Механизмы регенерации спинного мозга крыс при трансплантации обкладочных нейроэпителиальных клеток в биополимерном коллагеновом матриксе

Брюховецкий, Игорь Степанович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы регенерации спинного мозга крыс при трансплантации обкладочных нейроэпителиальных клеток в биополимерном коллагеновом матриксе
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регенерации спинного мозга крыс при трансплантации обкладочных нейроэпителиальных клеток в биополимерном коллагеновом матриксе"

На правах

БРЮХОВЕЦКИЙ Игорь Степанович

МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ СПИННОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ОБКЛАДОЧНЫХ НЕЙРОЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК В БИОПОЛИМЕРНОМ КОЛЛАГЕНОВОМ МАТРИКСЕ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток 2008

003451706

Работа выполнена в институте биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВ О РАН и в ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор медицинских наук Дюйзен Инесса Валерьевна

доктор медицинских наук, профессор Мотавкин Павел Александрович

доктор медицинских наук, профессор Красников Юрий Александрович

кандидат медицинских наук Дирлам Галина Глебовна

ФГУ «Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий»

Защита диссертации состоится «Л^ » // 2008 года в «часов на заседании диссертационного совета Д 208.007. 01 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 690990, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета

Автореферат разослан

л, /<о

2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Г.В. Рева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В общей структуре травм центральной нервной системы повреждениям спинного мозга отводится особая роль, поскольку кроме высокой летальности они сопровождается практически полной инвапи-дизацией (А.Г. Аганесов, 2003). Число таких больных неуклонно растет и только в России оно увеличивается более чем на 8000 человек ежегодно (М.А. Леонтьев, 2003). Проблема помощи спинальным больным длительное время считалась вообще не решаемой. Основные успехи в этой области стали возможны благодаря достижениям фармакологии (С.ТЛЗертилэ, 2001). Появление современных лекарств и разработка патогенетически обоснованных терапевтических схем позволило значительно улучшить качество жизни таких больных. Однако восстановить утраченные неврологические функции спинного мозга фармакологическими методами по сей день не представляется возможным. Проблема заключается в очень низкой способности нервной ткани к регенерации, которая может быть реализована только путем роста аксонов (S. Ramon у Cajal, 1928; В.И. Зяблов, 1986). Главным препятствием на пути роста аксонов является по-стгравматический глио-мезодермальный рубец (И.П. Шпак, 2006; Y.Abe, 2008). С другой стороны, при отсутствии консолидирующей ткани рубца между краниальным и каудальным отрезками спинного мозга (в случае обширных повреждений), они подвергаются ретракции, что делает восстановление нервных связей практически невозможным (В.И. Зяблов, 1986). Поэтому исключительно важной задачей современного этапа исследований является управление регенераторным потенциалом нервной системы путем регуляции скорости и качества консолидирующей ткани, замещающей нейрональный дефект (J.MacDonald, 2004; А.В Берсенев, 2007). Не менее значимой является проблема стимуляции роста и ремиелинизации поврежденных аксонов (H.Y Shen, 2007; Su Zhida, 2008). На сегодняшний день для решения этих проблем используется два главных подхода. Первый заключается в использовании биополимерных материа-

лов, позволяющих сформировать консолидирующую рубцовую ткань между разобщенными концами спинного мозга. Вторым направлением является использование трофических свойств различных клеточных линий при их трансплантации в область тканевого дефекта. При этом наилучшие результаты были получены при сочетании этих методик (С.Уасаг^, 2005; О.К^втап, 2007; Е. Букоуа, 2007). Однако, несмотря на обнадеживающие результаты, многие механизмы репаративного действия применяемых трансплантатов остаются не исследованными, что и определяет актуальность проблемы их дальнейшего экспериментального изучения с целью создания и отработки новых, более совершенных технологий клеточно-тканевой заместительной терапии.

Цель настоящего исследования: изучить особенности и механизмы восстановления поврежденного спинного мозга крыс при замещении тканевого дефекта композицией биополимерного коллагенового матрикса и обкладочных нейроэпительнальных клеток.

Задачи исследования:

1. Дать иммуноцитохимическую характеристику культуры обонятельных нейроэпителиальных клеток, используемых для трансплантации.

2. Оценить характер морфологических изменений тканей спинного мозга в раннем и позднем периоде травмы при нейротрансплантации.

3. Изучить особенности регенерации нервных волокон в тканях спинного мозга экспериментальных животных.

4. В рубце и прилегающих к зоне повреждения участках спинного мозга экспериментальных животных выявить особенности экспрессии маркеров ак-сонального роста.

5. Охарактеризовать динамику восстановления двигательных функций спинного мозга при травме и заместительной клеточной терапии.

Научная новизна и теоретическое значение работы: Впервые на собственном экспериментальном материале дана морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика обкладочных нейроэпители-

апьных клеток при их культивировании на биополимерном коллагеновом мат-риксе, использующемся для трансплантации. Проведен детальный анализ структуры тканевых перестроек при замещении постгравматического дефекта спинного мозга биополимерным матриксом, как при монотерапии, так и в комплексе с обкладочными нейроэпителиальными клетками. Дана морфохимиче-ская характеристика спинномозгового рубца, сформированного при использовании данной технологии, обоснована трофическая и ремиелинизирующая роль обкладочных нейроэпителиальных клеток, инкорпорированных в биополимерный коллагеновый матрикс. Представлены научные факты о реальной возможности прорастания аксонов поврежденного спинного мозга через биодегради-руемый полимерный матрикс. Предложенная нейроэндопротезная клеточно-биополимерная система может выполнять функции «моста» при имплантации его в диастаз между разобщенными участками поврежденного спинного мозга. В эксперименте на животных доказана возможность функционального восстановления спинного мозга после полного анатомического повреждения (иссечения участка) с использованием современных методов тканевой инженерии центральной нервной системы.

Результаты проведенного исследования расширяют представления о механизмах регенерации нервной ткани и позволяют обосновать возможность клинического использования биополимерных матриксов в комплексе с обкладочными нейроэпителиальными клетками при лечении травмы спинного мозга.

Практическая значимость работы. Результаты настоящего исследования могут найти широкое практическое применение в осуществлении реконструк-тивно-восстановительных операций в нейрохирургической практике, а также для проведения операций с использованием методов тканевой инженерии мозга.

Представленные в данной работе экспериментальные научные факты о возможности регенерации спинного мозга при его полном анатомическом перерыве с использованием критических биополимерных и клеточных технологий могут быть практической фундаментальной базой для проведения высокотехнологичных реконструктивных операций выбора у данного контингента

очень сложных неврологических больных. Экспериментальное обоснование возможности реконструкции и восстановления функций поврежденного спинного мозга, проведенные в данном исследовании, открывают перспективы для выполнения первых ограниченных клинических испытаний на человеке.

Положения, выносимые на защиту:

1. Трансплантация биополимерного гетерогенного коллагенового матрикса в область повреждения спинного мозга ускоряет процессы его' регенерации, реваскуляризации и реиннервации и способствует восстановлению двигательных функций у крыс после полной перерезки органа.

2. Обкладочные нейроэпителиальные клетки в условиях трансплантации выполняют нейротрофическую роль в отношении регенерирующих нервных проводников.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции «Высокие технологии в терапии и реабилитации заболеваний нервной системы» (г. Москва 2008) и на IV Всероссийском съезде трансплантологов (г. Москва 2008).

Публикация результатов работы: основные положения диссертации отражены в 5 печатных работах.

Объем и структура диссертации: Рукопись диссертации включает оглавление, введение, обзор литературы, главу "материалы и методы исследования", четыре главы, описывающих результаты собственных исследований, заключение, выводы и библиографический указатель. Объем диссертации составляет 123 страницы машинописного текста, включая 6 таблиц, 17 рисунков, 70 фотографий. Список литературы содержит 185 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Формирование модели острой травмы спинного мозга. Исследование выполнено на 65 беспородных половозрелых крысах-самках массой тела 180250 гр., содержащихся в стандартных условиях вивария. В работе использована экспериментальная модель травмы спинного мозга, предложенная S.Woerly

(1999), принцип которой заключался в полной экстирпации фрагмента спинного мозга толщиной 2-3 мм на уровне ТЫО. Операция проводились в условиях стерильного бокса, под общим обезболиванием, путем внутрибрюшинного введения 1 мл смеси, состоящей из 0,18 мл 2% раствора ксилазина, 0,36 мл 10% раствора кетамина (Ке(атте-а1Газап, \Voerden-HolIand) и 0,46 мл 0,5% раствора новокаина. Все животные были разделены на контрольную и три экспериментальные группы. В контрольной группе после перерезки спинного мозга рана послойно ушивалась. Во всех экспериментальных группах дефект спинного мозга непосредственно во время операции заполняли препаратом «Сферогель-Э» в объеме 50 мкл на животное. В первой группе - группа «Гель» - использовался только нейроматрикс. Во второй группе животных гель помещался в сформированный канал из полимерной спинномозговой оболочки (группа «Гель+оболочка»). В третьей группе животным в область рассеченного спинного мозга имплантировалась композиция, содержащая полимерный нейроматрикс и культуру обкладочных нейроэпителиальных клеток (250000 клеток на животное). Послеоперационный уход осуществлялся согласно рекомендациям 8.У/оег1у (1999). Животных выводили из эксперимента с помощью глубокого эфирного наркоза через 1-2 недели и через 10-12 недель после проведения операции. Все эксперименты выполнены в соответствии с Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г.).

Искусственная полимерная спинномозговая оболочка и гетерогенный биодеградируемый коллагеновый матрикс "Сферогель-Э" были получены из Клиники восстановительной интервенционной неврологии и терапии "Нейро-вита" (г. Москва). Сферогель представляет собой упругоэластичную массу, полученную из двух источников коллагена, формирующих две фазы: твердую - в виде микросфер из коллагена ткани млекопитающих, и жидкую - образованную из денатурированного коллагена ткани птиц. Матрикс дополнительно содержит компоненты физиологических культуральных сред, добавки, способствующие росту и дифференциации клеток и тканей, антибактериальные и/или

антивирусные компоненты и антиагрегационные препараты. Данный препарат разрешен к применению в клинической практике (патент РФ RU №2249462 «Универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации и способ его применения» от 10 .04.2005, Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФС 01032006/5580-06 от 28.12.2006, Сертификат соответствия № РОСС RU. ИМ 15 ВО 1314 доп №6054797, Протокол № 0972.1627.3.07 от 03.05.07 ИЛ ББМИ ФГУ «НИИТиИОРосздрава» (POCCRU0001.21HM 10).

Культура обкладочных нейроэпителиальных клеток (ОНК) Выделение и культивирование ОНК отработано и проведено совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ФГУ Государственного научного центра социальной и судебной психиатрии им. В.П.Сербского (руководитель - академик РАМН В.П.Чехонин) по методике X.Zhang (2004) в модификации данной лаборатории. Взятые под местной анестезией фрагменты слизистой оболочки верхней носовой раковины размером 2x2x3 мм помещали на 2 часа в охлажденный раствор Хенкса без Са2+ и Mg2+ (HBSS), содержащий антибиотики и антимико-тики (1:100; Gibco). После повторной промывки и удаления кровеносных сосудов ткань измельчали и инкубировали в течение 40 мин. при 36,5°С в растворе трипсина/025% ЭДТА, приготовленном на 0.01М фосфатном буфере (PBS, pH 7.4). Действие ферментов блокировали средой DMEM (Gibco), содержащей 3% сыворотки. Ткань промывали в трех сменах сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS; Hanks' balanced salt solution, Sigma) и диссоциировали повторным пипетированием в питательной среде. Состав среды: минимальная среда Игла (MEM, Sigma) 90%, эмбриональная сыворотка телят (Fetal bovine serum. FBS. Gibco. Ivitrogen), глюкоза 0.8%, глутамин 2мМ (Gibco), добавка B27 (Sigma), HEPES 20 мМ, ростовые факторы - фактор роста фибробластов (FGF2, lng/ml Sigma) и фактор роста нервов (NGF, 2ng/ml, Sigma). Полученную суспензию клеток центрифугировали (3 мин при 1200 об/мин), осадок ресуспенди-ровали в питательной среде того же состава. Количество и жизнеспособность клеток определяли в камере Горяева после окраски 0,1% раствором трипаново-

го синегЪ. Для последующего культивирования использовали клеточные суспензии только с 85-95% жизнеспособных клеток. Диссоциированные клетки (5х105 кл/мл) культивировали в 12-луночных планшетах на полилизин-ламининовом субстрате в течение 14 суток (Зб.5°С, 5% С02). Частичную смену 1/3 питательной среды производили два раза в неделю. Первичную культуру после формирования сливного монослоя снимали с помощью раствора трипси-на/ЭДТА. После промывки в HBSS и центрифугирования клетки ресуспензиро-вали в питательной среде. Клеточную суспензию (10000-12000 кп/см2) переносили в 12-луночные планшеты (площадь 25 см2). Таким способом культуры пассировали 4 раза до формирования сливного монослоя. Клетки внедряли в нейроматрикс путем последовательного наслаивания и центрифугирования (1000 об/мин, 10 мин) при температуре +10°С и вводили в количестве 250 тыс./животное.

Иммуноцнтохимические исследования ОНК. Для изучения свойств ней-роматрикса как основы для выживания и дифференцировки ОНК, часть клеток культивировали на планшетах, покрытых слоем «Сферогеля-Э» (36.5°С, 5% С02). Спустя 8-10 суток клеточный монослой фиксировали в 4% растворе па-раформальдегида, приготовленном на 0,01 М фосфатном буфере (pH 7.4) в течение 30 мин. После промывки в PBS (3x10 мин) клетки инкубировали 24 ч. при 4°С с первичными поликлокальными кроличьими антителами к ß-тубулину (1:300; Chemicon), нестину (1:100, Chemicon), глиальному кислому фибриллярному белку (GFAP, 1:1000; Chemicon), белку р75 (1:100, Chemicon) и кальций-связывающему белку S100 (1:100; Chemicon). После промывки в PBS клетки последовательно обрабатывали вторичными биотинилированными антителами козы к иммуноглобулинам кролика - 2 часа при комнатной температуре и ави-дин-биотиновым комплексом (ABC, Vector Laboratories, Inc). Хромогеном служил раствор диаминобензидина, приготовленный на фосфатном буфере (0.5 мг/мл) с добавлением 0.03% перекиси водорода, инкубацию в котором проводили под визуальным контролем. Препараты обезвоживали и заключали под покровные стекла в синтетическую смолу (Entellan, Merk).

Для проведения иммунофлуоресцентного окрашивания инкубацию со ви-доспецифическими вторичными антителами, меченными FITC и TRITS [1:100, Sigma], проводили в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем срезы промывали 2 раза по 10 минут и заключали в 50% забуференный глицерин.

Гистологическое исследование экспериментального материала Позвоночный столб длиной 2-2,5см, содержащий участок поврежденного спинного мозга, был фиксирован в 4% забуференном растворе параформальдегида (рН 7,2). Декальцинация образцов проводилась с использованием раствора муравьиной кислоты, затем образцы заключались в парафин. Продольные срезы спинного мозга, проходящие через область тканевого дефекта и прилежащие участки спинного мозга, а также поперечные срезы поясничных сегментов (толщиной 4-5 мкм) окрашивались гематоксилин-эозином, полутонкие срезы (толщиной 1 мкм) окрашивали 1% раствором метиленового синего.

Иммуногистохимическое исследование экспериментального материала проводилось на параллельных срезах с использованием первичных антител к белкам, характерным для нервной ткани и участвующим в процессах ее регенерации. В настоящей работе использовались мышиные моноклональные антитела к GAP-43 (growth-associated protein, neuromodulin, Chemicon, Anti-Growth Associated Protein 43, clone 9-1E12, P17677, 1:10) и нейрофиламенту-200 (NF-200, Chemicon, Anti-Neurofilament H&M, phosphorylated, clone NP1, P12036, 1:50). После депарафинирования и регидратации срезов их прогревали на водяной бане в предварительно нагретом до 95-99°С ЮмМ цитратном буфере (рН 6.0) в течение 30 минут для "демаскировки" антигенов. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15-20 минут и переносили в 0.1М фосфатный буфер (рН7.4) на 5 минут. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 15 мин в 1% раствором бычьего сывороточного альбумина и 1% растворе нормальной лошадиной сыворотки, приготовленном на 0.1М фосфатном буфере (рН 7.4). Инкубацию с первичными антителами проводили при 37°С в течение 1 часа, затем промывали 2 раза по 10 минут

в фосфатном буфере. Иммунологическое окрашивание проводили с помощью непрямой стрептавиади-биотин-пероксидазной реакцией, используя стандартный набор VECTASTAIN Elite ABC Kit Universal (Vector laboratories, PK-7200) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

Оценка соматических и неврологических функций у экспериментальных животных. Осмотр оперированных животных проводили ежедневно в течение двенадцати недель до момента выведения из эксперимента. Для оценки специфической целенаправленной локомоторной активности экспериментальных и контрольных животных использовали шкалу двигательных оценок- «ВВВ» (Basso, et al.,1995). Эта шкала является прямым аналогом оценочной шкалы «ASIA», используемой для диагностики неврологической патологии у человека. Шкала «ВВВ» ранжирует наблюдаемые параметры в 5 групп признаков, из которых статусу абсолютного здоровья соответствуют баллы от 18 до 21, а полная параплегия характеризуется оценкой 0-3 балла. Промежуточное положение занимают признаки (3-18 баллов), свидетельствующие о частичном восстановлении локомоторной активности.

Статистическую обработку данных производили методом ANOVA с использованием t-критерия Стьюдента (при подсчете числа обкладочных ней-роэпителиальных клеток в культуре, при измерении площади сирингомиелити-ческих кист и оценке плотности расположения нервных волокон в срезах спинного мозга) и непараметрического критерия Манна-Уитни (при анализе двигательных функций). Различия считали достоверными при р ^3.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Об эффективности применения матрикса «Сферогель» в нашем эксперименте наглядно свидетельствуют результаты, полученные у крыс экспериментальных групп «Гель» и «Гель+оболочка». В отличие от контрольной группы, где отчетливое формирование рубцовой ткани наблюдалось лишь на поздних сроках эксперимента (10-12 недель), у животных, получавших гель, ткань руб-

ца была сформирована уже на 2-3 неделе наблюдения. У экспериментальных животных всех групп к 10-12 неделе ткань, консолидирующая спинальный диастаз, отличалась хорошей васкуляризацией и наличием многочисленных нервных волокон, миелинизация которых происходила значительно быстрее, чем у контрольных крыс.

При гистологическом исследовании тканей спинного мозга животных контрольной и экспериментальных групп нами обнаружены значительные различия не только в темпах, но и в характере морфологических изменений, сопровождающих организацию послеоперационного дефекта; Основные различия выявлялись в области перерезки и в пограничных участках спинного мозга и определялись спецификой тканевого состава консолидирующего рубца, степенью его реваскуляризации и особенностями воспалительной реакции. Так, у всех животных с имплантируемым гелем, через 1-2 недели после операции обращала на себя внимание особая архитектоника астроцитарной реакции: внутри рубца и в промежуточной зоне пролиферирующие и мигрирующие в область травмы глиальные элементы располагались в виде тяжей, ориентированных параллельно длинной оси спинного мозга. В итоге у всех животных, получавших Сферогель, к 10-12 неделе эксперимента, ткань, консолидирующая фрагменты спинного мозга, была полностью сформирована и при окрашивании метилено-вым синим обнаруживала большое число миелинизированных нервных волокон, сгруппированных в небольшие пучки.

В то же время астроцитарная реакция у контрольных животных была наиболее выражена на границе травматического дефекта с тканью спинного мозга и сопровождалась скоплением глиоцитов в плоскости, перпендикулярной длиннику мозга. Преимущественно периферический тип астроцитарной реакции у контрольных животных, с одной стороны, замедлял консолидацию фрагментов пересеченного спинного мозга. С другой стороны, это приводило к формированию отчетливой глиомезодермальной капсулы, и, очевидно, в дальнейшем служило препятствием для развития соединительнотканных элементов в глубине рубца и сдерживало рост капилляров и нервных волокон.

Можно предполагать, что особенности глиопролиферативного процесса у животных экспериментальных групп определяются модулирующей ролью и пространственной композицией коллагеновых компонентов, составляющих основу геля. Было обнаружено также, что уже на ранних сроках эксперимента нейроматрикс активно прорастал фибробластами, которые ограничивали стенки новообразованных сосудов. Это свидетельствует о более раннем начале ан-гиогенеза и, следовательно, лучшей оксигенации рубца. Более успешную по сравнению с контролем васкуляризацию новообразованной консолидирующей ткани можно объяснить нейротрофическим действием агентов, включенных в

нервов, фактор миграции ;фиб-

.ции оптимальные условий для

Сферогель (фактор роста сосудов, фактор ростг робластов), создающих в области трансплантп прорастания сосудов.

Течение воспалительного процесса в поврежденной ткани мозга экспериментальных животных также имело значительные различия по сравнению с группой контроля. У последних воспалительные инфильтраты (сосредоточенные на периферии рубца и в пограничных участках) были представлены, главным образом, полиморфноядерными лейкоцитами. У животных с трансплантированным гелем в тот же период (1-2 неделя) воспалительные процессы протекали как в глубине рубца, так и в прилегающих к нему участках ткани. В составе воспалительных инфильтратов доминирующим клеточным типом были макрофаги и гемосидерофаги.

Основным отличием группы «гель+оболочка» от крыс остальных экспериментальных групп («гель» и «гель+клетки») является отсутствие фрагментов костной ткани в структуре новообразованного рубца, которые зачастую обнаруживались в составе новообразованной ткани при повреждении мозговых оболочек и плохой изоляции места дефекта от костных элементов травмированного позвоночника. Очевидно, вместе с прорастающей соединительной тканью в область будущего рубца проникали клеточные элементы из поврежденной костной ткани позвонков, являющиеся основой для образования остеогенных очагов. В нашем эксперименте ограничение имплантируемого нейроматрикса по-

лимерной спинномозговой оболочкой позволяло избежать этого эффекта, не нарушая при этом сроки и качество образующейся ткани.

В развитии постгравматических функциональных нарушений особая роль принадлежит кистозным образованиям, заполненных ликвором и расположенным далеко за пределами повреждения. Образование этих полостей представляет собой закономерное следствие процессов некроза и апоптоза и является морфологическим субстратом формирующейся постгравматической сиринго-миелии. Обилие полостей различной величины и формы, заполненных тканевой жидкостью было обнаружено нами у всех животных, использованных в эксперименте. Выраженность сирингомиелических кист в каудальном сегменте мозга неизменно превышала таковую в тканях рострального сегмента (табл. 1). Однако, в тканях спинного мозга всех животных, получавших Сферогель, суммарная площадь полостей в каудальном и краниальном отделах спинного мозга была существенно меньше, чем у контрольных животных.

Таблица 1

Площадь кистозных полостей в отделах спинного мозга, ограничивающих по-справматический дефект у контрольных и экспериментальных крыс

через 10-12 недель после операции (в 1 мм ткани мозга)

Площадь полостей Краниальный отрезок Каудапьный отрезок

Контрольная группа (мм2) 0.56±0.09 мм2 0.36±0.06 мм2

Группа «Гель» 0.22±0.05* мм2 0.31±0.05*мм2

Группа «Гель+оболочка» 0.18±0.06* мм2 0.28±0.03*мм2

Группа «Гель+клетки» 0.04±0.01* мм2 0.17±0.03*мм2

различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05

Животным третьей экспериментальной группы в область травмы спинного мозга имплантировалась композиция из коллагенового нейроматрикса и культуры обкладочных нейроэпителиапьных клеток. Необходимость создания данной экспериментальной группы продиктовано в нашей работе двумя обстоятельствами. Во-первых, создание комплексных клеточно-тканевых трансплантатов считается в настоящее время наиболее эффективным для проведения заместительной терапии у людей с травмами ЦНС. Во вторых, механизмы ре-

паративного действия используемых в нашей работе обкладочных нейроэпите-лиальных клеток остаются пока недостаточно изученными, несмотря на их успешное клиническое применение при лечении нейротравмы и некоторых де-миелинизирующих заболеваний (Y.Li et al., 2007).

Как и в группах «Гель» и «Гель+оболочка» рубец, соединяющий фрагменты пересеченного спинного мозга, к 10 - 12 неделе эксперимента у крыс группы «гель+клетки» был полностью сформирован. Его морфологический состав, характер васкуляризации и особенности воспалительной реакции не отличался от животных двух других экспериментальных групп. Однако по выраженности и характеру процессов аксональной регенерации крысы группы «гель+клетки» значительно отличались от других животных, использованных в эксперименте. При окраске срезов их мозга метиленовым синим было обнаружено значительное число морфологически сохранных нервных волокон, имеющих неповрежденную миелиновую оболочку. Новообразованные аксоны, сопровождающие кровеносные сосуды, зачастую группировались в небольшие пучки и встречались на всем протяжении рубца, а также в тканях промежуточной зоны - в ростральном и каудальном ее сегментах. У крыс контрольной группы эти волокна был очень немногочисленны, имели извитые, неровные контуры и располагались в ткани мозга поодиночке.

Об успехе регенераторных процессов, отчасти, можно было судить, анализируя сохранность проводникового аппарата мозга на уровне поясничных сегментов. В каудальных отделах спинного мозга (L4-L5) у животных группы «гель+клетки» явления дегенерации аксонов также были выражены существенно меньше, особенно в областях, принадлежащих нисходящим трактам. Можно предполагать, что более эффективно протекающие процессы роста и миелини-зации нервных волокон, а также их хорошая сохранность у животных третьей экспериментальной группы обусловлены, в первую очередь, нейротрофически-ми свойствами использованных при трансплантации клеток.

Это предположение подтверждается в нашей работе результатами имму-ногистохимической диагностики зоны рубца, в которых было показано, что в

тканях спинного мозга у животных с трансплантированными ОНК селективные нейрональные маркеры аксоногенеза и регенерации экспрессируются наиболее активно по сравнению с животными остальных экспериментальных групп. Клетки и нервные волокна, интенсивно окрашивающиеся антителами к ОАР-43 (основной маркер аксоногенеза) и нейрофиламенту-200 (белок промежуточных нейрофиламентов), были наиболее многочисленны у животных группы «гель+клетки». При этом у контрольных крыс здесь выявлялись только единичные ОАР-43- и №200-позитивные клетки и проводники. Пока трудно сделать вывод о том, принадлежит ли часть обнаруженных нами иммунопозитив-ных структур трансплантированными ОНК или окрашивающиеся на наших препаратах аксоны проходят в составе регенерирующих нервных трактов. Поэтому вопрос о доминирующем механизме прорегенераторной активности ОНК - заместительном (пластическом) или стимулирующем (трофическом) пока остается открытым и нуждается в проведении дополнительных исследований.

Для изучения модифицирующего влияния среды нейроматрикса на используемую клеточную культуру, ОНК культивировались на Сферогеле в течение 10 дней, где они прикреплялись, выживали и формировали морфологически и биохимически неоднородные популяции (табл. 2,3).

Таблица 2

Количество ОНК, имеющих различные морфологические характеристики при

культивировании на сферогеле

Морфологический тип Количество клеток

«Яичница - глазунья» 46±5.2%

Биполярная форма 34± 6.1%

Мультиполярная форма 31%± 4.2

Через 10 дней культивирования на геле популяция ОНК была представлена клетками трех морфологически неоднородных форм - биполярной, муль-типолярной и формой, называемой в литературе «яичница - глазунья». До настоящего времени остается открытым вопрос, являются ли эти три типа клеток терминально дифференцированными формами ОНК или это - переходные типы клеток, способных превращаться друг в друга по мере необходимости (при изменении условия локального микроокружения в зоне трансплантации).

Иммуноцитохимическая диагностика специфических нейрональных маркеров, проведенная в нашем исследовании, позволяет предполагать, что в культуре присутствуют клетки, находящиеся на разных этапах своей дифференцировки. Наряду с ОНК, экспрессирующими белки, характерные для незрелой нервной ткани (виментин, нестин), через 10 дней культивирования часть клеток приобретали биохимические характеристики нейронов и глиоцитов (табл. 3).

Таблица 3

Иммуноцитохимическая характеристика клеточной культуры

культивированной на сферогеле

Маркер Количество клеток

Бета-тубулин 92.6±6.9%

Виментин 92.6±6.9%

Нестин 78.3±5.7%

Р75 56.4±3.7%

вРАР 38.5±2.4%

БЮО 28.1%±4.2

Основная часть культивированных клеток (92%±6.9) интенсивно окрашивались антителами к белку микротрубочек цитоскилета тубулину, и к белку промежуточных филаментов - виментину. Несколько меньшее число клеток (78%±5,7) проявляли сродство к нестину - нейроспецефическому белку, типичному для нейральных стволовых клеток. Это факт свидетельствует о том, что культивируемая на Сферогеле, а, следовательно, используемая для нейротранс-плантации клеточная культура имела очень высокую степень чистоты и была представлена клетками нейронального (нейроэпителиального) происхождения. Кроме того, определенная популяция клеток демонстрировала интенсивное окрашивание при использовании антител к низкоаффинным рецепторам фактора роста нервов Р75 (56%±3.7), к глиально-фибриллярному кислому белку вРАР (38%±2,4), а также к кальций-связывающему белку БЮО (28%±4,2). Эти белки, как известно, являются маркерами глиальных клеток. Данное обстоятельство доказывает присутствие в культуре клеток, получивших программу развития, и начавших «движение» в глиальном направлении.

При этом некоторая часть клеток, имеющих типичную для ОНК форму «яичница-глазунья» интенсивно окрашивалась антителами к Б-ЮО и йРАР, что

позволяет предполагать их типичную обкпадочную, миелин-продуцирующую роль в зоне трансплантации. Клетки биполярной и мультиполярной формы также экспрессировали глиальный фибриллярный кислый белок, типичный для астроцитарной глии. По существующим представлениям эти клетки способны к миграции на значительные расстояния и, благодаря продукции факторов клеточной адгезии, способны увлекать за собой растущие аксоны (Li, 2007). Мы считаем, что наличие в культуре небольшой популяции клеток, эспрессирую-щих белки, типичные для астроцитов, может объяснять некоторые механизмы их репаративной активности в условиях трансплантации в область повреждения спинного мозга.

Наиболее перспективной в терапевтическом плане, на наш взгляд, является небольшая популяция клеток, интенсивно окрашиваемых антителами к Р75 и по форме занимающих промежуточное положение между мультиполярной ОНК и формой «яичница-глазунья». В настоящее время с экспрессией белка Р75 связывают локальное уменьшение тканевого фиброза (B.D.Sachs, et al, 2008). Не исключено, что именно это свойство определяет качество рубцовой ткани консолидирующей область травмы у животных группы "гель+клетки". Кроме того, часть Р75-иммунопозитивных клеток, наряду с короткими выростами цитоплазмы (очевидно, будущие дендриты) имели единичные длинные отростки, длина которых многократно превышала размер клеточного тела. Похожий морфологический тип обнаруживался нами и среди клеток, окрашенных антителами к нейроспецефическому белку тубулину. Это позволяет предполагать их возможную дифференцировку в нейрональном направлении, не исключено поэтому, что при трансплантации они способны выполнять не только трофическую (секреторную), но и заместительную (пластическую) роль, включаясь в функционирование новообразованных синаптических цепей. Окончательный выбор в пользу реализации нейротрофического или нейропластическо-го репаративных механизмов в месте трансплантации диктуется условиями пространственного микроокружения, что в конечном итоге, определяет более эффективную нейрорегенерацию.

Наряду с морфологическими изменениями, свидетельствующими о более эффективном течении нейр орепаративного процесса у всех животных, получающих сферогель, анализ их поведенческой активности, локомоторных функций и соматического статуса также подтверждает эффективность используемого клеточна-бшподииерного комплекса (рис. I).

И Положительна я динамике

□ Параплегия задних конечнастен

Группа 1Г1 Групп а II Группа I

О 20 <50 80 100

% животных к общему количеству в группе

Рис, 1. Изменения двигательной функции задних конечностей крыс через 12 недель после операции. Данные представлены в процентах к числу крыс каждой группы.

Восстановление двигательной функции в задних конечностях через 12 недель эксперимента было выявлено у всех крыс группы «гель+клетки». Животным этой группы также была свойственна самая высокая оценка качества локомоторики по неврологической шкале «ВВВ», баллы которой здесь приближаются к подобным показателям у здоровых животных (рис.2)

« 21

§ "

Е 15

Я 19 3 6

з:

И 0

• Контроль —*— гель гсль+оболочка —• " гель+клегки

Ве^айакй^и; чщет твват

1 • .'..»• ' ..е--. . ' •'•' • .'.'": '"'Ш-

4 в 8

Недели эксперимента

Рис. 2. Динамика восстановления локомоторных функций (по шкале ВВВ)

у животных, itc.noлъзоваяных в, эксперименте. По шкале абсцисс - длительность послеоперационного периода. По шкале ординат - баллы неврологической шкалы.

Эти крысы активно передвигались, обладали координированной походкой с использованием всех суставов задних конечностей, опираясь при этом на развернутые вперед подошвенные поверхности лап. При ходьбе по зеркальной поверхности выявлялся отчетливый клиренс большого пальца, тазовая область была приподнята, крыса могла стоять на задних лапах и частично опираться на хвост. Качественные изменения локомоторики у животных группы «гель+клетки» также сопровождались уменьшением спастичности мышц задних конечностей, появлением реакции отталкивания на тактильные раздражители и использованием задних лап при преодолении экспериментального препятствия (высота 12 см) на пути к кормушке (рис. 3).

Е)Г|1ПСртонус МЫШЦ 1ВД1ШХ конОчностей

Я Реакция оттллкппаппя на т; I.....-I раидрпжители

□ Использование 1ЯДНН* конечностей при лсрецвижсЕшм

Рис. 3. Изменения мышечного тонуса задних конечностей через 12 недель после операции.

Кроме того, именно в этой группе кожные дистрофические изменения в виде проплешин, очагов аллопеции и кожного воспаления были минимальными. Эти животные выглядели более подвижными, охотно принимали пишу и активно И) ггер ее о вались событиями в клетке и за ее пределами. Напротив, животные контрольной группы, в течение всего послеоперационного периода выглядели вялыми и адинамичными, передвигались очень медленно и только с использованием передних лап. Гипертонус задних конечностей с появлением спастических контрактур наблюдались у контрольных животных в течение 12 недель эксперимента (рис. 3).

Реакция отталкивания па тактильные раздражители, а также способность к передвижению с использованием задних конечностей также отсутствовали в течение всего периода наблюдения.

Результаты настоящего исследования позволяют рассматривать технологию имплатантации биополимерного матрикса с инкорпорированной клеточной культурой как ключевую стратегию восстановления двигательных функций у пациентов с травмой спинного мозга. Можно полагать, что она существенно расширит реабилитационные возможности спинальных больных, поскольку базируется на фундаментальных принципах нейрорегенерации - управление свойствами консолидирующей ткани и активация процессов направленного ак-сонального роста.

ВЫВОДЫ

1. Биополимерный гетерогенный коллагеновый матрикс представляет собой среду, оптимальную для выживания и дифференцировки обкладочных ней-роэпителиальных клеток в нейронапьном и нейроглиальном направлениях. При культивировании на матриксе ОНК формируют три морфологически неоднородных популяции и экспрессируют маркеры, характерные для незрелой нервной ткани (виментин, нестин), дифференцированных глиапьных (вРАР, белок ЭКЮ и Р375) и нервных клеток (тубулин).

2. Применение коллагенового матрикса при монотерапии, а также в комплексе с полимерной спинномозговой оболочкой (группы «гель» и «гель+оболочка») способствует консолидации посттравматического дефекта в более ранние сроки. Преобладание в составе протезирующей ткани соединительнотканных элементов препятствует образованию глиальной демаркационной линии, формированию сирингомиелических кист, модулирует течение воспалительных процессов и создает благоприятные условия для роста кровеносных сосудов.

3. Замещение дефекта спинного мозга биополимерным гетерогенным коллаге-новым матриксом с культурой обкладочных нейроэпителиальных клеток (группа «гель+клетки») стимулирует процессы регенерации и ремиелиниза-ции нервных проводников в области травмы и способствует сохранению структуры проводникового аппарата каудальных сегментов спинного мозга.

4. Высокая иммуноцитохимическая активность маркеров аксоногенеза (Gap-43 и NF200) в тканях рубца у животных группы «гель+клетки» свидетельствует о реализации нейротрофического эффекта обкладочных нейроэпителиапь-ных клеток в зоне трансплантации.

5. Восстановление утраченных при травме спинного мозга неврологических функций наиболее эффективно происходит у животных группы «гель+клетки» и проявляется улучшением локомоторной активности вплоть до появления способности к самостоятельному передвижению.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Брюховецкий, И.С. Результаты клинического применения тканевой инженерии мозга /И.С. Брюховецкий, A.C. Брюховецкий // Трансплантация нервных клеток и тканевая инженерия мозга при нервных болезнях. - М.: Нейровита, 2003. - С. 256-280.

2. Брюховецкий, И. С. Морфохимическая характеристика спинного мозга крыс после торакальной сегментэктомиии и трансплантации полимерного коллагенового нейроматрикса «Сферогель - Э»™ с инкорпорированными обкладочными нейроэпителиальными клетками /И.С. Брюховецкий, И.В. Дюйзен, П.А. Мотавкин // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия -2008. - Т. III, №2 - С. 57-62.

3. Брюховецкий, И.С. Технология получения, моделирования и имплантации искусственной клеточно-биополимерной нейроэндопротезной системы для пластики дефектов и повреждений головного и спинного мозга при реконструктивных операциях и тканевой инженерии центральной и вегетативной нервной систем. /И.С. Брюховецкий, A.C. Брюховецкий, В.П. Чехонин, В.И. Севастьянов, O.A. Мышкин, A.B. Комфорт, Е.И. Денисенко, А.Ю Лямин // «Высокие технологии в терапии и реабилитации заболеваний нервной системы»,- М.: ММА им. Сеченова, 2008.- С. 41- 43.

4. Брюховецкий, И.С. Технология получения, сертификации и криоконсер-вации препарата аутологичных гемопоэтических стволовых кле-tok(CD34+, CD45-) и способ его применения для лечения травматической болезни головного и спинного мозга человека /И.С. Брюховецкий, A.C. Брюховецкий, В.Н. Ярыгин, A.B. Фадеев, Г.Л. Менткевич, A.B. Комфорт, A.A. Фролов, Д.М. Мхеидзе, А.Ю. Лямин // «Высокие технологии в терапии и реабилитации заболеваний нервной системы» М.: ММА им. Сеченова, 2008. - С. 46- 48.

5. Брюховецкий, И.С. Тканевая инженерия при экспериментальном травматическом повреждении спинного мозга крыс с использованием биодегра-дируемого полимерного матрикса «Сферогель - Э» и обкладочных нейро-эпителиальных клеток / И.С. Брюховецкий, И.В. Дюйзен, A.C. Брюховецкий, В.И. Севастьянов, Н.В. Перова, В.П. Чехонин, Е.А.Савченко // Материалы IV Всероссийского съезда трансплантологов, посвященного памяти академика В.И.Шумакова. М.: НИИ трансплантологии и искусственных органов, 2008. - С . 46.

{

Брюховецкий Игорь Степанович

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 10.10.2008 г. Усл. п. л. 2,0. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Заказ 29.

Отпечатано на участке оперативной полиграфии редакционно-издательского отдела ГОУ ВПО ВГМУ 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 4

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Брюховецкий, Игорь Степанович

1. Оглавление.1.

2. Список сокращений.2.

3. Введение.3—

4. Глава 1. Обзор литературы.7 —

5. Глава 2. Материалы и методы исследования.30

6. Глава 3. Иммуноцитохимическая характеристика обкладочных нейроэпителиальных клеток vitro.44 — 51.

7. Глава 4. Динамика морфологических изменений тканей спинного мозга крыс после торакальной сегментэктомиии и при замещении тканевого дефекта биополимерным матриксом, содержащим обонятельные нейроэпителиальные клетки.52 — 66.

8. Глава 5. Морфо-химическая характеристика регенерирующих нервных волокон.66 — 76.

9. Глава 6. Динамика двигательных функций спинного мозга у экспериментальных животных при травме и заместительной клеточной терапии.77

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы регенерации спинного мозга крыс при трансплантации обкладочных нейроэпителиальных клеток в биополимерном коллагеновом матриксе"

Огромные масштабы травматизма позволяют рассматривать его в числе наиболее актуальных медико-социальных проблем. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, ежегодно в странах Евросоюза, Азии и Северной Америки травмы занимают третье место среди причин смерти, после сердечно - сосудистых и онкологических заболеваний, и лидируют I среди причин ухода из жизни в молодом возрасте. Повреждения позвоночника и спинного мозга составляют около 4 % в общей структуре всех травм [49]. Между тем, эта патология кроме высокой летальности, I которая по различным данным колеблется от 16 до 64 % пострадавших, сопровождается практически полной, глубокой инвалидизацией больных, что влечёт тяжелые социально-экономические последствия. Только в Российской I

Федерации ежегодно по этой причине более 8000 человек становятся i инвалидами в наиболее трудоспособном возрасте (18 - 45 лет) [45]. Естественно, число травмированных намного больше, чем количество получивших инвалидность. I

В оценке реабилитационного потенциала пациентов-инвалидов с позвоночно-спинномозговой травмой (ПСМТ) до настоящего времени преобладают весьма пессимистические взгляды. Причина скепсиса связанна с традиционными представлениями (Ramon у Cajal S., 1928) об ограниченных возможностях нервной ткани к регенерации [152]. Именно по этой причине клиницистами и нейробиологами неоднократно предпринимались попытки стимулировать процессы регенерации нервной ткани с помощью имплантации в зону перерыва спинного мозга различных экзогенных материалов - фрагментов дегенерирующего периферического нерва, участков вегетативных и спинальных ганглиев, выращенных в искусственных условиях нервных и глиальных клеток [18, 27, 40, 184]. Но, несмотря на значительные успехи в экспериментальной нейротранспланталогии, проблема успешного восполнения функциональных дефектов нервной ткани до конца XX века считалась практически не 1 решаемой. Основные трудности здесь были связаны с несоответствием темпов и характера формирующейся на месте повреждения рубцовой ткани, а также невозможностью терапевтического влияния на активность эндогенной системы роста и функционального восстановления поврежденных нервных волокон [34, 148, 149]. Главные достижения в этой области связаны с появлением современных биополимерных материалов, создающих оптимальные условия для выживания и дифференцировки различных линий стволовых клеток в культуре, а также для реализации их I нейрорепаративного потенциала зоне трансплантации [9, 116]. I

Современная идеология экспериментальной и клинической нейротрансплантологии базируется на двух основных подходах, использующих в заместительных целях либо биокомпозитные материалы (формирующие своеобразный тканевой протез, обеспечивающие быструю консолидацию разобщенных участков нервной ткани и создающие оптимальную среду для облегчения роста аксонов), либо трансплантацию различных клеточных линий выполняющих нейротрофическую, а возможно, и пластическую роль в очаге повреждения [68]. Совершенствование и широкое клиническое внедрение этих методов нуждается в детальном исследовании фундаментальных механизмов развития патологических и компенсаторно-восстановительных процессов, а также — в поиске новых источников клеток для трансплантации и наиболее оптимальном пути их использования.

Обкладочные нейроэпительнльные клетки (ОНК) в настоящее время рассматриваются как наиболее перспективный объект клеточной терапии посттравматических и демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы [53, 59, 120, 121, 151, 123, 138]. Это связано с простотой их получения, иммунологической безопасностью при аутотрансплантации и предположительно низкой способностью к онкогенной трансформации. В условиях культивирования, при создании соответствующей пространственной информации, они оказываются весьма жизнеспособными, активно пролиферируют и способны дифференцироваться в направлении нейронов и глиальных клеток, а при совместном культивировании с нервными клетками - участвуют в миелинизации их аксонов. Несмотря на доказанную эффективность трансплантации ОНК при различных неврологических заболеваниях и экспериментальных повреждениях нервной системы, многие механизмы их участия в процессах регенерации остаются невыясненными. До настоящего времени не решен вопрос о функциональной интеграции ОНК с тканями реципиента, их способности реконструировать трехмерную архитектуру нервной ткани, управлять процессами направленного роста поврежденных аксонов и обеспечивать их успешную миелинизацию. Нуждается в дальнейшем совершенствовании технология их выращивания, направленной дифференцировки и трансплантации в составе тканевых нейропротезов.

Разработкой и изучением свойств пригодных для трансплантации биополимерных матриксов занимаются в настоящее время ведущие лаборатории мира. Предложены нейроматриксы «NeuroGel» (IMITE, Швейцария); «RMx» (Total ReCord, США) и др. Используемый в настоящем исследовании биополимерный деградируемый нейроматрикс «СфероГель-Э» - полностью Российская разработка. В ходе его предварительных испытаний I было показано, что матрикс способствует более быстрому формированию нейропротезирующей ткани между пересечёнными концами спинного мозга I и препятствует образованию глиомезодермального рубца, ограничивающего регенерацию аксонов спинномозговых трактов [9, 40]. Однако недостаточно I изученными остаются механизмы, лежащие в основе его консолидирующей роли, а также возможность использования матрикса в качестве трансплантационной среды для ОНК, способной обеспечивать их выживание и направленную дифференцировку.

Цель настоящей работы: Установить особенности и механизмы восстановления поврежденного спинного мозга крыс при замещении тканевого дефекта биополимерным матриксом с культурой обкладочных нейроэпительнальных клеток.

Задачи исследования:

3. Изучить особенности регенерации нервных волокон в тканях спинного мозга экспериментальных животных.

4. Выявить особенности экспрессии и иммуноцитохимического распределения маркеров аксонального роста в спинном мозге экспериментальных животных на этапах реабилитации.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Брюховецкий, Игорь Степанович

выводы

1. Биополимерный гетерогенный коллагеновый матрикс представляет собой среду, оптимальную для выживания и дифференцировки обкладочных нейроэпителиальных клеток в нейрональном и нейроглиальном направлениях. При культивировании на матриксе ОНК формируют три морфологически неоднородных популяции и экспрессируют маркеры, характерные для незрелой нервной ткани (виментин, нестин), дифференцированных глиальных (ОБАР, белок 8100 и Р75) и нервных клеток (тубулин).

3. Замещение дефекта спинного мозга биополимерным гетерогенным коллагеновым матриксом с культурой обкладочных нейроэпителиальных клеток (группа «гель+клетки») стимулирует процессы регенерации и ремиелинизации нервных проводников в области травмы и способствует сохранению структуры проводникового аппарата каудальных сегментов спинного мозга.

4. Высокая иммуноцитохимическая активность маркеров аксоногенеза (ОАР-43 и №200) в тканях рубца у животных группы «гель+клетки» свидетельствует о реализации нейротрофического эффекта обкладочных нейроэпителиальных клеток в зоне трансплантации.

Заключение

В настоящей работе мы предприняли попытку изучить особенности и механизмы восстановления поврежденного спинного мозга крыс при замещении тканевого дефекта композицией из биополимерного нейроматрикса и культуры обкладочных нейроэпительнальных клеток. Анализируя полученные результаты, мы считаем необходимым обсудить следующие затронутые в нашей работе проблемы:

1. Адекватность используемого оперативного вмешательства для исследования механизмов восстановительного процесса в тканях спинного I мозга при нейротрансплантации;

2. Выбор и преимущества биодеградируемого гетерогенного нейроматрикса «Сферогель-Э» перед другими наполнителями;

3. Роль и механизмы реализации нейрорепаративного эффекта обкладочных нейроэпителиальных клеток;

4. Визуальные проявления динамики восстановительного процесса у животных, перенесших тяжелую спинальную травму.

В своих экспериментах мы использовали модель травмы, создающую ситуацию полного анатомического перерыва спинного мозга, путем I иссечения его фрагмента толщиной 2-3 мм. Мы считаем, что подобный подход имеет ряд преимуществ. Во-первых, данные, полученные на I моделях с полной экстирпацией фрагмента спинного мозга, представляют большую научно-практическую ценность, поскольку, в создаваемых экспериментальных условиях полностью исключается возможность произвольного, частичного самовосстановления и компенсации некоторых неврологических функций, что нередко наблюдается при неполном анатомическом перерыве спинного мозга [29]. В последнем случае морфо-функциональная регенерация происходит за счет тканей мозговых оболочек, волокон задних корешков и спинальных первично-чувствительных ганглиев, а также нейронов, глиоцитов и волокон противоположной к месту травмы стороны [18]. Сохранная структура спинномозгового канала, изолирующая ликвор от токсического влияния на нервную ткань, может также обеспечивать лучшее выживание и более успешное функциональное восстановление у животных с частичным повреждением спинного мозга [24]. В этой связи использованная в наших экспериментах торакальная сегментэктомия исключает интерпретацию любого из полученных результатов как закономерного (и ожидаемого) в случае частичного повреждения. Именно указанные обстоятельства, при использовании моделей с частичным повреждением спинного мозга, послужили поводом для безосновательного скепсиса некоторых нейробиологов и клиницистов в отношении возможностей клеточной трансплантологии [185].

Во-вторых, именно сегментэктомия по своим патогенетически механизмам, комплексу осложнений и прогнозу наиболее близка к тяжелой ПСМТ сопровождающейся полным перерывом спинного мозга у человека [24, 31, 51]. Подобная травма клинически очень демонстративна, поскольку тяжесть вегетативных и соматических расстройств в этом случае определяется уровнем повреждения спинного мозга. Кроме того, экспериментальная травма спинного мозга с полным анатомическим перерывом является идеальной моделью, в той или иной степени имитирующей практически любую неврологическую катастрофу: инсульт, миелопатию, острое воспалительное или демиелинизирующее заболевание. Эта общность обусловлена стереотипным каскадом реализации общепатологических алгоритмов (ишемия, некроз, апоптоз, воспаление, демиелинизация, перекисное окисление липидов, нейромедиаторная токсичность), которые в итоге определяют объем неврологического ущерба при любой патологии нервной системы [1, 51, 58]. Изучение процессов регенерации нервной ткани на уровне спинного мозга позволяет сравнивать функцию передних и задних конечностей у экспериментального животного, что при использовании стандартизованных международных шкал (ВВВ, ASIA) позволяет объективно оценить полученные результаты.

Использованная в нашей работе ситуация полного анатомического перерыва спинного мозга характеризовалась исключительной тяжестью течения и наличием большого числа осложнений. Прооперированные животные получали глюкокортикостероиды (дексаметазон), растворы глюкозы, антихолинэстеразные ; препараты (прозерин), антибиотики I фторхиналонового ряда, содержались в условиях полностью исключающих, сколько либо значительное колебание температур, однако даже в этих условиях смертность достигала 30%. В итоге, не у одного из выживших животных контрольной группы не произошло самопроизвольного восстановления утраченных вследствие травмы неврологических функций.

Следует отметить, что отсутствие самопроизвольного восстановления утраченных двигательных и тазовых функций встречается ещё в работах Рамона Кахаля, в итоге прекратившего эксперименты с полной перерезкой спинного мозга, осознав сложность борьбы с огромным числом неподдающихся учету осложнений [152]. Аналогичные результаты были получены в работах многих российских [18, 32, 40, 44] и зарубежных [149,

185] исследователей. Американский нейрохирург Л.Фримен (1955) прооперировал на протяжении ряда лет более двух тысяч крыс, и в его исследованиях описываются только единичные случаи некоторого I улучшение двигательных функций [184]. Вайс Янг, анализируя все I экспериментальные модели спинальной травмы, вообще исключает любую возможность произвольного восстановления двигательных функций после сегментэктоми по методу Уорли [185]. Вместе с тем, указывая на ничтожную вероятность самовосстановления, традиционно говорится о необходимости хорошей предоперационной подготовки, бережного отношения к тканям во время операции и качественного послеоперационного ухода с адекватной I состоянию животного фармакотерапией, что и было в точности выдержано в нашем эксперименте.

Безусловно, облегчение боли, нейропротективная, сосудистая и симптоматическая фармакотерапия являются обязательными условиями коррекции неврологического дефицита при спинальной травме [42]. Однако главным лимитирующим фактором на пути к клинически ценному I восстановлению неврологических функций у спинальных больных является посттравматический рубец и «пустые» пространства, формирующиеся в локусах обширного некроза нервной ткани, которые необходимо преодолеть растущим аксонам для установления утраченных связей [27]. В этой связи глио-мезодермальному рубцу, заполняющему дефект нервной ткани, всегда отводилась основная лимитирующая роль в процессах аксоногенеза. С I другой стороны, при отсутствии консолидирующей ткани рубца между краниальным и каудальным отрезками спинного мозга, они подвергаются ретракции, а пустые пространства заполняются ликвором с образованием сирингомиелитических кист, что делает восстановление нервных связей попросту невозможным [18]. Поэтому одной из наиболее важных задач тканевой инженерии при травмах спинного мозга является получение возможности управления скоростью и качеством образующейся ткани, замещающего нейрональный дефект. Предпринятые к настоящему времени попытки решения этого вопроса фармакологическими' и микрохирургическими методами к решению проблемы не привели. I

Применение имплантируемых и системно действующих нейрональных I модуляторов, нейротрендов и микропроцессорных стимуляторов («ЗотоАэг Бапек», «Соёшап») для избирательного воздействия на зону травмы имели определённый успех, но также не оправдали в полной мере возлагаемых надежд [9]. В конце 80-х годов XX века для получения наделённой особыми свойствами «ткани — моста», замещающей посттравматический дефект спинного мозга, было предложено использовать биополимерные материалы, что позволило братьям Ваканти впервые, в 1999 году впервые осуществить реконструкция полного анатомического перерыва спинного мозга [181]. Тип используемого материала при создании подобной конструкции и по сей день является одним из самых дискутабельных вопросов тканевой инженерии [9]. «Идеальный» материал еще не > открыт, однако на сегодняшний день

I '

89 большинством современных нейробиоинженерных корпораций: Total ReCord (США); IMITE (Швейцария) предложены и запатентованы собственные биополимерные среды предоставляющие возможность получения качественной ткани, восполняющей нейрональный дефект.

Биополимерный нейроматрикс «Сферогель—Э» - это полностью Российская разработка. Производство и хранение нейроматрикса не связанно с такими фантастическими затратами, как у американского или швейцарского аналогов. Об эффективности использования Сферогеля в нашем эксперименте наглядно свидетельствуют результаты, полученные у крыс групп «гель» и «гель+оболочка», где сращение отрезков спинного мозга протекало весьма успешно и в более ранние сроки. Консолидирующая ткань «моста - нейропротеза» у этих животных формировалась быстрее и отличалась хорошей васкуляризацией. Регенерирующие нервные волокна были здесь более многочисленными, их миелинизация происходила значительно быстрее, волокна прорастали пучками, а не поодиночке, как у контрольных животных; при этом область пустот также была выражена значительно меньше, чем в контрольной группе. По нашему мнению, скорейшей и полноценной в морфологическом и функциональном смысле I консолидации посттравматического дефекта у этих крыс, является три I группы факторов:

Во-первых, для успешной регенерации нервных проводников и восстановления утраченных неврологических функций важно, чтобы ткань, протезирующая спинальный диастаз, обладала определёнными свойствами. Филогенетически образование рубцовой ткани является логическим завершением всего хода любой травматической или воспалительной реакции, поэтому биологический смысл её появления заключается в скорейшем закрытии очага повреждения и изоляции его от агрессивного влияния факторов внешней среды. В силу необходимости, помимо мезенхимального (фибробластного) компонента, в образовании рубца участвуют клеточные элементы той ткани, в которой эта реакция протекает, в данном случае глиальные элементы, преимущественно, астроциты [28, 54, 109]. Очевидно, что управление качеством образования протезирующей посттравматический дефект «ткани - моста» осуществимо только при создании соответствующего баланса цитоархитектоники этих двух компонентов, при этом в идеале ¡такая ткань должна быть получена в исключительно сжатые сроки, что позволит избежать травматических перестроек и ретракции спинномозговых фрагментов. В нашем эксперименте при гистологическом исследовании спинного мозга выявлялись существенные различия в тканевом составе и сроках формирования рубца у животных из разных групп. У крыс всех экспериментальных групп рубцовая ткань начинала формироваться в более ранние сроки (конец 2 недели), тогда как у контрольных животных в эти 1 сроки полость дефекта СМ еще была занята фибриновыми массами. Спинномозговой рубец у животных контрольной группы был отчетливо сформирован лишь к 10 неделе эксперимента. Зона тканевого дефекта в этом случае была заполнена глио-мезодермальной тканью, имеющей четкую демаркационную границу с прилежащими участками мозга.

Таким образом, терапия препаратом Сферогель позволяет сформировать рубцовую ткань, создающую «мост» между ростральным и каудальным фрагментами спинного мозга, в более ранние сроки.

Во-вторых, в нейроматриксе содержится набор нейротрофичёских агентов (фактор роста сосудов, фактор роста нервов, фактор миграции фибробластов), действие которых создает в области трансплантации I идеальные условия для прорастания сосудов и регенерации нервных проводников. В нашем эксперименте у животных группы «гель+клетки» к 10 неделе рубец был полностью сформирован тканью, где, наряду с развитой астроцитарной глией, присутствовали также элементы соединительной ткани — фибробласты, пучки соединительнотканных волокон и многочисленные новообразованные микрососуды. Это свидетельствует о более раннем начале ангиогенеза и, следовательно, лучшей оксигенации рубца. Отличительной особенностью данного способа реконструкции нервной ткани является обилие нервных волокон, сопровождающих прослойки ткани в области сформированного рубца.

Предпосылки к такого рода морфологическому эффекту наблюдались уже на раннем этапе эксперимента. Так, у всех животных с имплантируемым гелем уже через 1-2 недели после операции, обращала на себя внимание иная архитектоника пролиферирующих астроцитов, которые выстраиваются в виде длинных клеточных тяжей, направленных параллельно длиннику спинного мозга как внутри рубца, так и в пограничной зоне. В то же время астроцитарная реакция в контрольных образцах, протекала, 1 преимущественно, в поперечном направлении что, очевидно, служило препятствием для развития соединительнотканных элементов и дальнейшего I роста нервных волокон. ; у

В целом, как демонстрируют наши гистологические препараты, использование «Сферогеля» совместно с ОНК или без них, позволяет достаточно быстро сформировать более качественную протезирующую ткань между каудальным и краниальным отрезками спинного мозга, что не только позволяет избежать их ретракции, образования глиальной демаркационной линии, но и создает более благоприятные условия для регенерации аксонов.

Наконец, биополимерная структура Сферогеля, выполняя опорную и зашитую функции в отношении регенерирующих нервных проводников, позволяет избежать их «спраутинга», делая возможным их направленный рост и достижение пункта назначения. Именно поэтому целенаправленная двигательная активность у животных в группах «Гель» и «Гель+оболочка» -в среднем 10 баллов по шкале «ВВВ» - существенно превосходила подобные показатели контрольной группы, где наивысшая оценка по той же шкале не превышала 5 баллов. Важно подчеркнуть, что близкие результаты были получены С. Уорли при использовании аналогичного по структуре нейроматрикса «ЫеигоОе!» [141]. В его исследованиях также было достигнуто восстановление структурной целостности спинного мозга после торакальной сегментэктомии без формирования грубого морфологического дефекта. Уорли убежден, что через определённое время имплантируемый биополимер замещается собственньши клеточными элементами и нервными j , волокнами [141]. Эту точку разделяет Джерри Райзман, получивший еще более убедительные результаты при реконструкции области травмы с помощью гидрогелевого биополимера и культуры ОНК [148, 149, 150]. I

Кроме того, полная реконструкция области повреждения спинного мозга к i концу второго месяца эксперимента при использовании данной технологии достигнута в работах Y. Li [120, 121, 122]. Об успешности завершенности процессов аксоногенеза при использовании ОНК свидетельствуют также работы L. Ramer, (2004) показавшего наличие отчетливых синаптофизинj позитивных гранул на телах и проксимальных дендритах мотонейронов люмбального сегмента спинного мозга [151]. I

Безусловно, современные биополимеры ещё далеки от совершенства.

Ведутся интенсивные работы по созданию на основе «Сферогеля-Э» | нейроматрикса принципиально нового типа. По мнению чешского исследователя Евы Жуковой, одним из способов совершенствования стратегии лечения полных перерывов спинного мозга с помощью биополимерного геля является добавление в его состав клеток, которые: 1) потенциально способны к встраиванию в структуру поврежденной ткани и 2) способны секретировать в течение длительного времени необходимый набор трофических и нейромодуляторных факторов [68]. В идеале такой нейроматрикс должен быть снабжен определенным набором «векторов» факторов дифференцировки j и нейротрофического действия, 1 обеспечивающих направленное деление и развитие стволовых (или малодифференцированных) клеток. Он должен также оказывать модулирующее влияние на эндогенные нейральные стволовые клетки, которые, как известно, располагаются «по берегам» центрального канала спинного мозга, но обладают I очень ограниченным репаративным потенциалом [50]. Их пролиферативного ресурса хватает для компенсации нейрональных потерь, возникающих при небольших повреждениях ЦНС преходящие нарушения мозгового кровообращения (транзиторные ишемические атаки, гипертонические кризы), сотрясения и ушибы головного и спинного мозга легкой и средней степени тяжести. Однако при обширных повреждениях ЦНС, к числу которых относится ПСМТ, их пролиферативные возможности оказываются недостаточными для компенсации неврологического дефицита и образования новых, функционально активных синаптических связей.

Известно, что главным препятствием для активной клеточной пролиферации, дифференцировки и направленного роста новообразованных нервных волокон является группа факторов-репеллентов (белок пс^о, сульфатированные гликозоаминопротеогликаны), источником которых становятся фрагменты размозженной нервной ткани и компоненты межклеточного матрикса [136, 142]. В этом разрезе одним из путей совершенствования биополимерных нейрокомпозитов считается использование компонентов, не только ингибирующих апоптоз и избыточную астроцитарно-микроглиальную реакцию, но и факторов, нейтрализующих эффекты репеллентов. Возможный механизм реализации такого действия связан с созданием особого типа нанокапсул с детерминированным сроком динамического высвобождения заключенных в них нейроактивных веществ. Гипотетически подобная структура способна выполнять в поврежденной нервной ткани тройственную роль - тканевого нейропротеза, вектора дифференцировки и нейропротективного агента.

Одним из ключевых компонентов реализации нейротрофической стратегии нейроматриксов служит включение в их состав некоторых клеточных компонентов. В нашем эксперименте используются обкладочные нейроэпителиальные клетки, что продиктовано огромным вниманием к ним как наиболее подходящему трансплантационному материалу для лечения неврологической патологии [70, 109, 120, 121, 123, 144, 148, 151]. В литературе нет точных данных о том, кто впервые описал ОНК. Первые шаги по изучению клеточной биологии структур обонятельного нейроэпителия предприняты Y. Nagahara еще в 1940 году, и именно с этого момента стали звучать предложения использовать ОНК-содержащие трансплантаты для лечения неврологической патологии [134]. В полной мере эта задача впервые была реализована в работах F.J.Roisen, (2001) а позднее X. Zhang, (2004), сумевших выделить культуру ОНК с высокой степенью чистоты [53, 55]. Именно вопрос чистоты клеточного материала, полученного из слизистой оболочки верхней носовой раковины является в настоящее время наиболее принципиальным, поскольку определяет понимание механизмов репарационного действия трансплантата. Поскольку ведущей причиной развития тяжелого неврологического дефицита у спинальных больных является утрата нервными проводниками миелиновой оболочки, то способность инициировать рост и ремиелинизацию повреждённых аксонов является одним из главных требований к трансплантируемой культуре. В естественных условиях ОНК не миелинизируют аксоны, однако, они приобретают такую способность, будучи трансплантированы в зону травмы. Предпринимались попытки объяснить подобные наблюдения низкой чистотой культур ОНК, которые могли быть «загрязнены» Швановскими клетками [61, 153, 180]. По его мнению, J. Boyd (2005) для идентификации ОНК традиционно используются антитела к белку - рецептору Р75 наличие которого также свойственно Швановским клеткам [70]. «В целях установления истины» Boyd J.G. предложил в обязательном порядке тестировавать культуру планируемую для трансплантации на содержание кальпоина, позволяющего отличить ОНК от Швановских клеток. Эти выводы весьма дискутабельны, поскольку имеются весьма достоверные данные (С. Ibanez, 2007), что кальпонин локализуется в фибронектин-позитивных фибробластах, также получаемых из пунктата обонятельного эпителия и оболочечных клеток обонятельной луковицы [74]. Таким образом, кальпонин не может служить для различия между ОНК и Швановскими клетками [75]. Вместе с тем очевидно прямое генетическое сродство ОНК к Швановским клеткам, равно как и к другим глиоцитам. Эта проявляется как в единой регуляции их активности через систему нейрогелинов, так и в единстве ряда белков цитоскилета [8]. По мнению R.Thompson, (2000) специфическим маркером Швановских является HNK-1 белок-рецептор [82]. Кроме того, ОНК на протяжении всего клеточного цикла экспрессируют нестин и виментин [31]. По мнению A.Vincent, (2005) именно этой способностью ОНК наиболее радикально отличаются как от Шванновских клеток, так и от фибробластов [102].

В наших экспериментах, клетки, культивируемые на Сферогеле, формировали монослой, в котором большая часть клеток (>90%) окрашивалась антителами к нестину. Кроме того, часть клеток уже очевидно получивших программу развития и «движущаяся» в направлении нейронов окрашивались антителами к (3-тубулину. Часть клеток интенсивно окрашивалась антителами к GFAP и Р75. Мы не производили типирование этого материала с использованием маркера Швановских клеток HNK-1. Однако клетки этого ряда активно окрашивались антителами к нестину и виментину, что позволяет достоверно утверждать, что это ОНК получившие программу развития, и «движущиеся» в глиальном направлении.

В нашем эксперименте при культивировании ОНК образовывали три различные морфологические формы - биполярную, мультиполярную и форму, называемую некоторыми авторами «яичница—глазунья». До настоящего времени нет четких представлений о том, являются ли эти три морфологические группы клеток терминально дифференцированными типами ОНК или они способны превращаться друг в друга по мере необходимости. Не исключено, что количественное соотношение этих клеток в месте трансплантации диктуется условиями пространственного микроокружения и определяет, в конечном итоге, более эффективную нейрорегенерацию по сравнению со Шванновскими трансплантатами. Так, в экспериментах Y. Li, (1998) доказаны существенные различия репаративного действия ОНК и ШК, проявляемые как в скорости миграции к месту травмы, так и способе миелинизации. Шванновские клетки оставались в месте трансплантации, а ОНК мигрировали вдоль белого вещества спинного мозга, первоначально увлекая аксоны за собой, а затем оставались на месте, пропуская растущие аксоны вперед. В другом эксперименте (Ramon С. A., et al., 1998) использовался трансплантат из Шванновских клеток в сочетании с ОНК, которые мигрировали, увлекая аксоны в дистальный отрезок спинного мозга, в результате чего аксоны регенерировали на длинные расстояния (до 1,5-2,5 см) и восстанавливали двигательные и чувствительные функции. В этом эксперименте меченные ОНК также обнаруживались в белом и сером веществе спинного мозга на 1,5 см от зоны трансплантации, в то время как смещение промаркированных ШК не превышало 800мкм.

Другим принципиальным отличием ОНК от ШК является способность образовывать комплексы с астроглией, изменяющие морфологию и динамику глиальной реакции в месте формирования рубца [151]. В то время как образующиеся в месте травмы комплексы Шванновских и астроглиальных клеток способствуют уплотнению рубца и стимулируют высвобождение про-воспалительных и анти-ростовых факторов, то комплексы ОНК с астроцитарной глией, напротив, усиливают пропускную способность глио-мезодермального рубца. Так, по мнению Джерри Райзмана (2003) в местах соприкосновения клеточных поверхностей ОНК и астроцитов, последние изменяют свою конфигурацию таким образом, чтобы их активные поверхности, были обращены в сторону мозговых оболочек [148, 149], что порождает эффект, названный Y. Li (1998) «открыванием дверей в нервную систему» [120, 121, 122]. Он проявляется в способности глиального рубца путем образования особых «каналов» пропустить мигрирующие ОНК влекущие за собой аксоны.

Полученные в настоящей работе результаты дополняют известные факты о "поведении" обкладочных нейроглиальных элементов обонятельного эпителия в культуре и при трансплантации. В условиях культивирования они образуют нейросферы, а при высвобождении из них и образовании монослоя способны дифференцироваться в клетки с морфологическими и биохимическими характеристиками нейронов и глиоцитов. Около 38% культивированных в нашей работе клеток экспрессировали ОБ АР — структурный белок, наиболее типичный для астроцитарной глии. Учитывая, что комплексы астроцитов с ОНК обладают особыми свойствами, индуцирующими направленный рост аксонов [121], мы считаем, что образование клеток, морфологически и биохимически похожих на астроциты, может служить фактором, благоприятствующим их репаративной активности в условиях дальнейшей нейротрансплантации.

Остальные клетки экспрессировали маркеры, наиболее типичные для олигодендроглиоцитов и клеток, подобных Шванновским - Р75, 8100, ОБ АР. Эти свойства позволяют предполагать их прямое или опосредованное участие в образовании миелиновой оболочки на регенерирующих аксонах. На это указывают результаты проведенного нами морфологического и иммуноцитохимического анализа срезов спинного мозга животных из группы «гель+клетки» а также оценка динамики восстановления двигательной функции у экспериментальных животных этой группы.

Действительно, число морфологически сохранных нервных волокон, имеющих миелиновую оболочку, доминировало у животных группы «гель+клетки», где они группировались в пучки, сопровождающие кровеносные сосуды. На срезах каудального отдела спинного мозга (Ь4) у животных группы «гель» и «гель+оболочка» явления дегенерации аксонов были менее выражены, особенно в тех областях, которые принадлежат нисходящим трактам — вентромедиальные сегменты задних канатиков и дорсо-латеральные зоны боковых. Указанные данные позволяют сделать вывод об активной реиннервации ткани рубца и каудальных сегментов спинного мозга, особенно выраженной у животных третьей экспериментальной группы. Похожие результаты были получены в эксперименте с использованием Сферогеля и культуры эмбриональных нервных клеток из головного мозга крыс [40]. .Г.МсВопаЫ (2000) используя биополимерный нейроматрикс с культурой полипотентных клеточных элементов, также получил полное восстановление двигательной активности в задних конечностях в у экспериментальных крыс [173]. Успех своих изысканий, как и большинство других исследователей, эти авторы связывают с активной секрецией нейротрофических компонентов помещенными в нейроматрис клетками [70, 109, 120, 121, 123, 144].

Зафиксированная в нашей работе компенсация неврологического дефицита у крыс группы «гель+клетки», а также более успешная миелинизация аксонов, входящих в состав нисходящих спинальных трактов, вероятно, связанна с выделением ОНК ряда нейротрофических агентов (фактора роста нервов МвБ, нейротрофического мозгового фактора ВОКБ, различных классов нейротрофинов (КГГ 3/4/5), глиального нейротрофического фактора вОМ7), промотирующая роль которых в отношении новообразования аксонов является неоднократно доказанной [78]. В совокупности они составляют основу многонаправленного нейротрофического действия трансплантата, применение которого в клинике и эксперименте в настоящее время связывается с индукцией и эффективной поддержкой направленного роста аксонов [70, 109, 120, 123].

Вопрос о судьбе ОНК, инкорпорированных в Сферогель и трансплантированных экспериментальным животным, остается открытым. Иммуногистохимический анализ зоны рубца у животных группы «гель+клетки» показал, что новообразованная нейропротезирующая ткань содержит клетки, активно экспрессирующие вАР-43 (основной маркер аксоногенеза) и нейрофиламент-200 (белок промежуточных нейрофиламентов). В то же время в образцах контрольной группы встречаются только единичные ОАР-43- и ]\ГР200-позитивные клетки и волокна. Возможность дифференцировки ОНК в направлении нейронов и глиальных элементов широко описана в литературе [144, 171, 183]. Пока трудно сделать вывод о том, принадлежит ли часть иммунопозитивных волокон трансплантированными ОНК или окрашивающиеся на наших препаратах аксоны проходят в составе регенерирующих нервных трактов.

Поэтому полученные в нашей работе данные позволяют говорить в первую очередь о стимулирующем (трофическом) механизме регенераторной активности ОНК, который обеспечивает не только более успешную реваскуляризацию рубцовой ткани, модулирует активность воспалительных процессов, но и стимулирует продукцию различных классов нейротрофических факторов существенно ускоряющих аксоногенез.

Вместе с тем наличие миелиновой оболочки на новообразованных нервных волокна не исключает возможность реализации заместительной (миелин-образующей) функции ОНК, трансплантированных в зону дефекта нервной ткани. Вопрос о механизмах этого действия ОНК нуждается в проведении дополнительных исследований. Известно, что в условиях культивирования, при контактном взаимодействии и нервными волокнами, этим клетки способны формировать типичную миелиновую оболочку на их поверхности [120, 121]. Однако данное свойство ОНК пока не нашло прямого подтверждения в условиях их трансплантации в структуры мозга, в связи с чем в литературе продолжается обширная дискуссия, начатая У. №§аЬага еще в 1940 году, когда была проведена первая операция по трансплантации ОНК в поврежденный мозг [134]. Большинство авторов считают, что образование миелиновой оболочки на прорастающих через мозговой рубец аксонов - функция исключительно Швановских клеток, активно мигрирующих в очаг повреждения под влиянием нейротрофических факторов, секретируемых ОНК [123]. Другие [145, 151] обосновывают миелин-продуцирующую роль сохранившихся или мигрировавших в область повреждения олигодендроцитов, в то время как третьи [119] настаивают на прямом участии в образовании миелина ОНК, имплантированных в зону тканевого дефекта и получивших здесь соответствующую программу развития. Эти факты находят клиническое подтверждение при успешном использовании трансплантации ОНК больным с диффузными демиелинизирующими заболеваниями [144].

В связи с обсуждением заместительной функции ОНК в зоне трансплантации интересным и многообещающим, на наш взгляд, является вопрос о возможности трансформации этих клеток в нервные элементы, их приживления в зоне пересадки и дальнейшей судьбе. Известно, что при соответствующих условиях и сроках культивирования ОНК могут формировать синаптические специализации и отвечать на раздражения как функционально зрелые нейроны [73, 93]. В нашем эксперименте около 5% культивированных на Сферогеле клеток, наряду с короткими выростами цитоплазмы (вероятно дендриты) имели длинный, единичный, аксоноподобный отросток. Это позволяет предполагать их возможную дифференцировку в нейрональном направлении. Мы не исключаем поэтому, что, будучи имплантированными, в область тканевого дефекта спинного мозга, они, отчасти, выполняют структурную роль, включаясь в функционирование новообразованных синаптических цепей. Для доказательства этого предположения необходимо проведение соответствующих иммуноцитохимических и электрофизиологических исследований.

Наряду с морфологическими изменениями, свидетельствующими о более эффективном течении нейрорепаративного процесса у экспериментальных животных, анализ их поведенческой активности, соматического статуса, и локомоторных функций также подтверждает эффективность используемого трансплантационного материала. Функциональное восстановление, наиболее выраженное у животных группы «гель+клетки», проявлялось преимущественно изменениями в двигательной сфере. Здесь наиболее отчетливо и в более ранние сроки выявлялись изменения тонуса задних конечностей, появление реакции отталкивания на тактильные раздражители и появление способности преодолевать экспериментальное препятствие на пути к кормушке с использованием задних лап, что позволяло, используя стандартизованную международную шкалу «ВВВ» оценить достигнутые результаты в 11 баллов. Экстраполируя полученные данные на шкалу тяжести спинальной травмы «ASIA», можно ожидать улучшения соответствующего критерию «В» и «С», что в свою очередь позволяет прогнозировать появление способности к самостоятельному передвижению больных и самообслуживанию.

Указанные технологии еще далеки от совершенства. Тем не менее, настоящее время стало очевидно, что использование данной технологии в достаточно большом количестве случаев позволяет существенно улучшить реабилитационные возможности спинальных больных, поскольку предлагаемые методы базируются на фундаментальных общебиологических механизмах регенерации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Брюховецкий, Игорь Степанович, Владивосток

1. Апоитоз при травматическом повреждении спинного мозга: перспективы фармакологической коррекции /А.Г. Баснакьян, A.B. Басков, H.H. Соколов, И.А. Борщенко // Вопросы мед. химии 2000. - № 5. - С.431 - 443.

2. Берсенев, A.B. Прогенераторные клетки костного мозга участвуют в метастазировании опухолей /А. В. Берсеньев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006. - №1.- С. 17-18.

3. Берсенев, A.B. Аутотрансплантация обкладочных клеток обонятельного анализатора для лечения травмы спинного мозга — австралийское исследование /A.B. Берсеньев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2005. №1. - С. 13-14.

4. Берсенев, A.B. Выделение и характеристика нейральных стволовых клеток из обонятельной области слизистой оболочки носа млекопитающих /A.B. Берсеньев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2006. №1. - С. 33-34.

5. Берсенев, A.B. Изучение спонтанной онкогенетической трансформации мезенхимальных стволовых клеток человека в культуре // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2005. №1. -С. 14-16.

6. Берсенев, A.B. Клеточная трансплантология история, современное состояние и перспективы/ A.B. Берсеньев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2005. - №1. - С. 49-56.

7. Берсенев, A.B. Трансплантация клеток пуповинной крови в область повреждения спинного мозга анализ первого клинического наблюдения / A.B. Берсеньев //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2006, -№1. - С. 30-31.

8. Брюховецкий, A.C. Трансплантация нервных клеток и тканевая инженерия мозга при нервных болезнях // М.: НейроВита, 2003. 398 с.

9. Викторов, И.В. Стволовые клетки мозга млекопитающих: биология стволовых клеток in vivo и in vitro / И.В. Викторов // Известия АН. Серия Биологическая. -2001. -№ 6. С. 646-655.

10. Возможности трансплантационного лечения спинномозговых травм (описание двух случаев) / С.С. Рабинович, В.Я. Тарабан, О.В. Повещенко и др. // Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии. Сб. ст. — Омск, 2000. С. 142-147.

11. Волков, A.B. \\ Тканевая инженерия: новые перспективы развития медицины \ A.B. Волков \\ Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2005. - №1 . - С. 57-63.

12. Восстановление функции спинного мозга: современные возможности и перспективы исследования/ И.Н. Шевелев, A.B. Басков, Д.Е. Яриков, И.А. Борщенко // Журнал Вопросы нейрохирургии 2000. - №3. - С. 35- 38.

13. Горелова, JI.E. Из истории переливания крови человеку с лечебной целью / JLE. Горелова // Рус. Мед. Журнал:. 2002. - Т. 10, № 25. - С.1163-1165.

14. Григорян, A.C. Трансплантация мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток для лечения реакции «трансплантат против хозяина» /A.C. Григорян // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2006. №3. -С. 31-32.

15. Деев, Р.В. Научное наследие Александра Максимова и современность / Р.В. Деев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2005. -№1. -С. 4-8.

16. Деев, Р.В. Роль стволовых стромальных (мезенхимальных) стволовых клеток в формировании гетеротопических оссификатов / Р.В.Деев, A.B. Берсенев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2005. №1. -С. 46-48.

17. Зяблов, В. И. Проблемные вопросы регенерации нервной системы: Лекции / В.И. Зяблов // Симферополь, 1986. - 156 с.

18. Иммунологические и клинические аспекты применения клеточной терапии в лечении последствий черепно-мозговой травмы / Селедцов В.И., Рабинович С.С, Кащенко Э.А. и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2006.- № 1 . С. 12 - 14.

19. Клеточная терапия в системе реанимации больных с тяжелой черепно-мозговой травмой /С.С. Рабинович, В.И. Селедцов, C.B. Астраков и др. // Вестник интенсивной терапии. -2004. -№ 4. -С. 24-27.

20. Корочкин, Л.И Стволовые клетки как генетическая проблема /Л. И. Корочкин // Вестник ВОГиС. -2004, -Т. 8, № 2. С. 73-80.

21. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановительной терапии поврежденных органов / В.И. Шумаков, H.A. Онищенко, М.Е. Крашенинников и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2002. - №4. - С. 7-11.

22. Леонтьев, М.А. Хирургическая коррекция патологии стопы в комплексе двигательной реабилитации у пациентов с нижней параплегией / М.А. Леонтьев//Медицина в Кузбассе. 2003.- №2. - С. 36-38.

23. Лившиц А. В. Хирургия спинного мозга. / А. В. Лившиц М., 1990. -350 с.

24. Мезенхимальные стволовые клетки и иммунопатологические состояния организма / П.В. Кругляков, Е.А. Лохматова, В.Б. Климович, А.Ю. Зарицкий // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2005. №3. -С. 36-41.

25. Мотавкин, П.А. Гистофизиология кровообращения в спинном мозге / П.А. Мотавкин, Ю.И. Пиголкин, Ю.В. Каминский М.: Наука, 1994 - 233с.

26. Мусина, P.A. Сравнительная характеристика мезенхимальных стволовых клеток, полученных из разных тканей человека / P.A. Мусина, Е.С. Бекчанова, Г.Т. Сухих // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2005.-№2.-С. 89-94.

27. Нейротравматология / А.Н. Коновалов, Л.Б. Лихтерман, A.A. Потапов // М.: Вазар Ферро , 1994. - 576 с.

28. Нейротрансплантация в лечение травмы спинного мозга / Д.С. Станков, П.И. Катунян, М.Е. Крашенинников, H.A. Онищенко // Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2003. №1; -С. 44-52.

29. Некоторые аспекты патофизиологии травматического повреждения и регенерации спинного мозга / И. А. Борщенко, А. В.Басков, А. Г. Коршунов, Ф. С. Сатанова // Журнал Вопросы нейрохирургии им. H.H. Бурденко. 2000.- № 2. С. 28-31.

30. Отеллин, В. А. Морфологическое обоснование применения метода нейротрансплантации в клинике / В.А. Отелин // Журнал Вопросы нейрохирургии им. Бурденко -1999. №4. - С. 37 - 38.

31. Пальцев, М.А. // Введение в молекулярную медицину /М.А. Пальцев- М.: Медицина, 2004. 496 с.

32. Петров, К.Б. Кинезотерапевтическая реабилитация дефектов осанки и фигуры: Учебное пособие для врачей / К.Б. Петров Новокузнецк, 1999. - 38 с.

33. Проблемы организации хирургического лечения больных с цереброваскулярной патологией в Российской Федерации / В. В. Крылов, В. В. Ярцев, Е. Н. Кондаков, Т. Н. Пирская // Журнал «Вопросы нейрохирургии» им. H.H. Бурденко. 2005. - № 2. - С. 38 - 39.

34. Репин, B.C. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина / B.C. Репин, A.A. Ржанинова, Д.А. Шаменков // М.: Реметэкс, 2002. -175 с.

35. Репин, B.C. Эмбриональные и взрослые стволовые клетки: место в современной медицине / B.C. Репин, И.Н. Сабурина // Лабораторная медицина. -2006. №8. -С. 33 - 41.

36. Регенеративная медицина: Направления, достижения, проблемы и перспективы развития. Часть II: Стволовые пространства / А.Л. Кухарчук, В.В. Радченко, В.М. Сирман // Украшский мед. часопис. -2004. №3. - С. 99107.

37. Регенерация спинного мозга крыс после торакальной сегментэктомии: рост и восстановление нервных проводников / Ярыгин В.И., Банин В.В., Ярыгин К.И., Брюховецкий A.C. // Морфология. -2006 . № 1. - С. 30-38.

38. Румянцев, А.Г. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей /А.Г. Румянцев, A.A. Масчан // Москва: МИА, 2003. 910 с.

39. Соколов, В.A. «Damage control»—современная концепция лечения пострадавших с критической политравмой /В.А. Соколов // Вестник травматологии и ортопедии им. H.H. Приорова. 2005. - № 1. - С. 81 - 84.

40. Сравнительный анализ дифференцировки и поведения нейральных и мезенхимальных стволовых клеток человека in vitro и in vivo/ М.А.Александрова, Г.Т. Сухих, Р.К. Чайлахян и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. - № 1. - С. 44-52.

41. Тактика лечения тяжелых повреждений позвоночника с использованием современных технологий / С.Т. Ветрилэ, C.B. Колесов, А.К. Борисов, A.A. Кулешов, В.В. Швец // Вестник травматологии и ортопедии им. H.H. Приорова. 2001. - №2. - С. 45 - 50

42. Трансплантация костного мозга, подобранного по HLA и MLC-антигенам, больной с пластической анемией /А.Е. Баранов, А.К. Гуськова, Б.А. Калюта и др. // Пробл. Гематологии. -1975. №12. - С. 28.

43. Триумфов, А.В. Топическая диагностика заболеваний нервной системы /А.В. Триумфов М.: МЕДпресс, 2000. - 304с.

44. Хирургическое лечение осложненной травмы позвоночника в остром периоде /А.Г. Аганесов, К.Т. Месхи, А.П.Николаев, Е.П. Костив // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н.Приорова. 2003. -№3. С — 48-52.

45. Цымбалюк, В.И. Нейрогенные стволовые клетки / В.И. Цымбалюк, В.В. Медведев //Киев: -2005. -596 с.

46. Шлапак, И.П. Спинальная травма: патофизиологические и клинические аспекты. /И.П. Шлапак, Ю.В Баран., М.С Лисянский // УкраУнський мед. часопис 2002. - № 5. - С. 15.

47. A prospective observational study of the yield of olfactory ensheathing cells cultured from biopsies of septal nasal mucosa / D. Choi, D. Li, S. Law at al. // Neurosurgery. 2008. - Vol 62, №5. p. 1140-1144.

48. Adult human olfactory stem cells / F.J. Roisen, K.M. Klueber, C.L. Lu et al. // Brain. Res. -2001. -Vol. 890. -P. 11-22.

49. Adult human hemopoietic stem cells produce neurons efficiently in the regenerating chicken embryo spinal cord / O.E. Sigurjonsson, M.C. Perreault, T. Egeland et al. // PNAS. -2005. -Vol. 5. P. 5227-5232.

50. Adult human olfactory neural progenitors cultured in defined media / X. Zhang, K.M. Klueber, Z. Guo et al. //Exp. Neural. -2004. -Vol. 186. -P. 112-123.

51. Aguayo, A.J. Influences of the glial environment on the elongation of axon after injury: transplantation studies in adult rodents / A.J. Aguayo, S. David, G. Bray // J. Exp. Biol., -1982; -Vol. 3. -P. 215-234.

52. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts and directed differentiation improves outcome / C. Hofstetter, N. Holmstrom, J. Lilja et al. // Nat.Neurosci. -2005. -Vol.8, № 3. P. 259-260.

53. Apoptotic cells associated with Wallerian degeneration after experimental spinal cord injury: a possible mechanism of oligodendroglial death. / Y. Abe, T.Yamamoto, Y.Sugiyama, T. Watanabe et al. // J. Neurotrauma. -1999 -Vol.16, № 10.- P. 945-952

54. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human spinal cord injury / F. Feron, C. Perry, J. Cochrane et al. // Brain. -2005. -Vol. 128. -P. 29512960.

55. Axons from CNS neurons regenerate into PNS grafts / P.M. Richardson, U.M. McGuinness, A.J. Aguayo // Nature. -1980. -Vol. 284. -P. 264 265.

56. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord / X.M. Xu, V. Guenard, N. Kleitman, M.B. Bunge // J. Comp. Neurol. -1995. -Vol. 351. P. 145-160.

57. Basso, D.M. Graded histo-logical and locomotor outcomes after spinal cord contusionusing the NYU weight-drop device versus transaction / D.M. Basso, M.S. Beattie, J.C. Bresnahan // ExpNeurol -1996. Vol. 139. P. 244-256.

58. Bakken, A.M. No differences in colony formation of peripheral blood stem cells frozen with 5- or 10% dimethyl sulfoxide/ A.M. Bakken, O. Bruserud, J.F. Abrahamsen // J. Hematother. Stem. Cell Res. -2003; -Vol. 12. - P. 351-358.

59. Barrett, G.L. The p75 neurotrophin receptor and neuronal apoptosis / G.L Barrett. // Prog. Neurobiol. 2000. - Vol. 61, № 2. - P. 205- 229.

60. Bernstein-Goral H. Spinal cord transplants support the regeneration of axotomized neurons after spinal cord lesions et birth: a quantitative double labeling study / H. Bernstein-Goral, B.S. Bregman // Exp. Neurol. -1993. -V. 123. -P. 118132.

61. Bjorklund A. Intracerebral neural transplants neuronal replacement and reconstruction of damages circuitries / A. Bjorklund, U. Stenevi // Ann. Rev. Neurosci. -1984. Vol. 7. - P. 279-308.

62. Bone Marrow Stem Cells and Polymer Hydrogels—Two Strategies for Spinal Cord Injury Repair. / E. Sykova, P. Jendelova, L. Urdzykova et al. //Cell. Mol. Neurobiology. 2006. -Vol. 26, № 7. - P. 1113 -1129.

63. Bone marrow transplantation / E.D. Thomas, R. Storb, R.A. Clift et al. // N. Engl. J. Med. -1975. -Vol. 292. -P. 832-843.

64. Boyd, J.G. Defining the role of olfactory ensheathing cells in facilitating axon remyelination following damage to the spinal cord / J.G. Boyd, R. Doucette, M.D. Kawaja // FASEB J. 2005. - Vol.19, №7. - P.694-703.

65. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord / X.M. Xu, A. Chen, V. Guenard et al. // J. Neurocytol. -1997. Vol. 26. -P. 1-16.

66. Brook, G.A. Columns of Schwann cells extruded into the CNS induces ingrowth of astrocytes to form organized new glial pathways / G.A. Brook, J.M. Lawrence, G. Raisman // Glia. 2001 .-Vol. 33, №2. - P.l 18 -30.

67. Brustle O. Building brain: neuronal chimeras in the study of nervous system development and repair/ O. Brustle // Brain Pathol. -1999. -Vol. 9. P.527-545.

68. Calponin is expressed by fibroblasts and meningeal cells but not olfactory ensheathing cells in the adult peripheral olfactory system / C. Ibanez, D. Ito, M. Zawadzka et al. // Glia. Vol. 55, № 2. - P. 144 -151.

69. Calponin is expressed by subpopulations of connective tissue cells but not olfactory ensheathing cells in the neonatal olfactory mucosa / M. Tome E. Siladzic, A. Santos-Silva, S.C. Barnett. // J. Neurosci. 2007. - Vol. 18, №8. - P. 74

70. Central neurvous system entry peripherally injected umbilical cord blood cells is not required for neuroprotection cin stroke / C.V. Borlongan, M. Hadman, C.D. Sanberg, P.R. Sanberg // Stroke. -2004. -Vol.35. -P. 2385.

71. Cell therapy using bone marrow stromal cells in chronic paraplegic rats: Systemic or local administration? / J. Vanquero, M. Zurita, S. Oya, M. Santos // Neurosci. Lett. 2006. -Vol. 394, №1. - P. 1-6.

72. Cellular localization of nerve growth factor synthesis by in situ hybridization / C.E. Bandtlow, R. Heumann, M.E. Schwab, H. Thoenen // EMBO J.-1987.-№6. -P. 891-899

73. Characterization of a pluripotent stem cell line derived from mouse embryo / A.M. Wobus, H. Holzhausen, P. Jakel, J. Schoneich // Exp. Cell Res., -1984. -Vol. 152. -P. 212-219.

74. Chen X. Multipotency of purified, transplanted globose basal cells in olfactory epithelium / X. Chen, H. Fang, J. Schwob // J.Comp.Neural.-2004. -Vol.469. -P. 457-474.

75. Chopp M. Spinal cord injury in human: treatment with bone marrow stromal cell transplantation / M. Chopp // Nature Med. -2005. -Vol. 10. -P. 785792.

76. Comparison of neuregulin-1 expression in olfactory ensheathing cells, Schwann cells and astrocytes / R.J. Thompson, B. Roberts, C.L. Alexander et al. // J. Neurosci Res. -2000. Vol. 61, №2. - P. 172- 185.

77. Cryopreservation of HPCs with higt cell concentration in 5-percent DMSO for transplantation to children. / A.I. Curcoy, I. Alcorta, J. Estella et al. //Transfusion. -2002. Vol. 42, № 7. -P. 962.

78. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF /A. Acheson, P. Barker, R. Alderson et al. //Neuron -1991. -№ 7. -P. 265-275.

79. Development of Ewing's sarcoma from primary bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells / N. Riggi , L. Cironi , P. Provero et al. // Cancer Res. -2005. Vol. 65, № 24. P. 11459-11468.

80. Diener, P.S. Fetal spinal cord transplants support the development of target reaching and coordinated postural adjustments after neonatal cervical spinal cord injury/ P.S. Diener, B.S. Bregman // J. Neurosci. -1998. -Vol. 18. P. 763-776.

81. Differentiation and maturation of embryonal carcinoma-derived neurons in cell culture / M.W. McBurney, K.R. Reuhl, A.I. Ally // J. Neurosci. -1988. -Vol. 8. -P. 1063-1073.

82. Dobrowsky, R.T. P75 neurotrophin receptor signaling: mechanisms for neurotrophic modulation of cell stress? / R.T. Dobrowsky, B.D. Carter //J. Neurosci Res. 2000. - Vol.61, № 3. - P. 237- 243.

83. Embrionic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation / S. Liu, Y. Qu T.J. Stewart et al. // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. -2000. -Vol. 97. P. 6126-6131.

84. Evans, M.J. Establishment in culture of pluri-potential cells from mouse embryos / M.J. Evans, M.H. Kaufman //Nature. -1981. -Vol. 292. -P. 154-156.

85. Expression of neural markers in human umbilical cord blood / J.R. Shanchez-Ramos, S. Song, S.G. Kamath et al. // Exp. Neurol. -2001. -Vol 171. P. 109-115.

86. Expression of neural markers in human umbilical cord blood / J.R. Shanchez-Ramos, S. Song, S.G. Kamath et al. // Exp. Neurol. -2001. -Vol. 171. -P.109-115.

87. Extension of the critical period for developmental plasticity of the corticospinal pathway / B.S. Bregman, E. Kunkel-Bagden, P.J. Reier, et al. // J. Comp. Neurol. -1989. -Vol. 282. -P. 355-370.

88. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords / N.I. Bamber, H. Li, P. Aebischer, X.M. Xu //Neural. Plas. -1999. -Vol. 6. P. 103-121.

89. Fetal transplants alter the development of function after spinal cord transection in newborn rats / D. Miya, S. Giszter, F. Mori et al. // J. Neurosci. -1997. -Vol. 17. P. 4856-4872

90. Fetal spinal cord transplants rescue some axotomized rubrospinal neurons from retrograde cell death in adult rats / F. Mori, B.T. Himes, M. Kowada, M. Murray, A. Tessler // Exp. Neurol. 1997. - Vol. 143. - P. 45 -60.

91. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice / T.R. Brazelton, F.M. Rossi, G.I. Keshet, H.M. Blau // Science. -2000. -Vol. 290. -P. 1775-1779.

92. Gastric cancer originating from bone marrow-derived cells /J. Houghton, C. Stoicov, S. Nomura et al. // Science. -2004. -Vol. 306. -P. 1568-1571.

93. Generation of histocompatible tissues using nuclear transplantation / R.P. Lanza, H.Y. Chung, J J. Yoo et al. // Nat. Biotechnol. 2002. Vol. 20, № 7. - P. 689-696

94. Genetic expression profile of olfactory ensheathing cells is distinct from that of Schwann cells and astrocytes / A.J.Vincent, J.M. Taylor, D.L. Choi-Lundberg et al. // Glia. 2005. - Vol.51, № 2. - P. 132- 147.

95. Geranylgeranylacetone limits secondary injury, neuronal death, and progressive necrosis and cavitation after spinal cord injury / M. Fujiki, Y. Furukawa, H. Kobayashi et al.// Brain Res. -2005. -Vol. 1053, №16. -P. 175 -184.

96. Grafts of genetically modified Schwann cells to the spinal cord: survival, axon growth and myelination. / M.H. Tuszynski, N. Weidner, M. McCormack et al. //Cell. Transplant. -1998. -Vol. 7. P. 187-196.

97. Hematopoietic stem cell and marrow stromal cell for spinal cord injury in mice / M. Koda, S. Okada, T. Nakayama et al. // Neuroreport. -2005. -Vol. 16, №16. -P. 1763 -1767.

98. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for octeogenic and hematopoeietic tissue / A J. Friedenstein, K.V. Petrakova, A.I. Kurolesova, G.P. Frolova // Transpl. -1968. -Vol.6. P. 230-247.

99. Human cord blood derived neurons, astrocytes and olygodendrocytes / L. Buzanska, E.K. Machaj, B. Zablocka et al. // J. Neurochem. -2001. -Vol. 171. P. 109-115.

100. Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi's sarcoma. / A.Y. Khakoo, S. Pati, S.A. Anderson et al. // J. Exp. Med. -2006. Vol. 203, №5. -P. 1235-1247.

101. Identification of a human olfactory ensheathing cell that can effect transplant-mediated remyelination of demyelinated CNS axons / S.C. Barnett, C.L. Alexander, Ylwashita et al//Brain.-2000. -Vol. 123.-P. 1581-1588.

102. Impaired recruitment of bone-marrow- derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumour angiogenesis and growth / D. Lyden, K. Hattori, S. Dias et al. //Nature Med. -2001. -Vol. 7. P. 1194-1201.

103. Intrastriatal and intranigral grafting of hNT neurons in the 6-OHDA model of Parkinson's disease / K.A. Baker, M. Hong, D. Sadi, I. Mendez // Exp. Neurol. -2000; -V. 162. -P. 350-360.

104. Intraspinal transplantation of CD34+ human umbilical cord blood cells after spinal cord hemisection injury improves functional recovery in adult rats / Z.M.Shao, H.J.Li, H.Y. Liu et al. // Cell Transplant. -2004. -Vol.13, № 2. P. 113-122.

105. Intraspinal transplantation of CD34+ human umbilical cord blood cells after spinal cord hemisection injury improves functional recovery in adult rats / Z.M. Zhao, H.J. Li, H.Y.Liu et al. // Cell Transplant. -2004. -Vol.13, №2. -P. 113-122.

106. International spinal research trust research strategy. Ill: A discussion document / M. Adams, T. Carlstedt, J. Cavanagh et al. // Spinal Cord. -2007. Vol.45, №1.-P. 2-14.

107. Jakeman, L.B. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions / L.B. Jakeman, PJ. //J. Comp. Neurol. -1991. -Vol. 307. -P. 311-334.

108. Kakulas, B.A. Neuropathology: the foundation for new treatments in spinal cord injury/B.A. Kakulas // Spinal Cord. -2004. Vol.42, №10. -P. 549-563.

109. Kohyama, J. Brain from bone: Efficient "meta-differentiation" of marrow stromaderived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent /J.Kohyama, H. Abe, T.Shimazaki // Differentiation. 2001. -Vol. 68. -P. 235-244.

110. Kuehnle, I. The therapeutic potential of stem cells from adults / I. Kuehnle, M.A. Goodell // BMJ. 2002. -Vol. 325. - P. 372-376.

111. Lakatos, A. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes / A. Lakatos , R.J. Franklin , S.C. Barnett // Glia. -2000.-Vol. 32, №3.-P. 214-225

112. Li, Y. Regeneration of adult rat corti-cospinal axons induced by transplanted olfactory ensheathing cells/ Y. Li, P.M. Field, G. Raisman // J. Neurosci. -1998. -Vol. 18. P. 10514-10524.

113. Li, Y. Interaction of olfactory ensheathing cells with astrocytes may be the key to repair of tract injuries in the spinal cord: the «pathway hypothesis» / Li, D. Li. G. Raisman // J .Neurocytol. 2005. - Vol.34, № 9. - P. 343-51.

114. Li, Y. Transplanted Schwann cells, not olfactory ensheathing cells, myelinate optic nerve fibres / Y. Li, D. Li. G. Raisman // Glia. -2007. Vol. 55, №3. -P. 312-316.

115. Long-distance axonal regeneration in the transected adult rat spinal cord is promoted by olfactory ensheathing glia transplants / C.A. Ramon, G.W. Plant, J. Avila, M.B. Bunge// J. Neurosci. -1998. -Vol. 18. P. 3803-3815.

116. Lu, C.Z. G-CSF and neuroprotection: a therapeutic perspective in cerebral ischaemia / C.Z. Lu, B.G. Xiao // Biochem. Soc. Trans. -2006. Vol. 34, № 6. -P. 1327-1333.

117. Mahmood, A. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury / A. Mahmood, D. Lu, M. Chopp // J. Neutrauma. -2004. -Vol. 21, №1. -P. 33-39.

118. Martin, G.R. Isolation of pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned to tera-tocarcinoma stem sells / G.R. Martin // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1981. -Vol. 78. -P.7634-7638.

119. Mathe, G. Treatment of non-leukemic hematosarcomas / G. Mathe, J.L. Amiel, G. Schwarzenberg // Vie Med. 1962. Vol.43, № 11. - P. 1573-88.

120. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates / S.M. Devine, C. Cobbs, M. Jennings et al. //Blood.-2003. -Vol. 101, № 8. -P. 2999-3001.

121. Mesenchymal stem cells that produce neurotrophic factors reduce ischemic damage in the rat middle cerebral artery occlusion model / K. Kurozumi, K. Nakamura, T. Tamiya et al. // Mol. Ther. -2005. -Vol. 11, №1. -P. 96-104.

122. Merkle, F.T. Mosaic oorganization of neural stem cells in the adult brain. / F.T. Merkle, Z. Mirzadeh, A. Alvarez-Buylla // Science. 2007; - -Vol. 317, № 6. -P. 381-384.

123. MMP-9 supplied by bone marrow-derived cells contributes to skin carcinogenesis / L. Coussens, C. Tinkle, D. Hanahan, Z. Werb // Cell. -2000. -Vol.103. -P. 481-490.

124. Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa /W. Murrell, F. Feron, A. Wetzig et al. //Dev. Dyn. -2005. -Vol. 233, № 2. P. 496-515.

125. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines / J.S. Odorico, D.S. Kaufinan, J.A. Thomson // Stem Cells. -2001. -Vol. 19. P. 193-204.

126. NG2 is a major chondroitin sulfate proteoglycan produced after spinal cord injury and is expressed by macrophages and oligodendrocyte progenitors / L.L. Jones, Y. Yamaguchi, W.B. Stallcup et al. // J. Neurosci.- 2002. Vol. 22, №7. -P. 2792-2803.

127. Nestin-positive mesenchymal stem cells favour the astroglial lineage in neural progenitors and stem cells by releasing active BMP4 / S. Wislet-Gendebien, F. Bruyere, G. Hans et al. // BMC Neurusci. -2004. -Vol. 5, №1. -P. 1-33.

128. Neurotrophin 3 Promotes Purification and Proliferation of Olfactory Ensheathing Cells From Human Nose / J. I. Bianco, C. Perry, D.G. Harkin et al. // GLIA. -2004. -Vol. 45. -P. 111-123.

129. Neural transplantation of hNT neurons for Huntington's disease / M.S. Hurlbert, R.I. Gianani, C. Hutt et al. // Cell Transplant. -1999. -Vol. 8. -P. 143-151.

130. Neural stem cells; a versatile tool for cell replacement and gene therapy in the central nervous system / V. Ourednik, J. Ourednik, K.I. Park, E.Y. Snyder // Clin. Genet. -1999. -Vol. 56. P. 267-278.

131. Neural tissue formation within porous hidrogels implanted in brain and spinal cord lesion: ultrastructural, immunocitochemical, and diffusion studies /S.Woerli, P.Petrov, E.Sykova, et al. // Tissue engenering. 1999. — Vol.5, №12. -P. 467-488.

132. No-go enhances the adhesion of olfactory ensheathingcells and inhibits their migration / Zhida Su, Cao Li, Zhu Yanling, et al. // J. Cell Science 2007. -Vol. 120.-P. 1877-1887.

133. Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype / L.A. Carter, J.L. MacDonald, A. J. Roskams et al. // J. Neurosci. -2004. -Vol. 24. P. 5670-5683.

134. Olfactory ensheathing cells in the nasal mucosa of the rat and human / Choi D., Law S. Raisman G., Li D. // Br. J. Neurosurg. 2008. -Vol. 22, № 2. - P. 301302

135. Onifer, S.M. Altered differentiation of CNS neural progenitor cells after transplantation into the injured adult rat spinal cord / S.M. Onifer, A.B. Cannon, S.R. Whittemore // Cell Transplant. -1997. -Vol. 6. P. 327-338.

136. P75 neurotrophin receptor regulates tissue fibrosis through inhibition of plasminogen activation via a PDE4/cAMP/PKA pathway / B.D. Sachs, S.B. George, R. M. Julianne et al.// The J. of Cell Biology.- 2007. Vol.177, № 6. P. 1119-1132.

137. Preparation of brain-derived neurotrophic factor- and neurotrophin-3-secreting Schwann cells by infection with a retroviral vector / S.T. Sayers, N. Khan, Y. Ahmed et al. // J. Mol. Neurosci. -1998. -Vol.10. -P. 143-160.

138. Raisman, G. A promising therapeutic approach to spinal cord repair (editorial) / G. A. Raisman // J. R. Soc. Med. -2003. -Vol. 96. P. 259-261.

139. Raisman, G.A. Repair of spinal cord injury: ripples of an incoming tide, or how I spent my first 40 years in research / G. A. Raisman // Spinal Cord. — 2006. -Vol.44, №7. P. 406-413.

140. Raisman, G.A. Myelin inhibitors: does NO mean GO? / G. A. Raisman // Nat Rev. Neurosci. 2004. - Vol. 5, №2. - P. 157- 161.

141. Ramer, L.M. Peripheral olfactory ensheathing cells reduce scar and cavity formation and promote regeneration after spinal cord injury / L.M. Ramer, E. Au, M.W. Richter//J. Comp. Neurol. -2004. -Vol. 473, №1. -P. 1-15.

142. Ramon, y Cajal S. Degeneration and regeneration of the nervous system. -London. Oxford Univ. press, 1928. Vol. Vi. - 386 p.

143. Regulation of ciliary neurotrophic factor expression in myelin-related Schwann cells in vivo / B. Friedman, S.S. Scherer, J.S. Rudge, et al. // Neuron. -1992.-№9. -P. 295-305.

144. Reie, P.J. Cellular transplantation strategies for spinal cord injury and translational neurobiology /P.J. Reie //NeuroRx. -2004. №1. -P. 424-451.

145. Reversible encephalopathy after cryopreserved peripheral stem cell infusion / M. Dhodapkar, S.L. Goldberg, A. Tefferi, M.A. Gertz // Am. J. Hematol. -1994. -Vol. 45. P.187-188.

146. Reversible leukoencephalopathy associated with re-infusion of DMSO preserved stem cells / M.A. Higman, J.D. Port, NJ. Beauchamp, A.R. Chen // Bone Marrow Transplant. -2000. -Vol. 26. P. 797-800.

147. Rubio, D. Spontaneous human adult stem cells transformation / D. Rubio, J. Garcia-Castro, M.C. Martin // Cancer Res. -2005. -Vol. 65. -P. 3035.

148. Severe respiratory depression after dimethylsulphoxide-containing autologous stern cell infusion in a patient with AL amyloidosis / M. Benekli, B. Anderson, D. Wentling et al. // Bone Marrow Transplant. -2000/ -Vol. 25, № 12. -P.1299-1301.

149. Schwann cells genetically modified to secrete human BDNF promote enhanced axonal regrowth across transected adult rat spinal cord / P. Menei, C. Montero-Menei, S.R. Whittemore et al. // Eur. J. Neurosci. -1998. Vol.10. -P. 607-621.

150. Saporta, S. Neural transplantation of human neuroteratocarcinoma (hNT) neurons into ischemic rats. A quantitative dose-response analysis of cell survival and behavioral recovery / S. Saporta, P.R. Sanberg // J. Neurosci. -1999. -Vol. 91. -P. 519-525.

151. Some issues in facial transplantation / Y. Chenggang, H. Yan, Z. Xudong, L. Binglun et al. //Am. J. Transplant. 2008 - Vol.8, №10. - P. 2169-2172.

152. Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantation / M. Chopp, X.H. Zhang, Y. Li et al. // Neuroreport. -2000. -Vol. 11. P. 3001-3005.

153. Sykova, E. Migration, fate and in vivo imaging of adult stem cells in the CNS / E. Sykova, P. Jendelova // Cell Death Differ. 2007. -Vol.14, 7. - P.1336-1342.

154. Targeting exogenous genes to tumour angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic cells / M. De Palma, M.A. Vinneri, C. Roca, L. Fvalzini //Nature Med. -2003. Vol. 9. -P. 789-795.

155. Tator, C. H. Strategies for recovery and regeneration after brain and spinal cord injury/ C. H. Tator // Inj. Prev. -2002. -Vol. 8. P. 33-36.

156. The role of depletion of dimethyl sulfoxide before autografting: on hematologic recovery, side effects, and toxicity / R. Syme, M. Bewick, D. Stewart et al. // Biol. Blood Marrow Transplant. -2004. -Vol.10. -P. 135-141.

157. Teratoma formation leads to failure of treatment for type I diabetes using embryonic stem cells-derived insulin-producing cells / T. Fujikawa, S.H. Oh, L. Pi et al. // Am. J. Pathol. -2005. -Vol. 166. P. 1781.

158. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion / J. Gao, J.E. Dennis, R.F. Muzic et al. // Cells Tissues Organs. -2001. -Vol. 169, №1. P. 12-20.

159. Tondreu, T. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation / T. Tondreu, L. Lagneaux, M. Dejeneffe//Differentiation. -2004. -Vol.72 , №7. -P. 319-326.

160. Transplantation of motoneuron-enriched neural cells derived from mouse embryonic stem cells improves motor function of hemiplegic mice /S. Chiba, Y. Iwasaki, H. Sekino, N. Suzuki // Cell. Transplant. -2003.-Vol. 12, № 5. -P. 457468.

161. Transplanted olfactory ensheathing cells incorporated into the optic nerve head ensheathe retinal ganglion cell axons: possible relevance to glaucoma / Li Y, Li D, Khaw PT et al. // J.Neurosci Lett. 2008. - Vol. 440, № 3. - P. 251-254.

162. Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains / E. Mezey, S. Key, G.Vogelsang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -2003. -Vol.100.-P. 1364-1369.

163. Transplanted embryonic stem cells survive, differentiate, and promote recovery in injured rat spinal cord / J.W. McDonald, X.Z. Liu, Y. Qu et al. // Nat. Med. -2000. -Vol. 5. P.1410-1412.

164. Transplants of human mesenchymal stem cells improve functional recovery after spinal cord injury in the rat / D. Cizkova, J. Rosocha , I. Vanicky et al. // Cell. Mol. Neurobiol. -2006. -Vol. 26, № 7. P. 1167 - 1180.

165. Transplantation of human neural stem cells for spinal cord injury in primates /A. Iwanami, S. Kaneko, M. Nakamura et al. // J.Neurosci. Res. -2005. Vol. 80, №2.-P. 182-190.

166. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with ontogenesis imperfeeta / E.M. Horwitz, D.J. Prockop, L.A. Fitzpatrick et al. //Nat. Med. -1999. -Vol. 5, №3. -P. 309-313.

167. Treatment of spinal cord injury by transplantation of fetal neural precursor cells engineered to express BMP inhibitor / T. Setoguchi, K. Nakashima, T. Takizawa et al. // Exp. Neurol. -2004. Vol.189, № 1. -P. 33-44.

168. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow / E. Mezey, K.J. Chandross, G. Harta et al.// Science. -2000; -Vol. 290. -P. 1779-1782.

169. Vacanti, C.A. Tissue-engineered spinal cord /C.A. Vacanti // Transplant. Proc. -2001. -Vol. 33, № 2. P. 592-598.

170. Viability and survival of hNT neurons determine degree of functional recovery in grafted ischemic rats / C.V. Borlongan, S. Saporta, S.G. Poulos et al. // Neuro. Rep. -1998. -Vol. 9. P. 2837-2842.

171. Whittemore, S.R. Neuronal replacement strategies for spinal cord injury / S.R. Whittemore // J. Neurotrauma. -1999. -Vol. 16. P. 667-673.

172. Windle, W. Regeneration in the central nervous system / W. Windle // Springfild, Illinois (U.S.A), 1955. 256 p.

173. Young, W. Spinal cord contusion models / W. Young // Prog. Brain Res. -2002.-Vol. 137.-P. 231-255.

Информация о работе

Брюховецкий, Игорь Степанович
кандидата медицинских наук
Владивосток, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Механизмы регенерации спинного мозга крыс при трансплантации обкладочных нейроэпителиальных клеток в биополимерном коллагеновом матриксе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы