Популяционные характеристики эритроцитов в норме и патологии; фильтрационно-осмотические методы исследования деформируемости

Лисовская, Ирина Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Популяционные характеристики эритроцитов в норме и патологии; фильтрационно-осмотические методы исследования деформируемости
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Популяционные характеристики эритроцитов в норме и патологии; фильтрационно-осмотические методы исследования деформируемости"

На правах рукописи

ЛИСОВСКАЯ Ирина Львовна

ПОПУЛЯЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭРИТРОЦИТОВ В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ; ФИЛЬТРАЦИОННО-ОСМОТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЕФОРМИРУЕМОСТИ.

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ОА Азизова, доктор медицинских наук, профессор ЕА. Лукина, доктор биологических наук, профессор Н.Н. Фирсов

Ведущая организация:

Физический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «_»_2004 г. в_час.

На заседании диссертационного совета Д 001.042.02 при Государственном учреждении-Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук по адресу: 125167 Москва, Новозыковский пр., д. 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат биологических наук

В.Д. Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Микроциркуляторное русло, включающее совокупность сосудов диаметром от 2 до 200 мкм, является конечным звеном сердечно-сосудистой системы, в котором осуществляется транскапиллярный обмен, обеспечивающий необходимый для жизни тканевой гомеостаз. Поскольку диаметр капилляров микроциркуляции сравним с размерами эритроцитов, первостепенное значение в этом процессе приобретает их деформируемость, т.е. способность изменять форму под действием внешних сил.

В норме исключительно высокая деформируемость эритроцитов является результатом оптимальных соотношений физических и геометрических параметров клеток. Изменение этих соотношений при различных патологических состояниях и повреждающих воздействиях может приводить к ухудшению реологических свойств крови и нарушению периферического кровоснабжения, способствуя усугублению патологических процессов. Кроме того, пониженная деформируемость связана с укороченным временем циркуляции эритроцитов в кровотоке при гемолитических анемиях.

Среди методов исследования деформируемости эритроцитов одно из важнейших мест занимают фильтрационные методы, основанные на изучении особенностей протекания (фильтрации) суспензий эритроцитов через фильтры, с порами диаметром 3-5 мкм. В настоящее время существует много модификаций фильтрационных методов. Однако часто исследователи получают трудносопоставимые результаты из-за отсутствия единых методических подходов, а также из-за проблем в интерпретации полученных данных. Обычно деформируемость (фильтруемость) эритроцитов характеризуют единственным показателем, что позволяет говорить только об относительном снижении или повышении деформируемости по сравнению с нормой. При этом не представляется возможным (1) выяснить, какие конкретно клеточные параметры ответственны за наблюдаемые изменения и (2) охарактеризовать с в о и т о в

в исследуемой крови. Тем самым снижается информационная ценность измерений деформируемости.

Измеряемые фильтрационными методами показатели являются интегральными, т.е. зависят сразу от нескольких клеточных параметров (объема клетки, отношения площади поверхности к объему, внутриклеточной вязкости, механических свойств мембраны). Кроме того, исследование реологических свойств эритроцитов с помощью фильтрационных методов существенно осложняется неоднородностью популяции эритроцитов. Вместе с тем характер этой неоднородности может служить важнейшим источником дополнительной информации, в частности иметь диагностическое и прогностическое значение. Нарушения в системе микроциркуляции при многих заболеваниях и экстремальных состояниях могут быть следствием изменения характера распределений эритроцитов по параметрам, влияющим на фильтруемость.

Проводя фильтрационные исследования, в некоторых случаях можно наблюдать снижение фильтруемости суспензий эритроцитов, происходящее в результате ухудшения деформируемости всех или большинства эритроцитов. Однако такое же или большее снижение фильтруемости может наблюдаться при сохранении реологических свойств основной массы эритроцитов, если в крови появляются даже небольшие примеси (субпопуляции) плохо деформирующихся клеток. До настоящего времени не существовало фильтрационных методов, позволяющих оценить относительное влияние отдельных геометрических и механических факторов на деформируемость эритроцитов. Не существовало также способов оценивать с помощью фильтрационных методов вклад отдельных субпопуляций в реологические свойства крови или суспензии эритроцитов, а значит, определять механизмы их изменения при тех или иных условиях in vitro или in vivo. Поэтому теоретическая и экспериментальная разработка фильтрационных методов для количественной оценки популяционных характеристик эритроцитов в крови (распределения эритроцитов по реологическим параметрам) является актуальной задачей и имеет большое теоретическое и практическое (диагностическое и прогностическое) значение

Цель исследования - создание и апробация фильтрационных методов, позволяющих определять механические и геометрические характеристики эритроцитов, а также оценивать характер распределения эритроцитов по реологически значимым параметрам.

Задачи исследования

1 Создать математические модели фильтрации суспензий эритроцитов через мембранные фильтры.

2 Разработать и изготовить фильтрационные устройства для исследования суспензий эритроцитов.

3 Использовать фильтрационно-осмотические методы для изучения популяционных характеристик эритроцитов в норме, при некоторых воздействиях и патологических состояниях.

4 Исследовать изменения популяционных характеристик эритроцитов при старении клеток in vivo и при изменении кальциевого гомеостаза эритроцитов in vitro.

Научная новизна. На основе математических моделей прохождения через калиброванные поры однородных и неоднородных суспензий эритроцитов впервые предложен фильтрационно-осмотическй метод (ФИОМ) для определения механических и геометрических параметров эритроцитов, а также характера распределения эритроцитов по реологически значимому параметру- критической осмотичности.

Разработаны и изготовлены два типа фильтрометров для оценки реологических свойств эритроцитов: фильтрометр ИДА-01, позволяющий измерять с точностью до 0.1 или 0.01 сек относительную скорость протекания фиксированного малого объема суспензии эритроцитов через мембранный фильтр с калиброванными порами (Патент РФ № 2052194) и кинетический фильтрометр ИДА-03, позволяющий регистрировать зависимость объема протекающей через фильтр жидкости (буфера или суспензии эритроцитов) от времени.

Предложен алгоритм обработки экспериментальных кинетических фильтрационных кривых, позволяющий, используя ФИОМ, с помощью кинетического фильтрометра ИДА-03 оценивать средние параметры исследуемой суспензии эритроцитов (параметры центра распределения) и

определять распределение эритроцитов в исследуемой суспензии по критической осмотичности.

С помощью фильтрационно-осмотических методов измерения деформируемости в сочетании с исследованием распределения эритроцитов по плотности получена новая информация о свойствах гетерогенных популяций эритроцитов в норме, при различных воздействиях in vitro и при некоторых патологических состояниях.

Исследованы изменения популяционных характеристик эритроцитов при старении клеток in vivo и при изменении кальциевого гомеостаза эритроцитов in vitro.

Сформулирована гипотеза об определяющей роли внутриклеточного свободного кальция в регуляции объема эритроцитов в процессе их циркуляции in vivo.

Теоретическое и практическое значение результатов исследования заключается в том, что были разработаны и изготовлены два типа фильтрометров для оценки реологических свойств эритроцитов в норме и патологии. Разработан фильтрационно-осмотический метод для количественной оценки популяционных характеристик эритроцитов в крови (распределения эритроцитов по реологически значимому параметру-критической осмотичности), позволяющий найти новые подходы при решении ряда научных задач в области физиологии клетки, усовершенствовать диагностику и прогноз при различных видах патологии, а также оценивать эффективность препаратов, применяемых в терапии.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на следующих конференциях:

Российский научный симпозиум «Экологические факторы и кроветворение». Москва 1992; II съезд биофизиков России, Москва, Россия, 1999; Вторая международная конференция «Микроциркуляция и гемореология» Ярославль-Москва, Россия, 1999; XI Meeting of the European Association for Red Cell Research. Ljubljana, Slovenia, 1997; 10-th International Congress of Biorheology, Pecs, Hungary, 1999; 12-th Meeting of the European Association for Red Cell Research. Abstracts. Germany, Otzenhausen 1999; 11th International Congress of Biorheology and 4th International Conference on Clinical Hemorheology. Antalya,

Turkey, 2002; 14-th Meeting of the European Association for Red Cell Research, Roscoif, France, 2003.

Результаты исследований опубликованы в 36 печатных работах в России и за рубежом.

• Соавторы: Ф.И. Атауллаханов, В.М. Витвицкий, РА. Кульман, Е.Г. Тужилова, И.Б. Гончаров, ВА. Аграненко, СВ. Колодей, В.М. Нестеренко, Ю.М. Розенберг, Е.С. Шурхина, Н.В. Цветаева, Морозов В.В, Радаев СМ., Остапченко Д.А., Степанова И.И., Бирюкова Л.С, Еременко Л.Л.ДСолошейнова Т.И., Ковалева Л.Г., Левина АА,Шайтан К.В., Щербинина СП.Д1обков А.Ф., Тимофеев И.Б., Чижов АА.,Терешкин Э.В., Кузнецов СВ.,Яковенко Е.Е., Мамукова Ю.И., Тутаева В.В.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалрв и методов, описание собственных результатов исследований, заключение, выводы, практические рекомендации и список цитированной литературы. Объем работы составляет 198 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 70 рисунками. Список цитированной литературы содержит 487 литературных источника (37 отечественных и 450 зарубежных). Работа выполнена в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. профессор Атауллаханов Ф.И.) Гематологического Научного Центра РАМН (директор академик А.И.Воробьев).

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Фильтрометр ИДА-01 (Патент РФ № 2052194) и кинетический фильтрометр ИДА-03 представляют собой фильтрационные устройства, позволяющие эффективно исследовать реологические свойства суспензий эритроцитов в норме, при различных патологиях и воздействиях.

2) Предложенные математические модели адекватно описывают процессы фильтрации суспензий эритроцитов через калиброванные поры.

3) Применение фильтрационно-осмотических методов исследования деформируемости эритроцитов позволяет получать важную информацию о популяционных характеристиках эритроцитов в эксперименте и клинической практике.

4) В процессе физиологического старения in vivo эритроциты сохраняют постоянное отношение площади поверхности к объему. При этом сферичность у старых эритроцитов выше, чем у молодых клеток. Ширина распределения по критической осмотичности достоверно больше в популяции старых эритроцитов

5) Регуляция объема эритроцитов в крови опосредована изменением концентрации внутриклеточного свободного кальция Са,.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика материала и методов исследования

Суспензии эритроцитов готовили из крови здоровых доноров или больных, взятой на гемоконсервантах ГПД, ЦГФ, ACD, CPD-A или на гепарине. Использовали также предназначенные для трансфузий эритроциты разных сроков хранения и размороженные криоконсервированные эритроциты. В работе исследовали эритроцитную массу, эритроциты, отмытые от тромбоцитов и лейкоцитов (ЭМОЛТ), криоконсервированные отмытые от криопротекторов эритроциты. Все среды заготавливались с помощью стандартных методов на станции переливания крови ГНЦ РАМН. Эритроцитную массу и ЭМОЛТ хранили в условиях банка крови при 4 град. С» При криоконсервировании использовались два вида криопротекторов: пропандиол (ПДС) и глицерин. Размороженные отмытые эритроциты, хранили в условиях банка крови при 4 град. С не более 1-3 суток.

В качестве контроля использовали эритроциты из донорской крови, взятой в день измерений. Эритроциты осаждали и дважды отмывали физиологическим раствором или HEPES-буфером-! (10 мМ HEPES, 5 мМ КС1, 140 мМ NaCl, pH 7.40, 300 мОсм), каждый раз удаляя надосадочную жидкость и верхний слой осажденных клеток, обогащенный тромбоцитами и лейкоцитами. Третий раз эритроциты отмывали НЕРЕ8-буфером-2 (20 мМ HEPES, 5 мМ КС1, 133-128 мМ NaCl, pH 7.40, 300 мОсм) или Трис-буфером (40 мМ Трис-НС1,130 мМ NaCl, 5 мМ КС1, рН=7.4) и ресуспендировали их в

том же буфере, получая исходную суспензию с гематокритом 50-70%. Содержание лейкоцитов составляло не более 0.5 на 1000 эритроцитов. Время, от приготовления суспензии до начала измерений не превышало 2 часов.

Все измерения проводились в течение суток после взятия крови и в течение трех часов после отмывки эритроцитов, кроме опытов, где специально изучали консервированные и криоконсервированные эритроциты. В ходе эксперимента исходная суспензия находилась при комнатной температуре. Непосредственно перед измерением суспензию разбавляли и инкубировали при температуре измерения.

Все растворы после приготовления фильтровали через фильтры фирмы Millipore с диаметром пор 0.22 мкм. Осмотичность растворов определяли с помощью криоскопического осмометра ОМКА-Щ-01 с погрешностью не хуже 1 мОсм.

Для оценки эффективности трансфузий (ЭТ) определяли количество гемоглобина в переливаемой дозе эритроцитов. Вычисляли ожидаемый прирост концентрации гемоглобина в крови больного (ДНС раляа). Измеряли концентрацию гемоглобина в крови больного до и через 24 часа. после - трансфузии. Определяли • реальный прирост концентрации гемоглобина в крови больного через сутки после трансфузии (ДНСреальн). Выражали ЭТ Как [(ДНСрсалшУ АНС расчета.]* Ю0%.

Методы модификации эритроцитов

Обработку эритроцитов глутаровым альдегидом (Г-А) осуществляли следующим образом. К суспензии эритроцитов в HEPES-буфере (Hct = 6-8%) добавляли Г-А в конечной концентрации 0.012-0.025%. Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 20-30 минут, после чего трижды отмывали их десятикратным объемом 10 мМ раствора глицина и ресуспендировали в этом же буфере.

Загрузку эритроцитов кальцием осуществляли тремя разными способами: (i) путем инкубации в кальций-содержащих средах с кальциевым ионофором А23187, (и) с ингибитором кальциевого насоса ортованадатом натрия и (ш) путем истощения клеток по АТФ.

Для фракционирования эритроцитов по плотности использовали метод Linderkamp and Meiselman (Linderkamp О., 19 82) в нашей модификации. Отмытые эритроциты ресуспендировали в аутологичной

плазме при Hct ~80 %. Суспензию помещали в пластиковые пробирки длиной 47 мм и диаметром 4 мм и центрифугировали при 5400 g в течение 40 мин. После этого отбирали 40 мкл самых верхних клеток (top cells). Затем дно пробирки срезали и отбирали 40 мкл клеток у самого дна пробирки (bottom cells). Полученные таким способом самые легкие и самые тяжелые клетки ресуспендировали в HEPES-6y<J>epe-2 с добавлением 10% плазмы. Каждая фракция содержала около 8 % от общего количества клеток. Кроме того, использовали метод фракционирования, основан ный на использовании одноступенчатого градиента плотности перкола (Macki L.H.,1987)

Фильтрационные измерения.

Для проведения фильтрационных измерений были разработаны фильтрометры двух типов.

Филыпрометр ИДА-01.

Одним из наиболее простых и удобных способов оценки фильтруемости эритроцитов является измерение скорости протекания небольшого фиксированного объема разбавленных суспензий через мембранные фильтры с цилиндрическими порами диаметром 3-5 мкм. Фильтруемость суспензии обычно определяют по отношению представляют собой время протекания через фильтр ресуспендирующей среды (буфера) и исследуемой суспензии, соответственно. Для оценки фильтруемости эритроцитов был разработан и сконструирован фильтрометр ИДА-01 (Патент РФ № 2052194). На рисунке 1 изображена схема фильтрометра ИДА-01.

1 -о

тгтг

Рисунок 1. Схема фильтрометра ИДА-01

Фильтрометр ИДА-01 позволяет измерять с точностью до 0.1 сек или 0.01 сек время протекания через мембранный фильтр 250 мкл буфера или суспензии с помощью датчика, вмонтированного в крышку, закрывающую заполненную колонку. Датчик представляет собой систему из трех игольчатых электродов разной длины, связанных с электронным измерителем времени. Отсчет времени запускается в начале вытекания жидкости и прекращается после вытекания 250 мкл. Поскольку средняя скорость протекания суспензии через фильтр обратно пропорциональна времени прохождения через этот фильтр фиксированного объема суспензии, фильтруемость определяли как отношение ^^ В некоторых опытах

определяли индекс фильтруемости как

Кинетический фильтрометр ИДА-03.

С целью, усовершенствования фильтрационных измерений было создано устройство ИДА-03, предназначенное для измерения объема жидкости (буфера или суспензии), протекающей через фильтр при

Последовательно соединенные части прибора: колонку, измерительную трубку и бак заполняют физиологическим раствором. В горизонтальной трубке находится пузырек воздуха который ее полностью перекрывает. На колонку сверху устанавливается фильтр, который фиксируется с помощью ячейки. Ячейку заполняют суспензией и, открывая кран 7, запускают фильтрацию. Перепад давления на фильтре в процессе фильтрации обеспечивается благодаря разности уровней жидкости в ячейке и в баке и составляет 1.50 ± 0.05 см Н2О. Изменение объема протекшей через фильтр жидкости в зависимости от времени осуществляют методом оптического сканирования положения пузырька в трубке при помощи ПЗС-матрицы с частотой опроса 900 Гц и пространственным разрешением 10 точек/мм. Информация поступает в компьютер, где программно определяется зависимость скорости движения пузырька от времени.

Экспериментальные кривые, полученные с помощью кинетического фильтрометра, представляют собой зависимость вытекшего объема жидкости от времени. По экспериментальным кривым вычисляют зависимость скорости фильтрации суспензии эритроцитов от времени и нормируют ее на скорость протекания буфера. Скорость фильтрации определяют как тангенс угла наклона прямой регрессии, проведенной через фиксированное количество точек. Объемная скорость протекания буфера через фильтр составляла 4±0.06мкл/с при давлении 150 Па и температуре

25 °С. При такой скорости фильтрации временное разрешение для дискретных значений объема, прошедшего через фильтр, составляло 0.023 сек.

На рисунке 3 приведены типичные кривые зависимости объема (а) и нормированной скорости фильтрации (б) от времени, а также зависимости нормированной скорости фильтрации от прошедшего через фильтр объема суспензии (с). Представлены кривые для эритроцитов донора и эритроцитов больной аутоиммунной гемолитической анемией (АИГА) после гемолитического криза. Из рисунка 3 видно что с самого начала фильтрации скорость фильтрации суспензии ниже, чем скорость фильтрации буфера.

треугольники соответствуют донорским эритроцитам, а темные ромбы - эритроцитам больной ЛИГА после гемолитического криза; а -зависимость объема жидкости, прошедшей через фильтр, от времени фильтрации б- зависимость от времени относительной скорости фильтрации, с - зависимость скорости фильтрации от объема суспензии прошедшей через фильтр. Сплошными линиями обозначены аппроксимирующие кривые.

Если аппроксимировать зависимость скорости фильтрации от объема, прошедшего сквозь фильтр, к нулевому объему, то полученное значение будет соответствовать скорости, с которой бы фильтровалась суспензия, если бы в ней не было забивающих фильтр клеток. Для описания экспериментальных кривых использовали математические модели, связывающие кинетику фильтрации суспензии эритроцитов через фильтр и распределение клеток по времени прохождения эритроцитов через поры фильтра.

В случае суспензии, состоящей из нескольких субпопуляций эритроцитов, зависимость скорости ее протекания через фильтр от времени описывается суммой экспонент, причем их число равно числу субпопуляций. В пределах точности эксперимента эта зависимость хорошо описывается суммой не более чем трех экспонент. Экспериментальную зависимость протекшего через фильтр объема суспензии от времени Vsusp(t), аппроксимировали, используя программу «Origin», функцией

1где Qt - объемная скорость протекания буфера через фильтр,

А, и t|. - варьируемые коэффициенты.

Относительную скорость прохождения эритроцитов основной субпопуляции через пору фильтра определяли по формуле

где vj -скорость протекания буфера через пору; wc -скорость прохождения эритроцитов через пору; Quo ~Qt-A/ -стационарная скорость протекания- суспензии. По фильтрационным кривым определяли также процентное содержание Z% клеток, которые не проходят через фильтр за время эксперимента («нефильтрующихся» клеток). При протекании через

фильтр объема суспензии (Vol), в котором содержится число «нефильтрующихся» клеток, равное числу пор на фильтре (No), скорость течения суспензии обращается в ноль. Зная концентрацию клеток з суспензии (с), можно определить процентное содержание нефильтрующихся клеток по формуле:

Z%=100xNo/(Volxc)

Фильтрационные измерения проводили, используя мембранные фильтры на основе полиэтилентерфталатной пленки толщиной 7 мкм и средним диаметром пор 3.1 мкм (ОИЯИ, Дубна, РФ),

Рисунок 4. Мембранный фильтр производства Объединенного института ядерных исследований (ОИЯИ, Дубна). Диаметр пор 3 мкм, толщина пленки 7 мкм.

а также фильтры фирмы Nuclepore с диаметром пор 3 мкм и Nickel-Mesh «Sokken» фильтры (Nakamura Т., 1994) (Рисунок 5)

Рисунок 5. Никелевый фильтр с идентичными порами производства фирмы Sokken (Япония).

Другие методы исследования

Распределение эритроцитов по плотности измеряли с помощью фталатного метода (Danon D, Mankovsky Y., 1964).

Везикуляцию оценивали по ацетилхолинэстеразной активности (Ellmann G ,1961). Активность измеряли в профильтрованной через фильтр Nuclepore с диметром пор 0 45 мкм надосадочной жидкости после осаждения эритроцитов

Средний объем эритроцитов, содержание гемоглобина, концентрацию клеток в суспензии и другие гематологические показатели определяли с помощью спектрофотометра и кондуктометрического гемоанализатора Cobas Micros (La Roche).

Статистическая обработкарезультатов. U

Обработка результатов выполнена методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стыодента. Различия выборок считали достоверными при р< 0 05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка фильтр ационно-осмотическихметодов.

Известно, что эритроциты в крови характеризуются непрерывными распределениями по площади поверхности, объему, количеству и концентрации гемоглобина и другим параметрам. Степень гетерогенности популяции эритроцитов (характер распределений эритроцитов по различным параметрам) является высокоинформативным показателем состояния системы крови и организма в целом.

Наиболее доступен и часто используется в диагностических целях такой показатель гетерогенности, как ширина распределения эритроцитов по объему- (RDW), параметр, получаемый с помощью стандартных гемоанализаторов (Akar N., 2002; Viswanath D., 2001). Однако точность определения объема эритроцитов с помощью приборов, основанных на изменении проводимости заполненного электролитом канала при прохождении через него клеток (система Coulter) не очень высока. Кроме того, при различных патологиях и некоторых воздействиях на эритроциты проводимость клеточных мембран может изменяться, внося значительные искажения в оценку распределения эритроцитов по объему.

В последнее время в разных лабораториях активно разрабатываются новые методы, позволяющие получать распределения эритроцитов по тем или иным параметрам (Dobbe J.G., 2002; Gifiord S.C., 2003), однако они, как правило, требуют проведения измерений на многих сотнях индивидуальных клеток и являются поэтому дорогостоящими и трудоемкими.

На основе математических моделей фильтрации однородных и неоднородных суспензий эритроцитов через калиброванные поры нами был разработан фильтрационно-осмотическй метод (ФИОМ) для определения механических и геометрических параметров эритроцитов, а также характера распределения эритроцитов по реологически значимому параметру -критической осмотичности. На первом этапе была создана модель

прохождения одиночного эритроцита через пору при разных значениях осмотичности среды, связывающая относительную скорость эритроцита с его геометрическими и механическими параметрами:

где - объемная скорость протекания буфера через пору фильтра, Н - количество гемоглобина в эритроците, f — коэффициент осмотической чувствительности (параметр в формуле зависимости объема эритроцита Voi осмотичности среды и: V = Н/НЬо + //и, НЬо = 694.4 г/л -предельная концентрация гемоглобина в клетке), Кст — критический объем эритроцита (максимальный объем эритроцита с данной площадью поверхности, при котором эритроцит еще способен пройти через пору с заданными размерами), - параметры, характеризующие влияние вязкости

гемоглобина и механических свойств эритроцита, соответственно, на скорость прохождения эритроцита через пору, = 0.0036 л/г. Модель предсказывает, что зависимость скорости прохождения эритроцита через пору от осмотичности ресуспендирующей среды и имеет максимум в изотонической области и снижается при увеличении или уменьшении осмотичности. В гипотонической области при некотором критическом значении эритроцит достигает критического объема , при котором

скорость фильтрации обращается в ноль из-за геометрических ограничений. При увеличении площади поверхности, при уменьшении содержания гемоглобина и коэффициента осмотической чувствительности значение уменьшается. В гипертонической области при увеличении осмотичности скорость снижается в результате уменьшения объема и соответствующего увеличения внутриклеточной вязкости.

Поскольку содержащиеся в реальной суспензии эритроциты неодинаковы, разные эритроциты перестают проходить через поры при разных значениях осмотичности, т.е. для данного типа фильтров каждая суспензия характеризуется определенным распределением эритроцитов по . Параметры этого распределения (положение максимума и ширина) зависят от соотношения параметров: Н, V и S в клетках исследуемой суспензии.

На рисунке 6 представлены полученные в эксперименте зависимости относительной скорости фильтрации от осмотичности среды для суспензий донорских эритроцитов ((а) Нс1 = 0.1%; (Ь) = 1%)) до и после обработки их глутаровым альдегидом. Значения осмотичности, при которых эти скорости обращаются в ноль, обозначали По(0.1%) и 0^(1%), соответственно.

"О™ и, моем

Рисунок 6. Зависимость относительной скорости фильтрации ¡¡/и от осмотичности среды и для эритроцитов здоровых доноров до (1) и после обработки глутаровым альдегидом в концентрациях (2) 0.012%, (3) 0.019, (4) 0.025%. (а) Яс<=0.1%; (Ь) На = 1%.

Суспензиям интактных эритроцитов с гематокритом Нс1 = 0.1% (рисунок 6а, кривая 1) и 1% (рисунок 6Ъ, кривая 1) в изотонической области соответствуют максимальные значения скорости фильтрации. Из рисунка 6 видно, что ужесточение клеток, снижая скорость фильтрации суспензий в гипертонической области, не изменяет значений П(0.1%) и П(1%). Это свидетельствует о том, что в соответствии с предсказаниями модели, значения мало зависят от вязкости внутриклеточного содержимого и механических свойств мембраны. При этом величина П существенно возрастает с ростом гематокрита.

то 1%)

Рисунок 7. Взаимосвязь между параметрами нормального (Гауссова)' распределения эритроцитов по иа и измеряемыми значениями осмотичности 32(0.1%) и 32(1%). Сплошная линия представляет собой расчетное нормальное интегральное распределение эритроцитов по и„ : М - 184 мОсм, а о = 10 мОсм. Значение и =31(0.1%) мОсм соответствует 2 = 30%, и = П(1 %) соответствует 2 = 3%.

Скорость протекания через фильтр фиксированного объема суспензии (в нашем случае 250 мкл) стремится к нулю, если число нефильтрующихся клеток в этом объеме приблизительно равно числу пор на фильтре. Поскольку в 250 мкл суспезии с гематокритом Н& = 1%* содержится приблизительно 2.5 * 107 эритроцитов, а каждый фильтр в нашем случае содержит пор, то процентное содержание нефильтрующихся

клеток (Х% = 100 * N0/11 %) п р«и=сВ(с%)а в л я е т 2-4%. Если же гематокрит суспензии тех же эритроцитов равен 0.1%, то для перекрывания всех пор фильтра понадобится в 10 раз большее содержание нефильтрующихся клеток (Т.% = 20-40%).. Таким образ о20),1ЭДв и н у т о в гипотоническую по сравнению с П(1%) область. Если гематокрит исследуемой суспензии увеличить, например, до 4%, то величина П еще возрастет: П(4%) > Х1(1 %).

Если принять, что ® при и = П(0.1%) 2 = 30%, а при и = П(1%) Ъ =

3% и что (и) распределение эритроцитов по исг Гауссово, то а [Л(0.1%) - М\ = 0.5 о., где М- центр распределения, а о - SD

Таким образом, если распределение эритроцитов по и „ близко к нормальному, то, определив значения П(0.1%) и 12(1%), можно оценить положение центра и ширину распределения.

о = [П(1 %) - 1X0.1 %)]/1.4

Значения й(0.1%) и П(1 %) можно использовать для оценки вида распределения эритроцитов по и „ и в том случае, когда распределение не является строго нормальным. Осмотичность и = П(0.1%) приблизительно соответствует критической осмотичности основной субпопуляции, а разность можно использовать в качестве грубой оценки

ширины распределения по> и сг. При необходимости можно уточнить форму распределения с помощью дополнительных измерений Н при других значениях гематокрита.

Распределение эритроцитов в крови здоровых доноров по плотности и критической осмотичности (по фильтруемости).

Нами было показано, что в крови доноров эритроциты имеют близкое к нормальному (Гауссову) распределение по критическим значениям осмотичности исг. При использовании фильтров со средним диаметром пор 3.2 мкм и толщиной 7 мкм распределение по и„ характеризуется параметрами М~ 185-195 мОсм и а = 5-13 мОсм, что соответствует СУ ~3-7%.

На рисунке 8 представлено типичное дифференциальное распределение эритроцитов нормального донора по иг,, аппроксимированное Гауссианом.

Используя кинетический фильтрометр ИДА-03, можно не только определить распределение эритроцитов по критическим значениям осмотичности, но и рассчитать значения некоторых параметров, характеризующих основную часть эритроцитов (Таблица 1).

Таблица 1

Параметры основной субпопуляции донорских эритроцитов. Унь -вязкость внутриклеточного гемоглобина. Температура фильтрации -25°С, перепад давления -150 Па. (п = 9)

V, я,. иа S/V, Ъ а Уиь. р, г/мл

мкм3 пг мОсм мкм2 мкм-1 мПас

М4 92.5' 29 Л■ 213?. 141ч 132 68.4г 0.65" гл- 1.099?:

О 4.1 1.5 5 5 1 40 0.18 1.4 0.001

cv% 4 5 2 4 2 0.58 0.28 0.19 0.1

Характер распределения по критической осмотичности эритроцитов разного возраста. Поддержание постоянного отношения поверхность/объем в процессе старения эритроцитов.

Хорошо известно, что геометрические параметры эритроцитов скоррелированы между собой. В процессе старения эритроцитов уменьшается как площадь их поверхности, так и объем (Canham P.B., 1968; Linderkamp О., 1982). Однако между различными исследователями имеются разногласия по поводу характера указанной корреляции. Одни авторы полагают, что в процессе старения эритроцита сохраняется постоянное отношение поверхность/объем (г =S/V ==const) (Canham' P.B., 1968; Linderkamp О., 1982). Другие считают, что при старении клеток остается постоянной их сферичность SPH, т.е форма клеток (Waugh R.E., 1992, Waugh R.E., 1996).

Соотношение площади поверхности и объема является одним из основных факторов, определяющих деформируемость (фильтруемость) эритроцита, поэтому для решения вопроса о характере соотношения этих параметров в различных фракциях эритроцитов мы исследовали с помощью фильтрационно-осмотического метода распределение клеток по ис! в эритроцитах, фракционированных по плотности. Полученные экспериментальные зависимости сравнивали с результатами математического моделирования процесса фильтрации эритроцитов различной плотности, полученными в предположении (1) постоянства отношения или (2) постоянства сферичности.

На рисунке 9 показана зависимость от осмотичности среды и средней относительной скорости прохождения через пору основной субпопуляции эритроцитов (w/wi,) из легкой (кривая 1) и тяжелой (кривая 2) фракций.

Можно видеть, что, хотя значения скорости для тяжелых эритроцитов при изотонических и гипертонических значениях и существенно меньше, чем для легких, в гипотонической области эти скорости сближаются. В нашем случае эритроциты легкой фракции перестают проходить . через поры приблизительно при 200 мОсм, а клетки тяжелой фракции при 206 мОсм. Стрелкой на рисунке 9 отмечено рассчитанное значение критической осмотичности для гипотетической клетки с объемом V" Ути сферичностью 5РН = БРНл. Для такой клетки и„= 193 мОсм, что значительно меньше, чем экспериментально измеренные величины.

7 -

о ■ . • ■ .................. I

160 200 250 300 350 400

и.мОсн

Рисунок 9. Зависимость от осмотичности среды к относительной скорости прохождения через пору основной субпопуляции эритроцитов (и>/и'») из легкой (кривая 1) и тяжелой (кривая 2) фракций.

объемом и большей плотностью, выше, чем у молодых клеток. Меньшая деформируемость (фильтруемость) более плотных (старых) эритроцитов в изотонических и гипотонических средах связана с большей внутриклеточной вязкостью этих клеток. Ширина распределения по и„ несколько больше для старых эритроцитов.

Сохранение постоянного отношения площади поверхности к объему при монотонном уменьшении обоих параметров в течение всей жизни эритроцита свидетельствует о том, что это отношение является важным регуляторным параметром. По-видимому, благодаря тому, что значение г поддерживается на постоянном уровне, обеспечивается унификация реологических свойств всех одновременно циркулирующих в кровотоке эритроцитов.

Распределение эритроцитов по плотности и критической осмотичности при некоторых воздействиях in vitro*

Несмотря на большое число работ, посвященных старению эритроцитов в кровотоке, механизмы, ответственные за наблюдаемую при этом корреляцию площади поверхности и объема эритроцита остаются неизвестными. Одним из возможных подходов к решению этого вопроса является исследование влияния различных факторов на характер распределения эритроцитов по параметрам, зависящим от S и V.

Мы изучали зависимость распределения эритроцитов по плотности и по критической осмотичности под действием изменения рН, температуры, инкубации с амфотерицином В и факторов, повышающих содержание внутриклеточного ионизированного кальция. Было показано, что при снижении рН от физиологического уровня до 6.8, несмотря на уменьшение средней плотности клеток (увеличение объема) на 5-7 % и сдвиг центра распределения по иСТ в гипертоническую область приблизительно на 20 мОсм, ширина этих распределений не изменяется или изменяется незначительно. Инкубация эритроцитов с полиеновым антибиотиком амфотерицином В приводит к увеличению V приблизительно на 5%, но ширина распределения также остается практически постоянной. Сдвиг распределения по плотности в целом без искажения его формы означает, что изменение объема примерно одинаково для всех клеток популяции. При

снижении температуры от 37 до 15 °С характер распределений эритроцитов по плотности и по критической осмотичности изменяются незначительно. Наблюдаемое при 15 °С снижение скорости фильтрации обусловлено существенным увеличением относительной вязкости внутриклеточного гемоглобина (почти на 30%) и, возможно, увеличением жесткости клеточной мембраны..

Уширениераспределенийэритроцитовпоплотности и фильтруемости под действием факторов, повышающих уровень внутриклеточного кальция.

Иная картина наблюдается при действии на эритроциты факторов, повышающих уровень внутриклеточного ионизированного кальция. Три разных воздействия, повышающих in vitro концентрацию внутриклеточного кальция в эритроцитах (обработка кальциевым ионофором А23187, инкубация с ортованадатом и истощение эритроцитов по АТФ в присутствии кальция), единообразно изменяют характер распределения клеток по плотности и по критическим значениям осмотичности. Во всех трех случаях, наряду со сдвигом распределений в целом в сторону больших значений плотности и меньших значений исп отмечается значительное уширение тех и других распределений, что свидетельствует о нарушении корреляционной связи между параметрами клеток в суспензии.

Показано, что при инкубации в течение 30 минут в буфере, содержащем 4 мкМ А23187 и от 5 до 200 мкМ кальция, средняя плотность эритроцитов быстро возрастает до максимально возможного значения, а ширина распределений по плотности практически не изменяется.

При инкубации в гепаринизированной аутологичной плазме (при более низких действующих концентрациях ионофора и милимолярных концентрациях Са2+) как средняя плотность, так и ширина распределения эритроцитов по плотности достоверно возрастают по сравнению с контролем (Таблица 2).

Таблица 2

Изменение распределений эритроцитов по плотности при загрузке их кальцием с помощью ионофора А23187.

Усредненные результаты измерения влияния инкубации эритроцитов (А) в HEPES-буфере, содержащем 4 мкМ кальциевого ионофора А23187

и от 20 до 200 мкМ СаСЬ или (В) в аутологичной гепарипизированной плазме, содержащей 10 мкМ А23187, на параметры распределения клеток по плотности. Клетки инкубировали с ионофором (А23187) или без него (Контроль) 30 минут при 37°С.

На рисунке 10 приведены кривые распределения эритроцитов по плотности (а) и по фильтруемости (Ь), полученные при загрузке эритроцитов кальцием с помощью инкубации с ортованадатом. Можно видеть, что наблюдается уширение распределений по плотности и фильтруемости..

В Таблице 3 приведены усредненные результаты измерения влияния инкубации эритроцитов с 1 мМ ортованадата, 1 мМ Са2+ и 0.5% альбумина

на параметры распределения клеток по плотности. Клетки инкубировали в течение 1 часа при 22 град. С. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что в присутствии ортованадата и кальция математическое ожидание (М) и коэффициент вариации распределения эритроцитов по плотности (СУ) достоверно возрастают.

Таблица 3

Изменение распределений эритроцитов по плотности при загрузке их кальцием с помощью ортованадата.

Усредненные' результаты измерения влияния инкубации эритроцитов в Трис-буфере, содержащем 1 мМ №зУ(>4 и 2 мМ СаСЬ, на параметры распределения клеток по плотности. Клетки инкубировали с ортованадатом (КазУО«) или без него (Контроль) I час при 22° С. р -уровень значимости отличия от контроля, (п -14)

Рю, г/мл Pw, г/мл Мс, г/мл CV (%)

Контроль 1.085 ±0.007 1.099 ±0.008 1.092± 0.008 0J9 ±0.078

Na3V04 1.091 ± 0.009 1.132 ±0.006 1.11410.012 1.45 ±0.33

р< 0.001 р< 0.001

Если эритроциты инкубировали при 37 град С в солевой среде, содержащей 1 мМ Са2+ и не содержащей глюкозы, в течение 40 часов, наблюдалось сжатие клеток и уширение распределения клеток по плотности (Таблица 4).

--1—I----—i-1-1—I—г- г '—I—•—i—■—I—' I ' I

l.oe 1.0а 1.10 1.12 1.14 100 150 200 250 300 350

Плотность. гДи1 Осмотичностъ, мОсм

Рисунок 11. Изменение распределения эритроцитов по плотности (а) и критической осмотичпости (Ь) до начала инкубации (контроль) и при

истощении их по АТФ в течение 40 часов при 37°С в HEPES-буфере, содержащем 1мМ СаСЬ и не содержащем глюкозы.

(a) Усредненные (М ± SEM, п = 6) распределения эритроцитов по плотности

(b) Типичные кривые зависимости процентного содержания нефильтрующихся клеток (Z%) от осмотичности среды и.

Таблица 4.

Изменение распределений эритроцитов по плотности при загрузке пх кальцием с помощью истощения клеток по АТФ.

Усредненные результаты измерения влияния инкубации эритроцитов, в НЕРЕв-буфере, содержащем 1 мМ Са 2+ и не содержащем глюкозы, в течение 35-40 часов при 37°С на распределение клеток но плотности. В качестве контроля использовали те же клетки до начала инкубации, р - уровень значимости отличия от контроля. (п=6).

Pio, г/мл Рад, Г/МЛ Мс, г/мл CV (%)

Контроль 1.090 ±0.006 1.102 ±0.004 1.096 ±0.003 0.42 ±0.10

Истощение по АТФ 1.100 ±0.007 1,130 ±0.006 1.117 ±0.004 0.86 + 0.17

р<0.01 р<0.01

Известно, что истощение по АТФ вызывает везикуляцию, т.е. уменьшение площади поверхности эритроцитов (Butikofer Р„ 1989; Lutz H.U., 1977). В наших опытах, если инкубацию проводили в присутствии экзогенного кальция, потеря ацетилхолинестеразной активности составляла от 5 до 10%, причем клетки сжимались в среднем на 30%. В результате кривая распределения клеток по фильтруемости не только уширялась, но и сдвигалась в гипотоническую область, свидетельствуя о том, что, несмотря на потерю клетками части поверхности, значения отношения поверхности эритроцитов к их объему г = S/V остаются увеличенными по сравнению с нормой. Однако уширение по фильтруемости было незначительно, так как вместе с объемом уменьшалась площадь поверхности.

40-часовая инкубация без добавленного кальция вызывала уширение распределения по фильтруемости без существенного изменения положения центра распределения.

Итак, три разных воздействия, повышающих концентрацию внутриклеточного кальция в эритроцитах in vitro, единообразно изменяют характер распределения клеток по плотности и по критическим значениям осмотичности. Наряду со сдвигом распределений в целом в сторону больших значений плотности и меньших значений отмечается значительное

уширсние тех и других распределений, свидетельствуя о нарушении корреляционной связи между параметрами клеток в суспензии.

Подобные эффекты были описаны в литературе. Известно, что при инкубации в среде, содержащей Л23187, ионофор распределяется между клетками равномерно и одинаково изменяет проницаемость для кальция всех эритроцитов в популяции. (Serrani R.E., 1995). Несмотря на это, многие авторы наблюдали, что инкубация с ионофором действует на клетки популяции неодинаково, вызывая разное увеличение Са, и, соответственно, разную степень сжатия. Так в работах Garcia-Sancho и Lew было показано, что в результате инкубации эритроцитов в буфере с ионофором А23187 появляются субпопуляции необратимо сжатых плотных клеток с очень высоким содержанием Са2+. Более пологий по сравнению с контролем характер приводимых в ряде статей кривых осмотического лизиса обработанных ионофором А23187 эритроцитов свидетельствует об уширении распределения таких клеток по литической осмотичности (Li Q., 1996).

Как известно, степень активации кальций-зависимых калиевых каналов (Гардос-эффект), а следовательно, величина клеточного объема V, определяется для каждой клетки стационарным значением концентрации внутриклеточного кальция (Са„) устанавливающимся в зависимости от соотношения скорости пассивного входа (Wm) и скорости АТФ-зависимого выхода (W«) кальция. В настоящее время можно считать доказанным, что скорость выхода Са3+ из эритроцитов (активность кальциевого насоса) существенно различна для разных клеток популяции. [Lew V, 2003; Romero P.J., 1997; Romero P.J., 1999; Seidler N.W, 1992; Vincenzi F.F, 1988]. Показано, что во фракции плотных (старых) эритроцитов, снижена по сравнению с фракцией легких (молодых) клеток. Поэтому стационарный уровень Cai в старых клетках увеличен, а объем, соответственно уменьшен по сравнению с молодыми клетками (Aiken N.R., 1992).

Полученные результаты позволяют сформулировать гипотезу о механизмах, обеспечивающих эту корреляцию в условиях in vivo. Кажется вероятным, что (i) регуляция объема эритроцитов в крови опосредована изменением концентрации внутриклеточного свободного кальция и (ii) изменение концентрации внутриклеточного кальция в эритроците и, как следствие этого, изменение объема клетки регулируется отношением

определяющим в процессе циркуляции деформацию клеточной мембраны и, соответственно скорость входа кальция в клетку (№,„)

Распределение по плотности и критической осмотичности консервированных и криоконсервированныхэритроцитов.

Фильтрационно-осмотические методы (ФИОМ) могут быть использованы для оценки качества консервированных и криоконсервированных эритроцитов, предназначенных для трансфузий. Применяемые в настоящее время эритроцит-содержащие трансфузионные среды, могут, согласно "Инструкции по фракционированию консервированной крови на клеточные компоненты и плазму", утвержденной МЗ РФ 1987, храниться в условиях банка крови при положительной температуре (4° С) до 21 дня. Проведенные исследования показали, что в течение первой недели хранения изменения эритроцитов как по плотности, так и по фильтруемости незначительны. По мере дальнейшего хранения распределения эритроконцентратов сначала сдвигаются в сторону меньших значений плотности (происходит небольшое раздувание), а затем наблюдается частичное сжатие клеток. При этом критические значения осмотичности возрастают как для основной субпопуляции так и

для 3% наименее деформируемых клеток (Л(1%)).. При стандартных условиях приготовления и сроке хранения при 4°С не более 5-7 суток реологические свойства (деформируемость) основной части клеток эритроцитной массы и суспензии отмытых эритроцитов (ЭМОЛТ) практически не отличались от нормы. Эффективность трансфузий этих эритроцит-содержащих сред близка к 100%. Поэтому трансфузии эритроцитной массы, хранившейся не более 5-7 дней не требуют предварительного контроля деформируемости.

При таком жестком воздействии как криоконсервирование с последующим размораживанием и отмыванием, наряду с появлением минорных аномальных субпопуляций, возможно ухудшение реологических характеристик основной массы эритроцитов. Причиной повреждения криоконсервированных эритроцитов могут явиться нарушение режима их заготовки, отмывки от криопротекторов или хранения. Переливание таких клеток может способствовать нарушениям микроциркуляции, развитию тканевой гипоксии и ацидоза.

Параллельное исследование деформируемости размороженных криоконсервированных эритроцитов и эффективности их переливания показало, что неэффективные трансфузии размороженных эритроцитов могут быть следствием ухудшенных реологических свойств основной массы переливаемых клеток. Была обнаружена корреляция между величиной определяемой для размороженных эритроцитов, и эффективностью трансфузий этих клеток, определяемой по приросту гемоглобина в крови больного на следующий день после трансфузии

На рисунке 12 по оси ординат отложены значения эффективности трансфузий (ЭТ) 20 препаратов размороженных эритроцитов против 'йа(0.1%), измеренных для этих препаратов перед трансфузией. Видно, что между двумя показателями существует выраженная корреляция. При значениях Йс{0.1%) > 220 мОсм размороженные клетки сильно изменены, отношение площади поверхности основной массы переливаемых клеток к их объему уменьшено, и эффективность трансфузий близка к нулю. При значениях отношение площади поверхности основной

массы переливаемых клеток к их объему не отличается от нормальных значений, и наблюдаемый прирост гемоглобина в крови больного практически равен расчетному, то-есть ЭТ = 100%. При промежуточных значениях: 200 мОсм <'П« (0.1%) < 220 мОсм наблюдаются, соответственно, промежуточные значения ЭТ.

-- I ■—I—I—I—>—I—'—г—'—I

100 190 200 210 220 230 240 1^(01«) ыОсм

Рисунок 12. Зависимость эффективности трансфузий (ЭТ) от Х1СГ(0.1%) для криоконсервированных эритроцитов.(п - 20). Криопротектор • пропандиол.

После переливания клеток, для которых прироста гемоглобина практически не наблюдалось. Поэтому в ряде случаев может быть целесообразной предтрансфузионная проверка качества размороженных криоконсервированных эритроцитов с помощью ФИОМ.

Использование ФИОМ для контроля качества размороженных криоконсервированных эритроцитов позволит избежать неэффективных трансфузий и возможных гемотрансфузионных осложнений, что особенно важно при тяжелых патологиях.

Распределение эритроцитов по плотности и критической осмотичности при некоторых патологических состояниях.

С помощью фильтрационно-осмотических методов исследовали изменение популяционных характеристик эритроцитов в крови больных наследственным сфероцитозом (НСф) и аутоиммунной гемолитической анемией (АИГА). Показано, что при НСф деформируемость основной массы эритроцитов значительно снижена, а гетерогенность популяции эритроцитов по плотности и по критической осмотичности увеличена. В крови присутствует значительная доля нефильтрующихся клеток. На рисунке 13 представлено типичное распределение по плотности эритроцитов больной наследственным сфероцитозом. Для сравнения приведено распределение эритроцитов донора (пунктирная линия). Видно, что популяция эритроцитов при сфероцитозе значительно более гетерогенна, чем в норме, что соответствует литературным данным.

В Таблице 5 приведены значения критической осмотичности П(1%),

измеренные для суспензий эритроцитов из крови 7 больных наследственным сфероцитозом. Можно видеть, что все эти показатели существенно больше, чем в норме. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что в крови больных" сфероцитозом эритроциты характеризуются пониженным отношением поверхность/объем и значительным увеличением гетерогенности популяции, что хорошо согласуется с литературными данными

Таблица 5

Критические значения осмотичности 11(1%) и 12(0.1%) и их разность 12(1%) - 12(0.1%) для суспензий 7 больных наследственным сфероцитозом. Параметры фильтра: толщина 7 мкм, диаметр поры 3.2 мкм. Метод двух гематокритов

Больной П(1%), п<0]%), П(1%)-П(01%)

мОсм мОсм мОсм

К1 280 234 46

В 286 232 54

Б 264 226 38

С 310 220 90

К2 280 220 60

Ч 240 218 32

П 292 254 38

- Среднее , 229±;1г.б;,-'.7

Норма 201 ±7 189 ±9 12±5

На рисунке 14 приведены результаты исследования эритроцитов четырех больных с диагнозом «наследственный сфероцитоз» с помощью кинетического фильтрометра ИДА-03. В крови больных присутствовало от 9 до 50% эритроцитов с плотностью, большей чем 1.110, что значительно выше нормы. Средняя плотность эритроцитов также была повышена. На рисунке показаны кривые зависимости относительной скорости прохождения через поры фильтра эритроцитов основной

субпопуляции от осмотичности среды. Видно, что максимальная скорость снижена в 2-3 раза. При этом в изотонических условиях в крови больных присутствует значительная фракция (1 - 5 %) плохо фильтрующихся клеток.

0.22 0,20

200 250 300 350 400 450 500

Рисунок 14. Зависимость относительной скорости прохождения эритроцитов через поры фильтра ^/ШЪ) от осмотичности среды. Пунктирная кривая - эритроциты из крови доноров. Кривые 1-4 -эритроциты больных с наследственным сфероцитозом..

Плотность и фильтруемость эритроцитов больных аутоиммунной гемолитической анемией (АИГА) также значительно отличаются от нормы. (Рисунки 15,16).

Таблица 6.

Средние параметры эритроцитов больных АИГЛ и доноров.

У, мкмЗ н, и«-, S, мкм2 S/V, мкм"1 ъ а V„b, мПас

1 88 29.7 0.224 132 1.49 59 6.84 3.0

2 110 35 0.224 156 1.41 154 1.70 5.5

3 90 30 0.206 139 1.54 133 0.62 7.9

4 89 29 0.208 138 1.56 340 0.60 7.5

5 70 21.4 0.206 117 1.67 37 0.96 3.5

6 92.5 31.4 0.237 134 1.45 71 0.42 18.6

Доноры:' 87.5" 29.0-'' ОД93~ 141W дай" пщ 0.68^' 6.9

SD 3.2 0.7 0.007 3 0.01 ъ\ 0.19 1.1

р<0.05

Из Таблицы 6 видно, что основная субпопуляция эритроцитов больных АИГА характеризуется уменьшенной площадью поверхности и сниженным отношением S/V. В соответствии с этим, значение критической осмотичности для клеток основной субпопуляции сдвинуто у больных в гипертоническую область. Величина MCV и вязкость внутриклеточного содержимого у разных больных могут отличаться от нормы в ту или другую сторону.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и изготовлены фильтрометры двух типов для количественной оценки реологических свойств эритроцитов. Фильтрометр ИДА-01 (Патент Российской Федерации № 2052194), позволяет измерять с точностью до 0.1 или 0.01 сек относительную скорость протекания фиксированного малого объема суспензии эритроцитов через мембранный фильтр с калиброванными порами. Кинетический фильтрометр ИДА-03, позволяет регистрировать зависимость объема протекающей через фильтр жидкости (буфера или суспензии эритроцитов) от времени.

2. Построены математические модели фильтрации однородных и неоднородных суспензий эритроцитов через калиброванные поры, и на их основе предложен фильтрационно-осмотическй метод определения механических и геометрических параметров эритроцитов, а также вида

распределения эритроцитов по реологически значимому параметру и„ (критическая осмотичность).

3. Разработан алгоритм обработки экспериментальных фильтрационных кривых, получаемых с помощью кинетического фильтрометра ИДА-03 при разных значениях осмотичности среды. Использование этого алгоритма позволяет определять распределение эритроцитов в исследуемой суспензии по критической осмотичности и оценивать параметры основной массы эритроцитов.

4. Предложен способ оценки популядионных характеристик эритроцитов в норме и патологии путем сочетания фильтрационно-осмотических методов измерения деформируемости и распределения эритроцитов по плотности.

5. Показано, что в крови доноров эритроциты имеют близкие к нормальным распределения по критическим значениям осмотичности иг. Определены параметры этих распределений

6. Показано, что в крови больных наследственным сфероцитозом и аутоиммунной гемолитической анемией популяционные свойства эритроцитов существенно изменены по сравнению с нормой. В обоих случаях отмечается пониженная деформируемость основной массы эритроцитов, повышенная гетерогенность популяции эритроцитов по плотности и критической осмотичности и высокое содержание нефильтрующихся клеток.

7. Разработан способ оценки качества криоконсервированных эритроцитов по критическому для фильтрации 0.1% суспензии значению осмотичности

Показано, что при мОсм эффективность

трансфузий близка к нулю.

8. Показано, что в процессе физиологического старения in vivo эритроциты сохраняют постоянное отношение площади поверхности к объему. При этом сферичность у старых эритроцитов выше, чем у молодых клеток. Ширина распределения по ис! достоверно больше в популяции старых эритроцитов.

9. Показано, что при изменении рН, температуры и под действием инкубации с амфотерицином В наблюдается сдвиг центров распределений эритроцитов по плотности и критической осмотичности без изменения ширины распределений.

10. Показано, что при действии факторов, повышающих уровень внутриклеточного ионизированного кальция, на эритроциты, наряду со

сдвигом распределений в сторону больших значений плотности и меньших значений иг,, отмечается достоверное уширение распределений, что свидетельствует о нарушении корреляционной связи между параметрами клеток. Предложена модель, качественно объясняющая этот эффект. 11. Сформулирована гипотеза об определяющей роли внутриклеточного свободного кальция в регуляции объема эритроцитов в процессе их циркуляции in vivo.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты работы рекомендуются для использования в научной и практической работе медицинских учреждений.

Фильтрационно-осмотический метод исследования деформируемости (ФИОМ) может применяться при исследовании реологических свойств и полуляционных характеристик эритроцитов в норме, при некоторых воздействиях in vitro, а также при патологических состояниях, в том числе, при различных гематологических заболеваниях.

ФИОМ является пока единственным фильтрационным методом, позволяющим изучать популяционные характеристики эритроцитов. В сочетании с исследованием распределения эритроцитов' по плотности фталатным методом ФИОМ позволяет, используя доступное и недорогое фильтрационное оборудование, получать оценку популяционных характеристик эритроцитов В настоящее время накоплен большой опыт применения ФИОМ в клинике ГНЦ для дифференциальной диагностики различных анемий и т.д.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Костына,МА, Лисовская И.Л. Способ определения деформируемости эритроцитов и устройство для его осуществления. Патент РФ N° 2052194, Приоритет 27.01.91 г

2. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Кульман РА, Лисовская И.Л., Тужилова Е.Г. Исследование деформируемости эритроцитов человека путем их фильтрации через поры ядерных мембран. Новое в трансфузиологии 1993 г., 2,34-36.

3. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Лисовская И.Л., Тужилова Е.Г. Анализ геометрических параметров и механических свойств эритроцитов методом фильтрации через мембранные ядерные фильтры. I. Математическая модель. Биофизика 1994, т.39, вып.4, стр. 672-681.

4. Витвицкий В.М Лисовская И.Л.,. Тужилова. Е.Г. Математическая модель процесса фильтрования эритроцитов через поры ядерных мембран.

Материалы Российского научного симпозиума «Экологические факторы и кроветворение». Москва 1992. стр. 9-10.

5. Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И-, Тужилова Е.Г., Витвицкий В.М. Анализ геометрических параметров и механических свойств эритроцитов методом фильтрации через мембранные ядерные фильтры. П.Экспериментальная проверка математической модели. Биофизика 1994, т.39, вып.5, стр. 864-872.6. Лисовская И.Л., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И., Волкова Р.И., Кульман F.A., Гончаров И.Б., Аграненко ВА. Фильтрационное исследование деформируемости эритроцитов. Гематология и трансфузиология 1993, т.38, №2,стр.12-15.

7. Лисовская И.Л., Е.Г. Тужилова, Витвицкий В.М., Кульман Р.А., Атауллаханов Ф.И. Фильтруемость эритроцитов человека через ядерные мембраны. Влияние осмотичности среды и концентрации кальция. Материалы Российского научного симпозиума «Экологические факторы и кроветворение». Москва 1992. стр. 68-69.

8. Лисовская И.Л., Шурхина Е.С., Атауллаханов Ф.И., Колодей СВ., Цветаева Н.В. Фильтрационно-осмотический метод оценки распределения эритроцитов по реологическим параметрам. Обоснование и практические приложения. Гематология и трансфузиология. 1999, №3, стр.20-24.

9. Лисовская И.Л., Шурхина Е.С., Нестеренко В.М., Розенберг Ю.М., Атауллаханов Ф.И. Определение содержания нефильтрующихся клеток в суспензии эритроцитов. Модификация фильтрационного метода. Биологические мембраны 1998, т. 15, №3, стр. 300-307.

10.Лисовская И.Л., Шурхина Е.С., Нестеренко В.М., Розенберг Ю.М., Атауллаханов Ф.И. Фильтрационно-осмотический метод оценки распределения эритроцитов по реологическим параметрам. Материалы II съезда биофизиков России 1999. т. I, стр. 250-251.

11. Морозов В.В., Атауллаханов Ф.И., Радаев СМ., Остапченко ДА., Лисовская И.Л., Розенберг Ю.М. Влияние перфторана на морфологию и реологические свойства эритроцитов у больных с тяжелой травмой и кровопотерей. Анестезиология и реаниматология 2001,-6, стр. 22-25.

12. Розенберг Ю.М.,. Шурхина Е.С, Нестеренко В.М., Цветаева Н.В., Колодей СВ., Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И. Деформируемость и плотность эритроцитов больных аутоиммунной гемолитической анемией в разные периоды течения болезни. Тромбоз, гемостаз и реология 2001, 3 (7), стр. 3339.

13. Степанова И.И., Бирюкова Л.С,Лисовская И.Л., Еременко Л.Л., Атауллаханов Ф.И. Снижение фильтруемости эритроцитов при нефрогенной анемии у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на программном гемодиализе. Проблемы гематологии и переливания крови 1998, т.2, стр. 11-16.

14. Степанова И.И., Колошейнова Т.И., Ковалева Л.Г., Бирюкова Л.С, Лисовская ИЛ., Еременко ЯЛ., Атауллаханов Ф.И. Сравнительное исследование фильтруемости эритроцитов у больных нефрогенной анемией, получающих и не получающих терапию программным гемодиализом. Клиническая лабораторная диагностика. 1998, №9, стр. 49.

15. Степанова И.И., Лисовская И.Л., Левина А.А., Атауллаханов Ф.И., Еременко Л.Л., Бирюкова Л.С. Влияние программного гемодиализа и рекомбинантного эритропоэтина на деформируемость эритроцитов больных хронической почечной недостаточностью терминальной стадии. Практическая нефрология. 1998, № 2, стр. 37-44.

16. Шайтан К.В., Лобков А.ФДимофеев И.Б,. Лисовская И.Л,..Чижов А.А., Терешкин Э.В. Метод лазерного цитомониторинга и его применение для определения размеров эритроцитов. Биол. Мембр. 2002,19, №3, стр. 210-218.

17.Шурхина Е.С., Цветаева Н.В., Колодей СВ., Лисовская И.Л., Нестеренко В.М., Кузнецов СВ., Атауллаханов Ф.И. Плотность и деформируемость эритроцитов больного аутоиммунной гемолитической анемией с антифосфолипидным синдромом в разные периоды течения болезни. Гематология и трансфузиология, 2003, т. 48, №3, стр. 19-22.

18.Яковенко Е.Е., Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И. Математический анализ влияния геометрических параметров и механических свойств эритроцитов на фильтруемость неоднородных суспензий. Биологические мембраны 1999, т.16,№3, стр. 364-375.

19.Яковенко Е.Е., Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И. Математический анализ влияния геометрических параметров и механических свойств эритроцитов на фильтруемость неоднородных суспензий. Материалы II съезда биофизиков России 1999. т. I, стр. 305-306.

20.Яковенко Е.Е., Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И. Математический анализ влияния геометрических параметров и механических свойств эритроцитов на фильтруемость неоднородных суспензий. Материалы П Международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» 1999, Ярославль-Москва, стр. 257-258.

21.Яковенко Е.Е., Розенберг Ю.М., Колодей СВ., Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И. Анализ фильтруемости неоднородных суспензий эритроцитов. Биологические мембраны, 2001, том 18, № 1, стр. 16-28.

22.Lisovskaya I.L., Rozenberg J.M., Nesterenko V. М., Samokhina A. A. Factors raising intracellular calcium increase red blood cell heterogeneity in density and critical osmolality. In press.

23.Lisovskaya IX., Rozenberg J.M., Nesterenko V.M., Samokhina A.A. Factors raising intracellular calcium increase erythrocyte heterogeneity in density and critical osmolality. 14-th Meeting of the European Association for Red Cell Research 2003, Roscoff, France, p. 9.

24.Lisovskaya I.L., Rozenberg J.M., Yakovenko E.E., Ataullakhanov F.I. Maintenance of constant surface area-to-volume ratio in density-fractionated erythrocytes. Biorheology 1999, v.36 № 1/2, p. 127.(10-th International Congress ofBiorheology).

25.Lisovskaya I.L., Rozenberg J.M., Yakovenko E.E., Ataullakhanov F.I. Erythrocyte distribution in geometrical parameters: assessment with the osmofiltration method. 12-th Meeting of the European Association for Red Cell Research. Abstracts. Germany, Otzenhausen 1999, p. 14.

26.Lisovskaya I.L., Rozenberg J.M., Yakovenko E.E., Ataullakhanov F.I. Maintenance of constant surface area-to-volume ratio in density-fractionated erythrocytes. Материалы II Международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» 1999, Ярославль-Москва, стр. 256-257.

27. Lisovskaya I.L., Rozenberg J.M., Yakovenko E.E., Ataullakhanov F.I.. Maintenance of a constant area-to-volume ratio in density-fractionated human erythrocytes. Биол. Мембр.2003, 20, №2, 160-168.

28. Lisovskaya I.L., Shurkhina E.S., Ataullakhanov F.I. A modification of the filtration method for studying the area-to-volume ratio distribution of erythrocytes. XI Meeting of the European Association for Red Cell Research. Ljubljana, Slovenia,1997,p.54.

29. Lisovskaya IX., Shurkhina E.S., Nesterenko V.M., Rozenberg J.M., Ataullakhanov F.I. Determination of the content of nonflterable cells in

erythrocyte suspensions as a function of the medium osmolality. Biorheology 1998, v.35, №2, p. 141-153.

30.Lisovskaya I.L., Shurkhina E.S., Yakovenko E.E., Tsvetaeva N.V., Kolodei S.V., Scherbinina S.P., Ataullakhanov F.I. Distributions of rheological parameters in populations ofhuman erythrocytes. Biorheology 1999, v. 36, № 4,299-309.

31.Rozenberg J.M, Lisovskaya I.L.,Uyesaka N., Kawa Т., Ataullakhanov F.I. Filtration of erythrocyte suspensions with different hematocrites through Nuclepore 3 and 5 ц nuclear filters and Nickel-Mesh 3.1 JJ. filter. Микроциркуляция и гемореология. II Международная конференция Материалы II Международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» 1999, Ярославль-Москва, стр. 253-255.

32.Rozenberg J.M., Levina A.A., Mamukova J.I., Tsvetaeva N.V., Kolodei S.V.,. Tutaeva V.V., Lisovskaya I.L., Ataullakhanov F.I.. Correlation between erythrocyte filterability and levels of immunoglobulins and complement bound on the erythrocyte surface. 11th International Congress of Biorheology and 4th International Conference on Clinical Hemorheology. Antalya, Turkey, 2002, p. 101.

33. Shurkhina E.S., Lisovskaya I.L., Nesterenko V.M., Kolodei S.V., Scherbinina S.P., Tsvetaeva N.VAtaullakhanov F.I. Decreased erythrocyte filterability in autoimmune hemolytic anemia and hereditary microspherocytosis: a correlation with increased cell density. Biorheology 1999, v.36 № 1/2, p. 144 (10-th International Congress ofBiorheology).

34. Shurkhina E.S., Tsvetaeva N.V., Kolodei S.V., Nesterenko V.M., Lisovskaya I.L., Ataullakhanov F.I. Staging of autoimmune anemia using assays for erythrocyte deformability and density. 14-th Meeting ofthe European Association for Red Cell Research 2003, Roscoff France, p. 45.

35. Yakovenko E.E., Lisovskaya I.L., Ataullakhanov F.I. Theoretical model of filtration kinetics of the heterogeneous erythrocyte suspension through the membrane Зц filters. Biorheology 1999, v.36 № 1/2, p. 130.(10-th International Congress ofBiorheology).

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ АИГА - аутоиммунная гемолитическая анемия АТФ - аденозинтрифосфат АТФ-аза - аденозинтрифосфатаза ГА - глутаровый альдегид ГГЦ - глюгицир

2,3 -ДФГ - 2,3 -дифосфоглицерат

ИДА-01, ИДА-03 - измеритель деформируемости автоматический

НСф - наследственный сфероцитоз

ПДС - раствор пропандиола

РПГ - раствор Перколл-гипака

ФИОМ - фильтрационно-осмотаческие методы

ХПН - хроническая почечная недостаточность

ЦГФ - цитроглюкофосфат

ЭМОЛТ — эритромасса, отмытая от лейкоцитов и тромбоцитов

ЭПО — эритропоэтин

ЭТ - эффективность трансфузий

Hct - гематокрит

НЕМА - Human Erythrocyte MicroChannel Analyzer

GPI - glycosylphosphatidylinositol (гликозилфосфатидилинозитол)

DMSO - dimethylsulfoxide (диметилсульфоксид)

ET-1 - endothelin-1 (эндотелии-1)

1Ь-10 - interleukin-10 (интерлейкин-10)

MCD - minimum cylindrical diameter (минимальный диаметр цилиндра)

NEM - N-ethylmaleimide (N-этилмалеимид)

PAF - Platelet activation factor

PGE-2 - Prostaglandin E2 (простагландин E2)

PS -Phosphatidylserine (фосфатидилсерин)

РЕ - Phosphatidylyethanolamine (фосфатидилэтаноламин)

SPH- sphericity (сферичность)

»- 3603

ООП МГУ. Заказ 20. Тираж 100

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лисовская, Ирина Львовна

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общие свойства эритроцитов. Деформируемость - важнейшая функциональная характеристика эритроцитов. Параметры эритроцитов, определяющие их деформируемость. Зависимость этих параметров от концентрации внутриклеточного ионизированного кальция

2. Основные методы количественной оценки деформируемости эритроцитов и возможность их применения для оценки популяционных характеристик эритроцитов в крови

2.1 Ротационная вискозиметрия

2.2 Эктацитомвтрия:ЬОЯСА, осмоскан, реоскоп

2.3 Фильтрационные методы

2.4 Микропипеточный метод

2.5 Измерение скорости движения эритроцитов по силиконовым микроканалам

3. Гетерогенность популяции эритроцитов в крови. Популяционные характеристики эритроцитов в норме. Корреляционные связи между параметрами эритроцитов

4. Физиологическое старение эритроцитов. Изменение основных параметров и реологических свойств эритроцитов при старении in vivo. Роль внутриклеточного ионизированного кал ьция

5. Влияние некоторых факторов на стационарный уровень внутриклеточного ионизированного кальция, на активность Гардос-каналов и деформируемость эритроцитов.

5.1 Увеличение проницаемости мембраны эритроцита для кальция под действием сдвигового напряжения

5.2 Увеличение проницаемости мембраны эритроцита для кальция и ингибирование кальциевого насоса под действием окислителей.

5.3 Факторы, влияющие на стационарный уровень внутриклеточного ионизированного кальция и реологические свойства эритроцитов in

6. Изменение реологических свойств и популяционных характеристик эритроцитов в крови при некоторых патологических состояниях и повреждающих воздействиях.

6.1. Гемолитические анемии.

6.1.1. Наследственный сфероцитоз и эллиптоцитоз.

6.1.2. Наследственная высоко-фосфатидилхолиновая гемолитическая анемия, наследственный ксероцитоз, наследственный стоматоцитоз.

6.1.3. Аутоиммунная гемолитическая анемия.

6.1.4. Серповидноклеточная анемия.

6.2. Гипертензия и мозговые нарушения.

6.3. Травмы, инфекции, сепсис и воспаление.

6.4 Хроническая почечная недостаточность (ХПН).

6.5. Механическая травма эритроцитов.

6.6. Консервированныеритроциты.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Популяционные характеристики эритроцитов в норме и патологии; фильтрационно-осмотические методы исследования деформируемости"

Актуальность проблемы. Микроциркуляторное русло, включающее совокупность сосудов диаметром от 2 до 200 мк, является конечным звеном сердечнососудистой системы, в котором осуществляется транскапиллярный обмен, обеспечивающий необходимый для жизни тканевой гомеостаз. Поскольку диаметр капилляров микроциркуляции сравним с размерами эритроцитов, первостепенное значение в этом процессе приобретает их деформируемость, т.е. способность изменять форму под действием внешних сил.

Среди методов исследования деформируемости эритроцитов одно из важнейших мест занимают фильтрационные методы, основанные на изучении особенностей протекания (фильтрации) суспензий эритроцитов через фильтры, с порами диаметром 3-5 мкм. В настоящее время существует много модификаций фильтрационных методов. Однако часто исследователи получают трудносопоставимые результаты из-за отсутствия единых методических подходов, а также из-за проблем в интерпретации полученных данных. В настоящее время деформируемость (фильтруемость) обычно характеризуют единственным показателем, что позволяет говорить только об относительном снижении или повышении деформируемости эритроцитов по сравнению с нормой. При этом не представляется возможным (1) выяснить, какие конкретно клеточные параметры ответственны за наблюдаемые изменения и (2) охарактеризовать свойства отдельных групп (субпопуляций) эритроцитов в исследуемой крови. Тем самым снижается информационная ценность измерений деформируемости.

Измеряемые фильтрационными, методами показатели являются интегральными, т.е. зависят сразу от нескольких клеточных параметров (объема клетки, отношения площади поверхности к объему, внутриклеточной вязкости, механических свойств мембраны). Кроме того, исследование реологических свойств эритроцитов с помощью фильтрационных методов существенно осложняется неоднородностью популяции эритроцитов. Вместе с тем характер этой неоднородности может служить важнейшим источником дополнительной информации, в частности иметь диагностическое значение. Нарушения в системе микроциркуляции при многих заболеваниях и экстремальных состояниях могут быть следствием изменения характера распределений эритроцитов по параметрам, влияющим на фильтруемость.

Целью настоящего исследования явилось создание и апробация фильтрационных методов, позволяющих определять механические и геометрические характеристики эритроцитов и оценивать характер распределения эритроцитов по реологически значимым параметрам. Исходя из цели исследования, были поставлены следующие задачи.

1] Создать математические модели фильтрации суспензий эритроцитов через мембранные фильтры. Разработать фильтрационно-осмотические методы исследования эритроцитов (ФИОМ).

2] Разработать и изготовить фильтрационные устройства для исследования суспензий эритроцитов.

3] Использовать фильтрационно-осмотические методы для изучения популяционных характеристик эритроцитов в норме, при некоторых воздействиях и патологических состояниях.

4] Исследовать изменения популяционных характеристик эритроцитов при старении клеток in vivo и при изменении кальциевого гомеостаза эритроцитов in vitro.

С помощью фильтрационно-осмотических методов измерения деформируемости (ФИОМ) в сочетании с исследованием распределения эритроцитов по плотности получена новая информация о свойствах гетерогенных популяций эритроцитов в норме, при различных воздействиях in vitro и при некоторых патологических состояниях.

Основные положения, выносимые на защиту:

Фильтрометры ИДА-01 (Патент РФ № 2052194) и кинетический фильтрометр ИДА-03 представляют собой фильтрационные устройства, позволяющие эффективно исследовать реологические свойства суспензий эритроцитов и деформируемость клеток в норме, при различных патологиях и воздействиях.

Предложенные математические модели адекватно описывают процессы фильтрации суспензий эритроцитов через калиброванные поры.

Применение фильтрационно-осмотических методов исследования деформируемости эритроцитов позволяет получать важную информацию о популяционных характеристиках эритроцитов в эксперименте и клинической практике.

Регуляция объема эритроцитов в крови опосредована изменением концентрации внутриклеточного свободного кальция Caj.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Лисовская, Ирина Львовна

выводы

4. Предложен способ оценки популяционных характеристик эритроцитов в норме и патологии путем сочетания фильтрационно-осмотических методов измерения деформируемости и распределения эритроцитов по плотности.

5. Показано, что в крови доноров эритроциты имеют близкие к нормальным распределения по критическим значениям осмотичности исг. Определены параметры этих распределений

7. Разработан способ оценки качества криоконсервированных эритроцитов по критическому для фильтрации 0.1% суспензии значению осмотичности 0(0.1%). Показано, что при Q(0.1 %)>210-215 мОсм эффективность трансфузий близка к нулю.

8. Показано, что в процессе физиологического старения in vivo эритроциты сохраняют постоянное отношение площади поверхности к объему. При этом сферичность у старых эритроцитов выше, чем у молодых клеток. Ширина распределения по исг достоверно больше в популяции старых эритроцитов.

10. Показано, что при действии факторов, повышающих уровень внутриклеточного ионизированного кальция, на эритроциты, наряду со сдвигом распределений в сторону больших значений плотности и меньших значений исг., отмечается достоверное уширение распределений, что свидетельствует о нарушении корреляционной связи между параметрами клеток. Предложена модель, качественно объясняющая этот эффект.

11. Сформулирована гипотеза об определяющей роли внутриклеточного свободного кальция в регуляции объема эритроцитов в процессе их циркуляции in vivo.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наиболее доступен и часто используется в диагностических целях такой показатель гетерогенности, как ширина распределения эритроцитов по объему-(RDW), параметр, получаемый с помощью стандартных гемоанализаторов [36,459]. Однако точность измерений объема эритроцитов с помощью приборов, основанных на изменении проводимости заполненного электролитом канала при прохождении через него клеток (система Coulter) не очень высока. Кроме того, при различных патологиях и некоторых воздействиях на эритроциты проводимость клеточных мембран может изменяться, внося значительные искажения в оценку распределения эритроцитов по объему.

В последнее время в разных лабораториях активно разрабатываются другие методы, позволяющие получать распределения эритроцитов по тем или иным параметрам [132,133,176], однако они, как правило, требуют проведения измерений на многих сотнях индивидуальных клеток и являются поэтому дорогостоящими и трудоемкими.

На основе математических моделей фильтрации через калиброванные поры однородных и неоднородных суспензий эритроцитов нами был разработан фильтрационно-осмотическй метод (ФИОМ) для определения механических и геометрических параметров эритроцитов, а также характера распределения эритроцитов по реологически значимому параметру - критической осмотичности. (ис,). Принцип фильтрационно-осмотического метода заключается в следующем. При постепенном уменьшении осмотичности ресуспендирующей среды и эритроцит с данной площадью поверхности S увеличивается в объеме без изменения площади поверхности и, начиная с некоторого значения и - исп перестает проходить через поры фильтра из-за геометрических ограничений. Поскольку содержащиеся в реальной суспензии эритроциты неодинаковы, разные эритроциты в суспензии перестают проходить через поры при разных значениях осмотичности, т.е. для данного типа фильтров каждая суспензия характеризуется определенным распределением эритроцитов по исг. Параметры этого распределения (положение максимума и ширина) зависят от соотношения параметров: Н, V,so и S в исследуемой популяции или субпопуляции эритроцитов.

ФИОМ является пока единственным фильтрационным методом, позволяющим изучать популяционные характеристики эритроцитов. В сочетании с исследованием распределения эритроцитов по плотности фталатным методом Даннона-Мариковского ФИОМ позволяет, используя доступное и недорогое фильтрационное оборудование, получать достаточно полную оценку популяционных характеристик эритроцитов в крови здоровых доноров, при некоторых воздействиях in vitro, а также при патологических состояниях. В настоящее время накоплен большой опыт применения ФИОМ в клинике ГНЦ для дифференциальной диагностики различных анемий и т.д.

Исследования проводили на разработанных и изготовленных в Лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН фильтрометрах двух типов. Фильтрометр ИДА-01, представляющий собой модификацию гемореометра Хансса, позволяет измерять с точностью до 0.1 или 0.01 с относительную скорость протекания фиксированного малого объема суспензии эритроцитов через мембранный фильтр с калиброванными порами. Кинетический фильтрометр ИДА-03, позволяет регистрировать зависимость от времени объема протекающей через фильтр жидкости (буфера или суспензии эритроцитов). Измерение осуществляется методом оптического сканирования положения пузырька воздуха в измерительной трубке при помощи ПЗС-матрицы. Обрабатывая экспериментальные кинетические фильтрационные кривые с помощью основанного на математических моделях специального алгоритма, оценивают средние параметры исследуемой суспензии эритроцитов (параметры центра распределения) и определяют распределение эритроцитов по критической осмотичности.

Нами было показано, что в крови здоровых доноров эритроциты имеют близкое к нормальному (Гауссову) распределение по критическим значениям осмотичности исг. При использовании фильтров со средним диаметром пор 3.2 мкм и толщиной 7 мкм (Дубна) распределение по ист характеризуется параметрами М = 185 ± 8 мОсм и а = 513 мОсм, что соответствует CV = 3-7% (п=9)

При использовании фильтров со средним диаметром пор 3.1 мкм и толщиной 3.5 мкм (Nickel-mesh filter) распределение эритроцитов здоровых доноров по ист характеризуется параметрами А/ « 213 мОсм и а « 5 мОсм, CV«2%. Относительная скорость прохождения эритроцита через пору в этом случае составляет около 0.2.

Фракционирование эритроцитов по плотности позволяет получить суспензии относительно легких (молодых) и относительно тяжелых (старых) клеток. Хорошо известно, что геометрические параметры эритроцитов скоррелированы между собой. В процессе старения эритроцитов уменьшается как площадь их поверхности, так и объем [259,473]. Однако между различными исследователями имеются разногласия по поводу характера указанной корреляции. Одни авторы полагают, что в процессе старения эритроцита сохраняется постоянное отношение поверхность/объем (г -S/V =const) [80,264]. Другие считают, что при старении клеток остается постоянной их сферичность SPH, т.е форма клеток [472,473,474].

Соотношение площади поверхности и объема является одним из основных факторов, определяющих деформируемость (фильтруемость) эритроцита, поэтому для решения вопроса о характере соотношения этих параметров в различных фракциях эритроцитов мы исследовали с помощью фильтрационно-осмотического метода распределение клеток по ист в эритроцитах, фракционированных по плотности. Полученные экспериментальные зависимости сравнивали с результатами, математического моделирования процесса фильтрации эритроцитов различной плотности, полученными в предположении (1) постоянства отношения S/V или (2) постоянства сферичности.

С помощью фильтрометров обоих типов было показано, что значение критической осмотичности для центра распределения фракции легких эритроцитов равно или несколько меньше, чем для центра распределения фракции тяжелых клеток. Сравнивая экспериментальные кривые с модельными кривыми, можно заключить, что в процессе старения эритроциты сохраняют постоянное отношение площади поверхности к объему. При этом сферичность старых эритроцитов, обладающих меньшим объемом и большей плотностью, выше, чем у молодых клеток. Меньшая деформируемость (фильтруемость) более плотных (старых) эритроцитов в изотонических и гипотонических средах связана с большей внутриклеточной вязкостью этих клеток. Ширина распределения по и„ несколько больше для старых эритроцитов.

Сохранение постоянного отношения площади поверхности к объему (г = S/V = const) при монотонном уменьшении обоих параметров в течение всей жизни эритроцита свидетельствует о том, что это отношение является важным регуляторным параметром. По-видимому, благодаря тому, что значение г поддерживается на постоянном уровне, обеспечивается унификация реологических свойств всех одновременно циркулирующих в кровотоке эритроцитов.

Мы изучали зависимость распределения эритроцитов по плотности и по критической осмотичности под действием изменения рН и температуры, инкубации с амфотерицином В и факторов, повышающих содержание внутриклеточного ионизированного кальция. Было показано, что при снижении рН от физиологического уровня до 6.8, несмотря на уменьшение средней плотности клеток (увеличение объема) на 5-7 % и сдвиг центра распределения по исг в гипертоническую область приблизительно на 20 мОсм, ширина этих распределений не изменяется или изменяется незначительно. Инкубация эритроцитов с полиеновым антибиотиком амфотерицином В приводит к увеличению V приблизительно на 5%, но ширина распределения также остается практически постоянной. Сдвиг распределения по плотности в целом без искажения его формы означает, что изменение объема примерно одинаково для всех клеток популяции. При снижении температуры от 37 до 15 °С характер распределений эритроцитов по плотности и по критической осмотичности изменяются незначительно. Наблюдаемое при 15 °С снижение скорости фильтрации обусловлено существенным увеличением относительной вязкости внутриклеточного гемоглобина (почти на 30 %) и, возможно, увеличением жесткости клеточной мембраны.

Иная картина наблюдается при действии на эритроциты факторов, повышающих уровень внутриклеточного ионизированного кальция. Три разных воздействия, повышающих in vitro концентрацию внутриклеточного кальция в эритроцитах (обработка кальциевым ионофором А23187, инкубация с ванадатом и истощение эритроцитов по АТФ в присутствии кальция), единообразно изменяют характер распределения клеток по плотности и по критическим значениям осмотичности. Во всех трех случаях, наряду со сдвигом распределений в целом в сторону больших значений плотности и меньших значений исг, отмечается значительное уширение тех и других распределений, что свидетельствует о нарушении корреляционной связи между параметрами клеток в суспензии.

Подобные эффекты были описаны в литературе. Известно, что при инкубации в среде, содержащей А23187, ионофор распределяется между клетками равномерно и одинаково изменяет проницаемость для кальция всех эритроцитов в популяции. [397].

Несмотря на это, многие авторы наблюдали, что инкубация с ионофором действует на клетки популяции неодинаково, вызывая разное увеличение Caj и, соответственно, разную степень сжатия. Так в работах Garcia-Sancho и Lew [168,169] было показано, что в результате инкубации эритроцитов в буфере с ионофором А23187 появляются субпопуляции необратимо сжатых плотных клеток с очень высоким содержанием Са2+. Более пологий по сравнению с контролем характер приводимых в ряде статей кривых осмотического лизиса обработанных ионофором А23187 эритроцитов свидетельствует об уширении распределения таких клеток по литической осмотичности [225,261].

Как известно, степень активации кальций-зависимых калиевых каналов (Гардос-эффект), а следовательно, величина клеточного объема V, определяется для каждой клетки стационарным значением концентрации внутриклеточного кальция Са,, устанавливающимся в зависимости от соотношения скорости пассивного входа (Wm) и скорости АТФ-зависимого выхода (Wex) кальция. В настоящее время можно считать доказанным, что скорость выхода Са2+ из эритроцитов Wex (активность кальциевого насоса) существенно различна для разных клеток популяции. Romero и Romero [372,370] и другие авторы [396,458] показали, что Wex во фракции плотных (старых) эритроцитов, снижена по сравнению с фракцией легких (молодых) клеток. Поэтому стационарный уровень С а, в старых клетках увеличен, а объем, соответственно уменьшен по сравнению с молодыми клетками [34,372].

Что означает наличие корреляции между Н (S) и V и почему эта корреляция исчезает при воздействиях, повышающих in vitro содержание внутриклеточного кальция?

На Рис 69а представлены начальные участки кривых зависимости активности кальциевого насоса Wex от Caj (кривых Михаэлиса-Ментен) для молодых эритроцитов с максимальной активностью кальциевого насоса (кривая 1) и старых эритроцитов с минимальной активностью кальциевого насоса (кривая 2), построенные по данным, приведенным в статье [370].

Wex = WmJ[l+KD/CaJ, (44) где F^max = 28 ммолей Са2+/л клеток/час, К1 о = 6500 нМ; F^max = 14.5 ммолей Са2+/л клеток/час, k!'d= 25200 нМ.

Предположим, что соответствующие зависимости для всех эритроцитов в крови расположены между кривыми 1 и 2.

На Рис 69Ь и 69с представлены соответственно зависимости объема и плотности эритроцитов от Caj в предположении, что

1) объем зависит от концентрации внутриклеточного кальция следующим образом: V= Fo+A/(B+Caj3) (45) тогда плотность клеток 6= 1 +0.265х#/[ F0+A/(B+Caj3)] (46)

2) все клетки имеют одинаковое содержание гемоглобина Н=33.3 пг/клетку. Значения

7 7 констант Fo=60.86mkm , А=480.7х10 , В=8.46х10 подобраны таким образом, что среднее физиологическое значение объема эритроцита V-9Q мкм3 и его плотность 5 = 1.098г/мл достигаются при Cai =20 нМ [260,384]. Максимальная плотность (6тах ) принята равной 1.130 г/мл, а минимальная (8mi„) - 1.075 г/мл в соответствии с нашими экспериментальными данными. V

3 „. s »

•т $ . г J

Ca,,il

IntnceHiiar Calcium concentration, Са, (nM)

Рис 69. а. Начальные участки кривых зависимости активности кальциевого насоса WеХ от Caj (кривых Михаэлиса-Ментен) для молодых (W1 та* — 28 ммолей Са2+/л клеток/час, A^d=6.5 мкМ)и старых (иЛшх = 14.5 ммолей Са2+/л клеток/час, к!'о - 25.2 мкМ.) клеток [370]. b. Кривая зависимости объема эритроцита от Са(, построенная в предположении, что V= Vo + a/(b+ Caj). Предполагается, что все клетки имеют одинаковое содержание гемоглобина Я=33.3 pg/cell. Значения констант К0=60.8бц3, а=480.7*103, Ь=8.46*103 подобраны таким образом, что среднее физиологическое значение объема эритроцита V=9Q мкм3 и плотность 5 = 1.098 г/мл достигаются при Са, =20 нМ. Максимальная плотность (Smax ) принята равной 1.130 г/мл, а минимальная (8ти1) - 1.075 г/мл в соответствии с экспериментальными данными. c. Кривая зависимости плотности эритроцита 8 (г/мл) от Caj: 8 = 1 + 0.265*H/V [259].

Рис 70

Схема, объясняющая уширение распределений эритроцитов по плотности в результате воздействий, повышающих внутриклеточную концентрацию кальция Caj. a. Кривые зависимости активности кальциевого насоса Wex от плотности 8 для клеток с максимальной активностью кальциевого насоса (fVexmax) и клеток с минимальной активностью кальциевого насоса (й^ехтт) (но данным Рис 7а и Рис 7с). Пунктирными линиями обозначена скорость Wm пассивного входа кальция в клетку в контроле (1) и после инкубации с ионофором А23187 в буфере (3) и в плазме (2). Стрелками показаны интервалы стационарных значений плотности эритроцитов. Согласно Таблице 1 эти интервалы таковы: для исходной популяции эритроцитов - от 1.090 до 1.104 г/мл; для эритроцитов, обработанных ионофором А23187 в буфере - от 1.113 до 1.132 г/мл; для эритроцитов, обработанных ионофором А23187 в плазме - от 1.099 до1.128 г/мл. С помощью представленной схемы можно качественно оценить, как зависит Wjn от 8 в каждом из перечисленных случаев. b. Кривые зависимости активности кальциевого насоса Wex от плотности 8 для клеток с максимальной активностью кальциевого насоса и клеток с минимальной активностью кальциевого насоса, (по данным Рис 7а и Рис 7с) в контроле (тонкие линии) и после снижения скорости Wex в 5 раз - имитация инкубации с ортованадатом (жирные линии). Скорость пассивного входа Win в эритроциты in vitro принята постоянной и равной минимальному значению для старых клеток в контроле.

На Рис 70а представлены кривые зависимости Wex от плотности для клеток с максимальной активностью кальциевого насоса (PFexmax) и клеток с минимальной активностью кальциевого насоса (Wexmm), полученные из формул (44 - 46). Интервалы стационарных значений плотности эритроцитов в данной модели определяются точками пересечения кривых 1 и 2 с кривыми зависимости скорости пассивного входа кальция Win от плотности клеток 5.

Зная эти интервалы для исходной популяции эритроцитов (1.090-1.104 г/мл), а также для эритроцитов, обработанных ионофором А23187 в буфере (1.113-1.132 г/мл) и в плазме (1.099-1.128 г/мл) (См Таблицу 10), можно качественно оценить, как зависит Wi„ от 5 в каждом из перечисленных случаев.

Из Рис 70а видно, что самое широкое распределение (ионофор в плазме) и более узкое, но сдвинутое еще дальше вправо распределение (ионофор в буфере) получаются при постоянных, не зависящих от 8 значениях Wi„, как это и должно быть в присутствии ионофора [397]. В то же время узкое распределение по плотности, характерное для суспензии интактных клеток, согласно Рис 70а, может быть получено в том случае, если скорость входа кальция в клетку максимальна при самой низкой плотности эритроцита (т.е. при максимальном значении объема) и уменьшается с увеличением плотности (при уменьшении объема клетки). В предположении, что все клетки имеют одинаковую площадь поверхности S, это означает, что узкое распределение по стационарным значениям плотности получится, если растет с уменьшением отношения г = S/V. В крови это отношение практически не зависит от возраста клетки [264,473], а значит, эритроцит с уменьшенным по той или иной причине отношением S/V, должен иметь повышенное значение Win. В процессе

Л г циркуляции он будет накапливать Са (и увеличивать Са,, и сжиматься) до тех пор, пока Wm не уменьшится до стационарного значения, соответствующего данному значению S.

Такая регуляция скорости входа кальция в циркулирующий эритроцит могла бы осуществляться непосредственно, благодаря повышению проницаемости клеточной л . мембраны для Са при ее растяжении под действием сдвиговых напряжений (shear stress) в кровотоке [255,211,216,]. Отметим, что существенные изменения проницаемости достигаются при сдвиговых напряжениях 1000-1300 дин/см2 , что значительно выше физиологических значений, не превышающих 400 дин/см2. Тем не менее, заметное увеличение Win может быть достигнуто и при физиологических значениях сдвиговых напряжений, если клетка подвергнута действию окислителей [33,367,417].

Можно предположить также, что при циркуляции эритроцитов происходит зависящее от сдвиговых напряжений (от г) высвобождение из них какого-либо внутриклеточного агента (например, АТФ [48]), который, поступая в кровоток и взаимодействуя с эндотелием сосудов или клетками крови, инициирует последовательность событий, приводящих к изменению кальциевого гомеостаза эритроцита.

Ресуспендированные в условиях in vitro эритроциты не подвергаются сдвиговым напряжениям, и fVin одинакова для всех клеток популяции [371]. Если при этом Wm не выше минимального значения этой величины в циркулирующей крови, in vitro может происходить только снижение Caj, и уменьшение числа активированных Гардос-каналов. Это не сказывается на наблюдаемых в эксперименте значениях объема, плотности и фильтруемости клеток, так как для установления нового стационарного состояния по калию (по объему и т.д.) требуются времена порядка нескольких суток [1,290].

При инкубации с ионофором А 23187 Win для всех клеток выше максимальной

Л I скорости входа Са in vivo, поэтому стационарные значения Са; повышаются, и наблюдается быстрое увеличение плотности и уширение распределений по плотности и фильтруемости (Рис 70а).

При инкубации с 1 мМ ортованадата существенно снижается активность кальциевого насоса Wtx [453, 435]. При этом, несмотря на низкий уровень Wm, происходит увеличение Caj и плотности, а также уширение распределений (Рис 71Ь)

По-видимому, аналогичная ситуация имеет место в случае истощенных по АТФ эритроцитов, в которых тоже снижена активность кальциевого насоса. Потеря части клеточной поверхности в результате везикуляции не изменяет качественной картины эффекта, хотя уменьшает сдвиг влево распределения истощенных эритроцитов по фильтруемости (Рис 69Ь). Итак, повышение концентрации внутриклеточного кальция в эритроцитах как за счет увеличения PFjn, так и за счет снижения fVex, вызывает уширение распределений по плотности и фильтруемости, то-есть приводит к появлению в популяции множества клеток с "неправильными" значениями отношений H/V и A/V. Дело в том, что возрастание Caj в эритроцитах и их дегидратация под действием ионофора, ортованадата или истощения по АТФ никак не зависят от других параметров клетки, в частности от S и Н. Узкие распределения эритроцитов по плотности и фильтруемости, существующие в организме (и в пробирке до тех пор, пока мы не увеличили произвольным образом Са;), свидетельствуют, как уже говорилось, о существовании in vivo корреляционных связей между V и S (между V и Н) [80,259,474].

Полученные результаты позволяют сделать некоторые предположения о механизмах, обеспечивающих эту корреляцию в условиях in vivo. Кажется вероятным, что (i) регуляция объема эритроцитов в крови опосредована изменением концентрации внутриклеточного свободного кальция Caj и (ii) изменение концентрации внутриклеточного кальция в эритроците и, как следствие этого, изменение объема клетки регулируется отношением г =S/V, определяющим в процессе циркуляции деформацию клеточной мембраны и, соответственно скорость входа кальция в клетку (WJ.

Фильтрационно-осмотические методы (ФИОМ) могут быть использованы для оценки качества консервированных и криоконсервированных эритроцитов, предназначенных для трансфузий. При таком жестком воздействии как криоконсервирование с последующим размораживанием и отмыванием, наряду с появлением минорных аномальных субпопуляций, возможно ухудшение реологических характеристик основной массы эритроцитов. Причиной повреждения криоконсервированных эритроцитов могут явиться нарушение режима их заготовки, отмывки от криопротекторов или хранения. Переливание таких клеток может способствовать нарушениям микроциркуляции, развитию тканевой гипоксии и ацидоза.

Параллельное исследование деформируемости размороженных криоконсервированных эритроцитов и эффективности их переливания показало, что неэффективность трансфузий размороженных эритроцитов может быть следствием ухудшенных реологических свойств основной массы переливаемых клеток. Обнаружена корреляция между величиной Qcr(0.1%), определяемой для размороженных эритроцитов, и эффективностью трансфузий этих клеток, определяемой по приросту гемоглобина в крови больного на следующий день после трансфузии. После переливания клеток, для которых Qcr(0.1%)> 210-215 мОсм, прироста гемоглобина практически не наблюдалось. Поэтому в ряде случаев может быть целесообразной предтрансфузионная проверка качества размороженных криоконсервированных эритроцитов с помощью ФИОМ. Использование ФИОМ для контроля качества размороженных криоконсервированных эритроцитов позволит избежать неэффективных трансфузий и возможных гемотрансфузионных осложнений, что особенно важно при тяжелых патологиях.

Применяемые в настоящее время эритроцит-содержащие трансфузионные среды, могут, согласно "Инструкции по фракционированию консервированной крови на клеточные компоненты и плазму", утвержденной МЗ РФ 1987, храниться в условиях банка крови при положительной температуре (4 С) до 21 дня. Проведенные исследования показали, что в течение первой недели хранения изменения эритроцитов как по плотности, так и по фильтруемости незначительны. По мере дальнейшего хранения распределения эритроконцентратов сначала сдвигаются в сторону меньших значений плотности (происходит небольшое раздувание), а затем наблюдается частичное сжатие клеток. При этом критические значения осмотичности возрастают как для основной субпопуляции (£2(0.1%)), так и для 3% наименее деформируемых клеток (Г2(1%)). При стандартных условиях приготовления и сроке хранения при 4°С не более 5-7 суток реологические свойства (деформируемость) основной части клеток эритроцитной массы и суспензии отмытых эритроцитов (ЭМОЛТ) практически не отличались от нормы. Эффективность трансфузий этих эритроцит - содержащих сред близка к 100%. Поэтому трансфузии эритроцитной массы, хранившейся не более 5-7 дней не требуют предварительного контроля деформируемости.

С помощью фильтрационно-осмотических методов исследовали изменение популяционных характеристик эритроцитов в крови больных наследственным сфероцитозом (НС) и аутоиммунной гемолитической анемией (АИГА). Показано, что при НС деформируемость основной массы эритроцитов значительно снижена, а гетерогенность популяции эритроцитов по плотности и по критической осмотичности увеличена. В крови присутствует значительная доля нефильтрующихся клеток.

Плотность и фильтруемость эритроцитов больных АИГА значительно отличаются от нормы . В период гемолитического криза ухудшение деформируемости эритроцитов связано с появлением большого количества (до 50 %) легких клеток (ретикулоцитов) с уменьшенным отношением площади поверхности клеток к объему (S/V). По мере выхода из криза количество легких клеток уменьшается, и деформируемость улучшается, оставясь ниже нормальных значений. При этом сниженная деформируемость эритроцитов определяется высоким содержанием в крови клеток увеличенной плотности (до 35 %). В период ремиссии плотность и фильтруемость синхронно приближаются к норме.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лисовская, Ирина Львовна, Москва

1. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Кияткин А.Б., Пичугин А.В. Регуляция объема эритроцита человека. Роль активируемых кальцием калиевых каналов.// Биофизика 1993, 38(5), 809-821.

2. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Комарова С.В., Мошаров Е.В. Энергозависимые процессы и метаболизм аденилатов в эритроцитах человека.// Биохимия 1996, 61(2), 266-274.

3. Буглов Е.Д., Слобожанина Е.И., Костин Г.М., Федорович Н.Е., Бекренева С.Л. Изменение реологических свойств цитратной крови и структурного состояния мембраны эритроцитов в процессе хранения.// Гематология и трансфузиология. 1988, 33, 18.

4. Воробьев А.И. (ред) Руководство по гематологии. 1985.

5. Гологорский В.А. и др. Ухудшение деформируемости эритроцитов как один из факторов, определяющих тяжесть состояния больных.// Анестезиология и реаматология, 1982, 1, 38.

6. Дудаев В.А. Механическая устойчивость эритроцитов при гипертензии.// Сов.Мед.// 1990,2, 10-11.

7. Зинчук В.В. Деформируемость эритроцитов: физиологические аспекты.// Успехи физиол. Наук 2001, 32(3), 66-78.

8. Ивенс И., Скейлак Р., Механика и термодинамика биологических мембран М.: Мир, 1982, 257.

9. Карабанов Г.М. Деформируемость эритроцитов.// Анестезиология и реаниматология, 1984, 1: 71.

10. Карою К., Педли Т., Шротер Р., Сид У. Механика Кровообращения. //Москва, «МИР»., 1981.

11. Катюхин JI.H. Реологические свойства эритроцитов. Современные методы исследования.// Российский физиологический журнал им. Сеченова 1995,81(6), 122-129.

12. Козинец Г.И, Быкова И.А., Ряполова И.В., Еременко J1.J1. Морфофункциональные особенности эритроцитов периферической крови больных железодефицитной анемией.// Гематология и трансфузиология 1984,29(6), 19-20.

13. Козинец Г.И., Сарычева Т.Г., Игнатов С.В., Гудим Т.В., Ландарь В.А. Оценка деформабельности эритроцитов методом фильтрации.// Лаб. Дело 1990, 11, 15-17.

14. Левтов В. А., Регирер С. А., Шадрина Н. X. Реология крови. // Москва, «Медицина», 1982.

15. Леонова В.Г. Анализ эритроцитарных популяций в онтогенезе человека. Наука. СО. 1987.

16. Лисовская И.Л., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И., Волкова Р.И., Кульман Р.А., Гончаров И.Б., Аграненко В.А. Фильтрационное исследование деформируемости эритроцитов. Гематология и трансфузиология 1993, т.38, №2, стр. 12-15.

17. Лисовская И.Л., Шурхина Е.С., Нестеренко В.М., Розенберг Ю.М., Атауллаханов Ф.И. Определение содержания нефильтрующихся клеток в суспензии эритроцитов.

18. Модификация фильтрационного метода. Биологические мембраны 1998, т. 15, №3, стр. 300-307.

19. Лиховецкая 3. М., Ершова Л. И., Курбанова Г.Н., Горбунова Н. А., Плющ О.П. Реологические свойства крови у больных гемофилией. Реологические исследования в медицине. // Сборник. Выпуск 1., 55-58.

20. Мельникова В.Н., Замалетдинова Т.З., Кирьянова Г.Ю. Пролонгированное хранение при температуре +4°С криоконсервированных и размороженных эритроцитов.//Гематология и трансфузиология. 1995, 3, 29-32.

21. Мищук И.И. Нарушение деформируемости эритроцитов. Обзор.// Анестезиол. Реаниматол. 1993, 2, 72-74.

22. Молчанова Т.П. Основы молекулярной организации белков мембран эритроцитов и их дефекты, приводящие к гемолитическим анемиям.// Гематология и трансфузиология 1989,7, 32-41.

23. Орлов СН, Покудин Н.И. Механизм и регуляция входа кальция в эритроциты.// Докл. Акад. Наук СССР 1988, 298, 753-756.

24. Ремизов В.О., Захарченко В.Н. Реологические свойства крови у детей и подростков с пограничной артериальной гипертензией.// Педиатрия, 1989, 11: 110.

25. Ройтман Е.В., Фирсов Н.Н., Дементьева И.И. и соавт. Термины, понятия и подходы к исследованиям реологии крови в клинике.// Тромбоз, Гемостаз и Реология 2000, 3(3),

26. Фирсов Н.Н., Коротаева Т.В., Вышлова М.А. Классификация тяжести гемореологических расстройств.// Тромбоз, Гемостаз и Реология 2000, 1(1), 22-23.

27. Черницкий Е.А., Слобожанина Е.И., Федорович И.Е., Новицкая Г.П. Везикуляция эритроцитов при их хранении и связь ее с другими процессами в клетке.// Биофизика 1994, 39, 357.

28. Черницкий Е.А.,Федорович И.Е., Слобожанина Е.И. Везикуляция и изменение мембранных белков эритроцитов в процессе хранения консервированной крови и эритроцитарной масы при 4°С.// Гематология и трансфузиология 1993, 8, 18-21.

29. Чернух A.M., Александров П.Н., Алексеев О.В. Микроциркуляция. М. 1984.

30. Adams R.A.,. Evans S.A,. Kooshesh F., Jones J.G. The effect of temperature on the filtration of diluted blood through 3 p.m and 5 pm filters.// Biorheology 1995, 30, 643-654.

31. Aiken N.R., Caley W.R., Satterlee J.D. A peroxidative model of human erythrocyte intracellular Ca2+ changes with in vivo aging: measurement by 19F-NMR spectroscopy.// Biochim. Biophys. Acta 1995, 1270, 52-57.

32. Aiken N.R., Satterlee J.D., Caley W.R. Measurement of intracellular Ca2+ in young and old human erythrocytes using 19F-NMR spectroscopy.// Biochim. Biophys. Acta 1992, 1136, 155-160.

33. Ajmani R.S. Hypertension and hemorheology.// Clin. Hemorheol. Microcirc. 1997, 17,397-420.

34. Akar N, Gokce H. Red blood cell indexes in patients with hereditary spherocytosis and beta-thalassemia combination. Pediatr Hematol Oncol. 2002 Dec; 19(8): 569-573.

35. Allan D., Billah M.M., Finean J.B., Michell R.H. Release of diacylglycerol-enriched vesicles from erythrocytes with increased intracellular Ca2+.// Nature 1976, 261, 5860.1. Л I

36. Allan D., Thomas P. Ca -induced biochemical changes in human erythrocytes and their relation to microvesiculation. // Biochem. J. 1981, 198, 433-440.

37. Allan D., Thomas P. The effects of Ca2+ and Sr2+ on Ca -sensitive biochemical changes in human erythrocytes and their membranes.// Biochem J 1981,198(3), 441-445.

38. Anderson DR, Kelton JG. Hemolysis, thrombocytopenia and the spleen. In: Bowdler AJ, ed. The spleen, structure, function and clinical significance.// London: Chapman and Hall medical 1990,287-318.

39. Ando K., Kikugawa K., Beppu M. Induction of band 3 aggregation in erythrocytes results in anti-band 3 autoantibody binding to the carbohydrate epitopes of band 3.// Arch Biochem Biophys 1997, 339,250.

40. Andrews DA, Low PS. Role of red blood cells in thrombosis. //Curr. Opinion Hematol. 1999, 6,. 76-82.

41. Arai K., lino M., Shio H., Uyesaka N. Further investigations of red cell deformability with nickel mesh. // Biorheology 1990,27,47-65.

42. Baneijee R., Nageshwari K., Puniyani R.R. The diagnostic relevance of red cell rigidity.// Clin. Hemorheol. Microcirc. 1998, 19,21-24.

43. Bartosz G. Erythrocyte aging: Physical and chemical membrane changes.// Gerontology 1991, 37; 33-67.

44. Baskurt O.K., Gelmont D., Meiselman H.J. Red blood cell deformability in sepsis.// Am.

45. J. Respir. Crit. Care Med 1998, 157(2), 421-427.

46. Baskurt O.K., Meiselman HJ Blood rheology and hemodynamics.// Semin.Hemost.2003,29(5), 435-450.

47. Baskurt O.K.,. Fisher T.C., Meiselman H.J. Sensivity of the cell transit analyzer (СТА) to alterations of red blood cell deformability, role cell cize pore size ratio and sample preparation. // Clin. Hemorheol. 1996, 16, 753-765.

48. Bateman R.M., Jagger J.E., Sharpe M.D., Ellsworth M.L, Mehta S., Ellis C.G. Erythrocyte deformability is a nitric oxide-mediated factor in decreased capillary density during sepsis.//Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001,280(6), H2848-H2856.

49. Bechdolt S, Schroeder LK, Samia C, Schmidt P. In vivo hemolysis of deglyceroliesed red blood cells.// Arch. Pathol. Lab. Med. 1986,110, 344-345.

50. Belboul A., Al-Khaja N., Bergman P., Roberts D., William-Olsson G. Blood cell filterability: reference values and clinical applications.// Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1990, 50, 297-302.

51. Bennett V. The membrane skeleton of human erythrocytes and its implications for more complex cells.// Annu. Rev. Biochem. 1985, 54, 273-304.

52. Berlin N.I. Life-span of red cell. In: The red blood cell (Bishop Т., Surgenor D.M., eds.)// Academic Press, New York 1964,423.

53. Bessis M., Mohandas N. A diffractometric method for the measurment of cellular deformability.//Blood Cells 1975, 1, 307-313.

54. Beutler E, Luzzatto L. Hemolytic anemia.// Semin Hematol. 1999, 36(Suppl 7), 38-47.

55. Beutler E. Hemolytic anemia in disorders of red cell metabolism.// NY: Plenum Medical Book Corp. 1978.

56. Beutler E. Red Cell Metabolism.// Grune & Stratton, New York, 1975.

57. Beutler E., Kuhl W., West C. The osmotic fragility of erythrocytes after prolonged liquid storage and after reinfusion.// Blood 1982, 59,1141-1147.

58. Bianchi G., Ferrari P., Trizio D., Ferrandi M., Torielli L., Barber B.R., Polli E. Red blood cell abnormalities and spontaneous hypertension in the rat. A genetically determined link //. Hypertension 1985, 7, 319-325.

59. Blackshear Р.1., Christianson T.J., Majerle R.J., Vargas F.F. Resistance of erythrocyte flow into pores.// J. Rheol. 1979,23, 681-702.

60. Blumenfeld N., Zachowski A., Galacteros F. et al. Transmembrane mobility of phospholipids in sickle erythrocytes: effect of deoxygenation on diffusion and asymmetry.// Blood 1991,77, 649-854.

61. Boas F.E., Forman L., Beutler E. Phosphatidylserine exposure and red cell viability in red cell aging and in hemolytic anemia.// Proc Natl Acad Sci USA. 1998, 95(6), 3077-3081.

62. Bocci V., Pessina G.P., Paulesu L. Studies of factors regulating the ageing of human erythrocytes—III. Metabolism and fate of erythrocytic vesicles.// Int J Biochem. 1980, 11(2), 139-142.

63. Bonomini M., Sirolli V. Uremic toxicity and anemia //. J Nephrol. 2003, 16, 21-28.

64. Bonomini M., Sirolli V., Reale M., Arduini A. Involvement of phosphatidylserine exposure in the recognition and phagocytosis of uremic erythrocytes.// Am J Kidney Dis 2001, 37, 807-814.

65. Bonomini M., Sirolli V., Settefrati N., Dottori S., Di Liberato L., Arduini A. Increased erythrocyte phosphatidylserine exposure in chronic renal failure.// J Am Soc Nephrol. 1999, 10, 19821990.

66. Bookchin R.M., Ortiz O.E., Lew V.L. Activation of calcium-dependent potassium channels in deoxygenated sickled red cells.// Prog. Clin. Biol. Res. 1987, 240, 193-200.

67. Bosch F.H., Werre J.M., Schipper L., Roerdinkholder-Stoelwinder В., Huls Т., Willekens F.L., Wichers G., Halie M.R. Determinants of red blood cell deformability in relation to cell age.// Eur J Haematol. 1994, 52(1), 35-41.

68. Bowman H.S., Oski F.A. Splenic macrophage interaction with red cells in pyruvate deficiency and hereditary spherocytosis.// Vox Sang. 1970,19,168-175.

69. Bozzo J., Hernandez M.R., Ordinas A. Reduced red cell deformability associated with blood flow and platelet activation: improved by dipyridamole alone or combined with aspirin.// Cardiovasc Res. 1995, 30, 725-730.

70. Bratosin D., Mazurier J., Tissier J.P., Estaquier J., Huart J.J., Ameisen J., Aminoff D, Montreuil J. Cellular and molecular mechanisms of senescent erythrocyte phagocytosis by macrophages. A review.//Biochimie 1998, 80, 173-195.

71. Breneton W., Murphy J.R. Rheologic studies of deoxygenated normal and hereditary spherocytosis blood and separated erythrocytes.// J. Lab. Clin. Med., 1974, 83, 112-118.

72. Brugnara C., De Franceschi L., Alper S.L. Ca2+ activated K+ transport of human and rabbit erythrocytes: comparison of binding and transport inhibition by scorpion toxins.// J. Biol. Chem 1993, 268, 8760-8768.

73. Butikofer P., Brodbeck U., Ott P. Modulation of erythrocyte vesiculation by amphiphilic drugs.// Biochim. Biophys. Acta 1987, 901,291-295.

74. Butikofer P., Lin Z.W., Kuypers F.A., Scott M.D., Xu C.M., Wagner G.M., Chiu D.T., Lubin B. Chlorpromazine inhibits vesiculation, alters phosphoinositide turnover and changes deformability of ATP-depleted RBCs.// Blood 1989, 73(6), 1699-1704.

75. Caimi G., Contorno A., Serra A. Red cell metabolic parameters and rheological determinants in essential hypertension.// Clin. Hemorheol. 1993,13, 35-44.

76. Cameron I.L., Hardman W.E., Smith N.K.R., Fullerton G.T.D., Miseta A. Changes in the concentration of ions during senescence of the human erythrocyte.// Cell Biology International. 1993, 17, 93-98.

77. Canadian Erythropoietin Study Group. Association between recombinant human erythropoietin and quality of life and exercise capacity of patients requiring haemodialysis.// Br Med J 1990, 300, 573-578.

78. Canham P.B., Burton A.C. Distribution of size in populations of normal human red cells.// Circulation Research 1968, 22,405-422.

79. Cannella G., La Canna G., Sandrini M. Reversal of left ventricular hypertrophy following recombinant human erythropoietin treatment of anemic dialysed uremic patients.// Nephrol Dial Transplant 1991, 6, 31-37.

80. Caprari P., Bozzi A., Ferroni L., Giuliani A., La Chiusa B.F., Strom R., Salvati A.M. Membrane alterations in G6PD- and PK-deficient erythrocytes exposed to oxidizing agents.// Biochem Med Metab Biol 1991,45(1), 16-27.

81. Caprari P., Bozzi A., Ferroni L., Strom R., Salvati A.M. Oxidative erythrocyte membrane damage in hereditary spherocytosis.// Biochem. Int. 1992, 26, 265-274.

82. Chabanel A. Lipid and protein contribution to red blood cell membrane viscoelasticity.// Clin. Hemorheol. 1988, 8, 307.

83. Chabanel A., Schachter D., Chien S. Increased rigidity of red blood cellmembrane in young spontaneously hypertensive rats.// Hypertension 1987,10(6), 603-607.

84. Chabanel A., Sung K.L., Rapiejko J., Prchal J.T., Palek J., Liu S.C., Chien S. Viscoelastic properties of red cell membrane in hereditary elliptocytosis.// Blood 1989, 73(2), 592595.

85. Chan M.T., Franzini E., Koutsouris D., Hanss M. The hemorheometer: a new filtration apparatus.// Acta Med Port. 1985, 6(9-12), S31-S33.

86. Chan T.C., Godin D.V., Sutter M.C. Erythrocyte membrane abnormalities in hypertension: a comparison between two animal models.// Clin. Exp. Hypertens. 1983, 5, 691719.

87. Chasis J.A., Agre P., Mohandas N. Decreased membrane mechanical stability and in vivo loss of surface area reflect spectrin deficiencies in hereditary spherocytosis.// J Clin Invest. 1982, 82,617-623.

88. Chasis J.A., Mohandas N. Erythrocyte membrane deformability and stability: distinct membrane properties that are independently regulated by skeletal protein associations.// J. Cell Biol. 1986,103, 343-350.

89. Chasis J.A., Prenant M., Leung A., Mohandas N. Membrane assembly and remodeling during reticulocyte maturation.// Blood 1989, 74, 1112-1120.

90. Chen L.T., Weiss L. The role of the sinus wall in the passage of erythrocytes through the spleen.// Blood 1973, 41, 529-537.

91. Chien S. Biophysical behavior of red cells in suspension. In: The Red blood Cell, edited by D. Maen. Surpenor. New York Academic 1975, 1031.

92. Chien S. Red cell deformability and its relevance to blood flow.// Ann. Rev. Physiol. 1987, 49, 177-192.

93. Chien S. Shear dependence of effective cell volume as a determinant of blood viscosity. // Science 1970, 168, 977-978.

94. Chiu D., Lubin B. Abnormal vitamin E and glutathione peroxidase levels in sickle cell anemia: Evidence for increased suspectibility to lipid peroxidation in vivo.// J. Lab. Clin. Med. 1979, 94, 542-548.

95. Chiu D., Lubin В., Roelofsen В., VanDeenen L.L.M. Sickled erythrocytes accelerate clotting in vitro: An effect of abnormal membrane lipid asymmetry.// Blood 1981, 58,398-401.

96. Christian J.A., Rebar A.H., Boon D.G., Low P.S. Senescence of canine biotinylated erythrocytes: Increased autologous immunoglobulin binding occurs on erythrocytes aged in vivo for 104 to 110 days.// Blood 1993, 82, 3469-3473.

97. Chunyi W., Yanjun Z., Weibo K. The influence of calcium ions and ionophore A23187 on microrheological characteristics of erythrocytes by new model ektacytometry.// Clin. Hemorheol. Microcirc. 2001, 24(1), 19-23.

98. Cicco G., Carbonara M.C., Stingi G.D., Pirrelli A. Cytosolic calcium and hemorheological patterns during arterial hypertension.// Clin Hemorheol Microcirc 2001, 24(1), 25-31.

99. Cicco G., Pirrelli A. Red blood cell (RBC) deformability, RBC aggregability and tissue oxygenation in hypertension.// Clin. Hemorheol. Microcirc. 1999, 21(3-4), 169-177.

100. Cicco G., van der Kleij A.J., Stingi G.D., Tarallo M.S., Pirrelli A. Laser-assisted optical rotational red cell analyzer (LORCA) in clinical practice. Hemorheological kinetics and tissue oxygenation.// Adv. Exp. Med. Biol. 1999, 471,631-637.

101. Clark M.R. Computation of the avarage shear-induced deformation of blood red cells as a function of osmolality.// Blood Cells 1989, 15, 427-439.

102. Clark M.R. Mean corpuscular hemoglobin concentration and cell deformability.// Ann NY Acad Sci. 1989, 565, 284-294.

103. Clark M.R. Senescence of red blood cells: progress and problems.// Physiol Rev. 1988, 68(2), 503-554.

104. Clark M.R., Guatelli J.C., Mohandas N., Shohet S.B. Influence of red cell water content on the morphology of sickling.// Blood 1980, 55, 823-830.

105. Clark M.R., Mohandas N., Shohet S.B. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance.// Blood 1983, 61, 899-910.

106. Clark M.R., Shohet S.B. Red cell senescence.// Clin Haematol. 1985, 14(1), 223257.

107. Clark M.R., Shohet S.B., Gottfried E.L. Hereditary disease with increased red blood cell phosphatidylcholine and dehydratation: one, two or many disorders?// Am. J. Hematol. 1993,42,25-30.

108. Claster S., Quintanilha A., Schott M.A., Chiu D., Lubin B. Neutrophil-induced K+ leak in human red cells: a potential mechanism for infection-mediated hemolysis.// J Lab Clin Med 1987, 109(2), 201-210.

109. Condon M.R., Kim J.E., Deitch E.A., Machiedo G.W., Spolarics Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis.// Am. J Physiol. Heart Circ Physiol. 2003, 284, H2177-H2184.

110. Connor J., Gillum K., Schroit A.J. Maintenance of lipid asymmetry in red blood cells and ghosts: effect of divalent cations and serum albumin on the transbilayer distribution of phosphatidylserine.// Biochim Biophys Acta 1990, 1025(1), 82-86.

111. Connor J., Рак C.C., Schroit A.J: Exposure of phosphatidylserine in the outer leaflet of human red blood cells: Relationship to cell density, cell age, and clearance by mononuclear cells.// J Biol Chem 1994,269,2399-2404.

112. Cooper R.A. Loss of membrane components in the pathogenesis of antibody-induced spherocytosis.// J Clin Invest. 1972, 51,16-21.

113. Costagliola C., Romano L., Scibelli G., De Vincentiis A., Sorice P., Di Benedetto A. Anemia and chronic renal failure: a therapeutical approach by reduced glutathione parenteral administration.// Nephron 1992, 61, 404-408.

114. Cristol J.P., Bosh J.Y., Badiou S., Leblanc M., Lorrho S., Descomps В., Canaud B. Erythropoietin and oxidative stress in hemodialysis. Beneficial effects of vitamin-E supplementation.// Nephrol Dial Transplant 1997, 12, 2312-2317.

115. Cynober Т., Mohandas N., Tchernia G. Red cell abnormalities in hereditary spherocytosis: relevance to diagnosis and understanding of the variable expression of clinical severity.// J. Lab. Clin. Med. 1996,128, 259-269.

116. Da Costa L., Mohandas N., Sorette M., Grange M.J., Tchernia G., Cynober T. Temporal differences in membrane loss lead to distinct reticulocyte features in hereditary sherocytosis and in immune hemolytic anemia.// Blood 2001, 98, 2894-2899.

117. Dagher G., Lew V.L. Maximal calcium extrusion capacity and stoichiometry of the human red cell calcium pump.// J. Physiol. 1988, 407, 569-586.

118. Danon D., Marikovsky Y. Determination of density distribution of red cell population. // J. Lab. Clin. Med. 1964, 64,668-673.

119. Danon D., Marikovsky Y., Fischler H. Surface charge of old, transformed, and experimentally deteriorated erythrocytes.// Ann N Y Acad Sci. 1983, 416, 149-158.

120. David-Dufilho M., Astarie C., Pernollet M.G., Del Pino M., Levenson J., Simon A., Devynck M.A. Control of the erythrocyte free Ca2+ concentration in essential hypertension.//Hypertension 1992,19(2), 167-174.

121. David-Dufilho M., Montenay-Garestier Т., Devynck M.A. Fluorescence measurements of free Ca2+ concentration in human erythrocytes using the Ca2+indicator fura-2.// Cell Calcium 1988, 9,167-179.

122. De Jong K., Beleznay Z., Ott P. Phospholipid asymmetry in red blood cells and spectrin-free vesicles during prolonged storage.// Biochim. Biophys. Acta 1996, 1281, 101-110.

123. De Jong K., Geldwerth D., Kuypers F.A. Oxidative damage does not alter membrane phospholipid asymmetry in human eiythrocytes.// Biochemistry 1997, 36(22), 6768-6776.

124. Dean J., Schechter A.N. Sickle-cell anemia: Molecular and cellular bases of therapeutic approaches.// N. Engl. J. Med. 1978, 299,752-763.

125. Desai S.A., Schlensinger P.H., Krogstad D.J. Physiologic rate of carrier-mediated Ca2+ entry matches active extrusion in human erythrocytes.// J. Gen. Physiol. 1991, 98(2), 349-364.

126. Devaux P.F. Protein involvement in transmembrane lipid asymmetry.// Annu Rev Biophys Biomol Struct 1992, 21,417-439.

127. Diaz C., Morkowski J., Schroit A.J. Generation of phenotypically aged phosphatidylserine-expressing erythrocytes by dilauroylphosphatidylcholine-induced vesiculation.// Blood 1996, 87,2956-2961.

128. Dimitriou P.A., Depascouale A.K., Germenis A.E., Antipas S.P. Kinetics of heat-damaged homologous erythrocytes, a five compartmental analysis.// Eur J Nucl Med. 1990, 17, 49-54.

129. Dintenfass L. Blood microrheology. Viscosity factors in blood flow, ishemia and trombosis. // London, Butterworth. 1971.

130. Dobbe J.G., Hardeman M.R., Streekstra G.J., Strackee J., Ince C., Grimbergen C.A. Analyzing red blood cell-deformability distributions.// Blood Cells Mol Dis. 2002, 28, 373-384.

131. Dobbe J.G., Streekstra G.J., Hardeman M.R., Ince C., Grimbergen C.A. Measurement of the distribution of red blood cell deformability using an automated rheoscope.// Cytometry 2002, 50, 313-325.

132. Dodson R.A., Hinds T.R., Vincenzi F.F. Effects of calcium and A23187 on deformability and volume of human red blood cells.// Blood Cells 1987, 12(3), 555-564.

133. Domen RE. Adverse reactions associated with autologous blood transfusion evaluation and incidence at a large academic hospital. Transfusion 1998, 38, pp. 296 300.

134. Dormandy J. (ed.) In: Red cell deformability and filterability. Martinus Nijhoff Publishers, 1983, 84.

135. Dormandy J.A., Flute P., Matrai A., The new St George's blood filtrometer.// Clin. Hemorheol. 1985, 5,975-983.

136. Dumaswala UJ., .Petrosky T.L., Greenwalt T.J. Studies in red blood cell preservation. 6. Red cell membrane remodelling during rejuvenation.// Vox Sang. 1992, 63, 12-15.

137. Dumaswala U.J., Dumaswala R.U., Levin D.S., Greenwalt T.J. Improved red blood cell preservation correlates with decreased loss of bands 3, 4.1, acetylcholinesterase and lipids in microvesicles.// Blood 1996, 87,1612-1616.

138. Dumaswala U.J., Greenwalt T.J. Human erythrocytes shed exocytic vesicles in vivo.//Transfusion, 1984,24, 490-492.

139. Eaton W.A., Hofrichter J. Hemoglobin S gelation and sickle cell disease.//Blood 1987, 70(5), 1245-1266.

140. Ellman G, Courtney D, Featherstone R. A new and rapid colorimetric determination of of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol 1961 ;7: 88.

141. Ellory J.C., Nash G.B., Stone P.C. Mode of action and comparative efficacy of pharmacological agents that inhibit calcium-dependent dehydration of sickle cells.// Br. J. Pharmacol. 1992, 106(4), 972-977.

142. Engelman B. Ca homeostasis of human erythrocytes and its pathological implications.// Klin. Wochenschr. 1991, 69,137-141.

143. Engelmann В., Duhm J. Distinction of two components of passive Ca2+ transport into human erythrocytes by Ca2+ entry blockers.// Biochim. Biophys. Acta 1989,981,36-42.

144. Engstrom K.G., Moller В., Meiselman H.J. Optical evaluation of red blood cell geometry using micropipette aspiration.// Blood Cells, 1992, 18, 241257.

145. Erkilic A.B., Isbir M., Ozdem S., Ogutman C. The influence of blood pressure on intracellular Ca2+ content in erythrocytes: effects of cadmium chloride and nifedipine. // Clin Exp Hypertens 1996,18(1), 77-86.

146. Eschbach J.W, Adamson J.W. Anemia of end-stage renal disease (ESRD).// Kidney Int 1985,28, 1-5.

147. Eschbach J.W. The anemia of chronic renal failure: pathophysiology and the effect of recombinant erythropoietin.// Kidney Int 1989, 35, 134-148.

148. Eschbach J.W., Adamson J.W., Cook J.D. Disorders of red blood cell production in uremia.// Arch Intern Med 1970, 126, 812-815.

149. Eschbach J.W., Downing M.R., Egrie J.C., Browne J.K., Adamson J.W. USA multicenter clinical trial with recombinant human erythropoietin.// Contrib Nephrol 1989, 76, 160-165.

150. Evans E.A., Mohandas N., Leung A. Static and dynamic rigidities of normal and sickle erythrocytes. Major influence of cell hemoglobin concentration.//J. Clin. Invest. 1984, 73,477-488.

151. Evans E.A., Waugh R.E. Osmotic correction to elastic area compressibility measurements on red cell membrane.// Biophys. J. 1978, 20, 307-313.

152. Falchetto R., Vorherr Т., Brunner J., Carafoli E. The plasma membrane Ca2+ pump containes a site that interacts with its calmodulin binding domain.// J. Biol. Chem. 1991, 266,2930-2936.

153. Fathallah H., Sauvage M., Romero JR., Canessa M., Giraud F. Effects of PKC alpha activation on Ca2+ pump and K(Ca) channel in deoxygenated sickle cells.// Am J Physiol 1997, 273(4 Pt 1), C1206-C1214.

154. Feriani M., Kimmel P.L., Kurantsin-Mills J., Bosch J.P. Effect of renal replacement therapy on viscosity in end-stage renal disease patients.// Am J Kidney Dis. 1992, 19, 131-139.

155. Ferrant A., Leners N., Michaux J.L., Verwilghen R.L., Sokal G. The spleen and haemolysis evaluation of the intrasplenic transit time.// Br J Haematol. 1987, 65,31-34.

156. Fisher J.W., Hatch F.E., Roh B.L., Allen R.C., Kelley B.J. Erythropoietin inhibitor in kidney extracts and plasma from anemic uremic human subjects.// Blood 1968,31,440-452.

157. Freedman J., Hoffman J.H. Ionic and osmotic equilibria of human red cells treated with nystatin.// J. Gen. Physiol. 1979, 74, 157-185.

158. Friederichs E., Farley R.A., Meiselman H.J. Influence of calcium permeabilization and membrane-attached hemoglobin on erythrocyte deformability. Am. J. Hematol.// 1992,41,170-177.

159. Frieder ichs E., Meiselman H J. Effects of calcium permeabilization on RBC rheologic behavior.//Biorheology 1994, 31,207-215.

160. Fuhrm ann G.F., Huttermann J., Knauf P. A. The mechanism of vanadium action on selective K+-permeability in human erythrocytes.// Biochim Biophys Acta 1984, 769(1), 130-140.

161. Fung. Y.C., Tsang W.C.O., Patitucci P. High resolution data on the geometry of red blood cells.// Biorheology 1981, 18, 369-385.

162. Gafter U., Malachi Т., Barak H., Djaldetti M., Levi J. Red blood cell calcium homeostasis in patients with end-stage renal disease.// J Lab Clin Med. 1989, 114(3), 222-231.

163. Gallagher P.G., Ferriera J.D.S. Molecular basis of erythrocyte membrane disorders.// Curr Op Hematol. 1997, 4,128-135.

164. Galli F., Ronco C. Oxidant stress in hemodialysis.// Nephron 2000, 84, 1-5.

165. Garcia-Sancho J., Lew V.L. Detection and separation of human red cells with different calcium contents following uniform calcium permeabilization.// J Physiol. 1988, 407, 505-522.

166. Garcia-Sancho J., Lew V.L. Properties of the residual calcium pools in human red cells exposed to transient calcium loads.// J Physiol. 1988, 407, 541556.

167. Gardos G. The function of calcium in the potassium permeabilituy of human erythrocytes.// Biochim. Biophys. Acta 1958, 30, 653-654.

168. Gardos G., Szasz I., Sarkadi B. Effect of intracellular calcium on the cation transport processes in human red cells.// Acta Biol Med Ger 1977, 36, 823829.

169. Gardos G., Szasz I., Sarkadi B. Effect of intracellular calcium on the cation transport processes in human red cells.// Acta Biol. Med. Ger. 1977, 36, 823-829.

170. Gamier M., Koutsouris D., Hanss M. On the membrane determinant of the erythrocyte deformability.// Clin. Hemorheol, 1985, 5, 401-406.

171. Geert W., Schmid-SchOnbein G.W. Biomechanics of Microcirculatory Blood Perfusion.// Annu. Rev. Biomed. Eng. 1999, 73-102.

172. Gehrs B.C., Friedberg R.C. Autoimmune hemolytic anemia.// Am J Hematol. 2002,69(4), 258-271.

173. Gifford S.C., Frank M.G., Derganc J., Gabel Ch., Austin R.H., Yoshida Т., Bitensky M.W. Parallel microchannel based measurements of individual erythrocyte areas and volumes.// Biophys. J. 2003, 84, 623-633.

174. Greenwalt T.J., Bryan D.J., Dumaswala U.J. Erythrocyte membrane vesiculation and changes in membrane composition during storage in citrate-phosphate-dextrose-adenine-1.//Vox. Sang. 1984,47,261-270.

175. Greenwalt T.J., Dumaswala U.J. Effect of red cell age on vesiculation in vitro.// Br. J. Haematol. 1988, 68, 465-467.

176. Greenwalt T.J., Dumaswala U.J. Effect of red cell age on vesiculation in vitro.// Br. J. Haematol. 1988,68,465-467.

177. Greenwalt T.J., Steane E.A., Lau F.O., Sweeney-Hammond K. Aging of the human erythrocyte.// Prog Clin Biol Res. 1980, 43, 195-212.

178. Gregersen M.I., Bryant C.A., Hammerle W.E., Usami S., Chien S. Flow characteristics of human erythrocytes through polycarbonate sieves.// Science 1967, 157, 825-827.

179. Groom A.C. Microcirculation of the spleen. New concepts, new challenges.// Microvasc. Res. 1987, 34, 269-289.

180. Halperin J.A.,. Brugnara C., Nicholson-Weller A. Ca2+-activated K+ efflux limits complement-mediated lysis of human erythrocytes.// J. Clin. Invest. 1989, 83, 1466-1471.

181. Hanss M. Erythrocyte filterability measurement by the initial flow rate method.//Biorheology 1983,20, 199-211.

182. Hanss M., Koutsouris D. Thermal transitions of red blood cell deformability. Correlation with membrane rheological properties.// Biochim Biophys Acta 1984, 769(2), 461-470.

183. Harano Т., Yamaguchi Т., Kimoto E. Hemolytic properties of Ca2+-treated human erythrocytes under hydrostatic pressure.// J. Biochem. 1994, 116, 773-777.

184. Harbak H., Simonsen L. Residual Ca pump activity in vanadate-inhibited and in ATP-depleted human red cells.// J. Physiol. 1987, 390, 95P.

185. Hardeman M.R., Ince C. Clinical potential of in vitro measured red cell deformability, a myth?// Clin. Hemorheol. Microcirc. 1999, 21, 277-284.

186. Hasegawa S., Nomura Т., lino M., Shio H., Schechter A.N., Uyesaka N. Causal role of dense microspherocytes in anemia of hereditary spherocytosis: clinical importance of filtrability measurements through 3-цш pores.//Clin. Hemorheol. 1994, 14, 571-584.

187. Havell T.C., Hillman D., Lessin L.S. Deformability characteristics of sickle cells by microelastimetry.// Am. J. Hematol. 1978, 4, 9.

188. Hebbel R.P. Beyond hemoglobin polymerization: the red blood cell membrane and sickle disease pathophysiology.// Blood 1991, 77(2), 214-237.

189. Hebbel R.P., Boogaerts M.A., Eaton J.W., Steinberg M.H. Erythrocyte adherence to endothelium in sickle cell anemia: Possible determinant of disease severity.// N. Engl. J. Med. 1980, 302,992-995.

190. Hebbel R.P., Leung A., Mohandas N. Oxidation-induced changes in microrheologic properties of the red blood cell membrane.// Blood 1990, 76, 1015-1020.

191. Hebbel R.P., Mohandas N. Reversible deformation-dependent erythrocyte cation leak. Extreme sensitivity conferred by minimal peroxidation.// Biophys. J. 1991, 60(3), 712-715.

192. Hebbel R.P., Moldow C.F., Steinberg M.H. Modulation of erythrocyte-endothelian interactions and the vasoocclusive severity of sickling disorders.// Blood 1981, 58, 947-952.

193. Heinz A., Hoffman J.F. Membrane sidedness and the interaction of H+ and K+ on Ca2+-activated K+ transport in human red blood cells.// Proc. Natl.Acad. Sci. USA 1990, 87,1998-2002.

194. Higgins C.F. P-glycoprotein. To flip or not to flip?// Curr Biol 1994, 4, 259-260.

195. Higgins C.F: Flip-flop: The transmembrane translocation of lipids.// Cell 1994, 79, 393-395.

196. Hinshaw L. Sepsis/septic shock: participation of the microcirculation: an abbreviated review.// Crit. Care Med. 1996,24, 1072-1078.

197. Hurd T.B., Dasmahaptura В., Machiedo G. Red cell deformability in human and experimental sepsis.// Arch. Surg. 1988; 123, 217-220.

198. Ibrahim F.F., Ghannam M.M., Ali F.M. Effect of dialysis on erythrocyte membrane of chronologically hemodialysed patients.// Ren Fail. 2002, 24, 779-790.

199. Icardi A., Paoletti E., Traverso G.B., Sarchi C., Cappelli G„ Molinelli G. Red cell membrane during erythropoietin therapy in hemodialysis and in hemofiltration.// Int J Artif Organs. 1991, 14, 147-149.

200. Iida K., Whitlow M.B., Nussenzweig V. Membrane vesiculation protects erythrocytes from destruction by complement.// J Immunol 1991, 147(8), 26382642.

201. Inaba M., Gupta K.C., Kuwabara M., Takahashi B.E., Maede Y. Deamidation of human erythrocyte protein 4.1:possible role in aging.// Blood 1992, 79,3355-3361.

202. Iolascon A., Miraglia del Giudice E., Perrotta S., Alloisio N., Morle L., Delaunay J. Hereditary spherocytosis: from clinical to molecular defects.// Haematologica 1998, 83(3), 240-257.

203. Ismail N.H., Cohn E.J., Mollitt D.L. Nitric oxide synthase inhibition negates septic-induced alterations in cytoplasmic calcium homeostasis and membrane dynamics.// Am. Surg. 1997, 63(1), 20-23.

204. Jacobash G.S., Minakami S., Rapoport S.M. In: Cellular and Molecular Biology of Erythrocytes (Yoshikawa J. & Rapoport S.M., eds). University of Tokyo Press, Tokyo, 1974, 55.

205. Jiao Y., Okumiya Т., Saibara Т., Tsubosaki E., Matsumura H., Park K., Sugimoto K., Kageoka Т., Sasaki M. An enzymatic assay for erythrocyte creatine as an index of the erythrocyte life time.// Clin Biochem. 1998, 31(2), 59-65.

206. Jindal H.K., Zhaowei A.I., Gascard P., Horton C., Cohen C.M. Specific loss of protein kinase activities in Senescent erythrocytes.// Blood 1996, 88, 14791487.

207. Johnson R.M. Membrane stress increases cation permeability in red cells.// Biophys. J. 1994, 67, 1876-1881.

208. Johnson R.M., Gannon S.A. Erythrocyte cation permeability induced by mechanical stress: a model for sickle cell cation loss. Am. J. Physiol. 1990, 259, C746-C751.

209. Johnson R.M., Panchoosingh H., Goyette G.J., Ravindranath Y. Increased erythrocyte deformability in fetal erythropoiesis and in erythrocytes deficient in glucose-6-phosphate dehydrogenase and other glycolytic enzymes.// Pediatr Res 1999,45(1),106-113.

210. Johnson R.M., Ravindranath Y. Osmotic scan ektacytometry in clinical diagnosis.//J Pediat Hematol/Oncol. 1996,18, 122-129.

211. Johnson R.M., Tang K., Induction of a Ca2+-activated K+ channel in human erythrocytes by mechanical stress.// Biochim. Biophys. Acta 1992, 1107, 314-318.

212. Jones J.G., Adams R.A., Cook A.M. Examination of a rheological profile for blood using micropore filters.//Br. J. Haematol. 1999, 104(1), 100-107.

213. Jones J.G., Adams R.A., Evans S.A. Bulk filtration through micropore membranes for analysing blood cell rheology in clinical research.// Clin. Hemorheol. 1994, 14,149-153.

214. Jones J.G., Holland B.M., Humphrys J., Quew R., Wardrop C.A.J. Evaluation of the contribution of red and white blood cells to the flow of suspensions of washed blood cells through 3 цт Nuclepore membranes.// Br. J.Haematol. 1984, 57,457-466.

215. Kannan R., Labotka R., Low P.S. Isolation and characterization of the hemichrome-stablized membrane protein aggregates from sickle erythrocytes.// J Biol Chem. 1988,263, 13766-13773.

216. Kannan R., Yuan J., Low P.S. Isolation and partial characterization of antibody- and globin-enriched complexes from membranes of dense human erythrocytes.// Biochem J 1991,278, 57-62.

217. Kaplay S.S. Erythrocyte membrane in protein-energy malnutrion: A23187-induced changes in osmotic fragility of human and rat erythrocytes.//Biochem. Med. 1984,31,371-377.

218. Kaye M. The anemia associated with renal disease.// J Lab Clin Med 1957, 52, 83-100.

219. Keidan A.J., Noguchi C.T., Player M. Erythrocyte heterogeneity in sickle cell disease: effect of deoxygenation on intracellular polymer formation and rheology of sub-populations.// Br. J. Haematol. 1989, 72(2), 254-259.

220. Kelemen Ch., Shu Chien, Artmann G.M. Temperature transitions of human hemoglobin at body temperature. Effects of Calcium.// Biophys J. 2001, 80, 2622-2630b.

221. Kikuchi Y., Koyama Т., Koyama Y., Tozawa S., Arai Т., Horimoto M., Kakiuchi Y. Red blood cell deformability in renal failure.// Nephron 1982,30, 8-14.

222. Kikuchi Y., Sato K., Mizuguchi Y. Modified cell-flow microchannels in a single-crystal silicon substrate and flow behavior of blood cells.// Microvasc. Res. 1994, 47, 126-139.

223. Kim Y.R., Ornstein L. Isovolumetric sphering of erythrocytes for more accurate and precise cell volume measurement by flow cytometry.// Cytometry, 1983,3,419-427.

224. Kirkpatrick U.J., Adams R.A., Lardi A. McCollum C.N. Rheological properties and function of blood cells in stored bank blood and salvaged blood.// Br. J. Haematol. 1998, 101(2), 364-368.

225. Kirschenbaum L.A., Aziz M., Astiz M.E., Saha D.C., Rackow E.C. Influence of Rheologic Changes and Platelet-Neutrophil Interactions on Cell Filtration in Sepsis.// Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000, 161, 1602-1607.

226. Knauf P.A, Fuhrmann G.F., Rothstein S., Rothstein A. The relationship between anion exchange and net anion flow across the human red blood cell membrane.// J Gen Physiol. 1977, 69(3), 363-386.

227. Knofler R., Urano Т., Malyszko J., Takada Y., Takada A. In vitro effect of endothelin-1 on collagen, and ADP-induced aggregation in human whole blood and PRP.// Thr. Res. 1995, 77, 69-78.

228. Коп K., Maeda N., Shiga T. Erythrocyte deformation in shear flow, influences of internal viscosity, membrane stiffness, and hematocrit.// Blood 1987,69,727-734.

229. Kopec I., Slomkowski M., Przybyszewska M., Szczepanik K., Maj S. Long-term observation of patients with autoimmune hemolytic anemia.// Acta Haematol. Pol. 1991, 22(1), 58-68.

230. Korbut R., Gryglewski R.J. The effect of prostacyclin and nitric oxide on deformability of red blood cells in septic shock in rats.// J. Physiol. Pharmacol. 1996,47(4), 591-599.

231. Korn G.A., Korn T.M. Mathematical handbook for scientists and engineers. Definitions, theorems and formulas for reference and review. McGraw-Hill Book Company, INC. New York, Toronto, London, 1961.

232. Kourie J.I. Interaction of reactive oxygen species with ion transport mechanisms.// Am. J. Phywsiol. 1998, 275, C1-C24.

233. Koutsouris D., Guillet R., Lelievre J.C., Guillemin M.T., Bertholom P., Beuzard Y., Boynard M. Determination of erythrocyte transit times through micropores. I. Basic operational principles.// Biorheology, 1988, 25, 763-772.

234. Kuettner J.F., Dreher K.L., Rao G.H., Eaton J.W., Blackshear PL., White J.G. Influence of the ionophore A23187 on the plastic behavior of normal erythrocytes.// Am J Pathol. 1977, 88(1), 81-94.

235. Kurantsin-Mills J., Lessin L.S. Aggregation of intramembrane particles in erythrocyte membranes treated with diamide.// Biochim Biophys Acta 1981, 641, 129- 137.

236. Kuross S.A., Hebbel R.P. Nonheme iron in sickle erythrocyte membranes: Association with phospholipids and potential role in lipid peroxydation.//Blood 1988, 72,1278-1285.

237. Kuross S.A., Rank B.H., Hebbel R.P. Excess heme in sickle erythrocyte inside-out membranes: Possible role in thiol oxydation.// Blood 1988, 71,876-882.

238. Kuypers F.A., Lewis R.A., Hua M., Schott M.A., Discher D., Ernst J.D., Lubin B.H. Detection of altered membrane phospholipid asymmetry in subpopulations of human red blood cells using fluorescently-labeled annexin V. //Blood 1996, 87, 1179-1187.

239. Kuypers F.A., Scott M.D., Schott M.A., Lubin В., Chiu D.T. Use of ektacytometry to determine red cell susceptibility to oxidative stress.// J Lab Clin Med. 1990, 116(4), 535-545.

240. Lacelle P.L., Kirkpatrick F.H. Determinants of erythrocyte membrane elasticity. In: Erythrocyte structure and functions. G.J. Brewer (ed.) New York: Alan R. Liss, Inc., 1975, 535.

241. Lake W., Rasmussen H., Goodman D.B.P. Effect of ionophore A23187 upon membrane function and ion movement in human and toad erythrocytes.// J. Membrane Biol. 1977, 32, 93-113.

242. Langenfeld J.E., Livingsrton D.H., Machiedo G.W. Red cell deformability is a early indicator of infection.// Surgery 1991, 110 (2), 398-403.

243. Langenfeld J.E., Machiedo G.W., Lyons M., Rush B.F., Dikdan G, Lysz T.W. Correlation between red blood cell deformability and changes in hemodynamic function.// Surgery 1994,116(5), 859-867.

244. Laragh. J.H., Brenner B.M. Hypertension: Pathophysiology, diagnosis, and management. Raven Press; New York, 1990.

245. Larsen F.L., Katz S., Roufogalis B.D., Brooks DE. Physiological shear stresses enhance the Ca2+ permeability of human erythrocytes.// Nature 1981, 294, 667-668.

246. Lecklin Т., Egginton S., Nash G.B. Effect of temperature on the resistance of individual red blood cells to flow through capillary-sized apertures.// Pflugers Arch 1996, 432(5), 753-759.

247. Legge D.G., Shortman K. The effect of pH on the volume, density and shape of erythrocytes and thymus lymphocytes.// Br. J Hematol. 1968, 14, 323-335.

248. Lerche D., Kozlov M.M., Meier W. Time-dependent elastic extensional RBC deformation by micropipette aspiration: redistribution of the spectrin network?//Eur. Biophys. J. 1991, 19(6), 301-309.

249. Lew V.L., Raftos J.E., Sorette M., Bookchin R.M., Mohandas N. Generation of normal human red cell volume, hemoglobin content, and membrane area distributions by 'birth' or regulation?// Blood 1995, 86, 334-341.

250. Lew V.L., Tsien R.Y., Miner C., Bookchin R.M. Physiological Ca2+.i level and pump-leak turnover in intact red cells measured using an incorporated Ca chelator.// Nature 1982,298,478-481.

251. Li Q., Jungmann V., Kiyatkin A., Low P.S. Prostaglandin E2 stimulates a Ca2+-dependent K+ channel in human erythrocytes and alters cell volume and filterability.// J. Biol. Chem. 1996, 271(31), 18651-18656.

252. Linde Т., Ronquist G., Sandhagen В., Wikstrom В., Frithz G., Pettersson L., Danielson B.G. Treatment of renal anaemia with recombinant human erythropoietin results in decreased red cell uptake of 45Ca.// Nephron, 1994, 68, 419-426.

253. Linder A., Hinds T.R., Davidson R.C., Vincenzi F.F. Increased cytosolic free calcium in red blood cells is associated with essential hypertension in humans.// Am J Hypertens 1993, 6(9), 771-779.

254. Linderkamp O., Meiselman H.J. Geometric, osmotic, and membrane mechanical properties of desity-separated human red cells.// Blood 1982, 59, 1121.

255. Linderkamp O., Nash G.B., Wu P.Y.K., Meiselman H.J. Deformability and intrinsic material properties of neonatal red blood cells.// Blood 1986, 67, 1244-1250.

256. Lipowsky H.H., Cram L.E., Justice W., Eppihimer M.J. Effect of erythrocyte deformability on in vivo red cell transit time and hematocrit and their correlation with in vitro filterability.// Microvasc. Res. 1993,46,43-64.

257. Lisovskaya I.L., Rozenberg J.M., Yakovenko E.E., Ataullakhanov F.I. Maintenance of a constant area-to-volume ratio in density-fractionated human erythrocytes. Биол. Мембр.2003, 20, №2, 160-168.

258. Lisovskaya I.L., Shurkhina E.S., Nesterenko V.M., Rozenberg J.M., Ataullakhanov F.I. Determination of the content of nonfilterable cells in erythrocyte suspensions as a function of the medium osmolality. Biorheology 1998, v.35, №2, p. 141153.

259. Lisovskaya I.L., Shurkhina E.S., Yakovenko E.E., Tsvetaeva N.V., Kolodei S.V., Scherbinina S.P., Ataullakhanov F.I. Distributions of rheological parameters in populations of human erythrocytes. Biorheology 1999, v. 36, № 4, 299-309.

260. Liu S.C., Derick L.H., Agre P., Palek J. Alteration of erythrocyte membrane skeletal ultrastructure in hereditary spherocytosis, hereditary elliptocytosis, and hereditary pyropoikilocytosis.// Blood 1990, 76, 198-205.

261. Lobuglio A.F., Cotran R.S., Jandl J.H. Red cells coated with immunoglobulin G: binding and sphering by mononuclear cells in man.// Science 1967, 158, 1582-1584.

262. Loge J.P., Lange R.D., Moore C.V. Characterization of the anemia associated with chronic renal insufficiency.// Am J Med. 1958, 24,4-18.

263. London. M. The role of blood rheology in regulating blood pressure.// Clin. Hemorheol. Microcirc. 1997, 17(2), 93-106.

264. Low P.S., Waugh S.M., Zinke K., Drenckhahn D. The role of hemoglobin denaturation and band 3 clustering in red blood cell aging.// Science 1985, 227, 531-533.

265. Lutz H.U. Erythrocyte clearance, in Harris J.R. (ed): Blood Cell Biochemistry, vol 1. New York, NY, Plenum, 1990, p 81.

266. Lutz H.U., Gianora O., Nater M., Schweizer E., Stammler P. Naturally occurring anti-band 3 antibodies bind to protein rather than to carbohydrate on band 3.// J Biol Chem 1993,268,23562-23566.

267. Lutz H.U., Liu S.C., Palek J. Release of spectrin-free vesicles from human erythrocytes during ATP-depletion. I. Characterization of spectrin-free vesicles.// J. Cell. Biol. 1977, 74, 548-560.

268. Lutz H.U., Stammler P., Fasler S. Preferential formation of C3b-IgG complexes in vitro and in vivo from nascent C3b and naturally occurring anti-band 3 antibodies.// J Biol Chem 1993,268, 17418-17426.

269. Lutz H.U., Stringaro-Wipf G. Senescent red cell-bound IgG is attached to band 3 protein.//Biomed Biochim Acta 1983, 42, SI 17-S121 (suppl).

270. Lutz HU., Nater M., Stammler P. Naturally occuring anti-band 3 antibodies have a unique affinity for C3. Immunology 1993, 80, 191-196.

271. Lux S.E., Glader B.E. Disorders in the red cell membrane. In: Hematology of Infancy and Childhood, Nathan D.G., Oski F. (eds.) WB Saunders Company, Philadelphia, 1981, 456.

272. Mackie L.H., Hochmuth R.M. The influence of oxygen tension, temperature, and hemoglobin concentration on the rheologic properties of sickle erythrocytes.//Blood 1990; 76, 1256-1261.

273. Mackie LH, Frank RS, Hochmuth RM. Erythrocyte density separation on discontinuous "percoll" gradients.// Biorheology 1987, 24, 227-230.

274. Marchesi V.T. The red cell membrane skeleton: recent progress.// Blood, 1983,61,1-11.

275. Marcus A.J. Multicellular eicosanoid and other metabolic interactions of platelets and other cells. In: Hemostasis and Thrombosis: Principles and Clinical practice. Ed Colman R.W., Hirsh J., Marder V.J. Salzman E.W., Philadelphia, 1994.

276. Martin D.W., Jesty J. Calcium Stimulation of Procoagulant Activity in Human Erythrocytes. ATP dependence and the effects of modifiers of stimulation and recovery.// J. Biol. Chem. 1995, 270,10468-10474.

277. Martin M.C., Sanchez P.M., Iglesias S., De Paula A., Bustamante J. Oxidative stress in chronic renal failure.// Ren Fail 1999, 21, 155-167.

278. Martinov M.V., Plotnikov A.G., Vitvitsky V.M., Ataullakhanov F.I. Deficiencies of glycolytic enzymes as a possible cause of hemolytic anemia.// Biochim Biophys Acta. 2000, 1474(1), 75-87.

279. Martinov M.V., Vitvitsky V.M., Ataullakhanov F.I. Volume stabilization in human erythrocytes: combined effects of Ca2+dependent potassium channels and adenylate metabolism.//Biophys Chem. 1999, 80(3), 199-215.

280. Marvel J.S., Sutera S.P., Krogstad D.J., Zarkowsky H.S., Williamson J.R. Accurate determination of mean cell volume by isotope dilution in erythrocyte populations with variable deformability.// Blood Cells 1991, 17, 497-512.

281. Massry S.G. Pathogenesis of the anemia of uremia: Role of secondary hyperparathyroidism.// Kidney Int 1983, 16 (suppl 24), S204-S207.

282. Matrai A., Bogar L., Flute P.T., Dormandy J.A. Comparison of four blood filtration techniques.// Clin Hemorheol, 1984,4, 513-517.

283. McGoron A.J., Joiner C.H., Palascak M.B. Dehydration of mature and immature sickle red blood cells during fast oxygenation/deoxygenation cycles: role of KC1 cotransport and extracellular calcium.// Blood 2000; 95(6), 2164-2168.

284. McNamara M., Wiley J. Passive permeability of human red blood cells to calcium.// Am. J. Physiol. 1986, 250, C26-C31.

285. Meier W., Kucera W., Lerche D., Baumler H. Surface area and volume determined by micropipette aspiration for red blood cells in hypotonic and hypertonic salt solutions.// Studia Biophysica 1983, 93: 101-104.

286. Meier W., Paulitschke M., Lerche D., Schmidt G., Zoellner K. Action of rHuEpo on mechanical membrane properties of red blood cells in children with end-stage renal disease.//Nephrol Dial Transplant. 1991, 6, 110-116.

287. Meiselman H.J. Hemorheologic alterations in hypertension: chicken or egg?//Clin Hemorheol. Microcirc. 1999,21(3-4), 195-200.

288. Meiselman H.J., Baker R.F., Flow behavior of ATP-depleted human erythrocytes.//Biorheology 1977, 14,111-126.

289. Melloni E., Michetti M., Salamino F., Potremoli S . Molecular and functional properties of a calpain activator protein specific for ц-isoforms.// J Biol. Chem. 1998, 273(21), 12827-12831.

290. Messmann R., Gannon S., Sarniak S. Mechanical properties of sickle cell membranes.//Blood 1990, 75, 1711-1717.

291. Minetti G., Ciana A., Profumo A., Zappa M., Vercellati C., Zanella A., Arduini A., Brovelli A. Cell age-related monovalent cations content and density changes in stored human erythrocytes.// Biochim Biophys Acta 2001, 1527, 149155.

292. Minetti G., Piccinini G., Balduini C., Seppi C. and Brovelli A. Tyrosine phosphorylation of band 3 protein in Ca2+/A23187-treated human erythrocytes.// Biochem. J. 1996, 320, 445^50.

293. Mir M.A., Bobinski H. Altered membrane sodium transport and the presence of a plasma ouabain-like inhibitory factor in acute myeloid leukaemia.Clin Sci Mol Med. 1975,48(3), 213-218.

294. Mitchell RM, Robinson TJ. Monitoring dietary compliance in coeliac disease using red cell distribution width. Int J Clin Pract. 2002 May;56(4):249-250.

295. Mohandas N., Chasis J.A. Red blood cell deformability, membrane material properties and shape: regulation by transmembrane, skeletal and cytosolic proteins and lipids.// Seminars in Hematology 1993, 30, 171-192.

296. Mohandas N., Chasis J.A., Shohet S.B. The influence of membrane skeleton on red cell deformability, membrane material properties, and shape.// Semin Hematol. 1983, 20, 225-242.

297. Mohandas N., Clark M.R., Jacobs M.S., Shohet S.B. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability.// J Clin Invest. 1980, 66, 563-573.

298. Mohandas N., Groner W. Cell membrane and volume changes during red cell development and aging.// Ann NY Acad. Sci 1989, 554, 217-224.

299. Mokken F.Ch., Kedaria M., Henny Ch.P., Hardeman M.R., Gelb A.W. The clinical importance of erythrocyte deformability, a hemorheological parameter.// Ann Hematol 1992, 64, 113-122.

300. Montero A.J., Garcia-Sancho J. High affinity inhibition of Ca-dependent К channels by cyt P-450 inhibitors.// J. Biol Chem 1992, 267(17), 11789-11793.

301. Moore R.B., Mankad M.V., Shriver S., Mankad V.N., Plishker G.A. Reconstitution of Ca2+ -dependent К transport in erythrocyte membrane vesicles requires a cytoplasmic protein.// J Biol. Chem. 1991,266, 18964-18968.

302. Moriyana Y, Fisher J.W. Effects of erythropoietin on erythroid colony formation in uremic rabbit bone marrow cultures.// Blood 1975, 45,659-664.

303. Mueller T.J., Jackson C.W., Dokter M.E., Morrison M. Membrane skeletal alterations during in vivo mouse red cell aging. Increase in the band 4.1a:4.1b ratio.// J Clin Invest. 1987, 79,492-499.

304. Mueller T.J., Morrison M. Glycoconnectin (PAS 2), a membrane attachment site for the human erythrocyte cytoskeleton. In: Erythrocyte Membranes 2: Recent Clinical and Experimental Advances, Alan R. Liss, New York, 1981,95.

305. Murdock R.C., Reynolds C., Sarelius I.H., Waugh R.E. Adaptation and survival of surface-deprived red blood cells in mice.// Am J Physiol Cell Physiol 2000, 279(4), C970-C980.

306. Nagel R.L. Developments in sickle cell anemia research. Introduction.// Experientia 1993,49(1), 5-15.

307. Nakamura Т., Hasegawa S., Shio H., Uyesaka N. Rheologic and pathophysiologic signigficance of red cell passage through narrow pores. // Blood Cells. 1994, 20, 151-168.

308. Nakashima K, Oda S, Miwa S. Red cell density in various blood disorders.// J.Lab. Clin.Med.l973, 82, 297-302.

309. Nash G.B. Filterability of blood cells, methods and clinical application. Biorheology 1990, 27, 873-882.

310. Nash G.B., Boghossian S., Parmar J. Alteration of the mechanical properties of sickle cells by repetitive deoxygenation: role of calcium and the effects of calcium blockers. //Br J Haematol 1989, 72,260-264.

311. Nash G.B., O'Brien E., Gordon-Smith E.C., Dormandy J.A. Abnormalities in the mechanical properties of red blood cells caused by Plasmodium falciparum.//Blood 1989, 74, 855-861.

312. Nash G.B., Wyard S.J. Changes in surface area and volume measured by micropipette aspiration for erythrocytes ageing in vivo.// Biorheology 1980, 17, 479-484.

313. Nash G.B., Wyard S.J. Erythrocyte membrane elasticity during in vivo ageing.// Biochim. Biophys. Acta 1981, 643,269-275.

314. Ney P.A., Christopher M.M., Hebbel R.P. Synergistic effects of oxidation and deformation on erythrocyte monovalent cation leak.// Blood 1990, 75, 11921198.

315. Neyses L., Stimpel M., Locher R., Streuli R., Kuffer В., Vetter W. Cholesterol and its oxidized derivatives modulate the calcium channel in human red blood cells.// J. Hypertens. Suppl. 1984, 2(3), S489-S492.

316. Nieuwland R., Berckmans R.J., McGregor S., Boing A.N., Romijn F.P., Westendorp R.G., Hack C.E., Sturk A. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis.// Blood 2000, 95, 930-935.

317. Nieuwland R., Berckmans R.J., Rotteveel-Eijkman R.C., Maquelin K.N., Roozendaal K.J., Jansen P.G., et. al. Cell-derived microparticles generated in patients during cardiopulmonary bypass are highly procoagulant. Circulation.// 1997,96, 3534-3541.

318. Nowak E., Wyrwicz G., Dabrowski Z., Smolenski O., Spodaryk K. Rheological properties of red blood cells (including reticulocytes) in patients with chronic renal disease.// Clin Hemorheol Microcirc. 1999, 21, 87-94.

319. Olivieri O., deFranceschi L., de Gioncoli M. et al. Potassium loss and cellular dehydratationof stored erythrocytes following incubation in autologous plasma: role of the KC1 cotransport system.// Vox Sang. 1993, 65, 95-102.

320. Oonishi Т., Sakashita K., Uyesaka N. Regulation of red blood cell filterability by Ca2+ influx and cAMP-mediated signaling pathways.// Am J Physiol. 1997, 273(6 Pt 1), C1828-C1834.

321. Op den Kamp J.A.F. Lipid asymmetry in membranes.// Annu. Rev. Biochem. 1979,48,47-71.

322. Orlov S.N., Pokudin N.I., Postnov Y.V. Calcium transport in erythrocytes of rats with spontaneous hypertension.// J. Hypertens. 1988,6, 829-837.

323. Ott P., Hope M.J., Verkley A.J., Roelofsen В., Brodbeck U., van Deenen L.L.M. Effect of dimyristoylphosphatidylcholine in intact erythrocytes: release of spectrin-free vesicles without ATP depletion.// Biochim. Biophys. Acta 1981, 641,79.

324. Palinski W., Torsellini A., Doni L. Influence of platelet activation of erythrocyte deformability. Thromb Haemost. 1983 49:84-86.

325. Park Y.S., Solomon S. The effect of amphotericin В on erythrocyte volume and cation content. Yonsei Medical Journal 1977, 18(2), 114-122.

326. Parthasarathi К, Lipowsky H.H. Capillary recruitment in response to tissue hypoxia and its dependence on red blood cell deformability.// Am. J. Physiol 1999, 277(6 Pt 2), H2145-H2157.

327. Paulitschke M., Nash G.B. Micropipette methods for analysing blood cell rheology and their application to clinical research.// Clin. Hemorheol. 1993, 13, 407-434.

328. Pekrun A., Gratzer W.G. Disorders of the red-cell membrane.// Curr. Opinion Pediat. 1990, 2, 116.

329. Persson S., Hedner P. Erythrocyte deformability measured by filtrometry. Influence of filtration pressure, MCH and MCHC.// Clin. Hemorheology 1993, 13, 791-801.

330. Petitfrere E., Nguyen P., Mailliot J.L., Culioli-Pickel В., Potron G. Alterations in erythrocyte membrane. Effect of neutrophil activation.// J Mai Vase. 1991, 16(3), 275-278.

331. Pettit K.L., Hunt W.B., George S.J., Barnes A.J. The use of nickel and polycarbonate filters to assess erythrocyte filterability in control subjects and diabetic patients.// Clinical Hemorheology 1993, 13, 661-670.

332. Pfafferott C., Nash G.B., Meiselman H.J. Red blood cell deformation in shear flow. Effects of internal and external phase viscosity and of in vivo aging.// Biophys. J. 1985, 47, 695-704.

333. Pfeffer S.R., Swislocki N.I. Role of peroxidation in erythrocyte aging.// Mech Ageing Dev. 1982, 18(4), 355-367.

334. Piccinini G., Minetti G., Balduini C., Brovelli A. Oxidation state of glutathione and membrane proteins in human red cells of different age.// Mech Ageing Dev 1995, 78(1), 15-26.

335. Piomelli S., Seaman C. Mechanism of red blood cell aging: relationship of cell density and cell age.// Am J Hematol 1993,42(1), 46-52

336. Powell R.J., Machiedo G.W., Rush B.F., Dikdan G. Oxygen free radicals: effect on cell deformability in sepsis.// Crit. Care Med. 1991, 19(5), 732-735.

337. Prall Y.G., Gambhir K.K., Ampy F.R. Acetylcholinesterase: an enzymatic marker of human red blood cell aging.// Life Sci. 1998, 63(3), 177-184.

338. Racca A., Biondi C., Cotorruelo C., Galizzi S., Rasia R.J., Stoltz J.F., Valverde J. Senescent erythrocytes: modification of rheologic properties, antigenic expression and interaction with monocytes. Medicina (Buenos Aires) 1999, 59, 33-37.

339. Racek J. Influence of antioxidants on the quality of stored blood.// Vox Sang. 1997, 72, 16-19.

340. Radtke H.W., Frei U., Erbes P.M., Schoeppe W., Koch K.M. Improving anemia by hemodialysis: Effect on serum erythropoietin.// Kidney Int 1980, 17, 382-387.

341. Radtke H.W., Klaussner A., Erbes P.M., Scheuermann E.H., Schoeppe W., Koch K.M. Serum erythropoietin concentration in CRF: relationship to degree of anemia and excretory renal function.// Blood 1979, 54, 877-884.

342. Reid H.L., Barnes A.J., Lock P.J., Dormandy J.A., Dormandy T.L. A simple method for measuring erythrocyte deformability. J Clin. Pathol. 1976, 29, 855-858.

343. Reinhart W., Wyss E.J., Arnold D., Ott P. Hereditary spherocytosis associated with protein band 3 defect in a Swiss kindred.// Br. J. Haematol. 1994, 86, 147-155.

344. Reinhart W.H. The influence of extracorporal circulation on erythrocyte and flow properties of blood.// J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1990, 100 (4), 538545.

345. Reinhart W.H., Chien S. Roles of cell geometry and cellular viscosity in red cell passage through narrow pores.// Am. J. Physiol. 1985, 248, 473.

346. Reinhart W.H., Huang C., Vayo M., Norwich G„ Chien S., Skalak R. Folding of red blood cells in capillaries and narrow pores.// Biorheology 1991, 28(6), 537-549.

347. Reinhart W.H., Straub P.W. Detection of less deformable erythrocytes in suspensions: evaluation of different rheological tests.// Clin. Hemorheol.1988, 8, 861876.

348. Reinhart W.H., Usami S., Schmalzer E.A., Lee M.M., Chien S. Evaluation of red blood cell filterability test: influences of pore size,// hematocrit level, and flow rate. J Lab Clin Med. 1984,104(4), 501-516.

349. Rettig M.P., Low P.S., Gimm J.A., Mohandas N., Wang J., Christian J.A. Evaluation of Biochemical Changes During In Vivo Erythrocyte Senescence in the Dog.// Blood 1999, 93, 1, 376-384.

350. Rittmeyer 1С., Nydegger UE. Influence of the cryoprotective agents glycerol andhydroethyl starch on red blood cell ATP and 2,3-diphosphoglyceric acid levels. Vox Sang. 1992, 62, pp. 141-145.

351. Rivera A., Jarolim P., Brugnara C. Modulation of Gardos channel activity by cytokines in sickle erythrocytes.// Blood 2002, 99, 357-363.

352. Rivera A., Rotter M., Brugnara C. Endothelins activate Ca2+-gated K+ channels via endothelin В receptors in CD-I mouse erythrocytes.// Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1999, 277, C746-C754.

353. Roggenkamp H.G., Kiesewetter H., Schmeink Т., Hollweg H.G. A new procedure for the quantification of erythrocyte deformability.// Biomed Tech (Berl). 1982, 27, 162-166.

354. Rohn T.T., Hinds T.R., Vincenzi F.F. Inhibition of the Ca pump of intact red blood cells by t-butyl hydroperoxide: importance of of glutathione peroxydase.// Biochim. Biophys. Acta 1993, 1153,67-76.

355. Romero P.J. Possible new modulators of the calcium pump of human erythrocytes Review. // Acta Cient Venez. 1993, 44(2), 74-80.

356. Romero P.J. Role of membrane-bound Ca in ghost permeability to Na and K.// J. Membr. Biol. 1976, 29, 329-343.

357. Romero P.J., Romero E.A. Differences in Ca2+ pump activity between sub-populations of human red cells.// Cell Calcium 1997, 21, 353-358.

358. Romero P.J., Romero E.A. Effect of cell ageing on Ca2+ influx into human red cells.// Cell Calcium 1999,26(3-4), 131-137.

359. Romero P.J., Romero E.A. The role of calcium metabolism in human red blood cell ageing: a proposal.//Blood Cells Mol Dis 1999, 25(1), 9-19.

360. Romero P.J., Romero E.A., Moraima D., Winkler B. Ionic calcium content of light & dense human red cells separated by percoll density gradients.// Biochim. Biophys. Acta 1997, 1323, 23-28.

361. Rosier F., M'Zali H., Giraud F. Cholesterol depletion affects the Ca2+ influx but not the Ca2+ pump in human erythrocytes.// Biochim. Biophys. Acta 1986, 863(2), 253-263.

362. Ross P.D., Minton A.P. Hard quasispherical model for the viscosity of hemoglobin solutions.// Biochem. Biophys. Res. Comm. 1977, 76, 971-976.

363. Rosse W.F. The spleen as a filter.// N Engl J Med. 1987, 317, 704-706.

364. Rossi J.P., Garrahan P.J., Rega A.F. Vanadate inhibition of active Ca2+ transport across human red cell membranes. Biochim Biophys Acta // 1981, 648(2), 145-150.

365. Rumbsy M.G., Barnes Y.W., Hoare D.G., Tovey L.A.D. Studies of the ageing of human erythrocytes in vitro.// Biochem. Soc. Trans. 1974,2, 550.

366. Rumbsy M.G., Trotter J., Allan D., Michell R.H. Recovery of membrane micro-vesicles from human erythrocytes stored for transfusion: a mechanism for the erythrocyte discocyte-to-spherocyte shape transformation.// Biochem. Soc. Trans. 1977, 5, 126.

367. Sakashita K., Oonishi Т., Ishioka N., Uyesaka N. Endothelin-1 improves the impaired filterability of red blood cells through the activation of protein kinase C. Jpn J Physiol.// 1999,49(1), 113-120.

368. Salamino F., Sparatore В., Melloni E., Michetti M., Viotti P.L., Pontremoli S., Carafoli E. The plasma membrane calcium pump is the preferred calpain substrate within the erythrocyte.// Cell Calcium 1994, 5(1), 28-35.

369. Samaja M., Rubinacci A., Motterlini R., De Ponti A., Portinaro N. Red cell aging and active calcium transport.//Exp. Gerontol. 1990, 25(3-4), 279-286.

370. Sandhagen B. Red cell fluidity in hypertension. Clin. Hemorheol. Microcirc. 1999,21 (3-4), 179-181.

371. Scharff O. Regulation of cytosolic calcium in blood cells.// Physiol. Rev. 1993, 73, 547-582.

372. Schatzmann H.J. ATP-dependent Ca++ extrusion from human red cells.// Experentia 1966,22, 364-368.

373. Schauf В., Aydeniz В., Bayer R., Wallwiener D. The laser diffractoscope -a new and fast system to analyse red blood cell flexibility with high accuracy.// Lasers Med Sci 2003, 18(1), 45-50.

374. Schlegel R.A., Prendergast T.W., Williamson P. Membrane phospholipid asymmetry as a factor in erythrocyte-endothelial cell interactions.// J. Cell Physiol. 1985, 123,215-218.

375. Schluter K., Drenckhahn D. Co-clustering of denatured hemoglobin with band 3: Its role in binding of autoantibodies against band 3 to abnormal and aged erythrocytes.// Proc Natl Acad Sci USA 1986, 83, 6137-6141.

376. Schmid-Schoenbein G.W., Seiffge D., DeLano F.A. Leukocyte counts and activation in spontaneously hypertensive and normotensive rats.// Hypertension 1991, 17, 323-330.

377. Scholtz P., Karris J., Gump F. Correlation of blood rheology with vascular resistance in critically ill patients.// J. Appl. Physiol. 1975, 49, 1008-1011.

378. Schrier S.L. Red cell membrane biology.// Clin. Haematol. 1985, 14, 1-12.

379. Schroit A.J., Zwaal R.F.A. Transbilayer movement of phospholipids in red cell and platelet membranes.// Biochim Biophys Acta 1991, 1071, 313-329.

380. Schwartz R.S., Musto S., Fabry M.E. Two distinct pathways mediate the formation of intermediate density cells and hyperdense cells from normal density sickle red blood cells.// Blood 1998, 92(12), 4844-4855.

381. Secomb T.W., Hsu R. Analysis of red blood cell motion through cylindrical micropores: effects of cell properties.// Biophys. J. 1996, 71, 10951101.

382. Segel G.B., Feig S.A., Glader B.E., Muller A., Dutcher P., Nathan D.G.// Blood, 1975,46, 271.

383. Seidler N.W., Swislocki N.I. The effects of pentoxifylline on the plasma membrane Ca2+ ATPase in age-separated rat and human erythrocytes.// J Clin Pharmacol 1992, 32(4), 332-337.

384. Serrani R.E., Gioia I.A., Corchs J.L. The homogeneous effect of calcium ionophore A23187 on potassium loss in human foetal red cell populations.// Physiol. Res. 1995,44(5), 275-280.

385. Shen K., DeLano F.A., Zweifach B.W. Circulating leukocyte counts, activation, and degranulation in Dahl hypertensive rats.// Circ. Res. 1995, 76, 276-283.

386. Shiga Т., Maeda N. Suda Т., Коп K., Sekiya M., Oka S. A kinetic measurement of red cell deformabillity: A modified micropipette technique.// Jap. J. Physiol 1979,29, 707-722.

387. Shiga Т., Sekiya M., Maeda N., Коп K., Okazaki M. Cell-age dependent changes in deformability and Ca accumulation of human erythrocytes.// Biochim. Biophys. Acta 1985, 814, 289-299.

388. Shiga Т., Sekiya M., Maeda N., Коп K., Okazaki M. Cell-age dependent in deformability and Ca accumulation of human erythrocytes.// Biochim. Biophys. Acta 1985,814,289-299.

389. Silveira P., Cynober Т., Dhermy D., Mohandas N., Tchernia G. Red blood cell abnormalities in hereditary elliptocytosis and their relevance to variable clinical expression. //Am J Clin Pathol 1997, 108, 391-399.

390. Simon G., Engel C.R. Reduced sodium concentration and increased sodium-potassium pump activity of erythrocytes in human hypertension.// Hypertension 1987, 9(6 Pt 2), 13-18.

391. Simonsen L.O., Gomme J., Lew V.L. Uniform ionophore A23187 distribution and cytoplasmic calcium buffering in intact human red cells.// Biochim. Biophys. Acta 1982, 692(3), 431-440.

392. Skalak R., Soslowsky L., Schmalzer E., Impelluso Т., Chien S. Theory of filtration of mixed blood suspensions.// Biorheology 1987, 24, 35-52.

393. Snyder L.M., Fairbanks G., Trainor J., Fortier N.L., Jacobs J.B., Leb L. Properties and characterization of vesicles released by young and old human red cells.//Br. J. Haematol. 1985, 59, 513-522.

394. Soldati L.,.Spaventa R., Vezzoli G., Zerbi S., Adamo D., Caumo A., Rivera R., Bianchi G. Characterization of voltage-dependent calcium influx in human erythrocytes by fura-2.// Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997, 236, 549554.

395. Song S.H., Groom A.C. The distribution of red cells in the spleen.// Can J Physiol Pharmacol. 1971, 49, 734-743.

396. Sorette M., Mohandas N. Measurement of surface area and sphericity of red cells and reticulocytes: application to diagnosis of red cell membrane disorders.// Blood 1996, 88,461a.

397. Starzyk D., Korbut R., Gryglewski R.J. The role of nitric oxide in regulation of deformability of red blood cells in acute phase of endotoxaemia in rats.// J. Physiol. Pharmacol. 1997, 48(4), 731-735.

398. Staubli М., Stone P.C., Straub P.W., Stuart J. Evaluation of methods for measuring erythrocyte deformability.// Clin. Hemorheol. 1986, 6, 589-602.

399. Stout J.G., Basse F., Lubin R.A., Weiss H.J., Wiedmer Т., Sims P.J. Scott syndrome erythrocytes contain a membrane protein capable of mediating Ca-dependent transbilayer migration of membrane phospholipids.// J.Clin Invest. 1997, 99(9), 2232-2238.

400. Stuart J., Johnson C.S. Rheology of the sickle cell disorders.// Bailliere's Clin. Haematol. 1987, 1, 747-775.

401. Stuart J., Nash G.B. Technological Advances in Blood Rheology.// Crit-Rev-Clin-Lab-Sci 1990, 28, 61-93.

402. Sugihara Т., Hebbel R.P. Exaggerated cation leak from oxygenated sickle red blood cells during deformation: evidence for a unique leak pathway.// Blood 1992, 80(9), 2374-2378.

403. Sugihara Т., Rawicz W., Evans E.A., Hebbel R.P. Lipid hydroperoxides permit deformation-dependent leak of monovalent cation from erythrocytes. //Blood 1991, 77(12), 2757-2763.

404. Sugihara Т., Rawicz W., Evans E.A., Hebbel R.P. Lipid hydroperoxides permit deformation-dependent leak of monovalent cation from erythrocytes.// Blood 1991, 77(12), 2757-2763.

405. Sugihara Т., Yawata Y., Hebbel R.P. Deformation of swallen erythrocytes provides a model of sickling-induced leak pathways, including a novel bromide-sensitive component.// Blood, 83,9,2684-2691.

406. Sulpice J.C., Zachowski A., Devaux P.F., Giraud F. Requirement for phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Ca2+-induced phospholipid redistribution in the human erythrocyte membrane.// J Biol Chem 1994, 269, 6347-6354.

407. Sutera S.P., Gardner R.A., Boylan C.W., Carroll G.L., Chang КС., Marvel JS. Age-related changes in deformability of human erythrocytes.// Blood 1985, 65(29), 275-282.

408. Sutera S.P., Pierre P.R., Zahalak G.I. Deduction of intrinsic mechanical properties of the erythrocyte membrane from observations of tank-treading in the rheoscope.//Biorheology 1989, 26, 177-197.

409. Sutton N., Tracey M.C., Johnston I.D., Greenaway R.S., Rampling M.W. A novel instrument for studying the flow behaviour of erythrocytes throughmicrochannels simulating human blood capillaries.// Microvasc. Res. 1997, 53, 272-281.

410. Suzuki H., Swei A., Zweifach B.W., Schmid-Schonbein G.W. In vivo evidence for microvascular oxidative stress in spontaneously hypertensive rats: Hydroethidine microfluorography.//Hypertension 1995,25, 1083-1089.

411. Suzuki Т., Dale G.L. Senescent erythrocytes. The isolation of in vivo aged cells and their biochemical characteristics.// Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85, 1647-1651.

412. Suzuki Y., Tateishi N., Cicha I., Shiba M., Muraoka M., Tadokoro K., Maeda N. Decreased deformability of the X-ray-irradiated red blood cells stored inmannitol-adenine-phosphate medium.// Clin. Hemorheol. Microcirc. 2000, 22(2), 131-141.

413. Svenmarker S., Jansson E., Stenlund H., Engstrom K.G. Red blood cell trauma during cardiopulmonary bypass: narrow pore filterability versus free haemoglobin.// Perfusion 2000, 15(1), 33-40.

414. Swei A., Lacy F., DeLano F.A. Schmid-Schonbein G.W. Oxidative stress in the Dahl hypertensive rat.//Hypertension 1997, 30,1628-1633.

415. Swislocki N.I., Tierney J.M. Prevention by pentoxifylline of transient Ca2+ accumulation and transglutaminase activation in rat erythrocytes.// J Clin Pharmacol 1991, 31(6), 531-536.

416. Szasz I., Sarkadi В., Gardos G. Mechanism of Ca-dependent selective K-transport induced by propranolol in red cells.// J Membr Res. 1977, 35, 75-93.

417. Tait J.F., Gibson D. Measurement of membrane phospholipid asymmetry in normal and sickle-cell erythrocytes by means of annexin V binding.// J Lab Clin Med 1994, 123,741-748.

418. Tavazzi В., Di Pierro D., Amorini A. M., Fazzina G., Tuttobene M., Giardina В., Lazzarino G. Energy metabolism and lipid peroxidation of human erythrocytes as a function of increased oxidative stress.// Eur. J. Biochem 2000, 267, 684-689.

419. Teitel P. Recent progress in improving data processing in filtration measurements.//Biorheology 1984, Suppl. 1, 231-240.

420. Tiffert T, Lew VL. Kinetics of inhibition of the plasma membrane calcium pump by vanadate in intact human red cells. Cell Calcium. 2001 Nov;30(5):337-342.

421. Tiffert Т., Spivak J.L., Lew V.L. Magnitude of calcium influx required to induce dehydration of normal human red cells.// Biochim Biophys Acta 1988, 943,157-165,

422. Tillman W., Levin C., Prindull G., Schroter W. Rheological properties of young and aged human erythrocytes.// Klinische Wochenschrift 1980, 58, 569574.

423. Tillmann W. Reduced deformability of erythrocytes as a common denominator of hemolytic anemias.// Wien Med Wochenschr. 1986, 136 Spec No, 14-16

424. Todd J.C., Mollit D.L. Effect of sepsis on erythrocyte intracellular calcium homeostasis.// Clin. Care Med. 1995,23, 459-465.

425. Todd J.C., Mollitt DL. Sepsis-induced alterations in the erythrocyte membrane.// Am. Surg. 1994, 60(12), 954-957.

426. Touyz RM., Milne F.J., Reinach S.G. Intracellular Mg2+, Ca2+ Na+ and K+ in.platelets and erythrocytes of essential hypertension patients: relation to blood pressure.// Clin Exp Hypertens 1992,14(6), 1189-1209.

427. Tran-Son-Tay R., Sutera S.P., Zahalak G.I., Rao P.R. Membrane stress and internal pressure in a red blood cell freely suspended in a shear flow.// Biophys. J. 1987,51,915-924.

428. Trautsch C., Tannert C., Maretzki D. Disproportional loss of membrane constituents in the course of erythrocyte aging.// Acta Biol Med Ger. 1981, 40(6), 743-746.

429. Tsuda K., Minatogawa Y., Furuya S. Enhanced calcium-sensitivity of erythrocytes in hypertension -calcium-induced changes of erythrocyte osmotic fragility in essential hypertension.// Japanese Circulation Journal 1986, 50, 11 Sell 64.

430. Tsuda K., Minatogawa Y., Tsuda S. Alterations in calcium-handling of erythrocytes in spontaneously hypertensive rats. Calcium-induced changes in the osmotic fragility of erythrocytes in hypertension.// Japanese Circulation Journal 1987,28, 923-931.

431. Turrini F., Arese P., Yuan J., Low P.S. Clustering of integral membrane proteins of the human erythrocyte membrane stimulates autologous IgG binding, complement deposition, and phagocytosis.// J Biol Chem. 1991, 266, 2361123617.

432. Turrini F., Mannu F., Arese P., Yuan J., Low P.S. Characterization of the autologous antibodies that opsonize erythrocytes with clustered integral membrane proteins.// Blood 1993, 81, 3146-3152^

433. Usberti M., Lima G., Arisi M., Bufano G., D'Avanzo L., Gazzotti R.M. Effect of exogenous reduced glutathione on the survival of red blood cells in hemodialyzed patients.// J Nephrol 1997, 10, 261-265.

434. Uyesaka N., Hasegawa S., Imai H., Nakamura Т., Furuhama K. Possible role of red cell deformability and microvasculature in microcirculation.// Jpn J Physiol 1992,42, 891-904.

435. Vacha J. Red cell life span. In: Red Blood Cells of Domestic Mammals. Agar N.S., Board P.G. (eds), Elsevier Science, Amsterdam, The Netherlands, 1983, 67.

436. Varecka L., Carafoli E. Vanadate-induced movements of Ca2+ and K+ in human red blood cells.// J Biol Chem 1982, 257(13), 7414-7421.

437. Vassar P.S., Hards J.M., Brooks D.E., Hagenberger В., Seaman G.V.R. Physicochemical effects of aldehydes on the human erythrocytes.// J. Cell Biol. 1972, 53, 809-818.

438. Vicaut E., Microcirculation and arterial hypertension.// Drugs 1999, 59, 110.

439. Victoria E.J., Pierce S.W., Branks M.J., Masouredis S.P. IgG red blood cell autoantibodies in autoimmune hemolytic anemia bind to epitopes on red blood cell membrane band 3 glycoprotein.// J Lab. Clin Med. 1990, 115(1), 74-88.

440. Vincenzi F.F., Cambareri J.J. Apparent ionophoric effects of red blood cell deformation.// Prog Clin Biol Res 1985, 195,213-225.

441. Vincenzi F.F., Hinds T.R. Decreased Ca pump ATPase activity associated withincreased density in human red blood cells.//Blood Cells. 1988, 14(1), 139-159.

442. Viswanath D, Hegde R, Murthy V, Nagashree S, Shah R. Red cell distribution width in the diagnosis of iron deficiency anemia. Indian J Pediatr. 2001 Dec;68(12):l 117-1119.

443. Vitvitsky V.M., Frolova E.V., Martinov M.V., Komarova S.V., Ataullakhanov F.I. Anion permeability and erythrocyte swelling. Bioelectrochemistry 2000, 52(2), 169-177.

444. Voerman H.J., Fonk Т., Thijs L.G. Changes in hemorheology in patients with sepsis or septic shock.// Circ. Shock 1989, 29(3), 219-227

445. Wagner G.M., Chiu D., Yee M.C., Lubin B.H. Red cell vesiculation a common membrane physiologic event.// J. Lab. Clin. Med. 1986, 108, 315-324.

446. Wagner G.M., Chiu D.T., Qju J., Heath RH, Lubin ВН. Spectrin oxidation correlates with membrane vesiculation in stored red blood cells.// Blood 1987, 69, 1777-1781.

447. Wagner G.M., Chiu D.T.Y., Lubin B.H., Lubin B.H. Red cell vesiculation a common membrane physiologic event.// J. Lab. Clin. Med. 1986, 108, 315-324.

448. Wagner G.M., Schwartz R.S., Chiu D.T., Lubin B.H. Membrane phospholipid organization and vesiculation of erythrocytes in sickle cell anemia.// Clin. Haematol. 1985, 14, 183-200.

449. Wallas C.H. Sodium and potassium changes in blood bank stored human erythrocytes.// Transfusion 1979, 19, 210-215.

450. Wallner S.F., Kurnick J.E., Ward H.P., Vautrin R., Alfrey A.C. The anemia of chronic renal failure and chronic diseases: In vitro studies of erythropoiesis.// Blood 1976, 47, 561-569.

451. Wallner S.F., Vautrin R.M. Evidence that inhibition of erythropoiesis is important in the anemia of chronic renal failure.// J Lab Clin Med 1981, 97,170-178.

452. Wang C., Zeng Y. Ka W. The influence of calcium ions and ionophore A23187 on microrheological characteristics of erythrocytes by new model ektacytometry.// Clin. Hemorheol. Microcirculation 2001, 24(1), 19-23.

453. Watcher C.J., Frattini P.L., Hung T.C. Erythrocyte deformability in patients during left ventriular assistance.// Clin. Hemorheol. 1991, 11(5), 325-337.

454. Waugh R.E., Agre P. Reductions of erythrocyte membrane viscoelastic coefficients reflect spectrin deficiencies in hereditary spherocytosis.// J. Clin. Invest. 1988,81, 133-141.

455. Waugh R.E., Hwang W.C., Sarelius I.H. Combined use of fluorescence microscopy and micromechanical measurement to assess cell and membrane properties.// Pflugers Arch. 1996, 431, 271.

456. Waugh R.E., Mohandas N. Jackson C.W., Mueller T.J., Suzuki Т., Dale G.L. Rheologic properties of senescent erythrocytes: loss of surface area and volume with red blood cell age.// Blood 1992, 79, 1351-1358.

457. Waugh R.E., Sarelius I.H. Effects of lost area on red blood cells and red blood cell survival in mice.// Am J Physiol 1996, 271, C1847-C1852.

458. Wegner G., Kucera W. Investigations on the deformability of human red blood cells stored in different preservative solutions: relation between cellular Hb concentration and in vivo survival.// Biomed. Biochem. Acta 1989, 48(8), 561567.

459. Wegner G., Kucera W., Lerche D. Deformability of stored erythrocytes as a criteria for their in vivo survival rate.// Folia Haematol. Int. Mag. Klin. Morphol. Blutforsch. 1986,113(5), 638-645.

460. Weinstein Т., Chagnac A., Korzets A., Boaz M., Ori Y., Herman M., Malachi Т., Gafter U. Haemolysis in haemodialysis patients: evidence for impaired defence mechanisms against oxidative stress.// Nephrol Dial Transplant. 2000, 15(6), 883-887.

461. Westerman M.P., Puchulu E., Schlegel R.A. Intracellular Ca(2+)-containing vesicles in sickle cell disorders.// J. Lab. Clin. Med. 1994, 124(3), 416420.

462. Wiley J.S., Ellory J.C., Shuman M.A. Shaller C.C., Cooper R.A. Characteristics of the membrane defect in the hereditary stomatocytosis syndrome.// Blood 1975,46, 337-356.

463. Wolfe L.C. The membrane and the lesions of storage in preserved red cells.// Transfusion 1985, 25,185-202.

464. Woon L.A., Holland J.W., Kable E.P., Roufogalis B.D. Ca2+ sensitivity of phospholipid scrambling in human red cell ghosts.// Cell Calcium 1999, 25(4), 313-320.

465. Wright L.C., Chen S., Roufogalis B.D. Regulation of the activity and phosphorylation of the plasma membrane Ca-ATP-ase by protein kinase С in intact human erythrocytes.// Arch Bioch Biophys. 1993, 306,277-284.

466. Wu L., Hinds T.R., Vincenzi E.F. Assay of the Ca pump ATP-ase activity of intact red blood cells.// Biochim Biophys. Acta 1992, 1106, 56-62.

467. Yamagushi Т., Kajikawa Т., Kimoto E. Vesiculation induced by hydrostatic pressure in human erythrocytes. //J. Biochem. 1991, 110, 355-359.

468. Zachowski A. Phospholipids in animaleukaiyotic membranes: transverse asymmetry and movement.// Biochem.J. 1993,294, 1-14.

469. Zilow E.P., Zilow G., Ruef P. Rheologic changes in stored erythrocyte concentrates.[Article in German] // Beitr Infusions ther. transfusions med. 1996, 33, 136-140.

470. Zwaal R F.A, Schroit A.J. Pathophysiologic Implications of Membrane Phospholipid Asymmetry in Blood Cells // Blood, 1997, 89,4, 1121-1132.

Информация о работе

Лисовская, Ирина Львовна
доктора биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Популяционные характеристики эритроцитов в норме и патологии; фильтрационно-осмотические методы исследования деформируемости - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Популяционные характеристики эритроцитов в норме и патологии; фильтрационно-осмотические методы исследования деформируемости - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы