Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Построение геометрического профиля эритроцитов по данным растровой электронной микроскопии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Построение геометрического профиля эритроцитов по данным растровой электронной микроскопии"

МИНИСТЕРСТВ» ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИПСКОЧ ФЕДЕРАЦИИ РОССИИСКИЯ ГОСУДАРСТВЕНШИ МЕДИЦИНСКИИ УЛКВ1Л'СЭТЕТ

На враалх рукописи

УДК. 611-ОЮ. 5; ¡616-073.4- Э

ЦОКОНА Татьяна Николаевна

"ПОСТРОЕНИЕ ГЕОМЕТРИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ ЭРИТРОЦИТОВ ПО ДАН'.ШМ РАС1РОИ0Л ЭЛЕКТРОННОЙ :<ИКЯОСКОШ!И"

Сгтецис льность 03.00.02. Биоериэггса .

АВТОРЕФЕРАТ длссертлцлп нд сс/исхание ученой степени кандидата Йиологичосккх паук

Москва 199.3

Работ л выполнена на кафедре биофизики государственного медицинского университета.

Российского

Научные руководители:

профессор, доктор биологических наук Рошупккн Д.И. доцент, кандидат биологических наук Петренко Ю.М.

Официальные опэнеиты:

профессор, доктор «риэико-м»тематических наук Акимов В.Н. ведущий тучный сотрудник Институте Океанологии РАН, \

кандидат медицинских наук Вандышев Д.Б.

I

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт

"риэико -химической медицины МЗ Российской Федерации.

"■' ' ' •

/ г &£>

Зашита состоится "" _1997г.в/У часов да

заседании специализированного совета при Российском государственном медицинском университете по адрессу :

117437 г.Москва ,ул.Островитянова ,д,1.,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского унивсрситетл.

ис 1993г .

Автореферат разослан Учении секретарь специализироьанного совета К-0в4-14-04 доцент, кандидат медицинских наук Буромский И.В.

ОЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАБОТЫ

В литературе «ре.чоиену дискодитоэл эритроцитов кок и вопросу, под действием неких факторов и причин эти клетки меняют -твою чюрку, удаляется большое мотание (Маркин B.C.19S0. Fun? Y.C.,Tsong K.C.O .WM). Примечательно, что яискоциткая форма эритроцитов при теоретических построениях получаете»! даже тогда, когда о их оснооу положены отличные друг от друга исуод-гы0 посылки (Bull В.3. , 1972, Canhara P.B. .1970).

По-еидиноиу, понятно дискоцптоз, которым интегрально определяют наблюдаемую форму нативных эритооцитов, не является достаточно конкретный и точный, чтобы быть критерием при изучении д>аптороъ и причин, пиегаких значение о формообразовании этих клеток. В связи с этик, пол» ¡теп актуальным выяснение структуры геометрического профиля эритроци-.ог, 4ля указанных целей.

Это актуально и для формирования параметров, полученных из данных геометрического профиля эритроцитов, по которым мо.-шо 6.мо бы объективно оценивать и аналигкровать состояние эритроцитов в клинических целях.

Целью данной работы является построэкие геометрического профиля эритроцитов на основе разро5отанно»: теории и метода се реализации, использующих данные по интенсивности вторичных элоктроиоа, эмиттмруегоых с ' поворяности клэтки, прь сканировании по но А электронного зонда в растровом глектронаом микроскопе, ünv. достлуенил поставленной цели необходимо решить следующие задачи.

1 .Разработать теорию построения геометрического профиля для осесиммчтричных клеток по данным зкисгсии яторичнмх электронов, возбугмоемой электронным зондом, при чго сканировании по поверхности клетки, обладателей свойством эмитировать вторичны? электроны. Это

соотстстпует условиям, имеющим место при исследовании обьактое ь роя<№л. У-модулниии в растровой алчктроннои микроскопе (РЗК) .

2.Продемонстрировать рлйотосиосоЗлость теории на примерах по _1?рхио;тей, имеющих п.чалитичесхое вигаженче их геометрического профиля. Грооости "мисленюй гжеперимент" по формированию электронного сигнал». э.свиаалентьнй случаи сканирования электронного зонда по пааорхности клеток в Г-ЭМ с последующим использованием этого сигнала ллн реконструкции геометрического профиля и сравнения его с исходным.

3.Определить и минимизировать ьлиявив факторов, искажающих форму ■ клеток » процессе их педг'/юьки к исследованию с помощью РЭМ и спетопиго микросхопирования.

•1 .Кс- следовать вопрос о том гак ионяьтся Форма эритроцитов в :»аииспмости от услоьий зкружакией ср^ды при отсутствии влияния побочна* модифицирующих форму ч>актс ров.

3. Пялучанио элактро^огралм (электрического сигаалл) при эт-зиттиро»аиии поверхностью' ьторичных алектронов и их регистрацию с помоцьи серийного РЭК г. юежиг'е У-лодуляции (применительно к условиям минимизации побочных транерормирукщих форму эритроиитои Факторов, в процесса подготовки эрг.троцктов к дакким исследованиям) .

6. Построение геометрического профиля эритроцитов по экспаримен гально полученным плектюдограпмаи при исследовании эритроцитов с погтощьи РЭМ.

7. Сравнение результатов по геометрическому профилю эритроцитов, полученных на основе разработанных подходов, и рлечитонгшх иа него мор?'Оматрических иараматрос» характеризующих чю^му эритроцитов, как теоретических, " ок и а-леперипвятальчьк. с двннгькда литературы.

Нл 1ыиаа_1шви.-аа8_*.

Разработана теория построения геометрического профиля '' ососиэтмэтричних клеток по про<?ишо интенсивности вторичных электронов.

полученного при электронном микроокопнровапии -и дока.ч.чнд по пригодность длп реконструкции.геометрического пробили таких клечок.

Установлены побочные модирииирумдие форму факторы. яскл.кашиио результаты о общепринятых методиках приготовлении эритроцитов для мнкроскоаирования (как оптического,.так и электронного).

Определен геометрический профиль эритропитое . име.ащих иид дискоцита и проЕеден сравнительный анализ полученных результатов с данными литературы.

1Ьхышг=ЛЕйвхиа;££К.'щ_ан анктасгь.-Г.а йй-гии*.

Настоящая работа может бить отнесена к области Фундаментальных исследований. Теория построения геометрического профиля осесикиэтричных клеток, разработанная и обоснованная е ланкой работе, могкет быть применена как в исслс ломаниях. касательно

ОПрОДЧЛ»>ния истинной ФОРМ!! эритроцитов и тех факторов которыми она обусловлена так и ь клинике, для определения физиологически гажных морфомотрич»чжих параметров эритроцитов.

