Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Популяционное разнообразие геномных кластеров глутатион-S трансферазных генов человека

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Популяционное разнообразие геномных кластеров глутатион-S трансферазных генов человека"

ПОПУЛЯЦИОННОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ГЕНОМНЫХ КЛАСТЕРОВ ГЛУТАТИОН-8 ТРАНСФЕРАЗНЫХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

17 МАП 2015

Москва 2015

005569261

005569261

Работа выполнена в отделе молекулярных основ генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук (ИМГ РАН)

Научный руководитель: Хрунин Андрей Владимирович, кандидат

биологических наук, ФГБУН ИМГ РАН.

Официальные оппоненты: Спицын Виктор Алексеевич, д.б.н., профессор,

заведующий лабораторией экологической генетики, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Медико-генетический научный центр.

Лебедев Юрий Борисович, д.б.н., профессор, заведующий лабораторией сравнительной и функциональной геномики, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

Защита состоится « 2015г. на заседании Диссертационного совета

Д217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика» и на сайте vvww.genetika.ru

Автореферат разослан

2015г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук, доцент [\ , . Воюшина Т.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Большую роль в развитии современных направлений молекулярной биологии и генетики сыграла грандиозная работа по расшифровке генома человека. По её завершению на одно из первых мест по значимости выдвинулась проблема изучения геномного разнообразия различных популяций и этнических групп. Актуальность этих исследований связана с тем, что они позволяют выявить новые аспекты структурно-функциональной организации генома, особенности его эволюционного развития, а также определить вклад полиморфных участков генома в возникновение и риски развития заболеваний и реакций на внешне средовые воздействия, включая лекарственные средства.

За последнее время важным подходом в изучении особенностей генофонда различных популяций и этнических групп стало полногеномное исследование его полиморфизма с применением технологий ДНК-микрочипов (полногеномное сканирование). Этот метод позволяет одновременно анализировать аллельный статус сотен тысяч полиморфных участков и получать глобальные сведения об изменчивости генома с высокой степенью точности и надёжности.

Кроме глобальных сведений, результаты сканирования содержат данные о популяционной изменчивости отдельных геномных регионов. Регионы могут иметь свои собственные эволюционные траектории в популяционной истории, и информацию об этом можно извлечь из результатов полногеномного генотипирования популяций. Важная роль, которую играют в организме системы генов глутатион Б-трансфераз, определяет значимость этих геномных регионов для изучения их популяционной изменчивости, основываясь на анализе данных полногеномного сканирования различных популяций.

Цели и задачи исследования: Целью настоящей работы является анализ аллельного и гаплотипического разнообразия в двух кластерах генов глутатион-Б трансфераз, принадлежащим к классам мю (СБ1'М) и альфа (СБТА) в русских популяциях.

J

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. С использованием данных полногеномного типирования однонуклеотидных полиморфных замен в трех русских популяциях провести анализ их аллельного разнообразия в геномных регионах кластеров генов GSTM и GSTA в сравнении с другими популяциями (популяции китайцев (СНВ), японцев (JPT), нигерийцев (YRI) и европейцев по происхождению из американского штата Юта (CEU).

2. Исследовать гаплотипическое разнообразие тех же кластеров в указанных популяциях.

3. Провести анализ гаплотипического разнообразия кластера генов GSTM в трех русских популяциях в подгруппах индивидуумов, различающихся по наличию или отсутствию делеции гена GSTM1 (делеционный полиморфизм гена GSTM1).

4. Определить возможные взаимосвязи между аллельным статусом делециониого полиморфизма гена GSTM1 и гаплотипическим разнообразием в кластере генов GSTM.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе проведения диссертационной работы было исследовано гаплотипическое и аллельное разнообразие двух геномных кластеров генов глютатион-S трансфераз, принадлежащим к классам мю и альфа в русских популяциях.

Однонуклеотидный полиморфизм в кластерах генов GSTA и GSTM, расположенных на разных хромосомах, имеет характеристики, указывающие на сходные эволюционные траектории в обоих участках генома. Показано отсутствие выраженных отличий между тремя русскими популяциями и европейской по происхождению популяцией CEU из проекта НарМар. В сравнительном анализе с популяциями японцев, китайцев и нигерийцев выявлены достоверные отличия. Проведенный анализ гаплотипического разнообразия обоих кластеров GSTs обнаружил сходство по некоторым гаплоблокам между европейскими выборками (включая русских) и нигерийской популяцией, что

указывает на схожие траектории в эволюционном развитии этих участков генома в данных общностях. Сопоставление гаплотипического разнообразия геномного кластера GSTM с делецией гена GSTM1 в трех русских популяциях показало статистически значимые различия в отдельных гаплоблоках между подгруппами гомозигот по делеции и остальными индивидуумами. Анализ в объединенной русской популяции показал существование достоверных характеристик гаплотипического разнообразия кластера GSTM у лиц, имеющих делецию гена GSTMI, что может указывать либо на «эффект основателя», либо на возможность предпочтительного возникновения делеции в определенных вариантах геномного окружения. Выявленный в работе ряд ассоциаций, описывается впервые.

Полученные результаты, в целом, расширяют имеющиеся представления об особенностях структурной организации кластеров генов GSTA и GSTM, белковые продукты которых имеют большое значение в процессах детоксикации. Они могут быть основой для разработки новых подходов в фармакогеномике различных лекарственных препаратов, а также для создания панелей генетических маркеров для тестирования реакций больных на лекарства. Положения, выносимые на защиту:

1. Геномные регионы, включающие кластеры генов глутатион-8-трансфераз А и М, имеют сходную эволюционную историю.

2. Отдельные геномные блоки (гаплоблоки) в кластерах генов глутатион-S-трансфераз А и М могут иметь специфичные эволюционные пути в различных популяционных общностях.

3. Вероятность возникновения делеции гена GSTM1 на конкретной хромосоме может зависеть от его геномного окружения.

Публикации и апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Ученого совета ИМГ РАН 27 октября 2014г., протокол №11 и 09 декабря 2014 года на заседании секции «Молекулярная биология» ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика». Основные результаты работы были представлены на международной конференции «The Bilology of Geneomes» (Cold Spring Harbor, USA, 2012) и V Международной Школе молодых учёных по молекулярной

генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, Россия, 2012). По материалам работы опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, а также тезисы в сборниках материалов конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 101 странице машинописного текста, включает 14 таблиц, И рисунков. Список цитируемых литературных источников включает 181 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Настоящая работа посвящена изучению гаплотипического и аллельного разнообразия двух геномных кластеров генов глютатион-S трансфераз, принадлежащим к классам мю и альфа в русских популяциях.

Для проведения анализа генетического разнообразия двух геномных кластеров - GSTA и GSTM, были использованы результаты полногеномного сканирования русских популяций, полученные с использованием ДНК микрочипов фирмы Illumina (Khrunin et al., 2013). Из всего массива данных, нами были отобраны однонуклеотидные полиморфные локусы, которые располагаются в районах локализации вышеупомянутых кластеров генов. Полученный набор локусов был проанализирован в трех русских популяциях, а также в нескольких популяциях, взятых из международного проекта НарМар. Были проанализированы три популяции русских из центральных районов европейской России - Андреапольского района Тверской области, рядом расположенных Курского и Октябрьского районов Курской области и Муромского района Владимирской области, а также четыре популяции из международного проекта НарМар: европейская (CEU), китайская (СНВ), японская (JPT) и нигерийская (YRI).

1. Анализ однонуклеотидного полиморфизма в кластере генов G S ТА.

На рисунке 1 изображены исследованные однонуклеотидные полиморфные локусы локализующихся в состав кластера генов GSTA. Расположение полиморфизмов приведено в соответствии с их локализацией относительно генов

данного кластера. Всего в кластере генов СБТА, было проанализировано 15 однонуклеотидных полиморфных маркеров.

GSTA1

GSTA3

GSTA4

Рисунок 1. Исследованные однонуклеотидные полиморфизмы в кластере генов GSTA.

Сначала нами был проведен анализ частот встречаемости аллельных вариантов каждого из полиморфизмов в изучаемых популяциях. Сравнительный анализ частот показал отсутствие различий в распределении аллелей исследованных локусов в популяциях русского населения. Близкие к ним параметры частот встречаемости аллелей были отмечены в европейской по происхождению популяции CEU. Распределение же аллелей в трех других популяциях из проекта НарМар - китайской, японской и нигерийской - в большинстве случаев существенно отличалось от наблюдаемого в выборках населения европейского происхождения.

Для количественной оценки уровней межпопуляционных вариаций частот аллелей анализируемых локусов нами были рассчитаны индексы фиксации Fsx. На рисунке 2 представлены результаты обработки полученной матрицы линеаризованных попарных величин FSt методом многомерного шкалирования. Из диаграммы видно, что русские популяции входят в состав единого кластера вместе с близкорасположенной к ним популяцией CEU, а африканская популяция YRI и азиатские СНВ и JPT находятся на значительном удалении от них.

0.6

<м 0.0

0.4

0.2

£ -0.4

-0.6

-0 8

-1.0

-1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -04 -0.2 0.0 02 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Размерность 1

Рисунок. 2. Двумерный график многомерного шкалирования генетических расстояний ^т) между популяциями русских и популяциями из проекта НарМар, полученный по результатам анализа однонуклеотидного полиморфизма в кластере СБТА.

Наряду с оценкой полиморфизма отдельных локусов был также проведен анализ их полиморфизма в составе гаплотипов. Для этого нами сначала были оценены уровни неравновесия по сцеплению между всеми исследованными полиморфизмами, на основе которых далее были вычленены гаплотипические блоки. Последние представляют собой группы локусов, характеризующихся высоким уровнем сцепления между собой. В качестве порогового значения для объединения отдельных полиморфизмов в составе гаплоблока была использована величина Э' > 0.7 (КЬгишп е1 а!., 2009).

По результатам анализа в составе кластера СБТА было выделено 6 гаплотипических блоков (рисунок 3). Гаплоблоки кластера генов СБТА были идентичными для всех исследуемых популяций русского населения из центрально-европейского региона России. В качестве примера, на рисунке 3 представлен график паттернов неравновесия по сцеплению, полученный для популяции русских из Андреапольского района Тверской области.

83

Рисунок. 3. Паттерны неравновесия по сцеплению и гаплоблоки, вычлененные в регионе кластера генов GSTA

Данные, полученные для двух других русских популяций - популяции из Муромского района Владимирской области и объединенной выборки из Курского и Октябрьского районов Курской области, имели сходные значения. Частоты встречаемости гаплотипов в составе выделенных гаплоблоков в анализируемых популяциях приведены в таблице 1. В отдельных популяциях ряд гаплоблоков не вычленялся.

Сравнение популяций основывалось на сопоставлении частот гаплотипов, рассчитанных для каждого из блоков. Результаты сравнений в виде полученных величин вероятности «Р» представлены в таблице 2. Уровни значимости «Р» были рассчитаны с учетом поправки на множественность сравнений для каждого из блоков. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии выраженных различий в частотах встречаемости гаплотипов между популяциями русских из Твери, Мурома, Курска и европейской по происхождению популяцией CEU. В случае же сравнения частот гаплотипов в популяциях русских с популяциями китайцев, японцев и нигерийцев можно говорить о достоверных различиях между ними. Величины большинства значений вероятности были существенно ниже установленных уровней значимости.

Таблица 1

Частоты гаплотипов в 6 вычлененных блоках кластера С8ТА

Гаплотипы Тверь 2Ы=192 Муром 2Ы=192 Курск 2Ы=192 СЕи 2Ы=330 СНВ 2Ы=168 .1РТ 7Н=\12 УМ 2Ы=332

1БЛОК ТС 0.604 0.630 0.590 0.594 0.905 0.872 0.701

СТ 0.396 0.370 0.410 0.406 0.095 0.128 0.299

2БЛОК ААА 0.682 0.686 0,670 0.652 0.500 0.523 0.311

сое 0.245 0.234 0,217 0.279 0.042 0.105 0.021

ОАА 0.073 0.079 0,107 0.107 0.458 0.372 0.641

ОАв 0 0 0 0 0 0 0.027

ЗБЛОК ТТ 0.469 0.479 0.479 0.551 0.214 0.163 0.810

ТС 0.396 0.375 0.432 0.288 0.560 0.547 0.073

ОТ 0.135 0.146 0.089 0.161 0.226 0.291 0.112

4 БЛОК СС 0.505 0.529 0.494 0.534 0.755 0.767 0.361

ТС 0.323 0.299 0.374 0.367 0.097 0.146 0.391

ТТ 0.172 0.164 0.120 0.094 0.136 0.081 0.238

СТ 0 0 0,011 0 0.013 0 0

5 БЛОК Ай 0.557 0.562 0.547 0.556 0.518

АА 0.380 0.306 0.351 0.340 - - 0.422

йА 0.063 0.131 0.101 0.104 - - 0.060

6БЛОК вА 0.849 0.869 0.831 0.855

Ай 0.078 0.046 0.089 0.055 - - -

во 0.073 0.079 0.074 0.091 - - -

Имеющиеся исключения относятся к блоку №5 и в некоторой мере к блокам №1 и №4, где значения Р для попарных сравнений частот гаплотипов в популяциях русских и нигерийцев были выше величин «Р», определенных для соответствующих блоков.

Таблица 2.

Результаты сравнения частот гаплотипов генов кластера СЗТА в популяциях Твери, Мурома, Курска и в

популяциях проеета НарМар (СЕЧ, СНВ, 1РТ, УШ)

№ ГАПЛО-БЛОКА МУРОМ КУРСК СЕ11 СНВ л>т УШ Ршюж*

ТВЕРЬ I 0,6746 0,8353 0,8534 <0,0001 <0,0001 0,0269 0,004

II 0,9599 0,4282 0,6984 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0025

III 0,9030 0,3306 0,0403 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0025

IV 0,8238 0,2076 0,0326 <0,0001 <0,0001 0,0065 0,0019

V 0,0484 0,3957 0,2428 — — 0,6452 0,0025

VI 0,4538 0,9276 0,4634 — — — 0,0025

МУРОМ I 0,4641 0,4574 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,004

II 0,5661 0,5307 <0.0001 <0.0001 <0,0001 0,0025

III 0,1764 0,1188 <0.0001 <0.0001 <0,0001 0,0025

IV 0,1599 0,0408 <0,0001 <0,0001 0,0006 0,0019

V 0,5052 0,5524 — — 0,0031 0,0025

VI 0,2664 0,8195 — — — 0,0025

КУРСК I 0,9266 <0,0001 <0,0001 0,0097 0,004

II 0,1321 <0.0001 <0.0001 <0,0001 0,0025

III 0,0013 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0,0025

IV 0,2053 <0,0001 <0,0001 0,0006 0,0019

V 0,9682 — — 0,1181 0,0025

*Рмнож - пороговые значения вероятности, рассчитанные с учетом поправки на множественность сравнений для каждого из блоков

2. Анализ однонуклеотидного полиморфизма в кластере генов GSTM.

В пределах участка генома, на котором располагается кластер генов GSTM, было проанализировано 14 маркерных локусов (рисунок 4). Как и в случае кластера генов GSTA, в распределении частот аллелей кластера GSTM также прослеживается сходство между исследованными популяциями русского населения, а также между ними и европейской по происхождению популяцией CEU. Различия в частотах аллелей наблюдаются при сравнении их с выборками из Азии (СНВ и JPT) и Африки (YRI). Двумерный график многомерного шкалирования матрицы рассчитанных для данного кластера Fst демонстрирует высокое сходство с приводившимся ранее графиком кластера GSTA.

По результатам анализа паттернов неравновесия по сцеплению между исследованными локусами в составе кластера GSTM было выделено 3 гаплотипических блока (рисунок 4).

Рисунок 4. Исследованные однонуклеотидные полиморфизмы и паттерны неравновесия по сцеплению внутри кластера генов (75ТМ.

Данные о частотах гаплотипов для каждого из гаплоблоков в кластере представлены в таблице 3. Как и в случае кластера С5ТА, внутри блоков

наблюдалось различное количество гаплотипов. Основываясь на данных таблицы 4, где приведены значения «Р» для попарных сравнений, можно говорить о том, что сколько-нибудь выраженные различия в частотах встречаемости гаплотипов между популяциями русских из Твери, Мурома, Курска, а также CEU отсутствуют. В то же время статистически значимые отличия наблюдались в большинстве случаев сравнений частот гаплотипов между популяциями русских и популяциями китайцев, японцев и нигерийцев. Имеющиеся исключения относятся лишь к блоку №1, значения «Р» которого для попарных сравнений частот гаплотипов между популяциями русских и нигерийцев был значительно выше установленного уровня значимости.

Таблица 3

Частоты гаплотипов в гаплоблоках кластера GSTM

Гаплотипы Тверь 2N=192 Муром 2N=192 Курск 2N=192 CEU 2N=330 СНВ 2N=168 JPT 2N= 172 YRI 2N=332

1БЛОК ТС 0.443 0.458 0.495 0.395 0,628 0,654 0,451

СА 0.458 0.411 0.400 0.456 0,314 0,297 0,414

СС 0.099 0.130 0.105 0.142 0,058 0,036 0,136

ТА 0 0 0 0 0 0,012 0

2 БЛОК AACG 0.391 0.365 0.378 0.430 0.150 0.179 0.092

CGTA 0.266 0.339 0.287 0.297 0.743 0.690 0.035

ААСА 0.198 0.167 0.213 0.130 0.083 0.071 0.377

CACA 0.141 0.120 0.122 0.142 0 0 0.494

CGTG 0 0 0 0 0.013 0 0

ААТА 0 0 0 0 0.012 0 0

AGTA 0 0 0 0 0 0.060 0

3 БЛОК AG 0.693 0.687 0.658 0.712 0.895 0.881 0.364

GT 0.302 0.313 0.337 0.288 0.105 0.095 0.601

GG 0 0 0 0 0 0.024 0.035

Таблица 4

Результаты сравнения частот гаплотипов кластера генов GSTM популяций Твери, Мурома, Курска и популяций проекта НарМар (CEU, СНВ, JPT, YRI)

№ ГАПЛО-БЛОКА МУРОМ КУРСК CEU СНВ JPT YRI Ршож

ТВЕРЬ I 0,5078 0,5183 0,2862 0,0021 <0,0001 0,4485 0,0025

II 0,3202 0,8943 0,2160 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0019

III 0,9120 0,9206 0,7647 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0025

МУРОМ I 0,6541 0,3994 0,0027 <0,0001 0,5856 0,0025

II 0,4052 0,1369 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0019

III 0,9392 0,5527 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0025

КУРСК I 0,0811 0,0313 0,0018 0,1701 0,0025

II 0,0906 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0019

III 0,8592 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0025

Таким образом, хотя гены подсемейств GSTA и GSTM находятся на разных хромосомах, проведенный нами анализ полиморфизма этих двух генных кластеров продемонстрировал значительное сходство соответствующих им паттернов вариации аллельных и гаплотипических частот, зафиксированных в исследованных популяциях. Спектры гаплотипов в русских популяциях из Твери, Мурома и Курска были похожи. Также не было выявлено заметных различий между ними и популяцией CEU, что, очевидно, является следствием их общего европейского происхождения. В этом контексте особенно интересным было обнаружить определенное сходство в частотах гаплотипов некоторых блоков (блок 5 в кластере GSTA и блок 1 в кластере GSTAÍ) между русскими популяциями и популяцией YRI из Нигерии. Так как европейские популяции кардинально отличались от популяций из Китая и Японии по частотам гаплотипов всех гаплоблоков, можно предположить, что отмеченное сходство может быть следствием каких-либо особых черт этих гаплоблоков в микроэволюционной

истории популяций. В то же время русские и нигерийская популяции статистически значимо отличались по всем остальными гаплоблокам обоих генных кластеров.

3. Анализ делеционного полиморфизма гена СБТМ1 в контексте гаплотнпнческого разнообразия геномного кластера (75771/.

Особенностью кластера генов СБТМ, в сравнении с другим исследованным нами кластером йБТА, является делеция его значительной части - около 16кЬ, захватывающая целиком ген СБТМ1 и встречающаяся с высокой частотой во многих популяциях человека. Представляло интерес изучить, есть ли взаимосвязи между делецией гена СБТАП и представленностью тех или иных гаплотипов в составе гаплотипических блоков кластера СБТМ1.

Классический метод ПЦР по анализу делеционного полиморфизма гена основывается на одновременной амплификации участка данного гена и используемого в качестве контроля участка какого-либо другого гена. В нашем исследовании в качестве такового был взят участок гена ОТР-циклогидролазы [КЬгипш А. е1. а1., 2008]. В результате удалось выделить в составе каждой популяции две подгруппы индивидуумов, у которых ген СБТМ! либо отсутствовал вовсе (подгруппа СБТМ! «0», гомозиготы по делеции), либо имелся хотя бы один его функциональный вариант (подгруппа СБТМ1 «+»: нормальные гомозиготы и гетерозиготы по делеции). По результатам анализа неравновесия по сцеплению в анализируемом регионе было выделено три гаплотипических блока (рисунок 4).

В каждой из подгрупп нами был проведен анализ паттернов неравновесия по сцеплению и вычленены гаплотипические блоки. Частоты встречаемости конкретных гаплотипов в подгруппах С5/'А// «0» и С7ЛТА// «+» в каждой из исследованных популяций отображены в таблице 5.

Таблица 5.

Частоты гаплотипов в подгруппах индивидуумов, несущих функциональные (0/+ и +/+; СБТМ1«+») и нулевые

(0/0; СБТМ! «0») варианты гена СБТМ1 в трех русских популяциях

№ гапло-блока Гаплотип Тверь Р Муром Р Курск Р

вЯТМ!«0» 2Ы=86 С5ТМ/«+» 2^106 СБТМ!«0» 2№90 в8ТМ1«+» 2И=102 СБтмп<а» 2И=80 СБТМ1«+» 2Ы=106

1 ТС 0,326 0,538 0,0120 0,422 0,490 0.0851 0,423 0,566 0.1149

СА 0,558 0,377 0,489 0,343 0,474 0,330

СС 0,116 0,085 0,089 0,167 0,103 0,104

2 ААСв 0,337 0,434 0,0009 0,411 0,324 0.0079 0,423 0,346 0.4665

ААСА 0,186 0,208 0,122 0,206 0,154 0,240

САСА 0,070 0,198 0,056 0,176 0,115 0,135

СйТА 0,395 0,160 0,411 0,275 0,308 0,279

СвСА 0,012 0 0 0 0 0

АССв 0 0 0 0,020 0 0

3 Ав 0,779 0,628 0,0191 0,811 0,578 0.0006 0,731 0,623 0.0785

вт 0,209 0,377 0,189 0,422 0,256 0,377

0,012 0 0 0 0,013 0

Из представленных в таблице 5 данных видно, что в первом гаплоблоке частоты гаплотипов в подгруппах С57"А//«0» и С57А//«+» во всех 3-х анализируемых популяциях русского населения имеют схожие значения. По данному гаплоблоку достоверных различий (Р<0.0028) между изучаемыми подгруппами С5ТА//«0» и С5ТА//«+» не было выявлено ни в одной из популяций.

Несколько иная ситуация наблюдается при рассмотрении второго гаплоблока. Здесь обращает на себя внимание факт существования различий в количестве выделенных гаплотипов как между анализируемыми популяциями, так и между выделенными подгруппами индивидуумов внутри каждой популяции. Статистически значимыми в данном гаплоблоке являются различия в распределении частот гаплотипов между подгруппами 05ТА/7«0» и С5ТА/7«+» в тверской популяции. Третий гаплоблок характеризуется разницей по числу гаплотипов. Здесь достоверные различия между изучаемыми подгруппами наблюдаются лишь в популяции из Мурома

В целом, в данном контексте популяция из Курской области выглядит более гомогенной, в сравнении с популяциями из Тверской и Владимирской областей. В двух последних различия в частотах встречаемости гаплотипов между подгруппами СБТМ1 «О» и С.$7'А/I «+» сохраняются по отдельным блокам даже после введения поправки на множественность сравнений (Р), равной 0.0028. Это относится ко второму блоку популяции из Тверской области и третьему - в случае популяции из Владимирской области.

Мы предположили, что неоднозначность результатов сравнений распределений гаплотипов между подгруппами в исследованных популяциях могла быть следствием малого размера самих этих подгрупп, недостаточных для эффективного расчета частот гаплотипов. Поэтому на следующем этапе мы провели такого же рода анализ в объединенной популяции, включающей выборки из популяций Твери, Мурома и Курска. Правомочность данного объединения основывалась на данных проведенного нами полногеномного анализа однонуклеотидного полиморфизма в популяциях Европейской части

России (Khrunin et al., 2013), где было продемонстрирована практически полная перекрываемость этнических облаков, соответствующих курской, тверской и муромской популяциям, и их дифференция от остальных популяций. Изменения в схеме анализа, т. е. переход от анализа разнообразия гаплотипов в индивидуальных популяциях к его анализу в составе объединенной популяции, привели к изменениям в количестве вычленяемых в кластере GSTM гаплоблоков, число которых возросло до четырех (рисунок 5). Кроме того, улучшившаяся статистика параметров неравновесия по сцеплению между локусами rs 12745189 и rs650985 позволила нам увеличить размеры 1-го гаплоблока и, соответственно, длину анализируемых гаплотипов. Частоты гаплотипов в выявленных гаплоблоках в объединенной популяции русских, включающей выборки русского населения из Тверской, Курской и Владимирской областей, приведены в таблице 6. Из представленных данных видно, что распределения гаплотипов в двух изучаемых подгруппах имеют значительные различия. Так, в первом гаплоблоке в подгруппе GSTMI «+» наиболее частым гаплотипом является -ТСТ, а в подгруппе GSTMI «0» - CAT.

I г

} deletion region j

it j j j i i

n

6i

Рисунок 5. Паттерны неравновесия по сцеплению и вычлененные гаплоблоки в кластере генов (75ТЛ/ в объединенной русской популяции.

Полученные для каждого из блоков значения вероятности «Р» свидетельствуют о том, что различия в частотах гаплотипов между выделенными подгруппами индивидуумов по делеции являются существенными. Во всех четырех вариантах сравнений их величины были значительно меньше порогового уровня значимости, рассчитанного с учетом поправки на множественность сравнений (Р=0.006). Результаты сравнений позволили предположить существование взаимосвязи между гаплотипическим разнообразием кластера СЛТА/ и делеционным полиморфизмом гена СБТМ1, в частности, его «нулевым» вариантом (СБТМ! «О»). Однако оставалась непонятными детали этой связи применительно к взаимоотношениям в подгруппе 0'57'Л//«+». Для вычленения из подгруппы СЬТЛ//«+» носителей с двумя функциональными вариантами гена СБТМ/ и индивидуумов, гетерозиготных по данному гену, нами был использован метод ПЦР в режиме реального времени в технологии Taq^ían.

В таблице 7 частоты гаплотипов представлены уже во всех трех подгруппах: гомозиготах по делеции, гетерозиготах и гомозиготах с обеими функциональными вариантами (копиями) гена С5ГМ/. Анализ сравнения частот гаплотипов был нами начат со второго по порядку, блока. Он представляет наибольший интерес в связи с тем, что два БЫРэ, из которых он состоит, располагаются с обеих сторон от делетируемого региона, причем не на очень большом расстоянии. Из данных таблицы 7 видно, что частоты гаплотипов второго блока различаются между подгруппами по делеции. Так, частота гаплотипа СТ в подгруппе нормальных гомозигот составляет 0,736, а в группе - гомозигот по делеции - лишь 0,583. Для гаплотипа СО этого же гаплоблока наблюдается противоположная ситуация, его частота оказалась выше в подгруппе гомозигот по делеции.

Сравнения частот встречаемости гаплотипов в подгруппах индивидов показало, что статистически достоверно они различаются в парах нормальные гомозиготы - гомозиготы по делеции и гомозиготы по делеции —

гетерозиготы, но не в паре нормальные гомозиготы — гетерозиготы (таблица 8).

Таблица 6.

Частоты гаплотипов в двух подгруппах в объединенной выборке 3-х

русских популяций

Гаплотипы СЛТШ «0» 2Ы=256 СБТМ! «+» 2К=314 Р

1 БЛОК САТ 0.508 0.350

ТСТ 0.390 0.532 0.0021

ССС 0.075 0.082

ССТ 0.028 0.036

2 БЛОК СТ 0.583 0.710

ее 0.406 0.217 <0.0001

тт 0.012 0.074

3 БЛОК ААСй 0.390 0.369

СвТА 0.374 0.237

ААСА 0.154 0.218 0.00008

САСА 0.079 0.170

СвСА 0.004 0

АССО 0 0.006

4 БЛОК вт 0.217 0.392

Ав 0.776 0.608 <0.0001

0.008 0

Далее мы проанализировали распределение частот гаплотипов в тех блоках, которые находятся на значительно большем удалении от делегируемого региона (блоки 1, 3 и 4). Данные таблицы 7 частот встречаемости гаплотипов показывают, что отмеченное выше разнонаправленное изменение частот гаплотипов здесь также сохраняется.

При этом частоты гаплотипов в подгруппе гетерозигот во всех случаях занимают промежуточное положение. Статистически значимыми, даже с учетом поправки на множественность сравнений (Р < 0.004), всегда были различия в частотах встречаемости гаплотипов в паре нормальные гомозиготы - гомозиготы по делеции. Несколько меньшее число статистически значимых различий в распределении гаплотипов было выявлено в паре гомозиготы по делеции - гетерозиготы и лишь одно - в паре нормальные гомозиготы - гетерозиготы (таблица 8). Молекулярные основы возникновения делеции в кластере СБТМ были исследованы в работе БЫ-^е Хи ег а1. [1998], в которой было показано, что у индивидуумов с функциональными вариантами гена СБТМ! кластер генов СЗТМ содержал два высоко гомологичных (идентичных более чем на 98%) региона, которые с обеих сторон фланкируют ген СБТМ!.

Таблица 7.

Частоты гаплотипов в 4 гаплоблоках кластера генов С57"Д/.

Гаплотипы Гомозиготы Гетерозиготы Нормальные

по делеции (2Ы=242) гомозиготы

(2Ы=256) (2Ы=72)

1 БЛОК ТСТ 0.390 0,512 0.597

САТ 0.508 0,380 0.250

ССТ 0.028 0,069 0.125

ССС 0.075 0,039 0.028

2 БЛОК СТ 0.583 0.705 0.736

СО 0.406 0.237 0.139

тт 0.012 0.055 0.125

3 БЛОК ААСв 0.390 0,392 0.319

ССТА 0.374 0,254 0.167

ААСА 0.154 0,188 0.306

САСА 0.079 0,158 0.208

СйСА 0.004 0 0

АвСО 0 0.008 0

4 БЛОК СТ 0.217 0.343 0.542

Ав 0.776 0.657 0.458

0.008 0 0

Таблица 8.

Статистика различий частот встречаемости гаплотипов кластера генов

Гомозиготы по делеции -Нормальные гомозиготы Гомозиготы по делеции -Гетерозиготы Нормальные гомозиготы — Гетерозиготы

1 БЛОК <0,0001 0,0060 0,9512

2 БЛОК <0,0001 <0,0001 0,0391

3 БЛОК <0,0001 0,0038 0,0700

4 БЛОК <0,0001 0,0022 0,0024

Такая структурная организация региона, т.е. наличие высоко гомологичных повторов, свидетельствует в пользу возможности прохождения неаллельной гомологичной рекомбинации на данном участке хромосомы и появлению делеции [ви е! а1., 2008], в данном конкретном случае - к делеции гена СБТМ1. Высокая частота встречаемости делеционных вариантов гена СБТМI во всех основных группах популяций человека, включая популяции русского населения, по-видимому, свидетельствует об отсутствии действия отбора против делеции (гомозигот по делеции) и поэтому может рассматриваться как результат ее возникновения в далекой предковой популяции с последующим ее распространением по типу «эффекта основателя». С другой стороны, если высоко гомологичные участки в кластере генов СБТМ! являются горячими точками рекомбинации, то рассматриваемая делеция, в принципе, могла возникать неоднократно. Полученные нами данные по гаплотипическому разнообразию региона кластера генов С5ТА/ в контексте делеционного полиморфизма гена СБТМ! у русского населения позволяют предположить, что делеция, скорее всего, возникала в разных гаплотипах, так как не было обнаружено различий в составе и количестве гаплотипов между выделенными группами индивидуумов по наличию/отсутствию делеции. В то же время, были выявлены статистически достоверные различия по частоте

встречаемости отдельных гаплотипов между группами, индивидуумов гомозиготных по делеции и гомозиготных по наличию функционального варианта гена С5ГЛ//, что указывает на возможность предпочтительного возникновения делеции в определённых вариантах геномного окружения.

ВЫВОДЫ

1. Полиморфизм однонуклеотидных замен в кластерах генов СЛТ/1 и СБТМ, расположенных на разных хромосомах, имеет характеристики, указывающие на сходные эволюционные траектории в обоих участках генома.

2. Анализ гаплотипического разнообразия обоих кластеров СБТ.ч выявил наличие в некоторых гаплоблоках сходства в частотах встречаемости гаплотипов между европейскими популяциями, включая русских, и африканской популяцией из Нигерии, что указывает на схожие эволюционные пути этих геномных блоков в исследуемых общностях.

3. Оценка гаплотипического разнообразия геномного кластера СБТМ в подгруппах индивидуумов с делецией гена СБТМ1 показала наличие статистически значимых различий в отдельных гаплоблоках между ними и остальными индивидуумами в трех русских популяциях.

4. Объединение выборок трех русских популяций позволило выявить статистически значимые различия по всем изучаемым гаплотипическим блокам класса СБТМ в подгруппах гомозигот по делеции гена СБТМ1 и остальными индивидуумами объединенной русской популяции. Это может указывать либо на «эффект основателя», либо на возможность предпочтительного возникновения делеции в определенных вариантах геномного окружения.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Filippova I, Khrunin A, Limborska S. Analysis of DNA variations in GSTA and GSTM gene clusters based on the results of genomewide data from three Russian populations taken as an example. BMC Genetics. 2012; 13:89.

2. Khrunin AV. Khokhrin DV, Filippova IN, Esko T, Nelis M. Bebvakova NA. Bolotova NL. Klovins J. Nikitina-Zake L. Rehnstrom K. Ripatti S. Schreiber S, Franke. Macek M. Krulisova V. Lubinski J. Metspalu A. Limborska SA. A genome-wide analysis of populations from European Russia reveals a new pole of genetic diversity in northern Europe. PlosOne. 2013;8(3):e58552.

3. Филиппова И.Н., Хрунин А.В.. Лимборская C.A. Анализ делеции гена GSTMI в контексте гаплотипического разнообразия геномного кластера GSTM в трех русских популяциях. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2014;2:8-12.

Материалы конференций:

_L Limborska S. Khrunin A, Filippova I, Khokhrin D, Bebvakova N. Bolotova N, Esko E, Metspalu A. Genomic variations in populations from the Far North East corner of Europe. Abstracts of papers presented at the 2012 meeting on "The Biology of Genomes", Cold Spring Harbor, NY, USA, 08-12 May 2012, p. 167. 2. Филиппова И.Н. Геномный полиморфизм регионов GSTA и GSTM в русских популяциях. Материалы V Международной Школы молодых учёных по молекулярной генетике «Непостоянство генома». 3-7 декабря 2012 г., Звенигород. С. 66. № 117.

Подписано в печать:

22.04.2015

Заказ № 10725 Тираж - 80 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru