Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пост-транскрипционное редактирование мРНК в Trypanosoma brucei на примере мРНК митохондриальной аденозинтрифосфатазы-6

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Пост-транскрипционное редактирование мРНК в Trypanosoma brucei на примере мРНК митохондриальной аденозинтрифосфатазы-6"

На правах рукописи

Желонкина Алевтина Геннадьевна

ПОСТ-ТРАНСКРИПЦИОННОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ мРНК В Trypanosoma brucei НА ПРИМЕРЕ мРНК МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТАЗЫ-6

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2006

Работа выполнена в университете им. Джонса Хопкинса г Балтимор, Мэрилэнд. США (Johns Hopkins University, School of Medicine, Baltimore, Maryland, USA)

Научный руководитель

доктор философии, профессор Барбара Соллнер-Вебб (Professor Barbara Sollner-Webb,

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор Ильичев А.А.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Дымшиц Григорий Моисеевич кандидат биологических наук Качко Алла Васильевна

Ведуи(ая организация

Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Защита состоится « 30 » «-аярвяя- 2006 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ГНЦ ВК «Вектор», К'ольцово Новосибирской области, 630559; гел. (483)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Ph.D.)

336-74-28.

Автореферат разослан « 27 » апреля_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

ЮQgfi \0Q>77

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Редактирование РНК в широком смысле этого слова включает в себя любой процесс, который приводит к синтезу молекулы РНК, отличающейся нуклеотидной последовательностью от кодирующей ее молекулы ДНК, за исключением тех изменений, которые происходят вследствие классического механизма сплайсинга (Simpson and Shaw, 1989).

Впервые процесс редактирования был описан в 1986 году при изучении гена цитохром оксидазы, а именно субъединицы 11 из трипаносом (Benne et al., 1986). Авторы выявили, что последовательность РНК этого гена не совпадает с кодирующей ее ДНК. С тех пор процессы редактирования были обнаружены среди разных организмов, и подвергаются этому процессу РНК разного типа: матричные, транспортные, рибосомальные (Backus el al., 1992; Stuart el al., 1997; Одинцова M.C., Юрина Н.П., 2000; Masanori Kugila et al., 2003; Flomen et al., 2004). Известы несколько типов редактирования РНК: I) замена нуклеотидов, например, в хлоропластах растений происходит замена С-нуклеотида на U-нуклеотид в последовательности мРНК (Gray el al., 1993); 2) вставка и/или делеция нуклеотидов.

11аи6олее ярким примером второго типа редактирования является пост-транскрипционная вставка и делеция U нуклеотидов в последовательности митохондриальных мРНК трипаносоматид (Bass, 1993). Этот процесс важен для созревания митохондриальных лре-мРНК в кинетопластидах, поскольку приводит к созданию инициирующего и терминирующего кодонов (Stuart, et al., 1997), и, таким образом, обеспечивает синтез функциональных белков. Гены, РНК которых подвергаются редактированию, называются криптопенами (Simpson, L. и Shaw, J., 1989). Некоторые транскригггы криптогенов проходят через ограниченную модификацию последовательности, например, в случае гена сохII редактирование мРНК ограничивается вставкой четырех U нуклеотидов (Benne и др., 1986). В других случаях - более 50% кодирующей последовательности образуется в результате редактирования (пэн-редактирование). Примером этому может служить мРНК гена АТФ-синтеггазы субъединицы 6 (А6) из Trypanosoma brucei (T. brucei) (Bhat. et al., 1990).

В процессе редактирования участвуют: пре-мРНК, которая подвергается редактированию, и направляющие РНК (гид-РНК или гРНК (Blum, et al., 1990а)), которые обеспечивают информацию для редактирования. гРНК состоят из трех основных частей (Рис. ЗВ). Для редактирования одной молекулы мРНК требуется несколько разных гРНК, которые включаются в процесс последовательно и направляют редактирование от 3' к 5' концу мРНК (Sollner-Webb, et

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА C.-fleTeDôvDf

al., 2001). Однако, мало было известно о характеристиках гРНК, которые являются критичными для цикла редактирования in vitro.

Механизм редактирования представляет собой многоциклический процесс. Каждый цикл включает в себя гри ферментативные стадии (Рис 1, а также см. Blum, et al., 1990а, Kable, еI al., 1996, Seiwert, et al., 1996). В 1997 году Руше (Rusche et al., 1997) выделила макромолекулярный комплекс из митохондрий Т brucei, состоящий из 7 основных белков (названных I-VI1), и ответственный за процесс редактирования мРНК в трипаносомах. Ферментативные комплексы, полученные другими группами ученых и при других условиях выделения, содержали эти же основные белки плюс еще около 10 других (Madison-Antenucci et al, 1998; McManus et al., 2000; Panigrahi et al, 2001a, 2003;) Белки IV и V основного комплекса являются двумя митохоцдриальными РНК-лигазамн, которые были выявлены с помощью реакции аденилирования (Rusche, el а!., 1997; Sabatini and Hajduk, 1995), но роль этих лигаз в процессе редактирования не определена. В комплексе также была выявлена концевая уридил-трансфераза (Schnaufer et al, 2003; Aphasizliev et al, 2003a,b). Об активностях других белков комплекса до сих пор нет каких-либо данных Нет ответов и на вопросы, связанные с организацией этого макромолекулярного комплекса, его структурой и взаимоотношениях с РНК.

Открытие редактирования РНК было большим сюрпризом, так как этот процесс противоречил центральной догме молекулярной биологии, согласно которой закодированная в ДНК информация транскрибируется в РНК, которая в свою очередь транслируется в функциональный белок. В настоящее время, РНК-редактирование рассматривается, как сложный процесс генной экспрессии, с помощью которого организм может увеличить число производимых белков без увеличения числа генов в геноме. Однако, одна ошибка в одном из сотен участков РНК-транскрипта в процессе редактирования может привести к нетранслируемой матрице. Таким образом, процесс редактирования РНК является фундаментальным для ключевого биологического процесса, реализации генетической информации в клетке. Следовательно, актуальность представленной работы прежде всего заключается в том, что изучение процесса редактирования мРНК поможет прояснить тонкие механизмы созревания РНК в клетке.

Практическая ценность работы

Так как сложившиеся подходы для борьбы как с человеческим (сонная болезнь), так и животным (болезнь Нагана) трипаносомиазисом потерпели неудачу, определение новых

аспектов биохимии и молекулярной биологии трипаносом может способствовать выявлению новых мишеней для создания более эффективных вакцин и поиску лечебных препаратов.

Цель и задачи исследовании

I (елью настоящей работы является исследование пост-транскрипционного механизма редактирования мРНК в митохондриях Tbrucei на примере редактирования пре-мРНК субъединицы-6 АТФазы (Аб). В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить, какие элементы гРНК являются критичными для эффективности процессов редактирования мРНК.

2. Определить роль белков IV и V основного ферментативного комплекса в обоих циклах редактирования пре-мРНК как при вставке так и при удалении U-нуклеотидов.

3. Выяснить состоит ли комплекс редактирования из двух физически отдельных субкомплексов, ответственных за катализ либо U-вставки, либо U-делеции, и происходит ли перекрывание ферментативных активностей между двумя отдельными активными центрами комплекса, если таковые существуют

Научная новизна работы

Впервые установлены характеристики гРНК, которые являются критичными для направления эффективного редактирования in vitro

С учетом критичных элементов были сконструированы новые гРНК in vitro, которые способствовали получению высокого выхода редактированного продукта, составившего в этом случае более 60% от нередактированной мРНК, что является значительным увеличением по сравнению с 1% в случае с природной гРИК.

Еелки IV и V являются первыми двумя белками основного ферментативного комплекса, роль которых была определена в процессе редактирования пре-мРНК-

- белок IV абсолютно необходим для сшивания РНК в процессе U-делеции, и поэтому был назван DREL (Deletion RNA Editing Ligase - РНК-лигаза для редактирования посредством делении);

- белок V функционирует специфически в цикле (J-вставки, и, следовательно, был назван IREL (Insertion RNA Editing Ligase - РНК-лигаза для редактирования посредством вставки).

- с помощью РНК-интерференции DREL также может заместить IREL в цикле U-вставки при инактивировании гена, ответственного за IREL, тогда как IREL не обладает такой замещающей функцией.

Впервые покачано, что TUTase, являясь ферментативной активностью вставочного редактирования, также функционирует в цикле U-делеции при обеспечении физиологического уровня UTP.

Несмотря на то, что процессы U-делеции и U-вставки отличаются на всех трех этапах каждого цикла, впервые было показано, что ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования, указывая на то, что белковый комплекс, ответственный за редактирование пре-мРНК в митохондриях Thrucei, не обладает теми функциональными ограничениями, представления о которых были сформулированы до наших исследований.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на нескольких международных конференциях и симпозиумах: "Molecular Parasitology meeting" (Marine Biological laboratory Woods Hole, Massachusetts, USA - in 1999, 2000, 2002), "The Fifth Annual Meeting of the RNA Society" (University of Wisconsin, USA - 2000), "The Sixth Annual Meeting of the RNA Society" (Banff, Alberta, Canada - 2001), "Tetra-State Ttypanosome Meeting" (Rockefeller University, USA - 2002, 2003, 2004). А также на трех коллоквиумах Департмепта Биологической Химии в Johns Hopkins University, School of Medicine, Baltimore, USA, трижды на семинарах "Parasitology Club" JHU, School of Medicine, Baltimore, USA и дважды на "Biology Club" в JHU, Homewood, Baltimore, USA.

Публикации

По материалам работы опубликованы 6 статей и тезисы S докладов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на МО страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы из 129 наименований, содержит 5 таблиц и 24 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Критичные элементы г РНК важные дли редактирования мРНК

Механизм редактирования пре-мРНК в митохондриях T.brucei представлен на рис. 1. Каждый цикл редактирования включает в себя эцдонуклеазное расщепление мРНК в 5* конце мРНК-гРНК дуплекса, удаление U-нуклеотидов с помощью З'-уридил-экзонуклеазы (З'-и-экзо) или их вставку с помощью концевой уридил-трансферазы (terminal-U-transferase или TUTase); и

наконец сшивание мРНК. Цикл U-делеции в участке редактирования 1 (УР1) или U-вставки в УР2 для мРНК А6 был воспроизведен в системе in vitro (Kable et al., 1996; Seiwert et al., 1994), используя мРНК, меченую с помощью иР-нуклеотида на одном из концов, си1ггезированную гРНК и митохондриальный экстракт (Seiwert el al., 1994), или более очищенные фракции ферментативного комплекса (Kable el al., 1996; Rusche el al., 1997; Alien el al., 1998; Madison-Antenucci el al., 1998; McManus el al., 2000; Seiwert el al., 1996).

U-делеция U-вставка

'JtL^rrrri* 'taj^rxnf

©ADP I ф 0ADP I »W-

¥ нуклеаза • кухлеаза

UMP-^ 3'-и-ЭИО ф UTP^( TUTase

> ^.^¿ШХр

(6<hvHV) I РНК (вацц-V) 1 РНК

улигаза j лигам

Рис.1. Механизм редактирования. Процесс редактирования пре-мРНК в митохондриях Т brucei является пост-транскрипционным созреванием мРНК посредством циклов делеции и вставки U-нуклеотидов. R - пурин, Y - пиримидин. При редактировании мРНК А6 цикл U-делеции составляет 10%, а цикл U-вставки - 90% от всего редактирования Аденозинцифосфат противоположно влияет на стадию расщепления в обоих циклах (Cruz-Reyes et al, 1998), З'-Ч-чкзо ие является обратимой реакцией TUTase (Cruz-Reyes et al., 1996; Rusche el al., 1997). Т рети я стадия описывается в этой работе

гРНК, ответственные за направление модификаций последовательности мРНК в Т brucei, имеют три основных консервативных участка (Рис. 2А и ЗВ). Однако, мало было известно о характеристиках гРНК, которые являются критичными для цикла редактирования in vitro В нашей работе мы изучали характеристики гРНК, важные для процессов U-делеции и U-вставки, а также надеялись сконструировать гРНК, которые могли бы увеличить выход редактированной мРНК. Повышение эффективности системы m vitro позволило бы лучше изучить как сам процесс редактирования, и ферментативные активности, вовлеченные в него.

Для достижения поставленной цели мы сконструировали ряд гРНК, в которых консервативные участки родительской гРНК были подвергнуты модификациям (Рис. 2А).

Рис. 2. Модификация участков гРНК для повышения эффективности цикла U-делеции. (А) Последовательности мРНК и гРНК с предполагаемыми связями Уотсоиа-Крика и неканоническими связями GU, дуплексы между парами мРНК:РНК обозначены затемненными прямоугольными участками. Уровень редактирования (Редактир.) с родительской гРНК принят за IX и, соответственно, оценен для модифицированных гРНК (см. нижнюю панель; названия для гРНК обозначены слева от последовательности; D в имени гРНК происходит от анг. «deletion» - делеция). Расщепление при участке редактирования I (УР!) указано наконечником стрелки над последовательностью мРНК, и УР2, УРЗ, УР4 помечены 2, 3, 4, соответственно. Горизонтальные линии при 5' н 3' концах мРНК представляют конечные последовательности: 5'-GGA AAG GUU AGG GGG AG-3' и 5'-AAU ACU UAC CUG GCA UC-3', соответственно; горизонтальная линия при 5*-конце гРНК является 5'-GGAUAUA-3'; штриховые линии в дуплексах мРНКтРНК - фосфодиэфирная связь; звездочкой обозначен ИР [рСр)-меченый 3'-конец мРНК. гРНК сконструированы таким образом, что при УР1 они направляют делению трех U. На верхней панели указаны три основные участка гРНК. якорь, гидовая часть и привязь (см. также Рис. ЗВ) (В и D) Авторадиограммы 9% денатурирующих акриламидиых гелей для анализа реакций U-делецин в системе от vilro с указанными гРНК; т[0,4]~ мРНК А6 до редактирования, в которой четыре U при УР1 и ноль U при УР2; обозначены также конечный (-3) и промежуточные (-1 и -2) продукты цикла U-делеции Продукты делении с D30CC" видны при более длительной выдержке фильма, где распределение продуктов редактирования похоже на случай с D32. Панель D является более короткой фотовыдержкой, чем панель В. (С и Е) Авторадиограммы 9% денатурирующих акриламидиых гелей для анализа первой стадии редактирования в цикле U-делеции - расщепление. Реакция проведена с использованием пирофосфата (PP¡) для ингибирования стадии сшивания мРНК (Cruz-Reyes and Zhetonkina el al, 2001).

Синтезированная нами гРНК (D30CC) состояла из якоря, но не имела центрального гидового участка (Рис. 2А), а также содержала мутации в олиго-и-хвосте для образования связей Уотсона-Крика с мРНК. Это застабилизировало связь между З'-концрм гРНК и 5'-концом мРНК во время редактирования и увеличило выход продукта в реакции U-делеции в 10 раз по сравнению с родительской гРНК (Рис. 2В, дорожки I и 2). Дальнейшее усиление комплементарное™ между 5'-участком мРНК и З'-участком гРНК за счет введения С нуклеотидов в хвостовую часть гРНК (D30CC' н D30CC", Рис. 2А) уменьшало выход конечного продукта (Рис. 2В). Полученный результат может быть объяснен двумя причинами: первое, наличие (J-нуклеотидов в

последовательности гРНК стимулирует редактирование, а С-нуклеотидов - ингибирует; второе, степенью комплементарное™ гРНК по отношению к мРНК в УР. Однако, создание гРНК, которые не спаривались с основаниями мРНК в районе, прилегающем к УР (032 и 032а, Рис. 2А), увеличило уровень и-делеции (Рис 2В). Эти результаты позволили отказаться от первого предположения и подтверждают второе. Последующее введение одноцепочечных элементов между мРНК и гРНК, прилегающих к УР (Рис. 2А, 033' и ПЗЗ), способствовало увеличению уровня делении и-нуклеотидов более чем в 100 раз по сравнению с родительской гРНК (Рис. 20).

На Рис. 2С и 2Е отображен начальный этап редактирования - расщепление, показано, что описанные выше эффекты в цикле и-делеции проявились уже на стадии расщепления мРНК. Это указывает на то, что активность эндонуклеазы в процессе и-делеции зависит от нес паренных оснований между мРНК и гРНК.

Дальнейшая оптимизация реакций и-делеции показала, что выход редактированного продукта составил более 60% от изначальной мРНК (Рис. ЗА), что является значительным увеличением по сравнению с 1% в случае с родительской гРНК (Рис. 2В, дорожка I).

АГРНК ВмРИК 5®?®=__.

ГРНК зон*

ta-

-J- ШФ

и-хвосг «НОВЬ

/мдмы! участок \

требуется Дяримаь * мемрфм 1ЙК * нт—ран. ыРНК ■ОМНИМИИЦР юс п. смРНК

и* требуется гон «»т UM* гцдомм часть «в uitfimim« сниоимма ермуяоем •оемдом ИЙМКГЬ

* никитмлм tojiiniiMiPHt

t tHHUl» HWfaffH U Л»ПГШЧ1 ■ ц |ЯЦ

в дам с—я/ющма уунда

Рис. 3. Элементы (РНК, важные для цикла И-делеции. (А) Циклы U-делецни с D33' и D33 были выполнены, как описано на Рис. 2. (В) гРНК состоят из грех основных участков а) 5' участок, который образует комплементарный дуплекс с 3' участком пре-мРНК до первого редактируемого сайта и назван «якорь»; б) средний участок (богатый аденииом), который содержит информацию о типе редактирования (вставка или делеция) и является комплементарным к мРНК после редактирования, используя связи Уотсона-Крика и неканонические гуаннн.-уридин (íj'U) связи, н назван «гндовая часть» в) }' алнго-U-хвост, который составляет от 5-30 нуклеотидов в длину (Blum, et al., 1990b), и является стабилизирующим элементом 5' конца пре-мРНК в процессе редактирования, в силу чего назван «привязь». В таблице показаны характеристики гРНК критичные для U-делеции (Cruz-Reyes and Zhelonkina е/ о/., 2001).

Таким образом, элементы гРНК (Рис. ЗВ), критичные для эффективного цикла делеции, удивительно просты: в дополнение к образованному якорному дуплексу мея(ду З'-концевым участком мРНК и 5'-участком гРНК необходимо сохранить несколько неспаренных оснований, прилегающих к участку редактирования, а также стабилизировать расщепленный 5'-участок пре-

мРНК, чтобы предотвратить его диссоциацию во время первых двух стадий в процессе редактирования. Другие консервативные элементы гРНК не требуются для цикла и-делеции, причем многие из них являются ингибирующими (Рис. ЗВ).

гРНК, направляющие и-делеции и и-вставки, отличаются только в районе УР тем, что в первом случае - это пиримидин, а во втором - пурин. При этом, нет индивидуальных гРНК для вставки или для делеции, и одна и та же гРНК, направляющая делецию(и) в одном УР, также направляет аставку(и) в предыдущем или последующем участках. Следовательно, можно предположить, что тс же самые элементы гРНК стимулируют как цикл и-делеции, так и цикл и-вставки.

Однако, при попытке использовать результаты нашей работы о критичных характеристиках гРНК для изучения и-вставки, было обнаружено, что элементы гРНК, важные для и-делеции, ингибируют процесс и-вставки (Рис. 4В), и многие из них делают это уже на первой стадии цикла (Рис. 4С).

В

#ИК юл--

<тю o'V.eM-

I AíííWi «1. А1<(П.»«>* ■(•Л"1!

100«

6 íiHtMAh ibkHt

m -

1 2 3 4 5 8

Рис. 4. Циклы U-делецни и U-вставки по-разному узнамл гРНК. (А) мРНК и гРНК последовательности, как на Рис. 2А, только для U-вставки, где rPI IK сконструированы таким образом, что при УР2 они направляют вставку двух U. (В) Авторадиограмма гелей, как на Рис. 2, только для анализа реакций U-вставки; +2 - конечный продукт вставки; химера образуется в процессе редактирования и состоит из 3' конца мРНК до УР и всей последовательности гРНК. (С) Авторадиограмма геля, как на Рис. 2, только для анализа первой стадии редактирования - расщепления - в цикле U-вставки

Эти данные обеспечили дополнительные доказательства, что циклы U-делеции и U-вставки отличны в начальной стадии расщепления не только в различном влиянии аденозин-нуклеотидов на этот процесс (Cruz-Reyes et al., 1998а), но и в узнавании i РНК. Это позволило предположить, что природная гРНК оптимизирована для U-вставки, а не для U-делеции Более того, поддержкой нашего предположения может служить тот факт, что тип вставочного редактирования у трипаносом составляет около 90% от всего редактирования мРНК А6.

В дальнейшем мы обнаружили, что цикл и-вставки нуждается в мосте сшивания, который образуется между мРНК и гРНК нуклеотидами сразу после УР2 (Рис. 5А). Наши последующие эксперименты показали, что эта зависимость цикла 1)-вставки проявляется на стадии сшивания мРНК в отличие от цикла и-делеции, в котором такой зависимое! и нет (Рис. 5В).

мРНК в'

-НАДАМЛ it К .

УР2

V

1. родител. гРНК у- -лдг,',лА

2. Б'ДИ)гРНК 3'- -'А 11ЛЛ

3. 5'Д(-5> гРНК 3'- --г- М АЛ

4. 6'Д(-9) гРНК 3'-— -1/ИН'АА

5. 5'd(-16) гРНК 3'-- -'I'M ЛЛ

Мост Редакт.

( f

гРНК 1 г з 4 а

+2— * - «мми»

в

«РНК»-

AÜGGOGAOOAOAGAAQAAAGQGAAAOUUGUG AUUUUOOAQUUAUAGAAUACUUACCU-

III I III II I lllllUlliTltll II

В CACACAACAAA CCCAAA СЛЛО^д^Л UAGAOCCUCAAUMJCAUAUAeO Г

И7С I47GIOU)

^(^(^A^AAACCCAAA^AO^jAAUll^OCCUC^UK^AUAtiAOO Г

I I.

..JJ III II И IUI III tili 11И IUI II

_l47G(GOAU) CACACAACAAA CCCAAA CAAQAUAAÜAGAQOCUCAAUAUCAUAUAOG T

- :

VbwaM

-"С")

Рис. 5. Цикл U-вставки нуждается в мосте сшивания. Верхняя последовательность - мРНК; расположенные ниже - гРНК. Роднтел - родительская гРНК. (А) В последовательностях мРНК и гРНК (для U-вставки) указаны только район УР2 и основания, образующие или необразующие мост сшивания (см. текст) Правая панель - авторадиограмма геля с реакциями U-вставки, как на Рис. 4, где «in» обозначает положение т[0,4]. Цифрами обозначены гРНК с левой панели (В) мРНК и гРНК последовательности, как на Рис. 2А, но только для U-вставки. Правая панель - авторадиограмма гелей с реакциями U-вставки, как на Рис 4В и 5А. (ins cut) - расщепленный 5'-участок мРНК после первой стадии цикла U-вставки PPi - пирофосфат.

Все это позволило предположить, что циклы U-делеции и U-всгавки отличаются друг от друга гакже и при сшивании. Для того, чтобы непосредственно исследовать стадию сшивания, было решено исследовать роль обеих РНК-лигаз, входящих в основной очищенный ферментативный комплекс редактирования: белки IV и V (Rusche el al., 1997).

2. Функции РНК-лигаз комплекса редактирования

Было показано, что оба цикла редактирования катализируются одним ферментативным комплексом, состоящим из семи основных белков, которым были присвоены номера от I до VII (Rusche, et al 1997) (Рис öA) Первыми белками, для которых была выяснина функция - это белки IV и V, которые являются РНК-лшазами (McManus, et al. 2001; Panigrahi, et al 2001; Rusche, et al. 200I,

Schnaufer, el al. 2001). Экспериментальные доказательства того, чго комплекс редактрования включает в себя две РНК-лигазные активности, были продемонстрированы при аденилировании и деаденилировании с АТФ или PPi, соответственно (Sabatini, ei al. 1995). Также было показано, что ферментагивный комплекс сшивает разрывы в РНК-субстразах, и не обладает такой способностью в отношении ДНК (Rusche, el al. 1997). Эти результаты говорят о том, что белки IV и V, действительно являются РНК-лигазами, механизм действия которых представлен на Рис. 6.

Ранее было замечено, что при очистке комплекса редактирования большая часть белка V аденилируется с помощью эндогенного АТФ, в го время как белок IV - нет, причем после

1. Е ♦ ÄTP Е-рА + РИ

2. Е-рА ♦ р- ^ 1Ар?-1-Е

3-—ОН* (Ар-р-JE -Р-♦ AMP * Е

Рис. 6. Механизм действия РНК-лигазы. Е- фермент, АТР - АТФ, AMP - АМФ, PPi - нирофосфат. I) Е активируется с помощью АТФ с образованием аленилового производного фермента и свободна о PPi. Реакция может проходить в отсутствии РНК и является обратимой при высокой концентрации PPi. 2) AMP переносится на 5' фосфат РНК-донора, генерируя 5'-5' пирофосфатный мост. 3) З'-ОН группа РНК-акцептора замещает 5' AMP, образуя новую фосфодиэфнрную связь Таким образом, первый шаг механизма может наблюдаться с использованием [а-32Р]-АТФ.

деаденилирования и ре-аденилирования оба белка находятся в соотношении 1:1 (Rusche, el al. 1997). Мы предположили, что обе РНК-лигазы по-разному активируются АТФ и/или деактивируются PPi, и решили выяснить роль каждой из этих двух лигаз в процессе РНК-редактирования.

В начале полностью деаденилированный очищенный комплекс редактирования был проинкубирован с [а-32Р]-АТФ для мечения и, соответственно, активирования РНК-лигаз. Было показано, что перенос AMP к лигззе V происходит при концентрации АТФ в 10 раз меньшей, чем га, которая необходима для активирования лигазы IV (Рис. 7А). Это различие между двумя лш азами подтолкнуло нас проверить стадию сшивания расщепленных РНК в процессах U-делеции и U-вставки при тех же самых концентрациях АТФ с комплексом редактирования, которые были использованы в реакции аденшшрования. Обнаружено, что концентрации АТФ по-разному влияют на обе формы редактирования, и это предполагает, что для U-делеции и U-вставки необходима своя лигаза. Значительно больше АТФ потребовалось на сшивание мРНК в процессе U-делеции, чем в процессе U-вставки, где активация лигазы проходила в пределах от 30

пМ до 300 пМ (Рис. 7В) и от 1 до 30 пМ (Рис. 7С), соответственно. Таким образом, количество АТФ, необходимое для сшивания мРНК в U-делеции совпадает с тем, которое необходимо для активации белка IV, названным DREL (Deletion RNA Editing Ligase - РНК-лигаза для делеционного редактирования). Количество АТФ, требуемое для сшивки продукта -вставки лежит в тех же пределах, которые необходимы для активирования белка V, названным IREL (Insertion RNA Editing Ligase - РНК-лигаза для вставочного редактирования). Необходимо

Рис. 7. Аденилнрование, ('-делеци« и И-всгавка, направляемые комплексом редактирования при разных концентрациях АТФ. Очищенный комплекс сначала был полностью инактивирован с помои^ыо 10 mM PPi (конечная концентрация I.S mM PPi), и только затем добавлено указанное количество АТФ. (А) Аденилнрование Авторадшнрамма 10% SDS-ПААГ, исследуя активацию OREL и IREL с использованием [а-32Р]-АТФ. Реакции, которые были инкубированы дольше или которые содержали РНК-субстрат, дали такие же результаты; дополнительный эффект не наблюдался с большей концентрацией АТФ (данные не показаны). Дуплексы белка DREL соответствуют двум изоформам (Rusche, et a!. 1997, 2001). (В я С) U-делеция и U-вставка Авторадиограммы 9% денатурирующих акриламидных гелей показывают генерируемые РНК-продукты при инкубировании обработанного комплекса с указанными количествами немеченого АТФ и меченой мРНК А6 по З'-концу, прей нкубирован ной с г РНК D32 иа (В) или 147G на (С). Реакции U-делеции содержали ImM AMP-CP (негидролизируемьш аналог ADP) (В), реакции U-вставки -ISO рМ UTP (С) Верхние панели показывают область геля, содержащую начальную мРНК (In) и конечный продукт U-делеции (-3) или продукт U-вставкк (+2); нижние панели указывают область геля, которая содержит фрагменты мРНК, оставшиеся после гРНК-напрааленною расщепления а участке U-лелеции (del cut) или U-вставкн (ins cut). (D) Авторадиограмма большого участка 9% денатурируете! о акриламидного геля, содержащего реакцию U-вставкн, как на (С), используя I рМ АТФ. (Е) Количественный анализ авторадиограмм, показывающий аденилнрование двух лигаз на (А) и продукты U-делеции и U-вставкн нз гелей на (В и С). Описание используемой аппаратуры и программного обеспечения дано в конце главы 2. Единица интенсивности полос выражена в 1000 пикселей.

отметить, что стадия редактирования, которая зависит от АТФ - это сшивание. Более того, ранее в литературе было показано, что первые две стадии обоих циклов редактирования не зависят от АТФ (Rusche, et al. 1997; Cruz-Reyes, et al., 1998). Также подтверждающим фактором того, что сшивание - это стадия, которая определяет ответную реакцию циклов редактирования на

\м.лт® # , * * .

мат-«*«*-*

МЦАТО

АШ-СР • -

вМ_ >_ г W| if, I,и tímUár

КМ.ЛТФ ■»»»» UTP • --

шипи

концентрацию АТФ, является количество несшитой расщепленной мРНК (Рис. 7В,С, нижние панели), которое обратно пропорционально количеству редактированного продукта (верхние панели). Соответственно, количество этой несшитой, но расщепленной мРНК, также обратно пропорционально уровню активирования соответствующей лигазы в реакции аденилирования (Рис. 7А). Следовательно, количество оставшейся расщепленной мРНК дает еще одно доказательство того, что в каждом типе редактирования функционирует своя РНК-лигаза.

Таким образом, наши данные показывают, что сшивание расщепленной пре-мРНК в процессах U-вставки осуществляет IREL, тогда как в процессах U-делеции DREL. Результаты по функционированию DREL в цикле U-делеции были подтверждены в системе in vivo (Huang, et al, 2001). На основании данных о том, что 1REL активируется при меньшей концентрации АТФ, чем необходимо для U-делеции и активирования DREL, заключили, что в сшивании мРНК в процессе U-делеции IREL не учавствует.

Было также проверено, имеют ли эти РНК-лигазы разную чувствительность к PP¡. Для визуализации деаденнлирования на геле обе лигазы были частично помечены 1 пМ [а-32Р]-АТФ (Рис 8А). При титровании PP¡ DREL сразу же деаденилировался, тогда как IREL оказался относительно более устойчивым (Рис. 8А). Титрование PPi в самих циклах редактирования при тех же самых реакционных условиях показало, что цикл U-делеции ингибируется при 0.1 шМ PPi (Рис. 8В), т.е. при концентрации инактивирования DREL (Рис. 8А, D). Следовательно, DREL, а не IREL сшивает продукты U-делецин. Тогда как, реакция U-вставки ингибируется при I шМ PPi, что в 10 раз больше, чем в случае с U-делецией (Рис. 8С). Эта концентрация PPi совпадает с профилем инактивирования IREL (Рис. 8A,D). Следовательно, IREL эффективно сшивает мРНК в цикле U-вставки. Таким образом, на основании результатов, полученных при тировании PPi, мы еще раз подтвердили, что каждой форме редактирования соответствует своя РНК-лигаза (Рис. 7).

Результаты экспериментов, представленные на Рис. 8, были получены при наличии в реакционной смеси небольшого количества АТФ. В связи с этим возникает вероятность противоположного эффекта PPi и АТФ на функционирование лигаз в этих экспериментах. Чтобы убрать влияние АТФ, титрование PPi было проведено в реакциях редактирования без добавления АТФ (Рис. 9). Такой подход возможен, так как большее количество IREL и некоторое количество DREL комплекса редактирования уже аденилировано (Rusche, et al. 1997), и, следовательно, достаточно для процесса U-вставки и частично U-делеции в отсутствии экзогенного АТФ (Cruz-Reyes, et al. 1998а; Рис. 9В и С, дорожки 1 и 2).

mMPPi - 1Я и 11«

пМ АТФ «-► -»

АМР-СР ♦-► -►

UTP »-----

OREL (!*)=>*

»EL (V| —. * — « >.

mil PPI - - - i л» » í

nU АТФ - IB1 i -►

AMP-CP --"

KlMPM---

nMAT* -»"i UTP •-

i Л 1 »24

инт o ai e 7S o i i

Рис. 8. Аденилнро ванне, U-делецня и U-вставка при различных концентрациях PPi.

Очищенный комплекс редактирования сначала был активирован с помощью указанного количества [о-ИР]-АТФ в (А) и немеченым АТФ в (В и С) до обработки указанным количеством PPi (А) Аденилирование было выполнено, как описано на Рис 7. (В и С) Анализ U-делеции и U-вставки был выполнен как описано на Рис. 7. (В) Отношение промежуточных продуктов к конечным в U-делеции во всех дорожках одинаково (D) Количественный анализ деаденилироеания двух лигаз, показанного на панели А, и продуктов U-делеции и U-вставки из гелей на панелях В и С сделан как на Рис. 7Е Блиница интенсивности полос была измерена в 1000 пикселей.

Также необходимо заметить, что реакции U-делеции и U-вставки оптимизированы и обычно исследуются при разных реакционных условиях. Так, для протекания реакции U-делеции необходимо 1 тМ АМР-Ср (негидролизуемый аналог АОР), такая концентрация способствует эндонуклеазному расщеплению (первая стадия редактирования). Тогда как высокая концентрация АМР-Ср ингибирует стадию расщепления в цикле U-вставки (Cruz-Reyes, el al. 1998а). Далее, для процесса U-вставки необходим UTP для активирования TUTase (КаЫе, et al. 1996), в то время как добавление UTP к реакциям U-делеции производит больше частичных продуктов (-1 и -2) и меньше конечного продукта редактирования (-3) (Cruz-Reyes, et al. 1998b, Zheionkina, el al. 2006). Поэтому титрование PPi было проведено как без участия АТФ, чак и при общих реакционных условиях, используя 1шМ АМР-СР и 150 цМ UTP. В результате было обнаружено, что U-делеция ингибируется при 0.1 mM PPi (Рис. 9А), в то время как продукты вставочного редактирования продолжали образовываться даже при 10-кратном увеличении концентрации PPi (Рис. 9В). Эти результаты указывают на то, что разная чувствительность U-делеции и U-вставки к концентрациям PPi, независит от небольшого количества добавляемого АТФ. Важно также отметить, что PPi не оказывает эффекта на две первые стадии обоих циклов редактирования. Так, на Рис. 9D показано, что расщепление мРНК, а затем действие З'-U-

экзонуклеазы не ингнбнруются даже при концентрации PPi до 1.5 шМ. Следовательно, разная

чувствительность U-делеции и U-вставки к PPi отражает третию стадию редактирования сшивание РНК.

mil PPI AMP-CP

UTP

В

- 1 г

-2 -3"

Рнс. 9. 11-делеция и и-всгавка при титровании РР1, ио при общих реакционных условиях.

(А и В) Реакции и-делеции и 11-вставки как описано на Рис К, но с добавлением 11ТР и АМР-Ср и без АТФ. (С) Количественный анализ и-делеции и 11-вставки на панелях А и В, как показано на Рис. 7Б. (О) При анализе З'-Ц-экзо использована 5'-меченая мРНК. Реакции были выполнены как описано на Рнс. 8В, но с использованием РР> для ингибирования стадии сшивания Показано положение расщепленной мРНК (все и), а также потерявшей 0, 1, 2,3 и-нуклеотида. Маркеры - Р1-нуклеазное расщепление той же самой мРНК после С-нуклеотндов; ОН - гидроксильное расщепление.

Таким образом, результаты, полученные при титровании PPi и АТФ обеспечивают двойное доказательство, что для сшивания мРНК в цикле U-делеции необходима РНК-лигаза DREL, а не IREL, в то время как сшивание мРНК в цикле U-вставки катализируется ферментом IREL. Наши выводы были подтверждены количественным анализом при сканировании авторадиограмм с помощью системы FluorChem 8000 Advanced Fluorescence, Chemiluminescence and Visible Light Imaging System с использованием программного обеспечения AlphaEaseFC (Рис. 7Е, 8D, 9С, 10В).

3. Ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования

3.1. DRFT, может функционировать в процессе U-вставки.

В предыдущем разделе было показано, что циклы U-делеции и U-вставки отличаются друг от друга в стадии сшивания. Необходимо отметить, что ранние модели для циклов редактирования рассматривали общее использование каталитических активностей при каждой стадии обоих циклов, т.е. общая эндонуклеаза, З'-и-экзонуклеаза - обратимая активность TUTase и общая лигаза (Hajduk, 1997; Stuart, et al., 1997). Позднее было замечено, что оба цикла редактирования отличаются как на первой, так и на второй ферментативной стадиях (Rusche, el

al. 1997; Cruz-Reyes, et al. 1998a,b; Cniz-Reyes, Zhelonkina, el al. 2001), а именно: для реакций зндоиуклеазного расщепления необходимы разные ко-факторы, a TUTase и 3'-1)-экзонуклеаза используют разные каталитические центры (первая нуждается в UTP, и вторая генерирует UMP). Основываясь на результатах ранних публикаций и наших результатах о DREL и IREL (Cruz-Reyes, Zhelonkina, et al. 2002), мы можем сделать вывод о том, что все три стадии U-делеции и U-вставки имеют отличия.

Однако, даже если U-делеция и U-вставка отличаются друг от друга во всех трех стадиях, существование общего ферментативного комплекса и влияние UTP на U-делецию (Cruz-Reyes, el al. 1996, Rusche, et al. 1997; Cruz-Reyes, el al. 1998b; Zhelonkina et al. 2006) обеспечивает возможность функционального замещения активностей двух типов редактирования. В то же время, из результатов, представленных в предыдущем разделе, до сих пор остается неясным, сшивается ли РНК в процессе U-вставки посредством действия только IREL или в комбинации с DREL при физиологической концентрации АТФ, которая на несколько порядков выше, чем та, которая была использована в наших исследованиях. Так как для функционирования DREL не требует строгих конформационных характеристик (Huang et al., 2001), то возможно, чю эта лигаза может действовать в процессе U-вставки, по крайней мере в отсутствии функционального IREL. Проведение реакций U-вставки в специальных условиях (см. описание к Рис 10) показало, что DREL сшивает расщепленную и редактированную мРНК в системе m vitro при вставочном редактировании (Рис. 10) Итак, если бы DREL мог функционировать вместо IREL iit vivo, то, вероятно, IREL не является значимым белком Интересно отметить, что при использовании РНК-интерференции для имактивирования белка IREL проциклическая форма трипаносом жизнеспособна с уменьшенным, больше чем на 90%, уровнем IREL (О'Неагп el al., 2003). Выделенный мигохондриальный экстракт из этих клеток вместе с контрольным экстрактом был далее очищен от неспецифических ингибиторов цикла U-вставки с помощью скоростного центрифугирования и использован для катализа этого типа редактирования. Результаты эксперимента показали одинаковое накопление продукта-вставки с контрольным экстрактом н с экстрактом из клеток, в которых количество IREL было уменьшено с помощью процесса РНК-интерференции (Рис. 10С). Это означает, что in vivo DREL функционирует в процессе U-вставки, по крайней мере, когда IREL отсутствует. Таким образом, впервые было показано, что активность, относящаяся к одному виду редактирования, т. е. U-делеции, может также функционировать в другом виде редактирования, г.е. U-вставке.

А

В-

С

+

ppi

итр fei м»

■ - l'-ocmiif □ Г вппм ¿'1-KTUEIC

РНК-«

[«ТО), «и

панетн Л

+2 Ъ-

Рис. 10. DREL сшивает расщепленную и редактированную и РНК как in vitro, так и in vivo при вставочном редактировании, когда IREL инактявирован. (А) Титрование АТФ в цикле U-вставка, как на Рис. 7, за исключением, что реакции были пре-инкубированны в течение 45 минут до того, как АТФ было добавлено для активации лигаз. При этой обработке общее количество продуктов U-BciaBKH уменьшилось и практически исчезло при АТФ от 10 до 30 пМ (ср. с Рис. 1С), которые были сшиты лигазой IREL. Следовательно, продукты U-вставки сшиты лигазой, которая нуждается в большем количестве АТФ (100-300 пМ, как на Рис. 7В), т.е. DREL (В) Количественный анализ U-вставки сделан как на Рис 7Е, при нормальных условиях реакции (открытый квадрат), при инактивированин IREL (открытый треугольник, гель на панели А), и U-делеции (закрытый квадрат) Графики для U-вставки и U-лелеции при нормальных условиях реакции взяты из Рис 7С (С) Катализ U-вставки контрольным экстрактом (РНК-и минус) и экстрактом из клеток, в которых IREL был инактивирован с помощью РНК-интерференции (РНК-и плюс) Реакции были выполнены, как описано на Рис 7

3.2. Фермент (J-вставкн (TUTase) функционирует в цикле U-делеции при добавлении ÜTP

Следующий вопрос, который было бы интересно выяснить' могут ли ферментативные активности одного вида редактирования участвовать в другом виде редактирования? Ранее было отмечено, что т vitru UTP влияет на распределение продуктов U-делеции при добавлении фиэиоло! ической концентрации этого нуклеотида в реакционную смесь (Cruz-Reyes, et al., 1996, 1998b). Однако, in vitro обычно UTP не добавляют в реакции U-делеции, хотя UTP является важным in vivo, а также в реакциях U-вставки in vitro (Igo et al., 2000; Cruz-Reyes et al., 2002; Aphasuhev et al, 2003b). Таким образом, было бы интересно выяснить причину влияния UTP на распределение продуктов U-делеции in vitro (Рис. IIA, ср. дорожки 1 и 2). Возникает ли этот эффект UTP в результате ингибирования З'-и-экзонуклеазы или активации TUTase, вынуждая эту активность функционировать в цикле U-делеции? Вероятно, могут существуют другие возможные причины для возникновения этого явления.

Первоначальные исследования показали, что этот эффект наблюдается при физиологическом уровне UTP (Cruz-Reyes et al., 1998а), но не с АТФ, GTP или UMP (Рис. ПА; Cruz-Reyes, Sollner-Webb, 1996). Это говорит о том, что влияние UTP на цикл U-делеции не

возникает в результате образования UMP из UTP, поскольку, UMP ингибирует З'-U-

экзонуклеазу. Таким образом, добавление UTP к реакциям U-делеции способствует либо потере меньшего количества U оснований РНК-субстратом или дополнительному приобретению U оснований этим же субстратом.

Рис. 11. Влияние UTP на реакции U-делецин. (А) Реакции U-делеции были выполнены как на Рис 7, но с добавлением 0 15 mM UTP или UMP, как указано. Использованы 3'-меченая мРНК и немеченая гРНК (Г>32а) (см. Рис. 2А). Числа внизу этого и последующих гелей выражают эффект UTP на U-делеции, который оценивает уменьшение (-3) продукта и накопление частичных продуктов (-2) и (-1): [(Ч/В), - (Ч/В).] / [1 - (Ч/В).]; где «+» и «-» субскрипты указывают на параллельные реакции

————— ............ <(С>) н «без» UTP, Ч и В представляют собой

сумму интенсивности полос Частичных продуктов U-делецин и Всех-частичных и конечных продуктов U-делеции. (В) Реакции были выполнены как на панели А за исключением использования нерадиоактивной мРНК и проанализированы с помощью метода «затравленного» удлинения п рай мера (Seiwert et al, 1994), останавливая удлинение сразу за УР (см. нижнюю панель, где представлена часть последовательности мРНК до УР1 включительно; комплементарная последовательность A6-RT праймера выражена стрелкой; волнистая линия указывает последовательность, которая была образована в процессе «затравленного» удлинения праймера). Реакции в дорожках 1,4 и 2, 3 - дубликаты. Указаны позиции меченого праймера (рг) н продуктов, полученных от изначальной мРНК (-ОЛп), от полностью (-3) и частично (-2, -I) редактированной мРНК. M - маркер, гидроксильиая деградация мРНК. (С) Для анализа левого фрагмента мРНК были использованы 5'- меченая мРНК; немеченая гРНК (D32a), очищенный комплекс, 0.15 шМ UTP и 1 5 шМ PPi. Указаны левый фрагмент мРНК после расщепления (del cut) и фрагменты, образованные при последующем удалении 1,2 или всех трех З'концевых U-нуклеотидов (-1,-2, -3). Маркеры получены при действии Т| РНКазы на мРНК (режет после G) и гидроксидной деградации мРНК (ОН, режет после любого нуклеотида). Нижняя панель - схематическое изображение эксперимента. Указана позиция участка расщепления (del.cul.).

Объяснением накопления удлиненных продуктов при наличии UTP может быть связано с добавлением нуклеотидов к З'-концу мРНК, а не в участке редактирования. Для того чтобы выяснить, в каком месте происходят модификации: в участке редактирования или в 3' конце мРНК, был проведен эксперимент, называемый «затравленное» удлинение праймера (Poison Primer Extension, см. Рис. 11В, нижняя панель). Реакция проводилась в ПЦР амплификаторе с использованием ddTTP нуклеотидов для остановки удлинения праймера сразу после УР в

С Т1 ОН 1 2

- * игр

г?

s

niimi ниш гпж

процессе делении (Рис. 11 В). В результате, было показано, что добавление UTP приводит к изменениям в участке редактирования, а не в З'-конце мРНК.

Добавление UTP к U-делеции может также стимулировать работу лигазы в этом процессе, и тем самым способствовать накоплению частичных продуктов. В этом случае добавление UTP будет способствовать восстанавлению АТФ фосфотрансферазой. Однако, когда мы ингибировали стадию сшивания с помощью PPi, UTP по-прежнему влиял на реакции цикла U-делеции (Рис. 11 С). Следовательно, наблюдаемый эффект UTP проявляется на второй стадии цикла U-делеции, в которой функционирует З'-и-экэонуклеаза или вставочная TUTase.

Чтобы различить, возникает ли UTP эффект в результате ингибирования З'-U-экзонуклеазы или стимулирования активности TUTase, UTP был добавлен с задержкой во времени, а именно, когда З'-и-экзонуклеаэа почти закончила свое действие над субстратом в процессе делеции (Рис. 12). На Рис. 12А представлен эксперимент только второй стадии редактирования. Первая и третия стадии редактирования были инактивированы с помощью предрасщепленного субстрата и PPi, соответственно. Такой предрасщепленный субстрат имитирует участок редактирования после эндонуклеазного расщепления и состоит из трех олигорибонуклеотидов, соответствующих левому и правому расщепленным продуктам мРНК и комплементарной rPHK (Igo el al., 2000,2002а,b; Law el al., 2005; Рис. 12A, нижняя панель,

Рис. 12. Добавление иуклеотидов посредством UTP, следуемое после U-удаления З'-IJ-экэонуклеазой. В этих PPi-содержащих реакциях UTP было добавлено с задержкой во времени, как указано; звездочкой обозначено время остановки реакции. (А) Указаны S'-меченый левый олигорибонуклеогид (5' ín) и молекулы, потерявшие I, 2 или все 3 3'-концевые U-нуклеотиды Дорожка (in) содержит изначальный олигорибонуклеогид без комплекса. (В) U-делеция как на Рис ПС, за исключением того, что UTP было добавлено после 30 мин. инкубирования без UTP. Изначальное инкубирование необходимо для зндонуклеазного и 3'-U-экзонуклеазного действия.

субстрат основан на натуральной мРНК А6 и активной rPHK D33" (Рис. 2А, Cruz-Reyes et а/., 2001)). В этом случае без добавления UTP к реакциям в течение первых 3-х минут более 90% молекул потеряли все З'-концевые U-нуклеотиды в силу действия активности З'-и-экзонуклеазы (Рис. 12А, дорожка 1). Затем UTP было добавлено к параллельным реакциям, и инкубирование

В

31 U аффшг 66 03 «г отжл.

лом i i г

* UTPUTP »

* аг

_* ж

spsf

М М гффтг 82 (Л ст вкл.

реакционных смесей продолжалось в течение еще дополнительного времени (Рис. I2A, дорожки 2 и 3), в результате чего размер большинства молекул увеличился на 1-2 нуклеотида. Таким образом, добавление UTP к реакции U-делеции не вызывает ингибирование активности З'-U-экзонуклеазы.

Так как комплекс редактирования может узнавать предрасщепленный субстрат по-другому, чем природный нерасщепленный субстрат, вышеописанный эксперимент был повторен с нерасщепленным субстратом и с добавлением PPi для ингибирования стадии сшивания (Рис. 12В). В этом случае UTP было опять добавлено с задержкой, после того как З'-и-экзонуклеаза удалила все U-нуклеотиды с З'-конца продукта расщепления. Было показано накопление удлиненных продуктов, происходящее в результате добавления U-нуклеотидов. В очищенном комплексе редактирования TUTase является единственной активностью, которая добавляет U-нуклеотиды. На основании этою мы заключили, что эффект UTP обеспечивается в результате действия TUTase в участке делении, что способствует образованию частичных продуктов в этом цикле.

Известно, что в митохондриях трипаносом находятся два TUTase энзима: 108 kDa (Aphasizhev et al., 2002, 2003b; Ernst et al., 2003; O'Heam et al., 2003), ответственный за созревание олиго-U-XBocra rPHK, и 57 kDa (Aphasizhev et al., 2003b; Ernst et al., 2003), ответственный за U-вставку при редактировании мРНК. Поэтому следующей нашей задачей было выяснить, какая TUTase вовлечена в катализ наблюдаемого изменения накопления продуктов U-делеции при добавлении UTP в реакционные смеси. Основная часть TUTase р 108 из митохондриального экстракта седиментирует при 8S (Aphasizhev et а1, 2002, СНеагп et al, 2003, Zhelonkina et al., 2006), в этой же фракции находится свободная от комплекса редактирования З'-и-экзонуклеаза, тогда как сам комплекс редактирования седиментирует при 20S (Rusche et al, 1997). При использовании 8S фракции для катализа предрасщепленной реакции U-делеции с добавлением UTP никакого эффекта UTP не наблюдалось (Рис. 13А). Этот результат, во-первых, подтверждает заключение, что UTP в реакции U-делеции не способствует ингибированию З'-U-экзонуклеазы, а, во-вторых, указывает на то, что TUTase р108 не поддерживает эффект, связанный с UTP. В наших экспериментах мы также использовали экстракты, в которых либо специфичная TUTase 57 kDa (Zhelonkina et al., 2006), либо TUTase 108 kDa были инактивированы с использованием РНК-интерференции (Aphasizhev et al., 2002) Когда катализ U-делеции проходил с митохоидриальным экстрактом, в котором белок р!08 был инакгивирован

А 05 Фя*. в Р«« *кет- С - Ь-Ш —экстракт о Кон b-lli экстракт

- + U TP - + UTP - - + U TP + ♦ U TP

О эффект -60 эффакт

.02 экстракт

10 ст. олсл.

01 ст олсл

Рис. 13. Эффект UTP вовлекает TUTase цикла U-вставки. (А) PPi-содержащие реакции с предрасщеплеиным субстатом для U-делеции были выполнены как на Рис. 12А, но с использованием 8S фракции мнтохондриалыюго экстракта, содержащей свободную 3'-1)-экзонуклеазу и лик р!08 TUTase, а не р57 TUTase комплекса редактирования. (В) Использование TUTase. Реакции U-делеции были выполнены как на Рис. 11А, но с использованием митохондриального экстракта из клеток, эхспрессирующмх РНК-интерференции к pl08 TTJTase. (С) Эффект UTP зависит от функционирования специфичной TUTase. PPi-содержащие реакции с предрасщеплеиным субстатом для U-делеции были выполнены как на панели А, но с использованием клеточного экстракта, выделенного из клеток, жспрессирующих РНК-интерференции к белку II (b-Ili, Law el al 2005). (D) Контрольные реакции U-вставки с использованием предрасщепленного субстрата для U-вставки (Igo et al, 2000), используя экстракт как на панели С. Указаны 5'-меченыК левый олнгорибонуклеотид (5'in) и продукты U-добавлеиия +1 и +2.

с помощью РНК-интерференции (Aphasizhev el al, 2002), то эффект, связанный с UTP, наблюдался (Рис. 13В). Однако, этот эффект не наблюдался при катализе реакции U-делеции (Рис. 13С) экстрактом, в котором специфичное действие TUTase р57 было ингибировано, как показано в реакции U-вставки, в которой вставочное редактирование действительно не происходит (Рис. 13D, дорожка 2). Итак, результаты наших экспериментов указывают на то, что TUTase р57, являясь активностью редактирования U-вставка, катализирует также добавление U-нуклеотидов в цикле U-делеции в присутствии UTP в реакционных смесях. Необходимо заметить, что TUTase р57 добавляет U-нуклеотиды в цикле U-делеции также активно (Рис. 14А), как и в предназначенном для действия этого фермента в цикле U-вставки (Рис. 14В). Таким образом, эффект UTP является характерной чертой большинства активных комплексов редактирования, и, следовательно, не представляет собой просто побочную реакцию.

Основываясь на факте, что физиологическая концентрация UTP способствует действию TUTase в циклах U-делеции, катализируемых клеточным экстрактом, митохондриальным экстрактом (Рис. 13В, Cruz-Reyes el al., 1996) или очищенным комплексом редактирования (Рис. II, 12, 14), можно предположить, что TUTase также функционирует в циклах U-делеции in vivo. Так как сшивание происходит быстрее in vivo, чем in vitro, и З'-и-экзонуклеаза работает быстрее

(Рис. 14С), чем TUTase, то кинетически все это должно способствовать полному U-удапению в большей части участков делении. Однако, когда была проанализирована РНК in vivo, то неполностью редактированные молекулы составили неожиданно большее количество и в основном в участках делении (Feagin el al., 1988; Sturm el al, 1990; Decker and Sollner-Webb, 1990). Это предполагает, что полное удаление U-нуклеотидов In vivo происходит медленно (Sturm el al., 1990), а так как 3'-11-экзонуклеаза функционирует очень быстро (Рис. I2A, 14С), то, следовательно, что-то другое замедляет U-делецню in vivo, возможно TUTase, которая добавляет U-нуклеотиды после действия З'-и-экзонуклеазы и до сшивания мРНК, как было продемострировано в этой работе in vitro.

В

Т1 ОН 1 2

.43 аффект

03 ст откп

9

- + УТР

rss

Ш+г

„. -*i Jß?*»"* -¡SS ikoJS__cul

.62 эффект

01 CT откп

Рис. 14. Действие TUTase в большинстве циклов U-делеции. (А) Эффективность TUTase в реакциях U-делеции т vitro PPi-содержащие реакции были выполнены как на Рис. 1IC. (В) Эффективность TUTase в реакциях U-вставки in vitro PPi-содержащие реакции использовали активную гРНК I47G (Рис 5В) и катализированы очищенным ферментативным комплексом, как на панели А, но не содержат АМР-Ср. Указаны позиция 5'-меченой мРНК после расщепления в участке вставочного редактирования (ins cut) и удлиненные продукты на I и 2 U-нуклеотида. (С) Быстрая З'-и-экзонуклеаза. PPi-содержащие реакции U-делеции были выполнены как на Рис. I2A, за исключением того, что отсутствал UTP и время ингибирования было 10 секунд.

Давно замеченная, но до сих пор необъясненная ассиметрия процесса редактирования, в котором 90% участков редактирования являются U-вставки и только 10% - U-делеции (Feagin et al., 1988; Blum et at., 1990), вероятно, отображает эволюционное предпочтение первому процессу перед вторым. Возможно, это происходило, чтобы лимитировать обширное образование частичных продуктов, вызванное действием TUTase.

Таким образом, несмотря на то, что в целом процессы U-делеции и U-вставки отличаются на всех трех стадиях каждого цикла, в данной работе впервые было показано, что ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также

функционировать в другом виде редактирования. Ото указывает на то, что белковый комплекс, ответственный за редактирование мРНК в митохондриях Т brticei, не обладает теми функциональными ограничениями, представления о которых были сформулированы до наших исследований.

ВЫВОДЫ

1 Выявлены элементы гидРНК, в механизме пост-транскрипционного редактирования мРНК в митохондриях Trypanosoma brtteei необходимые для эффективного цикла делеции: якорный дуплекс между З'-концевым участком мРНК и 5'-участком гидРНК; неспаренные основания, прилегающие к участку редактирования; элементы гидРНК для стабилизации расщепленного 5'-участка пре-мРНК.

2 Впервые продемонстрировано, что РНК-лигаза для делеционного редактирования (DREL) абсолютно необходима для сшивания мРНК в процессе U-делеции, тогда как РНК-лигаза для вставочного редактирования (IREL) функционирует только в цикле U-вставки.

3. С помощью РНК-интерференции показано, что DREL может заместить IREL в цикле U-вставки при инактивировании гена, ответственного за IREL, тогда как IREL не обладает такой замещающей функцией.

4 Впервые показано, что при обеспечении физиологического уровня UTP TUTase, являясь белком вставочного редактирования, также функционирует и в цикле U-делеции до стадии сшивания.

5 На примере DREL и TUTase впервые было показано, что ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования, указывая на то, что белковый комплекс, ответственный за редактирование пре-мРНК в митохондриях Trypanosoma brucei, не обладает теми функциональными ограничениями, представления о которых были сформулированы до наших исследований.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

I. Cruz-Reyes J., Zhelonkina A.G.. Rusche L., Sollner-Webb В. (2001) Trypanosome RNA editing: simple guide RNA features enhance U deletion 100-fold. Mol Cell Biol. 21: 884-892.

2 Huang C., Cruz-Reyes J., Zhelonkina A.G.. O'Hearn S., Wirtz E., Sollner-Webb B. (2001) Roles for ligases in the RNA editing complex of Trypanosoma bnicei: band IV is needed for U-delction. EMBO J. 20:4694-4703.

3. Sollner-Webb В., Cruz-Reyes J., Zhelonkina A.G.. and Huang C. (2001) RNA editing in Trypanosomes. Encyclopedia of Genetics. (Sydney Brenner, Jeffrey H. Miller and Jeffrey К. Miller, eds.). Academic Press, NY. p. 143-145.

4. Cruz-Reyes J., Zhelonkina A.G.. Huang C., Sollner-Webb B. (2002) Distinct functioas of two RNA ligases in active Trypanosoma brucei RNA editing complexes. Mol Cell Biol. 22: 46524660. [Первых два автора являются первыми со-авторами]

5. O'Hearn S., Huang С., Hemann М., Zhelonkina A.G.. Sollner-Webb В. (2003) Trypanosoma brucei RNA editing complex: band 11 is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Mol Cell Biol. 23: 7909-7919.

6. Zhelonkina A.G.. O'Hearn S., Law J., Cruz-Reyes J., Huang C., Alatortsev V.S., and Sollner-Webb B. (2006) T. brucei RNA editing: action of U-insertional TUTase within U-deletion cycle. RNA. 12:224-235.

Тезисы материалов конференций:

1. Cruz-Reyes J., Zhelonkina A.G., Rusche L. and Sollner-Webb B. (1999) U deletional and U-msertional RNA editing in T. brucei utilizes strikingly different gRNA determinants. Molecular Parasitology Meeting 10. p. 56.

2. Cruz-Reyes J., Zhelonkina A.G., Rusche L., and Sollner-Webb B. (2000) RNA editing in Trypanosoma brueei: all three mechanistic steps of U deletion and U insertion utilize different enzymatic activities. The Fifth Annual Meeting of the RNA Society, p. 170.

3 Cruz-Reyes J., Zhelonkina A.G, and Sollner-Webb B. (2000) RNA editing in Trypanosoma biucei: mRNA cleavage and З'-U-exonuclease but not RNA ligase are strongly modulated by single strand character of few mRNA and gRNA residues abutting the U-deletion site. Molecular Parasitology Meeting 11. p. 25.

4. Cruz-Reyes J., Zhelonkina A.G. and Sollner-Webb B. (2001) U deletion and U insertion use separate RNA ligases; hence their editing pathways differ at all three basic steps. The Sixth Annual Meeting of the RNA Society, p. 195.

5. O'Hearn S., Huang C., Cruz-Reyes J, Zhelonkina A.G. and Sollner-Webb B. (2001) Characterization of the mitochondrial RNA editing proteins in Trypanosoma brucei. The Sixth Annual Meeting of the RNA Society, p. 423.

Подписано в печать 24.04.2006 Формат 60x^4 1/16 Печл 1

Заказ №56 Бумага офсетная, «Огр/м2 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 3

löGGb

10 677

»10677

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Желонкина, Алевтина Геннадьевна

Список принятых сокращений Введение

Практическая ценность работы

Научная новизна работы

Публикации и апробация работы

Вклад автора

Глава 1. Обзор литературы «Пост-транскрипционное редактирование мРНК»

1.1. Виды редактирования

1.2. Трипаносомы - возбудители сонной болезни 15 % 1.3. Особенности клеточной структуры и генома трипаносом

V 1.4. Эволюция редактирования РНК

1.5. РНК, направляющие редактирование мРНК

1.6. Механизм редактирования - модели ранние и модель современная

1.7. Ферменты, катализирущие редактирование мРНК в трипаносомах, образуют комплекс

1.8. Идентификация компонентов ферментативного комплекса редактирования

1.9. Циклы U-делеции и U-вставки

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Реактивы

2.2. Ферменты

2.3. Изотопы 40 ") 2.4. Материалы

2.5. Матрицы, использованные в реакциях ПЦР

2.6. Олигонуклеотиды и олигорибонуклеотиды

2.7. Линия трипаносом

2.8. Среда и условия выращивания Т. brucei 43 ^ 2.9. Антитела для иммуноблотинга

2.10. Растворы

2.11. Методы

2.11.1. Выделение митохондриального экстракта из Т. brucei и его дальнейшая очистка

2.11.2. Конструирование плазмид для трансформации

2.11.3. Проведение трансформации

2.11.4. Характеристика экстрактов с помощью Норзерн и Вестерн блот анализов

• 2.11.5. Получение мРНК и гРНК

V, 2.11.6. Мечение и секвенирование полученных РНК

2.11.7. Полный цикл реакций редактирования

2.11.8. Анализ «затравленного» удлинения праймера

2.11.9. Анализ двух первых стадий в обоих циклах редактирования

2.11.10. Подтверждение формирования дуплекса между мРНК и гРНК

2.11.11. Предрасщепленный анализ редактирования

2.11.12. Проведение анализа аденилирования

2.11.13. Количественный анализ

Глава 3. Результаты и обсуждения

3.1. Критичные элементы гРНК для редактирования мРНК

3.2. Функции РНК-лигаз комплекса редактирования

3.3. Ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования 73 3.3.1. DREL может функционировать в процессе U-вставки

3.3.2. Фермент U-вставки (TUTase) функционирует в цикле U-делеции при добавлении UTP ^ 3.4. Заключение

Выводы ■* Список публикаций

Благодарности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пост-транскрипционное редактирование мРНК в Trypanosoma brucei на примере мРНК митохондриальной аденозинтрифосфатазы-6"

Открытие в конце 80-х годов редактирования РНК еще раз заставило изменить наши взгляды на реализацию генетической информации в клетке, « постулированной Уотсоном и Криком, где закодированная в ДНК информация л транскрибируется в РЖ, которая в свою очередь транслируется в f 0 функциональный белок. Редактированием РНК (editing) называются изменения в последовательности РНК на посттранскрипционном уровне. В настоящее время, РНК-редактирование рассматривается, как сложный процесс генной экспрессии, с помощью которого организм может увеличить число синтезируемых белков без увеличения числа генов в геноме (Simpson, L. и

• Shaw, J., 1989).

При изучении экспрессии гена цитохром оксидазы, а именно субъединицы II в ^ трипаносомах, было впервые замечено, что последовательность РНК, соответствующая этому гену, не совпадает с кодирующей ее ДНК (Benne et al., 1986). С тех пор процессы редактирования были обнаружены у разных эукариот. Редактированию подвергаются РНК разного типа: матричные, транспортные, рибосомальные (Backus et al., 1992; Stuart et al., 1997; Одинцова M.C., Юрина Н.П., 2000; Masanori Kugita et al., 2003; Flomen et al., 2004). Те гены, РНК которых проходят через процесс редактирования, называются криптогенами (Simpson, L. и v# Shaw, J., 1989). Некоторые транскрипты криптогенов подвергаются лимитирующей модификации последовательности, другие - подвергаются такому массивному г изменению, что их кодирующая последовательность становится очевидной только после редактирования.

Целью настоящей работы являлось исследование пост-транскрипционного механизма редактирования мРНК в митохондриях Т. brucei на примере А редактирования пре-мРНК субъединицы-6 аденозинтрифосфатазы (А6). В связи с этим необходимо было решить следующие задачи: ^ 1. Изучить, какие элементы гРНК являются критичными для эффективности процессов редактирования мРНК.

2. Определить роль белков IV и V основного ферментативного комплекса в обоих циклах редактирования пре-мРНК как при вставке так и при удалении Ui нуклеотидов.

3. Выяснить состоит ли комплекс редактирования из двух физически отдельных субкомплексов, ответственных за катализ либо U-вставки, либо U-делеции, и происходит ли перекрывание ферментативных активностей между двумя отдельными активными центрами комплекса, если таковые существуют.

Актуальность представленной работы, прежде всего, заключается в том, что изучение процесса редактирования мРНК поможет прояснить тонкие механизмы ^ созревания РНК в клетке.

Практическая ценность работы

Так как сложившиеся подходы для борьбы как с человеческим (сонная болезнь), так и животным (болезнь Нагана) трипаносомиазисом потерпели неудачу, определение новых аспектов биохимии и молекулярной биологии трипаносом может способствовать выявлению новых мишеней для создания более эффективных вакцин и поиску лечебных препаратов.

Научная новизна работы Впервые установлены характеристики гРНК, которые являются критичными для направления эффективного редактирования in vitro.

С учетом критичных элементов были сконструированны новые гРНК in vitro, которые способствовали получению высокого выхода редактированного продукта, составившего в этом случае более 60% от нередактированной мРНК, что является значительным увеличением по сравнению с 1% в случае с природной гРНК.

Белки IV и V являются первыми двумя белками основного ферментативного комплекса, роль которых была определена в процессе редактирования пре-мРНК:

- белок IV абсолютно необходим для сшивания РНК в процессе U-делеции, и поэтому был назван DREL (Deletion RNA Editing Ligase - РНК-лигаза для редактирования посредством делеции);

- белок V функционирует специфически в цикле U-вставки, и, следовательно, был назван IREL (Insertion RNA Editing Ligase - РНК-лигаза для редактирования посредством вставки).

- DREL также может заместить IREL в цикле U-вставки при инактивировании с помощью РНК-интерференции гена, ответственного за IREL, тогда как IREL не обладает такой замещающей функцией.

Впервые показано, что TUTase, являясь ферментативной активностью вставочного редактирования, также функционирует в цикле U-делеции при обеспечении физиологического уровня UTP.

Несмотря на то, что процессы U-делеции и U-вставки отличаются на всех трех этапах каждого цикла, впервые было показано, что ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования, указывая на то, что белковый комплекс, ответственный за редактирование пре-мРНК в митохондриях Т. brucei, не обладает теми функциональными ограничениями, которые были приняты ранее.

Публикации и апробация работы

По материалам работы опубликованы 6 статей и тезисы 5 докладов. Результаты работы были представлены на нескольких международных конференциях и симпозиумах: "Molecular Parasitology meeting" (Marine Biological laboratory Woods Hole, Massachusetts, USA - in 1999, 2000, 2002), "The Fifth Annual Meeting of the RNA Society" (University of Wisconsin, USA - 2000), "The Sixth Annual Meeting of the RNA Society" (Banff, Alberta, Canada - 2001), "Tetra-State Trypanosome Meeting"

Rockefeller University, USA - 2002, 2003, 2004). А также на трех коллоквиумах Департмента Биологической Химии в Johns Hopkins University, School of Medicine, ^ Baltimore, USA, трижды на семинарах "Parasitology Club" JHU, School of Medicine,

Baltimore, USA и дважды на "Biology Club" в JHU, Homewood, Baltimore, USA. v Вклад автора

Основные эксперименты были проведены автором. Часть работы, связанная с трансформацией клеток в Т. brucei, а именно: приготовление зондов, трансформация и выделение клеточного лизата из клеточных клонов, - была выполнена в сотруднечестве с доктором Ш. О'Хёрном, и Д. JIo (Johns Hopkins University, США).

• Работа выполнена при финансовой поддержке Public Health Service, грант за номером GM34231 от General Medical Science Institute, США.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Желонкина, Алевтина Геннадьевна

выводы.

Выявлены элементы гидРНК, в механизме пост-транскрипционного редактирования мРНК в митохондриях Trypanosoma brucei необходимые для эффективного цикла делеции: якорный дуплекс между 3'-концевым участком мРНК и 5'-участком гидРНК; неспаренные основания, прилегающие к участку редактирования; элементы гидРНК для стабилизации расщепленного 5'-участка пре-мРНК.

Впервые продемонстрировано, что РНК-лигаза для делеционного редактирования (DREL) абсолютно необходима для сшивания мРНК в процессе U-делеции, тогда как РНК-лигаза для вставочного редактирования (IREL) функционирует только в цикле U-вставки.

С помощью РНК-интерференции показано, что DREL может заместить IREL в цикле U-вставки при инактивировании гена, ответственного за IREL, тогда как IREL не обладает такой замещающей функцией.

Впервые показано, что при обеспечении физиологического уровня UTP TUTase, являясь белком вставочного редактирования, также функционирует и в цикле U-делеции до стадии сшивания.

На примере DREL и TUTase впервые было показано, что ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования, указывая на то, что белковый комплекс, ответственный за редактирование пре-мРНК в митохондриях Trypanosoma brucei, не обладает теми функциональными ограничениями, представления о которых были сформулированы до наших исследований.

3.4. Заключение

До нашей работы было известно, что TUTase р57 функционирует только в циклах U-вставки, и не было показано, что хотя бы одна активность целого комплекса редактирования могла функционировать как в U-делеции, так и в U-вставке. Нами были получены результаты, подтверждающие то, что добавление Л

UTP к реакциям U-делеции приводит к образованию более длинных продуктов, т.е. наблюдается эффект UTP. Одной из задач данного исследования было выяснить: возникает ли это явление в результате ингибирования З'-и-экзонуклеазы или активирования TUTase? Мы показали, что эффект UTP осуществляется в участке редактирования U-делеции (Рис. 17D), влияет на модификацию мРНК до стадии Ф сшивания после частичного удаления U нуклеотидов (Рис. 18), и возникает этот эффект UTP в результате активирования TUTase р57, а не ингибирования З'-U-экзонуклеазы. Более того, только функционирующий белок вставочного редактирования - TUTase р57 - добавляет U также в цикле U-делеции. Таким образом, TUTase комплекса редактирования действует не только в U-вставке, но и в U-делеции при редактировании мРНК.

Несмотря на то, что трипаносомы нуждаются в точно редактированном транскрипте, было показано in vivo, что более чем 90% мРНК в Г. brucei является неправильно редактированной (Decker and Sollner-Webb, 1990). Это означает, что редактирование in vivo проходит с высоким уровнем ошибок. Ранее было показано, что частичные продукты делеции способствуют повторному редактированию, пока г точное редактирование не будет достигнуто (Cruz-Reyes and Sollner-Webb, 1996). Необходимость повторного редактирования может замедлить процесс U-делеции (Cruz-Reyes and Sollner-Webb, 1996). Действительно, при исследованиях частично редактированной мРНК в L. tarentolae, было обнаружено, что in vivo точное редактирование делеционного участка происходит дольше, чем редактирование вставочного участка (Sturm and Simpson, 1990). Более того, in vivo блоки нетипичного редактирования часто начинаются в природных участках делеции, где вставлены дополнительные U-нуклеотиды (Sturm and Simpson, 1990). Эти вставки катализируются ферментом TUTase. Добавленные U-нуклеотиды способствуют присоединению гРНК, которая запускает ошибочное редактирование (Sturm et al., 1992; Kable et al., 1996). Давно замеченная, но до сих пор необъясненная ассиметрия процесса редактирования, в котором 90% участков редактирования являются U-вставки и только 10% - U-делеции (Feagin et al., 1988; Blum et al., 1990), вероятно, отображает эволюционное предпочтение первому процессу перед вторым. Возможно, это происходило из-за накопления частичных продуктов, образующихся в результате действия TUTase. Все это позволяет нам заключить, что TUTase процесса U-вставки может также функционировать в процессе U-делеции in vivo.

TUTase может действовать не только после делеционного расщепления и полного удаления U (Рис. 19А,С), но также и до того, как З'-и-экзонуклеаза закончила свое действие (Рис. 19D). После действия TUTase происходит сшивание мРНК. Поскольку частичные продукты U-делеции не обладают точным мостом сшивания, они будут сшиваться лигазой DREL, а не лигазой IREL, которой необходим точный мост сшивания между мРНК с гРНК (Igo et al., 2000, 2002а; Cruz-Reyes et al., 2002). Таким образом, действие TUTase обеспечивает дополнительную стадию, которую РНК субстрат делеции проходит до и после других стадий процесса U-делеции (Рис. 24). Наличие «смешанного» цикла редактирования говорит о том, что вставочный и делеционный субкомплексы не разделяют РНК субстраты. Скорее всего, ферментативный комплекс обеспечивает один эффективный путь редактирования для РНК, в котором белки комплекса редактирования конкурируют за обладание субстратом на основании их кинетических параметрах и/или аффинном связывании.

U-делеция без UTP:

R У

ADP ^ эндо ■RUoh^ v^rnri 3'

-и-экзо

U-делеция с UTP вовлекает TUTase: и банд-IV)

DREL лигаза

N 11

RUoh

TUTase

H 5

П^ГГГГ^

Полный продукт U-делеции банд-IV) XDREL Т лигазг

5'Л лигаза

5'

Частичный продукт U-делеции

U-вставка с UTP:

73'

ADP эндо

RUoh . .

•■- рТ~П~Т"л3 банд-V) f

IREL лигаза

Щ—RUj-r-T-T-Va'

Полный продукт U-вставки

Рис. 24. Пересмотренная схема механизма редактирования. Левая и правая колонки этой схемы представлены и объяснены на Рис. 7. Средняя колонка является заключением анализа, в котором добавление UTP влияет на циклы U-делеции, генерируя частичные продукты и вовлекая вставочную TUTase в процесс U-делеции. 4

Возможно, TUTase не является единственной активностью комплекса редактирования, которая фукционирует, как в U-делеции, так и в U-вставке. Так например, мы показали, что DREL необходим для сшивания в U-делеции, тогда как IREL эффективно сшивает U-вставку. В то же время, мы показали, что при ^ инактивировании белка IREL с помощью механизма РНК-интерференции, DREL сшивает продукты U-вставки (Рис. 16). В настоящий момент неизвестно, может ли i

DREL сшивать в цикле U-вставки в неповрежденном комплексе, но эта лигаза, возможно, является еще одним компонентом комплекса, который может функционировать в обеих формах редактирования. Также позволительно строить гипотезу, что З'-и-экзонуклеаза, будучи активностью процесса U-делеции, может функционировать в U-вставке для удаления экстра U нуклеотидов, которые могут • быть добавлены ферментом TUTase (Igo et al., 2002b; McManus et al., 2000).

Таким образом, несмотря на то, что в целом процессы U-делеции и U-вставки отличаются на всех трех стадиях каждого цикла, в данной работе впервые было показано, что ферментативная активность, относящаяся к одному виду редактирования, может также функционировать в другом виде редактирования. Это указывает на то, что белковый комплекс, ответственный за редактирование мРНК в митохондриях Т. brucei, не обладает теми функциональными ограничениями, представления о которых были сформулированы до наших исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Желонкина, Алевтина Геннадьевна, Балтимор(Baltimore)

1. Дейчман, A.M. (1999) Редактирование РНК // Обзор, 14.

2. Микрюков, К. А. (1993) Зоология // Москва.

3. Одинцова М.С., Юрина Н.П. (2000) Редактирование РНК в хлоропластах и митохондриях растений // Физиология растений, 47: 307-320.

4. Сайт всемирной организации здоровья (W.H.O) // № 259, 2001.

5. Alfonzo, J. D., Blanc, V., Esteves, A. M., Rubio, M. A., and Simpson, L. (1999) С to U editing of the anticodon of imported mitochondrial tRNA(Trp) allows decoding of the UGA stop codon in Leishmania tarentolae // EMBO J., 18(24): 7056-7062.

6. Allen, Т.Е., Heidmann, S., Reed, R., Myler, P.J., Gdringer, H.U., and Stuart, K.• (1998) Association of guide RNA binding protein gBP21 with active RNA editingcomplexes in Trypanosoma brucei И Mol. Cell. Biol., 18: 6014-6022.

7. Alsford S, Wickstead B, Ersfeld K, Gull K. (2001) Diversity and dynamics of the minichromosomal karyotype in Trypanosoma brucei II Mol Biochem Parasitol., 113(1): 79-88.

8. Aphasizhev, R., Aphasizheva, I., Nelson, R., Gao, G., Simpson, A., Kang, X., Falick, A., Sbicego, S., Simpson, L. (2003a) Isolation of a U-insertion/deletion editing complex from Leishmania tarentolae mitochondria // EMBO J., 22(4), 913-924.

9. Aphasizhev, R., Aphasizheva, I., Simpson, L. (2003b) A tale of two TUTases // PNAS, 100(19), 10617-10622.

10. Backus, J.W., Smith, H.C. (1992) Three distinct RNA sequence elements are required for efficient apolipoprotein В (apoB) RNA editing in vitro // Nucleic Acids Res, 20 (22), 6007-14.

11. Bakalara N., Simpson A. M. and Simpson L. (1989) The Leishmania kinetoplast-mitochondrion contains terminal uridylyltransferase and RNA ligase activities // J Biol Chem., 264(31), 18679-18686.

12. Bass, B.M. (1993) RNA editig: New uses for old players in the RNA world. In the RNA world // Gesteland, R. F., Atkins, J. F. (ed), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p. 383.

13. Benne, R., Van den Berg, J., Brakenhoff, J., Sloof, P., Van Boom, J., and Tromp, M. (1986) Major transcript of the frameshifted coxll gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA // Cell, 46, 819.

14. Bhat, G. J., Koslowsky, D. J., Feagin, J. E., Smiley, B. L., and Stuart, K. (1990) An extensively edited mitochondrial transcript in kinetoplasteds encodes a protein homologous to ATPase subunit 6 // Cell, 61, 885-894.

15. Blom D., de Haan a., van den Berg M., Sloof P., Jirkul M., Lukesl J. and Benne R. (1998) RNA editing in the free-living bodonid Bodo saltans // Nucleic Acids Research, 26(5), 1205-1213.

16. Blum B, Bakalara N, and Simpson L. (1990a) A model for RNA editing in kinetoplastid mitochondria: "guide" RNA molecules transcribed from maxicircle DNA provide the edited information // Cell, 60(2): 189-98.

17. Blum В., and Simpson, L. (1990b) Guide RNAs in kinetoplastid mitochondria have a nonencoded 3' oligo(U)tail involved in recognition of the preedited region // Cell, 62: 391-397.

18. Blum, В., Sturm, N.R., Simpson, A.M., Simpson, L. (1991) Chimeric gRNA-mRNA molecules with oligo(U) tails covalently linked at sites of RNA editing suggest that U addition occurs by transesterification // Cell, 65(4): 543-550.

19. Borst P. (1986) Discontinuous transcription and antigenic variation in tiypanosomes // Annu Rev Biochem., 55: 701-32.

20. Burgess, M., Heidmann, S., Stuart, K. (1999) Kinetoplast RNA editing does not require the terminal 3' OH of the gRNA terminus but can inhibit in vitro U insertion //RNA, 5: 883-892.

21. Byrne E.M., Cornell G.J., Simpson L. (1996) Guide RNA-directed uridine insertion RNA editing in vitro // EMBO J., 15(23): 6758-6765.

22. Casey T.M., Dufall K.G, Arthur P.G. (1999) An improved capillary electrophoresis method for measuring tissue metabolites associated with cellular energy state // Eur J Biochem., 261(3): 740-745.

23. Cavalier-Smith T. (1997). Cell and genome coevolution: facultative anaerobiosis, glycosomes and kinetoplastan RNA editing // Trends Genet., 13: 6-9.

24. Cech, T. (1991) RNA editing: world's smallest introns? I I Cell, 64: 667-669.

25. Cross G.A.M. (1975) Identification, purification and properties of clone-specific glycoprotein antigens constituting the surface coat of Trypanosoma brucei II Parasitology, 71: 393-417.

26. Cross G.A.M. (1990) Glycolipid anchoring of plasma membrane proteins // Annu. Rev. Cell Biol., 6: 1-39.

27. Cruz-Reyes J., and Sollner-Webb B. (1996) Trypanosome U-deletional RNA editing involves guide RNA-directed endonuclease cleavage, terminal U exonuclease, and RNA ligase activities//PNAS, 93(17): 8901-8906.

28. Cruz-Reyes J, Rusche LN, Sollner-Webb B. (1998a) Trypanosoma brucei U insertion and U deletion activities co-purify with an enzymatic editing complex but are differentially optimized //Nucleic Acids Res. 26(16): 3634-3639.

29. Cruz-Reyes J., Rusche L.N., Piller K.J., Sollner-Webb B. (1998b) T. brucei RNA editing: adenosine nucleotides inversely affect U-deletion and U-insertion reactions at mRNA cleavage // Mol Cell., 1(3): 401-409.

30. Cruz-Reyes, J., Zhelonkina, A. G., Rusche, L., and Sollner-Webb B. (2001) Trypanosome RNA Editing: Simple Guide RNA Features Enhance U Deletion 100Fold // Mol. Cell. Biol., 21: 884-892.

31. Cruz-Reyes, J., Zhelonkina, A., Huang, C., and Sollner-Webb, B. (2002) Distinct functions of two RNA ligases in active T. brucei RNA editing complexes // Mol. Cell Biol., 22: 4652-4660. The first two authors are co-first authors.

32. Das, A. and Bellofatto, V. (2003) RNA polymerase II-dependent transcription in trypanosomes is associated with a SNAP complex-like transcription factor // PNAS, 100(1): 80-85.

33. Decker, C.G., Sollner-Webb, B. (1990) RNA editing involves indiscriminate U changes throughout precisely defined editing domains // Cell, 61: 1001-1011.

34. Donelson, J., Gardner, M., and El-Sayed, N. (1999) More surprises from Kinetoplastida // PNAS, 96: 2579-2581.

35. Drozdz M, Palazzo SS, Salavati R, O'Rear J, Clayton C, Stuart K. (2002) TbMP81 is required for RNA editing in Trypanosoma brucei И EMBO J., 21(7): 1791-1799.

36. Ernst, N., Panicucci, В., Igo, R.P., Jr., Panigrahi, A.K., Salavati, R., Stuart, K. (2003) TbMP57 is a 3' terminal uridylyl transferase (TUTase) of the Trypanosoma brucei editosome // Mol. Cell., 11: 1525-1536.

37. Estevez A. M., Simpson L. (1999) Uridine insertion/deletion RNA editing in trypanosome mitochondria a review // Gene, 240: 247-260.

38. Fairlamb A.H. (1990) Novel biochemical pathways in parasitic protozoa // Parasitol, 99S: 93-112.

39. Feagin, J. E., Abraham J., and Stuart, K. (1988) Extensive editing of the cytochrome с oxidase III transcript in Trypanosoma brucei II Cell, 53: 413-422.

40. Flomen R, Knight J, Sham P, Kerwin R, MakojfA. (2004) Evidence that RNA editing modulates splice site selection in the 5-HT2C receptor gene // NAR, 32(7), 21132122.

41. Gibson, W., Bailey, M. (2003) The development of Trypanosoma brucei within the tsetse fly midgut observed using green fluorescent trypanosomes // Kinetoplastid Biol. Dis., 2 (1), 1-13.

42. Gilinger, G. and Bellofatto, V. (2001) Trypanosome spliced leader RNA genes contain the first identified RNA polymerase II gene promoter in these organisms // Nucleic Acids Research, 29(7), 1556-1564.

43. Goringer, H.,U., Koller, J., and Shu, H. (1995) Multicomponent complexes involved in kinetoplastid RNA editing // Parasitol. Today, 11,265-267.

44. Gott, J., Visomirski, L., and Hunter, J. (1993) Substitutional and insertional RNA editing of the cytochrome с oxidase subunit 1 mRNA of Physarum polycephalum // J. Biol. Chem., 268: 25483-25486.

45. Gott, J., and Emeson, R. (2000) Functions and Mechanisms of RNA Editing // Ann. Rev. Genet., 34:499-531.

46. Harlow, E., and Lane, D. (1988) Antibodies: a laboratoiy manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

47. Harris M.E., Moore D. R., and Hajduk S. M. (1990) Addition of uridines to edited RNAs in trypanosome mitochondria occurs independently of transcription // J Biol Chem., 265(19): 11368-11376.

48. Harris M.E., Decker C., Sollner-Webb В., and Hajduk, S. (1992) Specific cleavage of pre-edited mRNAs in tiypanosome mitochondrial extracts // Mol Cell Biol., 12(6), 2591-2598.

49. Hajduk, S. (1997) Defining the editing 'reaction' // Trends Microbiol., 5, 1-2.

50. Hajduk, S.L., and Sabatini, R.S. (1998) Mitochondrial mRNA editing in Kinetoplastid protozoa. Modification and Editing of RNA // Chapter 21, 377-393.

51. Hoare, C. (1972) The Trypanosomes of mammals: a zoological monograph // Oxford, Blackwell Scientific Pub. p.749.

52. Huang, С., Cruz-Reyes, J., Zhelonkina, A., O'Hearn, S., Wirtz, E. and Sollner-Webb, B. (2001) Roles for the ligases in the RNA editing complex of T. brucei: band IV is needed for U-deletion and RNA repair // EMBO J., 20: 4694-4704.4 k

53. Huang, C.E., O'Hearn, S.F., and Sollner-Webb, B. (2002) Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein // Mol

54. Cell Biol., 22(9): 3194-3203.

55. Igo, R.P., Jr., Palazzo, S.S., Burgess, M.L., Panigrahi, A.K., Stuart, K. (2000) Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of the kinetoplastid insertion RNA editing // Mol. Cell. Biol., 20: 8447-8457.

56. Igo R.P., Jr., Lawson S.D., Stuart K. (2002a) RNA sequence and base pairing effects on insertion editing in Trypanosoma brucei // Mol Cell Biol., 22(5): 1567-1576.

57. Koslowsky D.J., Yahampath G. (1997) Mitochondrial mRNA 3' cleavage/polyadenylation and RNA editing in Trypanosoma brucei are independent events // Mol Biochem Parasitol., 90(1): 81-94.

58. Kapushoc, S., Simpson, L. (1999) In vitro uridine insertion RNA editing mediated by cis-acting guide RNAs II RNA, 5: 656-669.

59. Kapushoc, S.T., Alfonzo, J. D., Rubio, M. A., and Simpson, L. (2000) End processing ^ precedes mitochondrial importation and editing of tRNA in Leishmania tarentolae II

60. The Journal of Biolog. Chem., 275 (48): 37907-37914.

61. Landweber L.F. (1992) The evolution of RNA editing in kinetoplastid protozoa // BioSystems, 28:41-45.

62. Landweber L.F. and Gilbert W. (1994) Phylogenetic analysis of RNA editing: A primitive genetic phenomenon // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 91: 918-921.

63. Law, J., Huang, C., O'Hearn, S., and Sollner-Webb, B. (2005) In Trypanosoma brucei RNA editing, band II enables recognition specifically at each step of the U insertion cycle //Mol. and Cell Biol., 25, p. 2785-2794.

64. Lonergan, К. M., and M. W. Gray. (1993) Editing of transfer RNAs in Acanthamoeba castellani mitochondria // Science, 259: 812-816.

65. Leung, S. S., and Koslowsky D. J. (2001) Interactions of mRNAs and gRNAs involved in trypanosome mitochondrial RNA editing: structure probing of an mRNA bound to its cognate gRNA // RNA, 7(12), 1803-1816.

66. Madison-Antenucci, S., Sabatini, R.S., Pollard, V.W., Hajduk, S.L. (1998) Kinetoplastid RNA-editing-associated protein 1 (REAP-1): a novel editing complex protein with repetitive domains // EMBO J., 17: 6368-6376.

67. Madison-Antenucci S., Hajduk S.L. (2001) RNA editing-associated protein 1 is an RNA binding protein with specificity for preedited mRNA // Mol Cell. 7(4), 879-886.

68. Madison-Antenucci, S., Grams, J., Hajduk, S. L. (2002) Editing machines: the complexities of Trypanosome RNA editing // Cell, 108: 435-438.

69. Masanori Kugita, Yuhei Yamamoto, Takeshi Fujikawa, Tohoru Matsumoto and Koichi Yoshinaga. (2003) RNA editing in hornwort chloroplasts makes more than half the genes functional //Nucleic Acids Res, 31 (9): 2417-2423.

70. Maslov D. A. and Simpson L. (1992) The polarity of editing within a multiple gRNA-mediated domain is due to formation of anchors for upstream gRNAs by downstream editing//Cell, 70: 459-467.

71. Maslov, D. A., Avila, H. A., Lake, J. A., Simpson, L. (1994) Evolution of RNA editing in kinetoplastid protozoa // Nature (London), 369: 345-348.

72. McConville, M.J., Turco, S.J., Ferguson, M.A., Sacks, D.L. (1992) Developmental modification of Lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania majorШpromastigotes to an infections stage // EMBO J., 11: 3593-3600.

73. McManus, M., Adler, В., Pollard, V. and Hajduk, S. (2000) T. brucei guide RNA > poly(U) tail formation is stabilized by cognate mRNA // Mol, Cell Biol. 20: 883-891.

74. McManus, M.T., Shimamura, M., Grams, J., Hajduk, S.L. (2001) Identification of candidate mitochondrial RNA editing ligases from Trypanosoma brucei // RNA., 7(2): 167-175.

75. Missel A., Souza A.E., Norskau G., Goringer H.U. (1997) Disruption of a gene encoding a novel mitochondrial DEAD-box protein in Trypanosoma brucei affects edited mRNAs //Mol Cell Biol. 17(9): 4895-48903.

76. Moore, M., Sharp, P. (1992) Site-specific modification of pre-mRNA: 2' hydroxyl group at the splice site // Science, 256: 992-997.

77. Moore, A., Mercer, J., Dutina, G., Donahue, C., Ryll, T. (1997) Effects of * ® temperature shift on cell cycle, apoptosis and nucleotide pools in CHO cell batchcultures // Cytotech, 23: 47-54.

78. Muller U.F., Lambert L., Goringer H.U. (2001) Annealing of RNA editing substrates facilitated by guide RNA-binding protein gBP21 // EMBO J. 20(6): 1394-13404.

79. O'Hearn, S.F., Huang, C.E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb B. (2003) Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical andmaintains band V ligase, which is nonessential // Mol Cell Biol., 23(21): 7909-7919.

80. Panigrahi, A., Gygi, S., Ernst, N., Igo, R., Stuart, Kf et al (2001) Association of two novel proteins, TbMP52 and TbMP48, with the T. brucei RNA editing complex //

81. Mol. Cell Biol. 21: 380-389.

82. Panigrahi, A., Schnaufer, A., Ernst, K, Salavati, R., Stuart, K. et al (2003) "> Identification of novel components of Trypanosoma brucei editosomes // RNA. 9:484.492.

83. Pays, E., Lips, S., Nolan, D., Vanhamme, L., Perez-Morga, D. (2001) The VSG expression sites of Trypanosoma brucei: multipurpose tools for the adaptation of the parasite to mammalian hosts. Mol. Biochem // Parasitol., 114 (1), 1-16.

84. Pollard, V.W., Harris, M.E., Hajduk, S.L. (1992) Native mRNA editing complexes from Trypanosoma brucei mitochondria // EMBO J., 11(12):, 4429-4438.

85. Read, L.K., Myler, P. J., Stuart, K. (1992) Extensive editing of both processed and preprocessed maxicircle CR6 transcripts in Tiypanosoma brucei // J Biol Chem., 267(2): 1123-8.

86. Rusche L.N., Piller K.J., Sollner-Webb B. (1995) Guide RNA-mRNA chimeras, ® which are potential RNA editing intermediates, are formed by endonuclease and

87. RNA ligase in a trypanosome mitochondrial extract // Mol Cell Biol., 15(6): 29332941.

88. Rusche, L.N., Cruz-Reyes, J., Piller,K.J. and Sollner-Webb,B. (1997) Purification of a functional enzymatic editing complex from Trypanosoma brucei mitochondria // EMBO J., 16: 4069-4081.

89. Rusche LN, Huang CE, Piller KJ, Hemann M, Wirtz E, Sollner-Webb B. (2001) The two RNA ligases of the Trypanosoma brucei RNA editing complex: cloning the essential band IV gene and identifying the band V gene // Mol Cell Biol., 21(4): 979989.

90. Sabatini R., Hajduk S.L. (1995) RNA ligase and its involvement in guide RNA/mRNA chimera formation. Evidence for a cleavage-ligation mechanism of Trypanosoma brucei mRNA editing // J Biol Chem., 270(13):7233-7240.

91. Schnaufer, A., Ernst, N.L., Palazzo, S.S., O'Rear, J., Salavati, R. and Stuart, K. (2003) Separate insertion and deletion subcomplexes of the Trypanosoma brucei RNA editing complex // Moll. Cell., 12: 307-319.

92. Seiwert, S.D., Stuart, K. (1994) RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro // Science, 266(5182): 114-117.

93. Seiwert S.D., Heidmann S., Stuart K. (1996) Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing // Cell., 84(6): 831-841.

94. Shapiro T.A., EnglundP.T. (1995) The structure and replication of kinetoplast DNA // Annu Rev Microbiol., 49: 117-143.

95. Simpson L. (1986) Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates // Int Rev Cytol., 99,119-79.t

96. Simpson, L., Thiemann, O. #., Savill, N. J., Alfonzo, J. D., and Maslov D. A. (2000). Evolution of RNA editing in trypanosome mitochondria // PNAS, 97 (13), 69866993.

97. Simpson, L., Sbicego, S. and Aphasizhev, R. (2003) Uridine insertion/deletion RNA

98. Ф editing in trypanosome mitochondria: a complex business // RNA, 9: 265-276.

99. Simpson L, Aphasizhev R, Gao G, Kang X. (2004) Mitochondrial proteins andicomplexes in Leishmania and Trypanosoma involved in U-insertion/deletion RNA editing//RNA., 10(2), 159-170.

100. Sollner-Webb (1991) RNA editing // Curr. Opin. Cell Biol, 3, 1056-1061

101. Stich, A., Abel, P.M., Krishna, S. (2002) Human African trypanosomiasis // British Med. Journal, 203-206.

102. Stich, A., Barret, M.P. and Krishna, S. (2003) Waking up to sleeping sickness // TRENDS in Parasitology, 19 (5), 195-197.

103. Stuart, K., Allen, Т. E., Heidmann, S., and Seiwert, S. D. (1997) RNA editing inkinetoplastid protozoa//Microbiol, and Molec. Biol. Reviews, 61 (1): 105-120.

104. Stuart, K, Panigrahi, A.K (2002) RNA editing: complexity and complications // Mol Microbiol., 45(3): 591-596.

105. Sturm, N.R., Simpson, L. (1990) Kinetoplast DNA minicircles encode guide RNAs for editing of cytochrome oxidase subunit III mRNA // Cell., 61(5), 879-884.

106. Sturm, N.R., Maslov, D.A., Blum, В., Simpson, L. (1992) Generation of unexpected editing patterns in Leishmania tarentolae mitochondrial mRNAs: misediting produced by misguiding // Cell, 70(3): 469-76.

107. Traut, T.W. (1994) Physiological concentrations of purines and pyrimidines // Mol Cell Biochem., 140(1): 1-22.

108. Van der Ploeg, L.H.T. (1987) Control of variant surface antigen switching in trypanosomes // Cell, 51: 159-161.

109. Vickerman, K. (1985) Developmental cycle and biology of pathogenic . trypanosomes // Br. Med. Bulletin, 41, 105-114.

110. Vickerman, K., Tetley, L., Hendry, К. A. K„ and Turner, С. M. R. (1988) Biology of African trypanosomes in the tsetse fly // Cell, 64, 109-119.

111. Wang, Z.J., Morris, M.E. Drew, and Englund, P.T. (2000) Inhibition of Trypanosoma brucei gene expration RNA interference using an integratable vector with opposing T7 promoters //J. Biol. Chem., 275: 40174-40179.

112. Wirtz, E., Ноек, M., and Cross, G.A. (1998) Regulated processive transcription of cromatin by T7 RNA polymerase in Trypanosoma brucei II Nucleic Acid Res., 26: 4626-4634.

113. Wirtz, E, Leal, S., Ochatt, С., and Cross, G.A. (1999) A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Mol. Biochem // Parasitol., 99: 89-101.

114. Zhelonkina A.G., O'Hearn S., Law J., Cruz-Reyes J., Huang C., Alatortsev VS., and Sollner-Webb B. (2006) T. brucei RNA editing: action of U-insertional TUTase within U-deletion cycle // RNA. 12(3): 476-487.