В работе критически проанализированы методы исследования форми эритроцитов оптическими методами, э которых кроме собственных гтогревшостей метода, (дифракция и др.) в определении геометрических параметров, возникают ошибки и ив-за аппроксимации профиля эритроцитов кривой, описываемой некоторой аналитической функцией (эллипсом, овалом Кассини и т.д), на основе которых, некоторые из параметров получают расчетным путем. ' Предложено на основе представленных в работа подходов, использовать метод электродной микроскопии при исследования Формы эригроиита. дл;г получения его истинного профиля, а следовательно, и точных мор<»ометрическпх параметров. Предложена четодика приготовления эритроцитов для оптического и .-члектроьиого текроскопирования. обеспечивающая минимальную трансформацию их (сходной формы.

V А -

Результаты работы выли доложены и обсузадьны на совместно'! конференции клф«ары биофизики медико-биологического факультета РГИУ и отдела биотизлки НЮТХМ 30 сентября 1991г.

Метог расчета геометрического профиля эритроцитов по дашшм рострсеой электронной микроскопии обсуждался на заседании кафедры математики РГМУ 30 сентября 1997.г.

Публчклцци.

Основное содержание диссертации изложено в 3 печатных работах.

Диссертпция состоит из введений.. обзора литературы. описания кптериалов и методов исследования, собственных результатов и обсуждения, вывод оз. слиске цитируемой литературы. и приложения, пакет программ для ПЭВМ на машинном языке 5Г>*ЗА31С.

Обьем работы составляет страниц машинописного текста. Список

цитируемых работ включает 26 отечественных и 94 иностранные авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В разделе "Обзор литературы" приведены сведэния о значимости исследования формы эритроцитов при изучении поверхностных свойств мембран. Анализ литературы показал, что вопрос о факторах, спродолякщих дискоцитную Форму эритроцита и ее модификацию, до • сих пор, остается спорный.

Б данном разделе работы приведет», все ииегациеся на сегодняшний д«нь данные о методах исследования формы эритроцитов. Показано, что имеющиеся в литературе противоречия относительно формы эритроцитов, ь норме и патологии, во многом обусловлониы несовершенством применяемых иетодик. Для преодоления этих противоречий необходима разработка .новых методических подходов, позволявших оценивать форму эритроцитов более точно и в условиях действия минимальных трасфорнируклгих форму

факторов. Основными недостатками световой микроскопии при исследовании ФОРМЫ эритроцитов ■<; целью получения морчюметрическкх параметре.-"! является явление дифракции. Кроме этого, при кикроскопирораиии суспенвим эритроцитов не удается зафиксировать клетки точно на боку, что делает затруднительный определение максимальной толщины клетки. №1нимальнпя толкина клетки свэтопым михроскопировэнием вообще не определяется. Дополнительные >югрепнести в вычисления максимальной и минимальной толщины клетки, методом интерференционной пикроскопи-л (Evans,1971), вносятся за счет аппроксимации профиля эритроцитов кривой, опкеиваемой аналитической «гуккцкэй-овадом Клссини.

Наиболее точный методом изучения незначителышх пзмояпяий геометрии клетки является в настоящее время электронно» микроскопироиание с помощью растрового электродного микроскопа. Большой интерес вызывает способ регистрации вторичных электронов а РЭМ, назваь zuh У-модуляцией (Kel)у,19691. Этот <-пособ был предложен для обнаружения малых уровней контраста, которые не оаздич дак для гллэа на изображении при обычной модуляция интенсивности пркостл (Kimoto, Rubs, 1969) . Ka к было показано. ремим детектирования вторичных электронов обладает высокой разрешанпяей способность» (Murata. 1973) и, кроме этого, коэффициент вторичной эмиссии проявляет сильную угловую эаэисямость от угла падения электронного зонда (Лукьянов, Бернооич, 1937, Muí lan, 1953, Newbury. 1975). что позволяет использовать ©го л.ля топографического исследования образцов. К сожалении, данный метод использовался только для качественного изучения поверхнос-.и. Его возможности, с частности способ детектирования в ре«кие У-модуляции. до конца но реализованы. хотя преимущества его очевидны, В наией работе, по результатам »кспгрипентов, получаемых в таком режиме и таким способом, на основании разработанной а работе теории и о-э реализации рэсчи.тивался гесг.етрический профиль . эритроцитов, по которому опр<?.",'»• лялясь моррто. срччес'лке параметры.

Ь работ« использованы методы:

1.Получение йритроцитов.

2.Парафинировали» посуды для эксперимента.

3.Смтован микроскопия.

4.Растровая электронная микроскопия.

5. Спвктросротомв^рия в ультрафиолетовом и видимом диапазонах (для спектрофотометрии мутных сред использовалась сфера Ульбрихта).

6.Динамическая калориметрия.

Дли достижения поставленной цели, на первом этапе, необходимо было решить задачи по разработке теории построения геометрического профиля по данным растровой ¡электронной микроскопии и проверки ее работоспособности.

Для расчета плотности интенсивности вторичных электронов »ккттировашшх с поверхности объекта при сканировании электронного зонда, рассмотрим процесс формирования электронного сигнала.

Под действием электрического поля. сформированного пушкой, модулятором и анодом в РЭМ, электроны сходятся в точке с диаметром <3, именуемой кроссовером. Окончательное формирование электронного зонда получается за счет создания конденсором и формирующей линзой упеньшекого изображения кроссовера, именуемого э дальнейшем . электронным зондом. Из-за явлении дифракции, сферической и хроматической аберациА. присущих всем электронно-оптическим системам, диаметр ¡электронного зонда имеет конечные размеры, которой пренебрегать нельзя (Егоега А.N..1970. «ЛоЬаг! К.,1972, РгеМег Н.С., 1972). Обычно, диаметр зонда составляет десятью доли "от диаметра микрообъекта (,ЗоНйг1 К,, 1972). Поперечное сечение электронного зонда будет окружность с диаметром равным й*. На Рис.1 она обозначена Ъ(х)..

Расчитаем распределение плотности интенсивности вторичной эмиссии в пределах поверхности "высвеченной" электронным зондом. Тункциональная зависимость эмиссии интенсивности вторичных электронов определялась иэ следутааих соображений.

Коэффициент эмиссии вторичных электронов зависит от атомного номера вещества (Reimer L.,1976), от ускорягацего напряжения между анодом и катодом электронной пушки РЭМ (Cosslett V.E., Thomas R.N.,1965) и от тока накала катода (Hachenberg О.. Brauer W.,1959). Очень сильная зависимость от угла падения зонда (Mullan Е.,19ЬЗ, Newbury D.E..1977. Shataa R.A. . и др..1956).

h < г

-£>лг С V/J л Im с х, 1 5 х \ ----Ш) \

Рис.1 Схема изображения эритроцита, лежащего на подложке. х0 - координата центра зонда. Ь(х)-уравнение проекции электронного зонда на поверхность обьекта, Ьх(х)—уравнение контура эритроцита.

Из литературы известно, что наиболее точно зависимость коэффициента вторичной эмиссии от угла падения, описывается следукюмй Функциональной зависимость» О/Оо-зесгде Оо- коэффициент вторичной эмиссии при нормальном падении электрона, И- угол падения (ЗЪа1аз И. А. и др.,1956). Причем, для лучшего выполнения этой зависимости необходимо устанавливать значения тока накала катода и ускорякндего напряжения в РЭМ, таким образом, чтобы энергия первичных электронов не превышала 5 КэВ. При этом сканирование должно проводиться при нормальном падении зонда относительно подложки.

Выполнении этих условий приводит к лучшему выполнании данной углО^ зависимости. Чтобы увеличить коэффициент вторччной эмиссии, необходимо, также, проводить предварительное напыление золотом исследуемого образца, кроме того, такая процедура позволяет материал поверхности сделать однородный. Следовательно, если выбрать в пределах окружности Мх) Рис.1, точку М, то интенсивность »миссии вторичных электронов в точке падения М, с учетом выи« сказанного, будет олисыаатьсп следующим выражбкиек

Их«,) - к вес «(х.Л) (1)

гдо !■,«>■ (х.М-иитенсмвиость падающего излучения, 11(х,Ъ)-угол . падения, к-коэррицивит вторичной эмиссии электронов. Обычные яначакия составляют 0.6. Общепринято, что плотность распределения интенсивности вторичных электронов в зонде соответствует Гауссову. Поскольку, размеры зонда не значительны. можно предположить, что »то распределение равномерное. Таким образом, в нашей теории ьадаюций зонд можно представить в виде пучка равномерно распределенных параллельных электронных лучей. нормально падающих на поверхность подложки. Обоснованность принятого допущеиич о параллельности электронных лучей и их нормальном падении по отношению к поверхности подложки подтверадас-тся экспериментально. В связи с этим, величина 1 (х, Ь ) •• '«•»а, будет постоянной по' сечению зонда и ее можно перенести о леьую часть выражения (1). и в дальнейших наших рассуждениях говорите об относительной интенсивности вторичных - элетронов. Для нахождения • зависимости угла падении в точке К от координат х и Ь. воспользуемся свойством осевой симметрии эритроцита. Угол пидения в каждой точке равен углу нлклоиа касательной, проведенной к этой точке на повзрхности эритроцита. Форма эритроцита обладает осевой симметрией в плоскости перпендикулярной основанию. Следовательно, изменения углов наклона (углов падения) касательных к кривой на , поверхности

эритроцита, получаемой при сечении его плоскостью перпендикулярно« основанию, будут одинаковыми. На рисунке 1 это линии КС и АВ.

Для нахождения И в точке М. лежащей на КВ, надо найти в точке И' на ЛЭ. Для нахождения координаты т.М' воспользуемся слелугаин-и соотношениями <рис.1).

ОМ1 + М'В - ОВ. откуда следует СИ' - ОБ - Н'В (2)

Поскольку М'В-МВ-Н' (радиус окружности), то можно записать, что ИВ» - КС* +■ РС> или М'Б' - МС* + ВС" (3)

Подставив О) в (2) получим

ОМ' -ОВ -ЧМ'В1 - ОВ - <(МС* +ВС" ) И)

Для нахождения ВС, воспользуемся следующим соотношением ВС V ОС - ОВ или ВС - 00 -ОС (5)

Подставим (5) в (4) и получим

ОМ' •• ОВ - ^(МС' + (ОВ -ОС)' ^ (6)

Для нашего случая ОЕ - 1?+<1/2, КС - Ъ (коордилата. по оси-Ю . ОС->: (координата по оси-х),

Следовательно, координата я'-ОМ' будет определяться по формуле X" - й + А/2 + (й + <1/2 ~ х)') (7)

Для определения плотности относительной интенсивности от всий плоскости эмитирукздей гггоришше роны необходимо проинтегрировать

выражение (1!, получаем следукщае:

зес £1 (х ') Ау. (в)

где а"Хо-с1/2, Ъ-хв+<3/2 - пределы интег рированкя по х. Уравнение Ь(х) ~ -Пй1 /4-(х-х») определяет пределы интегрирования по Ь. Координата х' определяется по уравнении (7).

Это выражение спраье/'.лнво для случая когда зонд находится на поверхности эритроцита. Рассмотрим процесс деиженик электронного зонда более подробно (Рис.2). Этапы движения молно 1 оделить на три случая.

Для случен 1! Рис.2, палекип алоктрокч^го :=.онд:\ будет ;1оркалън;.и относительно подложки, поэтов, относительная интенсивность I/1

будет пропорциональна только площади, "высвечиваемой" зондом, т.о. для случая 1) Ха - 0 имеем:

1/Г„.Л - 3.14159 d'/4 (9)

находится на расстоянии d/2 от граници эритроцита.

2)Зонд частично находите»! на подложке и, частично, на эритроците 0 < х« < d. •

3)Эокд полностью на поверхности эритроцита 2 d.

Для случая 2) Рис.2, О < х0 < d , заштрихованная часть окружности пропорциональна части относительной интенсивности, приходящуюся на подложку. Другая часть это сигнал идущий от поверхности.эритроцита. Следовательно, область интегрировании разделится и будем имоть четыре интеграла:

ГЬ №

1/1^., - г]а-г(д* /л-'.кгх*)') йх- г^и/з^'К'-Сх-р-а/г)") ах + '

|>1) Phl(x) f* rhfx)

+ da/a Jo see fi(x') dx dh +■ Jo вес fi(x') dx dh (10)

гдг o~x0--d/2. b- (d' /24Rd-Xo) /2 (R+d/2-x=). e-x<,+d/2. . ;

' i

Ураг.невив (10) включает в себя и уравнение (9). справедливое при Хо - 0. В этом случае веса 2-го. 3-го. 4-го интегралов равны 0. После вычисления 1-го интеграла получим I/I««« "- 3.1415Э d1 /4.

Лля случая Э) Рис.1, у.«, * й. когда весь зонд находится но контуре эритроцита будем иметь выражение (8).

Таким образом, с помощью полученных выражений (0) и (10), можно теоретически строить профиль интенсивности вторичных электронов при сканировании зондом по поверхности эритроцита, если известно, т.е. явно задана, зависимость угла падения от коордк 1аты х' в этих уравнениях. ,

Решение задачи о нахождении углов падения, значения которых необходимы для построения геометрического профиля исследуемого объекта, при известной электронной плотности, требует решения задачи, которая и разделе математической физики, относится к классу некорректно-поставленных задач. Решение таких задач невозможно в классическом варианте, ко многие задачи удается решить путем сведения их к условно-корректной задаче (Тихонов). Смысл данного метода состоит в следующем. Условно-корректной задаче ставится в соответствие семейство классически "коррекных задач (регуляризирующее семейство), зависящих от параметра. При стремлении этого параметра (параметра регуляризации) к некоторому пределу последовательность приближенных решений классически корректных задач должна стремиться к приближенному решению интересукией нас условно-корректной задаче. Это достигается при соотвотствуквдем выборе параметра регуляризации. Отбор возможных решений, обладающих свойством устойчивости можно осуществить некоторые итерационным методом.

В нашем случае такой метод решения неосуществим из-за неявной зависимости подиктегралькой функции от координат х и Ь. Из физических условий поставленной задачи, можно принять допущение, что углы падения принадлежат множеств* углов от 0' до 90", но это не приведет к

однозначному решению. поскольку одному и тому же аначению. относительной - интенсивности в уравнениях (8J я (10) можег соответствовать разный набор углов падения, что опять приводит к некорректной задаче. *

Существующие методы ассипптотнчвского подбора вида подинтвгральной функции были отвергнуты нами по-ряду причин. При выборе некоторой подинтвгральной »укипи, задакмей изменения угла падения, в качестве приближенного описания геометрического профиля исследуемого объекта, снова получаем неоднозначно» решение, поскольку одному и тому хе значению левой части уравнений (в) и (10) могут соответствовать несколько функций. Кроме этого,: такой ¡способ неосуществим из-за больиих временных затрат.•

• Нами был разработан метод решения задачи • и построения геометрического профиля ооесимметричных клеток . по профилю интонспвнооти "рторнчных электронов, некорректной задачи, аналогов которой'в литературе мы не обнаружили. Смысл его состоит в следующем. Если предположить, что электронный зонд имеет " бесконечно малый диаметр, т.е. сфокусирован ь точку, то при сканироэании таким зондом по поверхности эритроцита между относительной., интенсивностью/и- углом падения сутдвствовало-бы однозначное соответствие. описываемое выражением (1). Построение геометрического профиля клетки.можно было-«ы осуществить вычислением углов падений. используя: слодуящэе соотношение: ti(х) - orcsectI/I„.+) (11)

Эта эадача относится к классически-корректным задачам мгекатической физики. В .результата такого ssra мм получаем 1,чункдию-лоцман", которая будет, регулярно ивменяющимся ориентиром при поиске истинного решения. Если использовать эту зависимость для описания приближенного геометрического профиля в уравнениях (в) и <Ю), то' будем иметь условно-корректную задачу.- в том смысле, что Нв некотором шаге итерационного процесса между значениями углов падения в левой

части уравнений (3) и (10), и относительной интенсивностью, в правой, будет существовать однозначное соответствие. В связи с этим, итерационный процесс нахождения углов падения построим по следуюшвму алгоритму. Пусть профиль интенсивности получен "точечным" зондом. Тогда определяем значения углов падения. Получим приближенный геометрический профиль. Это первый шаг итерационного процесса. На втором шаге, сканируем электронным зондом объект, с полученной геометрией. Будем иметь соответствуккий ему профиль относительной интенсивности. На третьем шаго, сравниваем лолучешшй профиль относительной интенсивности с имеющимся. Если они не совпадают, изменяем геометрический профиль по некоторому правилу и снова сканируем его электронным зондом, т.е. возвращаемся ко второму юагу итерационного процесса. Такой переход необходимо производить до тех пор, пока профйли интенсивности не совпадут. Тогда эа геометрический профиль выбираем тот при котором расчитанная относительная интенсивность (на данном ваге итерационного процесса) и заданная экспериментально не совпали. Последовательность решения этой задачи представлена на Рис.3.

Случай а). Показан ' исходный геометрический профиль. Нииэ, соответствутаций ему профиль относительной интенсивности 1/1л»,.(хо).

Случай б) . Приближенный геометрический профиль, "функция-лоцман" определяемая по ур.(14).

Случай в). Расчет профиля интенсивности по ур.(8) я (10) с "функцией-лоциан" в подинтегральном выражении.

' Случаи г) . Сравнение! профилей интенсивности (построенных на шаго а) и в) ) по формуле | I/In.j. - I / * | i EPS. При их отличии следуе-т изменение геометрического профиля б). Затем снова выполнение пункта в) и т.д.. до тех пор. пока при выполнении в) профили интенсивности не совпадут. За решение выбирается тот геометрический профиль, который предшествовал в). функциональную зависимость угла падения и координат

1

I

I*

Рис.3 Последовательность построения геометрического профиля |

! (Пояснения а тексте). (

геометрического профиля можно задеть формулой Эйлера (12) или Эйлера-

Кошч(13)! у *-./1 4ЧопЦ1,Г(х.»1-Х1), ' Ч (12)

У»*» - У* +^ап(г11тапШ1»».))*(х1»х~х,). (13) Ч

Описанные процедуры представлязот из себя алгоритм действий для

реализации поставленной задачи на ПЭВМ. программная реализация

которого, выполнена в данкрй работе. Программный пакет представлен в

ариложении. ....

Сййиахвиай^ -.''.•/' ' . '• ' .' г. :

1. Построение теоретического профиля интенсивности вторичных -

электронов для поверхности. икекией , аналитическое выражение I

геометрического профиля. . ; .' ' (

Решекие дайной задачи является проверкой работоспособности

математической теории получения профиля интенсивности по. уравнениям |

18) и (10). Б качестве исследуемых объектов выбирались фигуры с |

лэвестныки геометрическими профилями, окружность и кривая, описываемая квадратической пункцией.

