Получение трансгенных растений табака с геном белка CspD из Bacillus thuringiensis и изучение элиситорных свойств бактериальных белков холодового шока

Кромина, Ксения Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Получение трансгенных растений табака с геном белка CspD из Bacillus thuringiensis и изучение элиситорных свойств бактериальных белков холодового шока
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Получение трансгенных растений табака с геном белка CspD из Bacillus thuringiensis и изучение элиситорных свойств бактериальных белков холодового шока"

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ФИТОПАТОЛОГИИ

На правах рукописи

Кромина Ксения Андреевна

Получение трансгенных растений табака с геном белка CspD из Bacillus thuringiensis и изучение элиситорных свойств бактериальных белков холодового шока.

06.01.11 - защита растений

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Большие Вяземы - 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии РАСХН в 2000-2005 гг.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Виталий Георгиевич Джавахия

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Февзи Сеид-Умерович Джалилов

кандидат сельскохозяйственных наук Александр Николаевич Игнатов

Ведущая организация: Институт биохимии

имени А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится » ¿¿{¿¿с^ 2006 г. в часов на

заседании диссертационного совета К-006-064-01 при Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии по адресу: 143050, Московская обл., Одинцовский район, п/о Б. Вяземы, ВНИИФ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан « ^» Я^у^С^ке 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук I И. II. Яковлева

&006А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы.

Защитные механизмы растений развивались в процессе длительной эволюции и, следовательно, способны обеспечить надежное противостояние фитопатогенам. Поэтому использование естественного защитного потенциала самих растений является привлекательным направлением в защите растений от болезней. Такой подход представляется относительно более безопасным, чем применение ксенобиотиков, так как в этом случае в окружающую среду не вносятся вещества, оказывающее негативное влияние на биосферу. Поскольку одним из механизмов фитоиммунитета, обеспечивающих устойчивость растения к патогенам, является индуцированная устойчивость, в настоящее время активно исследуется возможность использования данного типа устойчивости в сельском хозяйстве. Это, в свою очередь, требует изучения тех процессов, которые происходят в растении в ответ на внедрение патогенов и распознавание их метаболитов (элиситоров), что, в конечном счете, и приводит к возникновению устойчивости.

В середине 1990-х годов во ВНИИ фитопатологии был выделен низкомолекулярный (7,2 кДа) термостабильный белок из Bacillus thuringiensis, получивший название Microbial Factor 2 (MF2). Было показано, что МР2-белок способен индуцировать устойчивость растений в следующих парах патоген - хозяин: вирус табачной мозаики - табак, X-вирус картофеля - табак, Phytophthora infestans - картофель и Magnaporthe grísea - рис. Ген, кодирующий MF2 белок, был клонирован и секвенирован (Djavakhia et al., 2000). Поскольку в ходе дальнейшего анализа оказалось, что белок MF2 относится к классу белков холодового шока, он был переименован в Cold shock protein D (CspD). Представлялось перспективным перенести ген CspD в геном растений, для того чтобы выяснить возможность индукции устойчивости в трансгенных растениях

при экспрессии этого гена. В качестве объек iftttWfQttW* «ряйсгенных

БИБЛИОТЕКА { СПетерСуря Лл ,

' 09 i-, j

растений был выбран табак, так как это растение легко поддается агробактериальной трансформации.

Впоследствии стало известно, что белок холодового шока из Micrococcus lysodeikticus также служит неспецифическим элиситором защитных реакций растений (Felix и Boiler, 2003). При этом оказалось, что для элиситорной активности класса бактериальных белков холодового шока достаточно пептида, состоящего из 15 аминокислотных остатков (cspl5) и представляющего собой консенсусную последовательность в области РНК-связывающих мотивов RNP-1 и RNP-2. Авторами было показано, что cspl5 обладает элиситорной активностью по отношению к растениям семейства Solanaceae (.Nicotiana tabacum cv. Havanna 425 и Solarium tuberosum), но является неактивным по отношению к рису, огурцу и некоторым другим растениям. Оценка элиситорных свойств cspl5 проводилась исследователями в искусственной системе без участия патогена. В связи с этим, было необходимо изучить элиситорную активность пептида cspl5 в системах, отражающих естественное взаимодействие растения-хозяина и патогена.

1.2. Цели и задачи исследований.

Одной из целей наших исследований было получение трансгенных растений табака, в которых экспрессируется ген неспецифического элиситора CspD из бактерии В. thuringiensis, с последующей их оценкой на устойчивость к грибному и вирусному патогенам. Другой целью было изучение элиситорных свойств пептида cspl5, в том числе с использованием естественных система тестирования взаимодействия растение-хозяин - патоген.

Задачи исследований.

1. Получение генно-инженерных конструкций для экспрессии бактериального гена CspD в растении.

2. Создание трансгенных растений, несущих ген CspD.

3. Анализ устойчивости трансгенных растений к патогенам.

4. Оценка способности пептида cspl5 индуцировать устойчивость растений в системах растение-хозяин - патоген.

1.3. Научная новизна исследований.

1. Впервые созданы трансгенные растения табака с геном элиситора неспецифической устойчивости растений, CspD, выделенного из В. thuringiensis, и показана их устойчивость к грибному и вирусному патогенам.

2. Впервые показана способность пептида cpsl5 индуцировать устойчивость в естественных системах растение-хозяин - патоген у двудольных растений: табак (сорт Xanthi) - вирус табачной мозаики (ВТМ), картофель - Ph. infestans.

3. Впервые показана элиситорная активность пептида cpsl5 по отношению к однодольному растению в паре пшеница (сорт Мироновская 808) - возбудитель септориоза (Stagonospora nodorum).

1.4. Практическая значимость работы.

1. Полученные результаты по устойчивости трансгенных растений табака, несущих ген CspD, к грибному и вирусному патогенам позволяют начать исследования по созданию трансгенных растений сельскохозяйственных культур с целью их дальнейшего использования в селекционном процессе для получения сортов с широким спектром устойчивости к фитопатогенам.

2. Данные о способности пептида cspl5 индуцировать устойчивость к грибному патогену у пшеницы, к оомицету у картофеля и к вирусу у табака позволяют начать работу по разработке биопестицидов широкого спектра действия.

1.5. Апробация работы и публикации.

проходившем 5-9 мая 2004 г в Дании; III Съезде ВОГИС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», 6-12 июня 2004 г в Москве; третьем московском международном конгрессе «Биотехнологии: состояние и перспективы развития», 14-18 марта 2005 г в Москве.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ. 1.6. Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (3-5 главы), заключения, выводов и списка литературы. Материал изложен на 123 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 20 рисунков и 3 приложения. Список литературы включает 180 работ.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы рассматриваются механизмы индуцированной устойчивости растений, а также ряд элиситоров, вызывающих это явление.

2.1. Материалы и методы.

Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовался штамм Escherichia coli: DH5a (F', 080d lacZAM15, recAl, gyrA96, thi-1, hsd R17, (rk', mk*), supE44, relAl, deoR, A(lacZYA-argF), U169), «Invitrogen». Штамм Agrobacterium tumefaciens: AGL0 (Lazo et al., 1991). Плазмиду pUC 19/CspD, полученную ранее в лаборатории (Djavakhia et al., 2000) использовали в качестве источника гена CspD. Для создания кассеты экспрессии бактериального гена в растении использовали плазмиду pRTlOl (Topfer et al., 1988). Плазмида pRTIOl была любезно предоставлена доктором Е. Klocke (Institute of Chorticultural crops, BAZ, Germany). Для получения бинарных векторов для трансформации растений использовали плазмиду pBinl9 (Bevan, et al., 1984), предоставленную к.б.н. O.A. Шульгой (Центр «Биоинженерия» РАН).

Фитопатогенные микроорганизмы. Гриб Alternaria longipes любезно предоставлен доктором R. Krämer (Institute of Chorticultural crops,

BAZ, Germany). Гриб Stagonosporct nodorum любезно предоставлен отделом грибных болезней зерновых культур ВНИИ Фитопатологии. ВТМ поддерживался в лаборатории in vivo на растении Nicotiana tabacum (Samsun nn).

Пептид esp!5 (VKWFNAEKGFGFITP) был синтезирован сотрудниками группы инструментальных методов синтеза под руководством к.т.н. М. Б. Бару (Отдел биоинженерии филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино).

Суспензионная культура клеток табака N. tabacum L. (сорт Wisconsin 38, штамм 217) получена из «Специализированной коллекции культуры клеток высших растений» института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

В работе использованы стандартные методы молекулярного клонирования и молекулярного анализа трансгенных растений. которые проводились согласно методическим руководствам Sambrook et al. (1989,2001).

Агробактериальная трансформация табака проводилась методом «листовых дисков» согласно Horsch et al. (1985). Селекция и регенерация трансгенных растений табака проводилась на селективной среде с канамицином.

Биотесты. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к патогенному грибу A. longipes проводилась с использованием методики De Bolle et al. (1996) в нашей модификации. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к ВТМ и оценка активности пептида cspl5 в системе табак - ВТМ осуществлялась согласно Djavakhia et al. (2000). Для изучения элиситорной активности пептида cspl5 использовали пару пшеница - St. nodorum и методику Пыжиковой (Пыжикова и др., 1989) в нашей модификации, позволяющей обнаружить явление индуцированной устойчивости. Непосредственное влияние пептида cspl5 на патоген изучали при проращивании спор гриба в растворе пептида. Экстракцию

салициловой кислоты (CK) из тканей картофеля, обработанных пептидом cspl5, проводили по методике Meuwly и Metraux (1993). Изучение активации протонной сигнальной системы в суспензионной культуре клеток табака производили по методике, описанной у Felix и Boller (2003).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена и белка MF2, создание вектора для трансформации растений.

Для того чтобы охарактеризовать кодирующую область в нуклеотидной последовательности, полученную при секвенировании клонированного фрагмента геномной бактериальной ДНК с геном элиситора, был проведен анализ последовательности с использованием различных алгоритмов. В результате было обнаружено, что последовательность элиситора MF2 высоко гомологична последовательностям бактериальных белков холодового шока: идентичность с белком CspD из В. anthracis составила 99% для нуклеотидной и 100% для аминокислотной последовательностей, с CspD из В. cereus соответственно 91% и 95%. На основе полученных данных кодирующая последовательность гена белка MF2 была представлена в GenBank под названием CspD (cold shock protein D), которая получила номер AY272058.

Для того чтобы установить, нуждается ли нуклеотидная последовательность гена CspD в каких-либо модификациях для эффективной экспрессии в табаке, был проведен анализ его нуклеотидной последовательности. Во-первых, определяли, насколько кодоновый состав гена соответствует частотам использования кодонов у Nicotiana tabacum. Во-вторых, в последовательности гена CspD был проведен поиск областей, которые могут подвергаться сплайсингу при созревании мРНК или преждевременному полиаденилированию. Сравнительный анализ частот использования кодонов у N. tabacum и гена CspD позволил

заключить, что нуклеотидная последовательность гена СярО не содержит редкие кодоны и, следовательно, не будет происходить терминации трансляции этого гена в клетках табака. Также был проведен поиск интронов и поли А сигналов в транскрипте гена СйрИ. Данный анализ не выявил в последовательности Сяр£> возможных областей для альтернативного сплайсинга в эукариотических клетках. Кроме того, в исследуемом гене не было обнаружено итТСиА-подобных и АА11ААА-подобных последовательностей, кодирующих сигнал для полиаденилирования у табака (ЬЫУаш е1 а!., 2000; 01еЬп а1., 1998). Таким образом, было выяснено, что нуклеотидная последовательность гена СБрО теоретически не нуждается в модификации для его успешной экспрессии в табаке.

Для того чтобы бактериальный ген СярИ экспрессировался в растении, необходимо было поместить кодирующую последовательность гена под контроль промотора и терминатора транскрипта 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты. Ген ОрГ> амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в плазмиду рИТЮ!, содержащую эти регуляторные последовательности. В результате была получена плазмида рЯТ101/Су/>/). Кассету экспрессии гена СярИ (Р35Б/ СярБ /рАСаМУ) клонировали в полилинкер Т-ДНК бинарного вектора рВт19 (Веуап, ег а!., 1984), имеющий в области Т-ДНК маркерный ген устойчивости к канамицину -пргН, и получили плазмиду рВ1к7 (рис. 1). В плазмиде рВ1к7 смысловые последовательности генов СярВ и пргП сонаправлены. Плазмиду рВ1к7 переносили в штамм АвЬО А. Ште/аЫет при помощи стандартной методики трансформации агробактерии.

рЗбв СаШ

Рис. 1 Вектор рВШ7.

Плазмида, сконструированная для переноса и экспрессии гена Сэрй в растении, содержащая маркерный ген устойчивости к канамицину.

3.2. Получение трансгенных растений табака с геном СярИ.

В таблице 1 приведены результаты экспериментов по получению грансгенных растений табака при помощи агробактериальной трансформации.

Таблица 1

Эффективность агробактериальной трансформации табака

Сорт Всего Число Число Число тр Эффективность

табака регенерантов укоренившихся тр растений, в трансформации*.

регенерантов растений которых есть %

экспрессия С.чрИ

Башзип 174 45 9 5 6

(пп)

ХашЫ 173 57 15 7 9

(Ш)

*Эффективность трансформации определяли как отношение количества трансгенных (тр.) растений к общему числу эксплантов в опыте.

Оценку экспрессии целевого гена для истинных трансформантов проводили на уровне мРНК с помощью ПЦР с обратной транскрипцией. Результаты отображены на рисунке 2.

Рис. 2. Определение синтеза мРНК целевого гена CspD в трансгенных растениях методом ОТ-ПЦР

Н20 - контроль без ДНК матрицы, Нетр. - нетраснсгенное растение, +CspD -положительный контроль (плазмидная ДНК с целевым геном), Х№ и S№ -трансгенные линии табака сортов Xanthi и Samsun соответственно, РНК после обработки ДНКазой - контроль на отсутствие примесей ДНК в препаратах РНК, с которых в дальнейшем проводили синтез первой цепи кДНК, L - ДНК маркер (100 п.н.) Наличие полосы в 201 п.н. показывает экспрессию мРНК CspD гена. В некоторых линиях экспрессия мРНК отсутствует.

Из исследуемых трансгенных линий 7 линий сорта Xanthi (NN) и 5 линий сорта Samsun (nn) показали наличие полного транскрипта целевого гена в 201 п.н. В дальнейшем несколько таких линий было утеряно в результате контаминации культуры растений in vitro микроорганизмами. На устойчивость к фитопатогенам оценивали только трансгенные линии табака, в которых экспрессировался целевой ген. Трансгенные растения морфологически не отличались от контрольных растений и давали фертильное потомство.

Несмотря на то, что теоретически не было обнаружено препятствий для успешной транскрипции гена CspD в растении, необходимо было доказать это экспериментально. С этой целью проводилось определение количества транскрипта CspD с помощью ПЦР в реальном времени.

Анализ проводили на основе Taq-Man технологии 5'- нуклеазного анализа (Perkin-Elmer Corp., 1997). Дизайн олигонуклеотидов проводился при помощи программы "Oligo 6.31" так, чтобы ампликоны были длиной не более 150 нуклеотидов, а длина праймеров (табл. 2) и пробы составляла бы по 20-25 нуклеотидов. В качестве внутреннего стандарта для определения однородности концентрации кДНК был выбран ген «домашнего хозяйства» N. tabacum актин 9 (Volkov et al., 2003).

Таблица 2

Праймеры и пробы.

Название гена (GenBank Accession Number) Олю-онуклеотид (номер - позиция, считая от старт-колона) Последовательность

Cold shock protein D (AY272058) -178 CspD 5-ТТЛ GTTTTTTGT AAC GTT AGC AGC-3'

+88 CspD 5'- TTC TCA GCT АТС CAA GGT GAC GG-3'

probe +145 CspD 5'- FAM - TTC GAA AI С G ГГ GAA GGT AAC CGT G - BHQ1 -3'

Actrn 9 (X69885) +427 Nla-act9 5'- CTT TTC CAA CCA TCA ATG ATT-31

-484 Nta-act9 5'- CCA CAT CAC ACT TCA TGA TAG AGT T-3'

probe +453 Nta-act9 5'- FAM - GGA AGC TGC CGG AAT CCA CGA GAC T - BHQ1-3'

Уровень экспрессии гена СзрИ у линий Х6, XI0.6 и Х56 был сходным, так как при одинаковых значениях порогового цикла для актина 9, значения пороговых циклов для целевого гена у этих линий были близкими (табл. 3).

Таблица 3

Определение уровня экспрессии гена СярЮ в линиях трансгенных растений табака с помощью ПЦР в реальном времени.

\ Линия Гек X6 Х10.6 Х56 Х57 Нетрансгенный контроль Среднее ± ст. отклонение

Пороговый цикл± ст. отклонение

CspD 1 25,2±0,40 25,7±0,40 26,0±0,40 22,6±0,40 0 -

Актин 9 28,6±0,29 28,4±0,29 28,6±0,29 27,9±0,29 28,3±0,29 28,36±0,29

Уровень экспрессии гена С5рй у линии Х57 был значительно выше, так как при таком же значении порогового цикла для гена актина 9, значение порогового цикла для целевого гена было на 3 цикла меньше, что указывает на большее (до 8 раз) количество мРНК гена СхрО у этой линии.

3.3. Оценка устойчивости трансгенных растений к фитопатогенам.

Ранее было показано, что элиситор CspD из В. thuringiensis способен индуцировать устойчивость у разных растений как к вирусным (в паре табак - ВТМ), так и к грибным (в парах картофель - Р infestans, рис -М grísea) патогенам (Djavakhia et al., 2000). В связи с этим, представляла интерес оценка устойчивости полученных трансгенных растений также, как к вирусному, так и к грибному патогенам.

Для оценки устойчивости линий трансгенных растений табака к грибному патогену A. longipes было проверено несколько вариантов биотестов с целью выбора оптимального, который позволял бы выявить различия по степени развития болезни у испытуемых растений. Были проведены следующие виды биотестов: 1 - нанесение мицелия гриба в точку листа (Chakrabarti et al., 2002), 2 - нанесение определенного количества спор в точку листа (Lorito et al., 1998), 3 - нанесение спор в несколько точек на листе (Jennings et al., 2002) и 4 - опрыскивание поверхности листа споровой суспензией (модификация методики De Bolle et al., 1996). Варианты биотестов 1, 2 и 3 не позволяли выявить различия по степени устойчивости между контрольными и трансгенными линиями табака. Биотест 4 оказался наиболее чувствительным для выявления различий по устойчивости линий табака к A. longipes. После оптимизации концентрации суспензии спор, применяемой для инокуляции листьев (1 х 104 спор в 1 мл 50 мМ раствора глюкозы), этот метод был выбран для дальнейшей оценки устойчивости трансгенных растений к данному патогену. Изолированные листья трансгенных и контрольной линий табака равномерно опрыскивали суспензией спор A. longipes, а затем инкубировали во влажной камере. Через 7 дней подсчитывали количество образовавшихся некрозов. В результате было показано, что растения линий Х6, XI 0.6 и Х56 обладали повышенной устойчивостью к возбудителю альтернариоза (рис. 3), так как на листьях этих линий образовывалось достоверно меньше некрозов, чем на листьях растений контрольной линии. Кроме того, в отличие от пожелтевших через неделю

инкубирования листьев контрольных растений, листья трансгенных растений сохраняли зеленую окраску в течение всего периода наблюдений.

300

| 250-

УЖ

| 200 ■

2 150-

100-

| 50-

о -I

Дикий ТИП Х8 X 10.8 Х66 Х57

Рис. 3. Уровень устойчивости листьев трансгенных растений табака к А. \ongipes на 7-ой день после инокуляции спорами гриба

Пара N. гаЬасит (КМ) - ВТМ служит хорошей системой для изучения индуцированной устойчивости растений. При инокуляции листьев табака ВТМ после их предварительной обработки индуктором устойчивости происходит либо уменьшение размера некрозов, либо снижение их числа вследствие более быстрой реакции растения на вторжение ВТМ, при которой некрозы невидимы без помощи микроскопа (Дьяков и др., 2001). Для опыта листья трансгенных и контрольной линий табака (ХапЙп КМ) отбирали с одного яруса и заражали ВТМ. Обработанные листья помещали во влажную камеру при 22°С, количество некрозов подсчитывали через три дня. Число некрозов, образовавшихся в ответ на инокуляцию ВТМ, подсчитывали отдельно для каждой половины листа (для контроля равномерности нанесения вируса на поверхность листа).

Трансгенные растения линий Х6, XI 0.6 и Х56 показали достоверное снижение степени развития болезни при заражении ВТМ, т.е. на листьях трансгенных растений образовывалось достоверно меньше некрозов, чем на листьях нетрансгенных растений (рис. 4).

Рис. 4. Уровень устойчивости листьев трансгенных растений табака к ВТМ на 4-й день после инокуляции.

Результаты экспериментов показали, что трансгенные растения линий Х6, XI 0.6 и Х56 обладали повышенной устойчивостью как к возбудителю альтернариоза, так и к ВТМ. Такие результаты согласуются с ранее полученными данными по спектру активности элиситора СврБ, способного индуцировать защитный ответ в растениях, как против вирусных, так и против грибных патогенов (Ц]ауак1на еТ а1., 2000). Как было указано выше, уровень экспрессии мРНК гена Схр1> в растениях линиий Х6, XI 0.6, Х56 был сходен. Важно отметить, что степень устойчивости к грибному и вирусному патогенам для этих линий также была сопоставима. Кроме того, уровень устойчивости к обоим патогенам был сходен внутри каждой отдельной линии. Вышесказанное позволяет предполагать, что эффект устойчивости трансгенных линий связан с активацией защитных механизмов растения элиситором СэрБ. Растения трансгенной линии Х57 существенно не отличались по устойчивости от

растений дикого типа. При этом они обладали значительно большим содержанием транскрипта целевого гена по сравнению с трансгенными растениями линий Х6, XI 0.6, Х56. Не исключено, что в этом случае не происходило успешной трансляции мРНК целевого гена. Кроме того, возможно, что лишь определенная концентрация элиситора CspD в растении приводит к усилению его устойчивости. Остается неизученным вопрос о механизме и месте действия CspD в трансгенном растении.

3.4. Способность пептида cspl 5 индуцировать устойчивость в системах растение-хозяин - патоген.

Результаты опытов с белком CspD, полученные в нашей лаборатории, свидетельствовали о том, что данный элиситор способен индуцировать устойчивость не только у растений семейства Пасленовые, что было показано для пептида cspl5 (Felix и Boller, 2003), но и у риса к грибному патогену М. grísea (Djavakhia et al., 2000). В связи с этим, особенно важно было проверить, способен ли пептид cspl 5 индуцировать устойчивость у однодольных растений. Кроме того, надо было убедиться, что консенсусный пептид cspl 5 (VKWFNAEKGFGF1TP) способен индуцировать неспецифическую устойчивость к вирусным и грибным патогенам в системах растение-хозяин - патоген, что было показано для CspD, последовательность которого в области cspl 5 отличается от консенсусной на три аминокислоты (VKWFNSEKGFGFIEV). Для проведения таких опытов был синтезирован консенсусный пептид cspl5 и его элиситорная активность проверена в парах N. tabacum (сорт Xanthi NN) - ВТМ, картофель (сорт Истринский) - P. infestans и пшеница (сорт Мироновская 808) - Sí. nodorum.

3.4.1. Оценка активности пептида cspl5 в системе табак - ВТМ.

При оценке элиситорной активности cspl 5 в паре ВТМ - N. tabacum (сорт Xanthi NN) статистически достоверное снижение числа некрозов, вызываемых ВТМ, наблюдалось на листьях, обработанных пептидом в концентрации от 10 нМ, а при концентрациях 1 и 10 мкМ наблюдалось

резкое снижение количества некрозов (рис. 5). Уменьшение числа некрозов было отмечено в целом по листу, а не только на обработанной пептидом половине, что говорит о системном характере индуцированной устойчивости.

200

Концентрация пептида csp15

■ Контроль 010 нМ В100 нМ 01 мМ СИОрМ

Рис. 5. Результаты оценки способности пептида cspl5 индуцировать устойчивость к ВТМ в листьях табака.

3.4.2. СВЧ реакция в тканях картофеля при несовместимом взаимодействии с патогеном после обработки cspl5.

Обработка поверхности дисков клубней картофеля (сорт Истринский, R1) пептидом усиливала СВЧ-ответ тканей картофеля при их последующей инокуляции несовместимой расой (r4) Ph. infestons по сравнению с необработанными контрольными дисками (табл. 4). Так, после инфицирования устойчивого сорта количество некрозов в обработанной ткани снижалось на 33% (при концентрации пептида 100 нМ) и на 28% (при концентрации пептида 1 мкМ) по сравнению с необработанными дисками (100%). Обработка картофельных дисков низкой концентрацией пептида cspl5 (10 нМ) не приводила к снижению числа некротизированных клеток.

Таблица 4

Степень развития болезни на дисках из клубней картофеля, обработанных пептидом свр 15 и инокулированных несовместимой расой (т4) Р т(еБ1ап$_

Концентрация сэр 15 Среднее число некротизированных клеток в 1,5 мм слое клеток, ± 1,96Бе** % от контроля

10 нМ 18,1 ± 1,2 109±7

100 нМ 11,1 ± 1,2 61 ±1

1 мкМ 11,9 ± 1,3 72±8

Контроль без сер 15 16,6 ± 1,5 100±9

* * Бе - стандартное отклонение

3.4.3. Влияние сяр15 на прорастание спор St пойогит.

Для изучения механизма защитного действия сэр 15 было необходимо выяснить непосредственное влияние пептида на патоген. Пептид сэр 15 вносили в суспензию спор патогена в 0,1% растворе БСА в разных концентрациях. В качестве контроля использовали 0,1% раствор БСА. На следующий день оценивали рост мицелия под микроскопом. Во всех вариантах наблюдалось 100% прорастание спор при одинаковом росте и толщине гиф мицелия. Пептид сяр 15 не подавляет рост и развитие патогена, то есть не обладает фунгитоксичностью при концентрациях от 10 нМ до 10 мкМ.

3.4.4. Проверка защитной активности с$р15 в паре пшеница -Бь поЛогит.

Листья пшеницы обрабатывали различными концентрациями пептида сэр 15 в 0,1% растворе БСА. Контрольные отрезки листьев были обработаны 0,1% БСА. На обработанных пептидом участках листьев развитие симптомов септориоза наблюдалось с задержкой в два-три дня по сравнению с контрольными отрезками листьев (рис. 6).

Рис. 6. Способность пептида сэр15 в концентрациях 100 нМ, 1 мкМ, ЮмкМ индуцировать устойчивость у пшеницы к патогенному грибу 5? псхЗогит Стрелками показаны места нанесения пептида или суспензии спор патогена. Цифрами обозначены номера листьев, причем, в верхней и нижней части рисунка представлены одни и те же листья, разрезанные на две части, что необходимо для обеспечения единообразия реакции листьев пшеницы различных генотипов. Такая схема была разработана для возможности обнаружения индукции устойчивости на изолированных листьях пшеницы при наличии трансламинарного эффекта.

Приблизительно равный защитный эффект проявлялся на расстоянии 1520 мм от места непосредственного нанесения пептида при концентрациях сэр15 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ, и не проявлялся при 10 нМ. Степень развития болезни на опытных участках листьев составляла 1 -2 балла, а на контрольных участках - 3-4 балла. Так как в предыдущих опытах было установлено, что пептид сэр 15 не обладает фунгитоксичностью к 5?. пос1огит, то можно предположить, что его защитный эффект обусловлен индукцией устойчивости самих растений. 3.5. Изучение защитных реакций растения в ответ на обработку с«р15.

Целью следующего этапа экспериментов было изучение механизма действия пептида сэр!5. Были изучены способности сер 15 вызывать

накопление салициловой кислоты в тканях картофеля, индуцировать реакцию СВЧ в листьях табака и активировать протонную сигнальную систему в суспензионной культуре клеток табака.

3.5.1. Анализ содержания салициловой кислоты в тканях картофеля, обработанных пептидом сзр15.

Известно, что один из механизмов индукции устойчивости растений связан с накоплением СК в тканях растения. В связи с этим была изучена способность пептида сэр 15 вызывать накопление СК в тканях картофеля. Поверхность дисков картофеля (сорт Истринский), обрабатывали 0,1 % раствором БСА (контроль) и пептидом сер 15 в 0,1 % растворе БСА (табл. 5).

Таблица 5

Содержание СК в тканях клубней картофеля через 24 часа после их обработки пептидом сзр15.__

Образец Среднее содержание СК, нг/г ткани

0,1% БСА (контроль) 61

cspl5 10 нМ 210

HCP„,oj=89

Было показано, что пептид cspl5 способен активизировать накопление СК в тканях картофеля.

3.5.2. Инфильтрация cspl5 в межклеточное пространство листьев табака для обнаружения его способности вызывать реакцию СВЧ.

Инфильтрация очищенных препаратов специфических элиситоров (факторов авирулентности) в межклеточное пространство листа растения вызывает реакцию СВЧ, которая часто связана с индукцией SAR у растений. Для того чтобы выяснить является ли пептид cspl5 специфическим элиситором (фактором авирулентности) или неспецифическим элиситором (general elicitor или pathogen associated molecular pattern, PAMP) для табака, его инфильтровали в одну из половинок листьев табака в различных концентрациях до 10 мкМ в 0,1% растворе БСА. В другую половинку листьев инфильтровали 0,1% раствор БСА. Инфильтрация пептида cspl5 не приводила к образованию реакции

СВЧ в листьях табака при всех изучаемых концентрациях. Эти результаты указывают на то, что бактериальные белки холодового шока, по-видимому, можно отнести к классу PAMPs.

3.5.3. Оптимизация методики тестирования ранних защитных ответов растения в суспензионной культуре клеток табака. Проверка активности пептида cspl5 в культуре клеток табака.

При обработке клеток растений элиситорами происходит активация протонной сигнальной системы, что выражается в быстром поглощении протонов (Atkinson et al., 1985; Viard et al., 1994). В суспензионной культуре клеток растения этот мембранный эффект можно обнаружить уже через несколько минут после обработки элиситором по сдвигу pH питательной среды в щелочную область. За счет скорости анализа данная система является чрезвычайно удобной для поиска новых индукторов устойчивости растений (Felix et. al., 1999).

Суспензионную культуру клеток табака N. tabacum (сорт Wisconsin 38, штамм 217) выращивали в жидкой питательной среде. Оптимальный объем посевной культуры составил 8 мл клеток, в возрасте 7 дней в 50 мл свежей питательной среды. Чтобы определить стадию роста, на которой клетки являются наиболее чувствительными к действию элиситоров, анализировали суспензионные культуры в возрасте от 4 до 8 дней. Наиболее выраженная реакция на воздействие элиситора наблюдалась у клеток в возрасте 4-х дней. Клетки в возрасте 5-6 дней также подходили для анализа, но их чувствительность к элиситорам была значительно ниже.

Полученные результаты о способности пептида cspl5 активизировать протонную сигнальную систему у N. tabacum согласуются с данными Felix и Boller (2003). Добавление элиситора cspl5 в суспензионную культуру клеток табака приводило к быстрому защелачиванию внешней среды. Изменение концентрации пептида cspl5 в суспензионной культуре клеток в пределах от 1 до 10 нМ приводило к линейному изменению АрН. Увеличение концентрации пептида от 10 до

100 нМ лишь незначительно увеличивало сдвиг рН среды. Пептид сэр 15 в концентрации ЮОрМ практически не вызывал защелачивания среды клетками (рис. 7).

- Вода, контроль]

—сар15100 к М —с»р15 ЮвМ -Х-мр155»М —Ж—С1р152,5иМ —I— С|р151 к М

-©-«р1510врМ

Рис. 7. Активация протонной сигнальной системы клеток табака в ответ на обработку пептидом СБр15 в разных концентрациях.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные результаты исследования позволяют заключить, что повышенная устойчивость полученных трансгенных растений табака к грибному и вирусному фитопатогенам связана с экспрессией в них целевого гена элиситора CspD. Это значит, что ген CspD потенциально может быть использован для создания трансгенных растений, обладающих неспецифической устойчивостью, по крайней мере, к вирусным и грибным фитопатогенам. Тем не менее, требуются дальнейшие исследования в этой области по оптимизации уровня, времени и места экспрессии гена элиситора в тканях растений.

Пептид cspl5 индуцировал защитные реакции не только у табака и картофеля, что подтверждает литературные данные (Felix and Boller, 2003), но и у пшеницы. Учитывая результаты, показывающие способность белка CspD индуцировать устойчивость у риса (Djavakhiya et al., 2000), можно утверждать, что бактериальные белки холодового шока способны индуцировать устойчивость к фитопатогенам у двудольных растений семейства Пасленовых, и у некоторых представителей однодольных растений, а для обеспечения их элиситорного действия достаточно активного центра белков холодового шока - пептида cspl5. Можно предположить, что у растений существуют рецепторы для распознавания бактериальных белков холодового шока, и они могут быть структурно или организационно сходны с рецептором флагеллина (FLS2) арабидопсиса, так как спектр и скорость ранних защитных ответов у арабидопсиса на флагеллин и у табака на cspl5 сходны. В связи с этим, особенно важным представляется поиск оптимальных последовательностей пептидов в области cspl5 для каждого вида сельскохозяйственных растений с целью дальнейшей разработки высокоэффективных биопестицидов.

5. ВЫВОДЫ

1. Созданы генно-инженерные конструкции для экспрессии гена бактериального белка CspD в растении.

2. Впервые получены трансгенные растения табака с геном белкового элиситора неспецифической устойчивости растений CspD из В. thuringiensis.

3. Показана повышенная устойчивость полученных трансгенных растений табака к грибному и вирусному патогенам.

4. Разработана схема экспериментов для оценки устойчивости табака к A. longipes на изолированных листьях.

5. Впервые показана возможность фрагмента бактериального белка холодового шока - пептида cpsl5 - индуцировать устойчивость в системах растение-хозяин - патоген, для следующих пар: табак - вирус табачной мозаики, картофель - P. infestons и пшеница - St. nodorum.

6. Разработана методическая схема для определения активации механизмов индуцированной устойчивости на изолированных листьях пшеницы в паре пшеница - St. nodorum.

7. Впервые показана способность пептида cspl5 индуцировать накопление салициловой кислоты в тканях клубней картофеля.

8. Оптимизирована система для изучения раннего защитного ответа растений - активации протонной сигнальной системы - в суспензионной культуре клеток табака.

6. ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ РАБОТЫ

1. Шумилина Д.В., Кромина К.А., Рогожин И.А., Воинова Т.М., Джавахия В.Г. Создание трансгенных растений табака, несущих вставку гена MF2 белка из Bacillus thuringiensis, и испытание их на устойчивость к вирусным патогенам. Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений, Краснодар 2003, стр. 180-186.

2. Кромина К.А., Шумилина Д.В., Рогожин И.А., Войнова Т.М., Шольце П., Рихтер К., Крэмер Р., Клоке Э., Шуман Г., Джавахия В.Г. Создание трансгенных растений табака и рапса с геном mfi белка из Bacillus thuringiensis, индуцирующего неспецифическую устойчивость к фитопатогенам. Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии, Голицыно, 2003, стр. 201-203.

3. Кромина К. А., Рогожин И. А., Воинова Т. М., Батчикова Н. А., Корпела Т., Хомутов Р. М., Джавахия В. Г. Трансгенные растения табака с геном CspD белка из Bacilllus thuringiensis устойчивы к фитопатогенам. Биотехнология овощных, бахчевых, цветочных и малораспространенных культур: Сборник научных трудов международной научно-практической конференции. Вып. 1. -М.: ПТУ ВНИИО РАСХН, 2004, - С. 90-93.

4. Kromina К. A., Voinova Т. М., Rogozhine I. A., Battchikova N. A., Korpela Т., Khomutov R М., Dzhavakhiya V. G. Transgenic plants bearing CspD gene from bacillus thuringiensis are more resistant to plant pathogens. The International Joint Workshop on PR-Proteins and Induced Resistance, Denmark May 5-9,2004, p. 61.

5. Kromina K. A., and V. G. Dzhavakhiya. Peptide cspl5, which represents consensus sequence of RNA-binding motif RNP-1 of bacterial cold shock proteins, induces nonspecific resistance of plants to viral and fungal pathogens. The International Joint Workshop on PR-Proteins and Induced Resistance, Denmark May 5-9,2004, p. 144.

6. Кромина К. А., Воинова Т. M., Батчикова Н. А., Корпела Т., Хомутов Р. М , Джавахия В.Г. Изучение элиситорной активности пептида cspl5 представляющего собой консенсусную последовательность РНК-связывающего мотива RNP-1 бактериальных белков холодового тока на разных парах растение-патоген. III Съезд ВОГИС, Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития, 6-12 июня 2004 г, Москва, том 2, с. 335.

7. Кромина К. А. и Джавахия В. Г. Экспрессия бактериального гена CspD в растениях табака приводит к их повышенной устойчивости к грибным и вирусным фитопатогенам. Молекулярная генетика, вирусология и микробиология, 2006, №1, стр. 31-34.

8. Джавахия В.Г. и Кромина К.А. Белок холодового шока (БХШ), выделенный из Bacillus thuringiensis индуцирует устойчивость растений к вирусным, грибным и оомицетным патогенам, трансгенные растения табака, несущие ген CspD, более устойчивы к патогенам чем соответствующие нетрансгенные растения. Третий московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 14-18 марта, 2005, Москва, (в печага).

Автор благодарен своему научному руководителю Виталию Георгиевичу Джавахия за поддержку в ходе выполнения работы, а также Ларисе Александровне Щербаковой за пристальное чтение рукописи диссертации и обсуждение, Анне Владимировне Щенниковой и Илье Александровичу Рогожину за помощь в конструировании векторов, Ирине Васильевне Голденковой за плодотворное обсуждение результатов в ходе выполнения работы, Евгении Владимировне Матвеевой за предоставленную возможность по проведению ПЦР в реальном времени, Яне Сергеевне Паниной за помощь в работе по изучению защитных ответов картофеля, Дарье Владимировне Шумилиной за ценные замечания при чтении рукописи и обсуждение результатов в ходе исследования, Тамаре Николаевне Шманенковой, Михаилу Викторовичу Приданникову и всем сотрудникам лаборатории молекулярной биологии ВНИИ фитопатологии за помощь и дружеское отношение.

Особую благодарность автор выражает тем, кто стал его учителем во время стажировок вне стен родного института, а именно: Ольге Альбертовне Шульге, Эвелин Клоке, Елене Ковалевой и Йоргу Феликсу.

Автор глубоко признателен всем своим дорогим родственникам за понимание и глубокое обеспечение тылов, а также Анастасии Будишевской и безвременно ушедшей Нелли Александровне Вавиловой за моральную поддержку.

Принято к исполнению 27/03/2006 Исполнено 28/03/2006

Заказ №211 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

¿ош

Р - 7 1 8 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кромина, Ксения Андреевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

Терминология.

1.1. Устойчивость растений к болезням.

1.2. Индуцированная устойчивость растений, ее виды.

1.2.1. Системная приобретенная устойчивость.

1.2.2. Системная устойчивость, индуцируемая ризосферными бактериями.

1.2.3. Спектр генов арабидопсиса, экспрессируемых при активации защитных ответов на некрозообразующий патоген, салициловую кислоту, метилжасмонат и этилен.

1.3. Элиситоры устойчивости растений к болезням.

1.3.1. Элиситоры общих защитных отетов растений.

1.3.1.1. Флагеллин.

1.3.1.2. Бактериальный фактор элонгации.

1.3.1.3. Бактериальные белки холодового шока.

1.3.1.4. Консервативная область трансглютаминаз видов рода РЪугорЫЪога - пептид Рер-13.

1.3.1.5. Липополисахариды.

1.3.1.6. Петидил-пролил цистрансизомераза из бактерии Р. АиогеясепБ.

1.3.1.7. Хитин и хигозаны.

1.3.2. Элиситоры устойчивости растений, участвующие в процессе взаимодействия растение - патоген.

1.3.2.1. Факторы авирулентности.

1.3.2.2. Харпины.

1.4. Механизмы распознавания растением химических детерминант микроорганизмов.

1.4.1. Молекулярные детерминанты патогена, РАМРв.

1.4.2. Распознавание РАМРв у животных и растений.

1.4.3. Распознавание растением факторов авирулентности патогена.

1.4.4. Доступность РАМРб для растений.

1.5. Практическое применение индуцированной устойчивости растений для их защиты от болезней.

1.5.1. Обработка растений ицдукторами устойчивости.

1.5.2. Создание трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам.

1.5.2.1. Экспрессия в трансгенных растениях генов антимикробных веществ.

1.5.2.2. Экспрессия в растениях Я-генов близкородственных растений.

1.5.2.3. Экспрессия в растениях генов элиситоров, вызывающих реакцию СВЧ.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Материалы.

2.1.1. Химические реактивы и ферменты, использованные в работе.

2.1.2. Бактериальные штаммы.

2.1.3. Плазмиды.

2.1.4. Фитопатогенные микроорганизмы.

2.1.5. neimwcspl5.

2.1.6. Суспензионная культура клеток табака.

2.2. Методы.

2.2.1. Трансформация табака методом «листовых дисков».

2.2.2. Генетический анализ трансгенных растений поколения Т1.

2.2.3. Выделение растительной геномной ДНК.

2.2.4. Полимеразная цепная реакция.

2.2.5. Выделение тотальной РНК.

2.2.6. Анализ экспрессии CspD гена на уровне синтеза мРНК с помощью обратной транскрипции с последующей ПЦР.

2.2.7. Определение уровня экспрессии целевого гена с помощью ПЦР в реальном времени.

2.2.8. Выращивание трансгенных растений табака в климатической камере.

2.2.9. Культивирование гриба Alternaría longipes (Ellis & Everh.).

2.2.10. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к патогенному грибу A. longipes.

2.2.11. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики.

2.2.12. Оценка активности пептида cspl5 в системе табак - ВТМ.

2.2.13. Изучение скорости СВЧ реакции в тканях картофеля при несовместимом взаимодействии после обработки пептидом cspl5.

2.2.14. Изучение влияния пептида cspl5 на прорастание спор гриба Stagonospora nodorum.

2.2.15. Проверка активности пептида cspl5 с использованием пары пшеница - возбудитель септориоза (5. nodorum).

2.2.16. Инфильтрация пептида cspl5 в межклеточное пространство листьев табака.

2.2.17. Определение содержания салициловой кислоты в тканях картофеля, обработанных пептидом cspl5.

2.2.18. Измерение защелачивания питательной среды в суспензионной культуре клеток табака после обработки элиситором.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 3. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена и белка MF2 (CspD, номер в GenBank AY272058).

3.1. Анализ первичной структуры нуклеотидной и аминокислотной последовательностей гена и белка MF2.

3.2. Анализ нуклеотидной последовательности гена CspD с целью определения возможности его эффективной экспрессии в растениях табака.

Глава 4. Получение трансгенных растений табака с геном CspD. Биотесты с трансгенными растениями.

4.1. Конструирование бинарного вектора pBilt7, несущего бактериальный ген CspD, для трансформации растений.

4.2. Агробактериальная трансформация.

4.3. Молекулярный анализ трансгенных растений.

4.4. Сравнение уровня экспрессии в трансгенных линиях табака с помощью ПЦР в реальном времени.

4.5. Определение числа локусов в геноме растений, в которые произошла вставка Т-ДНК. Наследование вставки в поколении Т1.

4.6. Оценка устойчивости трансгенных растений табака.

4.6.1. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к патогенному грибу A. longipes.

4.6.2. Оценка трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики.

Глава 5. Изучение элиситорных свойств пептида cspl5.

5.1. Исследование способности пептида cspl5 индуцировать устойчивость в системах растение-хозяин - патоген.

5.1.1. Оценка активности пептида csp 15 в системе табак - ВТМ.

5.1.2. Изучение скорости СВЧ реакции в тканях картофеля при несовместимом взаимодействии с патогеном после обработки пептидом csp 15.

5.1.3. Изучение влияния пептида cspl5 на прорастание спор S. nodorum.

5.1.4. Проверка защитной активности пептида cspl5 в паре пшеница - S. nodorum.

5.2. Изучение защитных реакций растения в ответ на обработку пептидом cspl5.

5.2.1. Инфильтрация пептида csp 15 в межклеточное пространство листьев табака для обнаружения его способности вызывать реакцию СВЧ.

5.2.2. Анализ содержания салициловой кислоты в тканях картофеля, обработанных пептидом csp 15.

5.2.3. Оптимизация методики тестирования ранних защитных ответов растения в суспензионной культуре клеток табака. Проверка активности пептида csp 15 в культуре клеток табака.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Получение трансгенных растений табака с геном белка CspD из Bacillus thuringiensis и изучение элиситорных свойств бактериальных белков холодового шока"

Защитные механизмы растений развивались в процессе длительной эволюции и, следовательно, способны обеспечить надежное противостояние фитопатогенам. Поэтому наиболее привлекательным в защите растений от болезней является использование естественного защитного потенциала самих растений. Такой подход является более безопасным, чем применение ксенобиотиков, поскольку в этом случае в окружающую среду не вносятся вещества, оказывающее негативное влияние на биосферу. Поскольку одним из механизмов фитоиммунитета, обеспечивающих устойчивость растения к патогенам, является индуцированная устойчивость, в настоящее время активно исследуется возможность использования данного типа устойчивости в сельском хозяйстве. Это, в свою очередь, требует изучения тех процессов, которые происходят в растении в ответ на внедрение патогенов и распознавание их метаболитов (элиситоров), что, в конечном счете, и приводит к возникновению устойчивости.

В середине 1990-х годов во ВНИИ фитопатологии был выделен низко молекулярный (7,2 кДа) термостабильный белок из Bacillus thiiringiensis, получивший название - Microbial Factor 2 (MF2). Было показано, что МБ2-белок способен индуцировать устойчивость растений в следующих парах патоген - хозяин: вирус табачной мозаики - табак, Х-вирус картофеля - табак, Phytophthora infestons - картофель и Magnaporthe grisea - рис. Ген, кодирующий MF2 белок, был клонирован и секвенирован (Djavakhia et al., 2000). Поскольку в ходе дальнейшего анализа оказалось, что белок MF2 относится к классу белков холодового шока, он был переименован в Cold shock protein D (CspD). Было решено исследовать возможность переноса гена CspD в геном растений, чтобы выяснить возможность индукции устойчивости трансгенных растений при экспрессии этого гена. В качестве объекта для получения трансгенных растений был выбран табак, так как это растение легко поддается агробактериальной трансформации и продуцирует большое количество семян, что является важным при изучении наследования признаков.

Цели и задачи исследований.

Одной целью наших исследований было получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген неспецифического элиситора CspD, выделенного из бактерии В. thuringiensis, с последующей их оценкой на устойчивость к грибному и вирусному фитопатогенам. Другой целью нашей работы было изучение элиситорных свойств пептида cspl5, представляющего собой консенсусную последовательность активного центра элиситоров из группы бактериальных белков холодового шока. Исходя из целей работы, были поставлены следующие задачи:

1. создание генно-инженерных конструкций для экспрессии бактериального белка CspD в растении;

2. создание трансгенных растений;

3. анализ устойчивости трансгенных растений к фитопатогенам;

4. оценка способности пептида cspl5 индуцировать устойчивость растений в системах растение-хозяин - патоген.

Научная новизна исследований.

1. Впервые были созданы трансгенные растения табака с геном белкового элиситора неспецифической устойчивости растений CspD, выделенного из Bacillus thuringiensis, и показана их устойчивость к грибному и вирусному фитопатогенам.

2. Впервые показана способность пептида cpsl5, представляющего собой консенсусную последовательность активного центра бактериальных белков холодового шока, индуцировать устойчивость в естественных системах растение-хозяин - патоген у двудольных растений: табак (сорт Xanthi) - вирус табачной мозаики (ВТМ), картофель - Phylophlhora infestons.

Практическая значимость работы.

1. Показано, что по сравнению с исходными растениями трансгенные растения табака, несущие ген CspD, обладают повышенной устойчивостью к вирусу табачной мозаики и к грибному фитопатогену Alternaría longipes. Данный факт позволяет начать исследования по созданию трансгенных растений сельскохозяйственных культур с целью их дальнейшего использования в селекционном процессе для создания сортов с широким спектром устойчивости к фитопатогенам.

2. Оптимизирована методика оценки трансгенных растений на наличие и экспрессию гена CspD с помощью молекулярных методов.

3. Оптимизирована методика оценки устойчивости табака к некротрофному грибу A. longipes.

4. Показано, что консенсусная последовательность бактериальных белков холодового шока (пептид cspl5) способна индуцировать устойчивость к грибному фитопатогену у однодольного растения - пшеницы, к оомицету у картофеля и к ВТМ у табака. Такие результаты позволяют начать работу по созданию высокоэффективных биопестицидов широкого спектра действия.

5. Оптимизирована методика для оценки раннего защитного ответа в суспензионной культуре клеток табака на воздействие элиситоров.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены на международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, бахчевых, цветочных и малораспространенных культур», проходившей во ВНИИ Овощеводства в марте 2004 г; на международном семинаре "The International Joint Workshop on PR-Proteins and Induced Resistance" 5-9 мая 2004 г в Дании; III Съезде ВОГИС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», 6-12 июня 2004 г в Москве; на третьем московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 14-18 марта 2005 г в Москве.

По материалам диссертации опубликованоработ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (2-5 главы), выводов и списка литературы. Материал изложен на 124 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 22 рисункаа и 3 приложения. Список литературы включает 180 работ, из которых 176 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Кромина, Ксения Андреевна

выводы

1. Созданы генно-инженерные конструкции для экспрессии бактериального белка CspD в растении.

2. Впервые получены трансгениые растеиия табака с геном белкового элиситора неспецифической устойчивости растеиий CspD из Bacillus thuringiensis.

3. Показана повышенная устойчивость полученных трансгепных растений табака к грибному и вирусному фитопатогенам.

4. Оптимизированы условия проведения оценки устойчивости табака к Aliernaria longipes на изолированных листьях.

5. Впервые показана возможность фрагмента бактериального белка холодового шока -пептида cpsl5, индуцировать устойчивость в системах растение-хозяин - патоген, для следующих пар: табак - вирус табачной мозаики, картофель (сорт Истринский) -Phytophíhora infestans и пшеница (сорт Мироновская 808) - Stagonospora nodorum (возбудитель септориоза).

6. Оптимизирована методика проведения опыта для определения активации механизмов индуцированной устойчивости на изолированных листьях пшеницы в паре пшеница -Stagonospora nodorum.

1. Впервые показана способность пептида cspl5 индуцировать синтез салициловой кислоты в тканях клубней картофеля.

8. Оптимизирована система для изучения раннего защитного ответа растений -утечки/поглощения ионов К+/Н+ - в суспензионной культуре клеток табака.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шумилина Д.В., Кромина К.А., Рогожин И.А., Воинова Т.М., Джавахия В.Г. Создание трансгеиных растений табака, несущих вставку гена MF2 белка из Bacillus thuringiensis, и испытание их на устойчивость к вирусным патогенам. Трансгенпые растения - новое направление в биологической защите растений, Краснодар 2003, стр. 180-186.

2. Кромина К.А., Шумилина Д.В., Рогожин И.А., Войнова Т.М., Шольце П., Рихтер К., Крэмер Р., Клоке Э., Шуман Г., Джавахия В.Г. Создание трансгенных растений табака и рапса с геном mf2 белка из Bacillus thuringiensis, индуцирующего неспецифическую устойчивость к фитопатогенам. Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии, Голицыно, 2003, стр. 201 - 203.

3. Кромина К. А., Рогожин И. А., Воинова Т. М., Батчикова Н. А., Корпела Т., Хомутов Р. М., Джавахия В. Г. Трансгенные растения табака с геном CspD белка из Bacilllus thuringiensis устойчивы к фитопатогенам. Биотехнология овощных, бахчевых, цветочных и малораспространенных культур: Сборник научных трудов международной научно-практической конференции. Вып. 1. - М.: ГНУ ВНИИО РАСХН, 2004, - С. 90-93.

4. Kromina К. A., Voinova Т. М., Rogozhine I. A., Battchikova N. A., Korpela Т., Khomutov R.M., Dzhavakhiya V. G. Transgenic plants bearing CspD gene from bacillus thuringiensis are more resistant to plant pathogens. The International Joint Workshop on PR-Proteins and Induced Resistance, Denmark May 5-9, 2004, p. 61.

6. Кромина К. А., Воинова Т. М., Батчикова Н. А., Корпела Т., Хомутов Р. М., Джавахия В.Г. Изучение элиеиторной активности пептида cspl5 представляющего собой консенсусную последовательность РНК-связывающего мотива RNP-1 бактериальных белков холодового шока на разных парах растение-патоген. III Съезд ВОГИС, Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития, 6-12 июня 2004 г, Москва, том 2, с. 335.

8. Джавахия В.Г. и Кромина К.А. Белок холодового шока (БХШ), выделенный из Bacillus thuringiensis индуцирует устойчивость растений к вирусным, грибным и оомицетным патогенам, трансгенные растения табака, несущие ген CspD более устойчивы к патогенам чем соответствующие нетрансгенные растения. Третий московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 14-18 марта, 2005, Москва (в печати).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Кромина, Ксения Андреевна, Большие Вяземы

1. Дорохов Д.Б., и Клоке Е. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов. // Генетика. 1997. - т. 33. -№ 4 - С. 476-483.

2. Дьяков Ю. Т., Озерецковская О. Л., Джавахия В. Г. и Багирова С. Ф. Общая и молекулярная фитопатология. Учеб. пособие. М. - Общество фитопатологов. - 2001. -302 с.

3. Пыжикова Г.В., Санина А.А., Супрун Л.М., Курахтанова Т.Н., Гогаева Т.Н., Мепаришвили С.У., Анциферова Л.В., Кузнецов Н.С., Игнатов А.Н., Кузьмичев А.А. Методы оценки устойчивости селекционного материала и сортов пшеницы к септориозу. М. - 1989. - 44 С.

4. Abramovitch R.B., Kim Y.-J, Chen S., Dickman M.B. and Martin G.B. Pseudomonas type III effector AvrPtoB induces plant disease susceptibility by inhibition of host programmed cell death // The EMBO Journal. 2003. - V. 22. - P. 60-69.

5. Aderem A., Ulevitch R. Toll-like receptors in the induction of the innate immune response // Nature. 2000. - V. 406. - P. 782-787.

6. Alfano J. and Collmer A The type III (Hrp) secretion pathway of plant pathogenic bacteria: trafficking harpins, Avr proteins, and death // J Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 5655-5662.

7. Allard H.A. The mosaic disease of tobacco // USDA Bull. 1914. - P. 40.

8. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - № 17. - P. 3389-3402.

9. Atkinson M.M., Huang J.-S., and Knopp J. A. The hypersensitive reaction of tobacco to Pseudomonas syringae pv. pisi II Plant Physiol. 1985. - V. 79. - N. 3. - P. 843-847.

10. Axtell M.J., Staskawicz B.J. Initiation of RPS2- specified disease resistance in Arabidopsis is coupled to the AvrRpt2-directed elimination of RIN4 // Cell. 2003. - V. 112. - P. 369-377.

11. Bae W., Xia B., Inouye M., Severinov K. Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are transcription antiterminators // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 5. - № 97 (14). - P. 7784-7789.

12. Bairoch A., Bucher P., Hofmann K. The PROSITE database, its status in 1997 // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - No. 1. - P. 217-221.

13. Baker B., Zambryski P., Staskawicz B. and Dinesh-Kumar S.P. Signaling in plant-microbe interactions // Science. 1997. - V. 276. - P. 726-733.

14. Bauer D.W., Zumoff, C.H., Theisen T.M., Bogdanove A.J. and Beer S.V. Optimized production of Erwinia amylovora harpin and its use to control plant disease and enhance plant growth // Phytopathology. 1997. - V. 87. - P. S7.

15. Bhat S.R., Srinivasan Molecular and genetic analyses of transgenic plants: considerations and approaches // Plant Science. 2002. - V. - 163. - P. 673-681.

16. Bevan M. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation // Nucl. Acids Res. 1984. -V.12.-No. 22.-P. 8711-8721.

17. Bonas U., Lahaye T. Plant disease resistance triggered by pathogen-derived molecules: refined models of specific recognition // Curr Opin Microbiol. 2002. - V. 5. - P. 44-50.

18. Broekaert W.F., Terras F.R., Cammue B.P., Osborn R.W. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system // Plant Physiol. 1995. - 108 (4). - P. 1353-1358.

19. Brunner F., Rosahl S., Lee J., Rudd J.J., Geiler C., Kauppinen S., Rasmussen G., Scheel D., Nürnberger T. Pep-13, a plant defense inducing pathogen-associated pattern from Phytophthora transglutaminases // EMBO J. 2002. - V. 21. - P.6681-6688.

20. Chakrabarti A., Ganapathi T.R., Mukherjee P.K., Bapat V.A. MSI-99, a magainin analogue, imparts enhanced disease resistance in transgenic tobacco and banana // Planta. 2002. - V. 216.-No. 4.-P. 587-596.

21. Cohn J., Sessa G., Martin G.B. Innate immunity in plants // Curr Opin Immunol. 2001. - V. 13.-P. 55-62.

22. De Barjac H., Bonnefoi A. A classification of strains of Bacillus thuringiensis Berliner with a key to their differentiation//J. Invertebr. Pathol. 1967.-No. 11.-P. 335-347.

23. De Frammond A.J., Barton K.A., Chilton M.-D. Mini-Ti-: a new vector strategy for plant genetic engineering // Bio/Technology. 1983. - V. 5. - P. 262-269.

24. De Groot M.J., Bundock P., Hooykaas P.J., Beijersbergen A.G. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi // Nat. Biotechnol. 1998. - V. 16. - P. 839842.

25. Deroles S.C., Gardner R.C. Expression and inheritance of kanamycin resistance in a large number of transgenic petunias generated by Agrobacterium-mediated transformation // Plant Mol Biol. 1988a. - V. 11. - P.355-364.

26. De la Riva G. A., Gonzalez-Cabrera J., Vazquez-Padron R., Ayra-Pardo C. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation// EJB Electronic Journal of Biotechnology. 1998. V.l, No.3. P.l-16.

27. Deroles S.C., Gardner R.C. Analysis of the T-DNA structure in a large number of transgenic petunias generated by Agrobacterium-mediated transformation // Plant Mol Biol. 1988b.- V. 11.-P. 365-377.

28. Dhingra O.D., Sinclair J.B. Basic Plant Pathology Methods // CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida 1986.

29. Diehn S.H., Chiu W.L., De Rocher E.J., Green P.J. Premature polyadenylation at multiple sites within a Bacillus thuringiensis toxin gene-coding region // Plant Physiol. 1998. - V. 117.-№4.-P. 1433-1443.

30. Dong H., Delaney T.P., Bauer D.W. and Beer S.V. Harpin induces disease resistance in Arabidopsis through the systemic acquired resistance pathway mediated by salicylic acid and the NIM1 gene // The Plant Journal. 1999. - V. 20. - № 2. - P. 207.

31. Donnelly M.A., Steiner T.S. Two nonadjacent regions in enteroaggregative Escherichia coli flagellin are required for activation of toll-like receptor 5 // J. Biol Chem. 2002. - V. 277. -P. 40456-40461.

32. Dorokhov D.B. and Klocke E. A rapid and economic technique for RAPD analysis of plant genomes // Russian Journal of Genetics. 1997. - V. 33. - No. 4. - P. 358-365.

33. Dow J.M., Osbourn A.E., Wilson T.J.G., Daniels M.J. A locus determining pathogenicity of Xanihomonas campestris is involved in lipopolysaccharide biosynthesis // Mol. Plant-Microbe Interact. 1995. - V. 8. - P. 768-777.

34. Duclohier H. // Anion pores from magainins and related defensive peptides. Toxicology. -1994.-V. 87.-P. 175-188.

35. Erickson F.L, Holzberg S., Calderon-Urrea A., Handley V., Axtell M., Corr C., Baker B. The helicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defence response in tobacco // Plant J. 1999. - V. 18. - № 1. - P. 67-75.

36. Erbs G., Newman M.-A. The role of lipopolysaccharides in induction of plant defence responses // Mol. Plant Pathol. 2003. - V. 4. - №. 5. - P. 421^25.

37. Felix G. and Boiler T. The highly conserved RNA-binding motif RNP-1 of bacterial cold shock proteins is recognized as an elicitor signal in tobacco // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. -P. 6201-6208.

38. Felix G., Duran J.D., Volko S., Boiler T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin // Plant J. 1999. - V. 18. - P. 265-276.

39. Felix G. and Meins F. Jr. Ethylene regulation of B-1,3 glucanase in tobacco // Planta. -1987.-V. 172.-P. 386-392.

40. Fields K.A., Hackstadt T. Evidence for the secretion of Chlamydia trachomatis CopN by a type III secretion mechanism//Mol. Microbiol. -2000. V. 38.-№ 5.-P. 1048-1060.

41. Finlay B.B., Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity revisited // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. - V. 61. - P. 136-169.

42. Flor H. Current status of the gene-for-gene concept // Ann. Rev. Phytopathol. 1971. - V. 9. - P. 275-296.

43. Franza T., Sauvage C., Expert D. Iron regulation and pathogenicity in Erwinia chrysanihemi 3937: role of the Fur repressor protein // Mol. Plant Microbe Int. 1999. - V. 12. - № 2. - P. 119-128.

44. Gaffney T., Friedrich L., Vernooij B., Negrotto D., Nye G., Uknes S., Ward E., Kessman H. and Ryals J. Requirement of saiicylic acid for the induction of systemic acquired resistance // Science. 1993. - V. 261. - P. 754-756.

45. Gomez-Gomez L. Plant perception systems for pathogen recognition and defence // Mol Immunol.-2004.-V. 41. -№ 11.-P. 1055-1062.

46. Gomez-Gomez L., Bauer Z., Boiler T. Both the extracellular leucine rich repeat domain and ® the kinase activity of FLS2 are required for flagellin binding and signalling in Arabidopsis II

47. Plant Cell.-2001.-V. 13.-P. 1155-1163.

48. Gomez-Gomez L., Boiler T. FLS2: an LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis //Uo\ Cell.-2000.-V. 5.-P. 1003-1011.

49. Gomez-Gomez L. and Boiler T. Flagellin perception: a paradigm for innate immunity // Trends Plant Sci. 2002. - V. 7. - Issue 6. - P. 251 -256.

50. Gómez-Gómez L., Felix G., Boiler T. A single locus determines sensitivity to bacterial ^ flagellin in Arabidopsis thaliana II Plant J. 1999. - V. 18. - №. 3. - P. 277-284.

51. Gouy M. and Gautier C. Codon usage in bacteria: correlation with gene expressivity // Nucleic Acids Res. 1982. - V. 10. - № 22. - P. 7055-7074.

52. Grant M.R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance // Science. 1995. - V. 269. - P. 843-846.

53. Microbiol. 2000. - V. 3. - P. 261-227.

54. Hayashi F., Smith K.D., Ozinsky A., Hawn T.R., Yi E.C., Goodlett D.R., Eng J.K., Akira S., Underhill D.M., Aderem A. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5 // Nature. 2001. - V. 410. - P. 1099-1103.

55. He S.Y., Huang H.C. and Collmer A. Pseudomonas syringae pv. syringae harpinpss: a protein that is secreted via the Hrp pathway and elicits the hypersensitive response in plants // Cell. -1993.-V. 73.-P. 1255-1266.

56. Hellens R., Mullineaux P. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors // Trends Plant Sei. -2000. V. 5. - № 10. P. 446-451.

57. Hoch H.C., Staples R.C., Whitehead B., Comeau J., Wolf E.D. // Signalling for growth orientation and cell differentiation by surface topography in Uromyces. Science. - 1987. -V. 235.-P. 1659-1662.

58. Hoekema A., Hirsh P.R., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid // Nature.- 1983.-V. 303.-P. 179-180.

59. Höfte M. Classes of microbial siderophores // "Iron chelation in plants and soil microorganisms" edited by L.L. Barton and B.C. Hemming. Academic Press, San Diego, Calif. 1993.-P. 3-26.

60. Holmes F.O. Inheritance of resistance to tobacco mosaic disease in tobacco // Phytopathol. -1938.-V. 28.-P. 553-561.

61. Holt B.F., Hubert D.A., Dangl J.L. Resistance gene signalling in plants complex similarities to animal innate immunity // Curr Opin Immunol. - 2003. - V. 15. - P. 20-25.

62. Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Wallroth M., Eichholtz D., Rogers S.G. and Fraley R.T. A simple and general method for transferring genes into plants // Science. 1985. - V. 227.-P. 1229-1231.

63. Jennings D.B., Daub M.E., Pharr D.M. and Williamson J.D. Constitutive expression of a celery mannitol dehydrogenase in tobacco enhances resistance to the mannitol-secreting fungal pathogen Alternaría altérnala II Plant J. 2002. - No. 32. - P. 41-49.

64. Jia Y., McAdams S.A., Bryan G.T., Hershey H.P., Valent B. Direct interaction of resistance gene and avirulence gene products confers rice blast resistance // EMBO J. 2000. - V. 19. -P. 4004-4014.

65. Jones D.A., Thomas C.M., Hammond-Kosack K.E., Balint-Kurti P.J., Jones J.D.G. Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging // Science. 1994. - V. 266. - P. 789-793.

66. Joosten M.H.A.J. and De Wit P.J.G.M. The tomato-Cladosporium fulvum interaction: a versatile experimental system to study plant-pathogen interactions // Annu. Rev. Phytopathol.- 1999.-V. 37.-P. 335-367.

67. Keen N.T. Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen interactions // Ann. Rev. Genet.- 1990. V. 24.-P. 421-440.

68. Keller H., Pamboukdjian N., Ponehet M., Poupet A., Delon R. // Pathogen-induced elicitin production in transgenic tobacco generates a hypersensitive response and nonspecific disease resistance. The Plant Cell. 1999. - V. 11. - P. 223-235.

69. Kim M.-G, da-Cunha L., McFall A., Belkhadir Y., Dangl J.L., Mackey D. Two Pseudomonas syringae type III effectors inhibit RIN4-regulated basal defense in Arabidopsis // Cell. 2005. -V. 121.-P. 749-759.

70. Klarzynski O., Plesse B., Joubert J.-M., Yvin J.-C., Kopp M., Kloareg B., Fritig B. Linear-1,3 glucans are elicitors of defense responses in tobacco // Plant Physiol. 2000. - V. 124. - P. 1027-1038.

71. Kooman-Gersmann M., Honee G., Bonnema G., De Wit P.J.G.M. A high-affinity binding site for the AVR9 peptide elicitor of Cladosporium fulvum is present on plasma membranes of tomato and other solanaceous plants // Plant Cell. 1996. - V. 8. - P. 929-938.

72. Krieg A. A taxonomic study of Bacillus thuringiensis Berliner // J. Invertebr. Pathol. 1968. -No. 12, P. 366-378.

73. Kuc J. Induced immunity to plant diseases // Bioscience. 1982. - V. 32. - P. 854-860.

74. Kuc J. Systemic plant immunization // Tagungsbericht Akad Landw Wiss DDR. 1984. V. -222.-P. 189-198.

75. Kunik T., Tzfira T., Kapulnik Y., Gafni Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobaclerium II Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2001. - V. 98. - P. 1871— 1876.

76. Kunze G., Zipfel C., Robatzek S., Niehaus K., Boller T., Felix G. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants // Plant Cell. 2004. - V. 16.-P. 3496-3507.

77. Lawton K.A., Weymann K., Friedrich L., Vernooij E., Uknes S. and Ryals J. Systemic acquired resistance in Arabidopsis requires salicylic acid but not ethylene // MOI. Plant-Microbe Interact. 1995. - V. 8. - P. 863-870.

78. Lazo G.R., Stein P.A., Ludwig R.A. A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium II Bio/Technology. 1991. - V. 9. - P.963-967.

79. Leeman M., Van Pelt J.A., Den Ouden F.M., Heinsbroek M., Bakker P.A.H.M., Schippers B. Induction of systemic resistance against fusarium wilt of radish by lipopolysaccharides of Pseudomonas fluorescens II Phytopathology. 1995. - V. 85. - P. 1021-1027.

80. Leptosphaeria nodorum // C.M.I. Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria. London: The Eastern Press, Ltd. - 1966. - Set 9. - No. 86.

81. Li Q., Lawrence C.B., Xing H.-Y., Babbitt R.A., Bass W.T., Maiti I.B., Everett N.P. // Enhanced disease resistance conferred by expression of an antimicrobial magainin analog in transgenic tobacco. Planta. - 2001. - V. 212. - P. 653-639.

82. Lugtenberg B.J.J., Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V. Microbe-plant interactions: principles and mechanisms // Antonie van Leeuwenhoek. 2002. - V. 81. - P. 373-383.

83. Lynch J.M. and Whipps J.M. Substrate flow in the rhizosphere // In: Keister DL and Cregan PB (eds) The Rhizosphere and Plant Growth, Kluwer, Dordrecht. 1991. - P. 15-24.

84. Mackey D., Holt B.F., Wiig A., Dangl J.L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1- mediated resistance in Arabidopsis II Cell. -2002.-V. 108.-P. 1-20.

85. Martin G.B., et al. Map-based cloning of a protein kinase gene confering disease resistance in tomato // Science. 1993. - V. 262. - P. 1432-1436.

86. Matthysse A.G., Yarnall H., Boles S.B., McMahan S. A region of the Agrobacterium tumefaciens chromosome containing genes required for virulence and attachment to host cells// Biochimica et Biophysica Acta. 2000.- V. 1490.- P. 208-212.

87. McGuinness D.H., Dehal P.K., Pleass R.J. Pattern recognition molecules and innate immunity to parasites//Trends Parasitol.-2003. -V. 19.-P. 312-319.

88. Medzhitov R., Janeway C. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition // Cell. 1997. - V. 91. - P. 295-298.

89. Medzhitov R., Janeway C. Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system // Science. 2002. - V. 296. - P. 298-300.

90. Metraux J.-P. Systemic acquired resistance and salicylic acid: current state of knowledge // European Journal of Plant Pathology.- 2001. -V. 107.-P. 13-18.

91. Meuwly P. and Metraux J.-P. Ortho-anisic acid as internal standard for the simultaneous quantitation of salicylic acid and its putative biosynthetic precursors in cucumber leaves //Anal, biochemistry. 1993. - V. 214. - P. 500-505.

92. Miki B. Transgene expression and control // In Vitro Cell. Dev. Biol. 2002. - Plant 38. - P. 139-145.

93. Molina A., Mena M., Carbonero P., Garcia-Olmedo F. Differential expression of pathogen-responsive genes encoding two types of glycine-rich proteins in barley // Plant Mol. Biol. -1997.-V. 33.-P. 803-810.

94. Morris E.R., Walker J.C. Receptor-like protein kinases: the keys to response // Curr Opin Plant Biol. 2003. - V. 6. - P. 339-342.

95. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. - V. 15. - P. 473-497.

96. Nürnberger T. and Brunner F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns // Curr Opin Plant Biol. 2002. - V. 5. - P. 1-7.

97. Nürnberger T., Brunner F., Kemmerling B., Piater L. Innate immunity in plants and animals: striking similarities and obvious differences // Immunological Reviews. 2004. - V. 198. - P. 249-266.

98. Oostendorp M., Kunz W., Dietrich B. and Staub T. Induced disease resistance in plants by chemicals // European Journal of Plant Pathology. 2001. - V. 107. - P. 19-28.

99. Ozinsky A, et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors // Proc Natl Acad Sci USA. -2000.-V. 97.-P. 13766-13771.

100. Parker J.E. Plant recognition of microbial patterns // Trends in Plant Science. 2003. - V. 8. №6.-P. 245-247.

101. Perlak F.J., Fuchs R.L., Dean D.A., McPherson S.L., Fischhoff D.A. Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1991., - V. 88(8). - P. 3324-3328.

102. Pieterse C.M.J, and Van Loon L.C. Salicylic acid-independent plant defence pathways // Trends in Plant Sci. 1999. - № 4. - P. 52-58.

103. Prieto-Samsonov D.L., Vazquez-Padron R.I., Ayra-Pardo C., Gonzalez-Cabrera J. and de la Riva G.A. Bacillus thuringiensis: from biodiversity to biotechnology // Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 1997. - V. 19. - P. 202-219.

104. Rabea E.I., Badawy M.E.-T., Stevens C.V., Smagghe G., Steurbaut W. Chitosan as Antimicrobial Agent: Applications and Mode of Action // Biomacromolecules. 2003. - V. 4. - № 6. - P. 1457-1462.

105. Ramamoorthy V., Viswanathan R., Raguchander T., Prakasam V., Samiyappan R. Induction of systemic resistance by plant growth promoting rhizobacteria in crop plants against pests and diseases // Crop Protection. 2001. - V. 20. - P. 1-11.

106. Riely B.K., Ane J.M., Penmetsa R.V., Cook D.R. Genetic and genomic analysis in model legumes bring Nod-factor signaling to center stage // Curr Opin Plant Biol. 2004. - V. 7. — P. 408-413.

107. Roden J.A., Belt B., Ross J.B., Tachibana T., Vargas J., Mudgett M.B. A genetic screen to isolate type III effectors translocated into pepper cells during Xanthomonas infection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2004. V. 101. - № 47. - P. 16624-16629.

108. Ronald P.C., Salmerón J.M., Carland F.M., Staskawicz B.J. The cloned avirulence gene avrPto induces disease resistance in tomato cultivars containing the Pío resistance gene // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 1604- 1611.

109. Ross A.F. Systemic effects of local lesion formation // Beemster ABR and Dijkstra J (eds) Viruses of plants. North-Holland Publishing, Amsterdam. 1966. - P. 127-150.

110. Sachetto-Martins G., Franco L.O., de Oliveira D.E. Plant glycine-rich proteins: a family or just proteins with a common motif? // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. - V. 1492. - P. 1-14.

111. Samatey F.A., Imada K., Nagashima S., Vonderviszt F., Kumasaka T., Yamamoto M., Namba K. Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling // Nature. 2001. - V. 410. - P. 331-337.

112. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

113. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, the third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001.

114. Samuel G. Some experiments on inoculating methods with plant viruses, and on local lesions // Ann. Appl. Biol. 1931. - V. 18. - P. 494-507.

115. Samuel M.A., Hall H., Krzymowska M., Drzewiecka K., Hennig J., Ellis B.E. SIPK signaling controls multiple components of harpin-induced cell death in tobacco // Plant J. 2005. - V. 42.-No3.-P. 406-416.

116. Schenk P.M., Kazan K., Wilson I., Anderson J.P., Richmond T., Somerville S.C. and Manners J.M. Coordinated plant defense responses in Arabidopsis revealed by microarray analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - № 21. - P. 11655-11660.

117. Sheng O.J. and Citovsky V. Agrobacterium-plant cell DNA transport: have virulence poteins will travel // Plant Cell. 1996. - V. 8. - P. 1699-1710.

118. Song W.Y., Wang G.L., Chen L.L., Kim H.S., Pi L.Y., Holsten T., Gardner J., Wang B., Zhai W.X., Zhu L.H., Fauquet C., Ronald P. A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance geneXa21 II Science. 1995. - V. 270. - P. 1804-1806.

119. Szurek B., Rossier O., Hause G., Bonas U. Type Ill-dependent translocation of the Xanthomonas AvrBs3 protein into the plant cell // Mol. Microbiol. 2002. - V. 46. - № 1. -P. 13-23.

120. Tabaeizadeh Z., Agharbaoui Z., Harrak H., Poysa V. Transgenic tomato plants expressing a Lycopersicon chilense chitinase gene demonstrate improved resistance to Verticillium dahliae race 2 // Plant Cell Reports. 1999. - V. 19. - No. 2. - P. 197 - 202.

121. Takakura Y., Inoue Y., Kuwata S., Tsutsumi F., Ishida Y. // Disease-resistant plants and method of constructing the same. US Patent Application 20040073970. - 2004. -PCT/JP01/07785.

122. Takken F.L.W., Joosten M.H.A.J. Plant resistance genes: their structure, function and evolution // Eur J Plant Pathol. 2000. - V. 106. - P. 699-713.

123. Tans-Kersten J., Huang H., Allen C. Ralstonia solanacearum needs motility for invasive virulence on tomato // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 3597-3605.

124. Terakawa T., Takaya N., Horiuchi H., Koike M., Takagi M. A fungal chitinase gene from Rhizopus oligosporus confers antifungal activity to transgenic tobacco // Plant Cell Reports. 1997.-V. 16.-No. 7.-P. 439-443.

125. The shorter Bergey's manual of determinative bacteriology // Baltimore: The Williams and Wilkins Company, Ed. by Holt. 1980. - 495 p.

126. Thordal-Christensen H. Fresh insights into processes of nonhost resistance // Curr Opin Plant Biol. 2003. - V. 6. - № 4. - P. 351-357.

127. Tinland B.The integration of T-DNA into plant genomes // Trends Plant Sci. 1996. - V. 1. -№6.-P. 178-183.

128. Tisdale W.B., Wadkins R.F. // Phytopathology. 1931. -V. 21. - P. 641-660.

129. Ton J., Davison S., Van Loon L.C. and Pieterse C.M.J. Heritability of rhizobacteria-mediated induced systemic resistance and basal resistance in Arabidopsis // European Journal of Plant Pathology.-2001.-V. 107. P. 63-68.

130. Ton J., Jakab G., Toquin V., Flors V., Iavicoli A., Maeder M.N., Metraux J.-P., Mauch-Mani, B. Dissecting the P-aminobutyric acid-induced priming phenomenon in Arabidopsis II Plant Cell. 2005. - V. 17. - P. 987-999.

131. Topfer R., Schell J., Steinbiss H.H. Versatile cloning vectors for transient gene expression and direct gene transfer in plant cells // Nucl. Acids Res. 1988. - V. 16 (17). - P. 8725.

132. Underhill D.M., Ozinsky A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection // Curr Opin Immunol.-2002.-V. 14.-P. 103-110.

133. Van Aarssen R., Soetaert P., Stam M., Dockx J., Gossele V., Seurinck J., Reynaerts A., Cornelissen M. cry IA(b) transcript formation in tobacco is inefficient // Plant Mol Biol. -1995. -V. 28. No. 3. - P. 513-524.

134. Van der Biezen E.A., Jones J.D.G. Plant disease resistance proteins and the gene-for-gene concept // Trends Biochem Sci. 1998. - V. 23. - P. 454-456.

135. Van der Hoorn R.A., De Wit P.J., Joosten M.H. Balancing selection favors guarding resistance proteins // Trends Plant Sci. 2002. - V. 7. - P. 67-71.

136. Van Gijsegem F., Vasse J., Camus J.C., Marenda M. and Boucher C. Ralstonia solanacearum produces hrp-dependent pili that are required for PopA secretion but not for attachment of bacteria to plant cells // Mol. Microbiol. 2000. - V. 36. - P. 249-260.

137. Van Loon L.C. Induced resistance in plants and the role of pathogenesis-related proteins // European Journal of Plant Pathology. 1997. - V. - 103. - P. 753-765.

138. Van Loon L.C., Bakker P.A.H.M., Pieterse C.M.J. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria // Ann. Rev. Phytopathol. 1998. - V. 36. - P. 453-483.

139. Van Loon L.C. and Van Strien E.A. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins // Physiological and Molecular Plant Pathology. 1999. - V. 55. - P. 85-97.

140. Van Peer R., Schippers B. Lipopolysaccharides of plant-growth promoting Pseudomonas sp. strain WCS417r induce resistance in carnation to fusarium wilt // Neth. J. Plant Pathol. -1992.-V. 98.-P. 129-139.

141. Van Wees S.C., Glazebrook J. Loss of non-host resistance of Arabidopsis NahG to Pseudomonas syringae pv. phaseolicola is due to degradation products of salicylic acid // Plant J. 2003. - V. 33. - № 4. - P. 733-742.

142. Van Wees S.C.M., Pieterse C.M.J., Trijssenaar A., Van't Westende Y.A.M., Hartog F., van Loon L.C. Differential induction of systemic resistance in Arabidopsis by biocontrol bacteria // Mol. Plant-Microbe Interact. 1997. - V. 10. - P. 716-724.

143. Vazquez-Laslop N., Lee H., Hu R., Neyfakh A.A. Molecular sieve mechanism of selective release of cytoplasmic proteins by osmotically shocked Escherichia coli II Journal of Bacteriology. -2001. -V. 183. № 8. - P. 2399-2404.

144. Viard M.-P., Martin F., Pugin A., Ricci P., and Blein J.-P. Protein phosphorylation is induced in tobacco cells by the elicitor cryptogein // Plant Physiol. 1994. - V. 104. - P. 1245-1249.

145. Whitham S., Dinesh-Kumar S.P., Choi D., Hehl R„ Corr C. and Baker B. The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similarity to toll and the interleukin-1 receptor // Cell. -1994. V.-78.-P. 1101-1115.

146. Wei Z.-M. and Beer S.V. Harpin from Erwinia amylovora induces plant resistance // Acta Hortic. 1996. -V. 411. - P. 223-225.

147. Wei Z.U., Laby R.J., Zumoff C.H., Bauer D.W., He S.Y., Collmer A. and Beer S.V. Harpin, elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora // Science. 1992. - V. 257. - P. 85-88.

148. Wei Z.-M., Qiu D., Kropp M.J. and Schading R.L. Harpin, an HR elicitor, actives both defense and growth systems in many commercially important crops // Phytopathology. — 1998.-V. 88.-P. 96.

149. Wiame I. Irreversible heat inactivation of DNasel without RNA degradation // BioTechniques. -2000.-V. 29.-P. 252-256.

150. Yamanaka K, Fang L., Inouye M. The CspA family in Escherichia coli: multiple gene duplication for stress adaptation // Molecular Microbiology. 1998. - V. 27. - № 2. - P. 247254.

151. Zehnder G.W., Murphy J.F., Sikora E.J. and Kloepper J.W. Application of rhizobacteria for induced resistance // European Journal of Plant Pathology. 2001. - V. 107. - P. 39-50.

Информация о работе

Кромина, Ксения Андреевна
кандидата биологических наук
Большие Вяземы, 2006
ВАК 06.01.11

Диссертация

Получение трансгенных растений табака с геном белка CspD из Bacillus thuringiensis и изучение элиситорных свойств бактериальных белков холодового шока - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы