Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полухимическимй синтез процессированного гена гамма-интерферона быка

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полухимическимй синтез процессированного гена гамма-интерферона быка"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕВИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА

Ва правах рукописи ' УДК 547.963.32

РОСТАПШОВ ВИКТОР МИТР0ФАН08ИЧ

ПОЛУХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПРОЦЕССИРОВАННОГО ГЕНА У-ИНТЕРФЕР0НА БЬ1КА-

03.00.03' - Молекулярная виология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1988

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии нуклеиновых кислот Ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина Академии наук СССР-

Ваучный руководитель - член-корреспондент АН СССР доктор химических наук Е.Д.Свердлов

Официальные оппоненты-

доктор■химических наук - В.К.Потапов

кандидат химических наук - В.П.Вейко

Ведущая организация - институт молекулярной биологии

АН СССР.

Защита диссертации состоится 11 мая 1988 г. В 10 часов на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им.Н.М.Шемякина АН СССР, г.Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР.

Автореферат разослан "// ш Цл^М 1988 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Л 002.35.01

кандидат химических наук В.А.Несмеянов

Актуальность ..'пройдены. Развитие химических методов синтеза олигодеэокСирЖойуклёотидов ( в дальнейшем олигонуклеотиды) в последние годы привело к возможности химико-ферментативного синтеза длинных двухцепочечных последовательностей, что позволило получить ряд искусственных генов, кодирующих различные белки. Эти методы включают в себя получение наборов перекрывающихся синтетических олигонухлеотидов, составляющих в сумме обе цепи гена. Однако, часто возникает задача получения аналогов ухе имеющегося клонированного гена, отличающихся рядом нуклеотидных замен. Как известно, -при условии небольшого числа замен, локализованных в узкой области гена, эта задача успешно решается с помощью направленного мутагенеза. Однако,такой подход не удобен, если необходимо создать аналог гена, содержащий требуемые изменения во множестве точек, распределенных вдоль всей его цепи. Частным случаем такой задачи является преобразование гена, кодирующего белок одного биологического вида, в ген, кодирующий гомологичный белок другого вида. Существует несколько причин, по которым использование направленного мутагенеза в решении такого рода задач ограничено. Применяемые в настоящее время методики олигонуклеотид-нал-равленного мутагенеза вводят изменения в тот участок ШК, для которого синтезирован олигонуклеотид. Нутагенез в таком случае проводится с одного олигонуклеотида. Таким образом, для введения ряда замен, распределенных по всей длине протяженной последовательности, требуется многократно повторять акты олигонуклеотид-нап-равленного мутагенеза, либо синтезировать очень длинный олигонуклеотид. Первый путь чрезвычайно трудоемок, тогда как второй связан с целым рядом сложностей: по-первых, до настоящего времени

синтез олигонуклеотидов длиной более 200 является довольно трудной задачей; во-вторых, считается, что увеличение длины олигонук- ' леотида приводит х введению незапланированных мутаций вследствие увеличения количества модифицированных оснований в синтезированном олигонуклеотиде.

Цель работы. Основной задачей данной работы является разработка метода одновременного многоточечного направленного мутагенеза и получение с помощью этого метода процессированного гена гамма-интерферона быка на основе гомологичного гена человека, Сопутствующей задачей явилось создание полуавтоматического синтезатора для эффективного и быстрого синтеза олигонуклеотидов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате настоящего исследования разработан метод одновременного многоточечного мутагенеза, который позволяет быстро преобразовывать длинные фрагменты ДНК введением мутаций, рассредоточенных на всем протяжении нуклеотидной последовательности. Этот метод удобен для получения генов, кодирующих гомологичные белки различных видов, ; генов одного семейства, обладающих достаточной степенью гомологии, на основе одного, ранее полученного гена; для оптимизации уровня экспрессии генов в гетерологичных системах путей изменения регуляторных областей и/или изменения имеющихся кодонов на синонимические и т. д. В данной работе этот подход проиллюстрирован на примере получения процессированного гена гамма-интерферона быка исходя из имеющегося гена гамма-интерферона человека. При этом в процессе работы сконструирован полуавтоматический синтезатор, обладающий высокой производительностью, на котором за 2 года фосфи-тамидным методом синтезировано более 200 олиг/онуклеотидов длиной до 80 звеньев.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Для получения длинных олигонуклеотидных последовательностей, имеющих достаточную степень гомологии с ухе имеющимися, разработан метод одновременного многоточечного мутагенеза. Метод включает в себя следующие стадии (рис.1):

(а) Клонирование исходного гена в полилинкврную область одноните-вого фага Н13 или его аналога.

(б) Синтез олигонуклеотидов, составляющих цепь требуемого гена, частично комплементарную клонированной цепи. При этом планирование последовательности цепи из синтетических олигонуклеотидов проводится таким образом, чтобы выполнить требование максимальной ксмплементарности, что достигается за счрт вариабельности генетического кода.

(в) Цитирование синтезированных олигонуклеотидов с использованием клонированной цепи в качестве матрицы.

(г) Выделение лигированной цепи и синтез комплементарной ей цепи с помощью ДНК-полимеразы и синтетической затравки, комплементарной 3'-концу лигированной цепи.

(д) Клонирование полученного двухцепочечного фрагмента.

Данный метод был применен для синтеза гена, кодирующего гамма-интерферон быка, исходя из гена, кодирующего гамма-интерферон человека, полученного ранее в нашей лаборатории.

Как ' известно, гамма-интерфероны человека и быка - это белки одинаковой длины, степень гомологии которых составляет 62'/,, то есть из 143 аминокислотных остатков,, соответствующих зрелому гамма-интерферону - 55 остатков у них различны (рис.2). Хотя различия

Рис. 1. Схема преобразования гомологичных последовательностей с использованием синтетических олигонуклеотидов.

Ч Н<ШТТШ1ЕЖЛ®ГШ53РРУАКааРЬГ31)11КШСЕ31>КК1 КШУЗГШа * « **** **** *** * ** ****** *** ** «к*******»»

Ч ГЕШа)К0У10КЗГОПКСфНГСШЛаЗЗЕИ^РШ101РТО1>1а10Ш1Ш-******** ******* ******** ***** **

, Б ГК1{ШШ51ОКЗУЕТ1КЕСН1ГШТ!БНтчВСГЕКЬтЗУТБ111У0ККА1КЕ1 * ** *«* ****** ********

Б ЮШЕХЗРААКТОШКЗОМШОШАЗО

Рис. 2. Аминокислотные последовательности гамма-интерферона человека (Ч) и гамма-интерферона &ча ( Б ), Совпадающие аминокислотные остатки помечены звездочкой.

в аминокислотных последовательностях довольно существенны, вырожденность кода позволяет запланировать синтез такой кодирующей гамма-интерферон быка нуклеотидной последовательности, которая гомологична кДНК гамма-интерферона человека на 81, 5У,, (рис.3).

Б основе планирования последовательностей синтетических олиго-ауклеотидов, составляющих полную цепь гена гамма-интерферона быка, лежали следуюдае соображения:

1. Требование максимальной степени комплементаряости. Для увеличения степени комплементарности между олигонуклеотидами и матрицей в последовательность синтетического гена введены "молчащие" замены. Таким образом, пришлось отказаться от общепринятой стратегии планирования синтеза генов исходя из частоты встречаемости кодонов у организма, в котором планируется экспрессия.

.- 8 -

ХЬа I , .

...... ( I )__48

С 5' АСС^АСТаАТСТАаАТССА^ССМПШТА^^ТАа^ СОТААСЮАА

Ч 3' ТССС^АСТТААОТ^ ¿ШТТСГПТ

Ёсо О'

Ара I Есо В.Ч

с ТАттмтссмсгтлхзсАОАта ТАасаш(К1тоассссгтугс

, Ч АТААААТТАСЙ^АСТААЙСТАС АТОССГГАТТАС^^

120 ( IV ) 159 _( V )

С АА ШТ1ШААаАСС^СА(ЛХ»АСАААААААТМТССА^а ССАААТО1СТССТтАС

Ч ТГ СПААССШСТССТ^А ОЙТГААСА^ОШААТа

Есо ЯН

184 _ У1 ) ..... 217 ( VII )

С ТТСААА (рШТакШССПШ^АЩССк^АТС СШ(ШСТА^САТСАТО

Ч МСТГГ ЙТШЖ^

246 { VIII )

С ААССААвА САТСТТТСАШСТ1ТСГГСАА^

Ч ТТССТТСТ ШСГ1ТАСАаШААШ(Г1ТАТС(ШЪТГ1ттаШСГГАСГ1ШаОТ

Асс I

С АА ССГгеАТГСШтС^аАтеАСТГССАААТССМС ССАААС1СААТАААТ0ААСТ0 Ч ТГ СаАСТСАТТШкбССАТТаАСТШОТАСА^ СОШСОТАТСГАСПТиа

300 —— ( IX ) 338 ( X ) .. --------------------------------------------ТАААТ"" "

381 ( XI ) 414

С АТСШОТШСААтТСТСГГС СССААМТСТААТТТАА<Х>АА(дС<ЗААААА&лАС ТСАа

Ч Ж(ЛТЪАтС(ШЯШСАв С(ШС(ШтШШХ!Л1С0<ЛШТССТ0 АСГГС

, ' , Рз1 I , ,

(XII) 455 ......(XIII) 475

с ААтстсгшсаАаатсаААаАасАТссАтатААТсат тстсстасАасссссссссс

ч ТАС^сшаггссАасттстс АСАбаАса^бабсаасш!

Рис. 3. Нуклеотидньга последовательности планируемой синтетической значащей цепи гена гамма-интерферона быка (С) и комплементарной ей цепи исходного гена гамма-интерферона человека (Ч). Комплементарные основания помечены двумя точками.

2. Наличие уникальных сайтов рестрикции,

В целях облегчения анализа полученных последовательностей, а также для возмохности сворки гена из нескольких фрагментов Ш, введены уникальные сайты рестрикции с использованием "молчащих" замен. которые, в ряде случаев, приводят к нарушению требования максимальной комплементарности.

3. Наличие инициирущего кодона.

Для последующей экспрессии гена в прокариотических клетках к кодирующей части гена присоеденен ATG-кодон.

4. Наличие терминирующего кодона.

Терминатор трансляции был введен после кодирующей последовательности гена.

5. Удобство клонирования гена в различные векторы.

Для интеграции гена в экспрессиошше векторы на 5'- и 3'-концах запланированы сайты рестрикции Xba I и Pst I. соответственно.

5. Существование максимально длинных областей полной компле-ментарности на концах.

Запланированная последовательность (рис. 3) разбивалась на олиго-нуклеотиды таким образом, чтобы длина областей полностью комплементарных участков на их концах была не менее 4 нуклеотидов. Синтезированные олигонуклеотиды и степень их гомологии по отношению к матрице приведены в табл. 1.

В результате планирования первичная структура синтетического гена отличается от опубликованной природной (табл, 2), однако аминокислотная последовательность соответствует зрелому гамма-интерферону быка.

Существенным моментом работы была отработка быстрого и дос-

Таблица 1.

Синтезированные олигонуклеотиды и степень их гомологии к прокловиро-ваяной цепи гамма-интерферона человека.

N Последовательность длина % гомологии

I 48 75

II ССТГААаОААТАГПТААТаСААСПТСТССАаЛТС 35 89

III тАСсошсстасасс(хлтпстсАаАТАТ(ЛтаАА 37 70

IV ОААТТССАААйАСОАОАСГГСАСАААААААТААТССАОАО 39 92

V ССАААТТОТСТССТТТТАСТТСААА '25 100

VI <тттАш<шшмшсомтсА'гс 33 85

VII САААССАСТАШгАСАТСАТСААССААОА 29 83

VIII сАТ(штсАШ(птзхггсмтаасАасА<^ 54 74

IX 38 65

X асшасшштамжАтсшаттамштсшс 43 88

XI СССкШТСУкктЖОккЖЪАШАЪйкЪ 33 82

XII 41 90

XIII тстсстасАссссссссссс 20 90 .

XIV аасаааастаоАаоАСААССА 21 1

тупного синтеза олигонуклеотидов. На основе управляющего блока от прибора для БЭЖХ АЬТЕХ и 6-ходовых кранов был собран полуавтоматический синтезатор, на котором можно одновременно работать на 3 колонках. Сконструированный нами синтезатор позволяет довольно гибко варьировать программу синтеза и обеспечивает быстрый и эффективный синтез олигонуклеотидов. Для синтеза олигонуклеотидов использовался фосфитамидный метод. . Последовательность, время

Таблица 2.

Замены, проведенные в природной кодирующей последовательности гамма - интерферона быка.

Н: нуклеотида Природный Синтетический нуклеотида Природный Зннтетичесю

31 Т С 246 Т А

33 А Т 247 С С

39 а А 257 в А

; 55 А Т 260 а А

, 56 а С 290 а С

57 с т 293 т С

69 т а 296 т С

72 А 297 с т

81 т С 302 в

: 84 с т 308 а А

93 А т 307 с А

96 С т 317 т С

114 Т с 318 с Т

.117 А в 319 т С

122 Т А 337 с т

125 Т С 343 А с

145 С т 355 С т

146 с т 356 с т

158 с т 358 с А

168 т с 361 А С

169 с т 364 С а

188 т с 367 в А

189 а с 370 а А

197 с т 373 А б'

203 т с 385 С а

227 в А 394 С т

233 0 т 397 а А

234 т с 406 А С

236 а с 408 С т

операций цикла синтеза, а такхе концентрации и количества реагентов приведены в табл. 3. Время цикла составляло 6 мин. После завершения синтеза диметокситритильную группу удаляли непосредственно на полимере. Удаление остальных защитных групп и снятие

Таблица 3.

N Операция Реагенты Кол-во реагентов, мл Время, мив

1. Промывка Ацетонитрил 2 0,5

2. Двтритилирование 0, 2 2 трифторухсус- 2 0,7

ная к-та в дихлор-

этане

3. Промывка Ацетонитрил 3 0,8

4. Конденсация 0, i П раствор моно- 0,15 3

мера/0, 5 Ж раствор

тетраэола в ацето-

нитрил в (1:1, v/v).

5. Кэпирование Н-метклимидаэол/пи- 0,5 0,5

ридин/уксусный ангид-

рид/дихлорэтан

(1:1:1:1, v/r).

6. Окисление V/, раствор L(B смеси 0,7 0,5

CHjCOOH/пиридин

(1:9, т/т).

олигонуклеотида с полимера проводили обработкой концентрированным водным аммиаком при 60*С в течение 12 часов. Очистку полностью деблокированных олигонуклеотидов проводили в 12-20'/. полиакрила-милнон денатурирующем геле. Для последующего дотирования олигонуклеотиды П-ХШ (табл.1) были фосфорилированы по 5'-концевому гидроксилу с пснояью Т4 полинуклеотидкиназы. Олигонуклеотид I не фосфорилировали, чтобы исключить неспецкфическую пришивку каких-либо олигонуклеотидов к его 5'-концу, Для контроля количества материала на кмлом этапе и упрощения картины радиоавтографии при выделении полноразмерной цепи аликвоту олигонуклеотида II метили

Вотирование всех олигонуклеотидов осуществляли а один прием, 1 затем полноразиерную дотированную цепь очищали электрофорезом в полиакриламидном геле, идентифицируя ее по длине сопоставлением с соответствующими маркерами (рис. 4), Анализируя картину дотирования, можно предположить, что олигонуклеотиды, имеющие низкий процент гомологии, дотируются хуже, чем олигонуклеотиды с высоким процентом гомологии. Наиболее интенсивная полоса на радиоавтог-рамме принадлежит цепи, собранной из олигонуклеотидов I-VIII. Олигонуклеотид IX имеет наиболее низкий процент гомологии с матрицей (табл. 1), что приводит к уменьшению относительного количества олигонуклеотидов, отожженных на матрицу. Поэ;ому увеличение времени лигирозания не приводит к увеличению выхода полноразмерной цепи, тогда как увеличение относительной концентрации плохо дотируемых олигонуклеотидов уменьшает количество неполнораз-мерных цепей и увеличивает выход требуемого продукта.

Синтез второй цепи гена гамма-интерферона быка проводили с помощью большого фрагмента ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова) Б. coli, используя в качестве затравки синтетический олигонуклео-

Рис.4. Радиоавтограмма электрофореза,при выделении полноразмерной цепи. Б, В, Г - 30-ти кратный избыток кагдого олигонуклеотида к матрице. Д - 150-ти кратный избыток каждого олигонуклеотида к матрице. Б. В, Г - лигирование 3,5 суток. Д - лигирование 2 суток. Б. Д - 5-ти кратный избыток лигазы по сравнению с В, Г. А, Е - цепь гамма-интерферона человека.

тид d(GGGGGGGCTGCAGGACAACCA), комплементарный участку 452 - 472 синтетического гена. Олигонуклеотид содержит сайт рестргасционной энлонуклеазы Pst I. После синтеза 2-ой цепи продукт обрабатывали рестрикционными зндонуклеаэами ХЪа I, Pst I, и клонировали в специальный вектор на основе pUC-18, (сконструированный совместно с И.П.Черновым), имеющий уникальные сайты Xba I и Pst I. Клоны, со-

держащие требуемый ген. идентифицировали гибридизацией колоний с меченным ^Р синтетическим олигонуклеотидом из Н-коицевсй области гена. Было получено приблизительно 100 гибридизуюшихся клонов. 20 из которых были взяты дав анализа размера вставок в рекомбинант-ных плазмидах. Для 10 вставок, имеющих требуемую рестриктную карту, определена первичная структура методом Сэнгера. В результате определения нуклеотдкой последовательности было установлено, что вставки во всех проанализированных оояах отличаются от запланированной (табл.4).-

Из таблицы 4 видно, что имеются последовательности, соответствующие олигонуклеотидам I, IV, XI, XII, которые ни в одном из клонов не отличаются от запланированных; з последовательностях, соответствую« олигонуклеотидам II, V, IX. X, оказалось по 1 мутации в одной из 10 проанализированных вставок. Наконец, в последовательностях, соответствующих III, YII и VIII олигонуклеотидам, встречаются клоны,насушив одновременно по 2 мутации, а общее количество мутаций во всех клонах, приходящееся на эти олигонуклео-тиды, равно 4, 5 и 10, соответственно.

На основе анализа мутаций, их распределения по участкам гена, соответствующим различным синтетическим олигонуклеотидам, а тазае конкретной локализации мутаций относительно каждого олигомера, мозшо сделать вывод, что с увеличением длины олигону::леотида относительное количество незапланированных мутаций на нуклеотид не увеличивается, а увеличение количества циклов не приводит к статистически значимому увеличению приводящих к мутациям модификаций иуклеотидных звеньев, находящихся блихе к полимерному носителю (3* концу олигонуклеотида).

Таблица 4.

Г Л* позиция Н;олиго- запланиро- основание

мута- клона мутантногс нуклво- ванное в данном

ции основания тида основание клоне

1 1 98 III т

г 2 264 VIII т С

3 3 232 VII с т

4 3 234 VII т с

5 3 м СО VIII а с

6 3 300 VIII А -

7 3 309 IX Л с

8 4 197 VI С т

- 9 4 300 VIII А -

10 5 ИЗ III А СА

11 5 197 VI С т

12 5 232 VII С т

13 5 240 VII А с

14 5 242 VII А -

15 5 300 VIII А -

1е 6 300 VIII А -

17 6 372 X А т

18 7 181 V С т

19 7 280 VIII й т

20 8 90 III А с

21 8 93 III Й А

22 9 259 VIII а т

23 9 263 VIII с т

. 24 ' 10 75 II ; с т

25 '1 Ю , 251 VIII т -

- 17 -

E.coRI I EcoRV*

I E.coRI iEcoRV

Рис. 5 Схема сборки запланированного гена гамма-интерферона быка, из фрагментов двух плазнид.

Анализ незапланированных мутаций, введенных s последовательность, показывает, что 8 замен из 18 - это замены С на Т, которые приходятся приходятся на 6 из 13 синтетических фрагментов (II, III, V, VI, VII, VII). Это можно объяснить систематической ошибкой, связанной с тем, что при удалении защит концентрированный водным аммиаком частично может происходить деэаминирозаяие dC.

Требуемый ген гамма-интерферона быка с корректной структурой был получен комбинацией немутантных фрагментов из плазмид клонов 1 и 2 Íрл! и рд2). Плазкиды были расщеплены рестриктазами Eco RI и Eco RV. Электрофорезом в легкоплавкой агарозе были выделены вектор (плазмида p¿l) и фрагмент плазмиды ра2, которые затем Актировали (рис. 5).

Вставки рекомбинантных плаэмид анализировали с помощь» рест-рюсционных эндонуклеаз, (рис.6).

Г Д Е X К

Рис. 7. Гель-электрофорез плазмиды с запланированным геном гамма-интерферона быка, расщепленной эндонуклеаэами рестрикции. А - Асс I-Pst I; Б - Eco RV-Pst I; В - Ара I- Pst I; Г - Xba I-Pst I; | - XbaJrAccIî Е - Xba I-Eco.RV;

X - Xba I-Apa I.

pBR322 расщепленная Bsp RI.

Окончательно структура полученного гена подтверждена методом Сэнгера (рис.7).

GATC

GATC GATC_

r

3=i

ss

ш ~ ш

S — —

"3L

§

„SE

Рис 7. Радиоавтограмма"нуклеотидной последовательности части полусинтетического гена гамма-интерферона быка.

Выводы. 1. Разработан метод одновременного многоточечного мутагенеза, с помощь» которого можно быстро синтезировать длинные нук-леотидные последовательности, исходя из имеющихся гомологичных структур.

2. С помощью разработанного метода яа основе гена гамма интерферона человека получен процессированный гея гамма-интерферона быка.

3. Схонстуировая полуавтоматический синтезатор, обеспечив аший высокоэффективный и быстрый синтез олигодезоксирибонухлеотидов.

4. Показано, что увеличение длины синтезируемых олигодезохсири-бонухлеотидов не приводит к увеличению относительного количеств* нежелательных замен в клонированном фрагменте.

Основное содержание диссертации опубликовано в следущих работах:

Д. Ростапшов В. Н., Чернов И. П., Ажикина Т.. Л. , член-корреспондент АН СССР Свердлов Е. Д. Полухимический синтез процессированного ге-на^интерферона быка. - Доклады АН СССР, 1987 г., том 295,N4, стр. 1016-1020.

2. Ростапшов В. Н., Чернов И. П., Ажикина Т.. Л., Свердлоз Е. Д. Полухимический синтез процессированного гена ^-интерферона быка. В сб. "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы" 2-4 июня, 1987, Пущино, Тезисы докладов, стр. 78.

РОСТАПШОВ ВИКТОР ЫИТРОФАНОШТС

Полугиничеокий синтез процеооированного гена интерферона бнка

(Автореферат)

Подписано к печати 18.03.88 Формат 60x90 I/I6 Объем в пАл. 1,2 Уч.изд.л. Iii Тираж 100 Заказ 385 !Ь Т-02928 Бесплатно

Ротапринт Завода-втуза при ЗИЛе,109068,Москва,Автозаводская,16