Выло показано, что вид кривой относительной интенсивности зависит 9Т нескольких факторов. Как видно из Рис.4. сильная зависим.-ть электрического профиля от вида аналитической функции, огшсиьакией ^рометрический профиль фигуры. У геометрического профиля в крайней Трчке, имекщего угол падания "90* (окружность), соответствующий Профиль интенсивности будет иметь "острый" максимум, и профили интенсивности сильно отличакггся по форме.

Максимальное значение интенсивности зависит от радиуса окружности, диаметра зонда и шага сканирования.

При увеличении радиуса окружности, при неизменных других параметрах. как. видно из Рис.4, максимальное значение относительной интенсивности возрастает до некоторого предельного значения. Координата точки максимума не изменяется. При уменьшении радиуса, ^ответственно уменьшается и максимум интенсивности до значения равного 1 при П-0, что соответствует пустой подложке.

Рис.4(а) Геометрические прсф.ч.ли фигур, описываемых

(1)-уравнениями окружности у (х)—Г»В? — [х—<1/2)* )

(2)-квадратическая ф-ия, у(х) — (х-Г!-г)а /й + И О)-окружность с Ид. >Й

Рис.4(Ь1 Расчитанные профили интенсивности (линии 1, 2, 3 соответствуют геометрическим профилям).

Величина максимума зависит от диаметра зонда. Чем меньше диаметр, тем ыяи') максимум (Рис.5). При "точечном" зонде, которому соответствует значение <1. < . максимальное значение интенсивности устремляется в бесконечность. Поскольку в реальных процессах этого на наблюдается, то можно утверждать, что (1 зонда всегда будет иметь опроделенное значение, которым нельзя пренебрегать в аналитических выражениях. опксывагапих профиль интенсивности. Следует заметить, что величина "точечного" зонда, в данном случае, определяется из математических условий. Из-за особенности в точке Хв-<1/2, в псдинтегральных заражениях (8) и (10), для геометрического профили описываемого уравнением окружности, интегрирование можно осуществить с точностью, определяемой шагом сканирования, который в свою очереди меньше размеров зонда. Для профилей интенсивности не имеквд* особенностей, предельное значение размера зонда равно нулю. Существует гюискмость размера диаметра зонда от координаты точки максимума интенсивности ко оси-х. .75*4,.

диаметра зонда.(Точкой А отмечен край шарового сегмента)

Это справедливо для всех значений Данное соотношение

позволяет по экспериментально полученному профилю интенсивности определять диаметр электронного зонда, тем самым устраняя зависимость прифиля интенсивности от размера зонда.

Было выявлено, что вид кривой интенсивности зависит от шага сканирования. Максимум профиля возрастал при уменьшении шага сканирования до некоторого л предельного значения, зависящего от точности интегрирования. За критерий оптимальности иага было выбрано условие, при котором. с уменьшением шага сканирования профиль интенсивности оставался неизменным, для заданной точности вычисления интегралов. Оказалось, что оптимальный шаг сканирования не должен превышать размеров зонда и составляет величину ВКс2.5%И. при точности интегрирования равной 0.01.

2. Реконструкция геометрического профиля по профилю интенсивности вторичных электронов, полученных теоретически.

Следуя алгоритму, разработанному в предыдущем разделе, были построены геометрические , профили по • профилям интенсивности, построенными при решении задачи в предыдущем разделе.

. Расчет проводился для двух функций: 1)-окружность у(х)—{(Яа-(х-а/г)») и 2)-квадратическая функция у (х) — (х-И-г)* /й + Я. Были использованы значения Я-10, Ь-1, ЗН-0.025*13 для обеих функций. После сравнения построенного профиля интенсивности с заданным профилем, изменение "фуккции-лоцман" осуществлялось вариационным методом минимальных невязок .(Иарчук Г.И.,1980). При использовании данного метода в нашей работе, оказалось, что одним из важных в практическом отношений особенностей этого метода является то, что на первые

итерациях метод сходится значительно быстрее, чем асимптотически, что е

позволяет значительно снизить врокзямые затраты при решении: задачи па ЭВМ. Итерационный процесс методом ¡отнималькых невязок, рееенк.-

операторного уравнения u - A fi строили по следукшим ч-ормулам (Марчук Г.И., 1930) т_

fi'j« - fi'j - tj(Afi-j - u) (14)

(AgJ.g-1)

tj - --(15)

I! *»JBa="

■3s - \ii"j - u , где A - оператор (16)

Б нашей случае, решаемые интегральные уравнения можно представить в операторной ц>орме, где u-I/Io, Afi" ¿-I/I о*. скалярное произведение в ур- (13) равно (AgJ.sJ)~g. а квадрат нормы j| AgJ j|3a - sec(g), где д -jI/Io* - I/Io |, тогда итерационный процесс изменения углов падения осуществляется по формуле: fi"»-»x - fi"i - S*/sec(3)

Итерационный процесс продсляали до тех пор пока норма невязки не оказалась равной априорной погрешности входных данных, в нашем случае, точности вычисления интегралов 0.01 - Если это не выполнялось, продолжали итерационный процесс до тех. пор, пока норма невязки не превышала заданной погроздюсти. Геометрический профиль строили по формуле (13) Эйлера-Коши. Критерием точности построенного геометрического контура с луж ?а минимальная величина суммы квадратов отклонения заданных и расчитанных координат. Для квадратической функции эта величина была практически нулевой при SH-0.1*R. а для окружности, уменьшалась с уменьшением шага. Поскольку, при малом шаге вычисления занимает много машинного времени, то был выбран оптимальный шаг SH-0.025*Р.. При таком шаге ошибка в значении высоты окружности составила 2Sc*R. Для квадратической функции 09s . Соответственно, погрешность при вычислении площади 4^*5?, при вычислении объема 6%*R Бремя всегс- итерационного процесса заняло примерно 46 минут машинного времени (IВК 286).

Таким образом, успешное решение данной и предыдущей задач показали работоспособность математической теории т- ее пригодность для построения геометрического профиля осесимметричных клеток по профилям

интенсивности вторичных электронов, получаемых в РЭМ. Кроме того, определены оптимальные условия процесса расчета.

Следующей важной задачей нашей работы, было определить и ¡минимизировать влияние факторов. искажающих форму эритроците п процессе их подготовки к исследованию с помощью РЭК и световой .(икроскопией.

, При исследовании эритрсцитоз ö световом микроскопе нами Еыло ■фнаружено. что форма эритроцитов сильно зависела от материала чоаек п. ,ч)ТОРИХ они наблюдались. Изучение литературы по данному вопросу ¡(оказало, что давно известно о сильном модифицирующем действии лаувриала поверхности, в том числе стекла, на Форму эритроцитов (Popder,1948). Этот артефакт часто игнорируется экспериментаторами. v.u. модифицированные стеклом клетки трудно отличить от нормальных эритроцитов в оптическом микроскопе. После перебора посуды из разного Лйтвриала. с которым контактировал эритроцит, было обнаружено, что ((¡»«меньшим модифицирующим эффектом на их форму, обладают одноразовые Пластмассовые чашки Петри из материала "полистирол суспензионный, IIS рецептуры" (завод медицинских полимеров, Петербург).

Процедура подготовки образцов для электронного микроскопиро-вания (ЭМ) , включаю отмывание . эритроцитов дистиллированной водой, их "высушивание, напыление золотом'и др. представляет мощное воздействие на структуру эритроцитов и. следовательно, может вызыэоть трансформацию их формы. Это требует, перед этика операциями, осуществления жесткой фиксации эритроцитов. С другой стороны, сом процесс жесткого фиксирования эритроцитов может быть модифицирующим по отношению к их структуре и Форме. Другими с.ЮЕами, должны быть поручены доказательства, »»то наблюдаемые при ЭМ эритроциты тождественны по форме исходным, т.е. присутствующим в организме. В ц,,'1Шей работе - в качестве Фиксатора был выбран наиболее часто

используемый для этих целей глутаровий альдегкл (ГА). При исследовачии в.имнил разной концентрации ГА на fopiTv эритроцитов, было выявлено, что его применение сопряжено с заметной кодификацией «рормы клеток (Таб.1). Как видно из таблици. саныпи тра.чсрормирукщими концентрациями ГА оказались 2%. 2.5% и 4%, использупдиеся, однако, исследователями (Лощилов, Ефипозэ. Голиков,1984). Емэс7е с тем и малые концентрации l'A. используемы? в некоторых работах ¡Лисовский,Кидалоь, Гуд,196$^ такжо вьгзыва:от трансформацию формы эритроцитов. В то же врьмя, при концмнтр ац'.ш ГА 0.5Я> модификации форми эритроцитов, при CBeToaoti мякроскопировакии, не набляздоется. Данное обстоятельство вносит Cboji вклад в недостоверность некоторых литературных данных относительна <por>!w эритроцитов.

Таблица 1

Влияние ГА разной концентрации на «горму

эритроцит0е.

Конечная г.онцентрвция ГА в суспензии Наблюдаемые в диски формы эритроцитов Si дечюряироьанные клетки

0 25 33-98 2-12

0 50 100 -

1 00 87-9? 3-13

1 50 80-90 10-20

2 00 35-45 55-65

2 50 5-10 90-95

- 00 - 1.00

Объяснить эти результаты молено предполагая, что в

концентрациях ГА дейстьует на гсзмбрану, полимериэуяс:ь на захьатырая и приживая к мембране прииембранный гемоглобин, что в ито(-^ увеличивает ее жесткость, не изменяя, срормы клетки в целом. Это по-'-бидяяоиу. как раз имеет иег:ю грп используемых концентрациях ГА 0.3^

о то же время, при концентрациях ГА, по-видимому, недостаточных для

трго. чтобы охватить полимеркзационной сетью всю поверхность мембрагш.

Упрочнения мембраны по всей поверхности не происходит, т.". имеет

место некоторая ассимметрия механических свойств по мембране и

Обусловленная этим модификация фсгкы клетки. Эта ситуация, по-

видимому, характерна для концентраций ГА меньших 0.595. Следует

заметить, что фиксация клеток в концентрациях 0.5% и меньших, на иокт г

считаться жесткой, так как в гипооскотическкх услоеиях форма

эритроцитов, обработанных ГА в таких концентрациях, подвергается

дальнейшим изменениям. В то же время, фиксация эритроцитов ГЛ в

концентрации 0.5% обеспечивает отсутствие влияния на них такого

побочного фактора, как стекло или лкбого другого материала. Что

касается больших концентраций ГА, то при их применении ГА действует.

по-видимому, на весь объем эритроцита, связывая мембрану и молекулы

гемоглобина, и. превращая эритроцит в сплошную объемную ячеистую

структуру. ,С одной стороны, этот процесс сопряжен с изменением форма!

эритроцитов, и с другой. он делает ее жестко фиксированной.

индифферентной к последующим стрессовым воздействиям на эритроцит. а .

Рассмотренная картина фиксации эритроцитов ГА в зависимости от его концентрации согласуется с представлениями на этот . счет (Кого1 Г.М.М.,е1. а1..(1971).

Так как фиксация . 0.5% ГА является достаточной, чтобы устранить влияние на эритроциты случайных модифицирующих факторов при подготовке образца к световой микроскопии и. в то же время, ненадежно жесткой, чтобы эритроциты не изменяли свою форму после процедуры подготовки образцов к электронному микроскопированшо, необходимо проведение дополнительной постФиксаиии эрит?оцитов.

В работе обосновывается способ Фиксации эритроцитов, обеспечивающий у отсутствие модификации формы, и ее жесткость.

Наиболее оптимальная схема подготовки образцов к исследованию в РЭМ, с учетом сказанного, включала о себя следуям;ие основные этапы:

1.9иксация ГА (конечная концентрация в суспензии 0.5%, время

дейс вип 10 мин.)

2. Ч'ив сация ОеО.» (конечная концентрация в суспензии 0.02%. Бремя действия 10 гаш.)

3.Фиксация ГА (коночная концентрация в суспензии. 2.5%, 'эре.тя действия 10 мин.)

4.Прокыодние образцов дистиллированной водой (Э раза)

5.Нанесение на подложку и высушивание капли образца при комнатной температуре.

6.Напыление золотом, электронное мякроскопирование

Эта схема отличается от методик суще ствукщих в литературе ('Везззз.КееЗ, 1972) . но она позволила нам наблюдать в РЭМ нативную .орку эритроцитов, что подтверждалось наблюдениями по световому микроскопу, которые проводились параллельно электронному мккроскопироБанию.

Следует заметить, что по данным литературы, постфиксация эритроцитов четыре;:окисыл осмия применялась, однако в концентрациях на порядок ьыше той, которая приведена в кашей схеме и не в таком сочетании. Малая концентрация ОзО^ является существенным моментом при применении этого соединения для фиксации эритроцитов, исследуемых в РЭМ. Дело в том, что осмий, являясь химическим лементом с большим атомным номером, может сам эмиттировать вторичные электроны, усложняя этим интерпретацию экспериментальных электронограми. При малой концентрации этого агента такой возможностью можно пренебречь. Недостаток дополнительной жесткост.1 фиксации, обеспечиваемой ОзО<, компенсируется еще одной постфиксацией, теперь ГА в концентрации 2.5%. которая после применения осмия уже не искажает форму клеток.

Используя разработанный наия метод фиксации эритроцитов. на модифицирующий их юрку. мы провели исследовании, направленные на Изучение влияния различных сред на форму эритроцитов в условиях ICO'S дискоцитоза в контроле. Изучались следукшие факторы:

а) влияние на форму эритроцитов величины рН

б) влияние на форму эритроцитов осмолярности среды

Исследование проводилось методами световой и электронной

микроскопии. »

Влияние рН на форму эритроцитов.

Было приготовлено 4 суспонзиг. эритроцитов с разными значениями рН : 3.5, 5.5. 7.4, 10.5. Осмолягность всех суспензий оставалась постоянной 290 мОсм. Под сфероцитами. , согласно общепринятой классификации (Bessis,1972), подразумоваем шаровидные эритроциты, стоматоциты - клетки выпуклые с одной стороны, тороциты - клетки в виде тора,дискоциты-нормальные эритроциты.

Влияние осмолярности среды на форму эритроцитов.

Осмолярность среда создавалась NaCl (8%, 4"%, 2%, 0.9%. 0.5%, 0.3%). Эритроциты суспендировались в буферном растворе NaCl раз-личной концентрации и рН-7.4.

Сравнивая полученные результаты с данными литературы мы убеждаемся, что они отличаются от них. Вместо описанных зхиноцитов (раздутые клетки с небольшими Еыростамк на поверхности) (Bessis R. I.. Chai 1 ley В.,1972, Trotter Vf.D.,1956, Trincher 1С.,1982) при высоких значениях рН (8-10. 5SS), а также гипертонической среде (2-8% NaCl), мы наблюдали уплоиенкыё дископите, причем в определенном интервале гипертоничности среды [3-6% NaCl) были зарегистрированы плоские удлиненные дискоциты. Наблюдаемые формы в .классификации (Bessia M.,1972. Castolldi G.L.,1981; отсутствуют и. следовательно, общепринятого терцина не имени-.

1Ь

То, что другими исследователям;! при указанных условиях были пслучоны гхиноциты, связано, по-видимому, с наличием при постаноке orriJTü зхиноцятогенных факторов (Deuticke,1968, Fuji i .Tamara, 1983) или с трансформацией формы клеток при приготовлении образцов для ми^росчопирсвангя. Э:о*.иоциты иогут появиться от повторного промыьания в буферном физрастворе (Bes3iз.Lessin,1970, Kayden.Begsis.1970) или от соприкосновения крови со стеклом (Ponder,1948). Например, нами бил поставлен опыт, доказывающий, что если в контроле есть эхиноциты, то они обнаруживаются также и при высоких значениях pH, и о гипертонической среде наряду с уплсщеккягз! Формами. Следовательно, можно утверждать, что присутствие зхиноцитов в изученных условиях срода является, по-видимому, артефактом.

VI .Построение и.

?"Р^ТРС'Т1?У

Длр. построения геометр ическох-о профиля эритроцита на основе разработанного нами подхода необходимо иметь экспериментально полученный профиль интенсивности вторичных Электроноь — элсктронограто^у, получаемую при сканировании оондом по поверхности клетки вдоль ее диаметра в режиме У-модуляции РЭМ. Подготовка эритроцитов к исследованию в РЭМ осунестелилась по описанной вьыго мето;кке, которая, как отмечалось выше, не искажает их форму.

При исследовании эритроцитов в РЭМ их фотографировали (увеличение x1-500G) в обычноп режиме. а затем в режиме У-модуляции. В результате голучали негативное изображение интересукаего нас профиля наложенного kj изображение эритроцита. Для расчета геометрического профиля эритроцита необходимо ввести в компьютер значения интенсивности вдоль д.:акет!>а клетки к с оптикальдым иагои £>И. Поскольку процесс введения этих величин осуществлялся наки ьручну», пришлось увеличить негативное изображение эритроцита с электронограммоА чарез фотоумножитель и гогч'иести узеличелчоэ в 4.6 раза изображение на миллиметровую бумагу.

j-x соответствует направлению ■ сканирования зонда вдоль дилмотра эритроцита, размерность в мм. Начало координат соответствует случаю, .>ОГДа точка х«-0, т.е. когда зонд находится полностью на подложке и касается эритроцита только в одной точке x0-d/2. Для определения ^лсштаба по соответствукшим осям воспользуемся следующим соотношением Цели заданы реальные размеры эритроцита (mkta) , то масштабный коэффициент по оси-х будет равен М-1. Если задается радиус увеличенного в N pas эри-i роцита R (мм) , то необходимо кроме него, указать действительные размеры радиуса RI (irùrni) . Тогда M-R/R1.

Рис.8 Экспериментальный профиль интенсивности вторичных

электронов эритроцита (увеличение хбЭООО).

Для определения масьггаба , ю оси-У, необходимо воспользоваться ^одельным профилем. Край любого эритооцита всегда имеет наибольшую кривизну. Следовательно» можно предположить что угол падения в этой •урчке близок к углу равному 90". Относительная интенсивность в этой •урчке будет максимальной. В математической модели это соответствует одучаю, когда объектом сканирования является шаровой сегмент. Еило проверено, что у двух окружностей еттакщих радиусы И/ЯХ-к, диаметрк <1/(11-4 (соответствеенно) , при одинаковом шаге сканирования ЗИ-0.5%Н. точности вычлеления интегралов равной 0.01. макеккум интенсивности имел одинаковое значение. Задав радиус эритроцита. диаметр зонда и шаг сканирования, соответствующие экспериментальным

значениям (в км), г.п 'гориулап (в) и (10) (з ирограмме аыбран Rl-R/100) определяем максимальное значение относительной интенсивности (безразмерная величина). Обозначим это значение неременной В. Находя м^г-с.-мальное эначоние от но сито льнс-ñ интенсивности Атл„-С по графику (Рис.0) в миллиметрах, определим млсаггпб по оси-У как М1-В/С(»ai—1) . Бьедл значения Ai (мм) по графику lía Рис.8. будем получать относительную кнтс-иси&ность в безразмеиных единицах d точках Хо

I/Io » А/:0 * Ш + 1. (*)

После записи профиля интенсивности на экран дисплея ЭВМ выводится его графическое изображение для сравнения с графиком на Рис.9 (эксперимент!. После расчета ЭВМ выводит графич геометрического профиля эритроцита и таблицу с геометрическими параметрами: площадь поверхности. объем, диаметр, максимальная и минимальная толщина. Члктор формы - S3/V" и индекс сферичности Ис - V/Vc<p. где S-г.лощадь, V-обьем эритроцита. а Vcy-лбьеч сферы имеющей радиус эритроцита.

Фактор ч>оркк - индекс использующий с й для характеристики класса Формы, поскольку, для кавдог . класс* фигур он будет иметь некоторое постоянное значение. Сравнительный анализ полученного эритроцита с данным;: литературы приведен в таблице 2. Все эритроциты относятся к норкопитам, поскольку отношение диаметра к максимальной Толщине клетки не выходит з<г пределы 2.4 - 4.2 {Герглноь В.Г..1966). Вычисленные нами индексы, факгор формы и индекс сферичности, также помещены в данную таблицу. При сравнении. экспериментальный радиус R нормировался радиусом эритроцита R1, представленного автором. Смысл данного сравнении в той, что поскольку самым точным, не вызывающи] сомнений, параметром, определяемый авторами, является диаметр эритроцита. Было-бы интересно выявить, как изменились бы остальны? морфометрические параметры. если Sti эритроц/.т в их экспг имеитах имел истиной

геометрический профиль, полученный Kat-m. Е таблице расчктанкый эритроцит г.омечоч буквами РЭ.

Табл;-цг 2 Геометрические параметры эритроцита

1 источник d rain тол. max тол. S V

(mkra) (ifkra) <mkm) (Лт1) (mtab3) j ¡

1.Ponder 1.02 2.4 152 112 1 2 о; i ;

(1948) 8.5

РЭ 0.91 2.07 159 79 0. 21 644 *

2.Funs.Tong 0. 05 2.04 141 91.5 \ 0.49 1 339

(1968) 8 4 1

РЭ 0.89 2.05 156 76.6 0.25 644

3.Evaпз.Fung 0.81 2 .58 134 04.1 0.62 272 j

(1972) 7.8 i

РЭ 0.83 1.9 134 61 .4 0.25 644 ¡

4. Seek 1 2.5 138 93 1 o.sej 3ü4 !l

(1979) 8 i

РЭ 0.85 1.95 141 66 0.2; 644 i Ji

Анализируя данные в Таблице 2, приходим к выводу, что расиитанмие параметры эритроцита с истинной геометрией (рас читанные по нашей модели) отличаются от данных литературы.

Наибольшее отличив фактора формы, разного 524 для РЭ. отмечается со значением, представленного Poñder(l), который аппроксимировал форку эритроцита эллипсоидом. Отличается это значение и от значений которые представи.« Fung.Torig(2). Evas,Fung(3). Форму поперечного сечения эритроцита эти авторы описывали уравнением ока.юе Кассинч. -Usck(4) предложил описывать края профиля эритроцита двумя окружностями с радиусами меньшими, чем окружность, опясьшакиая вогнутую члсть сзчения

клетки. Следовательно, объективно регистрируемая форма эритроцита не соответствует тем формам, которые рассматривались в литературе. Следует отметить, что индекс сферичности для РЭ окавался очень пал. up сравнению с данными авторов (Таблица 2) . поскольку, расчитанный имр объем нмеет згвьппеннсв значение.

В связи с вшяо сказанным. можно сделать вывод, что наиболее ссмиительгагм параметром в дан1ШХ литературы является обьем эритроците, мал расчета которого, еаюш знать истинную Форму клетки.

ВДВОДЫ.

1 .Разработана теория и ' метод ее реализации для построения геометрического профиля осесимметрич;<ых клеток по данным эмиссии ьт оручных электронов, возбуждаемой электронным зондом. при его сканировании по поверхности клеток вдоль диаметра, при исследовании вх э' ркше У-модуляции в растрозом электронном микроскопе (РЭМ).

2.Продемонстрирована работоспособность теории ни примерах поверхностей, икеккаих аисллтиче;кое выражение их геометрического прсч>иля. На основе теории построены теоретические профили интенсивности - электронограммы. Э1:ьииалинтние случаю сканирования электоонного зонда по поверхности клеток в РЭМ, с псследукиип использованием этой электронограммы для реконструкции геометрического ггрсфмя заданной поверхности и сравнения его с исходным.

3.Исследован вопрос о том как меянется форма эритроцитов в зависимости от условий окружающей среды при отсутствии влияния псоо-шкх модифицируют1.* форму чакторсв. Установлено по результатам с!?етоЕЮго и электронного микроскопирования, что при отсутствии действия на эритроциты побочных кодифицирующих факторов их Форма в Физиологических условиях - I009i дискоцитная.

4.Разработана методика подготовки эритроцитов к электронному кикроскопироаанию ке исказкаклик их исходнуто форму.

5.Экспериментально, с попошью серийного РЭМ (JEM-ЮОСл, Japan) . получены электронограммы, отражающие процесс эмиссии вторичных электронов поверхностью, при сканировании по ней электронного зонда в режиме У-модуляции (применительно к условиям минимизации побоч!!кх трансформирующих форму эритроцитов факторов, в процессе подготовки их к данным исследованиям).

6.На основании теории и метода ее реализации построены геометрические профили эритроцитов по экспериментальным эдектронограммам. полученными при исследовании эритроцитов с помощью РЭМ. . Проведено сравнение результатов по геометрическому профилю эритроцитов и расчитанных из неге морфометрических параметров, характеризующих Форму эритроцитов, с дам.ыгс1 литературы.

7.Разработан пакет программ для ПЭВМ на языке gwBASIC. позволяншшй реализовать поставленные расчетные задачи за минимальное время.

Публикации по материалам диссертации.

1.PetrenJto Yu.M., Tcokova Т.К., Vladirairov Va.A. A possible role in membrane pathology of pressure differences arising on rnembran^s created by electrical field. //В тез.Constituent Congress International society foi* Parhophysiology.// Moscow, . May 26-June 1.1991.^236 p.

2.Цокова Т.Н., Петренко Ю.М. Построение геометрического профиля осесимметричных клеток по данным растровой электронной микроскопии. //Биофизика. 1993. ÔMHI/TU, .W?/'

3.Цокова Т.Н., Петренко . í0.M. Расчет геометрического профиля эритроцита по данным растровой электронной микроскопии. //Биофизика .1993, <в ,

/ вините,

Закаэ 228 . Тираж 100 Бесплатно

Ротапритная МИТХТ им. M.li.Ломоносова М.ПирогоЕСкая д.1