Получение трансгенных растений-продуцентов бычьего γ-интерферона

Савельева, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение трансгенных растений-продуцентов бычьего γ-интерферона
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение трансгенных растений-продуцентов бычьего γ-интерферона"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

САВЕЛЬЕВА Наталья Владимировна

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИИ-ПРОДУЦЕНТОВ БЫЧЬЕГО у-ИНТЕРФЕРОНА

03.00.15 - генетика

003471358

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

? Я < ' • - тч

V Г. д

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного университета, в лаборатории Генной и клеточной инженерии растений.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Лутова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Самбук Елена Викторовна

доктор биологических наук, профессор Ежова Татьяна Анатольевна

Ведущее учреждение:

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится ¿¿/¿'/¿Л 2009 г. в часов на заседании совета

Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского Государственного университета

Автореферат разослан "_"_2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Кандидат биологических наук Л.А.Мамон

Актуальность проблемы. Генетическая инженерия растений является относительно молодой и интенсивно развивающейся областью современной биотехнологии. Разработанные к настоящему времени методы молекулярной генетики и клеточной инженерии позволяют целенаправленно, по заранее намеченной программе модифицировать геном растения, используя генетическую информацию из разных геномов.

Одним из важных направлений в этой области является создание растений -продуцентов разнообразных фармакологических соединений. Оно позволяет сделать недорогими и, следовательно, общедоступными, многие фармацевтические препараты. В этом плане наилучшими продуцентами считаются микроорганизмы. Однако в ряде случаев существуют серьезные ограничения для использования микроорганизмов в качестве продуцентов фармакологических соединений. В этой ситуации растительные системы являются прекрасной альтернативой микроорганизмам.

При создании трансгенных растений и их внедрении в качестве коммерческих культур наиболее важным моментом является стабильное наследование и стабильно высокая экспрессия перенесенных генов. Показано, что в геноме трансгенных растений гетерологичные гены наследуются, как правило, доминантно по классическим законам Менделя (Ро1хукш е1 а1., 1985; Вис1аг й а1., 1986). Однако, функционирование целевых генов в окружении растительного генома может быть различным. Так, в литературе описано множество случаев широкой вариабельности экспрессии трансгенов среди индивидуальных трансформантов, а также случаи их полной инактивации. Таким образом, при создании растений-продуцентов необходимо комбинировать новейшие биотехнологические подходы с традиционными селекционно-генетическими методами, что позволит создавать высокоэффективные, стабильные растительные продуценты, необходимые для современного мира.

Данная диссертационная работа посвящена получению и изучению трансгенных растений табака и гороха, синтезирующих бычий у-интерферон.

Вирусные и бактериальные заболевания сельскохозяйственных животных приводят к значительным потерям, вследствие падежа или потери продуктивности. Важным этиологическим фактором таких заболеваний является снижение устойчивости организма к возбудителям, возникающее на фоне различных иммунодефицитов. Анализ причин заболеваемости показал, что основной ущерб животноводству наносят факторные инфекции, клинически проявляющиеся у маточного поголовья в нарушении репродуктивной функции, а у молодняка - в диарейных и респираторных синдромах. Исследование данного вопроса привело к заключению, что высокая частота инфекций сельскохозяйственных животных обусловлена постоянным присутствием неблагоприятных факторов, в том числе патогенных микроорганизмов.

Широкое и бессистемное применение антибиотиков, нитрофуранов, сульфамидных препаратов (без учета чувствительности к ним микроорганизмов, циркулирующих в хозяйствах) не всегда дает положительный результат, и приводит, как правило, лишь к угнетению иммунного ответа у животных. В связи с этим, становится актуальным применение препаратов, обладающих свойствами

иммуномодуляторов, обладающих противовирусным и антибактериальным действием.

В настоящее время большие надежды связывают с препаратами интерферонов, являющихся неспецифическими средствами защиты организма от вирусных инфекций. Для интерферонов характерными являются противовирусные, иммуностимулирующие, антибактериальные и антиконцерагенные свойства.

Таким образом, растения-продуценты у-интерферона могут стать эффективными и легкоприменимыми на практике иммуномодуляторами, применяемыми при инфекционных заболеваниях и иммунодефицитах других этиологии.

Цели и задачи работы. Цель данной работы состояла в получении трансгенных линий табака и гороха, стабильно наследующих и экспрессирующих гетерологичный ген у-интерферона. В соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи:

a. анализ наследования гетерологичного гена IFNG (ген. кодирующий бычий у-интерферон)у трансгенных растений табака (Т0-Т3);

b. анализ уровня и стабильности экспресиии гена IFNG у независимых трансформантов табака в ряду поколений Т0-Т3;

c. анализ трансгенных растений табака на наличие гетерологичного белка у-интерферона.

2. Изучение индукции иммунного ответа у мышей при пероральном введении растительных экстрактов табака, содержащих у-интерферон, включающее анализ формулы крови и анализ общего титра Ig (иммуноглобулины).

3. Подбор оптимальных методов для получения трансгенных линий гороха, стабильно наследующих и экспрессирующих ген IFNG

a. изучение способности к регенерации и трансформации сортов;

b. подбор методов для укоренения регенерантов гороха;

c. анализ трансгенных растений гороха на наличие и экспрессию гена IFNG в поколенях 1 о~ м-

Научная новизна. В ходе выполнения данной работы впервые были получены трансгенные линии табака и гороха, синтезирующие бычий у-интерферон и характеризующиеся стабильным наследованием и экспрессией гетерологичного гена IFNG в ряду поколений Т0-Т3 и Т0-Т4, соответственно. Для трансгенных растений табака показана изменчивость экспрессии гена IFNG у линий InterB и Inter311. Показано наличие гетерологичного белка у-интерферона в трансгенных растениях табака и гороха. Показана индукция иммунного ответа у мышей в результате перорального введения растительных экстрактов табака, содержащих бычий у-интерферон.

Впервые предложена методика трансформации гороха in vitro, позволяющая получать трансгенные растения через 4 месяца:

а. подобраны условия регенерации и укоренения при агробактериальной трансформации гороха in vitro;

b. впервые использован метод опудривания ИМК (индолил-масляной кислотой) для укоренения регенерантов гороха. Практическая ценность. Сконструирован агробактериальный вектор, содержащий ген бычьего у-интерферона под контролем конститутивного промотора 35S, который может быть использован для получения растений-продуцентов бычьего у-интерферона. Трансгенные линии табака и гороха, синтезирующие у-интерферон, могут быть использованы в качестве иммуномодуляторных средств в ветеринарии. Разработанная методика агробактериальной трансформации гороха in vitro, может быть использована для получения разнообразных продуцентов на основе данной культуры, а также для изучения молекулярной генетики гороха. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах: Ш-й съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва, 25-27 октября 2005 г.; вторая международная научно-практическая конференция "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности": Санкт-Петербург, 7-9 января 2006; 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых: "Биология - наука XXI века". Пущино, 17-21 апреля 2006; Международная научная школа - конференция молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях". Звенигород, 7-12 декабря 2008; V-й Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва, 16-20 марта 2009.

Кроме того, материалы диссертационной работы были представлены на международной биотехнологической выставке в Германии - Biotechnology exhibition: "Biotechnica". Ганновер, 9-11 октября 2007.

Материалы диссертационной работы представлены в виде устных докладов на отчетных семинарах лаборатории генной и клеточной инженерии растений СПбГУ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, полученные результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (372 источника). Работа изложена на 163 страницах и содержит 37 рисунков и 30 таблиц.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Растительный материал. В работе были использованы трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum L.), содержащие ген у-интерферона быка, полученные методом агробактериальной трансформации листовых дисков (рис. 1).

Рис. 1. Родословная трансгенных линий табака.

То - исходные независимые трансгенные растения, полученные в результате агробактериальнон трансформации;

Ti-Tj - поколения трансгенных растений табака, полученных в результате самоопыления.

Также были использованы растения гороха сортов Адагумский и Амброзия, районированных в Северо-западном регионе России и характеризующихся раннеспелостью и высокой урожайностью.

Условия культивирования растительного материала. Растительный материал культивировали в условиях in vitro и in vivo. Культивацию растений табака в условиях in vitro проводили на среде MS0 (Мурасиге-Скуга), а растений гороха — на среде В5 (Дрейпер и др., 1991).

Табак выращивали в условиях in vitro и in vivo при t 22 - 25°С, с фотопериодом 16 часов, при освещенности 6000 люкс. Растения гороха экспонировали при освещенности и фотопериоде, описанных для табака, однако, температура, при которой выращивали горох, была ниже и составляла 18-20°С.

Штамм Agrobacterium tumefaciens. Для получения трансгенных ратений табака и гороха был использован агробактериальный штамм, несущий вектор с гетерологичным геном бычьего у-интерферона. Ген у-интерферона был предоставлен сотрудниками лаборатории биохимической генетики СПбГУ Смирновым М.Н., Падкиной М.В. и Самбук Е.В. Агробактериальный вектор был сконструирован в нашей лаборатории при участии Ходжайовой JI.T. и Градобоевой А.Е. (сотрудник лаборатории биохимической генетики СПбГУ).

Агробактериальная трансформация. Трансгенные растения табака были получены в результате трансформации листовых дисков (Дрейпер и др., 1991).

Трансгенные растения гороха были получены с помощью трех методов агробактериальной трансформации: трансформации незрелых зародышей гороха in

vitro (Schroeder et al., 1993), трансформации цветка in vivo (Curtis, 2002; Desfeux et al., 2000; Trieu et al., 2000) и трансформации 7-дневных проростков in vivo (Коренева и др., 2001; Svabova et al., 2005).

Молекулярные методы. Пробы ДНК получали из листьев растений табака и гороха с помощью СТАВ-метода (Rogers et al., 1985).

Пробы РНК выделяли из растительного материала с помощью TriReagent (Sigma, кат № Т3934) и использовали для постановки реакций обратной транскрипции. Пробы кДНК анализировали методами ПЦР-анализа и ПЦР-анализа в реальном времени.

Изучение наследования и экспрессии гена IFNG в трансгенных растениях табака проводили методами ПЦР-анализа, ОТ-ПЦР-анализа и ПЦР-анализа в реальном времени. Для проведения различных видов ПЦР-анализа были использованы следующие праймеры:

- к гену IFNG:

sIFNG-1: 5'-TAATGCAAGTTCTCCAGATGTAGC-3' slFNG-2: 5'-ACATGGATGCTCTTCGACCT-3'

(1): 5'-ATGCAGGGCCAATTTTTTAGAG-3'

(2): 5'-AAGAGATTCTGACTTCTCTTCCGC-3'

зонд IFNG: 5'-FAM- TGGCTTTGCGCTGGATCTGCAGATCATCCA-BHQ

- к гену Ubi (ген, кодирующий убиквитин): ubi 1: 5 '-ATGCAGAT(C/T)CTTGTGAAGAC-3' ubi2: 5'-ACCACCCCG(G/A)AGACGGAG-3'

- к гену GAPDH (референсный ген, кодирующий фермент глицеральдегидфосфат-дегидрогеназу)

Gad-F: 5'-ACTGGTGTCTTCACTGACAAGG-3'

Gad-R: 5*-TGACACCCACAACAAACATCGG-3'

зонд Gad: 5'-Cy5-ACAAGGCTGCTGCTCACTTGAAGG-BQ2

Результаты ПЦР и ОТ-ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Результаты ПЦР-анализа в реальном времени обрабатывали с помощью программного обеспечения для анализатора нуклеиновых кислот "АНК-32" (Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург)

Анализ белковых проб. Экстракцию цитоплазматических белков проводили с помощью глицинового буфера рН 7,5 с добавлением ингибиторов протеиназ пепстатина А (15 мкМ), леопептина (15 мкМ) и PMSF (1 тМ).

Фракционирование белкового экстракта осуществляли с помощью растворов сульфата аммония различной насыщенности по стандартной методике (Долсон Р. И др., 1991).

Разделение белков проводили методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (Laemmli, 1970).

Подтверждение наличия белка в траснгенных растениях табака и гороха проводили с помощью Вестерн-блот гибридизации. Вестерн-блот анализ проводили, перенося белки на нитроцеллюлозную мембрану. Для проведения гибридизации использовали первичные поликлональные козьи антитела к рекомбинантному у-интерферону (R&D systems, кат. № AF-2300) и вторичные поликлональные противокозьи кроличьи антитела, меченные пероксидазой хрена («МЕДГАМАЛ» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, антитела диагностич. против IgG(H+L)

кролика меченные пероксидазой, сухие (антивидовой коньюгат)). Разведение первичных антител составило 1: 5000, разведение вторичных антител - 1: 3000.

Изучение активации иммунного ответа у лабораторных мышей. Растительный экстракт, приготовленный из трансгенных растений табака линии Inter311, перорально вводили мышам один раз в сутки в течение 6 дней. В эксперименте были использованы 12 самцов в возрасте 3 недель. Анализ результатов проводили на 16 день после начала опыта.

Серологический анализ крови. Мазки крови были приготовлены из капель крови, взятых у мышей из хвостовой вены до начала эксперимента и на 16 день после начала эксперимента. Окраску мазков проводили красителем азур-эозин по Романовскому по стандартной методике приготовления клинических мазков крови (Лилли Р., 1969). Подсчет клеток крови проводили под световым микроскопом при увеличении ЮОх.

Иммуноферментный анализ. Для определения общего титра Ig был проведен иммуноферментный анализ сыворотки крови мышей, полученной на 16 день после начала эксперимента. Для каждой пробы сделано 8 повторностей.

Статистические методы и компьютерная обработка. Результаты, полученные экспериментально, обрабатывали, используя статистический пакет, встроенный в Microsoft Office Exel 2007. Анализ наследования гетерологичного гена IFNG проводили, используя критерий у?. Построение денситограмм белковых спектров проводили при помощи компьютерной программы Image J 1.41 (http://rsb.info.nih.gov/ii/download.html).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ наследования гена IFNG у трансгенных растений табака. При анализе шести семей поколения Т, (InterA, Inter335, Inter605, Inter623, InterB и Inter311) выявлено наследование гетерологичного гена бычьего у-интерферона. У потомков 5 исходных трансформантов наследование гена IFNG соответствовало законам менделевского расщепления. Выявленное соотношение IFNG+:IFNG-растений в данных семьях не противоречило теоретически ожидаемому расщеплению 3:1, предполагающему интеграцию одной копии Т-ДНК в геном исходных трансформантов (Т0). Анализ семьи Inter335 (Т[) выявил расщепление по гену IFNG, отклоняющееся от менделевского. Поэтому, потомки растения Inter335 были исключены из дальнейшей работы, как растения с нестабильным наследованием целевого гена (табл. 1).

Таблица 1. Соотношение IFNG+- и IFNG- - потомков у трансгенных растений табака (Tt)__

Семья Расщепление Факт. х2 Факт. х2 Факт. (Ни: х2

(Т.) среди растений (Н0: 3:1, Н0: 3:1 (Н0:15:1, Н„: 63:1, теор. Н»:

Ti при теор. ожид.: теор. ожид.: 15:1 ожид.: 63:1

самоопылении 18,75:6,25) 23,44:1,56) 24,61:0,39)

IFNG+ IFNG-

InterA 17 8 2,72:1 0,65* 10,90:1 6,91 43,59:1 15,55

InterB 21 4 3,36:1 1,08* 13,46:1 4,45 53,85:1 35,6<

Inter311 17 8 2,72:1 0,65* 10,90:1 6,91 43,59:1 15,5i

lnter335 2 23 0.32:1 59.85 1,28:1 21,15 5,13:1 21,7:

Inter605 20 5 3,20:1 0,33* 12,82:1 5,01 51,28:1 29,8f

Inter623 21 4 3,36:1 1,08* 13,46:1 4,45 53,85:1 35,6?

* фактическое расщепление достоверно соответствует теоретическому при 05=3,841 (сЫ. = 1)

Анализ наследования гетерологичного гена бычьего у-интерферона в поколениях ТрТз для семей ШегВ и 1щег311 показал стабильное наследование гена соответствующее 3:1 и указывающее, что исходные трансформанты ШегВ и 1пГегЗ 11 (Т0) содержат единичную инсерцию Т-ДНК. Среди растений МегЗ 11 выявлено гомозиготное по гену ^N0 растение 1Щег311.2, на основе которого была заложена линия трансгенных растений табака.

Анализ экспрессии гена №N0 у трансгенных растений табака. Анализ уровня и стабильности экспрессии гена у-интерферона у трансгенных растений табака в ряду поколений был выполнен с помощью двух методов; ОТ-ПЦР-анализа и П1ДР-анализа в реальном времени.

ОТ-ПЦР-анализ. С помощью ОТ-ПЦР-анализа мы показали наличие I экспрессии бычьего гена у-интерферона у потомков четырех исходных трансформантов 1ЩегВ, ЬИегЗП, 1Щег605 и 1п1ег623 на уровне поколения Т,. Кроме того, мы выявили изменчивость уровня экспрессии ^N0 гена среди растений (Т|) внутри семей (рис. 2).

|| 1 г;

....."1

Рис. 2. ОТ-ПЦР-анализ растений семьи ШегВ (Т1), проведенный с праймерами

к гену у-интерферона.

М - маркер молекулярного веса (100 - 1000 н.п.);

К+ - ПЦР-реакция, проведенная с ДНК пробой Agrobacterium ¡ите/ааепее;

К- - ПЦР-реакция, проведенная с кДНК пробой нетрансгенного растения табака;

К— ПЦР-реакция, проведенная с водой;

1-25 - ПЦР-реакции, проведенные с кДНК пробами анализируемых трансгенных растений табака семьи ШегВ (Т1).

У потомков пятого трансформанта 1ЩегА было продемонстрировано отсутствие экспрессии гетерологичного гена №N0. Возможными причинами данного явления могли быть химерность исходного трансформанта 1ШегА (Т0) или инсерция Т-ДНК фрагмента в транскрипционно неактивный участок растительного генома.

Анализ наследования экспрессии гена №N0 в ряду поколений (ТГТ3), выполненный для потомков трансформантов 1Ш:егВ и ШегЗП, показал стабильное наследование экспрессии гена №N0 в поколении Т2 и Т3 у растений всех проанализированных семей. Показано, что, начиная с поколения Т2 изменчивость уровня экспрессии внутри семей отсутствует. Сохранение экспрессии №N0 у потомков растения МегЗ 11.2 в поколениях Т2 и Т3 позволило создать на их основе линию растений-продуцентов у-интерферона со стабильным наследованием и экспрессией гетерологичного гена.

ПЦР-анализ в реальном времени. Изучение уровня экспрессии гена бычьего у-интерферона в растениях линий 1ШегВ и ШегЗ 11 было проведено с помощью метода

ПЦР в реальном времени. Используя данный метод, мы подтвердили данные, полученные ранее с помощью метода ОТ-ПЦР-анализа. Так, была показана взаимосвязь между интенсивностью свечения ПЦР-продуктов, полученных в результате ОТ-ПЦР-анализа трансгенных растений семей 1п1егЗ 11 и 1МегВ, и уровнем экспрессии гетерологичного гена №N0. Для растений ЫегВ.б (Т,), 1пгегЗ 11.2 (Т,), 1ШегВ.6.14 (Т2), 1тегВ.13.6 (Т2) и 1тег311.2.12 (Т2), у которых была выявлена наибольшая интенсивность свечения ПЦР-фрагментов, показан высокий уровень экспрессии гена превышающий уровень экспрессии референсного

гена САРБН в 20-60 раз. Однако, сохранение высокого уровня экспрессии гетерологичного гена происходило лишь у части растений следующего поколения. Так, было выявлено значительное снижение уровня экспрессии гена №N0 у растений поколения Т2 в семьях МегВ.б и ШегВЛЗ. Необходимо отметить также, что у растения 1п1егЗ 11.2.12 (Т2) происходило сохранение экспрессии гена №N0 на том же уровне, что и у родительского растения МегЗ 11.2 (Т,).

Таким образом, на основе результатов ОТ-ПЦР-анализа и ПЦР-анализа в реальном времени среди растений табака семей 1п1егВ и МегЗ 11 выявлены трансгенные растения (МегВ.б.М, Шег311.2.12) со стабильно наследуемым высоким уровнем экспрессии гетерологичного гена №N0.

Анализ белковых проб у трансгенных растений. Анализ белковых проб методом Вестерн-блот гибридизации, выделенных из трансгенных растений табака и гороха, выявил белок массой 15 кГ>а, соответствующий у-интерферону (рис. 3).

инМ.ЗДе 311.2,2 311.2.3 311.2.8 311.2.12 311.2.22 у-^Г'!

Рис. 3. Вестерн-блот гибридизация белковых проб, полученных из трансгенных растений семьи 1гиег311.2 (Т2).

Дот-блот гибридизация показала присутствие гетерологичного белка у-интерферона во всех трансгенных растениях семьи 1шегВ.6.13 (Т3) и семьи 1п1ег311.2.7 (Т3). Следовательно, несмотря на разный уровень экспрессии гена №N0 в некоторых растениях, продемонстрированный методом ПЦР-анализа в реальном времени, синтез гетерологичного белка происходит в количествах, достаточных для его идентификации. С помощью калибровочной кривой и программы lmage} проведен анализ полос, соответствующих у-интерферону, в пробах, полученных из трансгенных растений семьи 1ШегЗ 11.2 (Т3). Показано, что в одном грамме растительного материала (сырой вес) содержится в среднем от 1 до 1,5 мкг у-интерферона. Таким образом, нам удалось получить линию трансгенных растений табака 1п1ег.311.2 - продуцента бычьего у-интерферона, характеризующуюся стабильным наследованием, экспрессией гетерологичного гена №N0 и синтезирующую белок у-интерферон.

Изучение активации иммунного ответа у лабораторных мышей. Белковые пробы для вскармливания мышей были получены путем фракционирования растительных экстрактов с помощью растворов сульфата аммония.

В эксперименте были использованы две группы мышей, одной из которых давали растительный экстракт, приготовленный из нетрансгенного растения табака (контрольная группа), а другой - растительный экстракт, приготовленный из трансгенных растений линии 1тег311.2 (опытная группа). Каждая из групп состояла из шести мышей. В эксперименте участвовали самцы, возраст которых на момент начала эксперимента был три недели. Белковые экстракты вводили перорально 1 раз в день в течение 6 дней в одно и то же время. Так, каждое животное из опытной группы получало примерно по 1 мкг у-интерферона в сутки.

Заключение о биологической активности у-интерферона проводили, сравнивая изменения серологических показателей крови и общего титра до и после вскармливания белковыми экстрактами.

Серологический анализ крови. Был проведен анализ 48 мазков крови, полученных из периферической крови мышей контрольной и опытной групп. Данные анализа представлены на гистограммах (рис. 4).

70 Т ■ До В

(¡о - я на II

50 -

40 ----

30 —-----

20..................

4.И4Ы

1(1 • и»........

1 =5

I х

< А.

Я о

¡1

Рис. 4. Результаты серологического анализа крови мышеи.

Показано отсутствие количественных различий уровней палочкоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов до и после перорального введения растительного экстракта мышам в контрольной и опытной группах (рис. 4). Исключение составили количественные изменения сегментоядерных нейтрофилов, выявленные в контрольной группе, а также изменения количества эозинофилов и базофилов в обеих группах. Незначительное снижение количества сегментоядерных нейтрофилов в контроле (рис. 4), указывает на омоложение клеток нейтрофильного ряда, происходящее в момент проведения эксперимента у некоторых животных контрольной группы. Скорее всего, это изменение связано с физиологическими колебаниями, происходящими в организмах животных в процессе жизнедеятельности.

Показано значительное повышение уровня эозинофилов и базофилов (в три раза) после вскармливания растительными экстрактами как в контроле, так и в опыте (рис. 4). Повышенный уровень эозинофилов в периферической крови подопытных животных может говорить о развитии аллергических реакций,

Контроль

¡скармливания б день после вскармливания

ЮМ.<

шна.

.............ЯЭЮ7

.....Г|

МЧ!М '■¡ШО

Опыт

До вскармливания

на 16 день после вскармливания

ИИ}

кт

5.7^.9

да,с.....

ч е

* X

й =

? с

» а.

2 о

= 5 г с

вызванных употреблением растительных экстрактов. Аллергические реакции, не вызваны у-интерфероном, т.к. повышение уровня эозинофилов наблюдали в обеих фуппах. Следовательно, наиболее вероятной причиной аллергической реакции являются собственные растительные белки табака, содержащиеся в препарате.

В результате проведения серологических исследований выявлено качественное изменение лимфоцитов. В крови животных из опытной группы обнаружено повышение количества активированных лимфоцитов на 25% после перорального введения растительного экстракта, содержащего у-интерферон (рис. 5). Эти данные указывают на активацию иммунного ответа у животных опытной группы.

Конхроль

100 90 30 70 «0 50 40 30 20 10 0

Ш довекармгиваккя 89-3%+и Щ на 16 декь после вскарклзгвзнкя

............................................. т ж

аВ

ж 31

ияаг11« Ж ■¡р У 1

_ В

10 О

7 И Я до воорминваккя — та 16 дао> поел? вск^ттошаиня

- "

шшШ

«т у.

11111111

УМ

9И-—.1 !ч- - ч! т Ш

И _, т ш 1

актиБир. лимфоциты неактивир. лимфоциты

активир. лимфоциты неактивир. лимфоциты

Рис. 5. Количество активированных и неактивированных лимфоцитов, содержавшихся в переферической крови мышей контрольной и опытной групп.

Таким образом, показано, что у-интерферон, синтезированный в трансгенных растениях табака линии 1п1ег311.2, обладает биологической активностью. В результате эксперимента мы показали, что терапии, которая состояла в оральном введении 1 мкг у-интерферона (на 20-30 г веса животного) однократно в течение 6 дней, было достаточно для индукции иммунного ответа у мышей. Данного количества также оказалось достаточно, чтобы пройти через систему желудочно-кишечного тракта и попасть в кровь. Этот результат является важным для дальнейшей работы по созданию «съедобных» растений-продуцентов, так как известно, что у-интерфероны являются кислотонеустойчивыми молекулами, поэтому пероральное введение у-интерферона могло привести к разложению молекул у-интерферона в процессе пищеварения. Развитие небольшой аллергической реакции, выявленной у животных обеих групп, вероятно, связано с недостаточной очисткой препарата у-интерферона, проведенной нами. Таким образом, для безопасного применения данного белка для профилактики инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы у животных необходимо вводить дополнительную очистку экстракта от растительных белков табака.

Анализ общего титра 1а. Для подтверждения данных об активации иммунитета, полученных в результате серологического анализа крови, был проведен анализ общего титра методом ИФА (иммуно-ферментным анализом). В

результате эксперимента выявлено повышение общего уровня в опытной группе мышей, которым давали белковый экстракт, содержащий у-интерферон. Таким образом, мы подтвердили ранее полученные с помощью серологического анализа данные об активации иммунного ответа у мышей в результате орального введения у-интерферона (рис. 6).

А492/620 пт

М5 ................... ;

4 на I

V.............................................. тИР.........

2,08 ±0,01

2.1 ...... .¡¿я ...........

2Д5 -

1 _

Контроль Опыт

Рис. 6. Обший титр измеренный для контрольной и опытной групп мышей на 16 день после начала эксперимента

Итак, созданная нами линия трансгенных растений табака 1гПегЗ 11.2 может быть использована в качестве линии растений-продуцентов бычьего у-интерферона. По результатам оценки в растениях синтезируется 1 -1,5 мкг/г сырого веса гетерологичного белка, что значительно ниже количества белка, которое можно синтезировать, используя микроорганизмы. Однако, большая биомасса растений табака позволяет получать гетерологичный белок в необходимых количествах. Кроме того, в наших экспериментах мы показали, что у-интерферон, как и любой другой иммуностимулятор, способен стимулировать иммунный ответ в малых концентрациях. Напротив, применение высоких доз иммуностимуляторов, по литературным данным, может приводить к серьезным патологическим изменениям в организме вплоть до летального исхода.

Эксперименты, проведенные на мышах, продемонстрировали индукцию иммунного ответа у животных в результате перорального введения у-интерферона. Эти результаты позволяют заключить, что синтезированный белок у-интерферон в трансгенных растениях был биологически активен. Однако, для использования данного препарата в ветеринарной практике необходимо провести дополнительную очистку целевого белка от растительных белков для исключения аллергических реакций.

Создание «съедобных» иммуномодуляторов на основе растений гороха.

Одним из новых перспективных подходов в иммунорегуляции является использование пероральных вакцин на основе рекомбинантных специфических антигенов и иммунорегуляторных цитокинов. В различных экспериментальных моделях и клинических испытаниях показана эффективность перорального введения антигенов для модуляции иммунного ответа. Одним из возможных путей доставки антигенов или цитокинов является использование трансгенных растений (Якушенко Е.В. и др., 2008). В предыдущем разделе мы продемонстрировали активацию иммунного ответа в результате перорального введения растительного экстракта у-интерферона лабораторным мышам. Однако, выделение и хранение

2,29 ±0,01

:..............: ..... 1

2,08 ±0,01

ГЦ и

г'Щ: ' ш

препарата у-интерферона сопряжено с некоторыми трудностями. Тогда как создаш «съедобных» иммуномодуляторов позволит избежать подобных проблем i упростить процедуру введения препарата животным.

Для создания «съедобных» иммуномодуляторов, содержащих бычий у-интерферон, мы выбрали культуру гороха, которая может быть использована i качестве пищевой добавки к кормовой базе крупного рогатого скота. Из литературь известно, что горох является трудно трансформируемой культурой с низкик выходом трансгенных растений (Grant et al., 1995; Grant et al., 1998). Поэтому бьи проведен подбор оптимальных методов акробактериальной трансформации дл> данной культуры.

Агробактериальная трансформация гороха была проведена для растениГ сортов Адагумский и Амброзия с помощью трех методов: трансформации незрелы> зародышей in vitro, трансформации цветка in vivo и трансформации 7-дневных проростков in vivo.

Перед проведением трансформации незрелых зародышей гороха in vitro была изучена способность к регенерации и корнеобразованию, а также подобрана сублетальная концентрация селективного агента канамицина для отбора трансгенных растений гороха.

Мы показали, что для обоих сортов гороха наиболее эффективно регенерация идет на среде В5, содержащей TDZ (тидиазурон) в концентрации 0,5 мг/л. Однако, процент регенерантов, полученных на среде B5+TDZ 0,5 мг/л для сорта Адагумский, был ниже, чем у сорта Амброзия. Таким образом, мы заключили, что сорт Амброзия имеет более высокий регенерационный потенциал по сравнению с сортом Адагумский. Наиболее эффективным способом укоренения в условиях in vitro среди проанализированных, является метод укоренения гороха на среде В5 с предварительным опудриванием черенков ИМК. В работе показано негативное влияние канамицина на рост и морфологию корней у растений гороха. Так, у всех выживших на среде с концентрацией канамицина 100 мг/л растений наблюдали замедленный рост побегов и измененную морфологию корней, выражающуюся в их утолщении. Корневая система растений, выросших на среде с канамицином, была слабо развита по сравнению с корневой системой контрольных растений. Поэтому для получения жизнеспособных трансгенных растений гороха мы сокращали время селекции предположительно трансгенных регенерантов до 1,5 недель.

После проведения предварительных методологических экспериментов была осуществлена агробактериальная трансформация растений гороха сортов Адагумский и Амброзия. Получено 6 Km-устойчивых регенерантов гороха сорта Адагумский и 98 Km-устойчивых регенерантов гороха сорта Амброзия. Полученные регенераты были привиты на растения того же сорта для их укоренения. Применяя трудоемкий метод прививок, нам удалось укоренить только 4 растения гороха сорта Адагумский.

В дальнейшем, мы оптимизировали методику трансформации незрелых зародышей гороха in vitro, заменив трудоемкий метод прививок регенерантов, на индукцию корнеобразования, с помощью опудривания ИМК. Таким образом, метод агробактериальной трансформации, предложенный нами, включает 6 этапов и длится всего 4 месяца:

- проращивание зародышей гороха - 4-5 дней;

- культивация и кокультивация эксплантов с агробактерией - 2 дня;

- селекция Km - 28 дней;

- индукция регенерации — 4-6 недель;

- укоренение с помощью опудривания ИМК - 2-3 недели;

- перенос в условия in vivo - 2 недели.

По литературным данным, ранее предложенные методы агробактериальной трансформации гороха in vitro занимают от 6 до 8 месяцев. Таким образом, разработанный нами метод по трансформации гороха требует меньше времени, а подобранные среды для эффективной регенерации и укоренения повышают выход трансгенных растений.

Наряду с описанными методами трансформации гороха in vitro большой популярностью в последнее время пользуются методы агробактериальной трасформациии in vivo. Нами предложен модифицированный метод трансформации 7-дневных проростков гороха in vivo, позволяющий избежать проблем, возникающих при трасформации in vitro, сократить время получения трансгенного растения и увеличить объем трансформируемого материала.

Процент истинно трансгенных растений гороха в поколении Ть содержавших гетерологичный ген бычьего у-интерферона, составил 1%. Проведение ПЦР-анализа и Вестерн-блот гибридизации растений поколения Т4 показало сохранение гетерологичного гена IFNG в геноме растений, а также выявило наличие белка у-интерферона у этих растений (рис. 7).

Y-IFN 2(3) 4(1) 7(3)

Рис. 7. Вестерн-блот гибридизация растений гороха (сорт Амброзия) поколения Т4.

2(3),) и 7(3) - пробы белка трансгенных растений гороха, 4(1) - проба белка нетрансгенного растения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе диссертационной работы были созданы трансгенные растения табака и гороха, синтезирующие бычий у-интерферон.

Трансгенные растения табака линий InterB и Inter311 характеризуются стабильным наследованием и экспрессией гетерологичного гена IFNG в ряду поколений Т0-Т3. Наличие гетерологичного белка у-интерферона в трансгенных растениях табака и гороха подтверждено методом Вестерн-блот гибридизации.

Изучение биологической активности белка у-интерферона, выделенного из трансгенных растений табака линии Inter311, проведено на мышах. Показано, что пероральное введение белковых экстрактов из трансгенных растений табака, приводит к качественным изменениям лимфоцитов периферической крови и повышению общего титра Ig.

В результате подбора условий регенерации и укоренения проведена оптимизация метода агробактериальной трансформации гороха in vitro. Впервые использован метод опудривания ИМК для укоренения регенерантов гороха. Таким

образом, нами предложена методика трансформации гороха in vitro, в результа которой можно получить трансгенные растения в более краткий срок по сравнешп с методами, описанными в литературе.

В результате агробактериальной трансформации 7-дневных проростко гороха были получены трансгенные растения, стабильно наследующи гетерологичный ген IFNG в ряду поколений Т0-Т4. Для этих растений показан присутствие белка у-интерферона. Таким образом, данные растения можи использовать в качестве «съедобных» иммуномодуляторов в ветеринарии.

ВЫВОДЫ

1. Получены линии табака InterB и Inter311, характеризующиеся стабильны! наследованием гетерологичного гена IFNG в поколениях То-Т3. Выявлен линия Inter311, гомозиготная по гену IFNG.

2. Среди трансгенных растений табака семей InterB и Inter311 (Ti) показан изменчивость экспрессии гена IFNG. Выявлены растения InterB.6.14 i Inter311.2.12, характеризующиеся стабильным наследованием (Т[-Т3) ] высоким уровнем экспрессии гетерологичного гена IFNG.

3. У трансгенных растений табака линий InterB и Inter311 методом Вестерн-бло гибридизации показано наличие белка массой 15 kDa, соответствующего у интерферону.

4. Показана индукция иммунного ответа у мышей при проведении недельно] терапии бычьим у-интерфероном, синтезированным в трансгенных растения: табака. Индукция иммунного ответа проявлялась в качественном измененш лимфоцитов периферической крови и повышении общего титра Ig.

5. Получены трансгенные растения гороха на основе сорта Адагумский, характеризующиеся стабильным наследованием гетерологичного гена IFNG i течение 4 поколений и синтезирующие бычий у-интерферон.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Савельева Н.В., Дудник Е.Э., Лутова Л. А. Модификация методов агробактериальной трансформации in vitro и in vivo для получения трансгенных растений моркови и гороха. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. М.: 2005. Т.1. №1. с.37-46.

2. Дудник Е.Э., Савельева Н.В., Лутова Л.А. Создание растений - биопродуцентов бычьего интерферона-гамма. // Материалы III съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. М.: 25-27 октября, 2005. с. 108-109.

3. Дудник Е.Э., Савельева Н.В., Лутова Л.А. Получение трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) с гетерологичными генами nptll и IFN-y. //Сборник трудов второй международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование". СПб: 07-09 января, 2006. с. 235-236.

4. Савельева Н.В., Дудник Е.Э., Лутова Л.А. Анализ наследования гетерологичного гена интерферон-гамма (IFN-y) у трансгенных растений N. tabacum L. //Сборник тезисов "Биология - наука XXI века. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых". Пущино: 17-21 апреля, 2006. Стр. 368.

5. Савельева Н.В., Дудник Е.Э., Лутова Л.А. Создание и анализ трансгенных растений - продуцентов бычьего гамма-интерферона. //Сборник статей.

"Биотехнология будущего". Международная школа-конференция молодых ученых, в рамках Международного Симпозиума «ЕС - Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной Программе». Санкт-Петербург. 5-9 июня. 2006. с. 79-80.

i. Лупышева Ю., Дунаева С., Пендинен Г., Новикова Л., Савельева Н., Лутова Л., Гавриленко Т. Регенерации и трансформация сортов малины и ежевики в культуре in vitro. Вестник СПбГУ, Серия 3 - Биология, Выпуск 2. - 2008. с. 28 -35.

Дудник Е., Курдюков И., Савельева Н., Емельянов В., Лутова Л. Трансгенные растения - продуценты у-интерферона быка. Международная научная школа — конференция молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" - 7 - 12 декабря 2008, Звенигород, Россия. С. 25.

!. Савельева Н.В., Дудник Е.Э., Лутова Л.А., Трансгенные растения с геном интерферона- у (IFNG) как иммуностимуляторы для крупного рогатого скота. Сборник трудов БиНИИ СПбГУ №54, 2008. с. 25-30.

). Савельева Н.В., Курдюков И.Д., Дудник Е.Э., Емельянов В.В., Лутова Л.А. Создание растительных продуцентов бычьего у-интерферона. Пятый Московский международный когресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" - 16-20 марта 2009, Москва, Россия. С. 348

Подписано в печать 14.05.2009. Ф-т 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 953.

Отпечатано в ООО "Издательство "ЛЕМА" 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савельева, Наталья Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Растительные системы в фармакологии и медицине.

1.1.1. Преимущества растительных систем.

1.1.2. Растительные продуценты.

1.1.2.1. Растения — продуценты рекомбинантных белков.

1.1.2.2. Растения - продуценты рекомбинантных антител.

1.1.2.3. Растения - вакцины.

1.2. Биотехнология растений.

1.2.1. Методы трансформации растений.

1.2.1.1. Агробактериальная трансформация.

1.3. Вопросы, возникающие при создании трансгенных растений — продуцентов фармакологически значимых белков.

1.3.1. Отбор трансгенного материала.:.

1.3.2. Наследование перенесенных генов./.:.

1.3.3. Экспрессия гетерологичных генов.

1.3.4. Гликозилирование белков в растительных системах.

1.3.5. Эффективность растительных систем (накопление целевого продукта)

1.4. Иммуностимуляторы для животноводства.

1.4.1. Интерферон и его функции.

1.4.1.1. Классификация интерферонов.

1.4.1.2. Участие у-интерферона в системе иммунного ответа.

1.4.2. Создание и применение препаратов у-интерферона в медицине и ветеринарии.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

11.1. Растительный материал.

II. 1.1. Стерилизация семян.

II. 1.2. Условия культивирования растительного материала.

II. 1.3. Селекция трансгенных растений табака и гороха.

11.2. Штамм Agrobacterium tumefaciens.

II.2.1. Условия культивирования агробактериального штамма.

И.З. Методы агробактериалыюй трансформации.

11.3.1. Метод трансформации листовых дисков табака in vitro.

11.3.2. Метод трансформации незрелых зародышей гороха in vitro.

11.3.3. Метод трансформации цветков гороха in vivo.

И.3.4. Метод трансформации проростков гороха in planta.

11.4. Молекулярные методы.

11.4.1. Выделение геномной растительной ДНК.

11.4.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacteriam tumefaciens.

И.4.3. Выделение тотальной растительной РНК.

11.4.4. Постановка реакции обратной транскрипции.

11.4.5. ПЦР-анализ.

11.4.6. Разделение продуктов ПЦР-реакций методом электрофореза.

11.4.7. Экстракция цитоплазматических белков из растительного материала.

11.4.8. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония.

П.4.9. Диализ белковых проб.

И.4.10. Разделение белков методом электрофореза в ПААГ.

II.4.11. Окрашивание гелевых пластин.

И.4.12. Вестерн-блот анализ.

II.4.13. Дот-блот анализ.

11.5. Изучение активации иммунного ответа у лабораторных мышей.

11.5.1. Серологический анализ крови.

11.5.2. Иммуноферментный анализ.

И.6. Статистические методы и компьютерная обработка.

11.6.1. Статистические методы.

11.6.2. Построение денситограмм.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

III.1. Получение линий трансгенных растений табака — продуцентов у-интерферона, характеризующихся стабильным наследованием и высоким уровнем экспрессии гетерологичного гена.

III. 1.1. Анализ наследования гена у-интерферона у трансгенных растений табака (ТгТз).

III. 1.2. Анализ уровня и стабильности экспрессии гена у-интерферона у трансгенных растений табака (Т0-Т3).

III. 1.2.1. Анализ стабильности экспрессии гена у-интерферона у трансгенных растений табака (Ti-T3).Ill

III. 1.2.2. Изучение экспрессии гетерологичного гена у-интерферона у потомков исходных трансформантов InterB и Inter311 (ТГТ2) методом ПЦРанализа в реальном времени.

III. 1.3. Анализ белковых проб трансгенных растений табака семей Inter311 и

InterB.

III. 1.4. Изучение активации иммунного ответа у лабораторных мышей.

III. 1.4.1. Приготовление белкового экстракта, содержащего у-интерферон из трансгенных растений табака линии Inter.311.2.

III. 1.4.2. Анализ активности у-интерферона, выделенного из трансгенных растений линии Inter311.2 на лабораторных мышах.

III.2. Создание «съедобных» иммуномодуляторов на основе растений гороха.

111.2.1. Трансформация культуры гороха in vitro.

111.2.1.1. Изучение регенерационной способности растений гороха в условиях in vitro.

111.2.1.2. Изучение корнеобразования у растений гороха в условиях in vitro

111.2.1.3. Изучение влияния селективного агента Km на процесс трансформации и определение сублетальной концентрации Km для культуры гороха.

111.2.2. Трансформация гороха in vivo.

111.2.2.1. Трансформация цветка.

111.2.2.2. Трансформация проростков гороха in planta.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение трансгенных растений-продуцентов бычьего γ-интерферона"

Генетическая инженерия растений является относительно молодой и интенсивно развивающейся областью современной биотехнологии. Разработанные к настоящему времени методы молекулярной генетики и клеточной инженерии позволяют целенаправленно, по заранее намеченной программе модифицировать геном растения, используя генетическую информацию из разных геномов.

Одним из важных направлений в этой области является создание растений - продуцентов разнообразных фармакологических соединений. Оно позволяет сделать недорогими и, следовательно, общедоступными, многие фармацевтические препараты. В этом плане наилучшими продуцентами считаются микроорганизмы. Однако в ряде случаев существуют серьезные ограничения для использования микроорганизмов в качестве продуцентов фармакологических соединений. В этой ситуации растительные системы являются прекрасной альтернативой микроорганизмам.

При создании трансгенных растений и их внедрении в качестве коммерческих культур наиболее важным моментом является стабильное наследование и стабильно высокая экспрессия перенесенных генов. Показано, что в геноме трансгенных растений гетерологичные гены наследуются, как правило, доминантно по классическим законам Менделя (Potrykus et al., 1985; Budar et al., 1986). Однако функционирование целевых генов в окружении растительного генома может быть различным. Так, в литературе описано множество случаев широкой вариабельности экспрессии трансгенов среди индивидуальных трансформантов, а также случаи их полной инактивации. Таким образом, при создании растений-продуцентов необходимо комбинировать новейшие биотехнологические подходы с традиционными селекционно-генетическими методами, что позволит создавать высокоэффективные, стабильные растительные продуценты, необходимые для современного мира.

Актуальность проблемы. Данная диссертационная работа посвящена получению и изучению трансгенных растений табака и гороха, синтезирующих бычий у-интерферон.

1. Получение линий трансгенных растений табака - продуцентов у-интерферона, характеризующихся стабильным наследованием и высоким уровнем экспрессии гетерологичного гена: a. анализ наследования гетерологичного гена IFNG (ген кодирующий бычий у-интерферон) у трансгенных растений табака (Т0-Т3); b. анализ уровня и стабильности экспресиии гена IFNG у независимых трансформантов табака в ряду поколений Т0-Т3; c. анализ трансгенных растений табака на наличие гетерологичного белка у-интерферона.

3. Подбор оптимальных методов для получения трансгенных линий гороха, стабильно наследующих и экспрессирующих ген IFNG a. изучение способности к регенерации и трансформации сортов; b. подбор методов для укоренения регенерантов гороха; c. анализ трансгенных растений гороха на наличие и экспрессию гена IFNG в поколенях Т0-Т4.

Впервые предложена методика трансформации гороха in vitro, позволяющая получать трансгенные растения через 4 месяца: a. подобраны условия регенерации и укоренения при агробактериальной трансформации гороха in vitro; b. впервые использован метод опудривания ИМК (индолил-масляной кислотой) для укоренения регенерантов гороха.

Практическаяценность. Показано, что сконструированный агробактериальный вектор, содержащий ген бычьего у-интерферона под контролем конститутивного промотора 35S, может быть использован для 8 получения растений-продуцентов бычьего у-интерферона. Трансгенные линии табака и гороха, синтезирующие у-интерферон, могут быть использованы в качестве иммуномодуляторных средств в ветеринарии. Разработанная методика агробактериальной трансформации гороха in vitro, может быть использована для получения разнообразных продуцентов на основе данной культуры, а также для изучения молекулярной генетики гороха.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах: III-й съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва, 25-27 октября 2005 г.; вторая международная научно-практическая конференция "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности": Санкт-Петербург, 7-9 января 2006; 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых: "Биология — наука XXI века". Пущино, 17-21 апреля 2006; Международная научная школа — конференция молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях". Звенигород, 7-12 декабря 2008; V-й Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва, 16-20 марта 2009.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Савельева, Наталья Владимировна

выводы

1. Получены линии табака InterB и Inter311, характеризующиеся стабильным наследованием гетерологичного гена IFNG в поколениях Т0-Т3. Выявлена линия Inter311, гомозиготная по гену IFNG.

2. Среди трансгенных растений табака семей InterB и Inter311 (Ti) показана изменчивость экспрессии гена IFNG. Выявлены растения InterB.6.14 и Inter311.2.12, характеризующиеся стабильным наследованием (ТГТ3) и высоким уровнем экспрессии гетерологичного гена IFNG.

3. У трансгенных растений табака линий InterB и Inter311 методом Вестерн-блот гибридизации показано наличие белка массой 15 kDa, соответствующего у-интерферону.

4. Показана индукция иммунного ответа у мышей при проведении недельной терапии бычьим у-интерфероном, синтезированным в трансгенных растениях табака. Индукция иммунного ответа проявлялась в качественном изменении лимфоцитов периферической крови и повышении общего титра

5. Получены трансгенные растения гороха на основе сорта Адагумский, характеризующиеся стабильным наследованием гетерологичного гена IFNG в течение 4 поколений и синтезирующие бычий у-интерферон.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие новых методов исследований в генетике, расширение и углубление наших представлений о структуре и законах организации наследственного аппарата клетки привели к разработке принципиально новых генно-инженерных методов, позволяющих преодолевать естественные природные барьеры не только между отдаленными видами и родами, но и между различными гетерологичными системами. В настоящее время, данные подходы широко используются как в прикладных, так и в фундаментальных исследованиях, являясь основой новых направлений в фармакологической индустрии, растениеводстве и животноводстве.

Важным разделом биотехнологии является биотехнология растений, ранее базировавшаяся на методах традиционной селекции (гибридизации, полиплоидии, мутагенеза и др.), с помощью которых селекционеры получали на протяжении многих десятилетий и получают в настоящее время генетическое разнообразие растительного материала. Однако одним из недостатков методов традиционной селекции является проблема «лишнего» генетического груза, который попадает в растение вместе с целевым геном. Поэтому после создания растений необходима последующая работа по удалению «ненужных» генов, состоящая в серии возвратных скрещиваний. Подобный этап может занимать от 5 до 7 лет. Напротив, методы генной инженерии, позволяют переносить целевой ген без дополнительного генетического окружения. Однако при применении методов генной инженерии интеграция целевых генов в геном растения происходит случайным образом. Поэтому каждое трансгенное растение в данном случае является уникальным с точки зрения генетики. Таким образом, применение современных методов генной инженерии в биотехнологии растений не исключает, а только дополняет традиционные методы селекции, которые важны для отбора трансгенных растений с требуемыми признаками и свойствами.

В диссертационной работе мы показали важность проведения последующей селекции для создания линий трансгенных растений, стабильно наследующих и экспрессирующих целевой ген бычьего у-интерферона. В ходе работы было показано, что интеграция целевого гена IFNG преимущественно происходила в транскрипционно активные участки генома. Тем не менее, была выявлена изменчивость экспрессии гена IFNG у трансгенных растений разных семей в Т1—Т3. В ходе работы была проведена селекция гомозиготных по гену

152

IFNG растений, которые характеризовались стабильным наследованием и экспрессией гетерологичного гена и на основе которых была создана линия трансгенных растений, синтезирующих бычий у-интерферон.

Изучение биологической активности бычьего у-интерферона, выделенного из трансгенных растений табака, выявило индукцию иммунного ответа у мышей, проявляющегося в качественном изменении лимфоцитов периферической крови и повышении общего титра Ig. Необходимо отметить высокую степень консервативности у-интерферонов млекопитающих, поскольку бычий у-интерферон стимулировал иммунный ответ у мышей. Это указывает на возможность широкого применения препаратов бычьего у-интерферона. Развитие небольшой аллергической реакции, выявленной у животных, вероятно, связано с недостаточной очисткой препарата у-интерферона, проведенной нами. Таким образом, для безопасного применения данного белка для профилактики инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы у животных необходимо вводить дополнительную очистку растительного экстракта табака.

В ходе работы было показано, что бычий у-интерферон является нестабильным белком и значительные потери его количества могут происходить на различных этапах выделения и очистки. Мы показали также, что пероральное введение этого белка вызывает иммунный ответ у животных. Таким образом, создание растений-иммуномодуляторов, синтезирующих бычий у-интерферон является оптимальным решением для «производства» ветеринарного «препарата у-интерферона». Так, в ходе работы были получены трансгенные растения-иммуномодуляторы на основе гороха посевного, синтезирующие бычий у-интерферон. Созданию данных растений предшествовала большая работа по подбору условий регенерации и укоренения гороха in vitro. Впервые использован метод опудривания ИМК для укоренения регенерантов гороха. В результате была предложена оптимизированная методика агробактериальной трансформации in vitro для гороха посевного, с помощью которой можно получить трансгенные растения в более краткий срок, по сравнению с методами, описанными в литературе. Кроме того, применяя методы трансформации in vivo, мы получили трансгенные растения гороха, стабильно наследующие гетерологичный ген IFNG в ряду поколений Т0-Т4. Для этих растений показано присутствие белка у-интерферона. Таким образом, данные растения можно в дальнейшем использовать в качестве «съедобных» иммуномодуляторов в ветеринарии.

В заключении необходимо отметить, что созданный вектор, содержащий ген бычьего у-интерферона, оказался функциональным в растениях табака и гороха и может быть использован для создания растений-продуцентов биологически активной формы этого белка на основе различных ценных сельскохозяйственных культур.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савельева, Наталья Владимировна, Санкт-Петербург

1. Атауллаханов Р.И., Катлинский А.В., Холмс Р.Д., Мастернак Т.Б., Ларин А.С., Малкина Е.Ю., Шишкова Н.М. Усиление образования антител под влиянием иммуномодулятора Гептон // Иммунология. 2003. - № 1. — с. 911.

2. Бояринцев Л.Е. Разработка и применение препаратов интерферона и биологически активных добавок в ветеренарии // Дисс. на соиск. уч. ст. докт. ветер, наук/ Воронеж. 2003. 342 с.

3. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо // Соросовский образовательный журнал. 1996. - № 2. — С. 32-36.

4. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо // Соросовский образовательный журнал. — 1999. № 8. — С. 56-58.

5. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо // Соросовский образовательный журнал. 2000. - № 6. С. 25-34.

6. Величко Л.Н., Дегтяренко Т.В., Малецкий А.П. Изменение фагоцитарной активности моноцитов/макрофагов у больных увеальной меланомой при комплексной терапии, включающей Лаферон // Медицина. 1997. — Т. 5. — С. 348-351.

7. Высоцкий, В.А. Клональное микроразмножение растений// Культура клеток растений и биотехнология. 1989. - С. 91-102.

8. Глеба Ю.Ю. Биотехнология растений // Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 6. - С. 3-8.

9. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: принципы и применение // Москва: Мир. 2002. - 368 стр.

10. Грант В. Эволюционный процесс // Москва: Мир. 1989. - 589 с.

11. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филипенко Е.А. и др. Нестабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) при инбридинге // Генетика. 1998. - Т. 34, № 9. С. 1212-1219.

12. Дейнеко Е.В. Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений (на примере Nicotiana tabacum L.) // Дисс. на соиск. уч. ст. докт. ветер, наук / Новосибирск. 2004. - 354 с.

13. Долсон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика // Москва: Мир, 1991. - 386 стр.

14. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений // Москва: Мир. 1991. - 344 стр.

15. Дячук В.А., Одинцова Н.А., Киселев К.В. и др. Перенос Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens в эмбрионы и первичные клеточные культуры морских ежей // Вестник научно-образовательных центров. 2003. - № 3-4.- С. 26-32.

16. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии // Москва: Медицина. 1996. - 243 стр.

17. Ершов В.И. Наглядная гематология. / Ред. Ершов В.И. // Москва: ГЭОТАР-Медиа. 2008. - 116 е.: ил.

18. Золова О.Э., Рукавцова Е.Б., Бурьянов Я.И. и др. Создание трансгенных растений табака, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Биотехнология. 1999. - № 6. - С. 42-45.

19. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы // СПб: Гиппократ. 1992. - 105 стр.

20. Коляков Я.Е. Ветеренарная иммунология // Москва: Агропромиздат. 1986.- 86 стр.

21. Корн Г., Корн Т. Справочник по матеметике для научных работников и инженеров // Москва: Наука. 1973. - 832 е.: илл.

22. Корнева А.В., Рекославская Н.И., Саляев Р.К. Перенос соевого гена glsn в растения гороха Pisum sativum L. с помощью агробактериальной трансформации in planta // Вестник Башкирского университета.- 2001. № 2.-С. 14-16.

23. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия // Москва: Мир. 1969. - с. 541-543.

24. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений // Санкт-Петербург: СПбГУ. -2003.-243 стр.

25. Лутова Л.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений // Генетика. 1998. - Т. 34, № 2. - С. 165-182.

26. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н.и др. Генетика развития растений // Санкт-Петербург: Наука. 2000. -585 стр.: илл.

27. Малышев А.А. Женьшень: биология разведения //Москва: Агропромиздат. -1986.- 141 с.

28. Маренкова Т.В. Изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) // диссерт. на соискание уч. ст. канд. биол. наук. / Новосибирск. 2005. - 172 стр.

29. Медведева М.А. Клиническая ветеринарная лабораторная диагностика. Справочник для ветеринарных врачей. // Москва: Аквариум-Принт. 2008.- 416 е.: ил.

30. Монастырева Л.А., Ткач Т.А., Парфенов В.В. Усовершенствование технологии лабораторного биосинтеза гетерологичного интерферона // Биотехнология. 1985. - № 5. с. 48-51.

31. Неринг К. Полевые кормовые культуры // Москва: Мир. 1974 - 344 стр.

32. Павлова З.Б. Изучение роли гормонов в клубенькообразовании с использованием генетической коллекции гороха (Pisum sativum L.) // Дисс. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук / Санкт-Петербург. 1999. 127 с.

33. Парфенов В.В. Антипролиферативное действие свинного лейкоцитарного интерферона и ингибитора действия интерферона // Вопр. Вирусологии. — 1987. Т. 32, № 5. - С. 574-576.

34. Петров Р.В. Иммунология // Москва: Медицина. 1987. - 678 стр.

35. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений // Москва: Наука.- 1988.-348 стр.

36. Придыбайло Н.Д. Иммунодефицита у сельскохозяйственных животных и птиц. Профилактика и лечение их иммуностимуляторами // Москва: ВАСХНИЛ. 1991. - 78 стр.

37. Рукавцева Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я. и др. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Генетика. 2003. - Т. 39. - С. 51-56.

38. Рукавцева Е.Б., Бурьянов Я.И., Шульга Н.Я., Быков В.А. Трансгенные растения для- фармакологии // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2006. - № 2. - С. 3-12.

39. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии // СПб: СПбГУ. 1999. -324 стр.

40. Свердлов Е.Д. Биотехнология (Интерферон и новая биология) // Москва: Наука. 1984.-126 стр.

41. Сингер М., Берг П. Гены и геномы // Москва: Мир. 1998. - 528 стр.

42. Смирнов М;Н., Падкина М.В. Производство рекомбинантных белков человека на основе дрожжевых систем // Биотехнология: состояние и перспективы развития: тезисы докладов участников II Московского международного конгресса. — 2003. № 59. — С. 23-27.

43. Степанюк О.В. Производные амидов пиридинкарбоновых кислот как иммуностимулирующие средства при желудочно-кишечных болезнях телят // Автореферат / Киев: Укр. сельскохоз. акад. 1990. — 45 стр.

44. Турчинович А.А., Дейнеко Е.В., Филипенко M.JI. и др. Трансгенные растения как биопродуценты белков медицинского назначения // Вестник ВОГиС. 2004. - № 28. - С. 56-61.

45. Федоров Ю.Н., Верховский О.А. Иммунодефициты домашних животных // Москва: Москва 1996. - 83 стр.

46. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология // Москва: Медицина. 2000. - 624' стр.

47. Ченцов Ю.С. Общая цитология: введение в биологию клетки // Москва: МГУ. 1995.-215 стр.

48. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. // Саратов. 2001. - 324 стр.

49. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Крымский М.А. и др. Экспрессия поверхностного антигена вируса гепатита В в трансгенных растениях картофеля и его характеристика // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1422-1430.

50. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. и др. Использование трансгенных растений моркови продуцентов интерлейкина-18 человека для модуляции иммунных реакций у мышей // Бюллетень СО РАМН. -2008. - Т. 131, № 3. - С. 70-75.

51. Abidor I.G., Arakelian V.B., Pastushenko V.F., Tarasevich M.R., Chernomordik L.V. Electrical breakdown of lipid bilayer membranes // Dokl Akad Nauk SSSR: «Electrical breakdown of lipid bilayer membranes». 1978. T. 240. P. 733-736.

52. Abreu S., Kaplan P. Rat fibroblast derived interferin: production in serum free medium and enhancement by theophylline// J. Interferon Res. 1984. V. 4. № 2. P. 161-166.

53. Abuodeh R.O., Orbach M.J., Mandel M.A., Das A., Galgiani J.N. Genetic transformation of Coccidioides immitis facilitated by Agrobacterium tumefaciens // J. Infect. Dis. 2000. V. 181. P. 2106-2110.

54. Agius F., Gonzalez-Lamothe R., Caballero J.L. et al. Engineering increased vitamin С levels in plants by overexpression of a D-galacturonic acid reductase //Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 177-181.

55. Anderson W.F., Killos L., Sanders-Haigh L., Kretschmer P J., Diacumakos E.G. Replication and expression of thymidine kinase and human globin genes microinjected into mouse fibroblasts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - V. 77, №9.-P. 5399-5403.

56. Aragao F.J.L., Vianna G.R., Albino M.M.C., Rech E.L. Transgenic dry bean tolerant to the herbicide glufosinate ammonium // Crop Sci. — 2002. V. 42. — P. 1298-1302.

57. Arakawa Т., Chong D.K., Merritt J.L., Langridge W.H. Langridge W.H. Expression of cholera toxin В subunit oligomers in transgenic potato plants // Transgenic Res. 1997. - V. 6. - P. 403-413.

58. Arakawa Т., Yu J., Chong D.K. et al. A plant-based cholera toxin В subunit-insulin fusion proteinprotects against the development of autoimmune diabetes // Nat. Biotechnol. 1998. - V. 16. - P. 934-938.

59. Arakawa Т., Yu J., Langridge W.H. Synthesis of cholera toxin В subunit-rotavirus NSP4 fusion protein in potato // Plant Cell Rep. 2001. - V. 20. - P. 343-348.

60. Aziz M.A., Singh S., Anand Kumar P., Bhatnagar R. Expression of protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine against anthrax // BBRC. 2002. - V. 299. - P. 345-351.

61. Babaoglu M., Davey M.R., Power J.B. Genetic engineering of grain legumes: key transformation events // AgBiotechNet. 2000. - Y. 2. - P. 167-169.

62. Bacchetti S., Graham F. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74, № 4. - P. 1590-1594.

63. Bailey M., Miller B.G., Telemo E., Stokes C.R., Bourne F.J. Altered immune response to proteins fed after neonatal exposure of piglets antigen // Int. Arch. Allergy Immunol. 1994. - V. 103, № 2. - P. 183-187.

64. Barta A., Sommergruber K., Thompson D. et al. The expression of a nopalin synthase human growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue // Plant Mol. Biol. 1986. - V. 6. - P. 347-357.

65. Barton K.A., Binns A.N., Matzke A.J., Chilton M.D. Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineering T-DNA, and transmission of T-DNA to R1 progeny // Cell. 1983. - V. 32. - P. 10331043.

66. Baruah-Wolff J., Harwood W.A., Lonsdale D.A., Harvey A., Hull R., Snape J.W. Luciferase as a reporter gene for transformation studies in rice (Oryza sativa L.) // Plant Cell Rep. 1999. - V. 18. - P. 715-720.

67. Bean S.J., Gooding P.S., Mullineaux P.M., Davies D.R. A simple system for pea transformation//Plant Cell Reports. 1997. -V. 16. - P. 513-519.

68. Beilmann A., Albrecht K., Shultze S., Wanner G., Pfitzner U.M. Activation of a truncated PR-1 promoter by endogenous enhancers in transgenic plants // Plant Mol. Biol. 1992. - V. 18. - P. 65-78.

69. Belanger H., Fleysh N., Cox S. et al. Human respiratory syncytial virus vaccine antigen produced in plants // FASEB J. 2000. - V. 14. - P. 2323-2328.

70. Biemann K. Structure of lysopine, a new amino-acid isolated from crown gall tissue // Biochim. biophys. Acta. 1960. - V. 40. - P. 369-370.

71. Binns A.N., Sciaky U., Wood H.N. Variation in hormone autonomy and regenerative potential of cells transformed by strain A66 of Agrobacterium tumefaciens // Cell 1982. - V. 31. - P. 605-612.

72. Binns A.N.,. Thomashow. M.F Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants I I Ann. Rev. Microbiol. 1988. - V. 42. - P. 575-606.

73. Boerjan W., Bauw G., Van Montagu M., Inze D. Distinct phenotypes generated by overexpression and suppression of S-adenosyl-L-methionine synthetase reveal developmental patterns of gene silencing in tobacco // Plant Cell. 1994. -V. 6.-P. 1401-1414.

74. Bohmer P., Meyer В., Jacobsen H.-J. Thidiazuron-induced high frequency of shoot induction and plant regeneration in protoplast derived pea callus // Plant Cell Reports. 1995. - V. 15. - P. 26-29.

75. Bouche F.B., Marquet-Blouin E., Yanagi Y. et al. Neutralising immunogenicity of a polyepitope antigen expressed in a transgenic food plant: a novel antigen to protect against measles // Vaccine. 2003. - V. 21. - P. 2074-2081.

76. Braun A.C. A physiological basis for autonomous growth of the crown-gall tumor cell // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1958. - V. 44. - P. 344-349.

77. Bravo-Angel A.M, Hohn В., Tinland B. The omega sequence of VirD2 is important but not essential for efficient transfer of the T-DNA by Agrobacterium tumefaciens // Mol. Plant-Microb. Interactions. 1998. - V. 11. - P. 57-63.

78. Briggs K., Zeitlin L., Wang F. et al. Anti-HSV antibodies produced in rice plants protect mice from vaginal HSV infection // Plant Biol. 2000. - V. 15. - P. 2532.

79. Bruyns A.M., De Jaeger G., De Neve M. et al. Bacterial and plant produced scFv proteins have similar antigen-binding properties // FEBS Lett. 1996. - V. 386. -P. 5-10.

80. Bucherna N., Okkels F.T., Palmgren C. Developmental timing of transgene expression in Arabidopsis thaliana using gene silencing mutants and matrix attachment regions // Plant J. 2004. - V. 39. - P. 440-449.

81. Budar F., Thiatoong L., Van Montagu M., Hernalsteens J.-P. Agrobacterium mediated gene transfer results mainly in transgenic plants transmitting T-DNA as a single Mendilian factor // Genetics. 1986. - V. 114. - P. 303-313.

82. Bundock P., den Dulk-Ras A., Beijersbergen A., Hooykaas P.J. Trans-kingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae //EMBO J. 1995. - V. 14. - P. 3206-3214.

83. Bundock P., Hooykaas P. J. J. Genetics Integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA in the Saccharomyces cerevisiae genome by illegitimate recombination//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996.-V. 93.-P. 15272-15275.

84. Cabanes-Macheteau M., Fitchette-Laine A.C., Loutelier-Bourhis C. et al. N-Glycosylation of a mouse IgG expressed in transgenic tobacco plants // Glycobiology. 1999. - V. 9. - P. 365-372.

85. Cangelosi G.A., Ankenbauer R.G., Nester E.W. Sugars Induce the Agrobacterium Virulence Genes Through a Periplasmic Binding Protein and a Transmembrane Signal Protein // PNAS. 1990. - V. 87. - P. 6708-6712.

86. Carrillo C., Wigdorovitz A., Oliveros J.C. et al. Protective immune response to foot-and-mouth disease virus with VP1 expressed in transgenic plants // J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 1688-1690.

87. Carrillo C., Wigdorovitz A., Trono K. et al. Induction of a virus-specific antibody response to foot and mouth disease virus using the structural protein VP1 expressed in transgenic potato plants // Virol. Immunol. 2001. - V. 14. — P. 49-57.

88. Castanon S., Martin-Alonso J.M., Marin M.S. et al. The effect of the promoter on expression of VP60 gene from rabbit hemorrhagic disease virus in potato plants // Plant Sci. 2002. - V. 162. - P. 87-95.

89. Chan M.-T., Chang H.-H., Ho S.-L., Tong W.-F., Yu S.-M. Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric alpha-amylase promoter/beta-glucuronidase gene // Plant Mol. Biol. -1993. V. 22. - P. 491-506.

90. Chang D.C., Reese T.S. Changes in membrane strucrture induced by electroporation as revealed by rapid-freezing electron microscopy // Biophys.J. -1990.-V. 58.-P. 1-12.

91. Chargelegue D., Vine N.D., Van Dolleweerd C.J. et al. A murine monoclonal antibody produced in transgenic plants with plant-specific glycans is not immunogenic in mice // Transgenic Res. 2000. - V. 9. - P. 187-194.

92. Chen L., Marmey P., Taylor N.J., Brizard J., Espinoza C., D'Cruz P., Huet H., Zhang S., de Kochko A., Beachy R.N., Faquet C.M. Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants // Nature Biotech. 1998. - V. 16. - P. 1060-1064.

93. Chen L., Marmey P., Taylor N.J., Brizard J., Espinoza C., D'Cruz P., Huet H., Zhang S., de Kochko A., Beachy R.N., Faquet C.M. Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants // Nature Biotech. 1998. - V. 16. - P. 1060-1064.

94. Cheng, M., Fry J.E., Pang S., Zhou H., Hironaka C.M., Duncan D.R., Conner T.W., Wan Y. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens //Plant Physiol. 1997. - Y. 115. - P. 971-980.

95. Cheon B.Y., Kim H.J., Oh K.H. et al. Overexpression of human erythropoietin (EPO) affects plant morphologies: retarded vegetative'growth in tobacco and male sterility in tobacco and Arabidopsis // Transgenic Res. 2004. - V. 13. - P. 542-549.

96. Cherdshewasart W., Gharti-Chhetri G.B., Saul M.W. et al. Expression instability and genetic disorders in transgenic Nicotiana plumbaginifolia L. plants // Transgenic Research. 1993. - Y. 2. - P. 307-320.

97. Chikwamba R., Cunnick J., Hathaway D. et al. A functional antigen in apractical crop: LT-B producing maize protects-mice against Escherichia coli heat labile enterotoxin (LT) and cholera toxin (CT) // Ibid. 2002. - V. 11. - P. 497493.

98. Chikwamba R.K., Scott M.P., Mejia L.B. et al. Localization of a bacterial protein in starch granules of transgenic maize kernels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.-V. 100.-P. 11127-11132.

99. Chong D.K.X., Roberts W., Arakawa T. et al. Expression of the human milk protein (3-casein in transgenic potato plants // Transgenic Res. — 1997. — V. 6. — P. 289-296.

100. Chowrira G.M., Akella V., Lurquin P.F. Electroporation mediated gene transfer into intact nodal meristems in planta: generating transgenic plants without in vitro tissue culture // Mol. Biothecnol. 1995. - V.3. -P. 17-23.

101. Christie P.J., Ward J.E., Winans S.C., Nester E.W. The Agrobacterium tumefaciens virE2 gene product is a single-stranded-DNA-binding protein that associates with T-DNA // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 2659-2667.

102. Clausen R. E. Polyploidy in Nicotiana // Amer. Nat. J. 1941. - № 75. - P. 291—306.

103. Conrad U., Fiedler U. Compartment-specific accumulation of recombinant immunoglobulins in plant cells: an essential tool for antibody production and immunomodulation of physiological functions and pathogen activity // Plant.

104. Mol. Biol. 1998. - V. 38. - P. 101-109.

105. Cooper A. M., Dalton D.K., Stewart T.A., Griffin J.P., Russell D.G. and Orme I.M. Disseminated tuberculosis in interferon gamma genedisrupted mice // J. Exp. Med. 1993. -V. 178. - P. 2243-2247.

106. Cramer C.L., Weissenbom D.L., Oishi K.K. et al. Bioproduction of human enzymes in transgenic tobacco // Ann. NY Acad. Sci. 1996. - V. 792. - P. 6271.

107. Cregg J.M., Vedvick T.S., Raschke W.C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris // BioTechnology. 1993. - V. 11. - P. 905-910.

108. Curtis I.S. Transformation of radish (Raphanus sativus L.) via sonication and vacuum infiltration of germinated seeds with Agrobacterium harboring a group 3 LEA gene from B. napus // Plant Cell Report. 2002. - V. 24. - P 494-500.

109. Daniel K., Chong X., Langridge W.H.R. et al. Expression of full-length bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants // Transgenic Res.2000.-V. 9.-P. 71-78.

110. Daniell H., Lee S.B., Panchal Т., Weibe P.O. Expression of native cholera toxin В subunit gene and assembly as functional oligomers in transgenic tobacco chloroplasts // J. Mol. Biol. 2001. - V. 311. - P. 1001 -1009.

111. Darnell J.E.Jr., Kerr I.M., Stark G.R. Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signalling proteins // Science.- 1994.-V. 264.-P. 1415-1421.

112. Davies D.R., Hamilton J., Mullineaux P. Transfonnation of pea // Plant Cell Reports.-1993.-V. 12.-P. 180-183.

113. Day C.D., Lee E., Kobayashi J. et al. Transgene integration into the same chromosome location can produce alleles that express at a predictable level, or alleles that are differentially silenced // Genes Dev. 2000. - V. 14. - P. 28692880.

114. De Cosa В., Moar W., Lee S. et al. Overexpression of Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals // Nature Biotechnol.2001.-V. 19.-P. 71-74.

115. De Duve C. The lysosome // Sci. Am. 1963. - V. 208. - P. 64-72.

116. De Groot M.J., Bundock P., Hooykaas P.J., Beijersbergen A.G. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi // Nat. Biotechnol. -1998.-V. 11.-P. 839-842.

117. De Jaeger G., Scheffer S., Jacobs A. et al. Boosting heterologous protein production in transgenic dicotyledonous seeds using Phaseolus vulgaris regulatory sequences // Nat. Biotechnol. 2002. - V. 20. - P. 1265-1268.

118. De la Riva G.A., Gonzalez-Cabrera J., Vazquez-Padron R., Ayra-Padro C. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation // EJB -1998.-V. 1, № 3. -P. 118-133.

119. De Neve M., De Loose M., Jacobs A. et al. Assembly of an antibody fragment in N. tabacum and Arabidopsis // Transgenic Res. 1993. - V. 2. - P. 227-237.

120. De Neve M., De Buck S., Jacobs A., Van Montagu M., Depicker A. T-DNA integration patterns in co-transformed plant cells suggest that T-DNA repeats originate from co-integration of separate T-DNAs // Plant J. 1997. - V. 11. - P. 15-29.

121. Dehio C., Schell J. Stable expression of a single-copy rolA gene in transgenic Arabidopsis thaliana plants allows an exhaustive mutagenic analysis if the transgene-associated phenotype // Mol. Gen. Genet. 1993. - V. 241. - P. 359366.

122. De Kathen A., Jacobsen H.-J. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Pisum sativum L. using binary and cointegrate vectors // Plant Cell Reports. 1990. - V. 9. - P. 276-279.

123. De Kathen A., Jacobsen H.-J. Cell competence for Agrobacterium-mediated DNA transfer in Pisum sativum L. // Transgenic Research. 1995. - V. 4. - P. 184-191.

124. Delores S.C., Gardner R.C. Expression and inheritance of kanamicin resistance in large number of transgenic petunias ganerated by Agrabacterium-mediated transformation // Plant Mol. Biol. 1988. - V. 11. - P. 355-364.

125. Desai U.A., Sur G., Daunert S. et al. Expression and affinity purification of recombinant proteins from plants // Protein Expr. Purif. 2002. - V. 25. - P. 195-202.

126. Desfeux C., Clough S.J., Bent A.F. Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method // Plant Physiol. 2000. - V. 123. - P. 895-904.

127. De Wilde C., de Neve M., de Rycke R. et al. Intact antigen-binding MAK33 antibody and Fab fragment accumulate in intercellular spaces of A. thaliana // Plant Sci. 1996. - Vol. 114. - P. 233-241.

128. D'Halluin, К. et al. Transformation of sugarbeet {Beta vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants // Biotechnology. 1992. -V. 10.-P. 309-314.

129. Diacumakos E.G., Holland S., Pecora P. A microsurgical methodology for human cells in vitro: evolution and applications // Proc Natl Acad Sci USA. -1970.-V. 65, №4. -P. 911-918.

130. Dieryck W., Pagnier J., Poyart C. et al. Human haemoglobin from transgenic tobacco // Nature. 1997. - V. 386. - P. 29-30.

131. Ducreux L.J.M., Morris W.L., Hedley P.E. et al. Metabolic engineering of high carotinoid potato tubers containing enhanced levels of b-carotene and lutein // J. Exp. Bot. 2005. - V. 56. - P. 81-89.

132. Dus Santos M.J., Wigdorovitz A., Trono K. et al. A novel methodology to develop a foot and mouth disease virus (FMDV) peptide-based vaccine in transgenic plants // Vaccine. 2002. - V. 20. - P. 1141-1147. '

133. Edelbaum O., Stein D., Holland N. et al. Expression of active human interferon-beta in transgenic plants // J. Interferon Res. 1992. - V. 12. - P. 449-453.

134. Egusa S., Otani H. Soybean protein fraction digested with neutral protease preparation, "Peptidase R", produced by Rhizopus oryzae, stimulates innate cellular immune system in mouse // Int. Immunopharmacol. — 2009. V. 9. — P. 78-79.

135. Ehsani P., Khabiri A., Domansky N.N. Polypeptides of hepatitis В surface antigen produced in transgenic potato // Gene. 1997. - V. 190. - P. 107-111.

136. Fagard M., Vaucheret H. (Trans)gene silensing in plants: how many mechanisms? // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. - V. 51. - P. 167-194.

137. Faye L., Gomord V., Fitchette-Laine A.C., and Chrispeels M.J. Affinity purification of antibodies specific for Asn-linked glycans containing alpha 1 —> 3 fiicose or beta 1 xylose // Anal. Biochem. 1993. - V. 209. - P. 104-108.

138. Faye L., Gomord V., Fitchette-Laine A.C., and Chrispeels MJ. Affinity purification of antibodies specific for Asn-linked glycans containing alpha 1 —> 3 fucose or beta 1 -> xylose // Anal. Biochem. 1993. - V. 209. - P. 104-108.

139. Fearing P.L., Brown D., Vlachos D., Meghji M., Privalle L. Quantitative analysis of CrylA(b) expression in Bt maize plants, tissues, and silage and stability of expression over successive generations II Mol. Breed. 1997. - V. 3. -P. 169-176.

140. Fernandez-San-Millan A., Mingo-Castel A., Miller M., Daniell H. A chloroplast transgenic approach to hyperexpress and purify human serum albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation // Plant Biotechnol. 2003. - V. 1. -P. 77-79.

141. Flynn J. L., Chan J., Triebold K.J., Dalton D.K., Stewart T.A. and Bloom B.R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection // J. Exp. Med. 1993. - V. 178. - P. 2249-2253.

142. Forsbach A., Schubert D., Lechtenberg B. et al. Comprehensive characterization of single-copy T-DNA insertions in the Arabidopsis thaliana genome // Plant Mol. Biol. 2003. -V. 52. - P. 161-176.

143. Franconi R., Di Bonito P., Dibello F. et al. Plant-derived human papillomavirus 16 E7 oncoprotein induces immune response and specific tumor protection // Cancer Res. 2002. - V. 62. - P. 3654-3658.

144. Frolova N.V., Matveeva T.V., Lutova L.A. Method of in vivo agrobacterial transformation of radish plants for obtaining the phenocopies of tumor formation in Raphanus sativus L. non-tumorous line // Biotechnology (Russia). 2004. -V. 4:-P. 3-7.

145. Fromm E.M., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1985. V. 82. - P. 5824-5825.

146. Fullner K.J., Nester E.W. Temperature affects the T-DNA transfer machinery of Agrobacterium tumefaciens // J. of Bacterid. 1996. - V. 178, № 6. - P. 14981504.

147. Gao Y., Ma Y., Li M. et al. Oral immunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg // World J. Gastroeterol. 2003. - V. 9. - P. 9961002.

148. Garfinkel D.J. Simpson R.B., Ream L.W., White F.F., Gordon M.P., Nester E.W. Genetic analysis of crown gall: Fine structure map of the T-DNA by site directed mutagenesis // Cell. 1981. -V. 27. - P. 143-153.

149. Gatz C., Quail P.H. TnlO-encoded tet repressor can regulate an operator-containing plant promoter // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 1394-1397.

150. Gelvin S.B. Agrobacterium VirE2 Proteins Can Form a Complex with T Strands in the Plant Cytoplasm // J. Bacteriol. 1998. -V. 180, № 16. - P. 4300-4302.

151. Gelvin S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "Gene-Jockeying" tool // Microbiol, and Mol. Biol. Rev. 2003. -V. 67. - P.16.37.

152. Gemmill T.R., Trimble R.B. (1999) Overview of N- and O- linked oligosaccharide structures found in various yeast species // Biochim. Biophys. Acta.-1999.-V. 1426.-P. 227-237.

153. Cereghino L.J., Cregg, J.M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V. 24. -P. 45-66.

154. Giddings G., Allison G., Brooks D., Carte A. Transgenic plants as factors for biopharmaceuticals//Nature Biotechnol. 2000. - V. 18.-P. 1151-1155.

155. Gil F., Brun A., Wigdorovitz A. et al. High-yield expression of a viral peptide vaccine in transgenic plants // FEBS Lett. 2001. - V. 488. - P. 13-17.

156. Glaser R.W., Leikin S.L., Chernomordik L.V., Pastushenko V.F., Sokirko A.I. Reversible electrical breakdown of lipid bilayers — formation and evolution of pores // Biochimica Et Biophysica Acta. 1988. - Y. 940. - P. 275-287.

157. Glausen R.E. Monosomic analysis in Nicotiana tabacum // Genetics. 1941. — V. 26.-P. 145.

158. Goldmann A., Thomas D.W., Morel G. C. R. The Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid as a host vector system for introducing foreign DNA in plant cells // Acad. Sci. (Ser. D) 1969. -V. 268. - P. 852-854.

159. Gomez N., Carillo C., Salinas J. et al. Expression of immunogenic glycoprotein S polypeptides from transmissible gastroenteritis coronavirus in transgenic plants // Virology. 1998. - V. 249. - P. 352-358.

160. Gomord V., Chamberlain P., Jefferis R., Faye L. Biopharmaceutical production in plants: problems, solutions and opportunities // Trends Biotechnol. 2005. -V. 23.-P. 559-565.

161. Graham F.L., Van der Eb A.J. "A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA" // Virology. 1973. - V. 52, № 2. - P. 456-457.

162. Grant J.E., Cooper P.A., McAra A.E., Frew T.J. Transformation of peas (Pisurn sativum. L.) using immature cotyledons // Plant Cell Reports. 1995. - V. 15. — P. 254-258.

163. Gutierrez-Ortega A., Avila-Moreno F., Saucedo-Arias L.J. et al. Expression of a single-chain human interleukin-12 gene in transgenic tobacco plants and functional studi // Biotechnol. and Bioeng. 2004. - V. 85. - P. 734-740.

164. Halfhill M.D., Millwood R.J., Rufty T.W. et al. Spatial and temporal patterns of green fluorescent protein (GFP) fluorescence during leaf development in transgenic oilseed rape, Brassica napus L. // Plant Cell Rep. 2003. - V. 22. - P. 338-343.

165. Haq T.A., Mason H.S., Clements J.D., Arntzen C.J. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants // Science. 1995. — V. 268.-P. 714-716.

166. Hellwig S,3 Drossard J., Twyman R.M., Fischer R. Plant cell* cultures for the production of recombinant proteins // Nature Biotechnology. 2004. — № 22. -P. 1415-1422.

167. Herberl-Bors E., Charvat В., Thompson D. et al. Genetic analysis of T-DNA insertions into the tobacco genome // Plant Cell Reports 1998. - V. 7.- P. 571574.

168. Herrera-Estrella L., Depicker A., van Montagu M., Schell J. Expression of chimeric genes transferred into plant cells using a Ti-plasmid-derived vector // Nature. 1983. - V. 303. - P. 209-213.

169. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plan // Nature. 1989. - V. 342. - P. 76-78.

170. Hiei Y., Komari Т., Kubo T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens // Plant Molecular Biology. 1997. - V. 35. - P. 205-218.

171. Higo K., Saito Y., Higo H. Expression of a chemically synthesized gene for human epidermal growth factor under the control of cauliflower mosaic virus17035S promoter in transgenic tobacco // Biosci. Biotech. Biochem. 1993. - V. 57.-P. 1477-1481.

172. Hildebrand E.M. Cane gall of brambles caused by Phytomonas n. sp. II J. Agric. Sci. 1940. - V. 61. - P. 685-698.

173. Hood E.E., Witcher D.R., Maddock S. et al. Commercial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and purification // Mol. Breeding. 1997. - V. 3. - P. 291-306.

174. Hood E.E., Woodard S.L., Horn M.E. et al. Monoclonal antibody manufacturing in transgenic plants myths and realities // Current Opinion Biotechnol. - 2002. -V. 13.-P. 630-635.

175. Horsh R.B., Fraley R.T., Rogers S.G. et al. Inheritance of functional foreign genes in plants // Science. 1984. - V. 223. - P. 496-498.

176. Huang Z., Dry I., Webster D. et al. Plant-derived measles virus hemagglutinin protein induces neutralizing antibodies in mice // Vaccine. 2001. - V. 19. - P. 2163-2171.

177. Ihle J.N. Cytokine receptor signaling // Nature. 1995. - V. 377. - P. 591-594.

178. Ihle J.N. Cytokine receptor signaling // Nature. 1995. - V. 377. - P. 591-594.186.1nze D., Follin A., van Lijsebettens M., Simoens C., Genetello C., van Montagu

179. Jani D., Meena L.S., Rizwan-ul-Haq Q.M. et al. Expression of cholera toxin В subunit in transgenic tomato plants // Transgenic Res. 2002. - V. 11. - P. 447454.

180. Jin S.G., Prusti R.K., Roitsch T. et al. Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: essential role in biological activity of VirG // J. Bacterid. 1990. - V. 172, № 9. - P. 4945-5490.

181. Jorgensen R.A. Cosupression, flower color patterns, and metastable gene expression states // Science. 1995. -V. 268. - P. 686-691.

182. Kalogeraki V.S, Winans S.C. Wound-Released Chemical Signals May Elicit Multiple Responses from an Agrobacterium tumefaciens Strain Containing an Octopine-Type Ti Plasmid // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 5660-5667.

183. Kanemoto R.H., Powell A.T., Akiyoshi D.E., Regier D.A. et al. Nucleotide sequence and analysis of the plant-inducible locus pinF from Agrobacterium tumefaciens И J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 2506-2512.

184. Kang T.J., Loc N.H., Jang M.O. et al. Expression of the В subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization // Ibid.-2003.-V. 12.-P. 683-691.

185. Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M. et al. A plant-derived edible vaccine against hepatitis В virus // FASEB J. 1999. - V. 13. - P. 1796-1799.

186. Karasev A.V., Foulke S., Wellens C. et al. Plant based HIV-1 vaccine candidate: Tat protein produced in spinach // Vaccine. 2005. - V. 23. - P. 1875-1880.

187. Kathuria S., Sriraman R., Nath R. et al. Efficacy of plant-produced recombinant antibodies against HCG // Human Reproduction. 2002. - V. 17. - P. 20542061.

188. Khoudi H., Laberge S., Ferullo J.M. et al. «Khoudi H., Laberge S., Ferullo J.M. et al. Biothechlogy aspects of plants // Biotechnol Bioeng. 1999. - V. 64. — P. 135-143.

189. Kikkert J.R., Humiston G.A., Roy M.K., Sanford J.C. Biological projectiles (phage, yeast, bacteria) for genetic transformation of plants. In vitro cellular and developmental biology // Plant. 1999, - V. 35. - P. 43-50.

190. Kilby N.J., Leyser H.M.O., Furner I.J. Promoter methylation and progressive transgene inactivation in Arabidopsis // Plant Mol. Biol. 1992. - V. 20. - P. 103-112.

191. Kim T.-G., Langridge W.H.R. Synthesis of an HIV-1 Tat transduction domain-rotavirus enterotoxin fusion protein in transgenic potato // Plant Cell Rep. -2004.-V. 22.-P. 382-387.

192. Kim S.M., Lee, J.S. Lee, Y.H. Kim W.J., Do S.I., Choo Y.K., Park Y.I. Increased a(2,3)-Sialylation and hyperglycosylation of N-glycans in embryonic rat cortical neurons during Camptothecin-induced apoptosis // Mol. Cells -2007.-V. 24.-P. 416-423.

193. Kinosita К Jr., Tsong T.Y. Formation and resealing of pores of controlled sizes in human erythrocyte membrane // Nature. 1977. — V. 268. - P. 438-441.

194. Kisung K., Mi-Hyun A., Mira S., Young-Kug C., Hyun S. K., Kinarm K., Hyouk J. Glyco-engineering of Biotherapeutic Proteins in Plants // Mol. Cells. 2008. — V. 25, №4.-P. 494-503.

195. Klein Т., Wolf D., Wu R., Sanford J. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells //Nature. 1987. - V. 327. - P. 70-72.

196. Klenchin V.A., Sukharev S.I., Serov S.M., Chernomordik L.V., Chizmadzhev Y.A. Electrically induced DNA uptake by cell is a fast process involving DNA electrophoresis // Biophys. J. 1991. - V. 60. - P. 804-811.

197. Klouda L., Mikos A.G. Thermoresponsive hydrogels in biomedical applications // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008. - V. 68, № 1. - p. 34-45.

198. Ко К., Tekoah Y., Rudd P.M. et al. Function and glycosyl'ation of plant-derived antiviral monoclonal antibody // Proc. Natl. Acad. Sci. USA/ 2003. - V. 100. -P. 8013-8018.

199. Kohli A., Gahakwa D., Vain P. et al. Transgene expression in rice engineered through particle bombardment: molecular factors controlling stable expression and transgene silencing // Planta. 1999. - V. 208. - P. 88-97.

200. Kong Q., Richter L., Yang Y.F. et al. Oral immunization with hepatitis В surface antigen expressed in transgenic plants // Ibid. 2001. - V. 90. - P. 11539-11544.

201. Koprivova A., Stemmer C., Altmann F., Hoffmann A., Kopriva S., Gorr G., Reski R., Decker E.L. Targeted knockouts of Physcomitrella lacking plant specific immunogenic N-glycans // Plant Biotech. 2004. - V. 2. - P. 517-523.

202. Krause C.D., He W., Kotenko S., Pestka S. Modulation of the activation of Statl by the interferon-gamma receptor complex // Cell Res. 2006. - V. 16, № 1. -P. 113-123.

203. Kumagai M.H., Turpen Т.Н., Weinzenl N. et al. Rapid high level expression of biologically active alpha-trichosanthin in transfected plants by an RNA viral vector // Ibid. 1993. - V. 90. - P. 427-430.

204. Kumar S., Fladung M. Transgene integration in aspen: structures of integration sites and mechanism of T-DNA integration // Plant J. 2002. - V. 31. - P. 543.

205. Kumar G.B.S., Ganapathi T.R., Revathi C.J. et al. Expression of hepatitis В surface antigen in transgenic banana plants // Planta. 2005. - V. 222. - P. 484493.

206. Kunik Т., Tzfira Т., Kapulnik Y. et al. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium // J. Biol. Chem. 2001. - V. 98. - P. 32-43.

207. Kurosaka A., Yano A., Itoh N., Kuroda Y., Nakagawa Т., Kawasaki T. The structure of a neural specific carbohydrate epitope of horseradish peroxidase recognized by antihorseradish peroxidase antiserum // J. Biol. Chem. 1991. -V. 266.-P. 4168-4172.

208. Kusnadi A.R., Nikolov Z.L., Howard J.A. Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations // J. Biol. Chem. 1997. - V. 56. - P. 437-484.

209. Kwon Т.Н., Seo J.E., Kim J. et al. Expression and secretion of the heterodimeric protein interleukin-12 in plant cell suspension culture // Biotechnol. and Bioeng. -2003. V. 81.-P. 870-875.

210. Kysely W., Jacobsen H.-J. Somatic embryogenesis from pea embryos and shoot apies //Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1990. - V. 20. - P. 7-14.

211. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during te assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-683.

212. Lamphear B.J., Streatfield S.J., Jilka J.A. et al. Delivery of subunit vaccines in maize seed // J. Control. Release. 2002. - V. 85. - P. 169-180.

213. Lamphear B.J., Jilka J.M., Kesl L. et al. A corn-based delivery system for animal vaccines: an oral transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in swine // Vaccine. 2004. - V. 22. - P. 2420-2424.

214. Larrick J.W., Yu L., Naftzger C. et al. Production of secretory IgA antibodies in plants // BiomoLEng. 2001. -V. 18. - P. 87-94.

215. Lauterslager T.G., Florack D.E., van der Wal T.J. et al. Oral immunisation of naive and primed animals with transgenic potato tubers expressing LT-B // Vaccine. 2001/ - V. 19. - P. 2749-2755.

216. Lee Y.W., Jin S., Sim W.S., Nester E.W. The sensing of plant signal molecules by Agrobacterium: genetic evidence for direct recognition of phenolic inducers by the VirA protein // Gene. 1996. - V. 179, № 1. - P. 83-86.

217. Lee Y.W., Jin S., Sim W.S., Nester E.W. The sensing of plant signal molecules by Agrobacterium: genetic evidence for direct recognition of phenolic inducers by the VirA protein // Gene. 1996. - V. 179, № 1. - P. 83-86.

218. Leelavathi S., Reddy V.S. Chloroplast expression of His-tagged GUS-fusions: a general strategy to overproduce and purify foreign proteins using transplastomic plants as bioreactors // Mol. Breeding. 2003. - V. 11. - P. 49-58.

219. Leemans J., Deblaere R., Willmitzer L., DeGreve H., Hernalsteens J.P., van Montagu M., Schell J. Genetic Identification of functions of TL-DNA transcripts in octopine crown galls // EMBO J. 1982. - V. 1, № 1. - P. 147-152.

220. Lehrman M.A., Schneider W.J., Siidhof T.C., Brown M.S., Goldstein J.L., Russell D.W. Mutation in LDL receptor: Alu-Alu recombination deletes exons encoding transmembrane and cytoplasmic domains // Science. 1985. - V. 227, №4683.-P. 140-146.

221. Leite A., Kemper E.L., da Silva M.J. et al. Expression of correctly processed human growth hormone in seeds of transgenic tobacco plants // Mol. Breeding. — 2000.-V. 6.-P. 47-53.

222. Letchovith G.I., Carmichae L.E. The effect of temperature on production and function of bovine interferons // Arch. Virol. 1984. - V. 82, № 3-4. - P. 211221.

223. Lev6e V., Garin E. , Klimaszewska K., Seguin A. Stable genetic transformation of white pine (Pinus strobus L.) after cocultivation of embryogenic tissues with Agrobacterium tumefaciens // Mol. Breed. 1999. - V. 5. P. 429-440.

224. Linn F., Heidmann I., Saedler H., Meyer P. Epigenetic changes in the expression of the maize Al gene in Petunia hybrida: role of numbers of integrated copies and state of methylation // Mol. Gen. Genet. 1990. - V. 222. - P. 329-336.

225. Littman S.J., Faltynek C.R., Baglioni C. Binding of human recombinant interferon-g to receptors on human cells // Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 1191-1195.

226. Liu Y.L., Wang J.F., Qiu B.S. et al. Expression of human hepatitis В virus surface antigen gene in transgenic tobacco // Sci. China B. 1994. - V. 37. - P. 37-41.

227. Loiseau J., Marche C., Le Deunff Y. Effects of auxins, cytokinins, carbohydrates and amino acids on somatic embryogenesis induction from shoot apices of pea // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995. - V. 41. - P. 267-275.

228. Loopstra C.A., Stomp A.M., Sederoff R.R. Agrobacterium-mediated DNA transfer in sugar ine // Plant Mol. Biol. 1990. - V. 15, № 1. - P. 1-9.

229. Lorence A., Verpoorte R. Gene transfer and expression in plants // Methods Mol.Biol. 2004. - V. 267. - P. 329-350.

230. Lowe K., Bowen В., Hoerster G., Ross M., Bond D., Pierce D., Gordon-Kamm B. Germline transformation of maize following manipulation of chimeric shoot meristems // Biotechnology. 1995. -V. 13. - P. 677-681.

231. Lunsdorf M.M., Rempel H., Jackson J.A., Baliski D.S., Hobbs S.L.A. Optimizing the production of transformed pea (Pisum sativum L.) callus using disarmed Agrobacterium tumefacience strains // Plant Cell Reports. 1991. - V. 9.-P. 479-483.

232. Lutova L.A., Pavlova Z.B., Ivanova M.M. Agrobacterium-transformation as a way to change hormonal metabolism in higher plants // Russian J. of Genetics. -1998.-V. 34, №2.-P. 109-123.

233. Ma J.K.C., Lherner Т., Stabila P. et al. Assembly of monoclonal antibodies with IgGl and IgA heavychain domains in transgenic tobacco plants // J. Immunol. -1994.-V. 4.-P. 131-138.

234. Ma J.K.C., Hikmat B.Y., Wycoff K. et al. Characterization of a recombinant plant monoclonal secretory antibody and preventive immunotherapy in humans // Nat. Med. 1998. - V. 4. - P. 601-606.

235. Ma J.K., Drake P.M., Christou P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants // Nat. Rev. 2003. - V. 4. - P. 794-805.

236. Ma Y., Lin S.-Q., Gao Y. et al. Expression of ORF2 partial gene of hepatitis E virus in tomatoes and immunoactivity of expression products // World J. Gastroeterol. 2003. - V. 9. - P. 2211-2215.

237. Magnuson N.S., Linzmaier P.M., Reeves R. et al. Secretion of biologically active human interleukin-2 and interleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension culture // Protein Expr. Purif. 1998. — V. 13. - P. 45-52.

238. Marusic C., Rizza P., Lattanzi L. et al. Chimeric plant virus particles as immunogens for inducing murine and human immune responses against human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 2001. - V. 75. - P. 8434-8439.

239. Mason H.S., Lam D.M.K., Arntzen C.J. Expression of hepatitis В surface antigen in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 11745-11749.

240. Mason H.S., Ball J.M., Shi J.J. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice // Ibid. — 1996. V. 93. - P. 5335-5340.

241. Mason H.S., Haq T.A., Clements J.D., Arntzen C.J. Edible vaccine protects mice against E.coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene //Vaccine.- 1998.- V. 16.-P. 1336-1343.

242. Matoba N., Magerus A., Geyer B.C. et al. A mucosally targeted subunit vaccine candidate eliciting HIV-1 transcytosis-blocking Abs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2004.-V. 101.-P. 13584-13589.

243. Matsumoto S., Ikura K., Ueda M., Sasaki R. Characterization of a human glycoprotein (erythropoietin) produced cultured tobacco cells // Plant Mol. Biol. 1995. - V . 27. - P.l 163-1172.

244. Matzke M., Priming M., Trnovsky J., Matzke A. Reverseble methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed plants // EMBO J. -1989.-V. 8.-P. 643-649.

245. Matzke M.A., Matzke A.J.M. Gene interactions and epigenetic variation in transgenic plants // Developmental Genetics 1990. - V. 11. - P. 214-223.

246. Matzke M.A., Matzke A.J.M. How and why do plants inactivate homologous (Trans) genes // Plant Physiol. 1995. - V. 107. - P. 679-685.

247. McCabe M., Mohapatra U.B., Debnath S.C. et al. Integration, expression and inheritance of two linked T-DNA marker genes in transgenic lettuce // Molecular Breeding. 1999. - V. 5. - P. 329-344.

248. McCormick A.A., Kumagai M.H., Hanley K. et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 703-708.

249. McGarvey P.B., Hammond J., Dienelt M.M. et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes // Biotechnology. 1995. - V. 13. - P. 1484-1487.

250. Medina-Bolivar F., Wright R., Funk V. et al. A non toxic lectin for antigen delivery of plant-based mucosal vaccines // Vaccine. 2003. - V. 21. - P. 9971005.

251. Melchers L., Maroney M.J., Dulk-Ras A., Thompson D.S. et al. Octopine and nopaline strains of Agrobacterium tumefaciens differ in virulence; molecular characterization of the virF-locus // Plant Mol. Biol. 1990. - V. 14. - P. 249259.

252. Melikov K.C., Frolov V.A., Shcherbakov A., Samsonov A.V., Chizmadzhev Y.A., Chernomordik L.V. Voltage-induced nonconductive pre-pores and metastable single pores in unmodified planar lipid bilayer // Biophys. J. 2001. -V. 80.-P. 1829-1836.

253. Menage A., Morel G. C. R. On the presence of octopine in crown-gall // Acad. Sci. 1964. - V. 259. - P. 4795-4796.

254. Menassa R., Nguyen V., Jevnikar A., Brandle J. A self-contained system for the field production of plant recombinant interleukin-10 // Mol. Breeding. 2001. -V. 8.-P. 177-185.

255. Merle C., Perret S., Lacour T. et al. Hydroxylated human homotrimeric collagen I in Agrobacterium tumefaciens-mediated transient expression and in transgenic tobacco plant // FEBS Lett. 2002. - V. 515. - P. 114-118.

256. Mett V.L., Lochhead L.P., Reynolds P.H.S. Copper-controllable gene expression system for whole plants // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 90. - P. 4567-4571.

257. Meyer P., Linn F., Heidmann I. et al. Endogenous and environmental factors influence 35S promoter methylation of a maize Al gene construct in transgenic petunia and its colour phenotype // Mol. Gen. Genet. 1992. - V. 231. - P. 345352.

258. Meyer P. Transcriptional transgene silencing and chromatin conmponents // Plant Mol. Biol. 2000. - V. 43. - P. 221-234.

259. Meza Т., Kamfjord D., Hakelien A.-M. et al. The frequency of silencing in Arabidopsis thaliana varies highly between progeny of siblings and can be influenced by environmental factors // Transgenic Research. — 2001. V. 10. — P. 3-67.

260. Mittelsten S.O., Paszkowsky J., Potrykus I. Reverseble inactivation of a transgene in Arabidopsis thaliana // Mol. Gen. Genet. 1991. - V. 228. - P. 104-112.

261. Modelska A., Dietzschold В., Sleysh N. et al. Immunization against rabies with plant-derived antigen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 24812485.

262. Morino К., Olsen O.A., Shimamoto К. Silencing of an aleurone-specific gene in transgenic rice is caused by a rearranged transgene // Plant J. 1999. - V. 17. — P. 275-285.

263. Murray C., Sutherland P.W., Phung M.M. et al. Expression of biotin-binding proteins, avidin and streptavidin, in plant tissues using plant vacuolar targeting sequences // Transgenic Res. 2002. - V. 11. - P. 199-214.

264. Mushegian A., Shepherd R. Genetic elements of plant viruses as tools for genetic engineering // Microbiol. Rev. 1995. - V 12. - P. 548-578.

265. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-supression of homologous genes in trans // Plant Cell. 1990. - V. 2. - P. 279-289.

266. Nemchinov L.G., Liang T.J., Rifaat M.M. et al. Development of a plant-derived subunit vaccine candidate against hepatitis С virus // Arch. Virol. -2000. - V. 145.-P. 2557-2573.

267. Newell C.A. Plant transformation technology. Developments and applications // Mol. Biotechnol. 2000. - V. 16. - P. 53-65.

268. Neuhaus G., Spandenberg G., Mittelstein O. et al. Transgenic rapesee plants obtained by the microinjection of DNA into microspore-derived embryoids // Plant J. 1987. - V. 75. - P. 30-36.

269. Ooms G., Hooykaas P.J.J., Noleman G., Schilperoort R.A. Gene expression // Gene. 1981. - V. 14. - P. 33-50.

270. Pagny S., Cabanes-Macheteau M., Gillikin J.W. et al. Protein recycling from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum in plants and its minor contribution to calreticulin retention // Plant Cell. 2000. - V. 12. - P. 739-756.

271. Park Y., Cheong H. Expression and Production of Recombinant Human Interleukin-2 in Potato Plants // Protein Expr. Purif. 2002. - V. 25. - P. 160165.

272. Parmenter D.L., Boothe J.G., van Rooijen G.J.H. et al. Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning // Plant Mol. Biol. 1995.-V. 29.-P. 1167-1180.

273. Pawlowski W.P., Somers D.A. Transgene inheritance in plants genetically engineered by microprojectile bombardment // Mol. Biotech. — 1996. V. 6. - P. 17-30.

274. Peeters K., De Wilde C., Depicker A. Highly efficient targeting and accumulation of a Fab fragment within the secretory pathway and apoplast of A. thaliana // Eur. J. Biochem. 2001. - V. 268. - P. 4251-4260.

275. Perrin Y., Vaquero C., Gerrard I. et al. Transgenic pea seeds as bioreactors for the production of a single-chain Fv fragment (scFV) antibody used in cancer diagnosis and therapy // Mol. Breeding. 2000. - V. 6. - P. 345-352.

276. Pestka S., Langer J.A., Zoon K.C., Samuel C.E. Interferons and their actions // Ann. Rev. Biochem. 1987. - V. 56. - P. 727-777.

277. Piers K.L., Heath J.D., Liang X., Stephens K.M., Nester E.W. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. V. 93.-P. 1613-1618.

278. Pniewski T. Kapusta J. Efficiency of transformation of Polish cultivars of pea (Pisum sativum L.) with various regeneration capacity by using hypervirulent Agrobacterium tumefaciens strains // Journal of applied genetic. 2005. - V. 46, №2.-P. 139-147.

279. Pogrebnyak N., Golovkin M., Andrianov V. et al. Severe acute respiratory syndrome (SARS) S protein production in plants: Development of recombinant vaccine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - P. 9062-9067.

280. Polowick P.L., Vandenberg A., Mahon J.D. Field assessment of outcrossing from transgenic pea (Pisum sativum L.) plants // Transgenic Research. 2000. -V. l.-P. 515-519.

281. Porta C., Spall V., Lin T. et al. The development of cowpea mosaic virus as a potential source of novel vaccines // Intervirology. — 1996. V. 39. - P. 79-84.

282. Potrykus I., Paszkowski J., Saul M. et al. Molecular and general genetics of a hybrid foreign gene introduced into tobacco by direct gene transfer // Mol. Gen. Genet.- 1985.-V. 199.-P. 169-177.

283. Риеуо J.J., Chrispeels M.J., Herman E.M. Degradation of transport-competent destabilized phaseolin with a signal for retention in the endoplasmic reticulum occurs in the vacuole // Planta. 1995. - V. 196. - P. 586-596.

284. Puonti-Kaerlas J., Eriksson Т., Engstrom P. Production of transgenic pea {Pisum sativum L.) plants by Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer // Theor. Appl. Genet. - 1990. -V. 80. - P. 246-252.

285. Ramirez N., Ayala M., Orenzo D. et al. Expression of a single-chain Fv antibody fragment specific for the hepatitis В surface antigen in transgenic tobacco plants // Transgenic Res. 2002. - V. 11. - P. 61 -64.

286. Ranee I., Norre F., Gruber V., Theisen M. Combination of viral promoter sequences to generate highly active promoters for heterologous therapeutic protein over-expression in plants // Plant Sci. 2002. - V. 162. - P. 833-842.

287. Relic В., Andjelkovi M., Rossi L. et al. Interaction of the DNA modifying proteins VirDl and VirD2 of Agrobacterium tumefaciens: Analysis by subcellular localization in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998.-V. 95, № 16.-P. 9105-9110.

288. Richter L.J., Thanavala Y., Arntzen C.J., Mason H.S. Production of hepatitis В surface antigen in transgenic plants for oral immunization // Nat. Biotechnol. -2000.-V. 18. -P. 1167-1171.

289. Rigano M.M., Dreitz S., Kipnis A.TP. ,et al. Oral immunogenicity of a plant-made, subunit, tuberculosis vaccine // Vaccine. 2005. V. 3. - P. 56-59.

290. Riker A.J., Banfield W.M., Wright W.H., Keitt G.W., Sagen H.E. Agriculture methods // J. Agr. Res. 1930. -V. 41. - P. 507-540.

291. Robbs S.L., I-Iawes M.C., Lin H.-J., Pueppke S.G., Smith L.Y. Inheritance of resistance to grown gall in Pisum sativum // Plant Physiol. — 1991. — V. 95. P. 52-57. ' ' .

292. Rogers S.O:, Bendich A.J. Extraction of DN A from milligram1 amounts of fresh, herbarium and mummifiediplant tissues // Plant Molecular Biology. 1985. - V. 5.-P. 69-76. •■;,."•'•.

293. Ruggiero F., Exposito J.Y., Bournat P. et al. Triplehelix assebly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants//FEBS Lett. 2000; -V. 469.-P. 132-136.

294. Saalbach I, Giersberg M, Conrad U. High-level expression of a single-chain Fv fragment (scFv) antibody in transgenic pea seeds // J. Plant Physiol. 2001. - V. 158.-P. 529-533. .

295. Sadir R., Lambert A., Lortat-Jacob H., Morel G. Caveolae and clathrin-coated vesicles: two possible internalization pathways for IFN-gamma and IFN-gamma receptor // Cytokine. 2001. - V. 7. - P. 19-26.

296. Sanago M.H.M., Shattuck V.I., Strommer J. Rapid plant regeneration of pea using thidiazuron7/ Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1996. - V. 45. - P. 165-168.

297. Sandhu J.S., IGrasnyanski S.F., Domier L.L. etal. Oral immunization of mice with transgenic tomato fruit expressing respiratory syncytial virus-F protein induces a systemic immune response // Transgenic Res. 2000. - V. 9. - Pi 127135. :

298. Sarwar A.,. Enbergs H. Effects of Saussurea lappa roots extract in ethanol on leukocyte phagocytic activity, lymphocyte proliferation and interferon-gamma (IFN-gamma) // Рак. J. Pharm. Sci. 2007. - V. 20, № 3. - P. 175-179: .

299. Sato Т., Selleri С., Young N.S., Maciejewski J.P. Hepatopoietic inhibition by interferon-gamma is partially mediated through interferon regulatory factor-1 // Blood. 1995. - V. 86. - P. 3373-3380.

300. Sawahel W.A. The production of transgenic potato plants expressing human a-interferon using lipofectin-mediated transformation // Cell.Mol.Biol. Lett. -2002.-V. 7.-P. 19-29.

301. Schell J., van Montagu M., de Beuckeller M., de Block M., Depicker A. et al. Cancerogenesis of plant // Proc. R. Soc. London (Ser. B) 1979. - V. 204. - P. 251-256.

302. Scheller J., Henggeler D., Viviani A., Conrad U. Purification of spider silk-elastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation // Transgenic Res. 2004. - V. 13. - P. 51-57.

303. Schindler C., Darnell J.E.Jr. Transcriptional responses to polypeptide ligands: the JAK-STAT pathway // Annu. Rev. Biochem. 1995. - V. 64. - P. 621-651.

304. Schoffl F., Baumann G. Thermo-induced transcripts of a soybean heat shock gene after transfer into sunflower using a Ti plasmid vector // EMBO J. 1985. -V. 4.-P. 1119-1124.

305. Schroder G., Waffenschmidt S., Weiler E.W., Schroder J. The T-region of Ti plasmids codes for an enzyme synthesizing indole-3-acetic acid // Eur. J. Biochem. 1984. -V. 188. - P. 387-391.

306. Schroeder H.E., Schotz A.H., Wardley-Richardson Т., Spencer D., Higgins T.J.V. Transformation and regeneration of two cultivars of pea (Pisum sativum L.)//Plant Physiology.-1993.-V. 101.-P. 751-757.

307. Schunmann P.H.D., Coia G., Waterhouse P.M. Biopharming the impliREDTM HIV diagnostic reagent in barley, potato and tobacco // Molecular Breeding -2002.-V. 9.-P. 113-121.

308. Shewmaker C.K., Sheehy J.A., Daley M. et al. Seed specific overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects // Plant J. 1999. - V. 20. - P. 401-412.

309. Shurvinton C.E., Ream W.J. Stimulation of Agrobacterium tumefaciens T-DNA transfer by overdrive depends on a flanking sequence but not on helical position with respect to the border repeat // Bacteriol. 1991. - V. 173, № 17. - p. 55585563.

310. Sijmons P.С., Dekker B.M.M., Schrammeijer B. et al. Producrion of correctly processed human serum albumin in transgenic plants // Biotechnology. — 1990. -V. 8.-P. 217-221.

311. Silvennoinen O., Ihle J.N., Schlessinger J., Levy D.E. Interferon-induced nuclear signalling by Jak protein tyrosine kinases // Nature. 1993. - V. 366. - P. 583585.

312. Skerman V.B.D., McGovan V., Sneath P.H.A. Int. Agrobacterium tumefaciens // J. Syst. Bacteriol.-1980.-V. 30.-P. 425-431.

313. Smarrelli JJr., Walters M.T., Diba L.H. Response of various cucurbits to infection by plasmid-harboring strains of Agrobacterium // Plant Physiol. -1986.-V. 82.-P. 622-624.

314. Smith R.H., Hood E.E. Agrobacterium tumefaciens transformation of monocotyledons // Crop Sci Soc. of America. 1995. - V. 35. - P. 301-309.

315. Smith E.F., Townsend C.O. A plant-tumor of bacterial origin // Science. 1907. -V. 25.-P. 671-673.

316. Smith E.F:, Townsend C.O. A plant-tumor of bacterial origin // Science. 1907. -V. 25.-P. 671-673.

317. Smith M.L., Mason HIS., Shuler M.L. Hepatitis В surface antigen (HBsAg) expression in plant cell culture: Kinetics of antigen accumulation in batch culture and its intracellular form // Biotechnol.Bioeng. 2002. - V. 80. - P. 812822.

318. Southgate E.M., Davey M.R., Power J.B., Marchant R. Factors affecting the genetic engineering of plants by microprojectile bombardment // Biotechnol. Adv. 1995. -V. 13, № 4. -P. 631-651.

319. Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J.J. (Ed.) The Rhizobiaceae. Molecular biology of model plant-associated bacteria // Kluwer Academic Publishers. -1998. / Ред. Тихонович И.А., Проворов H.A. / Санкт-Петербург: ИПК-Бионт. 2002. - 568 е.: иллюс.

320. Sriraman R., Bardor М., Sack М. et al. Recombinant anti-hCG antibodies retained in the endoplasmic reticulum of transformed plants lack core-xylose and core- (l,3)-fucose residues // Plant Biotechnol. J. 2004. - V. 2. - P. 279-288.

321. Stachel S. E., Nester E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir region of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens // EMBO J. 1986. -V. 5. P. 1445-1454.

322. Stachel S.E., Messens E., Van Montagu M., Zambryski P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens // Nature. 1985. - V. 318. P. 624-629.

323. Stachel S.E., Zambryski P. Vir A and virG control the plant induced activation of the T-DNA transfer process of Agrobacterium tumefaciens II Cell. 1986. — V. 46.-P. 325-333.

324. Staub J.M., Garcia В., Graves J. et al. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts // Nat. Biotechnol. 2000 - V. 18. -P. 333-338.

325. Stoger E., Vaquero C., Torres E. et al. Cereal crops as viable production and storage systems for pharmaceutical scFv antibodies // Plant Mol. Biol. 2000. -V. 42.-P. 583-590.

326. Streatfield S.J., Jilka J.M., Hood E.E. et al. Plant-based vaccines: unique advantages // Vaccine 2001. - V. 19. - P. 2742-2748.

327. Streatfield S.J., Lane J.R., Brooks C.A. et al. Corn as a production system for human and animal vaccines // Ibid. 2003. - V. 21. - P. 812-815.

328. Siidhof T.C., Goldstein J.L., Brown M.S., Russell D.W. The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins // Science. 1985. - V. 228, № 4701.-P. 815-822.

329. Sukharev S.I., Klenchin V.A., Serov S.M., Chernomordik L.V., Chizmadzhev Y.A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells the effect of DNA interaction with electropores // Biophys. J. - 1992. - V. 63. - P. 13201327.

330. Svabova L., Smykal P., Griga M., Ondrej V. Agrobacterium-mediated transformation Pisum sativum in vitro and in vivo // Biologia Plantarum. 2005. -V. 49, №3.-P. 361-370.

331. Szegedi E., Kozma P. Studies on the inheritance of resistance to crown gall disease of grapevine // Vitis. 1984. - V. 23. - P. 121-126.

332. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G. et al. Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato // Nat. Med. — 1998.-V. 4.-P. 607-609.i1 185

333. Tacket C.O:, Mason H.S., Losonsky G. et al. Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes // J. Infect. Dis. — 2000.-V. 182.-P. 302-305.

334. Terashima M., Murai Y., KawamuraM. et al. Production of functional human al-antitrypsin by plant cell culture // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 52.-P. 516-523.

335. Thanavala Y., Yang Y.F., Lyons P. et al. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis В surface antigen // Proc. Natl. Acad1. Sci. USA. 1995. - V. 92. -P: 3358-3361.

336. Thanavala-Y., Mahoney M., Pal S. et al. Immunogenicity in humans of an edible vaccine fonhepatitis В // Ibid. 2005. - V. 102. - Pi 3378-3382.

337. Thomas B~R., Deynze A.V., Bradford K.J. Production of therapeutic proteins in plants // Agricultural biothechnology in California-series. 2002. 342 pp.

338. Thompson D.V., Melcher L.S., Idler K.B^ Schilperoort R.A.et al. Analysis of the complete nucleotide sequence of the Agrobacterium tumefaciens virB operon // Nucl. Acids Res. 1988. - V. 16. - P. 4621-4636.

339. Tingay, S., McElroy Dr, Kalla R., Fieg S., Wang M., Thornton S., Brettell R. Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation // Plant J. 1997. -V. 11.-P. 1369-1376.

340. Tregoning J.S., Nixon P., Kuroda H. et al. Expression of tetanus toxin Fragment С in tobacco chloroplasts // Nuclei Acids Res. 2003. - V. 65. - P. 1174-1179.

341. Tregoning J.S., Maliga P., Dougan G., Nixon P. New advances in the production of edible plant vaccines: chloroplast expression of a tetanus vaccine antigen, TetC // Phytochemistry. 2004. - V. 65. - P. 989-994.

342. Tregoning J.S., Clare S., Bowe F. et al. Protection against tetanus toxin using a plant-based vaccine // Eur. J. Immunol. 2005. - V. 35. - P. 1-7.

343. Trexler M.M., McDonald K.A., Jackman A.P. Bioreactor Production of Human 1-Antitrypsin Using Metabolically Regulated Plant Cell Cultures // BiotechnoLProg. -2002. V. 18. - P. 501-508.

344. Trieu A.T., Burleigh S.H., Kardailsky I.V., Maldonado-Mendoza I.E., Versaw W.K., Blaylock L.A., Shin H., Chiou T.-J., Katagi H., Dewbre G.R., et al

345. Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium // Plant J. 2000. - V. 22. - P. 531-541.

346. Trimble R.B., Atkinson P.H., Tschopp R.R., Maley F. Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris // J. Biol. Chem. 1991. - V.266. - P. 22807-22817.

347. Tuboly Т., Yu W., Bailey S. et al. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants // Vaccine. 2000. - V. 18.-P. 2023-2028.

348. Tzitzikas E., Exploring variation in pea protein composition by natural selection and genetic transformation // PhD thesis. The Netherlands: WUR - 2005. -121 P.

349. Uecer U., Bartsch M., Scheurich P., Berkovic D., Ertel C., Pfizenmaier K. Quantitation and characterization of g-interferon receptors on human tumor cells // Cancer Res. 1986. - V. 46. - P. 5339-5343.

350. Ulker P., Allen G.C., Thompson W.F., Silker S., Weissinger A.K. A tobacco matrix attachment region reduce the loss of transgene expression in the progeny of transgenic tobacco plants // Plant J. 1999. - V. 18. - P. 253-263.

351. Usami S., Okamoto S., Takebe I., Machida Y. Factor inducing Agrobacterium tumefaciens vir gene expression is present in monocotyledonous plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 3748-3752.

352. Utsumi J., Kobayaski S. Interferon production with multifray culture system on a large scale // Interferon Res. 1984. -V.4,№l.-P. 9-16.

353. Vain P., James V.A., Worland В., Snape J.W. Transgene behavior across two generations in a large random population of transgenic rice plants produced by particle bombardment // Theor. Appl. Genet. 2002. - V. 105. - P. 878-889.

354. Valdes R., Reyes В., Alvarez T. et al. Hepatitis В surface antigen immunopuriflcation using a plant-derived specific antibody produced in large scale // BBRC. 2003. - V. 310. - P. 742-747.

355. Vandekerckhove J., Van Damme J., Van Lijsebettens M. et al. Enkephalins produced in transgenic plants using modified 2S seed storage proteins // BioTechnology. 1989. - V. 7. - P. 929-932.

356. Van Larebeke N., Genetello C., Schell J., Schilperoort R.A., Hermans A.K., Van Montagu M., Hernalsteens J.P. Acquisition of tumour-inducing ability by non-oncogenic agrobacteria as a result of plasmid transfer // Nature. 1975. - V. 255.-P. 742-743.

357. Vaquero C., Sack M., Chandler J. et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 11128-11133.

358. Vaquero C., Sack M., Schuster F. et al. A carcinoembryonic antigen-specific diabody produced in tobacco // FASEB J. 2002. - V. 16. - P. 408-410.

359. Vaucheret H., Beclin C., Fagard M. Post-transcriptional gene silencing in plants //J. Cell Sci. -2001. V. 114. P. 3083-3091.

360. Veluthambi K., Jayaswal R.K., Gelvin S.B. Virulence genes A, G, and D mediate the double-stranded border cleavage of T-DNA from the Agrobacterium Ti plasmid//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987.-V. 84.-P. 1881-1885.

361. Verch Т., Yusibov V., Joprowski H. Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector // J. Immunol. 1998. -V. 220.-P. 69-74.

362. Vesosky В., Turner O.C., Turner J., Orme I.M. Gamma interferon production by bovine gamma delta T cells following stimulation with mycobacterial mycolylarabinogalactan peptidoglycan // Infection and immunity. 2004. - V. 72, №8.-P. 4612-8.

363. Walmsley A.M., Arntzen C.J. Plants for delivery of edible vaccines // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. - V. 11. - P. 126-129.

364. Wandelt C.I., Khan M.R., Craig S. et al. Vicilin with carboxy-terminal KDEL is retained in the endoplasmic reticulum and accumulates to high levels in the leaves of transgenic plants // Plant J. 1992. - V. 2. - P. 181-192.

365. Ward J.E., Akiyashi D.E., Regier D., Datta A., Gordon M.P., Nester E. Characterization of the virB operon from an Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid // J. Biol. Chem. 1988. -V. 263. - P. 5804-5814.

366. Warzecha H., Mason H.S., Lane C. et al. Oral immunogenicity of human papillomavirus-like particles expressed in potato // J. Virol. 2003. - V. 77. - P. 8702-8711.

367. Waters W. R., Nonnecke B. J., Palmer M. V.et al. Fusion Protein for Differentiation of Infections of Cattle by Mycobacterium bovis and by M. avium subsp. avium and M. avium subsp. Paratuberculosis // CDLI. 2004. - V. 11.— P. 729-735.

368. Watson В., Currier T.C., Gordon M.P., Chilton M.D., Nester E.W. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens II J Bacteriol. 1975. - V. 123, № l.-P 255-264.

369. Weaver J.C. Electroporation a general phenomen for manipulating cals and tissues // J. Cell Biochem. - 1993. -V. 51. - P. 426-435.

370. Weaver J. C., Chizmadzhev Y. Theory of electroporation: A review // BioelectrochBioener. — 1996. — V. 41.-P. 135-160.

371. Webster D.E., Cooney M.L., Huang Z. et al. Successful boosting of a DNA measles immunization with an oral plant-derived measles vims vaccine // Ibid. -2002.-V. 76.-P. 7910-7912.

372. Wee E.G., Sherrier D.J., Prime T.A., Dupree P. Targeting of active sialyltransferase to the plant Golgi apparatus // Plant Cell. 1998. - V. 10. - P. 1759-1768.

373. Wenck A.R., Quinn M., Whetten R. W. et al. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Norway spruce (Picea abies) and loblolly pine (Pinus taeda) //PlantMol. Biol. 1999. -V. 39. - P. 407-416.

374. Williams B.R.G. Transcriptional regulation of interferon-stimulated genes // Eur. J. Biochem.-1991.-V. 200, № l.-P. 1-11.

375. Woodard S.L., Mayor J.M., Bailey M.R. et al. Maize (Zea mays)-derived bovine trypsin: characterization of the first large-scale, commercial protein product from transgenic plants // Biotechnol. Appl. Biochem. 2003. - V. 38. - P. 123-130.

376. Yamamoto Т., Davis C.G., Brown M.S., Schneider W.J., Casey M.L., Goldstein J.L., Russell D.W. The human LDL receptor: a cysteine-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA // Cell. 1984. - V. 39, № 1. - P. 462-465.

377. Yang D.C., Guo F.L., Liu B. et al. Expression and localization of human lysozyme in the endosperm of transgenic rice // Planta. 2003. - V. 216. - P. 597-603.

378. Yanofsky M.F., Porter S.G., Young C. et al. The virD operon of Agrobacterium tumefaciens encodes a site-specific endonuclease // Cell. 1986. -V. 47, № 3. -P. 471-477.

379. Young H.A. Regulation of interferon-gamma gene transcription // Seminars in Virology. 1995. V. 6. - P. 175-180.

380. Yu J., Langridge W.H. A. plant-based multicomponent vaccine protects mice from enteric diseases // Nat. Biotechnol. 2001. - V. 19. - P. 548-552.

381. Yuan L., Rnauf V.C. Modification of plant components // Current Opinion in Biotechnology. 1997. - V. 8. - P. 227-233.

382. Yusibov V., Modelska A., Steplewski K. et al. Antigens produced in plants by infection with chimeric plant viruses immunize against rabies virus and HI // Ibid. 1997. - V. 94. - P. 5784-5788.

383. Yusibov V., Hooper D., Spitsin S. et al. Expression in plants and immunogenicity of plant vims-based experimental rabies vaccine // Vaccine. — 2002.-V. 20.-P. 3155-3164.

384. Zaenen I., Van Larebeke N., Van Montagu M., Schell J. Supercoiled circular DNA in crown-gall inducing Agrobacterium strains // J Mol Biol. 1974. - V. 86, № 1 - P. 109-127.

385. Zambryski P., Joos H., Genetello C. et al. Ti-plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity //EMBO J. 1983. - V. 2.-P. 2143-2150.

386. Zeitlin L., Olmsted S.S., Moench T.R. et al. A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immunoprotection of the vagina against genital herpes //Nat. Biotechnol.- 1998. -V. 16.-P. 1361-1364.

387. Zerback R., Dressier R., Hess D. Flavonoid compounds from pollen and stigma of Petunia hybrida: inducers of the vir region of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid // Plant Science. 1989. - V. 62. - P. 83-91.

388. Zhang В., Yang Y.-H., Lin Y.-M. et al. Expression and production of bioactive human interleukin-18 in transgenic tobacco plants // Biotechnol. Lett. 2003. -V. 25.-P. 1629-1635.

389. Zhong G.-Y., Peterson D., Delaney D.E. et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds // Mol. Breed. 1999. - V. 36. - P. 345-356.

390. Zhu Z., Hughes K., Huang L. et al. Expression of human a-interferon cDNA in transgenic rice plants // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1994. - V. 36. -P. 197-204.

391. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B. et al. The Bases of Crown Gall Tumorigenesis // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 3885-3895.

392. Ziemienowicz A. Odyssey of Agrobacterium T DNA // Acta Biochimica Polonica. -2001.-V. 48, № 3. - P. 623-635.

Информация о работе

Савельева, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Получение трансгенных растений-продуцентов бычьего γ-интерферона - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы