Посттравматическая регенерация спинного мозга грызунов при трансплантации клеток обонятельной выстилки, микроглия-подобных клеток и реконструкции тканевого матрикса биосовместимыми карбомерами

Масгутова, Галина Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Посттравматическая регенерация спинного мозга грызунов при трансплантации клеток обонятельной выстилки, микроглия-подобных клеток и реконструкции тканевого матрикса биосовместимыми карбомерами
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Посттравматическая регенерация спинного мозга грызунов при трансплантации клеток обонятельной выстилки, микроглия-подобных клеток и реконструкции тканевого матрикса биосовместимыми карбомерами"

003484 110

На правах рукописи

Масгутова Галина Андреевна

ПОСТТРАВМАТИЧЕСКАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ СПИННОГО МОЗГА ГРЫЗУНОВ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК ОБОНЯТЕЛЬНОЙ . ВЫСТИЖИ,МИКРОГЛИЯ-ПОДОБНЫХКЛЕТОКИ РЕКОНСТРУКЦИИ ТКАНЕВОГО МАТРИКСА БИОСОВМЕСТИМЫМИ

КАРБОМЕРАМИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 5 мАР 2010

Саранск 2010

003494110

Работа выполнена в Государственном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Челышев Юрий Александрович

доктор медицинских наук, профессор

Швалев Вадим Николаевич

доктор биологических наук, профессор

Кузьмичева Лидия Васильевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская медицинская

академия им. И.М. Сеченова» Росздрава

Защита диссертации "состоится «_ « иСССХЛ? » 2010 г. в -Т^зас-па заседании диссертационного совета Д.212.117.01 при ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имепи Н.П. Огарёва» по адресу 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва» (430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)

Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва» www.mrsu.ru; e-mail: dsovet@mrsu.ru

/Р

Автореферат диссертации разослан «__!_» 010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук , профессор - В.П. Балашов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Для стимулирования посттравматической регенерации спишого мозга активно изучают возможность доставки в область повреждения ней-ротрофических факторов, молекул адгезии, противоапоптозных молекул, нейтрализаторов естественных ингибиторов роста аксонов и др. В качестве средств доставки потенциальных стимуляторов регенерации исследуют клеточные носители, а также гелевый матрикс в потенциальном пространстве роста аксонов. Клеточная терапия рассматривается как один из перспективных подходов для стимулирования ио-стгравматической регенерации спинного мозга. Исследования последнего десятилетия выявили новый источник клеток доя трансплантации при повреждении спинного мозга — клетки обонятельных структур (выстилки и луковицы) (Reier et al., 2004; Marshall et al., 2006). При трансплантации этих клеток отмечены нейропротекторный эффект (Lopez-Vales et al., 2004; Ramer et al., 2004), стимулирование регенерации аксонов (Ramon-Cueto et al., 2000; Lopez-Vales et al., 2006), ремиелинизация (Imaizumi et al., 2000; Sasaki et al., 2000) и частичное восстановление двигательной и чувствительной функций (Verdu et al., 2003; Lopez-Vales et al., 2006). Поддерживающее нейроре-генерацию влияние клеток обонятельной выстилки (КОВ) связывают с их способностью проникать через астроглиальный рубец и интегрироваться в ткань спинного мозга, продуцировать нейротрофические факторы, молекулы адгезии и белки внеклеточного матрикса (Perry et al., 2002; Barnett, Riddell, 2004; Викторов и др., 2006). Интерес к КОВ подкреплён лёгкой доступностью, малой инвазивностью процедуры забора материала и возможностью получения аутологичных клеток, не приводящей к длительному нарушению обоняния (Lanza et al., 1994; Ferron, Jusko, 1998). Несмотря на большое количество экспериментальных работ с использованием КОВ, как материала для трансплантации при травме спинного мозга, на сегодняшний день клеточные механизмы миелинизации регенерирующих аксонов остаются неясными.

Важным критерием отбора стволовых и прогениторных клеток для трансплантации является их низкая онкогенность. Изучению этого вопроса при клеточной терапии экспериментальной травмы спинного мозга уделено внимание только в единичных работах (Kulbatski et al., 2007; Ronsyn et al., 2007). Другим, не менее важным, критерием отбора клеток для трансплантации является минимальная инва-зивность процедуры введения клеток. Большинство исследований эффектов трансплантации клеток проведено с их введением непосредственно в область повреждения спинного мозга. При этом дополнительно травмируется ткань, что негативно влияет на процессы регенерации. Инъекции трансплантируемых клеток в сосудистое русло по этой причине более предпочтительны. Однако клетки, вводимые в кровоток, должны направленно мигрировать в область повреждения. Представляется очевидным, что наиболее предпочтительными кандидатами для эффективного применения вводимых через кровь клеток будут клетки мезенхимного происхождения (Dezawa, Ide, 2005; Lundberg, Blanc, 2009). Обоим вышеназванным критериям в наибольшей мере удовлетворяют происходящие из мезенхимы клетки микроглии, которые с точки зрения возможной трансформации кажутся более безопасными (Hartmann, Deimling, 2009). Для клеток микроглии показана активация при инфекции, ишемии и нейродегенеративных заболеваниях, способность мигрировать в область повреждения и экспресс?ировать цитокины, нейротрофины и иммуномодуля-торы (Ekdahl et al., 2009). Несмотря на эти позитивные свойства, в литературе прак-

тически отсутствуют сведения о применении микроглии для трансплантации с целью стимулирования регенерации при травме спинного мозга.

Исследования Tsuchiya et al. (2005) открыли возможность получения микро-гдия-подобных клеток (МПК) путём направленной дифференцировки из эмбриональной стволовой клетки мыши. Представляется актуальным изучение эффективности трансплантации МПК, гранефицировашшх геном нейротрофина 3 (NT3). Этот нейротрофин регулирует нейрогенез, регенерацию аксонов (Xu et al., 1995) и процесс миелинизации олигодендроцитами in vitro и in vivo (Yan, Wood, 2000; Jean et al., 2003). Выступая в роли хсмоаттрактанта, NT3 обеспечивает в спинном мозге восстановление «правильных» синаптических контактов регенерирующих аксонов со своими мишенями (Alto et al., 2009) и наряду с другими нейротрофическими факторами поддерживает выживание клеток (Woodhoo, Sommer, 2008).

Для эффективной посттравматической нейрорегенеращда актуальна реконструкция тканевого магрикса в потенциальном пространстве роста аксонов (Schmidt, Leach 2003). Этот подход активно разрабатывается для ЦНС (Novikova et al., 2003; Nomura et al., 2006). Однако в клинике локальное применение фармакологических пейропротекторов и стимуляторов роста нервных волокон, подводимых к месту повреждения при помощи биосовместимых и биодеградируемых материалов, остаётся практически нереализованным. Для подобных задач в эксперименте наиболее исследованы природные биоматериалы, такие как коллаген (Yoshii, Oka, 2001), фибрин (Nakayama et al., 2007) и фибронектин (Phillips et al., 2004). В этом отношении из синтетических материалов интерес представляют по-лиакрилаты (Zhong, Bellamkonda, 2008), которые образуют высоковязкие кристаллические гидрогели (Осипова, 1999) и хорошо сочетаются с биологически активными веществами (Lomas et al., 2004). В свою очередь, биосовместимый карбомер Carbopol® 97 IP NF, являясь полимером акриловой кислоты, образует гелевую матрицу, пролонгирующую действие фармакологически активных веществ (Hosmani, 2006). Ожидается, что введение композиции аминокислот и микроэлементов, в гидрогелевый матрикс на основе полиакриловой кислоты или карбопола, окажет позитивное влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга.

Цель и задачи исследования. Цель работы — оценить эффективность посттравматической регенерации спинного мозга грызунов при ксенотраиспланта-ции клеток обонятельной выстилки (КОВ) человека, аллотрансплантации микро-глия-подобных клеток, трансфицированных геном NT3 (МПК-EGFP-NT3), и реконструкции тканевого матрикса биосовместимыми карбомерами.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. На модели латеральной гемисекции спинного мозга крысы на уровне Т8 изучить

влияние трансплантации клеток обонятельной выстилки (КОВ) человека на восстановление двигательной функции задних конечностей и процессы деструкции и регенерации в прилегающих к месту травмы участках спинного мозга.

2. На модели латеральной гемисекции спинного мозга мыши на уровне Т8 исследовать способность микроглия-подобных клеток (МПК), трансфицированных генами зелёного флюоресцентного белка (EGFP) и NT3 (МПК-EGFP и МПК-EGFP-NT3), к миграции из периферической крови в область травматического повреждения и их выживание в этой области.

3. Оценить структурные и гистохимические изменения в ростральном и каудаль-ном фрагментах спинного мозга мыши, прилегающих к области гемисекции на уровне Т8, при введении в хвостовую вену МПК-EGFP и MIIK-EGFP-NT3.

4. На модели полной перерезки спинного мозга мыши на уровне Т9 оценить восстановление двигательной функции задних конечностей в условиях имплантации в разрыв нервной ткани гидрогеля на основе биосовместимых карбомеров - полиакриловой кислоты и карбопола (Carbopol® 971Р NF).

Научная новизна работы. Впервые при длительном мониторинге описан характер гистологических изменений после гемисекции спинного мозга крысы при трансплантации КОВ. Получены данные о поддерживающем влиянии КОВ человека на выживание олигодендроцитов в прилегающих к месту травмы отделах спинного мозга крысы. Впервые показано, что количество миелиновых волокон и переживающих нейронов после гемисекции спинного мозга может не коррелировать с показателями функционального теста (ВВВ). Впервые произведена генетическая модификация микроглия-подобных клеток (МПК) генами EGFP и NT3. Проведена оценка их способности к миграции и экспрессии гена нейротрофичс-ского фактора NT3 in vitro и in vivo. Показано, что введённые через хвостовую вену МПК оказывают стимулирующее влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга, что проявляется в уменьшении области повреждения, сохранности белого вещества и выживании астроцитов в эпицентре травмы, а также в прилежащих ростральном и каудальном фрагментах спинного мозга. Впервые установлено, что композиция аминокислот и микроэлементов (М4), введённая в гидро-гелевый матрикс на основе карбопола, стимулирует восстановление двигательной функции после полной перерезки спинного мозга мыши.

Научно-практическая значимость работы. В работе получены данные, обосновывающие целесообразность поиска новых клеточных типов, предназначенных для трансплантации с целью стимулирования регенерации в нервной системе. Установленное нами поддерживающее влияние трансплантации КОВ человека на олигодендроциты и потенциально на ремиелинизацию в обларти травматического повреждения спинного мозга подтверждает целесообразность применения КОВ в клинике. Данные о посттравматическом восстановлении спинного мозга позволяют рекомендовать микроглия-подобные клетки как перспективный клеточный тип для трансплантаций при травме спинного мозга человека. Полученные результаты о действии биосовместимых материалов на посттравматическое восстановление значимы для понимания механизмов пластичности спинного мозга.

Положения, выносимые на защиту:

1. Трансплантация клеток обонятельной выстилки человека в область гемисекции спинного мозга крысы стимулирует его регенерацию путём поддержания популяции олигодендроцитов в области повреждения.

2. Микроглия-подобные клетки, трансфицированные геном нейротрофина 3 (NT3), имеют выраженный миграционный потенциал и стимулируют посггравматиче-скую регенерацию спинного мозга мыши.

3. Композиция из аминокислот и микроэлементов в составе формируемого в разрыве спинного мозга гидрогелевого матрикса на основе карбопола стимулирует посттравматическое восстановление двигательной функции.

Апробация работы. Материалы работы доложены на XV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2008» (Москва, 2008); XIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань,. 2008); Всероссийской научной конференции «Ней-робиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008); Всероссийской конференции, посвященной 85-летию профессора Д'.С. Гордон (Чебокса-

ры, 2008); Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных "Инновации и актуальные проблемы техники и технологий" (Саратов, 2009); VI Всероссийском съезде АГЭ (Саратов, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 в журналах рекомендованных ВАК.

Структура и объём работы. Диссертационная работа в объёме 119 страниц машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 32 рисунками и 10 таблицами. Библиография включает 222 источника литературы, из них 216 иностранных и 6 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты с КОВ проведены на 30 белых беспородных половозрелых крысах-самках весом 200-250 гр. Эксперименты с МПК проведены на 26 половозрелых мышах-самках С57/В16 весом 17-18 гр. Эксперименты с гидрогелями полиакриловой кислоты (ПАК) и карбопола проведены на 27 белых беспородных мышах-самках весом 30-35 гр. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в Казанском государственном медицинском университете и одобренным Республиканским комитетом по этическим вопросам при Министерстве здравоохранения Республики Татарстан (протокол №2 от 13.03.07 г.).

Операции па спинном мозге. У наркотизированных крыс и мышей после ла-минэктомии и визуализации спинного мозга производили латеральную гемисек-цию справа на уровне Т8 или полную перерезку на уровне Т9. Рану ушивали послойно. В течение пяти дней после операции животным внутримышечно вводили 1 % раствор (6 мг/кг) цефазолина (крысы) или ампицилина (мыши).

Эксперименты с клетками обонятельной выстилки человека. Для трансплантации использовали нестин-позитивные нейральные стволовые КОВ человека, полученные в ФГУ «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского» (г. Москва) методом, описанным ранее (Савченко и др. 2005). Количество жизнеспособных клеток, предназначенных для трансплантации, было не менее 70%.

Животным опытной группы сразу после гемисекции шприцом Гамильтона вводили 200 тыс. клеток в 5 мкл раствора Рингера в две точки на расстоянии 1 мм ро-стральнее и каудальнее линии разреза и 0,5 мм латеральнее срединной линии. Животным контрольной группы в тех же условиях вместо клеток ¿водили раствор Рингера в том же объёме. Через 30 и 60 суток забирали фрагмент спинного мозга длиной 20 мм, через середину которого проходила плоскость гемисекции.

Эксперименты с микроглия-подобными клетками. Направлено дифференцированные из эмбриональной стволовой клетки мыши микроглия-подобные клетки (МПК) и плазмидные векторы для их трансфекции были получены в группе ней-рорегенерации Института реконструктивной нейробиологии, университетской клиники Бонна (Германия) по протоколу Tsuchiya et al. (2005) с изменениями (Napoli et al., 2009). Модификацию МПК плазмидой PLL3.7.-PGK-EGFP и их се-

лекцию производили методом лентивирусной трансфекции фибробластов линии 293 по стандартному протоколу Invitrogen (Naldini et al., 1996). В опытной группе МПК, экспрессирующие ген EGFP, дополнительно трансфицировали резистентной к неомицину плазмидой PLL3.7.-Neo-PGK-mNT3 с последующей селекцией по стандартному протоколу Invitrogen. Количество жизнеспособных клеток, предназначенных для трансплантации, было не менее 95%.

Через 7 суток после гемисекции животным опытных ipynn в хвостовую вену вводили по 4 млн. МПК-EGFP или MITK-EGFP-NT3 в 100 мкл фосфатного буфера (PBS). Животным контрольной группы в тех же условиях вводили 100 мкл PBS. Через 14 и 28 суток после введения клеток забирали 6 мм фрагмент спинного мозга, через середину которого проходила плоскость гемисекции.

Эксперименты по реконструкции тканевого матрикса. Гидрогели на основе биосовместимых карбомеров — полиакриловой кислоты (ПАК) и карбопола и их смеси с композицией аминокислот и микроэлементов М4 получали в НИЛ координационных соединений Химического института им. A.M. Бутлерова при Казанском государственном университете. Животным экспериментальных групп для заполнения дефекта ткани после полной перерезки спинного мозга вводили гель в количестве 3,6-4,0 мг на основе ПАК, карбопола, ПАК + М4, карбопол + М4. Животным контрольной группы производили полную перерезку спинного мозга без введения в разрыв гидрогелей.

Тестирование животных. Восстановление двигательной функции животных оценивали, визуализируя произвольные движения конечностей с помощью балльной шкалы «ВВВ» (Basso et al., 1995). Статистическую обработку результатов проводили методом ANOVA, а также с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Морфологические методы и морфометрия. Перед забором материала наркотизированным животным проводили последовательную транскардиальную перфузию фосфатным буфером (PBS) и раствором 4% параформальдегида. Выделенный фрагмент спинного мозга фиксировали в 10% формалине (рН 7,2-7,4) при 4°С в течение суток. В экспериментах с КОВ материал обезвоживали и заливали в парафин по стандартной методике, а в экспериментах с МПК материал постфиксировали в смеси DMSO-глицерин (1:5 по объёму) в течение 2 часов, заливали в'гель для криосрезов Tissue Teck (Sacura) и замораживали при-80°С.

На поперечных срезах спинного мозга, окрашенных метиленовым синим, в каудальном и ростральном направлениях от плоскости гемисекции определяли площади всего среза, белого вещества, серого вещества и области повреждения (Ankeny et al., 2004; Soares et al., 2007). В экспериментах с КОВ в этом же материале подсчитывали количество нейронов в участке серого вещества, расположенном вентрально от линии, проходящей во фронтальной плоскости через центральный канал. Также в этой группе производили подсчёт количества миелиновых волокон на поперечных полутонких срезах толщиной 2 мкм, окрашенных толуидиновым синим, на расстоянии 5 мм от плоскости гемисекции в ростральном и каудальном направлениях по методике Karimi et al. (2006). Для этого спинной мозг фиксировали в 2% глутаральдегаде, постфиксировали в 1% 0s04, обезвоживали и заливали в эпон-аралдит (Sigma). Достоверность различий оценивали по Стъюденгу.

Пероксидазная иммуногистохимия и иммунофлюоресценция. На поперечных срезах спинного мозга крыс через 30 суток после травмы и введения КОВ оценивали миграцию трансплантированных клеток. Для этого проводили иммуно-

гистохимическую реакцию с антителами против ядерного антигена клеток человека (HNu) (1:100) (Chemicon). В этом же материале и через 60 суток после травмы иммунофлюоресцентным методом исследовали экспрессию проапоптозных белков с антителами против касназыЗ (R&D Systems) (1:100) и рецептора FAS (CD95) (Santa Cruz Biotechnology) (1:80), а также с антителами против маркёра олигоденд-роцитов 04 (R&D Systems) (1:100).

В экспериментах с МПК иммуногистохимические реакции проводили на поперечных срезах спинного мозга мышей-реципиентов этих клеток через 35 суток после гемисекции. Для реакций использовали антитела против маркёра астро-цитов GFAP (Dako) (1:100) и FAS (Santa Cruz Biotechnology) (1:50). Места связывания антител при проведении пероксидазной реакции визуализировали с помощью DAB (Dako). Иммунофлюоресцентные реакции проводили в культурах клеток до трансплантации и на поперечных срезах спинного мозга мышей, забранного через 21 и 35 суток после операции. Для реакций in vitro использовали антитела против маркёра микроглии/макрофагов Iba-1 (Wako) (1:100) и NT3 (Santa Cruz Biotechnology) (1:50), для реакций на спинном мозге использовали антитела против GFAP (Dako) (1:100), Iba-1 (Wako) (1:200) и NT3 (Santa Cruz Biotechnology) (1:100). Для выявления мест связывания антител применяли флюоресцентную метку СуЗ (Dianova) (1:300), Суммарную иммунореактивность Iba-1- и GFAP- экспрес-сирующих клеток оценивали в пикселах на оцифрованных изображениях поперечных срезов спинного мозга по методу Deumens et al. (2006).

Морфофункциональная характеристика спинного мозга крысы после гемисекции и введения в область травмы клеток обонягтельной выстилки человека

Начиная с 7 суток после операции произвольные движения задних конечностей постепенно восстанавливались. Среднее значение показателя теста ВВВ для наблюдений в интервале между 7 и 28 сутками после операции составило 9,3 балла в опыте и 8,7 балла в контроле. В интервале между 32 и 60 сутками этот показатель составил в опыте 13,4 балла и в контроле 12,4 балла. По сравнению с контролем, среднее значение данного показателя при использовании КОВ увеличивается с 21 по 32 сутки после операции на 10,2% (Р<0,05), а с 35 по 53 сутки — на 13,5% (Р<0,05) (рис. 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Рис. I. Восстановление двигательной функции (тест ВВВ). По оси ординат — показатель теста. По оси абсцисс — сроки после операции в сут. * — Р<0,05 при сравнении показателей в группах с КОВ и раствором Рингера.

7 11 14 18 21 25 28 32 35 39 42 46 49 53 56 60

В области послеоперационного дефекта спинного мозга явных различий в характере морфологических изменений между контролем и опытом не обнаружено. К 30 и 60 суткам в области травмы и прилегающих каудальном и ростральном фрагментах спинного мозга границы между серым и белым веществом не прослеживались. В центральной зоне тканевого дефекта обнаружены многочисленные патологические полости (кисты) различного размера. В этой же зоне формируется глиомезо-дермальный рубец. В его составе сохраняются полости, окружённые прослойками соединительной ткани с выраженным астроглиозом и небольшим количеством капилляров.

Морфометрический анализ материала на 30 и 60 сутки после травмы показал, что площадь поперечного сечения мозга и площадь белого вещества восстанавливаются по мере удаления от эпицентра травмы в обоих направлениях, при этом различия между контролем и опытом зарегистрированы только на 60 сутки при удалении от плоскости гемисекции на 3 мм в ростральном направлении. При этом в опыте площадь поперечного сечения всего мозга возрастает на 15,3% (Р<0,05) по сравнению с контролем, а площадь белого вещества при введении КОВ на 14,6% (Р<0,05) больше, чем в контроле. По мере удаления от эпицентра травмы площадь области повреждения, размеры полостей и их количество уменьшаются, восстанавливается нормальная морфологическая картина спинного мозга, определяются чёткие границы белого и серого вещества. Несмотря на это, через 30 и 60 суток после травмы достоверных различий в площади восстановленного серого вещества между контролем и опытом выявлено не было. По показателю площади области повреждения достоверные различия между группами зарегистрированы только на 30 сутки при удалении от эпицентра травмы на 7 мм в ростральном направлении, где данный показатель в контроле превышает показатель в опыте на 62,8% (Р<0,05).

На поперечных срезах рострального фрагмента спинного мозга, удалённого от плоскости гемисекции на 5 мм, через 60 суток после травмы количество нейронов на ипсилатеральной стороне по сравнению с контралатеральной уменьшается в контроле и опыте соответственно на 31,6%(Р<0,05) и 26,5% (Р<0,05). В каудальном фрагменте при том же удалении количество нейронов на ипсилатеральной стороне уменьшается по сравнению с контралатеральной стороной в контроле и опыте соответственно на 35% (Р<0,05) и 45,8% (Р<0,05). Достоверных различий между группами не зарегистрировано.

Через 60 суток после травмы в участках спинного мозга, удалённых от плоскости гемисекции на 5 мм в ростральном направлении, количество миелиновых волокон на ипсилатеральной стороне, по сравнению с контралатеральной, уменьшается в контроле и опыте соответственно на 39,3% (Р<0,05) и 37,9% (Р<0,05). В аналогичном участке каудального фрагмента количество миелиновых волокон уменьшается в контроле и опыте соответственно на 46,0% (Р<0,05) И 41,9% (Р<0,05). Достоверных различий между группами не зарегистрировано.

Результаты иммуногистохимической реакции с антителами против ядерного антигена клеток человека (Н№д) позволили оценить миграционный потенциал трансплантированных в область латеральной гемисекции КОВ. Через 30 суток после введения клеток на поперечных срезах спинного мозга в дорсальной его части обнаружено выраженное скопление НКи+-клеток, которое распространяется на серое вещество. По мере удаления от места введения количество подобных клеток

убывает. IiNu"1-клетки мигрировали на расстояние до 6,2±1,23 мм в ростральном и до 5,8±1,08 мм в каудальном направлениях. КОВ человека или крысы начинают мигрировать через 4 часа после введения в спинной мозг иммунодефицитных крыс и к 7 суткам они проходят расстояние в 1 мм как в ростральном, так и каудальном направлении (Deng et al., 2006). В единичных работах показано выживание трансплантируемых непосредственно в патологическую полость клеток на протяжении трёх недель (Boyd et al, 2004). К третьему месяцу после трансплантации выживает всего 2% вводимых клеток обонятельных структур, трансплантированных через два месяца после нанесения контузионной травмы спинного мозга крысы (Barakat et al., 2005).

Через 60 суток после травмы в участках спинного мозга, удалённых от плоскости гемисекции на расстояние 3 мм в ростральном направлении, количество FAS+-KneTOK на ипсилатеральной стороне, по сравнению с контралатеральной, увеличивается в контроле и опыте соответственно на 44,4% (Р<0,05) и 50,8% (Р<0,05). В аналогичном участке каудального фрагмента количество FAS+-icieTOK на ипсилатеральной стороне, по сравнению с контралатеральной, увеличивается в контроле и опыте соответственно на 62,1% (Р<0,05) и 53,5% (Р<0,05). Достоверных различий между группами не зарегистрировано.

На поперечных срезах спинного мозга, удалённых от плоскости гемисекции на 5 мм в ростральном и каудальном направлениях, через 60 суток после травмы достоверных различий в количестве каспаза 3+-клеток между контролем и опытом выявлено не было, однако в группе с КОВ количество подобных клеток имеет тенденцию к уменьшению.

Через 60 суток после травмы количество 04+-клеток в опытной группе в ростральном фрагменте спинного мозга на расстоянии 3 мм от плоскости гемисекции на ипсилатеральной стороне на 22,8% (Р<0,05) больше, чем в контроле (рис. 2). При этом в опыте на ипсилатеральной стороне количество 04+-клеток на 42,5% (Р<0,05) меньше, чем на контралатеральной, а на контралатеральной стороне количество подобных клеток на 11,2% (Р<0,05) меньше, чем в интактном спинном мозге. Достоверных различий по данному показателю в каудальном фрагменте спинного мозга не обнаружено.

Рис. 2. Количество 04+-клеток (ось ординат). Пунктирная линия — количество 04т-клеток на уровне Т8 у интакт-ных животных. По оси абсцисс — удаление от места травмы в мм в ростральном (+) и каудальном (-) направлениях. * •— Р<0,05 при сравнении показателей при введении КОВ (серые столбики) и раствора Рингсра (белые столбики).

Таким образом, ксенотрансплантация КОВ непосредственно в область латеральной гемисекции спинного мозга крысы тотчас после нанесения травмы оказыва-

ет стимулирующее влияние на восстановление двигательной функции. Этот эффект, зарегистрированный на фоне отсутствия достоверных различий между опытом и контролем по площади белого вещества каудальнее места травмы, количеству выживающих нейронов, показателям выживания клеток по критериям экспрессии FAS и каспазы 3, может быть связан со стимулированием выживания и дифферен-цировки олигодендроцитов. К 60 суткам после гемисекции количество олигодендро-цитов в непосредственной близости от места травмы уменьшается практически вдвое. Феномен увеличения количества олигодендроцитов в условиях трансплантации КОВ в область повреждения спинного мозга может иметь несколько объяснений. Во-первых, трансплантируемые клетки, являясь источником нейротрофичсских факторов, способны поддерживать посттравматическое выживание нейральных клеток в спинном мозге реципиента, в том числе и олигодендроцитов. Согласно другому предположению, трансплантация КОВ может стимулировать дифференцировку предшественников олигодендроцитов (KulbatsM et al., 2007). Активация олигодендроцитов позволяет предполагать их участие, наряду со шванновскими клетками, в ремиелинизации регенерирующих аксонов, что может быть одним из факторов, способствующих частичному восстановлению двигательных функций при травме спинного мозга и трансплантации КОВ.

Морфофункциональная характеристика спинного мозга мыши после гемисекции и введения в хвостовую вену мнкроглия-подобпых клеток

На всех сроках эксперимента наибольшие показатели восстановления двигательной функции (тест ВВВ) зарегистрированы в группе с введением в хвостовую вену MIIK-EGFP-NT3. Среднее значение показателя теста ВВВ для наблюдений в интервале между 18 и 35 сутками после операции составило для группы МПК-EGFP — 8,2 балла, для МПК-EGFP-NT3 — 9,0 баллов и в контроле 7,1 балла. В группе MnK-EGFP-NT3 в этот период показатель теста на 21% (Р<0,05) выше, чем в контрольной группе. На сроках 32 и 35 суток после операции показатель теста ВВВ в группе с введением MnK-EGFP-NT3 был больше соответственно на 12,3% (Р<0,05) и 13,9% (Р<0,05), чем в группе животных, которым вводили МПК-EGFP (рис. 3). По показателю теста ВВВ при сравнении групп с введением МПК-EGFP и PBS (контроль) достоверные различия не зарегистрированы.

Рис. 3. Восстановление двигательной функции (тест ВВВ). По оси ординат — показатель теста. По оси абсцисс — сроки после операции в сут. *— Р<0,05 при сравнении показателей в группах с введением PBS и МПК-EGFP. ** — Р<0,05 при сравнении показателей в группах с введением МПК-EGFP и МПК-EGFP-NT3.

3 7 11 14 18 21 25 28' 32 35

Через 21 сутки после травмы на продольных срезах спинного мозга мыши установлено, что у животных с введением МПК-EGFP или MIIK-EGFP-NT3 меченые клетки локализуются преимущественно в области глиомезодермального рубца. По мере удаления от рубца в каудальном и ростральном направлениях количество флюоресцирующих клеток значительно снижается. Аналогичная картина наблюдалась при исследовании материала, забранного через 35 суток после травмы. Зелёное свечение обнаружено как в группе с введением МПК-EGFP, так и в группе с введением MnK-EGFP-NT3. Флюоресцирующие клетки не обнаружены в спинном мозге мышей контрольной группы, которым в тех же условиях вводили PBS.

Через 35 суток после операции в группах с введением МПК-EGFP, МПК-EGFP-NT3 и PBS в прилегающих к области травмы фрагментах типичная структура спинного мозга отсутствует. В эпицентре травматического повреждения формируются многочисленные кисты различного размера, уменьшающиеся по мере удаления от эпицентра травмы.

Морфометрический анализ в каудальном и ростральном фрагментах спинного мозга указывает на положительную динамику восстановления белого вещества и уменьшение области повреждения у животных с введением МГЖ-EGFP-NT3. На 35 сутки после травмы в группе животных с введением МПК-EGFP-NT3 площадь сохранённого белого вещества при удалении от плоскости гемисекции на 0,8 и 1 мм в ростральном направлении увеличивается соответственно на 16,9% (Р<0,05) и 16% (Р<0,05), а при том же удалении в каудальном направлении — на 31,3% (Р<0,05) и 21,3% (Р<0,05), по сравнению с аналогичными показателями в группе животных с введением PBS. При трансплантации MnK-EGFP-NT3 показатель восстановления площади белого вещества при удалении от плоскости гемисекции на расстояние в 1 мм в каудальном направлении возрастает на 16,2% (Р<0,05), по сравнению с аналогичным показателем в соответствующей области в группе с введением МПК-EGFP (рис. 4А).

-1 -0,8 -0,5 -0,2 +0,2 +0,5 +0.8 +1 -1 -0,а -0,5 -0,2 +0.2 +0,5 +0,8 +1

Рис. 4. Площадь сохранённого белого вещества (А) и области повреждения (Б) (ось ординат, мм2) через 35 суток после латеральной гемисекции спинного мозга и введения микроглия-подобных клеток (МПК) в хвостовую вену мыши. * — Р<0,05 при сравнении показателей в группах с введением PBS и MnK-EGFP-NT3. ** — Р<0,05 при сравнении показателей в группах с введением МПК-EGFP и МПК-EGFP-NT3. По оси абсцисс — удаление от места травмы в мм в ростральном (+) и каудальном (-) направлениях!

При введении МПК-EGFP-NT3 значительно уменьшается область повреждения спинного мозга. К 35 суткам после травмы в группе с MIIK-EGFP-NT3 при удалении на 0,8 и 1 мм от плоскости гемисекции область повреждения уменьшается соответственно на 29,6% (Р<0,05) и 50% (Р<0,05) в ростральном фрагменте и на 48% (Р<0,05) и 62,5% (Р<0,05) в каудальном, по сравнению с группой с введением PBS. При трансплантации MIIK-EGFP-NT3 по сравнению с введением МПК-EGFP площадь области повреждения уменьшается на 57,1% (Р<0,05) при удалении от места травмы на 1 мм в каудальном направлении и на 52,4% (Р<0,05) при том же удалении в ростральном направлегаш (рис. 4 Б).

В интактном спинном мозге мыши реакция с антителами против FAS выявляет единичные иммунопозитивные клетки, равномерно распределённые по всему срезу спинного мозга. При подсчёте количества FAS+-k.tctok через 35 суток после операции в участках спинного мозга в эпицентре травмы и при удалении на 0,8 мм в ростральном и каудальном направлениях не выявлены достоверные различия между группами с введением PBS, МПК-EGFP и MITK-EGFP-NT3.

Через 14 суток после введения в хвостовую вену меченые МПК локализуются преимущественно в зоне образования гаиомезодермального рубца. Через 35 суток после гемисекции в группе с введением MIIK-EGFP-NT3 выявлено присутствие NT3+-racTOK в эпицентре травмы и при удалении в ростральном и каудальном направлениях. Подобные клетки не обнаружены в спинном мозге мышей, которым в тех же условиях вводили МПК-EGFP или PBS.

В интактном спинном мозге мыши мелкие Iba-1+-клетки равномерно распределены в сером и белом веществе. После нанесения травмы и введения МПК в структурах спинного мозга выявлены крупные 1Ьа-1+-клетки, которые одновременно содержали флюоресцентную метку EGFP. Эти результаты свидетельствуют о принадлежности данных клеток к популяции трансплантируемых МПК, которые мигрируют из крови в структуры спинного мозга, где сохраняют фенотип клеток микроглии. В группах с введением МПК крупные 1Ьа-1+-клетки в большом количестве локализуются в области травмы спинного мозга. По мере удаления от эпицентра травмы, как в ростральном, так и в каудальном направлениях, экспрессия EGFP снижается соизмеримо со снижением экспрессии Iba-1.

Во всех группах в эпицентре травмы и во фрагментах, удалённых от плоскости гемисекции на 0,8 мм в ростральном и каудальном направлениях, прослежены мелкие 1Ьа-1+-клетки, не экспрессирующие EGFP. Данный тип клеток был определён как собственные клетки микроглии спинного мозга. Введение МПК-EGFP и МПК-EGFP-NTj значительно снижает количество собственных' клеток микроглии в эпицентре травмы, однако при удалении в ростральном и каудальном направлениях уровень экспрессии Iba-1 в данных группах приближается к интактным жнвотным. В группе с введением PBS в области травмы наблюдается увеличение экспрессии Iba-1, по сравнению с интактным спинным мозгом, но при удалении от плоскости гемисекции количество подобных клеток значительно меньше, чем в группах с введением МПК (рис. 5А).

В интактном спинном мозге мыши ОРАР+-клетки располагаются в большом количестве по периферии белого вещества, преимущественно в передних и задних канатиках. Через 35 суток после гемисекции и введения PBS GFAP+-ioieTKH в области травмы практически отсутствуют, отростки единичных клеток обнаружива-

ются по периферии белого вещества и лишь на отдалении от эпицентра травмы. Противоположная картина наблюдается в спинном мозге мышей, которым были введены MITK-EGFP-NT3. В данной группе GFAP+-KJieTKH локализуются преимущественно вокруг патологических полостей и их количество области повреждения вдвое больше, чем в интактном спинном мозге. В ipynne с введением МПК-EGFP экспрессия GFAP в эпицентре травмы ниже, чем в группе с введением МПК-EGFP-NT3, но достоверно выше, чем в интактном спинном мозге.

По характеру экспрессии GFAP на расстоянии 0,8 мм от эпицентра травмы в каудальном и в ростральном направлениях между интактными животными и при введении MnK-EGFP-NT3 различия не обнаружены. GFAP-иммунореактивность несколько снижается при введении МПК-EGFP, тогда как при введении PBS иммунореактивность GFAP уменьшается более чем на 50% (рис. 5 Б). Достоверных различий по экспрессии GFAP между группами с введением МПК-EGFP и MIIK-EGFP-NT3 при удалении на 0,8 мм в обоих направлениях зарегистрировано не было.

250

200

150

100

Л '1......'

160 140 120 100 80 60 40 -20 - 0

•-К ........J

♦ Ингактные -•--PBS А- МПК-EGFP MnK-EGFP-NT3

-0,8 эпицентр +0,8

-0,8 эпицентр

Рис. 5. Иммунореактивность 1Ьа-1 (А) и вРАР (Б) экспрессирующих клеток в спинном мозге. По оси ординат — показатель иммунореактивности в пикселах. По оси абсцисс — удаление от места травмы в мм в ростральном (+) и каудальном (-) направлениях.

Исследования по клеточной терапии травмы спинного мозга указывают на слабую способность введённых в кровоток клеток мигрировать в область повреждения (Fan et al„ 2008). Согласно нашим данным, генетически модифицированные МПК, полученные из эмбриональных стволовых клеток, имеют выраженный миграционный потенциал и способны к длительному выживанию в травмированном спинном мозге. Показана активация и миграция в область повреждения собственных клеток микроглии из отдалённых от места травмы участков спинного мозга (Sawada et al., 2009). При этом миграционный потенциал собственных клеток микроглии ограничен, что согласуется с нашими результатами подсчёта количества Iba-lVEGFP'-клеток в участках спинного мозга, удалённых от плоскости геми-секции. В свою очередь, модифицированные Iba-1+/EGFP+ МПК, мигрируя в область травмы и замещая здесь погибшие собственные клетки микроглии, предотвращают миграцию резидентной микроглии из отдалённых участков, сдерживая

вторичную дегенерацию, что проявляется в улучшении показателей двигательной функции. Введение МПК-EGFP и MITK-EGFP-NT3 стимулирует увеличение количества GFAP^-клеток в эпицентре травмы с их локализацией вблизи образованных полостей. Кроме того, мигрирующие в область травмы МПК сдерживают посттравматическую гибель астроцитов в отдалённых от места травмы участках. Этот эффект может быть связан с отсроченной трансплантацией МПК. Подобная трансплантация макрофагов, направленно дифференцированных из различных источников, оказалась достаточно эффективной в восстановлении нервных связей в ЦНС (Schwartz, Yoles, 2006). Клетки микроглии, обладая выраженной фагоцитарной активностью, способностью вырабатывать нейротрофичсские факторы, факторы роста и другие стимуляторы нейрорегенерации, а также участвуя в иммунных реакциях в ЦНС, могут позитивно влиять на посттравматическую нейрореге-нерацию.

Доставка в область повреждения при помощи МПК нейротрофического фактора NT3 повышает эффективность регенерации спинного мозга. Этот результат согласуется с данными ряда исследований по трансплантации при травме спинного мозга трансфицированных геном NT3 фибробластов (Arvanian et al., 2006), глия-рестрицированных предшественников (Cao et al., 2005) и шванновских клеток (Guo et al., 2007). Полученные нами данные позволяют рассматривать МПК в качестве адекватного носителя терапевтических генов для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга.

Восстановление двигательной функции после перерезки спинного мозга мыши и введения в разрыв полиакриловой кислоты и карбопола

Наибольшие значения показателя двигательной активности были зарегистрированы при введении в разрыв спинного мозга карбопола с композицией аминокислот и микроэлементов (М4). На 7, 11 и 14 сутки после операции данный показатель был выше соответственно на 52,6%, 46,6% и 50,9% (Р<0,05), по сравнению с животными контрольной группы (перерезка спинного мозга без введения гидрогеля). В группе животных с введением в разрыв карбопола+М4 на тех же сроках выявлено увеличение показателя двигательной активности соответственно на 47,2%, 55,6% и 47,1% (Р<0,05), по сравнению с животными с введением в разрыв только карбопола (рис. 6).

-о-ПАК

Рис. 6. Восстановление двигательной функции (тест ВВВ). По оси ординат — показатель теста. По оси абсцисс — сроки после операции в сут. * — Р<0,05 при сравнении группы карбопол+М4 с контролем (перерезка без гидрогеля), ** —Р<0,05 при сравнении группы карбопол+М4 с группой с введением только карбопола.

18 21

25 28

Карбопол в сочетании с композицией аминокислот и микроэлементов (М4) проявил себя как наиболее эффективная среда для поддержания посттравматической регенерации спинного мозга. Под влиянием аминокислот и микроэлементов в составе карбопола показано более динамичное восстановление двигательной функции, что хорошо прослеживается при травме спинного мозга на ранних сроках тестирования. Отсутствие положительной динамики показателей функционального теста при использовании только карбопола без добавления аминокислот и микроэлементов даёт основание полагать, что сам гель не стимулирует нейроре-генерацшо, а лишь является адекватной поддерживающей средой для роста нервных волокон. Установленное нами эффективное восстановление двигательных функций на ранних сроках эксперимента в условиях применения карбопола с композицией аминокислот и микроэлементов может быть связано со способностью этих добавок участвовать в сборке олигопептидов, которые не только формируют тканевый матрихс, но и позитивно влияют на внутриклеточные сигнальные пути, поддерживая выживание нейронов и рост аксонов в мозге. Это предположение согласуется с данными ЕШя-ВеЬпке е1 а1. (2006) по регенерации аксонов ЦНС и восстановлению функции при формировании в области разрыва зрительного тракта специального матрикса из самособирающихся нановолокон, состоящих из олиго-пеитида с последовательностью аргинин - аланин - аспартат - аланин. Широкой спектр биологического действия композиций аминокислот и микроэлементов даёт основание полагать, что их системное воздействие на организм осуществляется через ЦНС в тесной взаимосвязи с иммунной системой.

ВЫВОДЫ

1. Введение клеток обонятельной выстилки человека в область гемисекции спинного мозга крысы стимулирует восстановление двигательной функции к 60 суткам после травмы за счёт поддержания популяции олигодендроцитов.

2. Количество миелиновых волокон и переживающих нейронов в прилегающих к области гемисекции спинного мозга крысы не коррелирует с показателями поведенческого теста ВВВ, как при трансплантации клеток обонятельной выстилки человека, так и без неё.

3. Микроглия-подобные клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток мыши, при аллотрансплантации способны мигрировать из периферической крови в область латеральной гемисекции спинного мозга мыши, где выживают в течение не менее 28 суток.

4. Аллотрансплантация микроглия-подобных клеток стимулирует посттравматическую регенерацию спинного мозга, что проявляется в улучшении двигательной функции и уменьшении области повреждения.

5. Трансфекция микроглия-подобных клеток геном нейротрофина 3 (ЫТЗ) повышает способность этих клеток при аллотрансплантации стимулировать посттравматическую регенерацию спинного мозга мыши, что установлено по критериям восстановления двигательной функции, уменьшения области повреждения, сохранности белого вещества и количества ОРАР+-клеток.

6. Имплантация в разрыв спинного мозга гвдрогелевого матрикса на основе кар-бопола с композицией аминокислот и микроэлементов улучшает восстановление двигательных функций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фомина (Масгутова), Г.А. Гидрогслевый матрикс на основе биосовмсстимых карбомеров для восполнения дефектов в нервной ткани / Г.А. Фомина (Масгутова), Р.Ф. Масгутов, В.Г. Штырлин, Ю.И. Зявкина, Ю.А. Челышев// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2007. - Том 2, №4. - С. 63-67.

2. Салахов, М.Х. Нанотехнологаи для нейрорегенерации / М.Х. Салахов, Н.И. Силкин, В.Д. Скирда, Г.А. Фомина (Масгутова), Ю.А. Челышев, В.Г. Штырлин // Проблемы нелинейного анализа в инженерных системах. - 2008. - Том 14, №1(29). -С. 79-84.

3. Масгутова, Г.А. Трансплантации клеток обонятельной выстилки человека в условиях гемисекции спинного мозга крысы / Г.А. Масгутова, Е.Е. Драгунова // Материалы XIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань. -2008. - С. 209.

4. Богов, A.A. Клеточные технологии для нейрорегенерации / АЛ. Богов, JI.3.Гельфанд, Р.Р.Исламов, В.Е. Крылов, Г.А. Масгутова, М.В.Нигметзянова, И.Р. Мухаметзянов, И.С. Рапшов, A.A. Ризванов, Ю.А. Челышев // Материалы Британско-Российского совещания «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества». Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология». - 2008. - С. 221-224.

5. Челышев, Ю.А. Восстановление двигательной функции при трансплантации в область гемисекции спинного мозга крысы клеток обонятельной выстилки или моно-нуклеарных клеток крови пуповины человека / Ю.А. Челышев, Г.Ф. Шаймарданова, И.В. Викторов, Е.А. Савченко, A.A. Ризванов, P.P. Исламов, А.П. Киясов, И.М. Газизов, Т.С. Йылмаз, М.С. Калигин, Г.А. Масгутова, Л.К. Шафигу.тлина, Н.И. Ланник, Д.И. Андреева // Материалы Всероссийской конференции «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток». - Самара. - 2008. -С. 232-233.

6. Масгутова, Г.А. Эффективность трансплантации клеток обонятельной выстилки человека при их внутривенной инъекции и локальном введении в область травмы / Г.А. Масгутова, Е.Е. Драгунова, Р.Ф. Масгутов, И.С. Рапшов, Ю.А. Челышев // Материалы XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов».-Москва.-2008.-С. 15-16.

7. Масгутова, Г.А. Миграция и выживание в области гемисекции спинного мозга мыши аллотрансплашированных микроглия-подобных клеток, трансфицированных геном NT3 / Г.А. Масгутова, Р.Ф. Масгутов, Ю.А. Челышев // Морфологические ведомости. - 2009. - №3-4. - С. 4246.

8. Масгутова, Г.А. Исследование влияния биосовместимых карбомеров на по-сггравматическое восстановление спинного мозга / Г.А. Масгутова, Р.Ф. Масгутов, В.Г. Штырлнн, Ю.А. Челышев // Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Инновации и актуальные проблемы техники и технологий».-Саратов.-2009.-Том 1.-С. 316-318.

9. Челышев, Ю.А. Клеточные технологии стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга / Ю.А. Челышев, Г.Ф. Шаймарданова, Р.Ф. Масгутов, Г.А. Масгутова, A.A. Ризванов, Я.О. Рубашкина // - Морфология. - 2009. - Том 136, №4.-С. 150-151.

Сокращения:

КОВ — клетки обонятельной выстилки

МПК — микроглия-подобные клетки

МПК-EGFP — МПК, трансфицированные геном EGFP

MIIK-EGFP-NT3 — МПК, трансфицированные генами EGFP и NT3

ПАК — полиакриловая кислота

ВВВ — поведенческий тест для оценки двигательной функции

EGFP — зелёный флюоресцентный белок

FAS — рецептор смерти, CD95

GFAP — глиальный фибриллярный кислый белок

HNu — ядерный антиген клеток человека

Iba-1 — маркёр микроглии/макрофагов

NT3 — нейротрофин 3

04 — маркёр олигодендроцитов

PBS — фосфатно-солевой буфер

Подписано в печать 03.03.10г. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. 1,25.

Тираж 100. Заказ № 197. Отпечатано с готового оригинал - макета в ООО «Вестфалика» г. Казань, ул. Б. Красная, 67. Тел.: 236-62-72

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Масгутова, Галина Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Феноменология экспериментальной травмы спинного мозга

1.2. Молекулярные и клеточные механизмы экспериментальной травмы спинного мозга

1.3. Трансплантация клеток как стратегия стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга 17 1.3.1. Клеточные технологии ремиелинизации при экспериментальной травме спинного мозга

1.4. Нейротрофические факторы в регенерации спинного мозга

1.5. Биосовместимые и биодеградируемые материалы для поддержания регенерации спинного мозга

1.6. Экспериментальные модели травмы спинного мозга

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Экспериментальные группы

2.2. Опыты с клетками обонятельной выстилки человека

2.3. Опыты с микроглия-подобными клетками

2.4. Опыты с гидрогелями на основе биосовместимых карбомеров — полиакриловой кислоты и карбопола

2.5. Операции на спинном мозге

2.6. Тестирование восстановления двигательной функции

2.7. Морфологические методы и морфометрия

2.8. Пероксидазная иммуногистохимия и иммунофлюоресцентные методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Морфофункциональная характеристика спинного мозга крысы после гемисекции и введения в область травмы клеток обонятельной выстилки человека

3.2. Морфофункциональная характеристика восстановления спинного мозга мыши после гемисекции и введения в хвостовую вену микроглия-подобных клеток

3.3. Восстановление двигательной функции после перерезки спинного мозга мыши и введения в разрыв полиакриловой кислоты и карбопола

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Посттравматическая регенерация спинного мозга грызунов при трансплантации клеток обонятельной выстилки, микроглия-подобных клеток и реконструкции тканевого матрикса биосовместимыми карбомерами"

Актуальность работы. Для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга активно изучают возможность доставки в область повреждения нейротрофических факторов, молекул адгезии, противоапоптозных молекул, нейтрализаторов естественных ингибиторов роста аксонов и др. В качестве средств доставки потенциальных стимуляторов регенерации исследуют клеточные носители, а также гелевый матрикс в потенциальном пространстве роста аксонов. Клеточная терапия рассматривается как один из перспективных подходов для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга. Исследования последнего десятилетия выявили новый источник клеток для трансплантации при повреждении спинного мозга -— клетки обонятельных структур (выстилки и луковицы) (Reier et al., 2004; Marshall et al., 2006). При трансплантации этих клеток отмечены нейропротекторный эффект (Lopez-Vales et al., 2004; Ramer et al., 2004), стимулирование регенерации аксонов (Ramon-Cueto et al., 2000; Lopez-Vales et al., 2006), ремиелинизация (Imaizumi et al., 2000; Sasaki et al., 2000) и частичное восстановление двигательной и чувствительной функций (Verdu et al., 2003; Lopez-Vales et al., 2006). Поддерживающее нейрорегенерацию влияние клеток обонятельной выстилки (КОВ) связывают с их способностью проникать через астроглиальный рубец и интегрироваться в ткань спинного мозга, продуцировать нейротрофические факторы, молекулы адгезии и белки внеклеточного матрикса (Perry et al., 2002; Barnett, Riddell, 2004; Викторов и др., 2006). Интерес к КОВ подкреплён лёгкой доступностью, малой инвазивностью процедуры забора материала и возможностью получения аутологичных клеток, не приводящей к длительному нарушению обоняния (Lanza et al., 1994; Ferron, Jusko, 1998). Несмотря на большое количество экспериментальных работ с использованием КОВ, как материала для трансплантации при травме спинного мозга, на сегодняшний день клеточные механизмы мие-линизации регенерирующих аксонов остаются неясными.

Важным критерием отбора стволовых и прогениторных клеток для трансплантации является их низкая онкогенность. Изучению этого вопроса при клеточной терапии экспериментальной травмы спинного мозга уделено внимание только в единичных работах (Kulbatski et al., 2007; Ronsyn et al., 2007). Другим, не менее важным, критерием отбора клеток для трансплантации является минимальная инвазивность процедуры введения клеток. Большинство исследований эффектов трансплантации клеток проведено с их введением непосредственно в область повреждения спинного мозга. При этом дополнительно травмируется ткань, что негативно влияет на процессы регенерации. Инъекции трансплантируемых клеток в сосудистое русло по этой причине более предпочтительны. Однако клетки, вводимые в кровоток, должны направленно мигрировать в область повреждения. Представляется очевидным, что наиболее предпочтительными кандидатами для эффективного применения вводимых через кровь клеток будут клетки мезенхимного происхождения (Dezawa, Ide, 2005; Lundberg, Blanc, 2009). Обоим вышеназванным критериям в наибольшей мере удовлетворяют происходящие из мезенхимы клетки микроглии, которые с точки зрения возможной трансформации кажутся более безопасными (Hartmann, Deimling, 2009). Для клеток микроглии показана активация при инфекции, ишемии и нейродегенеративных заболеваниях, способность мигрировать в область повреждения и экспрессировать цитокины, нейротрофины и иммуномо-дуляторы (Ekdahl et al., 2009). Несмотря на эти позитивные свойства, в литературе практически отсутствуют сведения о применении микроглии для трансплантации с целью стимулирования регенерации при травме спинного мозга.

Исследования Tsuchiya et al. (2005) открыли возможность получения микроглия-подобных клеток (МПК) путём направленной дифференцировки из эмбриональной стволовой клетки мыши. Представляется актуальным изучение эффективности трансплантации МПК, трансфицированных геном нейротрофи-на 3 (NT3). Этот нейротрофин регулирует нейрогенез, регенерацию аксонов (Хи et al., 1995) и процесс миелинизации олигодендроцитами in vitro и in vivo (Yan,

Wood, 2000; Jean et al., 2003). Выступая в роли хемоаттрактанта, NT3 обеспечивает в спинном мозге восстановление «правильных» синаптических контактов регенерирующих аксонов со своими мишенями (Alto et al., 2009) и наряду с другими нейротрофическими факторами поддерживает выживание клеток (Woodhoo, Sommer, 2008).

Для эффективной посттравматической нейрорегенерации актуальна реконструкция тканевого матрикса в потенциальном пространстве роста аксонов (Schmidt, Leach 2003). Этот подход активно разрабатывается для ЦНС (Novikova et al., 2003; Nomura et al., 2006), однако в клинике локальное применение фармакологических нейропротекторов и стимуляторов роста нервных волокон, подводимых к месту повреждения при помощи биосовместимых и биодеградируемых материалов, остаётся практически нереализованным. Для подобных задач в эксперименте наиболее исследованы природные биоматериалы, такие как коллаген (Yoshii, Oka, 2001), фибрин (Nakayama et al., 2007) и фибронектин (Phillips et al., 2004). В этом отношении из синтетических материалов интерес представляют полиакрилаты (Zhong, Bellamkonda, 2008), которые образуют высоковязкие кристаллические гидрогели (Осипова, 1999) и хорошо сочетаются с биологически активными веществами (Lomas et al., 2004). В свою очередь, биосовместимый карбомер Carbopol® 971Р NF, являясь полимером акриловой кислоты, образует гелевую матрицу, пролонгирующую действие фармакологически активных веществ (Hosmani, 2006). Ожидается, что введение композиции аминокислот и микроэлементов, в гидрогелевый матрикс на основе полиакриловой кислоты или карбопола, окажет позитивное влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга.

Цель и задачи исследования. Цель работы — оценить эффективность посттравматической регенерации спинного мозга грызунов при ксенотранс-плантации клеток обонятельной выстилки (КОВ) человека, аллотрансплантации микроглия-подобных клеток, трансфицированных геном NT3 (МПК-EGFP-NT3), и реконструкции тканевого матрикса биосовместимыми карбомерами.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. На модели латеральной гемисекции спинного мозга крысы на уровне Т8 изучить влияние трансплантации клеток обонятельной выстилки (КОВ) человека на восстановление двигательной функции задних конечностей и процессы деструкции и регенерации в прилегающих к месту травмы участках спинного мозга.

2. На модели латеральной гемисекции спинного мозга мыши на уровне Т8 исследовать способность микроглия-подобных клеток (МГПС), трансфициро-ванных генами зелёного флюоресцентного белка (EGFP) и NT3 (МПК-EGFP и MIIK-EGFP-NT3), к миграции из периферической крови в область травматического повреждения и их выживание в этой области.

3. Оценить структурные и гистохимические изменения в ростральном и кау-далыюм фрагментах спинного мозга мыши, прилегающих к области гемисекции на уровне Т8, при введении в хвостовую вену МПК-EGFP и МПК-EGFP-NT3.

4. На модели полной перерезки спинного мозга мыши на уровне Т9 оценить восстановление двигательной функции задних конечностей в условиях имплантации в разрыв нервной ткани гидрогеля на основе биосовместимых карбомеров — полиакриловой кислоты и карбопола (Carbopol® 97IP NF).

Научная новизна работы. Впервые при длительном мониторинге описан характер гистологических изменений после гемисекции спинного мозга крысы при трансплантации КОВ. Получены данные о поддерживающем влиянии КОВ человека на выживание олигодендрсцитов в прилегающих к месту травмы отделах спинного мозга крысы. Впервые показано, что количество миелиновых волокон и переживающих нейронов после гемисекции спинного мозга может не коррелировать с показателями функционального теста (ВВВ). Впервые произведена генетическая модификация микроглия-подобных клеток (МГПС) генами EGFP и NT3. Проведена оценка их способности к миграции и экспрессии гена нейротрофического фактора NT3 in vitro и in vivo. Показано, что введённые через хвостовую вену МПК оказывают стимулирующее влияние на посттравматическую регенерацию спинного мозга, что проявляется в уменьшении области повреждения, сохранности белого вещества и выживании астроцитов в эпицентре травмы, а также в прилежащих ростральном и каудальном фрагментах спинного мозга. Впервые установлено, что композиция аминокислот и микроэлементов (М4), введённая в гидрогелевый матрикс на основе карбопола, стимулирует восстановление двигательной функции после полной перерезки спинного мозга мыши.

Научно-практическая значимость работы. В работе получены данные, обосновывающие целесообразность поиска новых клеточных типов, предназначенных для трансплантации с целью стимулирования регенерации в нервной системе. Установленное нами поддерживающее влияние трансплантации КОВ человека на олигодендроциты и потенциально на ремиелинизацию в области травматического повреждения спинного мозга подтверждает целесообразность применения КОВ в клинике. Данные о посттравматическом восстановлении спинного мозга позволяют рекомендовать микроглия-подобные клетки как перспективный клеточный тип для трансплантаций при травме спинного мозга человека. Полученные результаты о действии биосовместимых материалов на посттравматическое восстановление значимы для понимания механизмов пластичности спинного мозга.

Положения, выносимые на защиту:

1. Трансплантация клеток обонятельной выстилки человека в область гемисек-ции спинного мозга крысы стимулирует его регенерацию путём поддержания популяции олигодендроцитов в области повреждения.

2. Микроглия-подобные клетки, трансфицированные геном нейротрофина 3 (NT3), имеют выраженный миграционный потенциал и стимулируют посттравматическую регенерацию спинного мозга мыши.

Апробация работы. Материалы работы доложены на XV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоно-сов-2008» (Москва, 2008); XIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань, 2008); Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008); Всероссийской конференции, посвящённой 85-летию профессора Д.С. Гордон (Чебоксары, 2008); Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных "Инновации и актуальные проблемы техники и технологий" (Саратов, 2009); VI Всероссийском съезде АГЭ (Саратов, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 в журналах рекомендованных ВАК.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Масгутова, Галина Андреевна

ВЫВОДЫ

2. Количество миелиновых волокон и переживающих нейронов в прилегающих к области гемисекции спинного мозга крысы не коррелирует с показателями поведенческого теста в открытом поле (ВВВ), как при трансплантации клеток обонятельной выстилки человека, так и без неё.

5. Трансфекция микроглия-подобных клеток геном нейротрофина 3 (NT3) повышает способность этих клеток при аллотрансплантации стимулировать посттравматическую регенерацию спинного мозга мыши, что установлено по критериям восстановления двигательной функции, уменьшения области повреждения, сохранности белого вещества и количества GFAP+-mieTOK.

6. Имплантация в разрыв спинного мозга гидрогелевого матрикса на основе карбопола с композицией аминокислот и микроэлементов улучшает восстановление двигательных функций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Масгутова, Галина Андреевна, Саранск

1. Abe, Y. «Anoikis» of oligodendrocytes induced by Wallerian degeneration: ul-trastructural observations. / Y. Abe, T. Yamamoto, Y. Sugiyama, T. Watanabe, N. Saito, H. Kayama, T. Kumagai// J. Neurotrauma. 1999. - Vol.16. -P.945-952.

2. Acheson, A. Detection of brain-derived neurotrophic factor—like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF / A. Acheson, P.A. Barker, R.F. Alderson, F.D. Miller, R.A. Murphy // Neuron. 1991. -Vol.7(2). - P.265—275.

3. Akiyama, Y. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells / Y. Akiyama, C. Radtke, O. Honmou, J.D. Kocsis // Glia. 2002. - Vol.39. - P.229-236.

4. Akiyarna, Y. Remyelination of the rat spinal cord by transplantation of identified bone marrow stromal cells / Y. Akiyarna, C. Radtke, J.D. Kocsis // J. Neurosci. 2002. - Vol.22. - P.6623-6630.

5. Allen, A. Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury or fracture dislocation of spinal column / A. Allen // J. A.M. Med Assoc. — 1911. Vol.57. - P.878-880.

6. Alto, L. Chemotropic guidance facilitates axonal regeneration and synapse formation after spinal cord injury / L.T. Alto, L.A. Havton, J.M. Conner, E.R. Hollis Ii, A. Blesch, M.H. Tuszynski // 2009 Nat Neurosci. 2009. -Vol. 12(9).-P. 1106-1113.

7. Ankeny, D. Bone marrow transplants provide tissue protection, directional guidance for axons after contusive spinal cord injury in rat / D.P. Ankeny,

8. D.M. McTigue, L.B. Jakeman // Exp. Neurol. 2004. - Vol.190. - P. 17-31.

9. Asher, R. Versican is upregulated in CNS injury, is a product of oligodendrocyte lineage cells /R.A. Asher, D.A. Morgenstern, M.C. Shearer, K.H. Adcock, P. Pesheva, J. W. Fawcett // J. Neurosci. 2002. - Vol.22. -P.2225—2236.

10. Azari, M. Induction of endogenous neural precursors in mouse models of spinal cord injury and disease / M.F Azari, C. Profyris, D.W. Zang, S. Petratos, S.S. Cheema // Eur. J. Neurol. -2005. Vol.12. -P.638-648.

11. Bachelin, C. Efficient myelin repair in the macaque spinal cord by autologous grafts of Schwann cells / C. Bachelin, F. Lachapelle, C. Girard, P. Moissonnier, C. Serguera-Lagache, J. Mallet, D. Fontaine, A. Chojnowski,

12. E. Le Guern, B. Nait-Oumesmar, A. Baron-Van Evercooren// Brain. 2005. - Vol.l28.-P.540-549.

13. Bajrovic, F. Long-term effects of deprivation of cell support in the distal stump on peripheral nerve regeneration / F. Bajrovic, M. Bresjanac, J. Sketelj // J. Neurosci Res. 1994. - Vol.39(l). -P.23-30.

14. Barakat, D. Survival, integration and axon growth support of glia transplantation into the chronically contused spinal cord / D.J. Barakat, S.M. Gaglani,

15. S.R. Neravetla, A.R. Sanchez, C.M. Andrade, Y. Pressman, R. Puzis, M.S. Garg, M.B. Bunge, D.D. Pearse // Cell Transplantation. 2005. - Vol.14. - P.225—240.

16. Bareyre, F. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats / F.M. Bareyre // Nature Neurosci. 2004. - Vol.7. - P.269-277.

17. Barnett, S. Olfactory ensheathing cells (OECs), the treatment of CNS injury: advantages, possible caveats / S.C. Barnett, J.S. Riddell // J. Anat. 2004. -Vol.204(1). - P.57-67.

18. Barres, B. Does oligodendrocyte survival depend on axons? / B.A. Barres, M.D. Jacobson, R. Schmid, M. Sendtner, M.C. R.A.ff// Curr Biol. 1994. -Vol.3.-P.489-497.

19. Basso, D. A sensitive, reliable locomotor rating scale for open field testing in rats / D.M. Basso, M.S. Beattie, J.C. Bresnahan // Neurotrauma. 1995. -Vol.l2(l). -P.1-21.

20. Basso, D. Neuroanatomical substrates of functional recovery after experimental spinal cord injury: implications of basic science research for human spinal cord injury / Basso DM. // Phys Ther. 2000. - Vol.80(8). - P.808-817.

21. Basso, D. Graded histological, locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transaction / D.M. Basso, M.S.Beattie, J.C. Bresnahan // Exp. Neurol. 1996. - Vol.139. - P.244-256.

22. Beattie, M. Endogenous repair after spinal cord contusion injuries in the rat / M.S. Beattie // Exp. Neurol. 1997 - Vol. 148. - P.453-463.

23. Beites, C. Identification, molecular regulation of neural stem cells in the olfactory epithelium / C.L. Beites, S. Kawauchi, C.E.Crocker, A.L. Calof// Exp. Cell Res. 2005. - Vol.l0;306(2). - P.309-316.

24. Belkas, J. Long—term in vivo biomechanical properties, biocompatibility of poly(2—hydroxyethyl methacrylate-co-methyl methacrylate) nerve conduits

25. J.S. Belkas, C.A. Munro, M.S. Shoichet, M. Johnston, R. Midha// Biomate-rials. 2005. - VoI.2(6). - P. 1741-1749.

26. Bellamkonda, R. Peripheral nerve regeneration: An opinion on channels, scaffolds, anisotropy / R.V. Bellamkonda // Biomaterials. 2006. - Vol.27. -P.3515—3518.

27. Blits, B. Direct gene therapy for repair of the spinal cord / В Blits, M.B. Bunge // J. Neurotrauma. 2006. - Vol.23(3^1). - P.508-520.

28. Brittis, P. Nogo domains and a Nogo receptor: implications for axon regeneration/P. A. Brittis, J.G. Flanagan, //Neuron. -2001. Vol.30. - P. 11-14.

29. Buchli, A. Repair of the injured spinal cord. A joint approach of basic, clinical research / A.D. Buchli, E. Rouiller, R. Mueller, V. Dietz, M. Schwab // Neu-rodegener Dis. 2007. - Vol.4. - P.51-56.

30. Bunge, R. Linkage between axonal ensheathment, basal lamina production by Schwann cells / R.P. Bunge, M.B. Bunge, C.F. Eldridge // Ann Rev Neurosci. 1986. - Vol.9. - P.305-328.

31. Caggiano, A. ABCI improves locomotion, bladder function following contusion injury of the rat spinal cord / A.C. Caggiano, M.P. Zimber, A. Canguly, A.R. Blight, F. A. Gruskin // J. Neurotrauma. 2005. - Vol.22. - P.226-239.

32. Carter, J. Effect of spinal cord transection on neuromuscular function in the rat /J.G. Carter, M.D. Sokoll, S.D. Gergis // Anesthesiology. 1981. - Vol.55. -P.542-546.

33. Chen, C. High-Efficiency Transformation of Mammalian Cells by Plasmid DNA. / C. Chen, H. Okayama // Molec. Cell. Biol. 1987. - Vol.7. - P.2745-2752.

34. Cheng, H. Gait analysis of adult paraplegic rat after spinal cord repair /Н. Cheng, S. Almstrijm, L. Gimenez-Llort, R. Chang, S.O. Ogren, B. Hoffer, L. Olson // Exp. Neurol. 1997. - Vol. 148. - P.544-557.

35. Cheng, H. Neuroprotection of glial cell line-derived neurotrophic factor in damaged spinal cords following contusive injury / H. Cheng, J.P. Wu, S.F. Tzeng // J. Neurosci Res. 2002. - Vol.69(3). - P.397-405.

36. Chiang, H. Reinnervation of muscular targets by nerve regeneration through guidance conduits / H.Y. Chiang, H.F. Chien, H.H. Shen, J.D. Yang, Y.H.Chen, J.H. Chen, S.T. Hsieh// J. Neuropathol Exp Neurol. 2005. -Vol.64. -P.576-587.

37. Choi, B. Autologous fibrin glue in peripheral nerve regeneration in vivo /B.H.Choi, S.G. Han, S.H. Kim, S.J. Zhu, J.Y. Huh, J.H.Jung, S.H.Lee, B.Y. Kim // Microsurgery. 2005. - Vol.25(6). - P.495^199.

38. Chu, D. Delayed cell death signaling in traumatized central nervous system: hypoxia / D. Chu, J. Qiu, M. Grafe, R. Fabian, T.A. Kent, D. Rassin, O. Nesic, K. Werrbach-Perez, R. Perez-Polo // Neurochem Res. — 2002. Vol.27. — P.97-106.

39. Collazos-Castro, J. Olfactory glia transplantation into cervical spinal cord contusion injuries / J.E. Collazos-Castro, V.C. Muneton-Gomez, M. Nieto-Sampedro // J. Neurosurg Spine. 2005. - Vol.3(4). - P.308-317.

40. Deng, C. Survival and migration of human and rat olfactory ensheathing cells in intact and injured spinal cord / C. Deng, C. Gorrie, I. Hayward, B. Elston,

41. M. Venn, A. Mackay-Sim, P. Waite // J. Neurosci Res. 2006. - Vol.15. -Vol.83(7). - P.1201-1212.

42. Dezawa, M. Novel heparin/alginate gel combined with basic fibroblast growth factor promotes nerve regeneration in rat sciatic nerve / M. Dezawa, C. Ide // J Biomed Mater Res. 2005. - Vol.71(4). - P.661-668.

43. Dheen, S. Microglial activation, its implications in the brain diseases / S. Dheen, C. Kaur, E.A. Ling // Curr. Med. Chem. 2007. - Vol. 14(11). -P.l 189—1197.

44. Dubreuil, C. Rho activation patterns alter spinal cord injury, the role of activated Rho in apoptosis in the central nervous system / C.I. Dubreuil, M.J. Winton, I. McKerracher // J. Cell Biol. 2003. - Vol.162. - P.233-243.

45. Ekdahl, C. Brain inflammation, adult neurogenesis: the dual role of microglia /С.Т. Ekdahl, Z. Kokaia, O. Lindvall // H. Neuroscience. 2009. -Vol.l58(3). - P.1021-1029.

46. Enzmann, G. Functional considerations of stem cell transplantation therapy for spinal cord repair / G.U. Enzmann, R.L. Benton, J.E. Talbott, Q. Cao, S.R. Whittemore // J. Neurotrauma. 2006. - Vol.23. - P.479^195.

47. Euler, M. Morphological characterization of the evolving rat spinal cord injury after photochemically induced ischemia / M. von Euler, E. Sundstrom, I. Seiger / Acta Neuropathol. 1997. - Vol.94. - P.232-239.

48. Facchiano, F. Promotion of regeneration of corticospinal tract axons in rats with recombinant vascular endothelial growth factor alone and combined with adenovirus coding for this factor / F. Facchiano, E. Fernandez, S. Mancarella,

49. G. Maira, M. Miscusi, D.D. Arcangelo, G. Cimino-Reale, M.L. Falchetti, M.C. Capogrossi, R. Pallini // J. Neurosurg. 2002. - Vol.97(l). - P.161-168.

50. Fan, L. Migration, distribution of bone marrow stromal cells in injured spinal cord with different transplantation techniques / L. Fan, F. Du, B.C. Cheng,

51. H. Peng, S.Q. Liu // Chin J Traumatol. 2008. - Vol.11(2). - P.94-97.

52. Farooug, M. Pretreatment with alpha-phenyl-N-tert-butyl-nitrone (PBN) improves energy metabolism after spinal cord injury in rats / M. Farooug, Y. Olsson, L. Hillered // J. Neurotrauma. 1997. - Vol.14. - P.469^176.

53. Fawcett J. Overcoming inhibition in the Damaged spinal cord / J.W. Fawcett // J. Neurotrauma. 2006. - Vol.23. - P.371-383.

54. Ferron G. Pharmacokinetic, pharmacoimmunodynamic interactions between prednisolone, sirolimus in rabbits / G.M. Ferron, W.J. Jusko // Pharm Res. -1998. Vol. 15(12). - P. 1888-1894.

55. Fournier, A. Identification of a receptor mediating Nogo-66 inhibition of ax-onal regeneration / A. Fournier, T.GrandPre, S. Strittmatter // Nature. 2001. -Vol.409.-P.341-346.

56. Frade, J. Nerve growth factor: two receptors, multiple functions. / J.M. Frade, Y.A.Barde //Bioessays. 1998. - Vol.20(2). - P. 137-145.

57. Franklin R.J. What roles do growth factors play in CNS remyelination? / R.J. Franklin, G.L. Hinks, R.H. Woodruff, M.T. O'Leary. // Prog Brain Res. -2001. Vol.132. -P.185-193.

58. Freeman, L. Experimental observations of concussion, contusion of the spinal cord / L. Freeman, T. Wright // Ann Surg. 1953. - Vol.137. -P.433^143.

59. Freund, P. Nogo-A-speciflc antibody treatment enhances sprouting, functional recovery after cervical lesion in adult Primates / P. Freund, E. Schmidlin, T. Wannier, J. Bloch, A. Mir, M.E. Schwab, E.M. Rouiller // Nat Med. 2006. -Vol.12. -P.790-792.

60. Gensel, J. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity / J.C. Gensel, S. Nakamura, Z. Guan, N. van Rooijen, D.P. Ankeny, P.G. Popovich // J. Neurosci. 2009 - Vol.29. - P.3956 -3968.

61. Giglio, V. Left ventricular function, response to enalapril in patients with Duchenne muscular dystrophy during the second decade of life / V. Giglio // Am J Cardiol. 2007. - Vol.99(l). - P. 147-148.

62. Giulian, D. Inhibition of mononuclear phagocytes reduces ischemic injury in the spinal cord / D. Giulian, C. Robertson // Ann Neurol. 1990. - Vol.27(l). -P.33-42.

63. Gordon, S. Alternative activation of macrophages / S. Gordon // Nat Rev Immunol. 2003 - Vol.3:23. - P.35.

64. Gordon, S. Macrophage heterogeneity and tissue lipids / S. Gordon // J Clin Invest. 2007. - Vol. 117. - P.89-93.

65. GrandPre, T. Identification of the Nogo inhibitor of axon rgeneration as a Re-ticulon protein / T. Grandpre, F. Nakamura, T. Vartanian, S.M. Strittmatter // Nature. 2002. - Vol.403(6768). - P.439-444.

66. Groves, M. Inhibition of sensory neuron apoptosis, prevention of loss by NT3 administration following axotomy / M.J. Groves, S.F. An, B. Giometto, F. Scaravilli // Exp. Neurol. 1999. - Vol.155. -P.284-294.

67. Gruner, J. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat / J.A. Gruner // J. Neurotrauma. 1992. - Vol.9. - P.123-128.

68. Guest, J. The ability of human Schwann cell grafts to promote regeneration in the transected nude rat spinal cord / J.D. Guest, A. Rao, L. Olson, M.B. Bunge, R.P. Bunge // Exp. Neurol. 1997. - Vol.148. -P.502-522.

69. Hagg, Т. Intracerebral infusion of neurotrophic factors / T. Hagg // Methods Mol Biol. 2007. - Vol.399. - P. 167-180.

70. Harper, J. Axonal growth of embryonic stem cell-derived motoneurons in virro, in motoneuron-injured adult rat / J.M. Harper, C. Krishnan, J.S. Darman,

71. D.M. Deshpande, S. Peck, I. Shats, S. Backovic, J.D. Rothstein, D.A. Kerr // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. - Vol.101. -P.7123-7128.

72. Hartmann, C. Molecular pathology of oligodendroglial tumors / C. Hartmann, A. Deimling // Recent Results Cancer Res. 2009. - Vol.171. - P.25^19.

73. Hauben, E. Vaccination with dendritic cells pulsed with peptides of myelin basic protein promotes functional recovery from spinal cord injury / E. Hauben,

74. A. Gothilf, A. Cohen, O. Butovsky, U. Nevo, I. Smirnov, E. Yoles, S. Akselrod, M. Schwartz//J. Neurosci. -2003. Vol.23(25). -P.8808-8819.

75. He, Z. The Nogo signaling pathway for regeneration block / Z. He, V. Koprivica // Annu Rev Neurosci. 2004. - Vol.27. - P.341-368.

76. Hendriks, W. Viral vector-mediated gene transfer of neurotrophins to promote regeneration of the injured spinal cord / W.T. Hendriks, M.J. Ruitenberg,

77. B. Blits, G.J. Boer, J. Verhaagen // Prog Brain Res. 2004. - Vol.146. -P.451-476.

78. Hofstetter, C. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord, promote recovery / C.P. Hofstetter, E.J. Schwarz, D. Mess,

79. E.L. Widenfalk, A. Manira, D.J. Prockop, L. Olson // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - Vol.99. - P.2199-2204.

80. Horky, L. Fate of endogenous stem/progenitor cells following spinal cord injury / L. Horky, F. Galimi, F.H. Gage, P.J. Horner // J. Сотр. Neurol. 2009 (in the press).

81. Hosmani, A. Carbopol, its pharmaceutical significance: A review / A.H. Hosmani // Pharmainfo.net. 2006. - Vol.17. - P. 1-19.

82. Huang, E. Neurotrophins: roles in neuronal development and function / E.J. Huang, L.F. Reichardt // Annu Rev Neurosci. 2001. - Vol.24. - P.677-736.

83. Imaizumi, T. Transplantation of olfactory ensheathing cells or Schwann cells restores Rapid, secure conduction A.C.ross the transected spinal cord / T. Imaizumi, K.L. Lankford, J.D. Kocsis // Brain Res. 2000. - Vol.854. -P.70-78.

84. Inserra, M. Functional indices for sciatic, peroneal, posterior tibial nerve lesions in the mouse. Microsurgery. 1998. - Vol. 18(2). - P. 119-124.

85. Islamov, R. Induction of VEGF and its Fit—1 receptor after sciatic nerve crush injury / R.R. Islamov, V. Chintalgattu, E.S. Рак, L.C. Katwa, A.K. Murashov // Neuroreport. 2004. - Vol. 15(13). - P.2117-2121.

86. Jain, A. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury / A. Jain, Y.T. Kim, R.J. McKeon, R.V. Bellamkonda // Biomaterials. 2006. - Vol.27(3). -P.497—504.

87. Jean, I. Neurotrophin-3 specifically increases mature oligodendrocyte population and enhances remyelination after chemical demyelination of adult rat CNS

88. I. Jean, С. Lavialle, A. Barthelaix-Pouplard, C. Fressinaud // Brain Res. -2003. Vol.972(l-2). - P. 110-118.

89. Jeffery, N. Behavioural consequences of oligodendrocyte progenitor cell transplantation into experimental demyelinating lesions in the rat spinal cord / N.D. Jeffery, A.J. Crang, M.T. O'Leary// Eur. J. Neurosci. 1999. - Vol.11. -P.1508—1514.

90. Jones, L. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan, brevican, phospha-can, and versican are differentially regulated following spinal cord injury / L. Jones, R.U. Margolis, M.H. Tuszynski // Exp. Neurol. 2003. - Vol.182. -P.399-411.

91. Jones, L. NG2 Is a Major Chondroitin Sulfate proteoglycan produced after Spinal Cord Injury, Is Expressed by Macrophages, Oligodendrocyte progenitors / L.L. Jones, Y. Yamaguchi, W.B. Stallcup, M.H. Tuszynski // J. Neurosci. -2001. Vol.22.-P.2792-2803.

92. Keirstead, H. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate, restore locomotion after spinal cord injury

93. H.S. Keirstead, G. Nistor, G. Bernal, M. Totoiu, F. Cloutier, K. Sharp, O. Steward // J. Neurosci. 2005. - Vol.25. - P.4694-4705.

94. Kim, B. Differentiation of adult bone marrow stem cells into neuroprogenitor cells in vitro /B.J.Kim, J.H. Seo, J.K. Bubien, Y.S. Oh// NeuroReport. -2002. Vol.13. - P. 1185-1188.

95. Kim, H. Ex vivo VEGF delivery by neural stem cells enhances proliferation of glial progenitors, angiogenesis, and tissue sparing after spinal cord injury / HM Kim, DH Hwang, JE Lee, SU Kim, BG. Kim // PLoS One. 2009. -Vol.4(3). -P.4987.

96. Kitanan, P. Alteration in axial motoneuronal morphology in the spinal cord injured spastic rat / P. Kitanan // Exp. Neurol. 2005. - Vol. 192. - P. 100-108.4 V

97. Kroemer, G. Mitochondrial control of apoptosis / G. Kroemer, N. Zamzami, S. Susin//Immunol. Today. 1997. - Vol.l8. - P.44-51.

98. Kumar, S. Combination of growth factors enhances remyelination in a cupri-zone-induced demyelination mouse model / S. Kumar, J.C. Biancotti, M. Yamaguchi, J. Vellis // Neurochem Res. 2007 Apr- - Vol.32(4-5). -P.783-97.

99. Langone, F. Peripheral nerve repair using a poly(organo)phosphazene tubular prosthesis / F. Langone, S. Lora, F.M. Veronese, P. Caliceti, P.P. Parnigotto, F. Valenti, G. Palma // Biomaterials. 1995. - Vol.16. - Vol.5. -P.347-353.

100. Lanza, D. The effect of human olfactory biopsy on olfaction: a preliminary report / D.C. Lanza, D.A. Deems, R.L. Doty, D. Moran, D. Crawford, J.C.Rowley, A. Sajjadian, D.W.Kennedy// Laryngoscope. — 1994. -Vol. 104(7).-P.837-840.

101. Lee, I. In vivo Magnetic resonance tracking of olfactory ensheathing glia grafted into the rat spinal cord / I.H. Lee, J.W. Bulte, P. Schweinhardt,

102. Т. Douglas, A. Trifunovski, С. Hofstetter, L. Olson, С. Spenger // Exp. Neurol. -2004a. Vol.187. -P.509-516.

103. Lee, L. Acidic FGF enhances functional regeneration of adult dorsal roots / L.M. Lee, M.C. Huang, T.Y. Chuang, L.S. Lee, H. Cheng, I.H. Lee // Life Sci. 2004b. - Vol.74. - P. 1937-1943.

104. Lee, Y.L. Cytokine chemokine expression in contused rat spinal cord / Y.L. Lee, K. Shih, P. Bao, R.S. Ghirnikar, L.F. Eng // Neurochem Int. 2000. -Vol.36.-P.417-425.

105. Li, Y. Death of oligodendrocytes, microglial phagocytosis of myelin precede immigration of Schwann cells into the spinal cord / Y. Li, P.M. Field, G. Raisman // Journal of Neurocytology. 1999. - Vol.28. - P.417-427.

106. Li, Y. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory en-sheathing cells / Y. Li, I'm. Field, G. Raisman // Science. 1997. - Vol.277. -P.2000—2002.

107. Liu, B. Epidermal growth factor receptor activation: an upstream signal for transition of quiescent astrocytes into reactive astrocytes after neural injury / B. Liu, H. Chen, T.G. Johns, A.H. Neufeld // J. Neurosci. 2006. - Vol.26. -P.7532—7540.

108. Lomas, R. Effects of a per acetic acid disinfection protocol on the biocompati-bility, biomechanical properties of human patellar tendon allografts / R.J. Lomas, L.M. Jennings, J. Fisher, J.N. Kearney // Cell Tissue Bank. 2004. -Vol.5(3).-P. 149-160.

109. Lopez-Vales, R. Acute, delayed transplantation of olfactory ensheathing cells promote partial recovery after complete transection of the spinal cord / R. Lopez-Vales, J. Fores, E. Verdu, X. Navarro // Neurobiol Dis. 2006. — Vol.21(l). -P.57-68.

110. Lopez—Vales, R. Transplanted olfactory ensheathing cells modulate the inflammatory response in the injured spinal cord / R. Lopez-Vales, G. Garcia

111. Alias, J. Fores, J.M. Vela, X. Navarro, E. Verdu// J. Neurosci. 2004. -Vol. 1(3). - P.201—209.

112. Lundberg, J. Endovascular transplantation of stern cells to the injured rat / J. Lundberg, K. Le Blanc, M. Soderman, T. Andersson, S. Holmin // CNS Neuroradiology. 2009. - Vol.51(10). - P.661-667.

113. Lytle, J. Phenotypic changes in NG2+ cells after spinal cord injury /J.M. Lytle, S. Vicini, J.R.Wrathall // J. Neurotrauma. 2006. Vol.23(12). -P. 1726-1738.

114. McDonald, J. Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate, promote recovery in injured rat spinal cord / J.W. McDonald, X.Z. Liu, Y. Qu, S. Liu, S.K. Mickey, D. Turetsky, D.I. Gottlieb, D.W. Choi //Nat Med. 1999. -Vol.5.-P.1410-1412.

115. Magnuson, D. Comparing deficits following excitotoxic and contusion injuries in the thoracic and lumbar spinal cord of the adult rat / D.S. Magnuson, T.C. Trinder, Y.P. Zhang // Exp. Neurol. 1999. - Vol.156.-P. 191-204.

116. Marshall, C. The therapeutic potential of human olfactory-derived stem cells / C.T. Marshall, C. Lu, W. Winstead, X. Zhang, M. Xiao, G. Harding, K.M. Klueber, F.J. Roisen // Histol Histopathol. 2006. - Vol.21(6). - P.633-643.

117. Masgutov, R. Stimulation of the rat's sciatic nerve regeneration by local treatment with Xymedon / R. Masgutov, I. Raginov, G. Fomina, M. Kozlova, Y. Chelyshev // Cell Mol Neurobiol. 2006. - Vol.26(7-8). - P. 1413-1421.

118. McKerracher, L. Identification of myelin-associ-ated glycoprotein as a major myelin—derived inhibitor of neurite growth / L. McKerracher, S. David, D.L. Jackson, V. Kottis, R.J. Dunn, P.E. Braun// Neuron. 1994. - Vol.13. -P.805—811.

119. McKerracher, L. Targeting Rho to stimulate repair after spinal cord injury / L. McKerracher, H. Higuchi// J. Neurotrauma. 2006. - Vol.23. - P.309-317.

120. Metz, G. Validation of the weight-drop contusion model in rat: a comparative study of human spinal cord injury / G.A. Metz, A. Curt, H. van de Meent, I. Klusman, M.E. Schwab, V. Dietz // J. Neurotrauma. 2000. - Vol. 17. - P. 117.

121. Moore, K. Immobilized concentration gradients of neurotrophic factors guide neurite outgrowth of primary neurons in macroporous scaffolds / K. Moore, M. MacSween, M. Shoichet // Tissue Eng. 2006. - Vol. 12(2). - P.267-278.

122. Moreau-Fauvarque, C. The transmembrane semaphorin Sema4D/ CD100, an inhibitor of axonal growth, is expressed on oligodendrocytes, upregulared after CNS lesion / C. Moreau-Fauvarque, A. Kumanogoh, P. Cam, G. Jaillard,

123. G. Barbin, I. Boquec, C. Love, E.Y. Jones, H. Kikutani, C. Lubetzki, L. Dusart, A. Chedotal // J. Neurosci. 2003. - Vol.23. - P.9229-9239.

124. Moriyama, H. Progression, direction of contractures of knee joints following spinal cord injury in the rat / H. Moriyama, O. Yoshimura, H. Sunahori,

125. H. Nitta, H. Imakita, Y. Saka, H. Maejima, Y. Tobimatsu// Tohoku J.Exp. Med. 2004. - Vol.204. - P.37-44.

126. Nakamura, T. Experimental study on the regeneration of peripheral nerve gapsthrough a polyglycolic acid-collagen (PGA-collagen) tube / T. Nakamura // Brain Research. 2004. - Vol. 1027. - P. 18-29.

127. Nakayama, K. Enhancement of peripheral nerve regeneration using bioabsorb-able polymer tubes packed with fibrin gel / K. Nakayama, K. Takakuda, Y. Koyama, S. Itoh, W. Wang, T. Mukai, N. Shirahama // Artificial Organs. -2007. Vol.31(7). - P.500-508.

128. Nandoe Tewarie, R. Stem cell-based therapies for spinal cord injury. / R.S. Nandoe Tewarie, A. Hurtado, R.H. Bartels, A. Grotenhuis, M. Oudega // J. Spinal Cord Med. 2009. - Vol.2. - P. 105-114.

129. Napoli, I. Microglial precursors derived from mouse embiyonic stem cells / I. Napoli, K. Kierdorf, H. Neumann //. 2009. - Vol.57(15). - P. 1660-1671.

130. Nashmi, R. Mechanisms of axonal dysfunction after spinal cord injury: with an emphasis on the role of voltage-gated potassium channels / R. Nashmi, M.G. Fehlings // Brain Res. Rev. 2001. - Vol.38. - P. 165-191.

131. Newcomb, J. Temporal profile of apoptotic-like changes in neurons, astrocytes following controlled cortical impact injury in the rat / J.K. Newcomb, X. Zhao,

132. B.R. Pike, R.L. Hayes // Exp. Neurol. 1999. - Vol.158. - P.76-88.

133. Nomura, H. Bioengineered strategies for spinal cord repair /H.Nomura,

134. C.H. Tator, M.S. Shoichet // J. Neurotrauma. 2006. - Vol.3^1. - P.496-507.

135. Novikova, L. Biopolymers, biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury / L.N. Novikova, L.N. Novikov, J.O. Kellerth // Curr Opin Neurol. 2003. - Vol.6. - P.711-715.

136. Phillips, J. Fluid shear in viscous fibronectin gels allows aggregation of fibrous materials for CNS tissue engineering / J.B. Phillips, V.R. King, Z. Ward, R.A. Porter, J.V. Priestley, R.A. Brown // Biomaterials. 2004. - Vol.14. -P.2769—79.

137. Piotrowicz, A. Nerve guidance channels as drug delivery vehicles / A. Piotrowicz, M.S. Shoichet // Biomaterials. 2006. - Vol.9. - P.2018-2027.

138. Quencer, R. Advances in imaging of spinal cord injury: implications for treatment, patient evaluation / R.M. Quencer //Prog Brain Res. 2002. - Vol. 137. -P.3-8.

139. Rabchevsky, A. Creatine Diet supplement for spinal cord injury: influences on functional recovery, tissue sparing in rat / A.G. Rabchevsky, P.G. Sullivan, I. Fugaccia, S.W. Scheff//J. Neurotrauma. -2003. Vol.20. -P.659-669.

140. Rabchevsky, A. Therapeutic Interventions Following Mammalian Spinal Cord Injury / A.G. Rabchevsky, G.M. Smith // ARCH NEUROL. 2001. - Vol.58. -P.721-726.

141. Raineteau, O. Reorganization of descending motor tracts in the rat spinal cord / O. Raineteau, K. Fouad, F.M. Bareyre, &M. E. Schwab, // Eur. J. Neurosci. -2002. Vol.16. - P. 1761-1771.

142. Ramer, L. Peripheral olfactory ensheathing cells reduce scar, cavity formation, promote regeneration after spinal cord injury / L.M. Ramer, E. Au, M.W. Richter, J. Liu, W. Tetzlaff, A.J. Roskams // J. Сотр. 2004b. -Vol.473(l). - P. 1-15.

143. Ramon-Cueto, A. Functional recovery of paraplegic rat, motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia / A. Ramon—Cueto, M.I. Cordero, F.F. Santos-Benito, J. Avila// Neuron. 2000. - Vol.25. -P.425^135.

144. Ramon-y-Cajal, S. Degeneration, regeneration of the nervous system / S. Ramon-y-Cajal // Oxford University Press London Humphrey Milford. -1928.-Vol.1.

145. Reier, P. Cellular transplantation strat egies for spinal cord injury, translational neurobiology / P.J. Reier // NeuroRx. 2004. - Vol. 1. - P.424^51.

146. Ribotta, M. Activation of locomotion in adult chronic spinal rats is achieved by transplantation of embryonic raphe cells reinnervating a precise lumbar level / M.G. Ribotta, J. Provencher, D. Feraboli-Lohnherr, S. Rossignol, A. Privat,

147. D. Orsal // J. Neurosci. 2000. - Vol.20(13). - P.5144-5152.

148. Rice, T. Characterization of the early neuroinflammation after spinal cord injury in mice / T. Rice, J. Larsen, S. Rivest, V.W. Yong // Neuropathol Exp Neurol. 2007. - Vol.66(3). - P. 184-195.

149. Rizek, P. Cultures of rat olfactory ensheathing cells are contaminated with Schwann cells / P.N. Rizek, M.D.Kawaja // Neuroreport. 2006. - Vol. 17(5). - P.459-462.

150. Rolls, A. Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: A Role in microglia/macrophage Activation / A. Rolls, R. Shechter, A. London, Y. Segev, G. Rechavi, M. Schwartz // PLoS Medicine. 2008. -Vol.5.-P. 1262-1277.

151. E. Marck, D. Ysebaert, Z. Berneman // BMC Biotechnology. 2007. -Vol.7(90). - P.2—17.

152. Ruiz de Almodovar, C. Role and therapeutic potential of VEGF in the nervous system / C. Ruiz de Almodovar, D. Lambrechts, M. Mazzone, P. Carmeliet // Physiol Rev. 2009. - Vol.89(2). - P.607-648.

153. Saito, N. Implications of p53 protein expression in experimental spinal cord injury / N. Saito, T. Yamamoto, T. Watanabe, Y. Abe, T. Kumagai // J. Neurotrauma. 2000. - Vol. 17. - P. 173-182.

154. Sasaki, M. Protection of corticospinal tract neurons after dorsal spinal cord transection and engraftment of olfactory ensheathing cells / M. Sasaki, B.C. Hains, K.L. Lankford, S.G. Waxman, J.D.Kocsis // Glia. 2006. -Vol.53(4). -P.352-359.

155. Sawada, M. Neuroprotective, toxic changes in microglia in neurodegenerative disease / M. Sawada // Parkinsonism Relat. Disord. 2009. - Vol. 15(1). -P.39^11.

156. Schmidt, C. Neural tissue engineering: strategies for repair, regeneration / C.E. Schmidt, J.B. Leach // Annu Rev Biomed. 2003. - Vol.5. - P.293-347.

157. Schnell, L. Axonal regeneration in the rat spinal cord produced by an antibody against myelin-associated neurite growth inhibitors / L. Schnell, M.E. Schwab //Nature. 1990. - Vol.343. - P.269-272.

158. Schwab, J. Injury reactive myelin/oligodendrocyte-derived axon growth inhibition in the adult Mammalian central nervous system / M.E. Schwab, F. Bernard, C. Moreau-Fauvarque, A. Chedotal // Brain Res Brain Res. -2005. Vol.49. - P.295-299.

159. Schwab, M. Oligodendrocytes, CNS myelin are nonpermissive substtates for neurite growth, fibroblast spreading in vitro / M.E. Schwab, P. Caroni // J. Neurosci. 1988. - Vol.8. - P.2381-2393.

160. Schwab, M. Repairing the injured spinal cord /M.E.Schwab// Science. -2002b. Vol.295. - P. 1029-1031.

161. Schwartz, M. Immune-based therapy for spinal cord repair: autologous macrophages, beyond / M. Schwartz, E. Yoles // Neurotrauma. 2006. - Vol.23(3-4). - P.360-370.

162. Shuman, S. Apoptosis of microglia, oligodendrocytes after spinal cord contusion in rats / S.L. Shuman, J.C. Bresnahan, M.S. Beattie // J. Neurosci. Res. -1997. Vol.50. - P.798-808.

163. Silver, J. Regeneration beyond the glial scar / J. Silver, J.H. Miller // Nat Rev Neurosci. 2004. - Vol.5. - P. 146-156.

164. Su, Z. Nogo enhances the adhesion of olfactory ensheathing cells and inhibits their migration / Z. Su, L. Cao, Y. Zhu, X. Liu, Z. Huang, A. Huang, C. He // J Cell Sci. 2007. - Vol. 120. - P. 1877-1887.

165. Sundback, C. Biocompatibility analysis of poly(glycerol sebacate) as a nerve guide material / C.A. Sundback, J.Y. Shyu, Y. Wang, W.C. Faquin, R.S. Langer, J.P. Vacanti, T.A. Hadlock// Biomaterials. 2005. - Vol.26. -P.5454—5464.

166. Sykova, E. Bone marrow stem cells and polymer hydrogels—two strategies for spinal cord injury repair / E Sykova, P. Jendelova, L. Urdzikova, P. Lesny, A. Hejcl // Cell Mol Neurobiol. 2006. - Vol.26(7-8). - P. 1113-1129.

167. Tator, C. Update on the pathophysiology, pathology of acute spinal cord injury /С.Н. Tator//Brain Pathol. 1995. - Vol.5. -P.407-413.

168. Tohill, M. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers, stimulate nerve regeneration /М. Tohill, C. Mantovani, M. Wiberg, G. Terenghi // Neuroscience Letters. 2004. - Vol.362. - P.200-203.

169. Totoiu, M. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyeli-nation / M.O. Totoiu, H.S. Keirstead // J. Сотр. Neurol. 2005. - Vol.486. -P.373—383.

170. Vacanti, C. Tissue-engineered spinal cord / C.A. Vacanti // Transplant Proc -2001. Vol. 1(2). - P.592-598.

171. Vavrek, R. Neuronal populations capable of regeneration following a combined treatment in rats with spinal cord transaction / R. Vavrek, D.D. Pearse, K. Fouad // J. Neurotrauma. 2007. - Vol.24(10). - P. 1667-1673.

172. Verdu, E. Morphological characterization of photochemical graded spinal cord injury in the rat / E. Verdu, G. Garcia-AHas, J. Fores, J.M. Vela, J. Cuadras, R. Lopez-Vales, X. Navarro // J. Neurotrauma. 2003. - Vol.20(5). - P.483-499.

173. Wang, K. Oligodendrocyte-myelin glycoprotein is a Nogo receptor lig, that inhibits neurite outgrowth / K.C. Wang, V. Koprivica, J. A. Kim, R. Sivasankaran, Y. Guo, R.L. Neve, Z. He// Nature. 2002. - Vol.417. -P.941—944.

174. Wang, X. Delayed Nogo receptor therapy improves recovery from spinal cord contusion / X. Wang, K.W. Baughman, D.M. Basso, S.M. Strirrmarrer // Ann Neurol. 2006. - Vol.60. - P.540-549.

175. Willerth, S. Kinetic analysis of neurotrophin-3-mediated differentiation of embryonic stem cells into neurons / S.M. Willerth, S.E. Sakiyama-Elbert // Tissue Eng Part A. 2009. - Vol.2. - P.307-318.

176. Woodhoo, A. Development of the Schwann cell lineage: from the neural crest to the myelinated nerve. Glia. 2008. - Vol.56(14). - P.1481-1490.

177. Woodhouse, A. Chuah Spinal cord tissue affects ensheathing cell proliferation and apoptosis / A. Woodhouse, A.J. Vincent, M.A. Kozel, R.S. Chung,

178. P.M. Waite, J.C. Vickers, A.K. West // Neuroreport. 2005. - Vol. 16(7). -P.737-740.

179. Xu, X. Transplantation-mediated strategies to promote axonal regeneration following spinal cord injury. / X.M. Xu, S.M. Onifer // Respir Physiol Neuro-biol. — 2009. in press.

180. Xu, X. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord / X.M. Xu, V. Guenard, N. Kleitman, M.B. Bunge // J. Comp Neurol. 1995. - Vol.351. - P. 145-160.

181. Yamamoto, S. Proliferation of parenchymal neural progenitors in response to injury in the adult rat spinal cord / S. Yamamoto, N. Yamamoto, T. Kitamura, K. Nakamura, M. Nakafuku // Exp. Neurol. 2001. - Vol.172. - P. 115-127.

182. Yan, J. Extensive Neuronal differentiation of Human Neural Stem Cell grafts in adult rat / J. Yan, L. Xu, A. M. Welsh, G. Hatfield, T. Hazel, K. Johe, V.E. Koliatsos // Spinal Cord. PLoS Medicine. 2007. - Vol.42(39). - P.l-15.

183. Yang, Y. Neurotrophin releasing single, multiple lumen nerve conduits / Y. Yang, L. De Laporte, C.B. Rives, J.H. Jang, W.C. Lin, K.R. Shull, L.D. Shea//Controlled Release. 2005. - Vol.104. - P.433-436.

184. Yiu, G. Glial inhibition of CNS axon regeneration / G. Yiu, Z. He // Nat Rev Neurosci. 2006. - Vol.7. - P.617-627.

185. Yoshii, S. Peripheral nerve regeneration along collagen filaments / S. Yoshii, M. Oka // Brain Research. 2001. - Vol.888. - P. 158-162.

186. Yu, T. Guided cell adhesion, outgrowth in peptide-modified channels for neural tissue engineering / T.T. Yu, M.S. Shoichet // Biomaterials. 2005. -Vol.26.-P. 1507-1514.

187. Zhang, L. GDNF-enhanced axonal regeneration and myelination following spinal cord injury is mediated byprimary effects on neurons / L. Zhang, Z. Ma,

188. G.M. Smith, X Wen, Y. Pressman, P.M. Wood, X.M. Xu // Glia. 2009. -Vol.57(ll). -P.1178-1191.

189. Zhong, Y. Biomaterials for the central nervous system / Y. Zhong, R.V. Bellamkonda //J R Soc Interface. 2008. - Vol.5(26). - P.957-975.

190. Викторов, И. Мультипотентные стволовые и прогениторные клетки обонятельного эпителия / И.В. Викторов, Е.А. Савченко, О.В. Ухова,

191. H.Ю. Алексеева, В.П. Чехонин // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. - Том.4. - С. 185-193.

192. Масгутов, Р. Стимуляция ксимедоном регенерации энтубулированного нерва / Р.Ф. Масгутов, И.С. Рагинов, Г.А. Фомина, М.В. Козлова, Ю.А. Челышев // Морфологические ведомости. 2005. - №1-2. — С.22-24.

193. Осипова, Е. Водорастворимые комплексообразующие полимеры / Е.А. Осипова // Соросовский образовательный журнал. 1999. - Том 8. - Р.40^47.

Информация о работе

Масгутова, Галина Андреевна
кандидата биологических наук
Саранск, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Посттравматическая регенерация спинного мозга грызунов при трансплантации клеток обонятельной выстилки, микроглия-подобных клеток и реконструкции тканевого матрикса биосовместимыми карбомерами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы