Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение трансгенных мышей, несущих митохондриальную ДНК человека, передаваемую потомству

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение трансгенных мышей, несущих митохондриальную ДНК человека, передаваемую потомству"

На правах рукописи

Соколова Василина Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ, НЕСУЩИХ МИТОХОНДРИАЛЬНУЮ ДНК ЧЕЛОВЕКА, ПЕРЕДАВАЕМУЮ ПОТОМСТВУ

Специальность: 03.00.04 биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург ' 2004

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики ГУ Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор -академик Б.И.Ткаченко)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук В.Б.Васильев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Казакова Татьяна Борисовна кандидат биологических наук Спивак Ирина Михайловна

Ведущее научное учреждение: Санкт-Петербургский Государственный университет

Защита состоится в на заседании диссертационного

совета Д 001.022.03 при ГУ НИИЭМ РАМН по адресу: 193376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12

Автореферат разослан

*. 2004

У(ченый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Л. В. Пучкова

ZOOf't ßJG 55?

ОВ1ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАПОТЫ

Актуальность incjic.'ioitiiiniii. Около 60 лет назад было открыт первое заболевание, связанное с разобщением окисления и фосфорплнровшшя в митохондриях. Это положило начало неследованиям «болезней окислительного фосфорилирования» (0XPI10S diseases), передаваемых но материнской линии и отличающихся тяжелой симптоматикой, почти всегда заканчивающихся неблагоприятным исходом. В настоящее время известно около 120 нозологических единиц и синдромов.

Особенностью наследственных митохондриальных болезней является зачастую полное отсутствие патологических признаков в первые годы жизни человека. Это вызвано наличием в клетках сотен митохондрий как с мутантной, так и с нормальной ДНК, что получило название гетероплазмии. Содержание митохондрий с мутантной мнтохонлрналыюй ДПК (мтДНК) нарастает постепенно, и будущие пациенты нередко достигают половозрелого возраста и дают потомство, несущее те же мутации в мтДПК. Когда количество мутапгных копий мтДНК достигает в клетке «порога концентрации», энергетический метаболизм оказывается недостаточным, чго и проявляется в виде болезни с симптомами дегенерации разных органов.

Сегодня установлена природа ряда мутаций, вызывающих болезни OXPHOS. Это могут быть как точечные мутации, так и обширные делении, затрагивающие несколько генов. Однако, до сих пор неизвестны многие молекулярные механизмы, обеспечивающие возникновение и развитие симптомов >гих тяжелых заболеваний. Эго создает трудности для разработки методов лечения митохондриальных болезней. Среди прнчпи относительно слабого развития медицины в тгой области - отсутствие адекватной модели для изучения митохондриальных болезней, поскольку \ животных такие заболевания не обнаружены.

H поисках новых подходов к изучению данной проблемы многие ученые |> обратились к созданию так называемых «транемнтохондриальньш: животных. Такие работы по введению митохондрий одного вида животных в клетки друюю вида уже имеют заметный успех (Tinker! et (iL. 1997: Irwin et al., 1999; Kinaudo et cil.. 1999). Обнадеживающие результаты них пока

еще единичных работ позволяют рассчтывать на ю. чк> и недалеком будущем у мелшшны пояшися шансы продипнугься вперед, однако модель жниошого с симшомами, сходными с проявлениями боленш у человека до сих пор не разработана.

Цслыо нашего исследования явилось получение фапегенных мышей, несущих в органах/тканях мтДНК человека и изучение возможности их дальнейшего использования для создания модели митохондрпалыюго заболевания человека.

Для дос1 ижения цели были поставлены следующие задачи:

1) осуществление доставки митохондрий человека в оплодотворенные яйцеклетки лабораторной мыши и изучение влияния чужеродных митохондрий на развитие мышиных эмбрионов;

2) кошроль за сохранением либо элиминацией мгДНК человека на разных стадиях развития организма мыши:

3) изучение распределения чужеродной мтДНК в организме трапемитохондриальных мышей:

4) проверка гипотезы о возможной гстероплазмии в тканях/органах животных;

5) изучение возможности передачи чужеродной мтДНК потомству фаисмитохондриальиых мышей.

Научная новизна проведенных исследований состоит в том. что впервые в мире получены мыши, несущие в тканях/органах мгДПК человека, сосуществующую с собственной мтДНК животных. Показана также возможность передачи но материнской линии чужеродной мтДНК от фаисмитохондриальиых мышей их потомству.

| Научно-ппактическос значение работы состоит в том, что намечены конкретные niai и для получения животных, являющихся адеквашой моделью «болезней окислшельного фосфорилировапия». вызываемых мутациями » мтДНК и передаваемых по ма1сринской линии. Получение

uncoil модели прсдосшшп возможное м. для pajpaóoiкп новых подходов к .чсчсшпо подобных заболеваний, и том числе для испытания новых лекаре i псиных среде i в.

Основные положении, ныиосимые на защщу:

1) Показано, что введение в оплодотворенные яйцеклетки мыши митохондрий человека не оказывает отрицательного эффекта на развитие эмбрионов животных.

2) Установлено, что мтДПК человека сохраняется в зародышах мыши, развивающихся как in vitro. так и in vivo, а также в тканях новорожденных животных.

3) Чужеродная мтДНК распределяется неравномерно п организме трансмитохондриальных мышей.

4) В экспериментах по получению трансмитохондриальных мышей была создана искусственная гстероплазмия, когда в образцах тканей/органов животных наряду с собственной мтДНК обнаруживалась мтДНК человека.

5) Показана возможность передачи мтДПК человека от поколения 1;0 фансмитохондриальных мышей следующему поколению по материнской линии.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на научной конференции, посвященной НО-лепно Института Экспериментальной медицины. Саикт-Пегерб\рг. 2000 г, на X Международном Конгрессе «Генетика человека». Иена, 2001г.: на конференции EUROMIT-5 Общества исследователей митохондрии (The Mitochondria Research Society). Венеция. 2001; на IV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей, Сапкт-Петсрб\рг, 2001; па Ш съезде Биохимического Общества, Санкт-Петербург. 2002: па I Всероссийском конгрессе «Современные технологии и педиафип и детской \нр\ргпи», Москва, 2002.

Основное содержание дисееркщпн опубликовано и 24 научных сгап.ях п тезисах 7" докладон.

Структура диссертации

Диссертация изложена па /^¿страницах и содержит: введение, обзор литературы, методы и материалы исследований, результаты исследований, обсуждение результатов н выводы. Работа иллюстрировала рисунками. Список литературы содержит W названий работ па английском языке.

Материалы и метоца

Митохондрии человека, используемые для мнкроштьекцни н оплодотворенные яйцеклетки лабораторных мышей, выделяли из культуры клеток гепатомы человека HepG2. Пепосрелствсшю перед микрошгьекцией часть выделенных митохондрии окрашивали люминесцентным красителем MiloTrackcr Red (Sigma. USA) для оценки функциональной активности. Окрашенные митохондрии выявляли с номотыо люминесцентного микроскопа Luniam.

Работа была выполнена па мышах-гибридах СИДхС57Ш. (F|). Для получения зигот молодых самок (возраст 24-30 диен) индуцировали к супсровуляции последовательными внутрибршшшшымн инъекциями сывороточного гонадогропппа жеребой кобылы (Sigma, USA) и хориопического гонадотропина человека (чХГ) (Sigma. USA) и подсаживали к самцам юго же генотипа. Вофаст зародышей отсчитывали от времени введения чХГ.

Для 'ж'сплапташш оплодотворенных яйцеклеток самок умерщвляли путем дислокации шейных позвонков, извлекали яйцеводы и помешали их в чашку-Петри с раствором гиалуроиндазы (100-300 ед/мл). Расширенная часть ампулы яйцевода надсекалась инъекционной иглой для высвобождения яйцеклеток. Далее зиготы переносили в среду 1П6 п производили визуальную оценку их морфоло! ического С0С10ЯНИЯ. Для последующей микрошгьекпип oi6itpa;ni жизнеспособные оплоло! коренные яйцеклетки. Критерием для

oiöopa служили не. loci и ость блестящей оболочки, наличие второю направительного тельца и отсутствие кортикальных гранул в ооплазме.

Перел микроиньекцией яйцеклетки инкубировались в среде I П'6. еодерж;ш1ей цитохалалш В (5мкг/мл). Затем яйцеклетки переносили в микрокаплю среды с шпохалазином В под слой стерильною вазелинового масла, рядом помещали каплю раствора митохондрий человека для инъекции. Мнкрошп.скции проводили па микромапппуляторе «Diavert» фирмы «Lcilz». При эгом использовались специально приготовленные стеклянные инъекционные иглы с диаметром 4-6 мкм.

После успешной мпкрошгьекции отбирали зиготы без видимых признаков деградации, промывали их в нескольких каплях манипуляционной среды и переносили в среду для последующего культивирования или трансплантации в яйцевод самки-реципиента.

Часть зародышей с микроинъецированиыми митохондриями человека культивировали in vitro в пластиковых чашках Петри в микрокаплях среды МЗ под слоем минерального масла (Sigma, USA) в COj-инкубаторе при 37"С. Аналогично культивировали зиготы, в цитоплазму которых инъецировали буфер, не содержащий митохондрий. Контрольные эмбрионы, пе подвергавшиеся мнкроинъекции, помешали в культу раз ьную среду непосредственно после извлечения из яйцеводов. Часть контрольных зигот обрабатывали шпохалазином в той же концентрации и в течение тою же времени, чго и экспериментальные яйцеклетки, после чего культивировали в аналогичных условиях.

Для разделения на отдельные бласгомеры культивируемых in vitro зародышей 2-х и 4-х клеточной стадии развития блестящую оболочку эмбрионов удаляли химическим воздействием кислого раствора Тнродс. Для диссоциации эмбрионов па отдельные клетки использовали бескальциевую среду: 2-х и 4-х- клеточные зародыши инкубировали около 15-20 минут в бескалышевой среде S П'6 при 37° С. Затем каждый эмбрион по отдельности переносили в микрокаплю среды и пикетировали, втягивая и выталкивая его через микропипегку, огверетпе которой чум, меньше диаметра эмбрионов. Ндипичныс клетки, отделившиеся в процессе мой

манипуляции, отбирались и 0.5 мл мпкроцептрифужпые пробирки, содержащие 20 мкл Ы1Ц1' буфера. 20 мкМ дитщг>ритрнтола. 1.7 мкМ SDS и 0.05 мг/мл протсиназы К для последующего анализа с помощью ПЦР.

Для получения эмбрионов, развивающихся ш vivo, и новорожденных жнвотых часть микрошгьецированных митохондриями человека зигот лабораторных мышеи трансплантировали в организм псевдобеременпых приемных матерей. Псевдобеременность индуцировалась спариванием самок, находящихся в соответствующей стадии естественного цикла, с вазэктомированнымн самцами. Перенос зародышей осуществляли с помощью мнкроиинетки в правые яйцеводы псевдобеременпых самок через воронку яйцевода по 10-15 зигог на самку.

ДНК для последующего анализа выделяли из целых эмбрионов 7-II суток внутриутробного развития и из отдельных органов и тканей 13-суточных эмбрионов и 10-дневных новорожденных мышат. В качестве отрицательного контроля при выделении ДНК использовали зародышей и новорожденных животных, развившихся из неннъецнрованных зпгот.

Полученные 7-11-суточные зародыши гомогенизировали в буфере, содержавшем"50 мМ трис-11С1 (рН 8.0), 10 мМ ЭДТЛ. 0.02% SDS. 100 мМ NaCl и 1 мг/мл протенназы К (Sigma.USA). Пробы инкубировали при 55(,С в течение суток и при 95°С в течение 10 минут. ДНК осаждали двумя объемами 96% спирта.

ДНК из II-суточных зародышей, а также из органов и тканей 13-дпевных эмбрионов и новорожденных мышей, выделяли по следующей схеме. Гомогенизировали образцы в буфере следующег о состава: 50 мМ трис-ИС1 (рП 8.0), 10 мМ ЭДТЛ (рН 8.0) н 100 мМ NaCl. К пробам добавляли SDS до конечной концентрации 1% и протеиназу К до конечной концентрации 500 мг/мл. Пробы инкубировали при 55°С в течение ночи. Дважды проводили 5-минутную экстракцию равным объемом смссн хлороформ:феиол (1:1). ДНК осаждали добавлением двойного объема 96% этиловог о спирта.

Образны ДНК человека, использованные » качестве положительно! о контроля в пробах полимеразноМ цепной реакции (ПЦР), были выделены из

ocioK культуры Ilcp(i2. Ядерную ДИК выделяли методом, описанным Bell et «/. (1981). мнтохондриальную — методом Torroni et ai (1992). Тотальная ДИК мыши была выделена из печени животных согласно Maniatis et ai. (1982).

Для выявления мптохондриальной ДИК человека в эмбрионах и новорожденных животных использовали ПЦР со специально подобранными специфичными праймерами к мтДНК человека (прямой 5' CCTTCTTACGAGCCAAAA - 3' и обратный 5'-CTGGITG ACCATTGTTTG-3') и к мтДНК мыши (прямой 5'-ACTCTTCACACAAACATAA-3' и обратный 5'-CTGGGTGATCTTTGTTTG-3'). Для увеличения точности метода было предусмотрено наличие в амплифицируемых участках мптохондриальной ДНК негомологичного сайта рестрикции специфической эндоиуклеазой Alu I, которая расщепляет продует амплификации мтДНК человека па фрагменты длиной 59 и 190 п.н. и не имеет сайтов рестрикции на соответствующем участке мтДНК мыши.

При анализе эмбрионов, развивающихся in vitro (как целых зародышей, так и отдельных бластомсров). ДИК не выделяли, а использовали лизироваппые образцы целиком (см. выше). После инактивации протешшы К в пробирки с образцами добавляли ПЦР-буфср, содержащий нуклеотиды, специфические пранмеры и Taq-полимеразу. Для анализа ДНК зародышей, развивающихся in vivo, и новорожденных животных в предварительно собранную реакционную смесь добавляли по 2 мкл из каждого образца ДНК. выделенной как из целых jIOCTHMплантационных зародышей, так и из отдельных органон и тканей 13-суточных эмбрионов и новорожденных мышат. ПЦ1' длительностью в -10 циклов проводили в следующем режиме: денатурация - I мин. при 95"С, отжиг с нраймерами - 1 мин. при 49"С, элонгация - 1 мин. при 72(,С. Во всех случаях, когда в пробах выявляли присутствие мтДНК человека, эти же образцы ДНК анализировали методом ПЦР с использованием праймеров к 13-му экзону гена, кодирующего лпганд-связывающий домен рецептора .тппопротеипа низкой плотности человека ( i.e. с нраймерами к фрагменту ядерной ДНК человека) (Hobbs et ed.. 1992). Данные праймеры не имеют гомологии с

юшлыюп Д1IK Mi.iiiin. Режим ПЦР » -яом случае: 95" С — I минуIа. 6()" С — I минута. 72" С— i минута: 50 циклоп.

Продукты амплификации анализировал и с помощью -электрофореза в 8% ио.чшнфилампдпом геле, после проведения которого гели фиксировали 10% уксусной кислотой и окрашивали 0,1% AgNO-,.

Рс»ультаты исследований

Первым и необходимым этаном работы являлось создание высокоточного метода наблюдения за судьбой мигохондридльной ДИК человека в эмбрионе мыши. Для решения этой задачи был выбран метод нолимеразпой ценной реакции с негомологичными праймерамн.

H результат проведенного анализа юмологии известных последовательностей митохондриальиых ДНК (мтДИК) человека и мыши в качестве видоспсцпфичпых ираймеров на обеих мтДПК были выбраны исболыпнс негомологнчнме последовательности для синтеза комплементарных олигопуклеотидов. Длины амилифпцпрусмых участков составили 249 п.и. для мгДИК человека и 165 п.н. для мтДПК мыши, что позволяет легко разделить чти фрагменты в 8% ПЛЛГ.

Была проведена ПЦР пз 30 циклов в стандартных условиях с температурой отжига 5|"С. Для ПЦР использовались препараты тотальной ДНК мыши и человека. Проводились как «прямые» реакции (праймеры к мтДПК мыши с ДНК мыши и праймеры к мгДНК человека с ДНК человека), так и «перекрестные» (праймеры к мгДИК человека с ДНК мыши и праймеры к мтДПК мыши с ДНК человека). Последующий анализ продуктов амплификации в 8% ПЛЛГ выявил наличие амнлифнцироваиных фрагментов предсказанной длины во всех «прямых» реакциях и отсутствие продукта амплнфнкашш во всех «перекрестных» реакциях (рпс. I ).

Чюбы убедиться, что праймеры к мтДПК специфичны именно к мптохопдриалыюи ДИК, была также проведена ПЦР с использованием препаратов тотальной, ядерной н митохондрналыюй ДПК человека и мыши. Анализ продукюв ПЦР показал присутствие необходимых фра! мспюв ДПК в

реакциях с тлю п.юваппем юкин пои и мшочоп фн 1 п.пон ДНК и оку шнме от 1\ к ¡к 1кцпяч с гфеп ф памп я ирпои ДНК (рис 1)

I 2 3 4 5 5 7 8 9 10 И 12

!

^ " I 1 I ; , 1 Я? 216

НА» > - 104

Рис 1 Вичоспсцифнчные пранмерм к м гД11К человека и м пши

1 — отрицательным контроль ПЦР 2— едерная ДНК человек! -

3 — мигах андриальная ДНК чело» а а

4 — тотальная ДНК человека

5 — фрагмент мгДНК человека,

обработанный эндонуимазш А1и1 6—тотальная ДНК мьшш -

7 — адернаяДНКмьшм -

8 — мши ондриапьнал ДНК мьшш 5—тотальна» ДНК мьшш

Ш — фрагмент мгДНК шшц

о бработ юный знд онупх еазой А1 и 11 — тотальная ДНК человя а

пранмеры к мгДНК человека

примеры к мгДНК мыши

12 — маркер молекулярных размеров (а/ой i)

Д1Я \вси1чсння тчпостн мею ы пи ювон идешификиши чпгочон фнальиои ДНК било прс усмотрено наличие в амплнфшднруемыч участках \пДПК иегомо югичныч сайтов рссфикдшн специфическими ж юшк шазамн Одна из 1акич спецнфичсскич лпонуктсаз - Л!и1 -расщепляе! продукт амптификации мтДНК чс ювека на фрагмент и длиной 59 и 190 пи и не имей сайтов ресгрикцни на соошстетвмошем участке иитохоп фиа гыюи ДНК мыши Д1Я обрабош! ресфицирующеи шюнуктеаюн А1и1 бы ш выбраны проект ачп шфнклши ДНК человека с пранмерами к мгДНК чс ювека и продукт ачтифнкапии ДНК мыши с ираимерачп к мтДНК ммши Пашчие в первом продукте рссфикшш фрлменга т шнои 190 п и л исчезновение зоны 249 и и юворш об узнавании А1и! соотвс1егвуюшсго еаиы реефпыдии в амн шфшшрованпом упегке мгДНК чс ювека г)тек|рофоретичеекая нодви/кносп, продукта ресфикции фрагмента \пДПК мыши эпдонуклеазой А1и1 по сравнению с подвижное г мо изначального продумл амнчнфшации мтДНК мыши осылась неизменной (рис I)

1акич образом е помощью описанных выше моде иных экспериментов било показано, чю рмрабоышгыс нами /фанмеры к мгДПК чеюпека

специфично взаимодействуют только с митохондриалыюн ДНК человека н не взаимодействуют с мгДПК мыши, н наоборот.

Далее был разработан метод проведения НЦР с использованием в качестве матрицы ие препарата очищенной ДМК, а ДНК в лизате клеток мышиного эмбриона. В пробы были взяты как одноклеточные зародыши мыши (оплодотворенные яйцеклетки), гак и эмбрионы, прошедшие первое и второе деления (2-х и 4-х клеточные стадии, соответственно), а также зародыши на максимально возможной стадии развития in vitro - бластоцисты. Было показано, что использования даже одной зародышевой клетки достаточно для обнаружения в пробе ДНК методом ПЦР.

Далее приступили к переносу с помощью мпкроинъекций фракции митохондрий человека в оплодотворенные яйцеклетки лабораторных мышей для создания в клетках (а затем и в органах) животных тетсроплазмии по мтДПК человека.

Перед микроннъекцией небольшая порция митохондрий человека, выделенных из клеточной линии HepG2, была окрашена специфичным люминесцентным красителем MitoTracker Red. в результате чего митохондрии приобретали ¡фко-краеную окраску, хорошо заметную при использовании люминесцентного микроскопа с фильтрами, обеспечивающими длину волны возбуждения 599 нм. Это служило доказательством целостности митохондрий в растворе, предназначенном для введения в зиготу лабораторной мыши.

Для оценки жизнеспособности зародышей проводили исследование различии в темпах дробления in vitro мнкрошп.енировапных зигот по сравнению с шпактпыми. Были проанализированы четыре экспериментальные группы зародышей.

1-ая lpynna - контрольные зародыши, непосредственно извлеченные из материнского организма и перенесенные в среду для культивирования. 2-ая ipynna - также контрольные зародыши, которые не подвергались микроипъекции, но обрабатывались в течение 2 часов раствором цитохалазниа В. используемым в технике микрошп.скшш. 3-я - эмбрионы, микроииъецпрованные митохондриями человека (и растворе l'BS буфера). Группа 4 включала зародыши, подвергшиеся микроипъекции чистого PBS. не

содержащего митохондрии. 'Зародыши каждой m ipyiin. культивируемых /'/; vino. \спешно прошли нее стадии доимплангацпониого развития or 1-клеточпон стадии развития до формирования бластоцпсты. Сравнительный анализ темпов дробления зародышей показал, что выживаемость эмбрионов, принадлежащих к разным экспериментальным группам, неодинакова (см. рис.2).

О контрольные зародыши

□ зародыши, обработанные цитохалазином В.

■ зародыши, микроинъецированные митохондриями человека,

□ зародыши после микроиньекции буфера

I'nc.2. Сравнительный анализ темпов дробления зародышей, развивающихся ¡n rítro.

Для зародышей второй, третьей и четвертой групп было характерно формирование бластоцнст с задержкой на сутки по сравнению с 1-ой группой. Также наибольшее количество зародышей, достигших стадии бластоцпсты, наблюдалось в группе 1 и составляло 55.918.5% % от общего количества эмбрионов, культивируемых в искусственных условиях со стадии зиготы. Зародыши 2-ой, 3-ей и 4-ой фупп характеризовались более низким процентом формирования бласюцист (36.418.4%, 28.8±5.3% и 29.6*8.8%, соответственно). Тем не менее, полученные результаты давали основание полагать, что привнесенные митохондрии не препятс1вуюг развитию зародышей.

Псе инъецированные митохондриями человека зародыши мыши на разных стадиях развития т \ч!ги (стадия зиготы, стадии двух и чет ырех клеток, стадия бластоцпсты) проверялись па присутствие и них мгДПК человека. При этом во всех пробах с использованием инъецированных мпюхоидршши человека

»лродышсн мыши inte мвисимости oí срока u\ рашншя т мпо, mi ДНК mi. юнска бы и обп<1р\жепл (pin. 3)

2-клвточный зародыш

4-клеточный ' зародыш

i jj_!

; aji'Zli'"

»>. А

¿JLS'

r^j-rAtM i ÜMí t.

бластоциста

l'iic 3 Детекция мтДНК человека в заротышлч развивающихся т i то

Чюбы опредешть, как в \o.ie дробления яицек тетки происходит распределение инъенированныч митохондрии, эмбрионы па стадии \ и четырех ioictok раздеадти на б ыстомеры и исследовали каждый б ыстомер на присутствие в нем мгДНК чечовека Оказалось, чю >ас па стадии первою дробления зиготы на тва бмыомера митохондрии человека могм попасть при дроблении как в оба бтастомера, так и оказался лишь в одном из них (рис 3)

Аналогичная картина пабчюдалась и при нее тсдовапии оыельных бтастомеров, взятых пз ошого зародыша на стадии четырех клеюк миюхопдриальная ДНК чеюиска обнаруживалась как во всех четырех бистомерач, гак и в одном, в чвух ити в ipex бплегомерах, нотученпых из о inoro )ародыша (рис 3)

Да ice ос> щсств iíliii ipancinanrannio зигот, инъецированных митохондриями чеювека, слмклч-рсишшсшлч Цслио данною жеперимеша

была пош.пка проеледшь ш судьбой чужеродною генешчсскот материала н •зародыше, развивающемся in vivo. т.е. и организме приемных матерен.

Из 270 знгог. трансплантированных после микропньекции мшохондрпй человека в яйцеводы 23 неевдобеременных самок, 89. т.е. около 33.0±2.9%. успешно имплантировались в стенку матки н развивались внутриутробно до момента извлечения из материнского организма.

При визуальном осмотре зародышей, развивавшихся in vivo, не было отмечено каких-либо отклонений от нормы. Из зародышей 7o113",ч> дня эмбрионального развития, освобожденных от зародышевых оболочек, проводили выделение тотальной ДНК, котору ю затем анализировали методом ПЦР с использованием видоспсцифичных праймеров к мгДПК человека.

Важно отмстить, что анализ ДНК, выделенной из постимплантацпонпых зародышей (а в дальнейшем и новорожденных - см. ниже) проводился по следующей схеме:

1) все образцы исследуемой ДНК первоначально анализировались па присутствие мтДНК мыши методом ПЦР с использованием видоспсцифичных к мтДНК мыши праймеров:

2) па следующем этапе проводили ПЦР-анализ проб ДНК па присутствие мтДПК человека:

3) для проверки на случайное внесение в анализируемые пробы генетического материала непосредственных исполнителей экспериментов поступали следующим образом. С образцами ДНК. в которых выявляли присутствие мтДНК человека, обязательно проводили ПЦР с использованием праймеров к 13-му экзопу гена, кодирующего лнганд-связывающип домен рецептора лннопротеина низкой плотности человека (т.е. с праймерамп к фрагменту ядерной ДНК человека). Отсутствие продукта амплификации свидетельствовало об смсутствии примеси ядерной ДНК человека и, следовательно, лапало возможность исключить артефакт.

Из 89 зародышей различного срока постимплаитациоиного развития фрагмент мгДПК человека удалось выявить в 13 эмбрионах: в грех 8-суючиых зародышах, в пяти зародышах 9-ою дня развития и в двух

ыро1мша\. нзп 1ечишм\ из маюрниекою оришима на 10-ый день беременной п (рпе 4) а иноке в |ре\ 13-сутчны\ ыродышах

1 2 3 4 5 Ь 7 6 9 10 1) 12

1 — праймеры к мтДНК человека

2 — 4 рвгмент мтДНК человека

I/

и *

ъ»^ * л г

** 15 1 I

I .. -Ц.

Г' .

збработаиныиэндонукеазой А1и| \ | 3 — праймеры к мтДНК мыши

4—лраймерыкяДНК человека -

I 264 5 — праймеры к мтДНК чрловека -

247 б — 4 рагиект мтДНК человека.

'216

с брабогашшй эндснукеазой Л1и I

* *£200 7 — праймеры к мтДНК мыши

>/^164 8 — праймеры к яДНК человека

^ ^ ^ 150 9 — п рам еры к мтДНК человека

^ у--79 ю — праймеры к яДНК человека

3

« ч

зь 8.

12 Е | & а яь- Ц.

° а с, Й

А

11 — положительный контроль ПЦР "

12 — маркер молекулярных размеров (ЛУРвЧ)

Рис 4 Детекция мтДНК чечовека в заро и ииа\, развивающихся »мм о

Следует огмегип» чю морионы тостнгшие 13-ю дня развития, быти раздоены на отде п.ные орыны н ткгии ПЦР-анлчиз проводили на образцах тотальной ДИК, выделенной из сердца, печени, кишечника, тканей готовы, конечнооей и потоночинка При этом у щ\\ 13-суточных зфодышеи мгДНК человека была выяптена только в сердце. Ю1 да как в других нес шдоваппых органах иском! ш фра! мент обнаружен не был В третьем 13-дневном эмбрионе анализ показал наличие мтДНК чешвека в кишечнике и в тканях конечностей и 01сутствие искомого фрагмента ч|ДНК человека в других проанализированных органах (рис 5)

1 — праймеры к мтДНК человека —

2 — фрагмент мтДНК человека.

обработанный энцокугеазон А1и1 3— праймеры к мтДНК мыши —

4 — праймеры к шДНК человека —

5 — фрагмент мггДНК человека,

обработанный эндонугазои А1и1

6 — праймеры и мгДНК мыши —

7 —праймеры к тДНК человека кишечник зародыша №3

8 —прамеры к мгДНК человека —

9 — фрагмент мтДНК "еловека

обработаннш .¿нданукеазои А1и1 !0 — праймеры К! ДНК человека _

11 —потожителыши контроль ПЦР

12 — маркер моле^лярных разигроа (АЛ'бН)

сердце зародыша №1

сердце

зародыша №2

ткани

конечностей зародыша №3

Рис1) (>6|Пр)/КСНИС мтДНК ЧС10НСК1 и ор! Ш1\ ||1К1ИЯ\ 13" С\ 10 |Ш IX 1чПрИО||(>В

Oil тощим ji.hiom рабомл пало попчише поворож гспныч фапсмшочопдриалып гч жнвоигыч I0> мышиных iiiror. мнкрошп сцнровлшыч миючондрнями человека бы ш lpantii laiiiiiponaiibi 8 псевдоберемепиым самкам В рсз\ м.таю noivinni псекошчо пометов поколения Гц, общей чис ichhocti.io 25 мышл На десятый день II новорожтеппых самцов были забигы и разделены на счедующне ормны п ткани кншечиик, семенники, печень, сердце, легкие, желудок, мочевой пузырь, скелетная муск\ laivpa. мозг, селезенка почки При исследовании выделенной ДНК у тре\ новорожденных Самцов быт обнлр\ленл мтДНК человека У одного она была выявлена в сердце и семенниках, у другою - в сердце н ске гетлыч мышцах, у третьего - в мозге мышцах, желудке и мочевом пузыре (рис 6) Сгедуст 01метить, чю размеры и вес ггпч трех мышат бичи примерно на треть меньше в срависшш с ич собратьями, не

Представляю интерсс изучение возможности передачи чужеродной мигочондриальнои ДНК потомству траисмиточоидрнальных мышеи

Семь самок из полученного на прс шдущем лане исследовании поколения lo по достижении зретосш бычи спарены с иииктпыми самцами Общая чпслсипость нотомс1ва I i сооавнла 44 жпвогныч Ььыо нссгеювано 27 из нич (огалымя ДНК также была вы te тепа ns перечне 1спны\ выше органов и npoaiu шшроваиа ПИ1'-метдом с индоенеппфпчными праимерами В

ptrtjn кис и épi an i\ ui\ \ miiuilii была обнаружена mi ДНК человека y mi шш N I - в м икс, iciкн\. мпшцах. моз!с у мыши №2 - и яичниках сер ще. id mix же i) (кс, мышцах, ночках (рис 7)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ukj^UUMUv-IU »J—l

™ » - » г й

ШН

> • ! 4 s

I 4-мп кз лс1мк. mum limiiiiiiui

mi чин N I

' H 264 з 10 — сердце легкие ммшцн л с i) чок

( ^ яичники и почки ml 1ши К 2

_ _ _ÎJL &J w• Il—положителып ж контроль Г1ЦР

fi, \fprr. А 200

'1г:~> » ; 4 i"

164 — маркер молекулярных размеров (X/Pstl)

« 150

f>

Рис 7 Подтверждение присутствия мтДМК человека в органах и тканях мышеи поколения F|

Обсуждение результатов

Проведенное исследование направлено на выяснение возможности успешного переноса и сохранения чужеронюго ипетического материала мнюхондрии од1юго вида млекопитающих в органах и тканях другою вид i

Изо шровапные из к клок, гепатомы HcpG2 мишхопарни че ювека, фм1кциоиальная активность и ис юстность мембран коюрыч подтверждались в гесте с Mitolracker Red, инъецировались в шпоплазму oimoioi иоренных яйцеклеток мыши

Только около трети ильтивируемых m мио зародышей, микроинъецированных мшохондриями че говека, юешгалн era щи бтастоцисты Скорее всего эю связано как с цитоюксическим )ффскюм нигохалазина В, так и с деструктивным действием микроинъекции, хотя па имеющемся материале юеюверных различий между долей сформировавшихся бистоциет в группе зародышеи, не подверившихея микроиньекнии, но обработанных цигохалазнпом В (36 4±8 4%), и аналогичной долей в группах зародышей, подвергшихся микроинъекции мптохонфпи четовека (28 8*5 3%) ити буфера (29 6±8 8%) обнаружить не у П юеь Помимо )тою часп экспсримепылынix зародышей достшла ста цш блаиоцисти на емки позже по сравнению с кошрольпыми

ЭМбрНОППМИ, MIO. возможно. СВЯЗаПО С довольно Д.НПСЛМ1ЫМ

культивированием и среде с цптохалазином Ii. котрый является аитиактиновым агепюм. Об пом свидетельствует задержка н дроблении зародышей, не подвергавшихся мнкроинъекцнп. но обработанных цшохалазнном 13. И целом полученные результаты позволяют предположить, что искусственно введенные чужеродные митохондрии не останавливают' развитие зародышей и не снижают существенно их жизнеспособность.

Присутствие в мышиных эмбрионах и в органах и тканях новорожденных мышей мтДНК человека, введенной в составе митохондрий в зиготы мыши, было подтверждено как проведенными реакциями ПЦР с использованием видосисцифичных пранмеров к митохондриалыюн ДНК человека, так и специфичным расщеплением амплифнцированного фрагмента эндонуклеазой Alul.

Было показано, что введенный чужеродный генетический материал стабильно сохраняется в развивающихся эмбрионах лабораторного животного на протяжении всех стадий развития in vitro. Маловероятно, что в нот период происходила репликация или транскрипция чужеродной мтДНК. поскольку эти процессы не характерны и для собственной мтДНК ранних зародышей (Piko, Matsumoto. 1976).

Распределение инъецированного материала по бластомсрам в ходе дробления было неравномерным. По-видимому, уже па самых начальных этапах эмбрионального развития возможна сегрегация митохондрий, обладающих разными геномами. Вероятнее всего сефегацня имеет случайный характер и. возможно, связана с отсутствием активной реорганизации цитоскелета в ранних зародышах до появления асимметрии клеток на стадии компакгизации (Maro et а!., 1990).

Поскольку при дальнейшем развитии » организме приемной матери (in v/Vi)) лишь часть клеток, образующихся при дроблении зиготы, идет па формирование непосредственно зародыша, нельзя исключить случаев, когда ппьецированпый материал оказывается в тех клетках, которые впоследствии пойдут па формирование зародышевых оболочек. Возможно, именно этим можно объяснить, чю лишь часть 7" - 13"-днсвпых эмбрионов и

новорожденных жппошых, развившихся из инъецированных зпгог н неследованных нами на присутствие мгДПК человека, несли чужеродный генетический материал. Однако сушссгвуст также возможность того, чго в период постимплангацпонпого развития и результате происходящих в клетках процессов реорганизации цитоплазмы чужеродные митохондрии могут быть утеряны. Неизвестно, имеет ли элиминация чужеродных митохондрий направленный характер или связана с удалением митохондрий, частично разрушенных в ходе мнкроинъекции

Тем не менее, анализ ДНК, выделенной из постнмплаптационпых зародышей и новорожденных мышат, показал, что мтДНК человека может сохраняться как в эмбриональный, так и в постнатальный период. Также была показана возможность передачи по материнской линии чужеродной мтДПК следующему поколению лабораторных мышей.

Важно отметить тот факт, что чаще всего чужеродная мтДНК обнаруживалась в сердце и скелетной мускулатуре. По всей видимости, чужеродная мтДНК подвергается тканеспецифичной селекции, контролируемой ядерными генами (Jenuth el al.. 1997). Особенно часто мтДНК человека регистрировалась в сердце подопытных животных: дважды у 13-су ¡очных эмбрионов, у двоих самцов из трех новорожденных поколения Fo и > одного животного поколения Fj. Паши данные совпадают с результатами Meirclles и. Smith (1997). получивших трансмигохондрнальных животных с высоким процентом гетероплазмии в сердце (69%). Если полученные данные не случайны, такое распределение экзогенной мтДНК может позволить целенаправленно доставлять мутаптпуга мтДПК человека в кардиомиоциты для моделирования кардиомиоиат пй, нередких для ряда митохондриальных заболеваний (Arbustini et al.. 1998).

Возможность манипулировать митохондрнальнмм геномом и рсч-улировать экспрессию митохондриальных генов могла бы дать перспективы для генетической коррекции наследственных митохондриальных заболеваний. В этом ключе получение линий животных с истинной мигохопдриальпой ктероилазмией позволило бы, е одной стороны, исследован, процессы сегрегации мшохопдрнй и эмбриональном развитии, гге сопряженные с

патологией. и кроме loi о. получить модекулярпо-i епстическую модель мтохондриальиых болезней человека. Создание генпо-инжеиерпой модели мптохондрпальпых заболеваний может дать реальные перспективы изучения механизмов возникновения мутаций мтДПК, условий и особенностей передачи генетического дефекта в ряду поколений, принципов терапевтической коррекции расстройств энергетического обмена, а также подходов к генотсранни наследственных заболеваний, вызванных дефектами в мтДПК.

Выводы

1) Митохондрии человека, введенные в оплодотворенные яйцеклетки мыши методом микроннъекцни. не оказывают отрицательного эффекта на развитие эмбрионов животных.

2) мтДНК человека стабильно сохраняется в зародышах мыши, развивающихся in vitro, вплоть до стадии бластоцисты.

3) Искусственно введенная мгДПК человека обнаруживается в мышиных зародышах, развивающихся in vivo, (по крайней мере, до 13-го дня внутриутробного развития), а также в тканях новорожденных животных.

4) Неравномерное распределение чужеродной мтДНК наблюдается уже в ходе первых делений зародыша мыши и сохраняется при дальнейшем развитии организма. И результате чужеродный генетический материал обнаруживается не во всех органах ностимплантационных зародышей и новорожденных животных.

5) Во всех образцах тканей/органов полученных трансмитохондриальных животных наряду с мтДНК человека обнаруживалась собственная мтДНК мыши, что свидетельствует о наличии гетероплазмни;

6) Полученные трапемиюхоидриальные мыши поколения Г() могут передавать мтДНК человека но материнской линии следующему поколению Г|.

Список- работ, опубликованных но теме днесерптщщ

1. Vasilycv V.U.. Sokolova К,I., Sorokin A.V.. Bass M.G.. Arbuzova N.I., I'alkin M.I... Golubkov V.l.. D\ban A.P., Gaitskhoki V.S. Persistence of human mitochondrial DNA throughout the development to the blastocyst of mouse zygotes microinjected w ith human mitochondria// Zygote, 1909. № 7. pp. 516-520

2. Соколова H.A., Арбузова H.H.. Сорокин A.B.. Касс М.Г.. Васильев В.Б.. ГаГишжи B.C. Трансмнтохоидриальные мышиные зародыши, полученные в результате микрошгъекцнн митохондрий человека в мышиную зиготу// Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины (научная конференция, посвященная 110-летню Института Экспериментальной медицины), 2000, стр. 162-163.

3. Sokolova V., Arbuzova N. Constraction of transgenic mice carrying human mitochondria// European journal of human genetics (official journal of European Society of Human Genetics). 2001. 9. № I, p.330.

4. Vasilycv VB, Sokolova VA, Arbuzova N1. Sorokin AV, Bass MG, Kustova Mil. Human mtDNA persists in some organs of mouse embryos and of neonate mice from zygotes microinjected with human mitochondria// Mitochondrion (the official journal of the Mitochondria Research Society. 2001. 1. № 1. p. 94-95.

5. Соколова B.A., Арбузова H.H.. Сорокин A.B.. Басс М.Г. Трансмнтохоидриальные мышиные зародыши, полученные в результате мпкропнъекципй митохондрий человека в мышиную зигогу// Человек и сто здоровье (IV Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей). 2001. етр.232-233.

6. Соколова H.A., Арбузова H.H.. Клстова M.L.. Басе М.Г. Получение фапемитохондрнальпых мышей путем микрошгъекцнн митохондрий человека в зиготу мыши// Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. 2002. стр.215-216.

7. Васильев В.Б.. Соколова В.А., Кустова M.L.. Москалева О.С.. Сорокин A.B. Трансмнтохоидриальные животные с мнтохопдрналыюй гетероплазмней "человек/мышь"// Тезисы научных докладов (111 съезда Биохимического Общества), 2002. сгр. 280.

8. Васильев В.Б.. Соколова H.A., Кустова М.Е.. Мое калека О.С., Сорокин A.B. Получение трансмигохондрнальных мышей-носигелей митохондриальпои ДНК человека, передаваемом их потомству// Современные технологии в педиатрии и детской хирургии (I Всероссийский конгресс). 2002. Москва. 16-19 октября, стр. 458-459.

9. Sokolova К/1., Kustova М.Е.. Arbuzova N.I., Sorokin A.V.. Moskaliova O.S.. Bass M.G.. Vasilycv V.B. Obtaining mice that carry human mitochondrial DNA transmitted to the progeny// Molecular Reproduction and Development. 2004, 68. 3. pp.299-307.

Работа поддержана грантами РФФИ Ol-04-49812. 03-04-49209. MAC 02-»4-06989. 03-04-06977.1III1 1730.2003.4

Подписано в печать 09.09.04. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,16. Тираж 70 экз. Заказ №28.

ЦОП типографии Издательства СПбГУ. 199061, С-Петербург, Средний пр., 41.

»1774 1

РНБ Русский фонд

2005-4 14455

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколова, Василина Александровна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Строение митохондрий.

1.2. Функции митохондрий.

1.2.1. Продуцирование энергии митохондриями.

1.2.2. Митохондрии в оогенезе и раннем эмбриогенезе.

1.2.3. Участие митохондрий в апоптозе.

1.3. Митохондриальный геном.

1.3.1. Строение митохондриальной ДНК.

1.3.2. Репликация мтДНК.

1.3.3. Транскрипция мтДНК.

1.3.4. Регуляция биогенеза митохондрий.

1.4. Биосинтез белков в митохондриях.

1.5. Особенности генетики митохондрий.

1.6. Митохондриальные заболевания.

1.7. Современные представления об изучении и терапии митохондриальных болезней.

2. Методы и материалы.

2.1. Выделение фракции митохондрий человека из культуры клеток Нер02 и анализ функциональной активности.

2.2. Подготовка животных.

2.2.1. Гормональная стимуляция самок и суперовуляция.

2.2.2. Техника стерилизации самцов.

2.2.3. Подготовка псевдобеременных самок.

2.3. Манипуляции с эмбрионами.

2.3.1. Получение оплодотворенных яйцеклеток лабораторных животных (мышей) для цитоплазматической микроинъекции.

2.3.2. Цитоплазматическая микроинъекция митохондриальной фракции человека в оплодотворенные яйцеклетки лабораторных мышей.

2.3.3. Культивирование доимплантационных зародышей in vitro.

2.3.4. Разделение на бластомеры культивируемых in vitro зародышей 2-х и 4-х клеточной стадии развития.

2.3.5. Трансплантация зигот самкам-реципиентам.

2.4. Выделение ДНК.

2.4.1. Выделение ДНК из зародышей 7ого-10ого дня внутриутробного развития.

2.4.2. Выделение ДНК из зародышей 1 loro и 13ого дня внутриутробного развития и новорожденных мышей.

2.4.3. Выделение ДНК для контроля.

2.5. ПЦР-анализ.

2.5.1. Разработка видоспецифичных праймеров к мтДНК человека и мыши.

2.5.2. Анализ ДНК зародышей доимплантационных сроков развития.

2.5.3. Анализ ДНК постимплантационных зародышей и новорожденных мышей.

2.6. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле (ПААГ).

3. Результаты.

4. Обсуждение результатов.

5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение трансгенных мышей, несущих митохондриальную ДНК человека, передаваемую потомству"

В середине девятнадцатого века митохондрии впервые привлекли внимание исследователей механизмов клеточной жизнедеятельности. Многочисленные, легко выделяемые, являющиеся богатым источником ферментов, необходимых для выполнения разнообразных функций, эти органеллы были в центре внимания при изучении основных принципов клеточной энергетики. По прошествии многих лет, когда исследования функций ядерных генов стали более доступными, интерес молекулярных биологов к митохондриям стал спадать.

Однако, публикации последних двадцати лет говорят о том, что митохондрии вновь находятся в центре внимания исследователей, поскольку доказана их значимость для таких областей науки о жизни, как эволюционная биология, исследование механизма клеточной смерти, молекулярная медицина и даже судебная экспертиза (Kiberstis, 1999).

Одним из наиболее важных достижений было признание того, что митохондрии играют центральную роль в регуляции программируемой клеточной смерти или апоптоза. Как показывают многочисленные исследования, митохондрии способны вызывать клеточную гибель несколькими способами: нарушением транспорта электронов через митохондриальные мембраны; высвобождением/активацией белков, которые участвуют в апоптозе, изменением клеточного редокс-потенциала. По отдельности или вместе все эти механизмы помогут объяснить, как митохондриальные дефекты способствуют старению, развитию дегенеративных заболеваний человека и малигнизации клеток (Kroemer et aL, 1998, Tsujimoto and Shimizu, 2.000).

Изучение митохондрий играет также существенную роль в эволюционной биологии. Недавно проведенный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей примитивного митохондриального и эубактериального геномов внес существенные дополнения в известную популярную теорию эндосимбионтного происхождения митохондрий (Gray et aL, 1999). Существует и новое направление в использовании митохондриальной ДНК (мтДНК) как критерия для определения родства и уточнения происхождения разных видов в ходе эволюции (Gadaleta et al, 1989).

Около 60 лет назад было открыто первое заболевание, связанное с разобщением окисления и фосфорилирования в митохондриях, что положило начало исследовании «болезней окислительного фосфорилирования» (OXPIIOS diseases), отличающихся тяжелой симптоматикой, зачастую с неблагоприятным исходом. В настоящее время известно около 120 нозологических единиц и синдромов. Вызванные структурными нарушениями в ДНК митохондрий, эти синдромы наследуются по материнской линии (при слиянии мужской и женской гамет организм получает почти все свои митохондрии из яйцеклетки).

Особенностью наследственных митохондриальных болезней является зачастую полное отсутствие патологических признаков в первые годы жизни человека. Это вызвано присутствием в клетках растущего организма сотен митохондрий как с мутантной, так и с нормальной ДНК, что получило название гетероплазмии. Содержание митохондрий с мутантной митохондриалыюй ДНК (мтДНК) нарастает постепенно, и будущие пациенты нередко достигают половозрелого возраста и дают потомство, несущее те же мутации в мтДНК. Когда количество мутантных копий мтДНК, неспособных кодировать тРНК или белковые цепи ферментов, достигает в клетке «порога концентрации», энергетический метаболизм становится недостаточным, что и проявляется в виде заболевания с симптомами дегенерации разных органов.

Сегодня установлена природа ряда мутаций, вызывающих болезни OXPHOS. Это могут быть как точечные мутации, так и обширные делеции, затрагивающие несколько генов. Однако, до сих пор неизвестны многие молекулярные механизмы, обеспечивающие возникновение и развитие симптомов этих тяжелых заболеваний. Это создает трудности для разработки методов лечения митохондриальных болезней. Среди причин относительно слабого развития медицины в этой области - отсутствие возможности изучения митохондриальных болезней на животных, поскольку у них такие заболевания не выявлены.

Актуальность исследований, результаты которых описаны в последующих главах, обусловлена тем, что несмотря на обнаружение еще в 80-х годах прошлого столетия причинной связи между мутациями в мтДНК и возникновением митохондриальных заболеваний, до сих пор не была разработана модель животного с симптомами, сходными с проявлениями болезни у человека. Между тем, отсутствие такой модели серьезно затрудняет как научные исследования, так и испытания лекарственных препаратов, предлагаемых для облегчения проявлений этой тяжелой наследственной патологии. Перспективным подходом к изучению данной проблемы считается создание так называемых «трансмитохондриальных» животных. Работы по введению митохондрий одного вида животных в клетки другого вида уже имеют заметный успех (Pinkert et al., 1997; Irwin et al., 1999; Rinaudo et al., 1999). Обнадеживающие результаты этих пока еще единичных работ позволяют рассчитывать на то, что в недалеком будущем генно-инженерная модель животного с симптомами «болезни окислительного фосфорилирования» будет разработана, и у медицины появятся шансы продвинуться вперед.

Целью нашего исследования являлось получение трансгенных мышей, несущих в органах/тканях мтДНК человека и изучение возможности их дальнейшего использования для создания модели митохондриального заболевания человека.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) осуществление доставки митохондрий человека в оплодотворенные яйцеклетки лабораторной мыши и изучение влияния чужеродных митохондрий на развитие мышиных эмбрионов;

2) контроль за сохранением либо элиминацией мтДНК человека на разных стадиях развития организма мыши; .

3) изучение распределения чужеродной мтДНК в организме трансмитохондриальных мышей;

4) проверка гипотезы о возможной гетероплазмии в тканях/органах животных;

5) изучение возможности передачи чужеродной митохондриальной ДНК потомству трансмитохондриальных мышей.

Научная новизна проведенных исследований состоит в том, что впервые в мире получены мыши, несущие в тканях/органах мтДНК человека, сосуществующую с собственной мтДНК животных. Показана также возможность передачи по материнской линии чужеродной мтДНК от трансмитохондриальных мышей их потомству.

Научно-практическое значение работы состоит в том, что намечены конкретные шаги для получения животных, являющихся адекватной моделью «болезней окислительного фосфорилирования», вызываемых мутациями в мтДНК и передаваемых по материнской линии. Получение такой модели предоставит возможность для разработки новых подходов к лечению подобных заболеваний, в том числе для испытания новых лекарственных средств.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Показано, что введение в оплодотворенные яйцеклетки мыши митохондрий человека не оказывает отрицательного эффекта на развитие эмбрионов животных.

2) Установлено, что мтДНК человека сохраняется в зародышах мыши, развивающихся как in vitro, так и in vivo, а также в тканях новорожденных животных.

3) Чужеродная мтДНК распределяется неравномерно в организме трансмитохондриальиых мышей.

4) В экспериментах по получению трансмитохондриальных мышей была создана искусственная гетероплазмия, когда в образцах тканей/органов животных наряду с собственной мтДНК обнаруживалась мтДНК человека.

5) Показана возможность передачи мтДНК человека от поколения F0 трансмитохондриальных мышей следующему поколению по материнской линии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научной конференции, посвященной 110-летию Института Экспериментальной медицины, Санкт-Петербург, 2000 г; на X Международном Конгрессе «Генетика человека», Вена, 2001г.; на конференции EUROMIT-5 (The Mitochondria Research Society), Венеция, 2001; на IV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей, Санкт-Петербург, 2001; на III съезде Биохимического Общества, Санкт-Петербург, 2002; на I Всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва, 2002.

Основное содержание диссертации опубликовано в 2х научных статьях и тезисах 7й докладов.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Соколова, Василина Александровна

5. Выводы

1) Митохондрии человека, введенные в оплодотворенные яйцеклетки мыши методом микроинъекции, не оказывают отрицательного эффекта на развитие эмбрионов животных.

2) мтДНК человека стабильно сохраняется в зародышах мыши, развивающихся in vitro, вплоть до стадии бластоцисты.

3) Искусственно введенная мтДНК человека обнаруживается в мышиных зародышах, развивающихся in vivo, (по крайней мере, до 13-го дня внутриутробного развития), а также в тканях новорожденных животных.

4) Неравномерное распределение чужеродной мтДНК наблюдается уже в ходе первых делений зародыша мыши и сохраняется при дальнейшем развитии организма. В результате чужеродный генетический материал обнаруживается не во всех органах постимплантационных зародышей и новорожденных животных.

5) Во всех образцах тканей/органов полученных трансмитохондриальных животных наряду с мтДНК человека обнаруживалась собственная мтДНК мыши, что свидетельствует о наличии гетероплазмии;

6) Полученные трансмитохондриальные мыши поколения F0 могут передавать мтДНК человека по материнской линии следующему поколению Fi.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Василина Александровна, Санкт-Петербург

1. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Molecular biology of the cell// 3rd ed. Garland Publishing, Inc., New York, 1994,655-656.

2. Albina J.E. and Reichner J.S. Role of nitric oxide in mediation of macrophage cytotoxicity and apoptosis // Cancer Metastasis Rev.,1998,17:39-53

3. Anderson E., Condon W., Sharp D. A study of oogenesis and early embryogenesis in the rabbit, Oryctolagus cuniculus, with special reference to the structural changes of mitochondria // J Morphol., 1970,130:67-92.

4. Anderson S., Bankier A.T., Barrel B.G. et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome // Nature, 1981,290, № 2:457 465.

5. Antoshechkin I., Bogenhagen D. F., Mastrangelo I.A. The HMG-box mitochondrial transcription factor xl-mtTFA binds DNA as a tetramer to activate bidirectional transcription//EMBO J., 1997, 16:3198-3206.

6. Bakker H.D., Schölte H.R., Jenesons J.A. et al. Vitamin-responsive complex I deficiency in a myopathic patient with increased activity of the terminal respiratory chain and lactic acidosis // J. Inher.Metab.Dis., 1994, 17: 196-204.

7. Ballinger S.W., Shoffner J.M., Hedaya E.V. et al. Maternally transmitted diabetes and deafness associated with a 10.4 kB mitohcondrial DNA deletion // Nat.Genet., 1992, 1,№ 1: 11-15.

8. Bal-Price A.and Brown G.C. Nitric-oxide-induced necrosis and apoptosis in PC 12 cells mediated by mitochondria. // J Neurochem., 2000,75: 1455-1464

9. Beal MF. Mitochondrial dysfuction in neurodegenerative diseases // Biochim Biophys Acta, 1998, 1366: 211-223.

10. Bell G.I. Caram J.H., Rutter W.J. Polymorphic DNA region adjacent to the 5'-end of the human insulin gene. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1981, 78: 57595763.

11. Beitran B, Orsi A, Clementi E, Moncada S. Oxidative stress and S-nitrosylation of proteins in cells // Br J Pharmacol., 2000, 129: 953-960.

12. Bereiter-Hahn J., Voth M. Dynamics of mitochondria in living cells: shape changes, dislocations, fusion, and fission of mitochondria // Microsc Res Tech., 1994, 27:198-219.

13. Bibb M.J., Van Etten R.A., Wright K., Walberg M., Clayton D. Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA. // Cell, 1981, 26: 167-180.

14. Bogenhagen D.F. Repair of mtDNA in vertebrates // Am. J. Hum. Genet., 1999, 64, № 7: 1276-1281

15. Boldogh I., Vojtov N., Karmon S., Pon L.A. Interaction between mitochondria and the actin cytoskeleton in budding yeast requires two integral mitochondria outer membrane proteins, Mmmlp and MdmlOp // J. Cell Biol., 1998, 141: 1371-1381.

16. Boore J.L. Animal mitochondrial genomes // Nucl Acis Res., 1999, 27: 17671780.

17. Bridge D., Cunningham C.W., Schierwater B., DeSalle R., Buss L.W. Class-Ievel relationships in the phylum Cnidaria: evidence from mitochondrial genome structure // PN AS USA, 1992, 89: 8750-8753.

18. Brockington M., Alsanjari N., Sweeney M.G. et al. Kearns-Sayre syndrome associated with mitochondrial DNA deletion or duplication: a molecular genetic and pathological study // J. Neurol. Sei., 1995,11994, M 31, № 1: 78 87.

19. Brown M.D, Wallace D.C. Molecular basis of mitochondrial DNA disease // J. Bioenergetics and Biomembranes, 1994,26, № 3: 273 289.

20. Bullough D.A., Ceccarelli E.A., Roise D., Allison W.S. Inhibition of the bovine-heart mitochondrial Fi-ATPase by cationic dyes and amphipathic peptides // Biochim. Biophys. Acta, 1989, 975: 377-383.

21. Calkhoven C.F., Geert A.B. Multiple steps in the regulation transcription-factors level and activity// Biochem. J., 1996, 317: 329-342.

22. Chao D.T. and Korsmeyer S.J. BCL-2 family: regulators of cell death // Annu Rev Immunol., 1998, 16: 395-419.

23. Chapman and Hall, a Textbook of Histology, 12th edition, 1994

24. Chen X., Prosser R., Simonetti S. et. AI. Rearranged mitochondrial genomes are present in human oocytes // Am.J.Hum.Genet., 1995, 57,№ 3: 239 247.

25. Chomyn A., Attardi G. Recent advances on mitochondrial biogenesis // "Molecular Mechanisms in Bioenergetics", L. Ernster (Ed.), 1992,483-509.

26. Christianson T.W., Clayton D.A. A tridecamer DNA sequence supports human mitochondrial RNA 3'-end formation in vitro // Mol Cell Biol., 1988, 8: 4502-4509.

27. Clark K.M., Watt D.J., Lightowlers R.N., Johnson M.A., Relvas J.B., Taanman J.-W., Turnbull D.M. SCID mice containing muscle with humna mitochondrial DNA mutations // J Clin Invest., 1998, 102: 2090-2095.

28. Clayton D.A. Replication and transcription of vertebrate mitochondrial DNA // Ann Rev Cell Biol., 1991, 7: 453-478.

29. Copeland W.C., Ponamarev M.V., Nguyen D., Kunkel T.A., Longley M.J., Mutations in DNA polymerase gamma cause error prone DNA synthesis in human mitochondrial disorders // Acta Biochimica polonica, 2003, 50, № 1: 155-167

30. Cortese J.D. Stimulation of rat liver mitochondrial fusion by an outer membrane-derived aluminum fluoride-sensitive protein fraction // Exp Cell Res., 1998,240: 122-133.

31. Cummins J.M., Wakayama T., Yanagimachi R. Fate of microinjected sperm components in the mouse oocyte and embryo // Zygote, 1997, 5: 301-308.

32. Curgy J.J. The mitoribosomes. // Biol. Cell, 1985, 1: 1-38.

33. Dairaghi D.J., Shadel G.S., Clayton D.A. Human mitochondrial transcription factor A and promoter spacing integrity are required for transcription initiation // Biochim Biophys Acta, 1995, 1271: 127-134.

34. Danan C., Sternberg D., Van Steirteghem A. et al. Evaluation of paternal mitochondrial inheritance in neonates born after intracytoplasmic sperm injection // Am.J.Hum.Genet., 1999, 65, № 3: 463 473.

35. Daum G. Lipids ofmitochondria//Biochim Biophys Acta, 1985, 882: 1-42.

36. Davis AF and Clayton DA. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells // J. Cell Biol., 1996, 135: 883-893

37. Desjardins P., Frost E., Morais R. Ethidium bromide-induced loss of mitochondrial DNA from primary chicken embryo fibroblasts // Mol Cell Biol, 1985, 5: 1163-1169.

38. DiMauro S., Bonilla E. Mitochondrial encephalomyopathies. Rosenberg R.N., Prusiner S.B., DiMauro S., Barchi R. (eds.) // The molecular and genetic basis of neurological disease. 2nd ed. Boston: Butterworth-Heinemann, Boston, 1997,201 -235.

39. Dunbar D.R., Moonie P.A., Swingler R.J. et al. Maternally transmitted partial direct tandem duplication of mitochondrial DNA associated with diabetes mellitus // Hum. Mol. Genet., 1993, 2, № 7: 1619- 1624.

40. Ebert K.M., Alcivar A., Liem h., Goggins R., Hecht N.B. Mouse zygotes injected with mitochondria develop normally but the exogenous mitochondria are not detectable in the progeny// Mol Reprod Dev., 1989, 1: 156-163.

41. Enriquez J.A., Fernandez-Silva P., Montoya J. Autonomous regulation in mammalian mitochondrial DNA transcription // Biol Chem., 1999, 380: 737-747.

42. Fiore C., Trezeguet V., Le Saux A., Roux P., Schwimmer C., Dianoux A.C., Noel F., Lauquin G.J.-M., Brandolin G., Vignalis P.V. The mitochondrial ADP/ATP carrier: structural., physiological and pathological aspects // Biochimie, 1998, 80: 137-150

43. Frey T.G., Mannella C.A. The internal structure of mitochondria // TIBS, 2000,25:319-324.

44. Gadaleta G., Pepe G., De Candia G. The complete nucleotide sequence of the Rattus norvegicus mitochondrial genome: cryptic signals revealed by comparative analysis between Vertebrates// Journal of Molecular Evolution, 1989,28:497-516.

45. Gilmore and Wilson. The use of chloromethyl-X-rosamine (Mitotracker red) to measure loss of mitochondrial membrane potential in apoptotic cells is incompatible with cell fixation // Cytometry, 1999, 36, № 4: 355-358.

46. Gottlieb R.A. Programmed cell death. // Drug News Perspect., 2000, 13: 471476.

47. Gray M.W., Burger G. and Lang B.F. Mitochondrial evolution// Science, 1999,283: 1476-1481.

48. Gray M.W., Lang B.F. Transcription in chloroplasts and mitochondria: a tale of two polymerases // Trends Microbiol., 1998, 6: 1-3.

49. Gyllensten U., Wharton D., Josefsson A., Wilson A.C. Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice //Nature, 1991, 352: 255-257.

50. Haunstetter A. and Izumo S. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease // Circ Res., 1998, 15: 111 1-1129.

51. Hayashi J.-I., Takemitsu M., Goto Y.-I., Nonaka I. Human mitochondria and mitochondrial genome function as a single dynamic cellular unit // J Cell Biol., 1994, 125: 43-50

52. Herzberg N.H., Zwart R., Wolterman R.A., Ruiter J.P.N., Wanders R.J.A., Bolhuis P.A. Van den Bogert C. Differentiation and proliferation of respiration-deficient human myoblasts // BBA, 1993, 1181: 63-67.

53. Higuti T., Niimi S., Saito R., Nakosima S., Ohe T., Tani I., Yoshimura T. Rhodamine 6G, inhibitor of both H+-ejections from mitochondria energized with ATP and with respiratory substrates // Biochim Biophys Acta, 1980, 593: 463467.

54. Hobbs HH, Brown MS, Goldstein JL (1992) Molecular genetics of the LDL receptor gene in familial hypercholesterolemia.// Hum. Mut., 1992, 1: 445-466.

55. Hofhaus G., Gattermann N. Mitochondria harbouring mutant mtDNA a cuckoo in the nest? // Biol Chem, 1999, 380: 871-877.

56. Holt I.J, Harding A.E, Cooper J.M. et al. Mitochondrial myopathies: clinical and biochemical features of 30 patients with major deletions of muscle mitochondrial DNA// Ann.NeuroL, 1989, 26, № 5: .699 708.

57. Holt I.J., Harding A.E., Morgan-Hughes J.A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies // Nature, 1988, 331, № 6: 717-719.

58. Houshmand M., Holme E., Hanson C., Wennerholm U.B., Hamberger L. Is paternal mitochondrial DNA transferred to the offspring following intracytoplasmic sperm injection? // J Assist Reprod Genet., 1997, 14: 223-227

59. Inoue K, Nakada K, Ogura A, Isobe K, Goto Y, Nonaka I, Hayashi JI. Generation of mice with mitochondrial dysfunction by introducing mouse mtDNA carrying a deletion into zygotes. // Nat Genet., 2000, 26: 176-181

60. Irwin M.H., Johnson L.W., Pinkert C.A. Isolation and microinjection of somatic cell-derived mitochondria and germline heteroplasmy in transmitochondrial mice // Transgen Res., 1999, 8: 119-123.

61. Izquierdo J.M., Cuezva J.M. Thyroid hormones promote transcriprional activation of the nuclear gene cp<|ing for mitochondrial beta-F(l)-ATPase in rat liver//FEBS Lett., 1993,323: 109-112.

62. Jenuth JP, Peterson AC, Shoubridge EA (1997) Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice // Nature Genet, 16: 93-95.

63. Johnson A.A., Tsai Y.-C., Graves S.W., Johnson K.A. Human mitochondrial DNA polymerase holoenzyme: reconstitution and characterization // Biochemistry, 2000, 39: 1702-1708.

64. Karpati G., Arnold D., Matthews P. et al. Correlative multidisciplinary approach to the study of mitochondrial encephalomyopathies// Review Neurology, 1991, 147, № 6-7: 455-461.

65. Kaukonen J., Juselius J.K., Tiranti V., Kyttaelae A., Zeviani M., Comi G.P., Keraenen S., Peltonen L., Suomalainen A. Role of adenine nucleotide translocator 1 in mtDNA maintanance // Science, 2000, 289 782-785.

66. Keddie E.M., Higazi T., Unnasch T.R. The mitochondrial genome of Onchocerca volvulus: sequence, structure and phylogenetic analysis // Mol Biochem Patasitol., 1998,95: 111-127.

67. Kenyon L and Moraes CT (1997) Expanding the functional human mitochondrial DNA database by the establishment of primate xenomitochondrial cybrids// Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1997, 94: 9131-9135

68. Kiberstis P.A. Mitochondria make a comeback// Science, 1999, 283: 1475.

69. Kidd V.J. Proteolytic activities that mediate apoptosis // Annu Rev Physiol., 1998, 60: 533-573.

70. King M.P., Attardi G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation // Science, 1989, 246: 500-503

71. King MP, Attardi G. Injection of mitochondria into human cells leads to rapid replacement of the endogeneous mitochondrial DNA // Cell, 1988, 52: 811-819.

72. Koc EC, Burkhart W, Blackburn K, Moyer MB, Schlatzer DM, Moseley A, Spremulli LL. The large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Analysis of the complement of ribosomal proteins present. // J Biol Chem., 2001, 276: 43958-43969.

73. Kowaltowski AJ, Castilho RF, Vercesi AE. Mitochondrial permeability transition and oxidative stress // FEBS Lett., 2001, 495: 12-15.

74. Krippner A., Matsumo-Yagi A., Gottlieb R.A., Babior B.M. Loss of function of cytochrome c in Jurkat cells undergoing Fas-mediated apoptosis // J Biol Chem., 1996, 271: 21629-21636.

75. Kroemer G, Dallaporta B, Resche-Rigon M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. // Annu Rev Physiol., 1998, 60: 619-642.

76. Larsson N.-G, Holme E., Kristiansson B. et al. Progressive increase of the mutated mitochondrial DNA fraction in Kearns-Sayre Syndrome // Pediatric Research., 1990, 28, №2: 131-136

77. Larsson N.-G., Eiken H. G., Boman H. et al. Lack of transmission of deleted mtDNA from a woman with Kearns-Sayer syndrome to her child // American Journal of Human Genetics, 1992, 50: 360-363.

78. Levy S.E., Waymire K.G., Kim Y.K., MacGregor G.R., Wallace D.C. Transfer of chloramphenicol-resistant mitochondrial DNA into the chimeric mouse//Transgen Res., 1999, 8: 137-145.

79. Lewin B. Genes VII // Oxford University Press Inc., New York, 2000, 729731.

80. Li F., Srinivasan A., Wang Y., Armstrong R.C., Tomaselli K.J. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c // J Biol Chem., 1997, 272: 30299-30305.

81. Linnane A.W., Esposti M.D., Generowicz M. et al. The universality of bioenegetic disease and amelioration with redox therapy // Biochimica et Biophysica Acta, 1995,1271: 191-194.

82. Luft R. The development of mitochondrial medicine // PNAS USA, 1994, 91: 8731-8738.

83. Majamaa K., Rusanen H., Remes A.M., Pyhtinen J., Hassinen I.E. Increase of blood NAD+ and attenuation of lactacidemia during nicotinamide treatment of a patient with the MELAS syndrome // Life Sc., 1996, 58: 691-699.

84. Manfredi G., Thyagarajan D., Papadopoulou L.C., Pallotti F., Schon E.A. The fate of human sperm-derived mtDNA in somatic cells// Am.J.Hum. Genet., 1997, 61, № 9: 953 -960.

85. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. // Cold Spring Harbor Lab Press, N.Y., 1982

86. Marchington D.R., Barlow D., Poulton J. Transmitochondrial mice carrying resistance to chloramphenicol on mitochondrial DNA: developing the first model of mitochondrial DNA disease // Nature Med., 1999, 5: 957-960.

87. Maro B., Kubiak J., Gueth C., de Peunart H., Houliston E., Weber M., Antony C., Agkion J. Cytoskeleton organization during oogenesis fertilization and preimplantation development of the mouse // Int J Dev Biol., 1990, 34: 127137.

88. Martinus R.D., Garth G.P., Webster T.L., Cartwright P., Naylor D.J., Hoj P.B., Hoogenraad N.J. Selective induction of mitochondrial chaperones in response to loss of the mitochondrial genome // Eur J Biochem., 1996, 240: 98103.

89. Matthews R.T., Yang L., Browne S., Baik M., Beal F. Coenzyme Qio administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects//PNAS USA, 1998, 95: 8892-8897.

90. Meirelles F.V., Smith L.C. Mitochondrial genotype segregation during preimplantation development in mouse heteroplasmic embryos // Genetics, 1998, 148: 877-883.

91. Meirelles FV and Smith LC. Mitochondrial genotype segregation in a mouse heteroplasmic lineage produced by embryonic karyoplast transplantation. // Genetics, 1997, 145:445-451.

92. Mignotte F., tourte M., Mounolou J.C. Segregation of mitochondria in the cytoplasm of Xenopus vitellogenic oocytes // Biol Cell, 1987, 60: 97-102.

93. Miller K, Sharer K, Suhan J, Koretsky AP. Exrpression of functional creatine kinase in liver of transgenic mice // Am J Physiol, 1997, 272: 1193-1202.

94. Moraes C.T., DiMauro S., Zeviani M. et al. Mitochondrial DNA deletions in progressive external ophthalmoplegia and Kearns-Sayre syndrome // N.Engl. J.Med., 1989, 320, № 11: 1293-1299.

95. Moraes CT, Kenyon L, Hao HL (1999) Mechanisms of human mitochondrial DNA maintenance: the determining role of primary sequence and length over function.// Mol. Biol. Cell, 1999, 10: 3345-3356.

96. Muggleton-Harris A.L., Brown J.J.G. Cytoplasmic factors influence mitochondrial reorganization and resumption of cleavage during culture of early mouse embryos // Human Reprod., 1988, 3: 1020-1028.

97. Nass M.M.K. Abnormal DNA pattern in animal mitochondria: ethidium bromide-induced breakdown of closed circular DNA and conditions leading to oligomer accumulation // PNAS USA, 1970, 67: 1926-1933.

98. Nass M.M.K. Differential effects of ehtidium bromide on mitochondrial and nuclear DNA synthesis in vivo in cultured mammalian cells // Exp Cell Res., 1972,72:211-222.

99. Nass M.M.K., Nass S. Intramitochondrial fibers with DNA characteristics// J.Cell.Biol., 1963,19: 593-629.

100. Nelson B.D., Luciakova K., Li R., Betina S. The role of thyroid hormone and promoter diversity in the regulation of nuclear encoded mitochondrial proteins // Biochim Biophys Acta, 1995, 1271: 85-91.

101. Ozawa T. Mechanism of somatic mitochondrial DNA mutations associated with age and diseases// Biochim.Biophys.Acta, 1995, 1271, № 2: 177- 189

102. Palmer J.D., Adams K.L., Cho Y., Parkinson C.L., Qiu Y.-L., Song K. Dynamics evolution of plant mitochondrial genomes: mobile genes and introns and highly variable mutation rates // PNAS USA, 2000, 97: 6960-6966.

103. Parker W.D., Oley C.A. and. Parks J.K. A defect in mitochondrial electron-transport activity (NADH-coenzyme Q oxidoreductase) in Leber's Hereditary Optic Neuropathy II The New England Journal of Medicine, 1989, 320, №20: 1331-1333.

104. Parker WD, Swerdlow RH. Mitochondrial genetics'98. Mitochondrial dysfuction in idiopatic Parkinson disease // Am J Hum Genet., 1998, 62: 758762.

105. Peterson P.L. The treatment of mitochondrial myopathies and encephalomyopathies // Biochimica et Biophysika Acta, 1995, 1271: 275-280.

106. Piccolo G., Banfi P., Azan G. et al. Biological markers of oxidative stress in mitochondrial myopathies with progressive external ophthalmoplegia // Journal of Neurological Science, 1991, 105: 57-60.

107. Piko L., Matsumoto L. Number of mitochondria and some properties of mitochondrial DNA in the mouse egg // Dev Biol, 1976,49: 1-10.

108. Piky L., Taylor KD. Amounts of mitochondrial DNA and abundance of some mitochondrial gene transcripts in early mouse embryos // Dev Biol., 1987, 123: 364-374.

109. Pinkert CA, Irwin MH, Johnson LW, Moffatt RJ. Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection // Transgen Res., 1997, 6: 379-383

110. Poulton J., Morten K.J., Weber K., Brown G.K., Bindoff L. Are duplications of mitochondrial DNA characteristic of Kearns-Sayre syndrome? // Hum.Mol. Genet., 1994, 3, № 8: 947-951.

111. Prieur B., Bismuth J., Delaval E. Effects of adrenal steroid hormones on mitochondrial maturation during the late fetal period 11 Eur J Biochem., 1998, 252: 194-199.

112. Pusyriov A.T., Mazo A.M., Minchenko A.G., Ardonina T.A. Transcriptional mapping of the rat liver mitochondrial genome // Gene, 1983, 24, № 1: 115-124.

113. Reynier P., Figarella-Brander D., Serratrice G. et al. Association of deletion and homoplasmic point mutation of the mitochondrial DNA in an oculary myopathy// Biochemical and Biophysical Research Communication, 1994, 202, №3: 1606-1611.

114. Richter C. Do mitochondrial DNA fragments promote cancer and aging? // FEBS Lett., 1988, 241, № 1:1-5.

115. Roe B.A., Ma D.P., Wilson R.K., Wong J.F. The nucleotide sequence of the Xenopus laevis mitochondrial genome. // J.Biol.Chem., 1985, 260, № 17: 9759-9774.

116. Rogers S.L., Gelfand V.l. Membrane trafficking, organelle transport, and the cytoskeleton // Curr Opin Cell Biol., 2000, 12: 57-62.

117. Rosenberg RN, Prusiner SB, DiMauro S, Barchi RL (eds) // The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease. Butterworth-Heinemann. Boston, 1997, 237-269.

118. Rosing H.S., Hopkins L.C, Wallace D.C. et al. Maternally inherited mitochondrial myopathy and myoclonic epilepsy// Annals of Neurology, 1985, 17, №3:228-237.

119. Rosse T., Olivier R., Monney L., Rager M., Conus S., Feilay I., Jansen B., Börner C. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-indeced release of cytochrome c // Nature, 1998, 391: 496-499.

120. Rötig A., Colonna M., Bonnefont J.P. et al. Mitochondrial DNA deletion in Pearson's marrow/pancreas syndrome// Lancet., 1989, 9: 902 903.

121. Savontaus M.-L. MtDNA mutations in Leber's hereditary optic neuropathy// Biochimica et Biophysica Acta, 1995, 1271: 261-263.

122. Scarpulla R.C. Nuclear control of respiratory chain expression in mammalian cells // J Bioenerg Biomembr., 1997, 29: 109-121.

123. Schapira A.H.V. Mitochondrial involvement in Parkinson's disease, Huntington's disease, hereditary spastic paraplegia and Friedreich's ataxia// Biochim.Biophys.Acta, 1999, 1410, № 5: 159 170.

124. Schnaitman C., Greenawalt J.W. Enzymatic properties of the inner and outer membranes of rat liver mitochondria // , 1968, 38: 158-175.

125. Schon E.A., Bonilla E., DiMauro S. Mitochondrial DNA mutations and pathogenesis// J. Bioenerg.Biomembr., 1997,. 29, № 2: 131 -149.

126. Schon E.A., DiMauro S. Mitochondrial diseases// Karger Gazette, 1994, № 58: 2-4.

127. Schultz R.A., Swoap S.J., McDaniel L.D., Zhang B., Koon E.C., Garry D.J., Li K., Williams R.S. Differential expression of mitochondrial DNA replication factors in mammalian tissues // J Biol Chem., 1998, 272: 3447-3451.

128. Seibel P., Trappe J., Villani G. et al. Transfection of mitochondria: strategy towards a gene therapy of mitochondrial DNA diseases// Nucleic Acids Res., 1995, 23: 10-17.

129. Shapira A.H.V. Mitochondrial disorders: an overview // J Bioen Biom., 1997,29: 105-107.

130. Shimizu S., Eguchi Y., Kamiike W., Funahashi Y., Mignon A., Lacronique V., Matsuda H., Tsujimoto Y. Bcl-2 prevents apoptotic mitochondrial dysfunction by regulating proton flux // PNAS USA, 1998, 95: 1455-1459.

131. Shoubridge EA. Segregation of mitochondrial DNAs carrying a pathogenic point mutation (tRNAleu3243) in cybrid cells // Biochem Biophys Res Com., 1995,213: 189-195.

132. Silvestein T.P. Transmembrane measurements across bioenergetic membranes // Biochim Biophys Acta, 1993, 1183: 1-3.

133. Simonetti S., Chen X., DiMauro S., Schon E.A. Accumulation of deletions in human mitochondrial DNA during normal aging: analysis by quantitative VCR// Biochim.Biophys.Acta, 1992, 1180, № 12: 113 122

134. Skulachev V.P. Mitochondria in the programmed death phenomena; a principle of biology: "it is better to die than to be wrong". // IUBMB Life, 2000, 49: 365-373.

135. Smeitink J., Heuvel L., Di Mauro S. The genetics and pathology of oxidative phosporylation. // Nature Rev Genet., 2001, 5: 342-352.

136. Sobreira C., Hirano M., Shanske S. et al. Mitochondnial en-cephalomyopathy with coenzyme Q10 deficienc// Neurology, 1998, 48: 12381243.

137. St John J., Sakkas D., Dimitriadi K.at al. Failure of elimination of paternal mitochondrial DNA in abnormal embryos// Lancet., 2000, 355, № 3: 200.

138. Steihauser S., Beekert S., Capesius I., Malek O., Knoop V. Plant mitochondria RNA editing // J Mol Evol., 1999, 48: 303-312.

139. Stern S., Biggers J.D., Anderson E. Mitochondria and early development of the mouse//J Exp Zool., 1971, 176: 179-192.

140. Sutovsky P., Schatten G. Paternal contributions to the mammalian zygote: fertilization after sperm-egg fusion // Int Rev Cytol., 2000, 195: 1-65.

141. Taanman J.-W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. // Biochem. Biophys. Acta, 1999, 1410: 103-123.

142. Tokura T., Noda Y., Goto Y., Mori T. Sequential observation of mitochondrial distribution in mouse oocytes and embryos // J Assist Reprod Genet., 1993, 10: 417-426.

143. Torbergsen T., Mathies E. and Aalsy J. Epilepsy in a mitochondrial disorders// Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 1991, 54: 10731076.

144. Trounce I., Byrne E., Marzuki S. Decline in skeletal muscle mitochondrial respiratory chain function: possible factor in ageing// Lancet., 1989, 8639; 637 -639

145. Trounce I., Wallace D.C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells // Somat Cells Mol Genet., 1996, 22: 81-85.

146. Tsujimoto Y. and Shimizu S. VDAC regulation by the Bcl-2 family of proteins // Cell Death Differ., 2000, 7: 1174-1181.

147. Van den Bogert C., Speibrink J.N., Dekker H.L. Relationship between culture conditions and the dependency on mitochondrial function of mammalian cell proliferation // J Cell Physiol., 1992, 152: 632-638.

148. Wallace D.C. Diseases of the mitochondrial DNA // Ann Rev Biochem., 1992,61: 1175-212.

149. Wallace D.C. Mitochondrial genetics: a paradigm for aging and degenerative diseases? // Science, 1992a, 256: 628-632.

150. Wallace D.C. Mitochondrial DNA mutations in diseases of energy metabolism// J.Bioenerg.Biomembr.,1994a, 26, N 2: 241-250.

151. Wallace D.C. Mitochondrial DNA sequence variation in human evolution and disease// Proc. Natl. Acad. Sei., 1994, 91: 8739-8746

152. Wallace D.C. Mitochondrial DNA variation in human evolution, degenerative disease, and aging// American Journal of Human Genetic, 1995, 57: 201-223

153. Wallace D.C. Structure and evolution of organelle genomes// Microbiol Rev., 1982a, 46, N 3: 208 240.

154. Wallace D.C. Techniques in somatic cell genetics// Plenum, New York, 1982: 159-187.

155. Wallace D.C., Brown M.D, Lott M.T. Mitochondrial genetics// Principles and practice of medical genetics. Churchill Livingstone, London, 1997: 277-332.

156. Wallace D.C., Shoffner J.M., Trounce I. et al. Mitochondrial DNA mutation in human degenerative diseases and aging// Biochimica et Biophysica Acta, 1995, 1271: 141-151.

157. Wallace D.C., Shoffner J.M., Watts R.L., Juncos J.L., Torroni A. Mitochondrial oxidative phosphorylation defects in Parkinson's disease// Ann.Neurol., 1992: 32, N2:113-114.

158. Wallace D.C., Singh G., Lott M.T. et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy// Science, 1988, 242, N11: 1427-1430.

159. Wang T.W., Clayton D.A. DNA primase of human mitochondria is associated with structural RNA that is essential for enzymatic activity // Cell, 1986, 45: 817-825.

160. Zylber E., Vesco C., Penman S. Selective inhibition of the synthesis of mitochondria-associated RNA by ethidium bromide // J Mol Biol., 1969, 44: 195-204.