1998/, сигнал ЭПР этих комплексов начинал регистрироваться через 5-7 дней нахождения животных на указанной диете и далее поддерживался на постоянном стационарном уровне (рис.Зе).

Можно было ожидать, что и у животных, обработанных ЛПС могут возникать ДНКЖ. Инъекция мышам ЛПС вызывала через 3,5 часа резкое усиление образования N0, обнаруживаемого по уровню парамагнитных МНКЖ-ДЭТК, включающих в себя N0. Блокада этого синтеза неселективным ингибитором NOS - N-нитро-Ьаргинином приводила к снижению содержания этих комплексов практически до нулевого уровня (рис.3а,б). Однако, образование динитрозильных комплексов негемового железа с эндогенными лигандами (ДНКЖ) у этих животных не обнаруживалось (рис.Зв). Различные воздействия, которые в соответствии с результатами исследований ДНКЖ на клеточных культурах должны были повышать уровень ДНКЖ в тканях животных (введение животным повышенного количества глюкозы /Watts et al, 2001/, блокада синтеза глутатиона /Watts et al, 2002/, введение L-аргинина, как источника эндогенного N0), не влияли на этот результат. Интересно, что у животных, находившихся на питьевой диете с нитритом, а затем подвергнутых воздействию ЛПС, приводящим к повышению уровня N0 в организме, содержание ДНКЖ не повышалось, а даже снижалось (рис.Зж).

Аналогичный результат был получен на мышах, предварительно обработанных ЛПС, при последующем введении им экзогенных ДНКЖ с глута-тионом или цистеином (50 мкМ на 1кг живого веса) (табл.2).

_J<_

g- 2,045 3,0 1 94 2,04 2,1) 1,94 2,04 2,014 2 0 194

I ' ' • 1 1 1 I ' 1 ''

J. ^оЫ

\iAr /I

5mT 5щГ 5 mT *—Ь i—В ,_ в

Рис.3.

Левая и средняя панели: спектры ЭПР печени мышей, обработанных ЛПС, с последующим (через 4 часа) введением (а,б) железо-цигратного комплекса и ДЭТК, (в) хелезо-цитратного комплекса или (г,д) железо-цитратного комплекса и тиосульфата. Животным групп (б) и (д) через 2,5 часа после ЛПС введён NLA. Животных забивали через 15 мин после введения железо-цитратного комплекса, ДЭТК или тиосульфата. Правая панель: спектры ЭПР в печени мышей, находившихся в течение 7 дней на питьевой воде с нитритом и железо-цитратным комплексом (е) с последующей их обработкой ЛПС (ж). Спектры регистрировали при 77К.

Таблица 2.

Влияние бактериального ЛПС на количество ДНКЖ (в нмолях/г сырого веса ткани), обнаруживаемых в печени мышей после введения им экзогенных ДНКЖ с различными лигандами (50 мкмоля/кг живого веса).

Вводимые ДНКЖ Контрольные животные Животные, обработанные ЛПС

ДНКЖ-цис, 1:20 80 0 + 20,0 60,0 ±20,0

ДНКЖ-глу, 1:20 70 0 ±20,0 64,0 ±20,0

ДНКЖ-тс, 1:20 80 0 ±20,0 184,0 ±20,0

Контрольные животные: ДНКЖ, 1ч.

Животные, обработанные ЛПС: ЛПС,Зч; ДНКЖ, 1ч.

Обработка животных ЛПС, вызывающая усиленный синтез N0 из эндогенных источников, приводила не к повышению уровня ДНКЖ, а, в ряде случаев, к его снижению (табл.2). Иной результат был получен при введении мышам, обработанным ЛПС, низкомолекулярных ДНКЖ с тиосульфатом (50 мкМ на 1кг живого веса). В печени этих животных уровень белковых ДНКЖ был в 2-2,5 раза выше, чем у контрольных животных, которым вводили тот же низкомолекулярный ДНКЖ (табл.2). Очевидно, тиосульфат стабилизировал эти комплексы, включаясь в белковые ДНКЖ вместо лигандов нетиоло-вой природы, например, вместо остатков гистидина. Такое замещение наблюдалось ранее и описано в работе /Валин и др., 1977/. В связи с этим можно предположить, что введение тиосульфата животным, продуцирующим N0 из L-аргинина, может обеспечить стабилизацию не только экзогенных, но и эндогенных ДНКЖ. Действительно, при введении этого соединения вместе с цитратным комплексом двухвалентного железа (ферросульфат : цитрат = 1 : 5) в дозах 1250 мг тиосульфата и 30 мг ферросульфата на 1 кг живого веса мышам, обработанным ЛПС, через 15 мин в печени обнаруживался сигнал ЭПР ДНКЖ (рис.Зг). Его интенсивность достигала уровня, соответствующего 6 нм на 1 г сырого веса печени. Ингибитор NOS - N-нитро-L-аргинин полностью подавлял образование комплексов (рис. Зд). Этот результат показывает, что в ДНКЖ включался N0, образующийся ферментативным путём из L-аргинина.

Максимальное количество ДНКЖ достигалось на 10-15 мин после введения железа и тиосульфата, после чего уровень комплексов начинал снижаться (вплоть до нуля) на 30-40 мин. Данное снижение может быть обусловлено удалением тиосульфата из организма с мочой. Таким образом, впервые удалось продемонстрировать возникновение ДНКЖ у животных при участии оксида азота, образующегося по L-аргинин-зависимому пути. Это удалось показать, используя в качестве стабилизатора ДНКЖ тиосульфат, и это мы считаем главным результатом работы. Он, совместно с реззмь-

татами исследований на культуре клегок, создает основу для гипотезы о том, что ДНКЖ могут выступать в качестве эндогенных универсальных регуляторов биохимических и физиологических процессов. Эти комплексы могут выступать в качестве доноров свободных молекул N0, взаимодействующих с гемсодержащими белками, или в качестве доноров ионов нитрозония (N0*) и Fe+(N0+)2-групп, взаимодействующих с тиолсодержащими белками. Эксперименты показывают, что ДНКЖ в ряде случаев оказывают более активное действие, чем сам оксид азота и 8-нитрозотиолы. Если же учесть, что ДНКЖ сами по себе способны оказывать мощное вазодилатирующее и гипотензивное действие, а также способны подавлять агрегацию тромбоцитов, можно полагать, что ДНКЖ могут стать основой для создания нового класса фармакологических средств, а именно - сердечно-сосудистых и антитромбо-тических лекарств.

Основными агентами, снижающими у животных содержание ДНКЖ до ЭПР-неконтролируемого уровня, выступают, по-видимому, супероксид и пероксинитрит. Как будет показано ниже, они способны снижать и уровень МНКЖ-ДЭТК в организме мышей, обработанных ЛПС.

Влияние экзогенных ДНКЖ на уровень МНКЖ-ДЭТК в органах мышей, обработанных ЛПС

Ранее нашей группой было показано, что образующиеся парамагнитные МНКЖ-ДЭТК чувствительны к действию как супероксида, так и перок-синитрита /Уатп е! а1, 2001/. Их воздействие переводит комплексы в ЭПР-недектируемую, по-видимому, диамагнитную форму. Для преодоления этого эффекта был разработан так называемый АБС метод /Уапп е! а1, 2001/. Суть его состоит в проведении параллельных опытов на двух группах животных. В первой группе предполагается обршовывать в тканях МНКЖ-ДЭТК экзогенного происхождения. Данные комллексы, перехватывая на себя анионы супероксида и пероксинитрита, МОГ/Т обеспечить защиту от воздействия этих агентов большинства эндогенно образующихся МНКЖ-ДЭТК. Таким

_}С|_

образом, суммарная концентрация парамагнитных МНКЖ-ДЭТК будет описываться, как А+В-С, где А - концентрация сохранившихся парамагнитных экзогенных комплексов, В - концентрация парамагнитных комплексов эндогенного происхождения, а С - комплек:ы, перешедшие в реакции с суперок-сидом/пероксинитритом в ЭПР-недевггируемую форму. В параллельных опытах у животных подавляется синтез эндогенных МНКЖ-ДЭТК введением им ингибитора NOS. В результате суммарный уровень парамагнитных МНКЖ-ДЭТК в той же ткани будет примерно равен А-С. Предполагается, что величина С в обоих типах опытов будет одинаковой. Последнее может выполняться, если концентрация А с>тцественно больше величины В. Последующее вычитание интенсивности сигналов, регистрируемых в первой и второй группе животных, должно обеспечивать оценку эндогенных МНКЖ-ДЭТК (величину В). Для образования экзогенных МНКЖ-ДЭТК мышам, предварительно обработанным ЛПС, взодили ДНКЖ с глутатионом, фосфатом или тиосульфатом (50 мкМ на 1кг живого веса), а затем через 30 мин на последующие 30 минут ДЭТК и цитратный комплекс железа в дозах, указанных в методической части. Второй группе животных за 45 минут перед введением ДНКЖ вводили ингибитор NOS - NLA. Результаты опытов приведены в табл. 3 и на рис.4. Из них следует, что использование ДНКЖ с глута-тионом или фосфатом для образования в тканях экзогенных МНКЖ-ДЭТК или не даёт никакого "выигрыша" в концентрации эндогенных МНКЖ-ДЭТК (введение ДНКЖ с фосфатом) по сравнению с оценкой этих комплексов обычным методом (последний даёт величину В-С), или величина В ниже В-С и имеет даже отрицательное значение (введение ДНКЖ с глутатионом). При введении более устойчивых в организме животных ДНКЖ с тиосульфатом, для большинства тканей, в особенности для почек, селезёнки и мозга величина В, определённая ABC методом, имеет более высокое значение, чем величина В-С, определяемая обычным методом. Только для лёгких такого "выигрыша" не обнаруживалось.

Рис.4.

Спектры ЭПР печени мышей, обработанных ЛПС, с последующим (через 4 часа) введением им железо-цитратного комплекса + ДЭТК (а), или железо-цитратного комплекса + ДЭТК + ДНКЖ с тиосульфатом (б,г). Животным группы (г) через 2,5 часа после ЛПС вводили NLA. в - результат вычитания спектров (б) и (г). Спектры зарегистрированы при77К.

Таблица 3.

Влияние низкомолекулярных ДНКЖ на уровень МНКЖ-ДЭТК (в нмолях/г сырого веса ткани) в органах животных, обработанных ЛПС.

Вводимые ЛПС + ЛПС + №А+ ЛПС

ДНКЖ ДНКЖ ДНКЖ

В + А-С А-С В-С В

ДНКЖ-глу,1:20; 50 мкмоля/кг 8,0 ±2,0 18,0 ±6,0 8,0 ±2,0 -10,0

ДНКЖ-фос,1:20 50 мкмоля/кг 500 ±100 300 ±60 200 ±40 200

ДНКЖ-тс, 1:20, 50 мкмоля/кг:

печень 840 ±80 680 ±60 54 ±20 160

легкие 240 ±50 230 ±50 18 ± 6 10

почки 640 ±150 340 ±80 36 ±12 300

селезенка 240 ±40 180 ± 20 2,0 ±0,6 60

мозг 220 ±60 120 ±20 14 ± 4 100

Схема проведения эксперимента:

(В - С) - ЛПС,4ч; Ре-ДЭТК,30мин.

(В + А - С) - ЛПС,Зч45мин; ДНКЖ, 15 мин; Ре-ДЭТК,30 мин.

(А - С) - ЛПС,2ч; NLA,1445MHH; ДНКЖ, 15мин; Ре-ДЭТК,30 мин.

-22 -ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что ДНКЖ могут возникать в организме животных при участии оксида азота, образующегося по Ь-аргинин-зависимому пути.

2. Впервые установлено, что введение тиосульфата в организм животных, обработанных ЛПС, приводит к стабилизации эндогенных ДНКЖ, что обеспечивает их регистрацию методом ЭПР. Низкий уровень ДНКЖ у животных, обработанных ЛПС, определяется деструктивным действием на эти комплексы анионов супероксида и перокси-нитрита.

3. Показано, что комплексы железа с дизтилдитиокарбаматом (ДЭТК) способны выступать в качестве ловушек оксида азота. Связывание оксида азота приводит к образованию парамагнитных мононитрозиль-ных комплексов железа (МНКЖ), регистрируемых в органах животных методом ЭПР.

4. Установлено, что воспалительное действие бактериального эндотоксина (ЛПС) резко усиливает образование МНКЖ-ДЭТК, что обусловлено усилением синтеза N0, осуществляемого iNOS.

5. Показано, что введение железа (II) усиливает синтез N0 в организме животных.

- 23 -

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ванин А.Ф., Кубрина Л.Н., Курбанов И.С., Мордвинцев П.И., Храпова Н.В., Галаган М.Е., Матханов Э.И. Железо как индуктор образования окиси азота в организме животных.// Биохимия. 1989. Т.54. С.1974-1979.

2. Храпова Н.В., Маленкова И.В., Ванин А.Ф. S-нитрозотиолы и динитрозо-тиольные комплексы железа как источники оксида азота в организме жи-вотных.//Биофизика. 1995.Т.40.В.1. С.117-121.

3. Микоян В.Д., Сереженков ВА., Бражникова Н.В., Кубрина Л.Н., Хачатрян Г.Н., Ванин А.Ф. Образование парамагнитных нитрозильных комплексов негемового железа в организме животных при участии оксида азота из экзогенных и эндогенных источников.// Биофизика. 2004. Т.49. С. 121-127.

4. Мордвинцев П.И., Курбанов И.С., Кубрина Л.Н., Храпова Н.В., Ванин А.Ф. Изучение методом ЭПР содержания окиси азота в табачном дыме.// В сб. Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве. Казань. 1988. Т.2. С. 17.

5. Храпова Н.В., Воеводская Н.В., Ванин А.Ф. Interaction of S-nitrosoglutathione with non-cellular preparations of mice and rats livers: EPR studies.// Тезисы докладов Международной конференции "EPR-spectroscopy of nitric oxide in biological systems". Суздаль. 1996. С. 17.

6. Воеводская Н.В., Храпова Н.В., Ванин А.Ф. Деструктивное действие иона нитрозония на активные центры железосерных белков в тканях животных.// Тезисы докладов Всероссийской конференции «Физика и химия элементарных химических процессов», Черноголовка. 1997. С.28.

7. Voevodskaya N.V., Khrapova N.V., Vanin A.F. Destructive action of ni-trosonium ion on active centers of iron sulphur proteins in animals tissues.// The

5 International Conference of Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes. Moscow. 1997. P.21.

Voevodskaya N.V., Khrapova N.V., Vanin A.F. Destructive action of ni-trosonhim ion on active centers of iron sulphur proteins in animals tissues.// In: International Symposium on Nitric Oxide in Health and Diseases. Kumamoto. Japan. 1997. P. 15.

1Р?0 777

Подписано в печать 7/IX 2004 г Формат 60x84/16. Закао ЫаТ5. Тираж^ОО экз. П л.1.5 . Отпечатано в РИИС ФИ1Н с оригинал-макета заказчика. 119991 Москва, Ленинский проспект, 53. Тел. 132 5128

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Бражникова, Надежда Владиленовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1Л. ДНКЖ и S-нитрозотиолы.

1.2. S-нитрозотиолы в биообъектах.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА.

3.1. Железо, как индуктор образования оксида азота в организме животных.

3.2. Fe- ДЭТК, как ловушки экзогенного NO в организме животных.

3.3. Поведение экзогенных S-нитрозотиолов (S-нитрозоцистеина, S-нитрозоглутатиона) и ДНКЖ с цистеином или глутатионом в организме мышей.

3.4. Влияние тиосульфата на уровень ДНКЖ в организме животных.

3.5. Влияние экзогенных ДНКЖ на уровень МНКЖ-ДЭТК в органах мышей, обработанных ЛПС.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поведение экзогенных доноров NO в организме животных"

За последние 15 лет было показано, что в организме животных и человека практически во всех органах и тканях ферментативным путем непрерывно продуцируется простейшее химическое соединение - оксид азота (NO). Оказалось, что в качестве универсального регулятора это соединение управляет многочисленными биохимическими процессами. Оксид азота необходим для установления нормального тонуса кровеносных сосудов, для нормального функционирования секреторных тканей. Продуцируясь в нервных окончаниях вегетативной нервной системы, оксид азота участвует в регуляции функционирования желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы. Оксид азота продуцируется и в центральной нервной системе, обеспечивая установление длительных связей между нейронами мозга (долговременная память), так что N0 необходим для обучения и творческой деятельности человека.

Синтез N0 осуществляется так называемыми NO -синтазами (NOS), включающими в себя начальный восстановительный домен и второй -гемсодержащий домен фермента, продуцирующий N0. В качестве единственного субстрата NOS выступает аминокислота L - аргинин (L -Arg.). Окисление аминогруппы в гуанидиновом остатке этой кислоты приводит к превращению L-Arg в другую аминокислоту - L-цитруллин с выбросом свободной нейтральной молекулы NO. В организме свободная молекула NO быстро включается в реакцию с анионами супероксида (Ог")-Эта реакция приводит к образованию довольно токсичного из-за высокой окислительной активности пероксинитрита (ONOO)". В физиологической среде (при нейтральных значениях рН) это соединение протонируется и быстро распадается с выделением активного токсичного гидроксильного радикала и двуокиси азота; последняя гидролизуется с образованием нитритов и нитратов. N0 погибает и при связывании с гемовой группой гемоглобина и других гемсодержащих белков. Катализируемое гемовой группой окисление NO кислородом, в основном, приводит к образованию нитрата.

Стационарный уровень N0, определяемый скоростями его синтеза и гибели, в норме не превышает нескольких микромолей. Именно при этих концентрациях NO оказывает регуляторное действие на метаболические процессы. Вместе с тем, стационарный уровень N0 может повышаться до сотни микромолей. Эта ситуация характерна для активированных иммунокомпетентных клеток - макрофагов и нейтрофилов. В отличие от других тканей и органов, где синтез NO осуществляется так называемыми конститутивными (постоянно присутствующими) изоформами NOS -эндотелиальной (eNOS) или нейрональной изоформами NOS (nNOS), в макрофагах и нейтрофилах iNOS (индуцибельные) появляются после активации этих клеток различными биологически активными веществами. Этот фермент для производства N0 нуждается только в L-аргинине, тогда как для активации конститутивных NOS необходим еще и кальций. NO, генерируемый в больших концентрациях иммунокомпетентными клетками, обнаруживает цитотоксическое действие, что позволяет ему функционировать в качестве одного из основных эффекторов системы клеточного иммунитета. Предполагается, что это оружие используется иммунной системой для защиты организма как от бактериальной, так и злокачественной инвазии.

В настоящее время становится все более очевидным, что функционирование N0 в организме, как свободно диффундирующей в клетки и ткани молекулы, малоэффективно. В свободном состоянии молекула NO быстро погибает в различных реакциях, приводящих к его окислению в нитриты и нитраты. Есть основание полагать, что реализация, как правило, паракринного действия N0 обеспечивается включением NO в некоторые соединения, защищающие его от быстрой гибели. В качестве этих соединений сейчас предполагаются S-нитрозотиолы (RS-NO) или динитрозильные комплексы негемового железа (ДНКЖ). Эндогенное происхождение этих соединений в настоящее время продемонстрировано: их образование связано с ферментативной генерацией NO из L-аргинина и оно подавляется ингибиторами NO-синтаз. Оба типа соединений легко синтезировать in vitro, что позволяет использовать эти соединения для детального исследования их поведения в организме животных. Вопросы, которые здесь могут быть решены, сводятся к следующему: во-первых, какие превращения они могут испытывать в организме, во-вторых, какое действие они могут оказывать на этот организм, в-третьих, какие вещества могут влиять на время их жизни в организме. Выяснению этих вопросов и посвящена настоящая диссертационная работа. Очевидно, что понимание особенности поведения S-нитрозотиолов и ДНКЖ в организме животных может также способствовать установлению механизмов биологического действия лекарственных соединений, активным началом которых выступает N0. К таковым относятся, например, органические нитраты, наиболее известным представителем которых, является нитроглицерин.

Сейчас происходит усиленный поиск и синтез NO - доноров, которые могут составить основу будущих лекарственных средств. Не исключено, что метаболизм этих лекарственных средств сопряжен с синтезом из них RS-NO и ДНКЖ.

Цель работы состоит в изучении факторов, влияющих на образование ДНКЖ в организме животных по L-аргинин-зависимому пути. Ранее такое образование было обнаружено только на клеточных культурах. Единственным методом, позволившим зарегистрировать в них эндогенные ДНКЖ, является спектроскопия ЭПР: ДНКЖ характеризуются специфическим сигналом ЭПР с gcp = 2,03 (сигналом 2,03).

В связи с этим в задачи исследования входит:

1. Проверка способности экзогенных спиновых ловушек -железо-дитиокарбаматных комплексов - образовывать в организме животных парамагнитные мононитрозильные комплексы, регистрируемые методом ЭПР.

2. Изучение методом ЭПР поведения экзогенных ДНКЖ в организме животных.

3. Проверка возможности образования ДНКЖ в организме животных при участии экзогенных S-нитрозотиолов.

4. Изучение влияния железа, как компонента ДНКЖ, на образование оксида азота в организме животных.

5. Изучение влияния разнообразных агентов (восстановителей, железа, тиолов и т.д.) на образование ДНКЖ в организме животных.

Научная новизна.

1. Впервые обнаружено образование ДНКЖ в тканях животных при участии N0, продуцируемого ферментативным путем из L-аргинина.

Показано, что для этого необходимо вводить животным тиосульфат, ослабляющий действие супероксида на ДНКЖ.

2. Показано, что использование железо-дитиокарбаматных комплексов позволяет обнаруживать методом ЭПР в организме животных оксид азота, образующийся по L-аргинин-зависимому пути. АВС-модификация метода, устраняющая влияние супероксида на уровень парамагнитных нитрозо-аддуктов железо-дитиокарбаматных комплексов, резко повышает количество регистрируемого таким образом оксида азота в организме животных.

3. Показано, что введение животным железа вместе с ДЭТК повышает уровень МНКЖ в печени. Предполагается, что в ответ на прооксидантное действие железа в клетках быстро активизируется антиоксидантная защита (например, генерация восстановленного глутатиона), что и приводит к снижению уровня супероксида и повышению уровня МНКЖ.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для создания нового класса фармакологических средств - доноров NO, ионов нитрозония (NO+) и групп Fe+(NO+)2, которые могут выступать в качестве сердечно-сосудистых и антитромботических лекарств.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции «Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве», Казань, 1988; Международной конференции "EPR-spectroscopy of nitric oxide in biological systems", Суздаль, 1996; Всероссийской конференции «Физика и химия элементарных химических процессов», Черноголовка, 1997; The 5 International Conference of Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes, Moscow, 1997; International Symposium on Nitric Oxide in Health and Diseases. Kumamoto, Japan, 1997.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 научные статьи и 5 тезисов докладов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- комплексы железа с диэтилдитиокарбаматом (ДЭТК) способны выступать в качестве ловушки оксида азота; динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ), вводимые в организм животных, разрушаются ДЭТК с образованием парамагнитных МНКЖ-ДЭТК;

ЛПС резко усиливает образование МНКЖ-ДЭТК, что обусловлено усилением синтеза N0, осуществляемого iNOS; введение железа (II) усиливает синтез N0 в организме животных; введение тиосульфата в организм животных, обработанных ЛПС, приводит к стабилизации эндогенных ДНКЖ и возможности их регистрации методом ЭПР; проведенные исследования показывают, что ДНКЖ могут возникать в организме животных при участии оксида азота, образующегося по L-аргинин-зависимому пути.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Бражникова, Надежда Владиленовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что динитрозильные комплексы негемового железа (ДНКЖ) могут возникать в организме животных при участии оксида азота (N0), образующегося по L-аргинин-зависимому пути.

2. Впервые установлено, что введение тиосульфата в организм животных, обработанных липополисахаридом (ЛПС), приводит к стабилизации эндогенных ДНКЖ, что обеспечивает их регистрацию методом ЭПР. Низкий уровень ДНКЖ у животных, обработанных ЛПС, определяется деструктивным действием на эти комплексы анионов супероксида и пероксинитрита.

3. Показано, что комплексы железа с диэтилдитиокарбаматом (ДЭТК) способны выступать в качестве ловушек оксида азота. Связывание оксида азота приводит к образованию парамагнитных мононитрозильных комплексов железа (МНКЖ), регистрируемых в органах животных методом ЭПР.

4. Установлено, что воспалительное действие бактериального эндотоксина (ЛПС) резко усиливает образование МНКЖ-ДЭТК, что обусловлено усилением синтеза N0, осуществляемого iNOS.

5. Показано, что введение железа (II) усиливает синтез NO в организме животных.

В заключение считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность и признательность моему научному руководителю профессору Анатолию Федоровичу Ванину за новизну и оригинальность идей, постоянную помощь и полезное обсуждение результатов.

Я глубоко признательна всем сотрудникам лаборатории физической химии биополимеров за помощь, понимание и дружеское содействие в работе.

Особую благодарность я приношу моим коллегам и соавторам Кубриной JI.H. и Микояну В.Д., чья энергия и энтузиазм поддерживали меня в процессе всей работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Бражникова, Надежда Владиленовна, Москва

1. Ванин А.Ф., Налбандян P.M. Свободные радикалы нового типа в дрожжевых клетках.//Биофизика. 1965. Т.10. С.167-168.

2. Ванин А.Ф., Блюменфельд Л.А., Четвериков А.Г. Исследование методом ЭПР комплексов негемового железа в клетках и тканях.// Биофизика. 1967. Т. 12. С.829-838.

3. Ванин А.Ф. Идентификация методом ЭПР комплексов двухвалентного железа с цистеином в биологических системах.// Биофизика. 1967. Т.32. С.277-283.

4. Ванин А.Ф., Четвериков А.Г. Парамагнитные нитрозильные комплексы гемового и негемового железа.// Биофизика. 1968. Т. 13. С.608-613.

5. Vanin A.F., Osipov A.N., Kubrina L.N., Burbaev D.S., Nalbandyan R.M. On the origin of paramagnetic centers with g~2,03 in animal tissues and microorganisms.// Studia biophysica. 1975. V.49. P.13-21.

6. Ванин А.Ф., Кубрина Л.Н., Лисовская И.Л., Маленкова И.В., Четвериков А.Г. Эндогенные нитрозильные комплексы гемового и негемового железа в клетках и тканях.// Биофизика. 1971. Т. 16. С.650-655.

7. Ванин А.Ф., Киладзе С.В., Кубрина Л.Н. О факторах, влияющих на образование динитрозильных комплексов негемового железа в органах животных in vivo.// Биофизика. 1977. Т.22. С.850-856.

8. Ванин А.Ф. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Нитрозильные комплексы негемового железа в тканях животных и микроорганизмах.// М. 1980. 296с.

9. McDonald С.С., Philips W.D., Mower H.F. An electron spin resonance study of same complexes of iron, nitric oxide and anionic ligands.// J. Am. Chem. Soc. 1965. V.87. P.3419-3326.

10. Бурбаев Д.Ш., Ванин А.Ф., Блюменфельд JI.A. Электронная и пространственная структура динитрозильных комплексов железа.// Журнал структурной химии. 1971. Т.12. С.252-257.

11. Ванин А.Ф., Налбандян P.M. Свободнорадикальные состояния с локализацией неспаренного электрона на атоме серы в дрожжевых клетках.//Биофизика. 1966. Т.Н. С.178-179.

12. Ванин А.Ф., Кйладзе С.В., Кубрина Л.Н. О включении низкомолекулярных SH-содержащих соединений в нитрозильные комплексы негемового железа в бесклеточных и клеточных препаратах.//Биофизика. 1975. Т.20. С.1068-1073.

13. Ileperuma О.А., Feltham R.D. Iron-sulfur complexes of NO.2.Synthesis and exchange studies of Fe(NO)(s2 CN(CH3)2)2 of crystal and molecular structure of cys-Fe(N0)(N02)(S2 CN(CH3 )2 )2// Inorg. Chem. 1977. V.16 P.1876-1883.

14. Vanin A.F., Malenkova I.V., Serezhenkov V.A. Iron catalyzes both the decomposition and synthesis of S-nitrosothiols: optical and EPR studies.//Nitric Oxide: Biol.& Chem. 1997. V.l. N3. P.191-203.4Й

15. Vanin A.F., Serezhenkov V.A., Mikoyan V.D., Genkin M.V. The 2,03signal as an indicator of dinitrosyl iron complexes with thiol containing ligands.//Nitric Oxide: Biol.& Chem. 1998. V.2. P.224-234.

16. Мордвинцев П.И., Кубрина Л.Н., Клещев А.Л., Ванин А.Ф. О происхождении структурных изменений у нитрозильных комплексов негемового железа, образующихся в тканях животных in vivo и in vitro.// Studia biophysica. 1984. V.103. P.63-70.

17. Foster M.A., Hutchison J.M.S. The origin of an ESP signal at g=2,03 from normal rabbit liver and the effects of nitrites upon it.// Phys. Med. Biol. 1974. V.19. P.289-302.

18. Commoner В., Woolum J.C., Senturia B.H., Ternberg J.L. The effects of 2-acetylaminofluorene and nitrite on free radicals and carcinogenesis in rat liver.// Cancer. Res. 1970. V.30. P.2091-2097.

19. Woolum J.C., Commoner B. Isolation and identification of aparamagnetic complexes from the livers of carcinogen-treated rats.// Biochim. Biophys. Acta. 1970. V.201. P.131-140.

20. Ванин А.Ф., Варич В.Я. Образование нитрозильных комплексов негемового железа (комплексов 2,03) в тканях животных in vivo.// Биофизика. 1979. Т.24. С.666-671.

21. Ванин А.Ф., Варич В.Я. Нитрозильные комплексы негемового железа в тканях животных.// Studia Biophysica. 1981. V.86. P. 177185.

22. Nitric Oxide from L-Arginine.:a Bioregulatory System. Elsevier Sci.//London. 1990. 296p.

23. Lancaster J.R., Hibbs J.B. EPR demonstration of iron-nitrosyl complex formation by cytotoxic activated macrophages.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V.87. P.1223-1227.

24. Pellat C., Henry Y., Drapier J-C. IFN-activated macrophages: detection by electron paramagnetic resonance of complexes between L-arginine-derived nitric oxide and non-heme iron proteins.// Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1990. V.166. P.l 19-125.

25. Drapier J-C., Pellat C., Henry Y. Generation of EPR-detectable nitrosyl-iron complexes in tumor target cells cocultured with activated macrophages.//J. of Biol. Chem. 1991. V.266. P.10162-10167.

26. Lancaster J.R., Werner-Felmayer G., Wachter H. Coinduction of nitric oxide synthesis and intracellular nonheme iron-nitrosyl complexes in murine cytokine-treated fibroblasts.// Free Rad. Biol. Med. 1994. V.16. P.869-870.

27. Stadler J., Bergonia H.A., DiSilvio M., Sweetland M.A., Billiar T.R., Simmons R.L., Lancaster J.R. Nonheme nitrosyl-iron complex formation in rat hepatocytes: detection by EPR spectroscopy.// Arch. Biochem. Biophys. 1993. V.302. P.4-11.

28. Kim Y-M., Bergonia H., Lancaster J.R. Nitrogen oxide-induced autoprotection in isolated rat hepatocytes.// FEBS Lett. 1995. V.374. P.228-232.

29. Sergent O., Griffon В., Morel I., Chevanne M., Dubos M.P., Cillard P., Cillard J. Effect of nitric oxide on iron-mediated oxidative stress in primary hepatocyte culture.// Hepatology. 1997. V.25. P. 122-127.

30. Geng Y-L., Petersson A-S., Wennmalm A., Hannson G. Cytokine-induced expression of nitric oxide synthase results in nitrosylation of heme and nonheme iron proteins in vascular smooth muscle cells.// Exp. Cell. Res. 1994. V.214. P.418-424.

31. Corbett J.A., Sweetland M.A., Wang J.L., Lancaster J.R., McDaniel M.L. Nitric oxide mediates cytokine-induced inhibition of insulin secretion by human islets of Langerhans. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P.731-1735.

32. Muller В., Kleschyov A.L., Stoclet J-C. Evidence for N-acetylcysteine-sensitive nitric oxide storage as dinitrosyl-iron complexes in lipopolysaccharide-treated rat aorta.// Br. J. Pharmacol. 1996.V.119. P.1281-1285.

33. Bastian N.R., Yim C-Y., Hibbs J.B., Samlowski W.E. Induction of iron-derived EPR signals in murine cancers by nitric oxide. // J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.5127-5131.

34. Клещев A.JI., Мордвинцев П.И., Ванин А.Ф. Роль оксида азота и железа в гипотензивном действии нитрозильных комплексов железа с различными анионными лигандами.// Stadia biophysica. 1985. V.105. P.93-102.

35. Мордвинцев П.И., Руднева В.Г., Ванин А.Ф., Шимкевич Л.Л., Ходоров Б.И. Ингибирующий эффект динитрозильных комплексов железа с низкомолекулярными лигандами на агрегированный осадок.//Биохимия. 1986. Т.51. С.1851-1857.

36. Мордвинцев П.И., Путинцев М.Д., Галаган М.Е., Орановская Е.В., Медведев B.C., . Ванин А.Ф. Гипотензивная активность динитрозильных комплексов железа с белками в наркотизированных животных.// Бюлл.кардиол.Центра. 1998. №1. С.46-51.

37. Галаган М.Е., Орановская Е.В., Мордвинцев П.И., Медведев B.C., Ванин А.Ф. Гипотензивный эффект динитрозильных комплексов железа в бодрствующих животных.// Бюлл.кардиол.Центра. 1998. №2. С.75-80.

38. Галаган М.Е., Широколава А.В., Ванин А.Ф. Гипотензивная активность оксида азота, образующегося из экзогенных и эндогенных источников.//Вопросы мед.химии. 1991. Т.37. С.67-69.

39. Vedernikov Yu.P., Mordvintcev P.I., Malenkova I.V. and Vanin A.F. Similarity between the vasorelaxing activity of dinitrosyl iron complexes and endothelium-derivated relaxing factor.// Eur.J.Pharmacol. 1992. V.211. P.313-317.

40. Vedernikov Yu.P., Mordvintcev P.I., Malenkova I.V. and Vanin A.F. Effect of diethyldithiocarbamate on activity of the nitric oxide-realeasing vasodilators.//Eur.J.Pharmacol. 1992. V.212. P.125-128.

41. Kleschyov A.L., Muller В., Stoclet J-C. Nitric oxide store as dinitrosyl-iron complexes in lipopolysaccharide- treated vessels: localization and mechanism of formation.// Br. J. Pharmacol. (Suppl). 1997. P. 120-129.

42. Flitney F.W., Megson I.L., Flitney D.E., Butler A.R. Iron-sulphur cluster,a novel class of nitric oxide generator: mechanism of vasodilator action on rat isolated artery.// Br. J. Pharmacol. 1992. V.107. P.842-848.

43. Kim Y-M., Chung H.T., Simmons R.L., Billiar T.R. Cellular non-heme iron content is a determinant of nitric oxide mediated apoptosis, necrosis and caspase inhibition.// J. Biol. Chem. 2000. V.275. P. 1095410961.

44. Шарф В.Г., Кукушкина Г.В., Пулатова M.K., Корман Д.Б., Горбачева Л.Б. ЭПР-исследование денитрозирования алкилнитрозомочевины in vivo.// Известия АН СССР сер. биол. 1986. №3. С.429-435.

45. Исиченко Т.С., Байдер JI.M., Лужков В.Б. Обнаружение анион-радикалов нитрозофурана в процессе электрохимического восстановления 5-нитрофурана. ЭПР-исследования и квантово-химические расчеты.// Химия гетероциклич. соединений. 1989. Т.9. С.1178-1183.

46. Филатов Д.Э., Кудрявцев М.Е., Байдер Л.М., Шарыгин В.Л., Грякалов К.В., Пулатова М.К., Корман Д.Б. Рибонуклеоттидредуктаза "мишень" действия нитрозометилмочевины.// Известия АН СССР. сер. биол. 1991. №4. С.528-539.

47. Ding H. and Demple B. Direct nitric oxide signal transduction via nitrosylation of iron-sulfur centers in the Sox R transcription activation.// Proc. Nad. Acad. Sci. USA. 2000. V.97. P.5146-5150.

48. Foster M.W. and Cowan B. Chemistry of nitric oxide with protein-bound iron-sulfur centers. Insight of physiological reactivity.// J. Am. Soc. 1999. V.121. P.4093-4100.

49. Welter R., Yu L. and Yu C-A. The effects of nitric oxide on electron transport complexes.// Arch. Biochem. Biophys. 1996. V.331. P.9-14.

50. Kennedy M.C., Antholine W.E. and Beinert H. An EPR investigation on the products of cytolic mitochondrial aconitases with nitric oxide.// J. Biol. Chem. 1997. V. 272. "P. 20340-20347.

51. Voevodskaya N.V., Serezhenkov V.A., Cooper C.E., Kubrina L.N., Vanin A.F. Exogenous ferrous iron is required for the nitric oxide-catalysed destruction of the iron-sulphur center in adrenodoxin.// Biochem. J. 2002. V.368. P.633-639.

52. Yang W., Rogers P.A. and Ding H. Repair of nitric oxide-modified ferrodoxin 2Fe-2S. cluster by cysteine desulfurase (IscS).// J. Biol. Chem. 2002. V.277. N15. P.12868-12873.

53. Vanin A.F., Huisman A., Stroes E., de Ruijter-Heijstek F., Rabelink Ton, van Faassen E. Antioxidant capacity of mononytrosyl-iron-dithiocabamate complexes: implications for NO trapping.// Free Rad. Biol. Med. 2001. V.30. N8. P.813-824.

54. ButlerA.R. Non-heme iron nitrosyls in biology.// Chem. Rev. 2002. V.102. P.1155-1165.

55. Komarov A.M., Мак I.T. and Weglicki W.B. The origin of dinitrosyl-iron complex in endothelial cells.// Ann. N-Y Acad. Sci. 2000. V.899. P.407-410.

56. Ванин А.Ф., Мордвинцев П.И., Клещев A.JI. Обнаружение оксида азота в тканях животных in vivo.// Studia Biophysica. 1984. V.102. P.135-143.

57. Kubrina L.N., Coldwell W.S., Mordvintcev P.I., Malenkova I.V., Vanin A.F.EPR evidence for nitric oxide production from guanidino nitrogen of L-arginine in animal tissues in vivo.// Biochim. Biophys. Acta. 1992. V.1099. P.233-237.

58. Williams D.L.H. S-nitrosation and the reactions of S-nitroso compounds.// Chem. Soc. Rev. 1985. V.14. P.171-196.

59. Butler A.R., Rhodes P. Chemistry, analysis and biological roles of S-nitrosothiols.// Anal: Biochem. 1997. V.249. P.l-9.

60. Vanin A.F., Malenkova I.V., Serezhenkov V.A. Iron catalyzes both decomposition and synthesis of S-nitrosothiols: optical and EPR studies.//Nitric Oxide: Biol. & Chem. 1997. V.l. P.191-203.

61. Stubauer G., Guiffre A., Sarti P. Mechanism of S-nitrosothiol formation and degradation mediated by copper ions.// J. Biol. Chem. 1999. V.274. P.28128-28133.

62. Butler A.R., Al-Sa'doni H.H., Megson I.L., Flitney F.W. Synthesis, decomposition and vasodilator action of some new S-nitrosated dipeptides.// Nitric Oxide: Biol. & Chem. 1998. V.2. P. 193-202.

63. Feelisch M., Stamler J.S. Donors of nitrogen oxides, in: Feelisch M., Stamler J.S. (Eds.). Methods in Nitric Oxide Research.// Wiley. New York. 1996. 84 p.

64. Gaston B. Nitric oxide and thiol groups.// Biochim. Biophys. Acta. 1999. V.1411. P.323-333.

65. Beloso P.H., Williams D.L.H. Reversibility of S-nitrosothiol formation.// Chem. Commun. 1997. V.l. P.89-91.

66. McAninly J., Williams D.L.H., Askew S.C., Butler A.R., Russel C. Metal ions catalysis in nitrosothiol (RSNO) decomposition.// J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1993. P.1758-1759.

67. Williams D.L.H. The mechanism of nitric oxide formation from S-nitrosothiols (thionitrites).//Chem. Commun. 1996. V.l. P.1085-1091.

68. Singh R.J., Hogg N., Joseph J., Kalyanaraman B. Mechanism of nitric oxide release from S-nitrosothiols.// J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.18596-18603.

69. Dicks A.P., Swift H.R., Williams D.L.H., Butler A.R., Al-Sa'doni H.H., Cox B.G. Identification of Cu1+ as the effective reagent in nitric oxide formation from S-nitrosothiols (RSNO).// J. Chem. Soc. Perkin Trans.1996. V.2. P.481-487.

70. Gorren A.F., Schrammel A., Schmidt K., Mayer B. Decomposition of S-nitrosoglutathione in the presence of copper and glutathione.// Arch. Biochem. Biophys. 1996. V.330. P. 219-228.

71. Dicks A.P., Beloso P.H., Williams D.L.H. Decomposition of S-nitrosothiols: the effect of added thiols.// J. Chem. Soc. Perkin Trans.1997. V.2. P. 1429-1434.

72. Sorenson E., Skiles E.H., Xu В., Aleryani S., Kostka P. Role of redox-active iron ions in the decomposition of S-nitrosocysteine in subcellular fractions of porcine aorta.//Eur. J. Biochem. 2000. V.267. P.4593-4599.

73. Gorge M.P., Hothersall J.S.,. Neild G.H, Noronha-Dutra A.A. Role of copper(I)-dependent enzyme in anti-platelet action of S-nitrosoglutathione.// Br. J. Pharmacol. 1996. V.119. P.536-538.

74. Al-Sa'doni H.H., Megson I.L., Bisland S., Butler A.R., Flitney F.W. Neocuproine, a selective Си (I) chelator and the relaxation of rat vascular smooth muscle by S-nitrosothiols.// Br. J. Pharmacol. 1997. V.121. P.1047-1052.

75. Vanin A.F., Serezhenkov V.A., Malenkova I.V. Nitric oxide initiates iron binding to neocuproine.// Nitric Oxide. 2001. V.5. P. 166-175.

76. Vanin A.F., Muller В., Alencar J.L., Lobysheva I.I., Nepveu F., Stoclet J.-C. Evidence that intrinsic iron not intrinsic copper determines S-nitrosocysteine decomposition in buffer solution.// Nitric Oxide. 2002. V.7. P.194-209.

77. Sheu F.-W., Zhu W., Fung P.C.W. Direct observation of trapping and release of nitric oxide by glutathione and cysteine with electron paramagnetic resonance spectroscopy.// Biophys. J. 2000.V.78. P. 12161226.

78. Spencer N.Y., Zeng H., Palet R.P., Hogg N. Reaction of S-nitrosoglutathione with the heme group of deoxyhemoglobin.// J. Biol. Chem. 2000. V.275. N47. P.36562-36567.

79. Moriel P., Pereira I.R.O., Bertolami M.C., Abdalla D.S.P. Is ceruloplasmin an important catalyst for S-nitrosothiol generation in hypercholesterolemia?// Free Radical Biology and Medicine. 2001. V.30. N3. P.318-326.

80. Marshall H.E., Stamler J.S. Inhibition of NF-kB by S-nitrosylation.// Biochem. 2001. V.40. P.1688-1693.

81. Shin J.H., ChungS., Park T.J., Uhm D-Y., Suh C.K. Nitric oxide directly activates calcium-activated potassium channels from rat brain reconstituted into planar lipid bilayer.// FEBS Lett. 1997. V.415. P.299-302.

82. Bauer P.M., Buga G.M., Fukuto J.M., Pegg A.E., Ignarro L.S. Nitric oxide inhibits ornithine decarboxylase via S-nitrosylation of cysteine 360 in the active site of the enzyme.// J. Biol. Chem. 2001. V.276. N37.

83. Mohr S., Zech В., Lapetina E.G., Brune B. Inhibition of caspase-3 by S-nitrosation and oxidation caused by nitric oxide.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V.238. P.387-391.

84. Wolosker H., Panizzutti R., Engelender S. Inhibition of creatine kinase by S-nitrosoglutathione.// FEBS Lett. 1996. V.392. P.274-276.

85. Xian M., Chen X., Liu Z., Wang K., Wang P.G. Inhibition of papain by S-nitrosothiols.// J. Biol. Chem. 2000. V.275. N27. P.20467-20473.

86. Miyamoto Y., Akaike Т., Alam M.S., Ihoue R., Hamamoto T. Novel functions of human ai-protease inhibitor after S-nitrosylation: inhibition of cysteine protease and antibacterial activity.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V.267. P.918-923.

87. Sehajpal P.K., Basu A., Ogista J.S., Lander N.M. Reversible S-nitrosation and inhibition of HIV-1 protease.//Biochemistry. 1999. V.38. P.13407-13413.

88. Marshall H.E., Merchant K., Stamler J.S. Nitrosation and oxidation in the regulation of gene expression.// FASEB. 2000. V.14. P.1889-1900.

89. Oliveiera L., Bouton C., Drapier J-C. Thioredoxin activation of iron regulatory proteins.// J. Biol. Chem. 2000. V.274. N27. P.516-521.

90. Hausladen A., Privalle C.T., Kemg Т., DeAngelo J., Stamler J.S. Nitrosative stress: activation of the transcription factor OxyR.// Cell.1996. V.86. P.719-729.

91. Kim Y-M., De Vera M.E., Watkins S.C., Billiar T.R. Nitric oxide protects cultured rat hepatocytes from tumor necrosis factor- a-induced apoptosis by inducing heat shock protein 70 expression.// J. Biol. Chem.1997.V.272. P.1402-1411.

92. Al-sa'doni H.H., Ferro A. S-nitrosothiols: a class of nitric oxide-donor drugs.// Clin. Sci. 2000. V.98. P.507-520.

93. Al-sa'doni H.H., Megson I.L., Bisland S., Butler A.R., Flitney F.W. Neocuproine, a selective Cu(I) chelator, and the relaxation of rat vascular smooth muscle by S-nitrosothiols.// Brit. J. Pharmacol. 1997. V.121. P.1047-1050.

94. Ricardo K.B.S., Shishido S.M., De Oliveira M.G., Krieger M.N. Characterization of hypotensive effect of S-nitroso-N-acetylcysteine in normotensive and hypertensive conscious rats.// Nitric Oxide.2002. V.7.P.57-66.

95. Star R.A. Proc. of Southwestern Internal Medicine Conference: Nitric Oxide. Am. J. Med. Sci. 1993. V.306. P.348-358.

96. Butler A.R., Rhodes P. Review. Chemistry, analysis and biological roles of S-nitrosothiols.//Analytical Biochem. 1997. V.249. P.l-9.

97. Ванин А.Ф. Оксид азота: регуляция клеточного метаболизма без участия системы клеточных рецепторов.// Биофизика. 2001. Т.46. С.631-641.

98. Severina I.S., Bussygina O.G., Pyatakova N.A., Malenkova I.V., Vanin A.F. Activation of soluble guanylate cyclase by NO-donors S-nitrosothiols, and dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing legands.//Nitric Oxide. 2003. (в печати).

99. Boldyrev A.A., Bulygina E.R., Kramarenko G.G., Vanin A.F. Effect of nitrosocompounds on Na/K-ATPase.// Biochim. Biophys. Acta. 1997. V.1321. P.243-251.

100. Roy В., Lepoivre M., Henry Y., Fontecare M. Inhibition of ribonucleotide reductase by nitric oxide derived from thionitrites: Reversible modifications of both subunits.// Biochemistry. 1995. V.34. P.5411-5420.

101. Ванин А.Ф., Кубрина JI.H., Мордвинцев П.И. Карбахолин индуцирует образование оксида азота в печени животных in vivo.// Докл. АН СССР. 1988. Т.301. №2. С.490-492.

102. Варич В.Я., Ванин А.Ф., Овсянникова Л.М. Обнаружение эндогенного оксида азота в печени мышей методом ЭПР.// Биофизика. 1987. Т.32. С. 1064-1065.

103. Ванин А.Ф. Взаимопревращение двух возможных форм эндотелий-зависимого фактора релаксации.// Биофизика. 1993. Т.38. С.751-760.

104. Stamler J.S., Osborne J.A., Jaraki О., Rabbani L.E. Adverse vascular effects of homocysteine are modulated by endothelium-derived relaxing factor and related oxides of nitrogen.//J. Clin.Invest. 1993. V.51. P.308-318.

105. Vanin A.F., Stukan R.A., Manukhina E.B. Physical properties of dinitrosyl & iron complexes with thiol-containg ligands in relation with theirvasodilatator activity.//Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1295. P.5-12.

106. Moiseeva E.V., Merkulova I.B., Bijleveld C., Koten J.W., Miroshnikov A.I., Den Otten W. Cancer Immunol. Immunother. 2003. PMID :12719897.

107. Vanin A.F. Iron diethyldithiocarbamate as a spin trap for nitric oxide. //Methods inEnzymol. 1999. V.301. P.269-279.

108. Ignarro L.J. Nitric Oxide: Biology and Pharmacology.// 1st Ed. Academic Press. San Diego. 2000. 320p.

109. Koppenol W.H. The basic chemistry of nitrogen monoxide and peroxynitrite.// Free Rad.Biol. Med. 1998. V.25. P.385-391.

110. Espey M.G., Miranda K.M., Thomas D.D., Xavier S., Citrin D., Vitek f M.P., Wink D.A. A chemical perspective on the interplay between NO,reactive oxygen species, and reactive nitrogen oxide species.// Ann. N-Y. Acad. Sci. 2002. V.962. P.195-206.

111. Ванин А.Ф. Биологическая роль оксида азота: история, современное состояние и перспективы исследований.// Биохимия. 1998. Т.63. С.782-793.

112. Gow A.J., Chen Q., Hess D.T., Day B.J., Ischiropolus H., Stamler J.S.Basal and stimulated protein S-nitrosylation in multiple cell types and tissues.// J.Biol.Chem. 2002. V.277. P.9637-9640.

113. Butler A.R., Rhodes P. Chemistry, analysis and biological roles of S-„ nitrosothiols.//Analyt. Biochem. 1997. V.249.P.1-9.

114. Rafikova O., Rafikov R., Nudler E. Catalysis of S-nitrosothiols formation by serum albumin: The mechanism and implication in vascular control.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V.99. P.5913-5918.

115. Jourd"heuil D., Gray L., Grisham M.B. S-Nitrosothiol formation in blood of lipopolysaccharide-treated rats.// Biochem.Biophys.Res. Comm. 2000. V.273. P.22-26.

116. Chamulitrat W., Jordan S.J., Mason R.P., Litton A.L., Wilson J.G., Wood J.G., Wolberg G., Molina Y., Vedia L. Targets of nitric oxide in a mouse model of liver inflammation by Corynebacterium parvum.ll Arch. Biochem. Biophys. 1995. V.316. P.30-37.

117. Лобышева И.И., Сереженков B.A., Ванин А.Ф. Взаимодействие пероксинитрита и перекиси водорода с динитрозильными комплексами железа, содержащими тиоловые лиганды, in vitro.// Биохимия. 1999. Т.64. №2. С. 194-200.

118. Titheradge М.А. Nitric oxide in septic shock.// Biochim. Biophys. Acta.1999. V.1411. P.437-455.

119. Miller A.A., Megson I.L., Gray G.A. Inducible nitric oxide synthase-derivate superoxide contributes to hyperreactivity in small mesenteric arteries from a rat model of chronic heart failure.// British J. Pharmacol.2000. V.131. P.29-36.

120. Watts R.N., Richardson D.R. Nitrogen monoxide (NO) and glucose. Unexpected links between energy metabolism and NO-mediated iron mobilization from cells.//J.Biol. Chem. 2001. V.276. P.4724-4732.

121. Vanin A.F., Mordvintcev P.I., Kleschyov A.L. Appearance of nitric oxide in animal tissues.// Studia biophysica. 1984. V.102. P. 135-143.

122. Kalyanoraman B. Detection of nitric oxide by electron spin resonance in chemical, photochemical, cellular, physiological, and pathophysioologicals systems.// Methods in Enzymol. 1996. V.268. P. 168-201.

123. Vanin A.F., Huisman A., van Faassen E.E.Iron dithiocarbamate as spin trap for nitric oxide detection: pitfalls and successes.// Methods in Enzymol. 2002. V.359. P.27-42.

124. Кубрина JI.H., Мордвинцев П.И., Ванин А.Ф. Образование оксида азота в тканях животных при воспалении.// Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1989. №1. С.31-33.

125. Варич В.Я. Механизм образования нитрозильных комплексов негемового железа в тканях in vivo.// Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. 1982. 136с.