Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полученио и исcледование трансгеннных растений подсолнечника (Holianthus annuus L.)

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Полученио и исcледование трансгеннных растений подсолнечника (Holianthus annuus L.)"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА. Биологический факультет

На правах рукописи УДК:'577.21:581.143,6:633.854.78

САНГВАН ХАРЕАЛ СИНГХ

Получение и исследование трансгенннх растений ' подсолкочника / НоИшПЬид шшиио I. Л

Специальность - 03,00.12 - Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание упеной степени кандидата биологических наук

Москва - 1993 год

Работа выполнена в Научнол центре "Биоянженерия" • Российской Академии наук .

Научный руководитель: член-корреспондент РАСХН доктор биологических наук, • профессор К.Г.Скрябин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, "г профессор Б.А.Тарасов

кандидат биологических наук 'Г ■• • Т.А.Вйасова - '

■ Ведущее учреждение: ВНИИ сельскохозяйственной

■ , ,, биотехнологии РАСХН '

11 * * ■ ■ . ■ * , - ' * . *'

. ; "Защита состоится " •^•¿'/С'^-1993 года в "час. оЗ; : йа'заседания спедиализврованного сбвота К.053.05.14 по

,йр*оу«деякю учвной стегани кандидата биологических наук в -; Московской Государственном университете по адресу: 119ЙЭ9, Мооква, Воробьевы горн, ¡•¿ГУ, биологический факультет. -

.;. .С двссертащгей можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета. ЕЯ7. . •'.•

■ Автореферат разослан " "

/Ж 1993 г. ' Учйнкй секретарь - - , ' . , ' \ ' спзадалйэврованного совета

кандидат, бяологическяг наук . О.Г.Полесская

Введение

Актуальность темы. Одной гз ванных сельскохозяйственных культур является подсолнечник, используемый для получения масла с высоким содержанием яирнвх кислот и витаминов. Подсолнечник выращивают в различите регионах мира; эта культура хорошо адаптируется к неблагоприятна условиям среды. В России созданы высокомасличные сорта подсолнечника, которые послужили источником создания ценных гибридов и изучения явлений мужской цитоплазматической. стерильности. Однако, частная генетика этого объекта по сравнению с другими сельскохозяйственными культурами разработана недостаточно. Широкие возможности для решения многих задач генетики и селекции подсолнечника, в частности, создания форм устойчивых к пестишдам, инсектицидам и патогенам открывает сельскохозяйственная биотехноло-' гия, основанная на применении методов генетической инженерии..

Принципиальная возможность переноса чужеродных генов в клетки подсолнечника при использовании Ti-плазмид A.tumefa-'-- eienadbuia показана рядом-авторов / îiatzka et al , „. 1984, ' Coldsbrough ot al", 1986, Everett et al , 1SS7/. Од-

нако;' из-за неспособности k регенерации опухолевых трансформированных клеток эта система не получила применения в генетиче-• ской инженерии подсолнечника. Использование "обезоруженных", лишенных опухолеобраэутацих генов векторных систем, сконструированных ht. основе Т^-плазмид A. tuasfaoiena ■ и разработка способов регенерации растений подсолнечника из каллуса / Patteraon,Eve:rott , v 1935/ и зародышей / M.Preyaainet, 8.]?reyeginet, . 19е8,врропвп1со et al , _ 1991/ открывает пути к созданию трансгеннюс растений подсолнечника с поуошья метода генетической трансформации. 3Va задача i/ожет быть речо-на при Есполъзорании векторных плазмид с удобными генетически.™

маркерами и штаммов А. *щаГас1впв • получецньад о Помосъю трехродителъских скрещиваний. Поскольку эффективность различии х Бекторних пяазмид к штамкоб бактерий неодинакова для различных растений и зависит от их генотипа и физиологического состояния, то необходимо осуществить поиск способных к трансформации лин"В подсолнечника и выявить наиболее удобние для трансформации итаюда АегоЬпо1ег1шз гилш:Сас1впа.

цнль и задач;; исследования. Работа посвящена разработке сисгемн генетической трансформации подсолнечника на основе использования 1Ч'-плазмкднвх векторов, способных осуществлять поднос чулародных генов в клетки табака к других растений.

Р диссертации были поставлены следующие задачи:

1. Анализ взаимодействия различных штаммов а. ьшос-асХепз .с различными линиями /генотипами/ подсолнечника.

2. 1-ияработка мнтоца генетической трансформации _у подсолнечника. с помощью И -плазмидного вектора, содержащего маркер-кий ген устойчивости к канамаишу.

3. Определение экспрессии, маркерного генаЛРТН а. метках •' тропегенных расте'ндй.

4. Сравнительное изучение эффективности трансформация табака и подсолнечника при использовании различных штшздв

Л,1шаеГас1епа •

Научная чоаизта и практическая значгаость работы. В работе осу!й?'СТМ9Н!х генетическая транс^оркадш у полсолнечника при использовании векторной систегуД А. шаеГас1епа • Ислучеш: трииогонннр растения подсолнечника сорта Ркакскнски?.. в хоторю: ну-'С! гка ?кспрепсия г<?наиРТП, !•• .ьч-ролируигаго устойчивость к мнакгцпну. Уставлено, что способность к трене Кр* аная за-¿•г.егг от г лютип-ч | асгечлй. В результат? с4;йгягт*лкчого ышсж.

- о -

взаимодействия различных штик^лоы А^итеГаоАепа , с подсолнечником вияилон шташ / А '¿31 с плазл.вдой рВ1 121/, обладающей более высокой трансформирующей активностью.

Нолученниэ результаты свидетельствуют о поз ложности получения трансгенных ¡астении подсолнечника с чужеродныеи генами, что расширяет Ю31,!о-кностп создать линий перспективных для ее-ленпии. Разработанная систона генетическом трансформации г»окет бить использована для получения трансгешшх растений с ризлнчнш сочетанием признаков. О'га методики позволяет также :сследовать особенности экспрессии различных генов, введенных в составе векторных плазыид, в зависимости от генотипа, гормонально! 'о статуса и различных физиологических параметров объект/

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного системам генетической трансформации у растений, разделов с описанием материалов и методов, главы с результатами и обсуждением; в "завершении работы приведены выводи. Габота изложена на У5 страницах, ссдер:яит 10 рисунков и- таблиц; список литературы включает 140 наименований» ' • "

- 4 -

M A T E P И Л Л Ь И А Е Т О Д U ' .

Растительный материал, катериалсд; служили растения табака /•HÍoatlená tabaо ига J, линия .oVfettt" Havana SH-I , .a также подсолнечника / Hslianthúe шшииа • ¿» /, сорта Енисей, Надежный, Ржаксинский, иибредчая линия 3629, / любезно предоставленные А.М.Гуядаевта/; ядерйте мутанты n cfrLorina 3 • n chlorine 4 ; пластидные 1'утантыей chlorina б,en cbloriiia 7 / любезно предоставленные Ю.Д.Велецкиы/.

Б качестве эксплантов использовали незрелые зародыши на 9-21 день после опдления: сегменты гиюкотидя, первуг пару листьев, апексы пойегов 5-13-дкевиых асептических проростков. Индукция каллуса подсолнечника. Образование каллуса индуцировали гз незрелых зародитей 'размером 0,1-0,8 см на питательной среде MS / Kurashige , SXoog 1962/, модифицированной I'ano-ненко и Зорониной / Г&поненко, Воронина,'1890/, рН 5,6. Стерилизацию сомякок проводили / 9-21-й день после опыления/ в 10$ р-ро г'ипохлорида а, в точение 30 ь*ин. Бактериальное щтцм/у и празуидк. Использовгиш сунервирулентш/Я атролмювый штаьм А281 / предоставлении)! М,П.Гордоном/ и'-разо-руявннкй.октопииовый штамм ISA 44U4 / предоставленный Ч.Ю.Бо-ваиом/. Оба Лтамка Agrobacteriua tumefaciens , содержали

вектор бинарного т?ша р31 121 / созданный на основе иектора pBla 19/, с маркерными Х'енами ¡юог.шдпнфосфотранс^еразу / К Fi II / Guq / предоставленный Р.А.Дкефрерсоном/. Плаз-к:сдв pal 121 была перенесена в штаммы A, tœoefaciens путем •греяродк'Хвяьских скрещиваний /Дихтенитейа, Дрейл'ер, 1986/ с использованием плазмидк-покоетык. рГК 2С13.

Для цультиввровалш, ЛактеглЛ были г.спользсвачы среду A3

УТ, Бактерии Е. coli для последующего выделения плазшдной ДНК выращивали при 37°С на богатой среде УТ. Агробактерии для последующего наделения плазкидиой Х.Д1К выращивали при 28°С на богатой УЕБ-среде.

Трансформация клеток К. colt и выделение плазмидной ДНК. Трансформацию бактгркй проводили пс методу Mandel и

Higa /1970/. В ряде случаев использовали также компетентный клетки Е. coli , приготоаченные по методу Hanahan /1983/. Для выделения плазмидной ДНК использовали модифицированный метод Birnboim и Doly /1979/.

Ферменты.Большая часть ферментов, включая эндонуклеазы рестрикции, получена из НПО "Фермент" / Вильнюс/.

Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы 1 Б. coli , ДЦК-лигаза и полинуклеотидкиназа фага Т4 были получены от фирмы ' " Amersham " /Великобритания/,

Рестрикция ДНК. Рестрикцию ДНК проводили в буферах, рекомендуемых фирмами■-роставщиками. Концентрация ДНК в рестрикпионной смеси не превышала 0,1 мкг/мкл раствора. Рестрикцию останавливали, смешивая образец с половиной объема 7,5 М раствора аммония ацетата и двух объемов этанола. После 15 минутного инкубирования нуклеиновые кислоты осаздали центрифугированием яри 12 ООО в в течение 15 минут и растворяли в трэфемом объеме стерильной воды.

Дотировали- фрагментов ДНК. Фрагменты ДНК лидировали в смеси объемом 10 мкл, содержащей однократный буфер оледупшего состава: 50 мМ Тр с-Gl, pH 7,5, 10 мМ N^Clg, 10 ДТТ, 1 М спер-мидина, 0,5 !.í.¡ рпбо АТФ и 100 мкг/о БСА.

Количество векторной ДНК в реакционной смеси не превышало 20 мг. Если в реакции лигирогшп использовался лофосФоролкро-

ванный векторный фрагмент, то молярное соотношение вектор/ фрагмент составляло 2:1, во всех^ остальных случаях - 1:2 -1:3. ~ ' •

При лидировании фрагментов с липкими концами концентрации . ДШ-лигазы бактериофага T<J в сЛрс.и составляла'0,005 ед/мкл/ единицы Wei'sa , реакцию проводили в течение ночи при 4 6°С.

рыделение ДИК из клеток A. tumefaelens_ь Выделение

тотальной ДНК из клеток A. tumefaolens проводили со-

гласно методике Вгарег J. /1986/.

Конъюгапионный перенос плазмид из К. 00:11 в A.tunefaolena_

Проводили согласно методике Cheyaan « Dipioiser /1987/.

Эффективность конъюгации составляла 10 - 10 . • Трансформация сегментов листьев табака.

1. Растения табака ввращивалг vitro иа побегов, на половинчатой среде М , с концентрацией агара 0,7$. Брали листья

ст 4-х недельных растьний л и или " Petit " Havana SR- I .

2. Отрезали сегментн листьев площадью - 0,5 см^ и переносили . в чашки Петри с 10 мл жидкой .полной среды М3 .

3. Добавляли 10 мл бактериальной культуры: Агробактерик ¡выращивали в точение ночи на минимальной среде с 300 V.r/i/л спекти-not/muma / ^ew» / и/пли 10С0 мг/ш стрептомицина / siEma /.

4. Инкубировали образцы в течение 48 ^асов при 25°С в комнате для культивирования растений.

5. Инфвдяровашше образцу дваяды проживали жидкой полной Ms, средой / в 2-х исходлкх оСъека>/.

6. Переносили сегменты листьев в пробирку со средой для индукции лебегов путем помещения нижнего экидерквса ка агар. Для регеке-рапии лебегов ?а£ака в голну» среду Us с концентрацией агара

гобагллда 1.U кг/л бензилакг.ноауркна / sißnla /, и

L,1 mi/л 'ЛУК / blgma /. Кроме того, 50U мг/i.ui сефотаксш.а /Agrobaoteriun/ добавляли в среду, чтобы олиышировать клетки A.tumsfaciena , Добавляли каиамицш /100 мг/мл / / aigma / в качестве селективного агента для получения трансформированных побегов табака.

7. Образцы инкубировали при 25°С в ^екиме 16 часов освещения / 200 люкс / 6 часов темноты.

8. После появления маленьких побегов / через 3-4 недели/ листовые диски переносили на свежую среду и выращивали в течение 3-х недель.

9. 5 побегов / £ 0,5 см длины / переносили в стеклянный контейнер, содержащий агаризованный МС среду без фитогормонов, но с добавлением 500 мг/мл сефотаксшла. Побеги последовательно переносили на среду ЫС, в которой концентрацию сефотакскма гра-диентно уменьшали до нуля в течение следующих 2-х переносов, для получения'аксенических растений.

Определение активности Д РТ 1Г. проводили методом Рейсса с •соавт. / Rat a a et al ,"1984/ в модификация, описанной в работе

Ой. Block at al /1У84/. •

Селекция и регенерация трансформантов. После 2 или 3-х дней кокультивирования, листовые диски переносили в среду, содержащую 500 мг/мл карбешщиллина / чтобы ликвидировать клетки A.tumefaoiena / и 30 мг/мл канамкцкн сульфата,' для селек-

ции трансформированных клеток растений я побегов. Карбенвдиллян применяется для подавления бактериального роста: другие антибиотики, такие как сефотаксим при 500 мг/мл могут быть заменены или использованы в сочетании с карбеницшииюм, чтобы обеспечить эффективный контроль селекции. Через 3-4 недели каллус я побеги появляются яа листовых да ках табака, культивируемых на

- 8 -

селективной среде вместе с клеткам А. *илш£ас1епа содержащими химерную конструкцию с геном устойчивости к кана-мицину. В контрольных листовых дисках рост не наблюдался.

Побеги переносили в почву.через 4 недели, когда корни достигали не менее 3 мм дайны. Корди промывали для удаления среды и молодые рр тгения помещали в стерильных условиях в ростовые камеры с освещением и контролируемой влажностью. Важным фактором выпивании молодых растений является защита кх от высыхания. Трансформация у подсолнечника. Для трансформации подсолнечника незрелые зародыши культивировали с ночной культурой А. ^еГ-

во!епз . Ночные культуры агробактерий выращивали на двукратной среде УТ жля АВ с канагшцлном / 50 мг/л /.

Селекцию трансгенкой ткани вели на безгормоиальной среде МЗ , содержащей 100 мг/л канамищшсульфата / ввпга / и 500 мг/л' клафарона /Ноидве / при использовании вектора А281 / рВ1 121/, и на среде того ко состава с фитогорионами' при использовании вектора Ь ВА 4404 / рВ1 121 /. В качестве контроля, использовали необработанные незрелые-зародыши, помещенные на модифицированную и селективную ¿реду, а также незрелые зародили, обработанные агробактериальными штаммами А 281 и ЬВй 4404, лишенными пяазмвд, с последующим культивированием на селективной среде. Результат» и обсуждение.

1. Получение и адализ трансгеннкх растений табака. Для селэк-цив клеток растений и побегов через 2-3 дня кокультивировашя листовые дески переносили в ту же среду, содерг-сащую 500 мг/л к&рбенцийляна г, 3(3 ¡.^г/мл кана:.ияугасульфата. Чтобы обеспечить гЗ^ехтденый контроль слзкцик используется се^отахск?«. / мг/ьл / в'.-,¿сто касгенга'-тлгпа, кл г р :очэтан/.и с карбек-

-В'-

m

л в 1 l'î it ., 13

Wj .!ff j

Г ' " " - ' i J ,

i i 'Лч* '»<$

-шт

ряс. i, определенна йеткепоотд пзлшошфо^зортрнкофор^ш /ípt и/в paoïOBsn тябшса. I« LBA 4404 (xxHTpati) ; а-С - гтучтш я рэ зуаыгатв ТрШСфОрЛЩЙЛ À,tumûfaoi«me XJSA 4404 ( Î01121 )| 7-12 - ааяучзшш я разуямиг» тр сфорицка A.tUfflefaoie"e А 281 (jSI KI ) \ 13 - А 281 ( шгграл» )»

-/«• -

, циллииом. Через 3-4 дня, в отличие от контрольных вариантов, на среде для культивирования с клетка,.и штаьл;а А„ turneraciens L ЗА 4404, содержащими химерную конструкцию с геном устойчивости к канамицину, наблюдался рост каллусов, и побегов.

Селекцию растений, способных к экспрессии чужеродного гена, проводили па среде /солевой состав ЫЗ , в витамины, . 30 г/л сахароза/, содержащей 600 мгДд карбенциллина и ЗСмгЛл канамицина. Отбор проводили по признаку укоренения побегов.

По результатам определешш неоыкцинтрансфсразьой активности было установлено, что в 8 растений из 12 / Рис. 1 / обнаруживается экспрессия генаНРТП, что свидетельствует о трансгенной природе этих растений.

2. Сравнение эффективности трансформации табака различными штампами' агиобактеput}. Для трансформации фрагментов листьев табака были использованы штаммы ЬВА 4404 и А 281, в которые путем трехродительских скрещиваний бил перенесен бинарный вектор рВ1 121. Т-ДНК плазмиды р'1Во542 штамма А 281 содержит • гены синтеза фигогормонов, .а Т-ДНК рВ1 121, содеротт геи МРТ 11, т.е. устойчивости к канамицину, Таким образом, при' трансформации итаю.юм А 281 / рВ1 121 / на среде без фито-гормонов с 100 'Мг/л канашцина происходит отбор двойных трансформантов. Результаты опытов по определешш эффективности трансформации при использовании различных штаммов огробакте-рий представлены в таблице 1. '

При трансформации фрагментов листьев щта'ъи ЬОЛ 44U4 и LBA 44U4 / рВ1 121/, рост устойчивых к канашицшу тканой происходил на среде с фмогормопм и. При трансформации Л 281 /рВ1 121/ наблюдался сплошной.рост устойчивой к капа.-.ицину • ткани у 14 эксплантдв на среде с фггсггчи/онгл,"., ну 15 ?кс-

Таблица 1.

Сравнение эффективности трансформации Шсо-^апа гаЪасил различными штаммами агр'обактерий / ЬВА 4404 и А 281 /

Штамм Соеда М 8

гошоны+ Кт+ гормонн* Ка~' гошоннт К«''

Ь ВА 4404 Рост каллус- Сплошной Нет роста

/рВ1 121 / ной ткани в рост на всех

отдельных точ- эксдлантах

ках эксплан-

тов. 4,2 точ-

ки на 20 эк-

сплантах

А 281 Сплопяой Сплошной Сплошной рост

/рВ1 121 / рост на кра- рост на. на 15 из 3.1 ,

рТЧВо 542 ях 14 экс- всех тэвс- аксплантов (

плантоз из плантах

20 . - • * ; ■

Кт - каиаштин; в качестве гормонов ■ использовали^ МУК /^-нафтилуксуснад кислота / ; КАП / 6-бе'нзилашнс|пурин /

- - •

плаитов в среде без фнтогормонов / табл. 1 /.

Таким образом, трансформация листоенх пластинок табака при использовании шташи Agrobacterium А 281 /рВ1 121/ происходит эффективнее, чо» при использовании штата IjBA 4401 / рВ1 121/, то есть вирулентность штат.,а А 281 втие, чем • • ЬВА 441)4.

3, Генетическая трансформация незиелнх заротокей 'подсолнечника

ПРИ использовании fl- -рлазшд Agrobacterlua tumefaciena._(

Впервые » 1987 году Эверетт с соавторами получили трансгеннье растення подсолнечника / Everett et al , 1987/. Ма-

териалом служили участки типокотиля стерильных 7-дневных асептических проростков, которые инокулировали ночной культурой неонкогенного штамма ¿.tumefaeiena С 288 / MAI. 715/.

В качестве доминантного селективного маркера использовали устойчивость к аминогликозидноку антибиотику канамицяну. Однако зти опыги позднее воспроизвести не удалось / ïeerboltejr,

Dek > 1991/. Трудности в осуществлении трансформации у • подсолнечника, по нашему шению, связаны с тем, что клетки подсолнечника отличаются высокой чувствительностью к воздействию агробактерий и процесс трансформации в большей степени зависит от исходного генотипа растений и возраста экспланта, ' Нами совместно с И.П.Ворониной и А.К.Гапоненко бнла изучена возможность трансформации незрелых зародышей при использовании восьми различных генотипов подсолненнчка с помощью со-культивирования с ночной культурой A. tumeîeelena .

Прежде всего исследовали влияние антибиотиков на процесс каллусогенеза и регелеращш растений при подборе селективной средн. Как известно, влияние антибиотика зависит от генотипа растений. Й связи с втмм, в работе анализировали действие

различных антибиотиков / вапномишш, рифашицин с тетрациклином, клафоран, канамицин / на растения подсолнечника с различным генотипом. Только кларораи не оказывал заметного угнетающего влияния на рост каллуса и регенерацию растений. При концентрация канамявдиа 100 мг/л ЗБ-60% незрелых зародышей показали способность-к росту.

Учитывая полученные данные, в дальнейшей работе в качестве селективной среды была использована среда, содержащая в каче- . стве селективного агента канамицин /100мг/л/ и клафоран / 500 мг/л * как агент подавляющий рост агройактерня.

Селемткю трансформированных тканей проводили на безгормо-" иальной среде, так как в Т-ДНК pT-íJBo 542 находятся гены био- ' синтеза фктогорчонов. Отбор двойных трансформантсв, при ввода- . нии Т-ДНК pTibo 542 н Т-ДНК piJl 121 проводили на среде бе:з ■ фитогоркснов, но в присутствии 100 мг/л канамшцика. На 7-8 -сутки после сокультивированкя незрелых зародышей со шташом агробактерии А 281 и селекции па среде без фитог-ормонов и ка-намяцина наблюдали интенсивный д>пухолевый рост на семядолях. В результате трансформации при использовании А 281 /рВ1 12-1/' и дальнейшего культивирования на среде без канамюиша были получены сходные результаты, 3? из 123 эксплантсв подсолнечника сорта Р-аксинский при культивировании на среде с lQUwr/л канашщина, проявляли способность образовывать опухоли /табл.2/.! Однако трансформация была обнаружена не у всех йсследсваш'ых сортов и линий подсолнечника. Способность к генетической трансформации зависит от. генотипа растения. Как видно нз таблицы 2 образование трансгенной ткани происходило только у одного кз восьми ислсшьзуекых генотипов,при этом эффективность трене-

-Mf-

формации штамма А 281 / рВ1 121/ били више, чем при использовании штамма Ь ВА 4404 / рВ1 121/. Пи в одном, из случаев использования ткани гипокотиля / включая растения сорта Ргаксинский/ трансформация не наблюдалась. 4. Сравнительный анализ аффективности трансформации незрелых зароиышей подсолнечника различишь штаммами A^robncterlum -

tumefaclens__ Повышенная вирулентность штаммов

A. tumefaciens , к донорнш растенияк является необходимы..; условием для увеличения частоты трансформации. В этом отношении штамм А 281, по сравнению с другими штампами применяется чаще, так как обладает вирулентностью ко многим вида/! растений / Hood et &1 , 1984/. Данный штамы несет супервирулентную шшзмиду pTibo 542. Было показано, что при использовании плаз-миды pTiBo Ь42 в качестве плазмиды-гомощника в бинарной система частота трансформации существенно возрастает / An et al , 19ЙЬ/. В результате трансформации незрелых зародышей сорта Ржаксинскии штаммы A. tumefaclana , А 281 /рВ1 121 / частота образования опухолевых линий составляла Зи.ОЬ'/. После сокуль-тлвирошния с ЬВА 44U4 / рВ1 121/ частота образования морфс-генных каллу с них линий составляла 5,33%' / табл. 2 /. Таким образом, трансформация незрелых зародышей данного сорта происходит более эффективно при использовании штамма А 2Ь1 /рВ1 '121/, чем со штим.юм L3A 4404 /рВ1 121/. Лля осуществления трансформации и изучения характер экспрессии генов, целесообразно применять вирулентный штамм Л. tumefacienu , A LM. Однако, в дшшш.. случае, регенерат я раотеикК из опухолевых клеток иегюзмоана.

При 1!спольаоглш1! Ш 44¡Л тршсФoj usponti".ныв зкс-

плантн псиаилк на сел»'кгирн\1е ciery с ^ктох^ьоньмк, та» кап

Таблида 2.

Частота трансформация незрелнх зародышей /Н3/ и Гипокотиль /Г/ подсолнечника различными штаммами Agrobacteriura tumefaoiens.

Геногипи подсолнечника Иташш агробактерий

A28I (pBI 121 ) 1ВМ404(рВГ 121)

Кол-во Число часто-эксплаи- транс- та трал татов генчнх сформа- олухо- НИИ левых гу \ линий к<° ' Кол-во Число Час-1-эксплаи-тран- тота татов сген- трапных сфор-каллу- мащта сных г</ \ ЛЕИИЙ № '

Енисей «з Г 137 120 - 125 - . 145 ' -

Надекный d Г Г37 197 - - - 127 215 - '

3629 3 Г 217 151 187 185

и» РяаксинскиА 3 Г 123 37 • 30,08% 151 75 4 5,34? 66 - ,

a chlorina Н3 3 Г 107 103 - • - . 198 165

и chlorine ^3 4 Г 124 147 - - 144 131 -

en chlorina ^з б г 133 146 147 151

еа chlorine.Н_ 7 г3 135 -151 147 161

.. - i4 -

.данная плазмида является разоруженной. Полученные :;орфогенныо каллусы росли на среде с 100 мг/л каны.иодна и были способны к регенерации растений.

На среде с добавлением фитогорь.онов, но без канаь.гцина

после сокультивкрования LBA 4404 / рВ 121 / индукция кгллусоп

происходила /4 из 75 эксилантов сорта Ржаксинскин индуцировали

морфогешшй каллус/, но каллусные линии росли медленно. • Результаты по трансформации гипокотиля были отрицательными.

5. определение неомишнсЬосботракссТеразнстй активности р клетках трансформантов подсолнечника. Для доказательства осуществления трансформации с помощью плазыиды, содержащей маркерный ген , HPT II, были поставлены опыты по определению неомицинфосфотранс-феразной активности в клетках каллусов, полученных в опытах по трансформации с сортом Ржак'инский. Проводилась проверка растительной ткани на присутствие клеток агробактерии. Части каллусов, выращенных на сроде с канадшвдном и кдафораном, подвергали разрушению в стерильных условиях и 'высевали на бактериальную питательную среду АВ с 50 мг/л канамицина. Отсутствие роста бактериальных колоний на поверхности сроды свидетельствовало о том, что каллусные ткани, не содержали жизнеспособных бактерий . A^robactariun tuaafaoicma • Активностьн РТ П определяли в опухолевых линиях, полученных в результате со-культивирования эксплантов со штаг,злой А 281 / рВ1 121 /, а также в 4 каллусных линиях, выделенных после трансформации со • штаммом ЬВА 4404 / рВ1 121 /. Ойа типа линий выращивали на среде с канамицином. В оишие от контрольных образцов /баз

' использования И-йлазмпд/ у всех опухолевых линий к каллусов, » _

полученных после процедуру трансформации, была обнаружена ВРТ П -активность. Это указывало на-то, что все вти линии яеля™ югоя'трансформаятами/'обладаюишя новым-признаком устойчкх >сти к канамяпину за счет экспрессии гана Я FT П/ Рис.2/.

Feo» «2 . Определенно агяшюстя цоо^шшшфосфотраЕсфэрй^м . / roí и / в каддусннх и овзхолэхш дшашс оолнечикка сорта РашашвгиЛ« , '''

1 - 8 - окатракты шг опухолей» подучишшх в рФ* /.Í зудыага т;лнсфэр*пцаа a. tuaafaoiene i ? » ЙЙ31 /гдатрошЛ 3 « G, а - Д23А Д*Ш21/, S - 16 - око-тракти as гадаусов» Еолудаззгж n pi-* зультмо транофо^гяцаз A.ttesefaciena î О ~ « 1ЛД44М /fB112iA 13-lß - bliMÍOi /l»H7j<vr>/f ;

..•-левы в о д ы

1» lia модельной системе генетической трансформации у табака с использованием бинарного И -плазмщшого вектора исследована трансформирующая ег,'(Активность различных штаммов Àgrobactarium tumofaoiens

2. Разработана система генетической трансформации незрелых зародышей подсолнечника с помощью И-плазмядиого вектора и получены трансгеннь'е растения, устойчивые к канаыицину, в соматических клетках которых экспрессируется ген ИРТ П.

3. Способность к трансформации у подсолнечника зависит от генотипа растения! трансформация обнаружена у сорта Ржаксин-

• ский.

,4. Установлено, что эффективность трансформации незрелых аа-' родшлей подсолнечника выше при использовании супервкрулентного-агропинсзого итамма A. tamefacieaa , . А 281 /рБ1 121 /, по Сравнению о октошпювюд штаммом 1Ш.4404,