Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека и сравнение их характеристик при культивировании в разных системах

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Получение постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека и сравнение их характеристик при культивировании в разных системах"

На правах рукописи

005048256

КОЛЬЦОВА Анна Михайловна

ПОЛУЧЕНИЕ ПОСТОЯННЫХ ЛИНИЙ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И СРАВНЕНИЕ ИХ ХАРАКТЕРИСТИК ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В РАЗНЫХ СИСТЕМАХ

03.03.04.— Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ЯНВ 2013

Санкт-Петербург - 2012

005048256

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук

Полянская Галина Георгиевна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Михельсоп Виктор Михайлович Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук Васильев Андрей Валентинович Институт биологии развития им Н.К. Кольцова,

Москва

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет», Биолого-почвенный факультет, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится «...» января 2013 года в «...» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Адрес электронной почты Института: се] 1Ыо<°)mail.cvtsph.rssi.ru Сайт: Ьир//\у\у\у-су&рь.г55ьги Факс: 8 (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан декабря 2012 г. г

Су' <

Ученый секретарь Диссертационного совета, ^/(¿/{Р'^"Т"-5

кандидат биологических наук Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), выделенные из ранних эмбрионов млекопитающих, включая человека, на стадии не позднее бластоцисты, являются носителями информации развития всего организма в онтогенезе. ЭСК являются уникальными плюрипотентными клеточными популяциями. К основным свойствам ЭСК относятся способность к самообновлению, т.е. к неограниченной пролиферации и одновременно способность к дифференцировке во все типы соматических клеток и в линию половых клеток. Линии ЭСК являются уникальной экспериментальной моделью для фундаментальных исследований в разных областях клеточной и молекулярной биологии, а также для прикладных исследований в области регенеративной медицины, фармакологии и токсикологии.

Впервые постоянные линии ЭСК человека были получены в 1998 году (Thomson et al., 1998). В настоящее время в разных странах мира имеется несколько сотен постоянных линий ЭСК человека. Несмотря на то, что все линии обладают рядом общих свойств, каждая из них уникальна, что определяется как генетической индивидуальностью, так и условиями культивирования. Многими авторами показано существование межлинейных различий, связанных с их иммунным и эпигенетическим профилем, экспрессией отдельных генов и, в частности, генов, ответственных за разные направления дифференцировки, с морфологией колоний и скоростью роста (Drukker et al., 2002; Abeyta et al., 2004; Lagarkova et al., 2006; Allegrucci, Young, 2007; Tavakoli et al., 2009). Поэтому работы по увеличению количества новых линий ЭСК человека с индивидуальной вариабельностью позволят расширить базу для широкомасштабных фундаментальных и биомедицинских исследований.

Для успешного получения и длительной пролиферации ЭСК человека, в отличие от большинства других клеток, широко используют культивирование ЭСК на слое фидерных клеток. Однако любой ксеногенный или аллогенный фидер не исключает риска контаминации для ЭСК (Martin et al., 2005; Cobo et al., 2008; Kubikova et al., 2009). Поэтому преимущество при культивировании линий ЭСК имеют аутогенные фидерные клетки человека (Fu et al., 2010; Lee et al., 2012). Тем не менее, при любом фидерном культивировании имеются 2 динамичные живые системы, каждая из которых зависит от условий культивирования, включающих широкий спектр факторов. Таким образом, условия, созданные для ЭСК in vitro, менее стабильны, чем для других клеток, культивируемых на постоянном субстрате. Это может способствовать изменчивости клеточных линий ЭСК при длительном культивировании.

В связи с этим одной из важных задач, связанных с использованием ЭСК человека в фундаментальных и прикладных исследованиях, является освобождение их от сопутствующих фидерных клеток, т.е. разработка бесфидерных систем культивирования, которые состоят из двух основных компонентов: субстрата и ростовой среды. Подбор оптимальных субстратов для бесфидерного культивирования основан, главным образом, на взаимодействии белков внеклеточного матрикса (ВКМ) с интегринами, экспрессируемыми ЭСК в определенных ростовых средах. В настоящее время наиболее часто используют следующие субстраты: Матригель (Xu et al., 2001); отдельные белки ВКМ - ламинин, фибронектин, коллаген, витронектин (Amit et al., 2004; Braam et al., 2008; Miyazaki et al., 2008; Jones et al., 2010); искусственно синтезируемые пептиды (Kolhar et al., 2010); синтетические субстраты (Nandivada et al., 2011); белки ВКМ, синтезированные фидерными клетками (Klimanskaya et al., 2005; Ilic et al., 2012). Для успешного культивирования ЭСК человека на бесфидерных субстратах необходим подбор ростовой среды, оптимальной для данного субстрата.

В настоящее время не получено унифицированной оптимальной бесфидерной системы культивирования, способной поддерживать рост любых линий ЭСК человека, являющейся стабильной по своим характеристикам и исключающей риск ксеногенной или аллогенной контаминации. Каждая система обладает определенными недостатками. В связи с этим работы по оптимизации систем культивирования ЭСК человека до сих пор являются актуальными. Возможно, что исходя из генетической уникальности каждой клеточной линии ЭСК, помимо оптимизации условий культивирования в целом для ЭСК человека, необходим индивидуальный подход, связанный с применением некоторых методических модификаций.

Учитывая перспективность линий ЭСК для фундаментальных и прикладных биологических и биомедицинских исследований, и принимая во внимание данные литературы о разнообразии линий ЭСК человека, связанные с их генетической индивидуальностью и условиями культивирования, представлялось существенным получить и охарактеризовать ряд новых постоянных линий ЭСК человека в разных системах культивирования.

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы - получение постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека и сравнение их характеристик при культивировании в разных системах.

Задачи работы: 1. Выделение внутренней клеточной массы из предимплантационных бластоцист.

2. Длительное культивирование внутренней клеточной массы в фидерной системе с целью получения постоянных линий ЭСК человека.

3. Характеристика полученных линий ЭСК человека.

4. Разработка бесфидерной системы культивирования ЭСК человека:

а) дифференцировка линии ЭСК в мезенхимном направлении с целью получения аутогенного субстрата для дальнейшего культивирования ЭСК;

б) подбор состава среды для бесфидерного культивирования;

в) разработка метода получения субстрата для бесфидерного культивирования ЭСК и характеристика полученного субстрата.

5. Длительное культивирование ранее полученных линий ЭСК в бесфидерной системе с целью получения постоянных сублиний.

6. Характеристика новых сублиний ЭСК человека.

7. Сравнительный анализ свойств полученных линий ЭСК, культивируемых в разных системах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Три новые линии ЭСК - SC5, SC6 и SC7, полученные в фидерной системе культивирования, полностью соответствуют статусу плюрипотентных стволовых клеток человека.

2. Поддержание стабильной системы культивирования является необходимым условием в работе с линиями ЭСК человека. Нарушение условий культивирования может привести к изменениям основных свойств ЭСК, вплоть до их потери.

3. Полученная из линии SC5 неиммортализованная линия фибробластоподобных клеток - SC5-MSC по своему фенотипу и способности к дифференцировке соответствует мезенхимным стволовым клеткам. Эта линия была использована в качестве продуцента компонентов ВКМ и ростовых факторов, необходимых для культивирования ЭСК.

4. Длительное культивирование линий SC5 и SC7 в разработанной новой бесфидерной системе, созданной на основе клеток линии SC5-MSC, позволило получить сублинии SC5-FF и SC7-FF, полностью соответствующие статусу плюрипотентных стволовых клеток человека.

5. Возможность создания не только аутогенной системы культивирования (SC5-FF) ЭСК человека, но и аллогенной (SC7-FF), свидетельствует об универсальности разработанной новой системы бесфидерного культивирования.

6. Сравнительный анализ основных характеристик линий ЭСК, культивируемых в фидерной системе, и их сублиний, полученных в бесфидерной системе, показал их сходство. Это свидетельствует о том, что разработанная бесфидерная система культивирования, которая гораздо

стабильнее любой фидерной системы, может быть рекомендована для фундаментальных, биомедицинских и фармакологических исследований.

Научная нопизна работы

Получены три новые линии плюрипотентных ЭСК человека, каждая из которых обладает стабильным нормальным кариотипом, способна к неограниченной пролиферации in vitro, дифференцировке в производные трех зародышевых листков и в линию половых клеток. Несмотря на то, что все линии обладают свойствами, общими для ЭСК человека, каждая из них является генетически уникальной, что позволяет расширить базу для дальнейших широкомасштабных фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований.

Методом ненаправленной индуцированной дифференцировки из линии SC5 была получена новая неиммортализованная линия мезенхимных стволовых клеток SC5-MSC. Полученная линия может быть использована для фундаментальных исследований в области клеточной и молекулярной биологии, для прикладных исследований в регенеративной медицине, фармакологии и токсикологии, а также в качестве фидера для ЭСК человека, клеток-продуцентов ростовых факторов и компонентов ВКМ, способных поддерживать рост недифференцированных ЭСК человека.

На основе полученной линии SC5-MSC была создана новая бесфидерная система культивирования ЭСК. Разработана методика получения субстрата, оптимального для дальнейшего культивирования на нем ЭСК, а также подобран состав ростовой среды. Частичное использование кондиционированной среды от клеток линии SC5-MSC позволило максимально снизить количество дополнительных ростовых факторов, вносимых извне, необходимых для поддержания ЭСК в отсутствие фидерных клеток.

В разработанной бесфидерной системе были получены 2 новые сублинии SC5-FF и SC7-FF, обладающие всеми свойствами эмбриональных стволовых клеток человека и характеризующиеся нормальным кариотипом человека. Сравнение свойств сублиний, полученных в бесфидерной системе культивирования, со свойствами клеточных линий, из которых они были получены, не показало принципиальных различий, что подтверждает способность разработанной новой системы длительно поддерживать ЭСК в культуре без изменения их статуса.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные новые линии ЭСК человека представляют собой уникальный клеточный материал. Каждая линия генетически индивидуальна и обладает всеми свойствами плюрипотентных ЭСК человека. Полученные линии могут

быть основой для широкомасштабных фундаментальных исследований в разных областях молекулярной и клеточной биологии, а также для решения прикладных задач регенеративной медицины и фармакологии. Так, полученные линии SC5 и SC7 были использованы нами в работе по исследованию характера экспрессии раково-тестикулярных антигенов. Определение характера экспрессии раково-тестикулярных антигенов в ЭСК, в их дифференцированных дериватах и в раковых клеточных линиях может быть полезным для изоляции аномально экспрессирующих эти антигены клеток, способствующей повышению уровня безопасности при использовании ЭСК в клеточной терапии.

Получение различных типов клеток человека с помощью дифференцировки ЭСК не сопровождается инвазивными процедурами, часто являющимися необходимым условием получения клеточных линий. Так, методом ненаправленной индуцированной дифференцировки из линии SC5 была получена линия фибробластоподобных клеток (SC5-MSC), обладающая фенотипом и способностью к мультипотентной дифференцировке, характерными для мезенхимных стволовых клеток (МСК). Линия SC5-MSC является источником большого количества генетически однородного клеточного материала, необходимого для проведения разнообразных исследований. Полученные характеристики свидетельствуют о широких возможностях этой линии для использования в регенеративной медицине. Эта линия будет введена в фонды Коллекции культур клеток позвоночных ИНЦ РАН с целью выдачи клеточных образцов по заявкам разных учреждений РФ и стран СНГ.

Использование бесфидерной системы позволило создать более стандартизированные и стабильные условия для культивирования ЭСК. Разработанные принципы бесфидерного культивирования могут быть использованы другими исследователями, работающими с линиями ЭСК.

Полученные в работе экспериментальные результаты используются в курсе лекций «Клеточная биотехнология» для магистров первого курса СПбГТУ.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 статей и 11 тезисов. Материалы диссертации были представлены на 10-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2007 г.), Школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург,

2008 г.), Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург,

2009 г.), Всероссийской научной школе-конференции для молодежи

«Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009 г.), Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010 г.), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010 г.), конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2011 г.), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз - Россия 2011» (Воронеж, 2011 г.), 3-й конференции молодых ученых ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, 2012 г.), 2-й всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012) и на научных семинарах отдела клеточных культур Института цитологии РАН. Диссертационная работа апробирована на научном семинаре Отдела клеточных культур Института цитологии РАН 27 июня 2012.

Личный вклад автора Все экспериментальные процедуры, описанные в работе, были проведены автором лично. Структурный кариотипический анализ проводили совместно с Т.К. Яковлевой. Анализ проб на проточном цитофлуориметре осуществлял В.В.Зенин. Анализ экспресии генов методом ПЦР и дифференцировку ЭСК in vivo проводили совместно с О.Ф. Гордеевой и Н.В. Лифанцевой. Анализ белков ВКМ методом электрофореза осуществляли совместно с И.В. Воронкиной и JI.B. Смагиной. Во всех совместных работах вклад автора был определяющим. Обсуждение и написание статей проводили совместно с соавторами и научным руководителем диссертации.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылки. Диссертация изложена на 144 страницах. Иллюстративный материал содержит 1 схему, 28 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Выделение внутренней клеточной массы из предимплантационных бластонист. Бластоцисты (5-6-е сутки развития) были предоставлены Международным центром репродуктивной медицины (Россия) с согласия доноров.

Внутреннюю клеточную массу бластоцисты изолировали механически и переносили на слой митотически инактивированных фидерных клеток, представленный линией МСК из костного мозга 5-6-недельного эмбриона человека - FetMSC.

2. Культивирование и митотическая инактивация фидерных клеток.

Клетки FetMSC культивировали в условиях 5% С02, 37°С и 90% влажности. Ростовая среда состояла из 90% DMEM/F12 (Биолот, Россия) и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, HyClone, США). Для блокирования пролиферации монослой фибробластов обрабатывали митомицином-С (Sigma, США) в концентрации 10 мкг/мл в течение 2.5 ч.

3. Культивирование ЭСК человека в условиях фидерного слоя. Ростовая среда для получения и культивирования линий ЭСК состояла из 80% Knockout Dulbecco's modified Eagles medium (Gibco, США), 20% Knockout Serum Replacement (Gibco, США), 2 мкМ L-глютамина, 1% заменимых аминокислот NEAA, 0.1 мкМ 2-меркаптоэтанола (Sigma), 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) (Chemicon, США). ЭСК человека культивировали в условиях 5% С02, 37°С и 90% влажности. Для криоконсервации использовали среду, состоящую из 90% ростовой среды для ЭСК и 10% диметилсульфоксида (DMSO, Sigma, США). Колонии пересевали механически через 5-6 сут.

4. Определение времени удвоения популяции ЭСК человека. Среднее время одного удвоения клеточной популяции определяли путем измерения площади не менее 10 колоний в течение 4-5 сут при помощи компьютерной программы WCIF ImageJ.

5. Кариотипироваиие. За 4 ч до фиксации в культуру ЭСК вводили колцемид КагуоМАХ (0.1 мкг/мл, Gibco). Клетки диссоциировали с помощью смеси трипсина и версена (1:3), проводили гипотоническую обработку смесью 0.075 М раствора KCl и 1%-го раствора цитрата натрия, фиксировали смесью метанола с ледяной уксусной кислотой (3:1, Реактив, Россия). Для количественного кариотипического анализа метафазных пластинок хромосомы окрашивали водным раствором Гимза (1:50, Sigma, США). Для структурного кариотипического анализа проводили дифференциальное G-окрашивание хромосом в соответствии с ранее описанной методикой (Ozkinay and Mitelman, 1979). Кариотипы линий анализировали с помощью микроскопа Axio Imager.Ml (Carl Zeiss, ФРГ) с системой автоматического кариотипирования Ikaros 4 Karyotyping System (MetaSystems, Germany) и описывали в соответствии с Международной системой для цитогенетической номенклатуры хромосом человека ISCN (Shaffer et al., 2009).

6. Дифференцировка ЭСК in vitro. ЭСК переносили в культуральные чашки с низкой адгезией (Медполимер, Россия) в среду для ЭСК без добавления bFGF. Образовавшиеся в суспензионной культуре эмбриоидные тельца (ЭТ) культивировали в среде в течение 10 сут. ЭТ диссоциировали до единичных клеток, высевали на стекла, покрытые желатином, и культивировали в течение 2-х нед в среде DMEM/F12 с 10% FBS.

7. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы. Клетки в течение 20 мин фиксировали 4%-ным параформальдегидом (ПФ), а затем 30 мин обрабатывали BCIP/NBT Liquid Substrate System (Sigma) при температуре 37°С. Анализ проводили под световым микроскопом (Nicon eclipse TS 100, Япония).

8. Иммунофлуоресцентный анализ маркеров недифференцированных и дифференцированных ЭСК человека. Для идентификации маркеров плюрипотентных ЭСК использовали моноклональные антитела (AT) против транскрипционных факторов Oct-4 (Santa Cruz, США) и Nanog (BD Pharmingen, США), поверхностных антигенов SSEA-4 (Мс813-70), TRA-1-81 и TRA-1-60 (Chemicon International, США). Для выявления Р-гликопротеина, АТФ-связывающего ABCG2 транспортера были использованы моноклональные AT ВХР-21 (Alexis Biochemical, США). В качестве вторых AT были использованы иммуноглобулины кролика и козы, конъгогированные с флуоресцеином, FITC (Millipore, США) и Alexa 488 (Molecular Probes, США).

Для выявления дифференцированных клеток-производных трех зародышевых листков использовали первые AT против ßIII-тубулина (Sigma, США) и нестина (Chemicon, США), а-фетопротеина (AFP, Sigma, США) и а-актинина (Sigma, США), в концентрации, рекомендованной призводителем.

Клетки фиксировали 4%-ным ПФ в течение 20 мин при tK0MH, блокировали неспецифическое связывание антител 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (Sigma, США) в течение 1 ч, обрабатывали 0.1%-ным раствором TritonXlOO (для транскрипционных факторов) при tK0M„ в течение 15 мин. Далее препараты инкубировали в растворе первых AT (в концентрации, рекомендованной производителем) в течение ночи при температуре +4°С, промывали раствором PBS без Са2+ и Mg2+ (Биолот, Россия) и инкубировали с раствором вторых AT (в концентрации, рекомендованной производителем) в течение 1ч при tKOMH. Затем отмывали и докрашивали ядерным красителем Hoechst 33342 (2мкг/мл, Sigma, США) в течение 10 мин при tK0MH . В качестве отрицательного контроля использовали аналогичные препараты, обработанные только вторыми AT. Анализ проводили под микроскопом Zeiss LSM 5 Pascal.

9. Дифференцировка ЭСК in vivo. Кластеры колоний ЭСК человека (1-2 х10б) инъецировали иммунодефицитным мышам (Nu/Nu) подкожно. Через 12 нед мышей усыпляли и извлекали развившиеся тератомы. Опухолевую ткань обрабатывали фиксатором Буэна, заключали в парафин, готовили гистологические срезы. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином (Sigma, США). Все протоколы по работе с животными одобрены Комитетом по биоэтике ИБХ РАН.

10. Анализ экспрессии генов методом ПЦР. Тотальную РНК из ЭСК

человека, эмбриоидных телец и фидерных клеток выделяли с использованием TRIzol® Reagent (Invitrogen) по протоколу, рекомендованному производителем. Образцы тотальной РНК обрабатывали ДНКазой (Ambion, США). Для синтеза кДНК использовали 0.5 мкг тотальной РНК на пробу, ревертазу RevertAid М-MuLV и случайные олигонуклеотидные последовательности (random hexamer oligonucleotide primers) (Fermentas, Канада/Литва). Пробы для ПЦРготовили в соответствии с протоколом производителя Taq ДНК-полимеразы (Silex, Россия). Температура отжига праймеров была адаптирована к оптимальным условиям ПЦР для каждой используемой пары праймеров. ПЦР-анализ экспрессии изучаемых генов проводили на амплификаторе Eppendorf (Германия).

11. Получение и характеристика линии мезенхимиых стволовых клеток SC5-MSC. Из ЭСК получали ЭТ по ранее описанной методике. ЭТ переносили на гидрофильную (адгезионную) поверхность в среду а-МЕМ (Биолот, Россия) с добавлением 10% FBS (Hyclone, США). Через несколько суток вокруг прикрепившихся ЭТ выявляли однородные зоны фибробластоподобных клеток, диссоциировали их до единичных клеток и переносили на новые гидрофильные чашки Петри. В результате длительного культивирования получили линию фибробластоподобных клеток.

Кариотипический анализ полученной линии проводили на 12-м пассаже культивирования по ранее описанной методике.

Иммунофенотипирование проводили с помощью панели конъюгатов CD-маркерных моноклональных AT с флуорохромами. В работе использовали моноклональные AT против CD-34, CD-I 17 (c-kit), HL A-AB С и HLA-DR (Caltac, США), CD-44, CD-73, CD-105 (Beckman Coulter, США), CD-90 (Chemicon, США). В качестве негативного контроля использовали очищенные мышиные IgGl/Fitc и IgGl/PE AT (DAKO, Дания). Для анализа с помощью проточной цитофлуориметрии экспрессии SSEA-4 и TRA-1-60 суспензию клеток фиксировали 1%-ным ПФ в течение 20 мин при tKOV1H, инкубировали с первыми AT в течение ночи при +4°С, отмывали и инкубировали со вторыми флуоресцеин-конъюгированными AT (1:500, Millipore, США) в течение 1ч при 37°С. Все пробы анализироали на цитометре Beckman Coulter.

Индукцию остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировки и их оценку проводили согласно методике, описанной в статье М. Рейес с соавторами (Reyes et al., 2001). Результаты оценивали под световым микроскопом (Nicon eclipse TS 100, Япония).

12. Получение кондициоиированнои среды от клеток линии SC5-MSC. Клеточный монослой промывали раствором PBS без Са+2 и Mg+2 и вносили ростовую среду для культивирования ЭСК без bFGF, состоящую из

80% DMEM/F12 (Биолот, Россия), 20% Knockout Serum Replacement (Gibco, США), 2 мкМ L-глютамина, 1% заменимых аминокислот NEAA, 0.1 мкМ 2-меркаптоэтанола (Sigma, США). Через 24 ч инкубации клеток при 37°С и 90% влажности, кондиционированную среду отбирали, фильтровали через стерильный фильтр (0.22 мкм, Orange Sientific, Бельгия). Хранили при -20 С.

13. Получение внеклеточного матрикса от клеток линии SC5-MSC. Клетки рассевали на чашки Петри в концентрации, обеспечивающей плотный монослой, и инкубировали при 5% С02, 37°С и 90% влажности в течение 2-х нед, меняя ростовую среду каждые 3-4 дня. При помощи пипетки отделяли край монослоя от чашки Петри и той же пипеткой аккуратно смывали его с поверхности культурального пластика. Поверхность культурального пластика с оставшимися на ней белками ВКМ промывали 2 раза раствором PBS без Са+2 и Mg+2, высушивали и хранили при -20°С.

14. Культивирование ЭСК в бесфидерной системе. Колонии ЭСК культивировали на ВКМ от фидерных клеток в ростовой среде (состав описан в п. 12), половина которой была кондиционирована клетками SC5-MSC, а концентрация bFGF увеличена до 32 нг/мл. Колонии ЭСК пересевали механическим способом каждые 5-6 сут. Смену среды проводили ежедневно.

15. Статистическая обработка результатов. Результаты обрабатывали статистически с использованием t критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при вероятности нулевой гипотезы Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.1. Получение и характеристика линий ЭСК в условиях фидерного культивирования. Клетки внутренней клеточной массы 3 бластоцист из 15, после выделения и переноса на слой фидерных клеток, прикрепились и начали активно пролиферировать, формируя плоские, типичные для ЭСК, колонии (рис. 1). В результате длительного культивирования были получены и охарактеризованы 3 новые линии ЭСК человека - SC5, SC6 и SC7 (Крылова, Кольцова и др., 2009а; Кольцова и др., 2011).

Рис. 1. Морфология колоний ЭСК человека, растущих на слое фидерных клеток FetMSC.

Линии прошли более 150 удвоений клеточной популяции. Среднее время одного удвоения клеточной популяции составило: 28.2+0.6 ч, 21.0+0.6 и 24.0+2.4 ч для линий SC5, SC6 и SC7, соответственно. Для линии SC5 время удвоения было достоверно больше, чем для SC6 (Р < 0.01).

1.2. Кариотипический анализ линий SC5, SC6 и SC7. Кариотипический анализ клеточных линий SC5, SC6 и SC7 был проведен на 25-м пассаже

12

культивирования, что соответствует более чем 150 удвоениям клеточной популяции. При количественном кариотииическом анализе исследовали 260 метафаз в SC5, 215 - в SC6 и 120 - в SC7; долю полиплоидных клеток определяли при анализе 500 метафаз. Показано, что линии SC5, SC6 и SC7 характеризуются высокой частотой клеток с модальным числом хромосом, равным 46 (98.0+0.9; 98.6+0.8; и 99.2+0.8 %), и низкой долей полиплоидных клеток (0.2+0.2, 2.8+0.7, 3.0±0.8), соответственно.

При структурном кариотипическом анализе хромосом исследовали 30, 55 и 50 метафаз в линиях SC5, SC6 и SC7, соответственно (рис. 2).

Рис. 2. Кариотипы линий ЭСК человека SC5, SC6 и SC7. а - нормальный 46ХХ кариотип линии SC5; б - нормальный 46ХХ кариотип линии SC6; в -нормальный 46XY

кариотип линии SC7, в рамке случайные

структурные хромосомные перестройки.

Структурные изменения хромосом, были выявлены в 3 из 50 проанализированных клеток только в линии SC7: парацентрическая инверсия хромосомы 10 inv(10)(ql 1.2q24) в одной клетке и аномальный характер G-бандирования коротких плеч хромосом 1 и 7 в двух других метафазах. Измененный рисунок дифференциального G-окрашивания короткого плеча хромосомы 1, по-видимому, является результатом парацентрической инверсии [inv(l)(?p21~22p36.1)], сопровождаемой дупликациями хромосомного материала. Результаты свидетельствуют, что частота нормальных метафаз в линии SC7 составляет 94.0%, а обнаруженные структурные хромосомные изменения носят неклональный характер, что подтвердилось при повторном анализе на 40-м пассаже культивирования - данные структурные изменения не были обнаружены. Таким образом, судя по характеру дифференциального G-окрашивания хромосом при уровне разрешения 400-550 дисков на гаплоидный набор хромосом, кариотипы клеточных линий ЭСК не имели отличий от нормального кариотипа человека 46, XX - SC5 и SC6 и 46, XY - SC7.

1.3. Анализ маркеров недифференцированных ЭСК человека в линиях SC5, SC6 и SC7. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы (рис. 3) и иммунофлуоресцентный анализ экспрессии транскрипционных факторов Oct-4, Nanog и поверхностных антигенов SSEA-4, TRA-I-60 (рис. 4) подтвердил их наличие, что свидетельствует о том, что все линии экспрессируют маркеры, характерные для недифференцированных ЭСК человека (Draper et al., 2002; Ginis et al., 2004).

SC5 SC6 SC7

К Il Si if ?! X Ie U ta !i ii il k

il" К К il II )! И ii !•: л f- îî ?! H "if ii -ii Ir !! li

11 Ij H 11 il 11 li 11 « <e Iî M Il 1! H >1 U H

H и .. .. 11 H 1! •• il )) )) V ii

a S ' ' ,0 в

Рис. 3. Гистохимический анализ активности

щелочной фосфатазы в недифференцированных клетках линий SC5, SC6 и SC7.

Рис. 4. Иммуно-флуоресцентный анализ экспрессии маркеров недифференцированных ЭСК человека (Oct-4 и докрашивание Hoechst 33342, Nanog, SSEA-4, TRA-1-60) в клетках линий SC5, SC6 и SC7.

1.4. Диффереицировка ЭСК линий SC5, SC6 и SC7 in vitro. Все три

линии ЭСК человека способны дифференцироваться in vitro в клетки экто-, энто- и мезодермального происхождения. Иммунофлуоресцентный анализ подтвердил присутствие белков, специфических для клеток-производных трех зародышевых листков (рис. 5).

1.5. Диффереицировка ЭСК линий SC5, SC6 и SC7 in vivo. При трансплантации ЭСК иммунодефицитным мышам во всех линиях формировались зрелые тератомы. Гистологический анализ тератом выявил присутствие разных типов дифференцированных соматических клеток, являющихся производными эктодермы, мезодермы и энтодермы: клетки ороговевающего эпителия, гладкомышечные клетки, клетки соединительной и жировой тканей, секретирующие эпителиальные клетки в зачатках крипт кишечника. В качестве примера дифференцировки ЭСК in vivo представлена линия SC7 (рис. 6).

Рис. 5.Иммунофлуорссцентный анализ экспрессии маркеров ранней дифферениировки ЭСК человека (нестина и

рШтубулина - маркеры эктодермы, о-фетопротеина — маркер энтодермы, а-актинина - маркер мезодермы) в клетках линий SC5, SC6 и SC7.

Рис. 6. Дифференцировка in vivo линий ЭСК человека в производные трех зародышевых листков в экспериментальных тератомах.

а, б - секреторный эпителий кишечного типа в зачатках кишечных крипт; в - клетки соединительной и жировой ткани; г - клетки ороговевающего эпителия; д -гладкомышечные клетки; в качестве примера представлена линия SC7.

Таким образом, способность полученных линий ЭСК - SC5, SC6 и SC7 дифференцироваться в производные трех зародышевых листков как in vitro, так и in vivo подтверждает их плюрипотентный статус.

1.6. ПЦР анализ экспрессии генов плгорипотеитных ЭСК и генов ранней диффереицировки в линиях SC5, SC6 и SC7. В качестве модели дифференцировки использовали эмбриоидные тельца (ЭТ) на 1, 5 и 10-е сутки (Кольцова и др., 201J) (рис. 7). Было обнаружено, что недифференцированные клетки линий SC5, SC6 и SC7 экспрессируют гены транскрипционных факторов ОСТ4 и NANOG и гены DPPA3/STELLA и DAZL, отвечающие за

способность ЭСК дифференцироваться в линию половых клеток, но не экспрессируют гены-маркеры соматических клеток - GATA4, AFP, BRY, РАХ6.

Рис. 7. Транскрипционный профиль недифференцированных ЭСК человека и эмбриоидных телец (ЭТ) на 1, 5 и 10-е сут дифференцировки в клетках линий SC5, SC6 и SC7.

В процессе дифференцировки ЭТ, образованных клетками этих линий, увеличивается экспрессия генов G AT A4 и AFP, специфических для внезародышевой и зародышевой энтодермы, и генов BRY и РАХ6, специфических для ранних мезодермальных и нейроэктодермальных клеток, соответственно, а уровень экспрессии генов, специфических для плюрипотентиых клеток, постепенно снижается.

Таким образом, из полученных результатов по изучению транскрипционного профиля маркерных генов следует, что линии SC5, SC6 и SC7 удовлетворяют критериям недифференцированных плюрипотентиых ЭСК.

1.7. Анализ экспрессии транспортера множественной лекарственной устойчивости в линиях SC5, SC6 и SC7.

В связи с данными о наличии в ряде линий ЭСК человека экспрессии генов транспортеров множественной лекарственной устойчивости, обеспечивающих механизм защиты от повреждающих воздействий различными химическими факторами (Sarkadi et al., 2006, 2009; Erdei et al., 2012) в полученных линиях была изучена экспрессия генов транспортеров ABCG2 и

АВСВ1.

Рис. 8. Иммунофлуоресценгный анализ экспрессии гена транспортера множественной лекарственной

устойчивости ABCG2 в клетках линий - SC5, SC6 и SC7. Иммунофлуоресцентная окраска моноклональными антителами против ABCG2 транспортера показала его наличие в линиях SC5, SC6 и SC7 (рис.8).

С помощью ПЦР-анализа была исследована экспрессия генов ABCG2 и АВСВ1 в недифференцированных клетках и дифференцирующихся ЭТ (рис. 9).

SC5 SC6 SC7

О CT-4 ЭСКЭТ1 ЭТ5ЭТ10 ЭСКЭТ1 ЭТ5 ЭТ1С ЭСКЭТ1 ЭТ5 эти

Nanog

DPPA3

DAZL GATA 4

AFP BRY IS5s5 т ■ ■ ■

І'АХб RPL19 ■HILJ-I

SC5 SC6 SC7

АВСВI ЭСК ЭТ1 ЭТ5ЭТ10 ЭСК ЭТ1 ЭТ5ЭТ10 ЭСКЭТ1 ЭТ5 эти

ABCG2 RPLI9 ■ ■ ■ ■ ■ гт т

Рис. 9. Экспрессия генов транспортеров ABCG2 и АВСВ1 в недифференцированных ЭСК человека и в эмбриоидных тельцах на 1, 5 и 10-е сут дифференцировки линий SC5, SC6 и SC7.

Экспрессия мРНК ABCG2 транспортера наблюдалась во всех линиях на всех изученных стадиях. Полученные данные согласуются с результатами других авторов, также выявивших экспрессию гена ABCG2 в ЭСК человека, как на уровне мРНК, так и на уровне белка (Bhattacharya et al., 2004; Pal et al., 2009; Erdei et al., 2012).

Существенно более низкий уровень экспрессии был обнаружен для гена транспортера АВСВI. В работе Апати и др. (Apati et al., 2008) с помощью ПЦР-анализа также была выявлена экспрессия АВСВ1 транспортера в ЭСК человека, однако иммунофлуоресцентный анализ с помощью моноклональных антител и анализ функционального действия этого транспортера не обнаружил экспрессии АВСВ1 на уровне белка. В связи с низким уровнем экспрессии мРНК АВСВ1 мы не проводили иммунофлуоресцентный анализ его экспрессии. Поэтому можно констатировать наличие некоторых межлинейных различий между линиями SC5, SC6 и SC7 по экспрессии АВСВ1 только на транскрипционном уровне. Есть данные, что экспрессия АВСВ 1 транспортера развивается по ходу мезенхимной дифференцировки ЭСК человека (Barbet et al., 2012). Необходимо отметить, что экспрессия мРНК АВСВ1 транспортера в ЭСК человека находится на очень низком уровне и в некоторых случаях, возможно, он ниже уровня чувствительности используемого метода при описанных условиях. Возможно, функционирование этого транспортера в ЭСК человека проявляется не во всех условиях культивирования.

Таким образом, очевидно, что в разных линиях ЭСК присутствует экспрессия гена ABCG2 транспортера множественной лекарственной устойчивости. По-видимому, наличие транспортера ABCG2 является одним из механизмов, способствующих поддержанию генетической стабильности в линиях ЭСК человека.

2. Влияние условий культивирования на проявление свойств линий ЭСК. Нами была показана зависимость свойств ЭСК от стабильности условий культивирования (Крылова, Кольцова и др., 2009 а, б). В системе фидерного культивирования были получены 2 линии ЭСК человека - SC3 и SC4. Клетки культивировали в тех же условиях, что и остальные линии, за исключением того, что в состав среды был введен ростовой фактор активин-А, а концентрация кислорода была снижена до физиологической - 5%,

17

способствующей стабилизации характеристик ЭСК (Ezashi et al., 2005; Chen et al., 2010). Линии SC3 и SC4 прошли около 120 удвоений клеточной популяции. Среднее время удвоения клеточной популяции составило 37.5 ± 4.2 ч и 28.2 ± 0.6 ч, соответственно. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы, иммунофлуоресцентный анализ экспрессии транскрипционного фактора Oct-4 и поверхностных антигенов SSEA-4, TRA-1-60 и TRA-1-81, а также способность к дифференцировке in vitro в производные 3 зародышевых листков подтвердили статус ЭСК человека. Предварительный кариотипический анализ выявил нормальный кариотип исследуемых линий - 46, XX для SC3 и 46, XY для SC4.

Последующее резкое изменение условий культивирования - исключение из ростовой среды активина-А и повышение концентрации кислорода до 20% (стандартно используемая концентрация при культивировании клеток) -привело к изменению свойств клеточных линий. Так, произошло нарушение пролиферации, выраженное в асинхронности и неравномерной (скачкообразной) активности в течение одного пассажа. Одновременно клетки перестали четко окрашиваться ядерным флуоресцентным красителем -йодистым пропидием (PI). Причем подобный результат был отмечен при окрашивании как фиксированных, так и обработанных детергентами клеток, при существенном варьировании времени экспозиции. Далее была предпринята попытка окрашивания ядер ЭСК витальным флуоресцентным красителем Hoechst 33342, активно проникающим в клетки. Во всех случаях результат был аналогичен картине окрашивания PI. Существенно подчеркнуть, что нефлуоресцентный краситель Гимза четко окрашивал ядра вне зависимости от их состояния (рис.10).

Рис. 10. Окрашивание ядер клеток линий SC3 и SC4 флуоресцен г-ными красителями: йодистым пропидием (PI) и Hoechst 33342; окрашивание но Гимза. Окрашивание PI клеток SC3 и SC4 (а, б) соответственно и клеток SC4 после изменения условий культиви-рования (б;); окрашивание Хехстом 33342 клеток SC3 и SC4 (в, г) соответственно и SC3, SC4 после изменения условий культивирования окрашивание по Гимза клеток линий SC3 и SC4 (д, е),соответственно.

Следует также отметить, что в описываемых линиях наблюдали другую морфологию колоний. В отличие от плоских колоний в линиях SC3, SC4 до изменения условий и SC5 - SC7, колонии линий SC3, SC4 после изменения условий были многослойными. Корреляция между многослойностью колоний,

характером пролиферативной активности и диффузным окрашиванием флуоресцентными ядерными красителями была выявлена ранее еще в 5 линиях ЭСК (Крылова и др., 2003, 2005). Обнаруженное явление может быть связано с нарушением равновесия в структуре колоний ЭСК, которое, в свою очередь, было спровоцировано резким изменением состава газовой фазы, исключением из ростовой среды активина-А и, возможно, другими неучтенными факторами.

Линии SC3 и SC4 по-разному отреагировали на изменение условий: если линия SC3 повела себя описанным выше образом, то линия SC4 быстро ушла в дифференцировку, перестала делиться и погибла.

Другие изменения наблюдали при кратковременном культивировании линии SC3 при 5% От и добавлении в среду активина-А с последующим переводом и длительным культивированием в стандартных условиях. Полученная сублиния SC3a по морфологии колоний и основным свойствам была сходна с линиями SC5, SC6 и SC7, но имела ограниченный дифференцировочный потенциал (Кольцова и др., 2011).

Таким образом, приведенные данные подтверждают необходимость не только создания оптимальной системы культивирования, но и поддержания этой системы в стабильном состоянии. Нельзя также исключить и генетическую детерминированность процесса образования постоянных линий ЭСК человека.

3. Получение и характеристика клеточной линии SC5-MSC, полученной из линии ЭСК SC5. С целью получения аутогенного субстрата для дальнейшего культивирования ЭСК была проведена дифференцировка линии SC5 в мезенхимном направлении. В результате была получена неиммортализованная линия SC5-MSC, представленная фибробластоподобными клетками (рис.11) (Крылова, Кольцова и др., 2012). SC5-MSC характеризуется высокой пролиферативной

активностью и нормальным кариотипом 46, XX.

Рис. 11. Морфология клеток линии SC5-MSC.

Методом проточной цитофлуориметрии было показано наличие экспрессии поверхностных антигенов, характерных для МСК человека: CD44, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC и отсутствие экспрессии антигенов: CD34 и HLA-DR

При индукции дифференцировки in vitro линия SC5-MSC показала способность формировать жировую, костную и хрящевую ткань, что соответствует статусу МСК (рис.12).

Рис. 12. Дифференцировка клеток в направлении остео-, адипо- и хондро-генеза. а - выявление активности щелочной

фосфатазы при культивировании в остеогенной среде; б - формирование минеральных комплексов по реакции von Kossa в межклеточном пространстве; в- окрашивание клеток Oil Red О при культивировании в адипогенной среде; г - окрашивание клеток толуидиновым синим при культивировании в хондрогенной среде.

Таким образом, полученная клеточная линия обладает набором свойств, характерных для МСК.

Мы использовали линию SC5-MSC в качестве продуцента компонентов ВКМ и ростовых факторов для бесфидерного культивирования ЭСК человека. 4. Разработка бесфидерной системы культивирования ЭСК человека 4.1. Подбор состава ростовой среды для бесфидерного культивирования ЭСК человека. В работе показано, что культивирование ЭСК человека с использованием кондиционированной среды позволило упростить систему культивирования, избежать включения в ростовую среду дополнительных ростовых факторов семейства TGFß. Наличие экспрессии гена TGFßl в клетках линии SC5-MSC, а также ряда других генов семейства TGFß и гена FGF2, поддерживающих рост недифференцированных ЭСК человека, было подтверждено методом ПЦР-анализа (Кольцова и др., 2012).

Рис. 22. Анализ экспрессии генов семейства TGFß и FGF2 в кондиционированной среде от фидерных клеток SC5-MSC.

4.2. Анализ белкового состава внеклеточного матрикса, полученного после снятия фидерных клеток линии 8С5-МБС разными способами. Был

проведен анализ ВКМ от линии 8С5-М8С, полученного разными способами. В результате был выбран ВКМ, получаемый при механическом снятии необработанного монослоя фидерных клеток. (Кольцова и др.,2012). В отличие от ВКМ, получаемого при механическом снятии необработанного монослоя фидерных клеток после предварительной криогенной процедуры и ВКМ после механического снятия митотически инактивированного митомицином-С монослоя фидерных клеток, при использовании выбранного варианта матрикса наблюдали высокую степень адгезии кластеров ЭСК при посеве. Возможно, это определяется наличием в его составе наибольшего количества фибронектина и ламинина.

SC5-MSC

ACTIVIN сэ

NODAL ■I

LEFTY!

TGF$1

ВМР4

CDF3 m

FCF2

HP ЯГ ES

5.1. Получение и характеристика сублиний ЭСК человека в системе бесфидерного культивирования. При длительном культивировании клеток линии SC5 на выбранном субстрате (аутогенная бесфидерная система) и клеток линии SC7 (аллогенная бесфидерная система) образовались две постоянные сублинии ЭСК - SC5-FF и SC7-FF. Среднее время одного удвоения клеточной популяции для них составило 23.0 + 0.8 ч и 25.0 + 1.5 ч, соответственно. Для сублинии SC7-FF оно практически совпадает с исходной линией SC7 (24.0+2.4 ч) Однако среднее время удвоения в сублинии SC5-FF достоверно меньше, чем в SC5 - 28.2+0.6 ч (Р < 0.01), т.е. в бесфидерной системе имеет место более быстрое обновление клеточной популяции. Это может свидетельствовать о том, что данная система аутогенного бесфидерного культивирования оптимальна для этой линии. Из представленных результатов следует, что в настоящий момент сублиния SC5-FF прошла более 300, а сублиния SC7-FF - более 115 удвоений клеточной популяции.

5.2. Кариотипический анализ сублииий SC5-FF и SC7-FF. Количественный кариотипический анализ сублиний SC5-FF и SC7-FF проводили на 49 и 15 пассажах культивирования, соответственно. Модальное число хромосом и пределы изменчивости клеток по числу хромосом определяли при анализе 140 и 110 метафаз в SC5-FF и SC7-FF, соответственно. Долю полиплоидных клеток определяли при анализе 500 метафаз. Для сублиний SC5-FF и SC7-FF характерна высокая частота клеток с модальным числом хромосом, равным 46 (98.6+1.0; 98.2+1.3%, соответственно). Доля полиплоидных клеток для обеих линий составила 6.6+1.1%, что достоверно выше, чем в исходных линиях SC5 и SC7, Р < 0.01. Структурный кариотипический анализ дифференциально G-окрашенных хромосом в 70 метафазных пластинках для SC5-FF и в 50 - для SC7-FF при уровне разрешения 400-550 дисков на гаплоидный набор показал нормальный кариотип человека: 46, XX и 46, XY (рис.13). Кариотипическая структура SC7-FF стабильнее, чем исходной линии SC7, в которой было отмечено незначительное число

единичных хромосомных аберраций, носящих случайный характер и не свидетельствующих об аномальности кариотипа клеточной линии.

Рнс. 13. Кариотипы клеточных сублиний SCS-FF, SC7-FF.

5.3. Анализ маркеров недифференцированных ЭСК человека в полученных сублиниях. Гистохимический анализ выявил наличие активности щелочной фосфатазы в обеих сублиниях (рис. 14). Иммунофлуоресцентный анализ показал, что обе сублинии экспрессируют маркерные факторы,

SC5-FF SC7-FF

м. Jr'< -t 1/ Н >' >i H u fi

■п if !: -'! il ir )! a ir H «!

II !! И H 1! 11 « !! Jt i t tl si

" : '.: ! :

подтверждающие статус ЭСК человека - транскрипционный фактор ОсМ и

поверхностные антигены 88ЕА-4 и ТЯА-1-81 (рис. 15).

Рис. 14. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы в недифференцированных ЭСК клетках сублиний 8С5-ГГ и 8С7-1-Т.

Рис.15. Иммуно-

флуоресцентный анализ экспрессии маркеров недифференцированных ЭСК (ОсЬ 4, 88ЕА-4, ТКА-1-81) и транспортера множественной лекарственной устойчивости АВСС2 в клетках сублиний 8С5-КГи 8С7-РК.

Ранее нами также было показано наличие экспрессии гена ABCG2 в линиях ЭСК человека, в частности, в SC5 и SC7 (Кольцова и др., 2011). С целью выяснения влияния разных систем культивирования на наличие экспрессии этого гена мы провели иммунофлуоресцентный анализ и установили, что в обеих сублиниях, как и в линиях, из которых они были получены (рис.8), имеет место экспрессия ABCG2 (рис.15).

5.4. Дифференцировка ЭСК сублиний SC5-FF и SC7-FF in vitro. Иммунофлуоресцентный анализ дифференцированных клеток, выявил экспрессию маркеров ранней дифференцировки, характерных для производных эктодермы (нестин), мезодермы (а-актинин) и энтодермы (а-фетопротеин) в

сублиниях SC5-FF и SC7-FF (рис. 16), что подтвердило

плюрипотентный статус сублиний. Рис. 16. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркеров ранней дифференцировки ЭСК (а-актинина -маркера мезодермы, а-фетопротеина -маркера энтодермы и нестина - маркера эктодермы) в клетках сублиний SC5-FF и SC7-FF.

6. Сравнительный ПЦР-анализ маркеров плторипотентных ЭСК человека и маркеров ранней дифферекцировки в линии SC5 и сублинии SC5-FF.

Исследуемая панель маркеров и проб клеток была аналогична панели в п. 1.6. В результате анализа не было выявлено значительных различий в

экспрессии изучаемых генов в клетках SC5 и SC5-FF (рис. 17).

Рис. 17. Анализ экспрессии генов, специфических для плюрипотентных клеток и ранних клеток-предшественников трех зародышевых листков, в недифференцированных ЭСК и эмбриоидных тельцах (ЭТ) на 1, 5 и ]0-е сут дифференцировкн.

Таким образом, данные иммунофлуоресцентного и ПЦР анализов свидетельствуют о том, что сублинии SC5-FF и SC7-FF, культивирующиеся в аутогенной и аллогенной бесфидерных системах, сохраняют статус ЭСК, которым обладают линии SC5 и SC7, из которых они получены (Кольцова и др., 2012).

7. Сравнительная количественная оценка состава клеточной популяции методом проточной цитофлуориметрии

Метод проточной цитофлуориметрии показал отсутствие достоверных различий по уровню экспрессии маркеров SSEA-4 и TRA-1-81 между исходными линиями SC5 и SC7 и полученными из них сублиниями SC5-FF и SC7-FF (Р > 0.05). Во всех случаях уровень экспрессии антигена SSEA-4 достоверно выше антигена TRA-1-81 (Р < 0.05) (Кольцова и др., 2012). Показано, что в колониях ЭСК человека имеет место гетерогенность по экспрессии характерных поверхностных антигенов (Stewart et al., 2006; Li et al., 2011). Тем не менее, из представленных данных следует наличие во всех линиях большого количества недифференцированных ЭСК.

Таблица. Экспрессия поверхностных маркеров в клетках линий SC5, SC5-FF, SC7, SC7-FF.

ОСТ-4 NANOG DPPA3 DAZL GATA4 AFP BRY РАХ6 RPH 9

SC5 ЭСК ЭГ1 ЭТ5ЭТ10 SC5-FF ЭСКЭТ1 ЭТ5 ЭТ10

■ III ■ ещм^ ■ III ІСТМЙ

шшшшяшш

НВВ^ЕЯ

■ " 5

Маркер Доля клеток в разных линиях, экспрессирующих определенный маркер, %, х +sx

SC5 SC5-FF SC7 SC7-FF

SSEA-4 93.5 ± 1.9 91.6 + 3.9 98.2 +0.3 95.1 + 2.4

TRA-l-81 60.7 ± 7.7 73.2 + 3.5 54.5 +5.8 63.8 ^8.6

Примечание: приведены средние значения из 3^1 экспериментов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе в фидерной системе культивирования получены три новые линии ЭСК человека - SC5, SC6 и SC7. Эти линии имеют нормальный кариотип, экспрессируют маркеры недифференцированных ЭСК и способны дифференцироваться в производные трех зародышевых листков in vitro и in vivo.

Принимая во внимание недостатки фидерной системы, была разработана новая бесфидерная система культивирования, использующая в качестве субстрата ВКМ, синтезированный фидерными клетками. В качестве продуцента ВКМ использовали линию SC5-MSC, полученную методом ненаправленной индукции из линии ЭСК человека SC5.

Был разработан новый метод получения ВКМ, при котором использовали необработанные клетки-продуценты, а снятие монослоя проводили без использования каких-либо химических агентов или физического воздействия.

Использование ВКМ и кондиционированной среды, полученных от клеток линии SC5-MSC, позволило создать аутогенную бесфидерную систему культивирования для клеток линии SC5 и аллогенную - для клеток линии SC7. В результате длительного культивирования были получены две сублинии SC5-FF и SC7-FF, обладающие нормальным кариотипом и всеми основными маркерами недифференцированных ЭСК человека, а также способные дифференцироваться in vitro в производные трех зародышевых листков.

При сравнительном анализе свойств ЭСК, культивируемых в разных системах, были проведены следующие исследования: количественный и структурный кариотипический анализ; определение среднего времени удвоения клеточных популяций; цитофлуориметрический анализ уровня экспрессии поверхностных маркеров SSEA-4 и TRA-1-81, характеризующих количество недифференцированных, активно делящихся ЭСК в популяциях; иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркеров недифференцированных ЭСК; иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркеров плюрипотентности ЭСК; ПЦР-анализ экспрессии генов, специфичных для плюрипотентных ЭСК. Проведенный сравнительный анализ не выявил принципиальных различий по характерным свойствам между линиями, культивируемыми в разных системах. Учитывая разработку новой, универсальной системы бесфидерного культивирования, можно заключить, что как сама система культивирования, так и полученные в ней 2 сублинии расширили возможности для фундаментальных, биомедицинских и фармакологических исследований, проводимых с использованием ЭСК человека. Представленные результаты по получению и характеристике сублиний SC5-FF и SC-FF соответствуют мировому уровню.

выводы

1. В системе фидерного культивирования получены 3 новые постоянные линии ЭСК человека - SC5, SC6 и SC7. Все линии соответствуют статусу плюрипотентных стволовых клеток человека;

2. Поддержание стабильной системы культивирования является необходимым условием в работе с линиями ЭСК человека. Нарушение условий культивирования может привести к изменениям основных характеристик ЭСК, вплоть до их потери.

3. Полученная из линии SC5 неиммортализованная линия фибробластоподобных клеток - SC5-MSC по своему фенотипу и способности к дифференцировке соответствует мезенхимным стволовым клеткам. Эта линия была использована в качестве продуцента компонентов ВКМ и ростовых факторов, необходимых для культивирования ЭСК.

4. Длительное культивирование линий SC5 и SC7 в разработанной новой бесфидерной системе, созданной на основе клеток линии SC5-MSC, позволило получить сублинии SC5-FF и SC7-FF, полностью соответствующие статусу плюрипотентных стволовых клеток человека.

5. Возможность создания не только аутогенной системы культивирования (SC5-FF) ЭСК человека, но и аллогенной (SC7-FF), свидетельствует об универсальности разработанной новой системы бесфидерного культивирования.

6. Сравнительный анализ основных характеристик линий ЭСК, культивируемых в фидерной системе, и их сублиний, полученных в бесфидерной системе, показал их сходство. Это свидетельствует о том, что разработанная бесфидерная система культивирования, которая гораздо стабильнее любой фидерной системы, может быть рекомендована для фундаментальных, биомедицинских и фармакологических исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Крылова Т.А., Кольцова A.M., Зенин В.В., Гордеева О.Ф., Мусорина A.C. , Горячая Т.С., Шлыкова С.А., Каменецкая Ю.К., Пинаев Г.П., Полянская Г.Г. Характеристики и специфические особенности новых линий эмбриональных стволовых клеток человека// Цитология, 2009а. Т. 51 (7), С. 565-576.

Крылова Т.А., Кольцова A.M., Гордеева О.Ф., Мусорина A.C., Горячая Т.С., Пинаев Г.П., Полянская Г.Г. Выделение, идентификация и специфические особенности постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека // Сб. «Аутологичные стволовые клетки. Перспективы клинического применения», 20096. Москва. Изд-во Литтерра, С. 23—42.

Кольцова A.M., Гордеева О.Ф., Крылова Т.А., Лифанцева Н.В., Мусорина A.C., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Сравнительные характеристики новых линий эмбриональных стволовых клеток человека SC5, SC6, SC7 и SC3a// Онтогенез, 2011. Т. 42 (4), С. 1-15.

Lifantseva N.. Koltsova A., Krylova T., Yakovleva T., Poljanskaya G., Gordeeva О. Expression Patterns of Cancer-Testis Antigens in Human Embryonic Stem Cells and Their Cell Derivatives Indicate Lineage Tracks // Stem Cells Int, 2011. Vol 2011, Article ID 795239,13 pages.

Крылова Т.А., Кольцова A.M., Зенин В.В., Мусорина A.C., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Сравнительные характеристики новых линий мезенхимных стволовых клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток, костного мозга и крайней плоти человека // Цитология, 2012. Т. 54 (1), С. 5-16.

Кольцова A.M., Воронкина И.В., Гордеева О.Ф., Зенин В.В., Лифанцева Н.В., Мусорина A.C., Смагина Л.В., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Разработка новой бесфидерной системы и характеристика полученных в ней сублиний эмбриональных стволовых клеток человека при аутогенном и аллогенном культивировании// Цитология, 2012. Т.54 (8), С. 637651.

Гамазин Д.А., Кольцова A.M. Белковый состав внеклеточного матрикса, продуцируемого фидерными фибробластами в культуре. Тезисы 10-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». Санкт-Петербург, 20-21 апреля. 2007 г.

Кольцова A.M., Крылова Т.А. Полянская Г.Г. Получение линий эмбриональных стволовых клеток человека из предимплантационных бластоцист. Тезисы докладов и сообщений школы-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток». Санкт-Петербург, 6-10 октября. Цитология, 2008 г. Т. 50. С. 808-809.

Кольцова A.M., Крылова Т.А., Зенин В.В., Мусорина A.C., Яковлева Т.К. Полянская Г.Г. Эмбриональные стволовые клетки человека. Тезисы докладов и сообщений Всероссийского симпозиума по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий». Санкт-Петербург, 12-14 октября. Цитология, 2009 г. Т. 51. С. 769-770.

Кольцова A.M., Крылова Т.А., Яковлева Т.К. Мусорина A.C., Полянская Г.Г. Получение и идентификация постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека. Материалы Всероссийской научной школы-конференции для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования». Москва. 21-26 сентября. 2009 г. С. 31-32.

Кольцова A.M., Крылова Т.А., Зенин В.В., Мусорина A.C., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Эмбриональные стволовые клетки человека. Тезисы Всероссийского симпозиума по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий», Санкт-Петербург, 12-14 октября. Цитология, 2009 г. Т. 51. С. 769-770.

Кольцова A.M., Крылова Т.А., Мусорина A.C., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Аутологичная система бесфидерного культивирования эмбриональных стволовых клеток человека. Материалы Всероссийской научной школы-конференции. Москва, 25-28 октября. Сб. тезисов «Стволовые клетки и регенеративная медицина», 2010 г. С. 38-39.

Кольцова A.M., Крылова Т.А., Мусорина A.C., Полянская Г.Г. Бесфидерная система культивирования эмбриональных стволовых клеток человека. Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», Санкт-Петербург, 21-22 декабря. 2010 г. С. 209.

Кольцова A.M., Крылова Т.А., Зенин В.В., Мусорина A.C., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Характеристика мезенхимных стволовых клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека. Материалы конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», Москва, 6-8 июня, 2011 г.

Кольцова A.M., Крылова Т.А., Гордеева О.Ф., Лифанцева Н.В., Зенин В.В., Мусорина A.C., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки человека. Получение, характеристика, дифференцировка. Материалы конгресса «Симбиоз -Россия 2011». 23 -27 мая, Воронеж. 2011. С. 207-210.

Кольцова A.M., Смагина Л.В., Воронкина И.В., Полянская Г.Г.. Влияние внеклеточного матрикса, полученного разными методами, на поддержание эмбриональных стволовых клеток человека в культуре. Тезисы докладов 3-й конференции молодых ученых ИНЦ РАН. 15-16 мая, Санкт-Петербург. Цитология, 2012 г. Т. 57 (4), С. 343.

Кольцова Л.М., Гордеева О.Ф., Зепин В.В., Лифанцева Н.В., Мусорина А.С., Яковлева Т.К., Г.Г. Полянская. Сравнительный анализ свойств постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека, при культивировании в разных системах // Медицинский академический журнал, 2012. Т. 12 (3). С. 61-63.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Крылова и др. (2003) Цитология. 2003. Т. 12. С. 1172-1178. - Крылова и др. (2005) Цитология. 47. 121-129. - Abcyta ct al. (2004) Hum. Mol. Genet. 13, 601-608. - Allcgrucci, Young. (2007) Hum. Reprod. Update. 13. 103-120. - Amit ct al. (2004) Biol. Reprod. 70. 837845. - Apati ct al. (2008) Biochimica et Biophysica Acta. 1778. 2700-2709. - Barbct ct al. (2012) Cell Cycle. 11. 1611-620. - Illiattacharya ct al. (2004) Blood. 103. 2956-2961. - Braam ct al. (2008) Stem Cells. 26. 2257-2265. - Chen ct al. (2010) Tissue Eng Part A. 16. 2901-2913. - Cobo et al. (2008) Cloning Stem Cells. 10. 65-74. - Draper ct al. (2002) J Anat. 200. 249-258. -Drukkcr ct al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 99. 9864-9869. - Erdci et al. (2012) Eur Biophys J. [Epub ahead of print], - Ezashi ct al. (2005) Proc. Natl. Acad. USA. 102. 4783^1788. -Fu et al. (2010) Tissue Eng Part С Methods. 16. 719-733. - Ginis ct al. (2004) Dev Biol. 269. 360-380. - Ilic ct al. (2012) Cytotherapy. 14. 122-128. - Jones ct al. (2010) Stem Cells Dev. 19. 1923-1935. - Klimanskaya ct al. (2005) Lancet. 365. 1636-1641. - Kolhar ct al. (2010) J Biotcchnol. 146. 143-146. - Kubikova ct al. (2009) Cytotherapy. 11. 330-340. - Lagarkova ct al. (2006) Cell Cycle. 5. 416^420. - Lcc ct al. (2012) Differentiation. 83. 92-100. - Li et al. (2011) Langmuir. 27. 8294-8301. - Martin ct al. (2005) Nat. Med. 11. 228-232. - Miyazaki ct al. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 375. 27-32. - Nandivada ct al. (2011) Nat Protoc. 6. 10371043. - Ozkinay and Mitclman (1979) Hereditas. 90. 1-4. - Pal et al. (2009) Exp. Biol. Med. (Maywood). 234. L230-L243. - Reyes ct al. (2001) Blood. 98. 2615-2625. - Sarkadi ct al. (2006) Physiol. Rev. 86. 1179-1236. - Sarkadi ct al. (2009) Stem Cells. 28. 174-176. - Stewart ct al. (2006) Nature Methods. 3. 807-815. - Tavakoli ct al. (2009) BMC Cell Biol. 10. 44-58. -Thomson ct al. (1998) Science. 282. 1145-1147. - Xu ct al. (2001) Nat Biotechnol. 19. 971-974. - Shaffer et al. (2009).(1SCN). S. Kargcr, Basel.

Подписано в печать 12.12.2012 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 666

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кольцова, Анна Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эмбриональные стволовые клетки человека.

1.1.1. Общая характеристика эмбриональных стволовых клеток.

1.1.2. Получение и культивирование линий ЭСК человека.

1.1.2.1. Выделение внутренней клеточной массы бластоцисты.

1.1.2.2. Культивирование ЭСК человека.

1.1.2.2.1. Фидерная система культивирования ЭСК человека.

1.1.2.2.2. Бесфидерная система культивирования ЭСК человека.

1.1.2.2.3. Ростовая среда для культивирования ЭСК человека.

1.1.3. Основные маркеры, определяющие статус ЭСК человека.

1.1.4. Маркеры диффсренцировки ЭСК человека in vitro и in vivo.

1.1.5. Определение кариотипа ЭСК человека.

1.1.6. Межлинейные различия ЭСК человека.

1.1.7. Перспективы использования ЭСК человека для прикладных биомедицинских исследований.

1.1.7.1. Препятствия для использования ЭСК в регенеративной медицине.

1.1.7.2. Примеры использования ЭСК человека в регенеративной медицине.51 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Выделение внутренней клеточной массы из предимплантационных бластоцист.

2.2. Культивирование и митотическая инактивация фидерных клеток.

2.3. Культивирование ЭСК человека в условиях фидерного слоя.

2.4. Определение времени удвоения популяции ЭСК человека.

2.5. Кариотипирование.

2.6. Дифференцировка ЭСК in vitro.

2.7. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы.

2.8. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркеров недифференцированных и дифференцированных ЭСК человека.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эмбриональные стволовые клетки человека.

1.1.1. Общая характеристика эмбриональных стволовых клеток.

1.1.2. Получение и культивирование линий ЭСК человека.

1.1.2.1. Выделение внутренней клеточной массы бластоцисты.

1.1.2.2. Культивирование ЭСК человека.

1.1.2.2.1. Фидерная система культивирования ЭСК человека.

1.1.2.2.2. Бесфидериая система культивирования ЭСК человека.

1.1.2.2.3. Ростовая среда для культивирования ЭСК человека.

1.1.3. Основные маркеры, определяющие статус ЭСК человека.

1.1.4. Маркеры дифференцировки ЭСК человека in vitro и in vivo.

1.1.5. Определение кариотипа ЭСК человека.

1.1.6. Межлинейные различия ЭСК человека.

1.1.7. Перспективы использования ЭСК человека для прикладных биомедиципских исследований.

1.1.7.1. Препятствия для использования ЭСК в регенеративной медицине.

1.1.7.2. Примеры использования ЭСК человека в регенеративной медицине.51 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Выделение внутренней клеточной массы из предимплантационных бласгоцист.

2.2. Культивирование и митотическая инактивация фидерных клеток.

2.3. Культивирование ЭСК человека в условиях фидерного слоя.

2.4. Определение времени удвоения популяции ЭСК человека.

2.5. Кариотипирование.

2.6. Дифферепцировка ЭСК in vitro.

2.7. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы.

2.8. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркеров недифференцированных и дифференцированных ЭСК человека.

2.9. Дифференцировка ЭСК in vivo.

2.10. Анализ экспрессии генов методом ПЦР.

2.11. Получение и характеристика линии мезенхимных стволовых клеток SC5-MSC.

2.12. Получение кондиционированной среды от клеток линии SC5-MSC.

2.13. Получение внеклеточного матрикса от клеток линии SC5-MSC.

2.14. Иммупофлуоресцентный анализ белков ВКМ.

2.15. Оценка уровня флуоресценции белков ВКМ.

2.16. Электрофоретический анализ состава ВКМ.

2.17. Иммуноблоттинг.

2.18. Культивирование ЭСК в бесфидерной системе.

2.19. Анализ поверхностных маркеров плюрипотентных ЭСК методом проточной цитофлуориметрии.

2.20. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Получение и характеристики линий ЭСК в условиях фидерного культивирования.

3.1.1. Выделение внутренней клеточной массы из предимплантационных бластоцист.

3.1.2. Кариотипический анализ линий SC5, SC6 и SC7.

3.1.3. Анализ маркеров недифференцированных ЭСК человека в линиях SC5, SC6 и SC7.

3.1.4. Дифференцировка ЭСК линий SC5, SC6 и SC7 in vitro.

3.1.5. Дифференцировка ЭСК линий SC5, SC6 и SC7 in vivo.

3.1.6. Анализ экспрессии генов плюрипотентиых ЭСК и генов ранней дифференцировки методом ПЦР в линиях SC5, SC6 и SC7.

3.2. Анализ экспрессии транспортера множественной лекарственной устойчивости в линиях SC5, SC6 и SC7.

3.3. Влияние условий культивирования на проявление свойств линий ЭСК.

3.4. Характеристика клеточной линии SC5-MSC, полученной из линии

ЭСК SC5.

3.5. Разработка бесфидерной системы культивирования ЭСК человека.

3.5.1 Подбор состава ростовой среды для бесфидерного культивирования ЭСК человека.

3.5.2. Анализ белкового состава внеклеточного матрикса, полученного после снятия фидерных клеток линии SC5-MSC разными способами.

3.5.3. Анализ способности внеклеточных матриксов, полученных разными способами, к поддержанию роста недифференцированных ЭСК человека.

3.6. Получение сублиний ЭСК человека в системе бесфидерного культивирования и их характеристика.

3.6.1. Кариотипический анализ сублиний SC5-FF и SC7-FF.

3.6.2. Анализ маркеров недифференцированных ЭСК человека в полученных сублиниях.

3.6.3. Дифференцировка ЭСК сублиний SC5-FF и SC7-FF in vitro.

3.6.4. Анализ маркеров плюрипотентных ЭСК человека и маркеров ранней дифференцировки в сублиниях SC5-FF и SC7-FF методом ПЦР-анализа.

3.7. Сравнительная количественная оценка состава клеточной популяции методом проточной цитофлуориметрии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека и сравнение их характеристик при культивировании в разных системах"

Актуальность проблемы

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), выделенные из ранних эмбрионов млекопитающих, включая человека, на стадии не позднее бластоцисты, являются носителями информации развития всего организма в онтогенезе. К основным свойствам ЭСК относятся способность к самообновлению, т.е. к неограниченной пролиферации, и плюрипотентность - способность к дифференцировке во все типы соматических клеток и в линию половых клеток. Линии ЭСК являются перспективной экспериментальной моделью для фундаментальных исследований в разных областях клеточной и молекулярной биологии, а также для прикладных исследований в области регенеративной медицины, фармакологии и токсикологии.

Впервые постоянные линии ЭСК человека были получены в 1998 году (Thomson et al., 1998). В настоящее время в разных странах мира имеется несколько сотен постоянных линий ЭСК человека. Несмотря на то, чю все линии обладают рядом общих свойств, каждая из них уникальна, что определяется как генетической индивидуальностью, так и условиями культивирования. Многими авторами показано существование межлинейных различий, связанных с их иммунным и эпигенетическим профилем, экспрессией отдельных генов и, в частности, генов, ответственных за разные направления дифференцировки, с морфологией колоний и скоростью роста (Drukker et al., 2002; Abeyta et al., 2004; Carpenter et al., 2004; Rosier et al., 2004; Lagarkova et al., 2006; Sidhu, Tuch, 2006; Allegrucci, Young, 2007; Kim et al., 2007; Pal et al., 2009; Tavakoli et al., 2009). Поэтому работы по увеличению количества новых линий ЭСК человека с индивидуальной вариабельностью позволят расширить базу для широкомасштабных фундаментальных и биомедицинских исследований.

Для успешного получения и длительной пролиферации ЭСК человека, в отличие от большинства других клеток, широко используют культивирование ЭСК на слое фидерных клеток. Однако любой ксепогепный или аллогенный фидер не исключает риска контаминации для ЭСК (Martin et al., 2005; Ileiskanen et al., 2006; Stacey et al., 2006; Cobo et al., 2008; Kubikova et al., 2009). Поэтому преимущество при культивировании линий ЭСК имеют аутогенные фидерные клетки человека (Stojkovic et al., 2005а; Yoo et al., 2005; Choo et al., 2008; Chen et al., 2009; Fu et al., 2010; Lee et al., 2012). Тем не менее, при любом фидерном культивировании имеются 2 динамичные живые системы, каждая из которых зависит от условий культивирования, включающих широкий спектр факторов. Таким образом, условия, созданные для ЭСК in vitro, менее стабильны, чем для других клеток, культивируемых па постоянном субстрате. Это может способствовать изменчивости клеточных линий ЭСК при длительном культивировании.

В связи с этим одной из важных задач, связанных с использованием ЭСК человека в фундаментальных и прикладных исследованиях, является освобождение их от сопутствующих фидерных клеток, т.е. разработка бесфидерных систем культивирования, которые состоят из двух основных компонентов: субстрата и ростовой среды. Подбор оптимальных субстратов для бесфидерного культивирования основан, главным образом, на взаимодействии определенных доменов белков внеклеточного матрикса (ВКМ) с поверхностными рецепторами - интегрипами, экспрессируемыми ЭСК в определенных ростовых средах. В настоящее время наиболее часто используют следующие субстраты: Матригель - коммерческий препарат, представленный комплексом белков базальной мембраны, полученных из саркомы мыши (Xu et al., 2001, 2005; Rosler et al., 2004; Stojkovic et al., 20056; Wang et al., 2005; Choo et al., 2008; Montes et al., 2009; Tsai et al., 2010; Higuchi et al., 2011; Sanches et al., 2010); отдельные белки ВКМ - ламинин, фибронектин, коллаген, витронектии (Xu et al., 2001; Amit et al., 2004; Beatti et al., 2005; Fletcher et al., 2006; Braam et al., 2008; Miyazaki et al., 2008; Baxter et al., 2009; Valamehr et al., 2011); искусственно синтезируемые пептиды (Klim et al., 2010; Kolhar et al., 2010; Meng et al., 2010a); синтстические субстраты (Brafman et al., 2010; Mahlstedt et al., 2010; Lee et al., 2011; Higuchi et al., 2011; Nandivada et al., 2011; Valamehr et al., 2011; Ueda et al., 2012); белки ВКМ, синтезированные фидерными клетками (Klimanskaya et al., 2005; Abraham et al., 2010; Meng et al., 20106; Ilic et al., 2012). Для успешного культивирования ЭСК человека на бесфидерных субстратах необходим подбор ростовой среды, оптимальной для данного субстрата.

В настоящее время не получено унифицированной оптимальной бесфидерной системы культивирования, способной поддерживать рост любых линий ЭСК человека, являющейся стабильной по своим характеристикам и исключающей риск ксеногенной или аллогеипой контаминации. Каждая система обладает определенными недостатками. В связи с этим работы по оптимизации систем культивирования ЭСК человека до сих пор являются актуальными. Возможно, что исходя из генетической уникальности каждой клеточной линии ЭСК, помимо оптимизации условии культивирования в целом для ЭСК человека, необходим индивидуальный подход, связанный с применением некоторых методических модификаций.

Учитывая перспективность линий ЭСК для фундаментальных и прикладных биологических и биомедицинских исследований, а также принимая во внимание данные литературы о разнообразии линий ЭСК человека, связанные с их генетической индивидуальностью и условиями культивирования, представлялось существенным получить и охарактеризовать ряд новых постоянных линий ЭСК человека в разных системах культивирования.

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы - получение постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека и сравнение их характеристик при культивировании в разных системах.

Задачи работы:

1. Выделение внутренней клеточной массы из предимплантационных бластоцист.

2. Длительное культивирование внутренней клеточной массы в фидерной системе с целыо получения постоянных линий ЭСК человека.

3. Характеристика полученных линий ЭСК человека.

4. Разработка бесфидерной системы культивирования ЭСК человека: а) дифференцировка линии ЭСК в мезенхимном направлении с целью получения аутогенного субстрата для дальнейшего культивирования ЭСК; б) подбор состава среды для бесфидерного культивирования; в) разработка метода получения субстрата для бесфидерного культивирования ЭСК и характеристика полученного субстрата.

5. Длительное культивирование ранее полученных линий ЭСК в бесфидерной системе, с целыо получения постоянных сублиний.

6. Характеристика новых су б линий ЭСК человека.

7. Сравнительный анализ свойств полученных линий ЭСК, культивируемых в разных системах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Три новые линии ЭСК - SC5, SC6 и SC7, полученные в фидерной системе культивирования, полностью соответствуют статусу плюрипотентных стволовых клеток человека.

2. Поддержание стабильной системы культивирования является необходимым условием в работе с линиями ЭСК человека. Нарушение условий культивирования может привести к изменениям основных свойств ЭСК, вплоть до их потери.

3. Полученная из линии SC5 неиммортализовапная линия фибробластоподобпых клеток - SC5-MSC по своему фенотипу и способности к дифференцировке соответствует мезенхимным стволовым клеткам. Эта линия была использована в качестве продуцента компонентов ВКМ и ростовых факторов, необходимых для культивирования ЭСК.

4. Длительное культивирование линий SC5 и SC7 в разработанной новой бесфидерной системе, созданной на основе клеток линии SC5-MSC, позволило получить сублинии SC5-FF и SC7-FF, полностью соответствующие статусу плюрипотентных стволовых клеток человека.

5. Возможность создания не только аутогенной системы культивирования (SC5-FF) ЭСК человека, но и аллогенной (SC7-FF), свидетельствует об универсальности разработанной новой системы бесфидерного культивирования.

6. Сравнительный анализ основных характеристик линий ЭСК, культивируемых в фидерной системе, и их сублиний, полученных в бесфидерной системе, показал их сходство. Эю свидетельствует о том, что разработанная бесфидерная система культивирования, которые гораздо стабильнее любой фидерной системы, может быть рекомендована для фундаментальных, биомедицинских и фармакологических исследований.

Научная новизна

Получены три новые линии плюрипотентных ЭСК человека, каждая из которых обладает стабильным нормальным кариотипом, способна к неограниченной пролиферации in vitro, дифференцировке в производные грех зародышевых листков и в линию половых клеток. Несмотря на то, что все линии обладают свойствами, общими для ЭСК человека, каждая из них является генетически уникальной, что позволяет расширить базу для дальнейших широкомасштабных фундаментальных и биомедицинских исследований.

Методом ненаправленной индуцированной дифференцировки из линии SC5 была получена новая неиммортализованная линия мезенхимных столовых клеток SC5-MSC. Полученная линия может использоваться для фундаментальных исследований в области клеточной и молекулярной биологии, для прикладных исследований в регенеративной медицине, фармакологии и токсикологии, а также в качестве фидера для ЭСК человека и клеток-продуцентов ростовых факторов и компонентов ВКМ, способных поддерживать рост недифференцированных ЭСК человека.

Па основе полученной линии SC5-MSC была создана новая бесфидерная система культивирования ЭСК. Разработана методика получения субстрата, оптимального для дальнейшего культивирования на нем ЭСК, а также подобран состав ростовой среды. Частичное использование кондиционированной среды от клеток линии SC5-MSC позволило максимально снизить количество дополнительных ростовых факторов, вносимых извне, необходимых для поддержания ЭСК в отсутствие фидерных клеток.

В разработанной бесфидерной системе были получены 2 новые сублипии SC5-FF и SC7-FF, обладающие всеми свойствами эмбриональных стволовых клеток человека и характеризующиеся нормальным кариотипом человека. Сравнение свойств сублиний, полученных в бесфидерной системе культивирования, со свойствами клеточных линий, из которых они были получены, не показало принципиальных различий, что подтверждает способность разработанной системы длительно поддерживать ЭСК в культуре без изменения их статуса.

Теоретическое н практическое значение работы

Полученные новые липни ЭСК человека представляют собой уникальный клеточный материал. Каждая линия генетически индивидуальна и обладает всеми свойствами шиорипотентных ЭСК человека. Полученные линии могут быть основой для широкомасштабных фундаментальных исследований в разных областях молекулярной и клеточной биологии, а также для решения прикладных задач регенеративной медицины и фармакологии. Так, полученные линии SC5 и SC7 были использованы нами в работе по исследованию характера экспрессии раково-тестикулярных антигенов. Определение характера экспрессии раково-тестикулярных антигенов в ЭСК, в их дифференцировочных дериватах и в раковых клеточных линиях может быть полезным для изоляции аномально экспрессирующих эти антигены клеток, способствующей повышению уровня безопасности при использовании ЭСК в клеточной терапии.

Получение различных типов клеток человека с помощью дифференцировки ЭСК, не сопровождается иивазивными процедурами, часто являющимися необходимым условием получения клеточных линий. Так, методом ненаправленной индуцированной дифференцировки из линии SC5 была получена линия фибробластоподобных клеток (SC5-MSC), обладающая фенотипом и способностью к мультипотентной дифферепцировке, характерной для мезенхимных стволовых клеток (МСК). Линия SC5-MSC является источником большого количества генетически однородного клеточного материала, необходимого для проведения разнообразных исследований. Полученные характеристики свидетельствуют о широких возможностях этой линии для использования в регенеративной медицине. Эта линия будет введена в фонды Коллекции культур клеток позвоночных ИНЦ РАН с целью выдачи клеточных образцов по заявкам разных учреждений РФ и стран СНГ.

Использование бесфидерной системы позволило создать более стандартизированные и стабильные условия для культивирования ЭСК. Разработанные принципы бесфидерного культивирования могут быть использованы другими исследователями, работающими с линиями ЭСК.

Полученные в работе экспериментальные результаты используются в курсе лекций «Клеточная биотехнология» для магистров первого курса СПбГТУ.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Кольцова, Анна Михайловна

ВЫВОДЫ

1. В системе фидерного культивирования получены 3 новые постоянные линии ЭСК человека - SC5, SC6 и SC7. Все линии соответствуют статусу плюрипотентных стволовых клеток человека;

2. Поддержание стабильной системы культивирования является необходимым условием в работе с линиями ЭСК человека. Нарушение условий культивирования может привести к изменениям основных характеристик ЭСК, вплоть до их потери.

3. Полученная из линии SC5 неимморгализованная линия фибробластоподобных клеток - SC5-MSC по своему фенотипу и способности к дифференцировке соответствует мезенхимным стволовым клеткам. Эта линия была использована в качестве продуцента компонентов ВКМ и ростовых факторов, необходимых для культивирования ЭСК.

4. Длительное культивирование линий SC5 и SC7 в разработанной новой бесфидерной системе, созданной на основе клеток линии SC5-MSC, позволило получить сублипии SC5-FF и SC7-FF, полностью соответствующие статусу плюрипотентных стволовых клеток человека.

5. Возможность создания не только аутогенной системы культивирования (SC5-FF) ЭСК человека, но и аллогенной (SC7-FF), свидетельствует об универсальности разработанной повой системы бесфидерного культивирования.

6. Сравнительный анализ основных характеристик линий ЭСК, культивируемых в фидерной системе, и их сублиний, полученных в бесфидерной системе, показал их сходство. Это свидетельствует о том, что разработанная бесфидерная система культивирования, которая гораздо стабильнее любой фидерной системы, может быть рекомендована для фундаментальных, биомедицинских и фармакологических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все липни ЭСК человека являются генетически уникальными, так как каждая из них получена от конкретного индивидуума. Наряду с генетическими особенностями, для ЭСК характерны и межлинейные различия, проявляющиеся под влиянием таких факторов, как способы получения и культивирования клеточной линии. Проведение широкомасштабных фундаментальных и биомедицинских исследований с использованием ЭСК человека возможно лишь при наличии широкого спектра клеточных линий с индивидуальной вариабельностью. Поэтому, несмотря па имеющееся в настоящее время во всем мире большое количество линий ЭСК человека, получение новых линий актуально до сих пор.

В данной работе в условиях фидерного культивирования были получены три новые линии ЭСК человека - SC5, SC6 и SC7, которые имеют нормальный кариотип, экспрессируют маркеры недифференцированных ЭСК и способны дифференцироваться в производные трех зародышевых листков in vitro и in vivo.

Получение и культивирование ЭСК человека на слое фидерных клеток является традиционным, но не универсальным методом. Наличие двух динамичных клеточных систем, каждая из которых зависит от условий культивирования, способствует дестабилизации системы. Таким образом, условия, созданные для ЭСК in vitro менее стабильны, чем для других клеток, культивирующихся на постоянном субстрате. Это может способствовать изменчивости клеточных линий ЭСК при их длительном культивировании, отразиться на воспроизведении результатов исследований и перспективах применения ЭСК в биомедицинских технологиях. Принимая во внимание недостатки фидерной системы, актуальной задачей была разработка оптимальной бесфидерной системы культивирования ЭСК человека. Основными компонентами любой системы культивирования являются субсфат и ростовая среда.

За основу была выбрана бесфидерная система, использующая в качестве субстрата ВКМ, синтезированный фидерными клетками. В качестве продуцента ВКМ использовали линию SC5-MSC, полученную методом ненаправленной индукции из линии ЭСК человека SC5. Помимо способности поддерживать рост ЭСК человека, как в фидерной, так и в бесфидерной системах культивирования, полученная линия SC5

MSC по иммунофенотипу и способности дифференцироваться в остео-, адипо- и хондрогенном направлениях соответствует мезенхимным стволовым клеткам. Полученные характеристики свидетельствуют о широких возможностях использования линии SC5-MSC для исследований в области регенеративной медицины и являются основой для составления паспорта коллекционной клеточной линии, согласно международным стандартам для введения этой линии в фонды коллекции культур клеток позвоночных ИНЦ РАН.

Был разработан новый метод получения ВКМ, при котором использовали необработанные клетки продуценты, а снятие монослоя проводили без использования каких-либо химических агентов или физического воздействия.

В качестве основного компонента ростовой среды в разрабатываемой бесфидерной системе была использована кондиционированная среда от клеток линии SC5-MSC. Использование этой среды позволило избежать дополнительного внесения ростового фактора TGF(31. Наличие экспрессии гена TGF/31 в клетках линии SC5-MSC, а также ряда других генов семейства TGFJ3 и гена FGF2, поддерживающих рост недифференцированных ЭСК человека, было подтверждено методом ПЦР-анализа.

Использование ВКМ и кондиционированной среды, полученных от клеток линии SC5-MSC, позволило создать аутогенную бесфидерную систему культивирования для клеток линии SC5 и аллогенную - для клеток линии SC7. В результате длительного культивирования были получены две сублинии SC5-FF и SC7-FF, обладающие нормальным карпотипом и всеми основными маркерами недифференцированных ЭСК человека, а также способные дифференцироваться in vitro в производные трех зародышевых листков.

При сравнительном анализе свойств ЭСК, культивируемых в разных системах, были проведены следующие исследования: количественный и структурный кариотипический анализ; определение среднего времени удвоения клеточных популяции; цитофлуориметрический анализ уровня экспрессии поверхностных маркеров SSEA-4 и TRA-1-81, характеризующих количество недифференцированных, активно делящихся ЭСК в популяциях; иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркеров недифференцированных ЭСК; иммунофлуоресцентный анализ экспрессии маркеров плюрипотснтности ЭСК; ПЦР-анализ экспрессии специфичных для плюрипотентных ЭСК генов. Проведенный сравнительный анализ не выявил принципиальных различии по характерным свойствам между линиями, культивируемыми в разных системах. Учитывая разработку новой, универсальной системы бесфидерного культивирования, можно заключить, что как сама система культивирования, так и полученные в ней 2 сублинии, расширили возможности для фундаментальных, биомедицинских и фармакологических исследований, проводимых с использованием ЭСК человека. Представленные научные результаты по получению и характеристике сублиний SC5-FF и SC-FF соответствуют мировому уровню.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кольцова, Анна Михайловна, Санкт-Петербург

1. Абслев Г. И. Альфа-фетопротсин: биология, биохимия, молекулярная генетика// Иммунология. 1994. Т. 3.

2. Гордеева О.Ф., Миталипов Ш.М. Плюрипотентные стволовые клетки: поддержание генетической и эпигенетической стабильности и перспективы клеточных технологий// Онтогенез. 2008. Т. 39. С. 405 -419.

3. Гордеева О.Ф. Технологии оценки биобезопасности фармакологических веществ и клеточных технологий с использованием моделей плюрипотентных стволовых клеток// Сб. «Клеточные технологии для регенеративной медицины». С-Пбю: Изд-во Политехи, ун-та, 2011.

4. Кольцова A.M., Гордеева О.Ф., Крылова Т.А., Лифанцева Н.В., Мусорина A.C., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Сравнительные характеристики новых линий эмбриональных стволовых клеток человека SC5, SC6, SC7 и SC3a // Онтогенез, 2011. Т. 42 (4), С. 1-15.

5. Крылова Т.А., Зенин В.В., Мусорина A.C., Баранов B.C., Бичевая II.К., Корсак B.C., Никольский H.H., Пинасе Г.II, Полянская Г.Г. Получение и характеристика постоянных эмбриональных стволовых клеток человека// Цитология. 2003. Т. 12. С. 1172 1178.

6. Крылова Т.А., Зенин В.В., Михайлова H.A., Пинасе Г.П., Никольский H.H., Полянская Г.Г. Постоянные линии эмбриональные стволовые клетки человека// Цитология. 2005. Т. 47. С. 121 129.

7. Попов Б.В. Введение в клеточную биологию стволовых клеток:учебно-методическое пособие//, СПб.: СпецЛит. 2010.

8. Седова Г.П. Количественные аспекты злокачественного роста//Мат. Морфология. Электронный математический и медико-биологический журнал. 2008. Т.7. Вып. 2.

9. ФаллерД. М., ШилдсД. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. Пер. с англ. М.: «Издательство БИНОМ». 2006.

10. Abdel-Rahman В., Fiddler М., Rappolee D., Pergament Е. Expression of transcription regulating genes in human preimplantation embryos.// Hum Reprod. 1995 V. 10. P. 2787-2792.

11. Abeyta M.J., Clark А.Т., Rodriguez R.T., Bodnar M.S., Pera R.A., Firpo M.T. Unique gene expression signatures of independently-derived human embryonic stem lines // Hum. Мої. Genet. 2004. V. 13. P. 601-608.

12. Abraham S., Riggs M.J., Nelson K., Lee V., Rao R.R. Characterization of human fibroblast-derived extracellular matrix components for human pluripotent stem cell propagation. 2010П Acta Biomater. V. 6. P. 4622-^633.

13. Addla S.K., Brown M.D., Hart C.A., Ramani V.A., Clarke N.W. Characterization of the Hoechst 33342 side population from normal and malignant human renal epithelial cells// Am J Physiol Renal Physiol. 2008. V. 295. P.:F680-7.

14. Allegrucci С., Young L.E. Differences between human embryonic stem cell lines // Hum. Reprod. Update. 2007. V. 13. P. 103-120.

15. Amit M., Margulets V., Segev II, Shariki K., Laevsky I., Coleman R., Itskovitz-Eldor J. Human feeder layers for human embryonic stern cells// Biol Reprod. 2003. V.68. P. 2150-2156.

16. Amit M., Shariki C., Margulets V., Itskovitz-Eldor J. Feeder and serum free culture of human embryonic stem cells // Biol. Reprod. 2004. V. 70. P. 837-845.

17. Amit M., Laevsky /., Miropolsky Y. Shariki K., Peri M., Itskovitz-Eldor J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells.// Nat Protoc. 2011. V. 6. P. 572-579.

18. Andracchi S., Korte G.E. Expression of plasma membrane alkaline phosphatase in normal and regenerating choriocapillaris in the rabbit// Acta Anat (Basel). 1991. V. 141. P. 289-293.

19. Antomtcci I., Stuppia L., Kaneko Y., YuS., Tajiri N., Bae E.G., Chheda S.H., IVeinbren N.L., Borlongan C. V. II Cell Transplant. 2011. V. 20. P. 789-795.

20. Bai II, Wang Z.Z. Directing human embryonic stem cells to generate vascular progenitor cells// Gene Thcr. 2008. V.15. P. 89-95.

21. Baker D.E., Harrison N.J., Maltby E., Smith K., Moore H.D., Shaw P.J., Heath P.R., Holden II, Andi 'cws -P. IK Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vitro // Nature Biotechnol. 2007. V. 25. P. 207-215.

22. Barberi T., Willis L.M., Socci N.D., Studer L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells// PLoS Med. 2005. V.2(6):el 61;

23. Bat tula V.L., Bareiss P.M., Treml S., Conrad S., Albert I, Hojak S., Abele H., Schewe B., Just L., Skuiella T., Biihring H.J. Human placenta and bone marrow derived MSC cultured in serum

24. Tree, b-FGF-containing medium express ccll surface frizzled-9 and SSEA-4 and give rise to multilineage differentiation// Differentiation. 2007. V. 75. P. 279-291.

25. Beattie G.M., Lopez A. D., Bucay N. HintonA., Firpo M.T., King C.C., Hayek A. Activin A maintains pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers// Stem Cells. 2005. V.23. P. 489-495.

26. Ben-Hur T., Idelson M., Khaner LL, Peru M„ Reinhartz E., llzik A., Reubinoff B.E. Transplantation of human embryonic stem cell-derived neural progenitors improves behavioral deficit in Parkinsonian rats// Stem Cells. 2004. V.22. P. 1246-1255.

27. Benton G., George J., Kleinman H.K., Arnaoutova LP. Advancing science and technology via 3D culture on basement membrane matrix// J Cell Physiol. 2009.V. 221. P. 18-25.

28. Bhatia M. Hematopoietic development from human embryonic stem cells// Hematology Am. Soc. Hematol.Educ. Program. 2007. P. 11-16.

29. Biancotti J.C., Nanvani K., Mandefro B., Golan-Lev T., Buehler N. Hill D., Svendsen C.N., Benvenisty N. The in vitro survival of human monosomies and trisomies as embryonic stem cells// Stem Cell Res. 2012. V. 9. P. 218-224.

30. Bigdeli N., Andersson M., Strehl R., Emanuelsson K., Kilmare E., Hyllner ,/., Lindahl A. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces//J Biotechnol. 2008. V. 133. P. 146 153.

31. Boiani M., Eckardt S., Scholer LL.R., McLaughlin K.J. Oct4 distribution and level in mouse clones: consequences for pluripotency// Genes Dev. 2002. V. 16. P. 1209-19.

32. Bonner-Weir S., Weir G. New sources of pancreatic beta-cells// Nat. Biotechnol. 2005. V. 23. P. 857-861.

33. Bortvin A., Eggan K., Skaletskу LI., Akutsu H., Berry D.L., Yanagimachi R., Page D.C., Jaenisch R. Incomplete reactivation of Oct4-related genes in mouse embryos cloned from somatic nuclei// Development. 2003. V. 130. P. 1673-1680.

34. Bosnia G.C., Custer R.P., Bosma M.J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse//Nature. 1983. V. 301. P. 527-530.

35. Brafman D.A., Chang C.W., Fernandez A., Willerl K, Varghese S., Chien S. Long-term human pluripotent stem cell self-renewal on synthetic polymer surfaces// Biomaterials. 2010. V. 31. P. 9135-9144.

36. Brothman A.R., Persons D.L., Shaffer L.G. Nomenclature evolution: Changes in the ISCN from the 2005 to the 2009 edition// Cytogenet Genome Res. 2009. V. 127. P. 1-4.

37. Buhr N., Carapito C., Schaeffer C., Hovasse A., Van Dorsselaer A., Viville S. Proteome analysis of the culture environment supporting undifferentiated mouse embryonic stem and germ ccll growth// Electrophoresis. 2007. V. 28. P. 1615-1623.

38. Callaerts P., Halder G., Gehring WJ. PAX-6 in development and evolution// Annu Rev Ncurosci. 1997. V. 20. P.483-532.

39. Caplan A.I., Dennis J.E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators// J. Cell Biochem. 2006. V. 98. P. 1076-1084.

40. Carpenter M.K., Rosler E.S., Fisk G.J., Brandenberger 11, Ares X, Miura T., Lucero M., Rao M.S. Properties of four human embryonic stem cell lines maintained in a feeder-free culture system// Dev Dyn. 2004. V. 229. P. 243-258.

41. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Twee die S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells// Cell. 2003. V. 113. P. 643-655.

42. Chavez S.L., Meneses J.J., Nguyen H.N., Kim S.K, Pera R.A. Characterization of six new human embryonic stem cell lines (HSF7, -8, -9,-10, -12, and -13) derived under minimal-animal component conditions // Stem cells Dev. 2008. V. 17. P. 535-546

43. Chen A.E., Melton D.A. Derivation of human embryonic stem cells by immunosurgery// J Vis Exp. 2007. V. 10. P. 574.

44. Chen H.F., Kuo H.C., Lin S.P., Chien C.L., Chiang M.S., Ho H.N. Hypoxic culture maintains self-renewal and enhances embryoid body formation of human embryonic stem cells// Tissue Eng Part A. 2010. V. 16. P. 2901-2913.

45. Cheng L., Hammond II., Ye Z, Zhan X., Dravid G. Human adult marrow cells support prolonged expansion of human embryonic stem cells in culture// Stem Cells. 2003. V. 21. P. 131-142.

46. Chin A.C., Padmanabhan J., Oh S.K., Choo A.B. Defined and serum-free media support undifferentiated human embryonic stem cell growth// Stem Cells Dev. 2010. V.19. P. 753- 761.

47. Cho M., Lee E.J., Nam H., Yang J.H, Cho J., Lim J.M., Lee G. Human feeder layer system derived from umbilical cord stromal cells for human embryonic stem cells// Fertil Steril. 2010. V. 93. P. 2525-2531.

48. Choo A., Ngo A.S., Ding V., Oh S., Kiang L.S. Autogeneic feeders for the culture of undifferentiated human embryonic stem cells in feeder and feeder-free conditions// Methods Cell Biol. 2008. V. 86. P. 15-28.

49. Choo A., Lim S.K. Derivation of mesenchymal stem cells from human embryonic stem cells// Methods Mol Biol. 2011. V. 690. P. 175-182.

50. Colognato II, Yurchenco P.D. Form and function: the laminin family of heterotrimers// Dev Dyn. 2000. V.218. P. 213-234.

51. Cowan C.A., Klimanskaya /., McMahon J., Atienza J., Witmyer J., Zucker J.P., Wang S., Morton C.C., McMahon A.P., Powers D., Mellon D.A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts//New Engl. J. Med. 2004. V. 350. P. 1353-1356.

52. Daadi M.M., Maag A.L., Steinberg G.K. Adherent self-renewable human embryonic stem cell-derived neural stem cell line: functional engraftment in experimental stroke model// PLoS One. 2008. 20; 3 (2):el644.

53. De Robert is E.M., Kuroda H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos// Annu Rev Cell Dev Biol. 2004. V. 20. P. 285-308.

54. Dennis K., Uittenbogacird M., Chiaramello A., Moody S.A. Cloning and characterization of the 5'-flanking region of the rat neuron-specific Class III beta-tubulin gene// Gene. 2002. V. 294. P. 269-277.

55. Dick E., Rajamohan D., Ronksley J., Denning C. Evaluating the utility of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells for drug screening// Biochem. Soc. Trans. 2010. V. 38. P. 10371045

56. Draper J.S., Pigott C., Thomson J.A., Andrews P.W. Surface antigens of human embryonic stem cells: changes upon differentiation in culture// J Anat. 2002. V. 200. P. 249 258.

57. Draper J.S., Smith K., Gokhale P., Moore II D., Malt by E., Johnson J., Meisner L, Zwaka T.P., Thomson J. A., Andrews P.W. Recurrement gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22 P. 53-54.

58. Drukker M., Benvenisty N. The immunogenicity of human embryonic stem-derived cells// Trends in Biotechnol. 2004. V. 22. P. 135-141.

59. Duan Y., Ma X., Zoit, W., Wang C., Bahbahan I. S., Ahuja T. P., Tolstikov V., Zern M. A. Differentiation and characterization of metabolically functioning hepato-cytes from human embryonic stem cells// Stem Cells. 2010. V. 28. P. 674-686.

60. Easier S.S., Ross L.S., Frankfurter A. Initial tract formationin the mouse brain// J. Neurosci.1993. V. 13. P.285-299.

61. Ebert A.D., Svendsen C.N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges//Nat Rev Drug Discov. 2010. V.9. P. 367-372.

62. Ellerstrom C, Strehl R., Moya K., Andersson K., Bergh C., Lundin K., Hyllner J., Semb H. Derivation of a xeno-free human ES cell line // Stem cells. 2006. V. 24. P. 2170-2176.

63. Erdei Z., Sarkadi B., Brozik A., Szebenyi K., Vdrady G., Mako V., Pentek A., Orbdn T.I., Apdti A. Dynamic ABCG2 expression in human embryonic stem cells provides the basis for stress response// Eur Biophys J. 2012. Epub ahead of print.

64. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos//Nature. 1981. V. 292. P. 154-156.

65. Ezashi T., Das P., Roberts R.M. Low tensions and the prevention of differentiation of hES cell // Proc. Natl. Acad. USA. 2005. V. 102. P. 4783-4788.

66. Fedarko N.S., Bianco P., Vetter U., Robey P.G. Human bone cell enzyme expression and cellular heterogeneity: correlation of alkaline phosphatase enzyme activity with cell cycle// J Cell Physiol. 1990. V.144. P. 115-121.

67. Feldbush T.L., Lafrenz D. Alkaline phosphatase on activated B cells characterization of the expression of alkaline phosphatase on activated B cells. Kinetics and membrane anchor// J Immunol. 1991. V. 147. P. 3690-3695.

68. Fernando R. /., Liizinger M., Trono P., Hamilton D. H., Schlom J., Palena C. The T-box transcription factor Brachyury promotes epithelial-mesenchymal transition in human tumor cells// J Clin Invest. 2010. V. 120. P. 533-544.

69. Forsyth N.R., Musio A., Vezzoni P., Simpson A.H., Noble B.S., McWhir J. Physiologic oxygen enhances human embryonic stem cell clonal recovery and reduces chromosomal abnormalities // Cloning and Stem Cells. 2006. V. 8. P. 16-23.

70. FuX., Toh W.S., Liu H., Lu K., Li M., Cao T. Establishment of clinically compliant human embryonic stem cells in an autologous feeder-free system// Tissue Eng Part C Methods. 2011. V.17. P. 927-937.

71. Fu X, Xu Y. Self-renewal and scalability of human embryonic stem cells for human therapy// Regen Med. 2011. V. 6. P. 327-334.

72. Gang E.J., Bosnakovski D., Figueiredo C.A., Visser J.W., Perlingeiro R.C. SSEA-4 identifies mesenchymal stem cells from bone marrow// Blood. 2007. V. 109. P. 1743-1751.

73. Ginis I., Luo Y., Miura 71, Thies S., Brandenberger R., Gerecht-Nir S., Amit M., Hoke A., Carpenter M.K., Itskovitz-Eldor J., Rao M.S. Differences between human and mouse embryonic stem cells// Dev Biol. 2004. V. 269. P. 360-380.

74. Gepstein L. Derivation and potential applications of human embryonic stem cells// Circ Res. 2002. V. 15. P. 866-876.

75. Giovanella B.C., Fogh J. The nude mouse in cancer research// Adv Cancer Res. 1985. V. 44. P. 69-120.

76. Gitlin D., Boesman M. Serum alpha-fetoprotein, albumin, and gamma-G-globulin in the human conceptus//J Clin Invest. 1966. V. 45. P. 1826-1838.

77. Gopalakrishna-Pillai S., Iverson L.E. Astrocytes derived from trisomic human embryonic stem cells express markers of astrocytic cancer cells and premalignant stem-like progenitors// BMC Med Genomics. 2010. V. 27. P. 3 12.

78. Graves K.H., Moreadith R.IV. Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stem cells from preimplantation rabbit embryos// Mol Reprod Dev. 1993. V. 36. P. 424 -433.

79. Greber B., Lehrach LI., Adjaye J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor p signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal// Stem Cell. 2007. V. 25. P. 455-464.

80. Hambiliki F., Ström S., Zhang P., Stavreus-Evers A. Co-localization of NANOG and OCT4 in human pre-implantation embryos and in human embryonic stem cells// J Assist Reprod Genet. 2012. Epub ahead of print.

81. Harris H. The human alkaline phosphatase: what we know and what we don't know// Clin Chim Acta. 1989. V. 186. P. 171 174.

82. Harrison N.J, Baker D, Andrews P. IV. Culture adaptation of embryonic stem cells echoes germ cell malignancy // Int. J. Androl. 2007. V. 30. P. 275-281.

83. Hasegawa K., Pomeroy J.E., Pera A4.F. Current technology for the derivation of pluripotent stem cell lines from human embryos // Cell Stem Cell. 2010. V. 6. P. 521-531.

84. He W, Li K., Wang F., Oin Y.R., Fan Q.X. Expression of OCT4 in human esophageal squamous cell carcinoma is significantly associated with poorer prognosis// World J Gastroenterol. 2012. V. 18. P. 712-719.

85. Hematti P. Human embryonic stem cell-derived mesenchymal progenitors: an overview.// Methods Mol Biol. 2011. V. 690. P. 163-174.

86. Henderson J.K., Draper J.S., Baillie LIS., Fishel S., Thomson J.A., A4oore H., Andrews P. IV. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens// Stem Cells. 2002. V. 20. P. 329-337.

87. Hernandez D., Iiuban L., Mason C. Feeder-free culture of human embryonic stem cells for scalable expansion in a reproducible manner// Stem Cells Dev. 2011. V. 20. P. 1089- 1098.

88. Hen-era M.B., Bussolati В., Bruno S., Fonsato V., Romanazzi G.M., Camussi G. Mesenchymal stem cells contribute to the renal repair of acute tubular epithelial injury// Int J Mol Med. 2004. V. 14. P. 1035-1041.

89. Higuchi A., Ling Q.D., Ко Y.A., Chang Y., Umezawa A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells// Chem. Rev. 2011. Kill. P. 3021-3035.

90. Hill K.L., Obrtlikova P., Alvarez D.F., King J.A., Keirstead S.A., Allred J.R., Kaufman D.S. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function// Exp Hematol. 2010. V. 38. P. 246-257.

91. Ho P. J., Yen M.L., Yet S.F., Yen B.L. Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges//Cell Transplant. 2012. V.21. P. 801-814.

92. Hongisto II, Vuoristo S., Mikhailova A., Suuronen R.t Virtanen I., Otonkoski Т., Skottman II. Laminin-511 expression is associated with the functionality of feeder cells in human embryonic stem cell culture// Stem Cell Res. 2012. V. 8. P. 97-108.

93. Huang HA., Chen S.K., Ling Q.D., Chien C.C., Liu H.T., Chan S.H. Multilineage differentiation potential of fibroblast-like stromal cells derived from human skin// Tissue Eng Part A. 2010. V. 16. P.1491-1501.

94. Hughes C.S., Radan L., Betts D., Poslovit L.M., Lajoie G.A. Proteomic analysis of extracellular matrices used in stem cell culture// Proteomics. 2011. V. 11. P. 3983-3991.

95. Hynes R.O. Specificity of cell adhesion in development: the cadherin superfamily// Curr Opin Genet Dev. 1992. V. 2. P. 621-624.

96. Iannaccone P.M., Taborn G.U., Gar ton R.L., Caplice M.D., Brenin D.R. Pluripotent embryonic stem cells from the rat are capable of producing chimeras// Dev Biol. 1994. V. 163. P. 288292.

97. Irwin E.F., Gupta R., Dashti D.C., Healy K.E. Engineered polymer-media interfaces for the long-term self-renewal of human embryonic stem cells// Biomaterials. 2011. V.32. P. 6912-6919.

98. Jeter C.R., Badeaux M., Choy G., Chandra D., Patrawala L, Liu C., Calhoun-Davis T., Zaehres II, Daley G.Q., Tang D.G. Functional evidence that the self-renewal gene NANOG regulates human tumor development// Stem Cells. 2009. V. 27. P. 993-1005.

99. Jones M.B, Chu C.H, Pendleton J.C, Betenbaugh M.J, Shiloach J, Baljinnyam B, Rubin J.S, Shamblott M.J. 2010. Proliferation and pluripotency of human embryonic stem cells maintained on type I collagen. Stem Cells Dev. 19: 1923-1935.

100. Kato K., Yoshimoto M., Kato K., Adachi S., Yamayoshi A., Arima T., Asanoma K., Kyo S., Nakahata 71, Wake N. Characterization of side-population cells in human normal endometrium// Hum Reprod. 2007. V. 22. P. 1214-1223.

101. Kerjaschki D., Poczewski //., Dekan G., Horvat R., Balzar E., Kraft N, Atkins R.C. Identification of a major sialoprotein in the glycocalyx of human visceral glomerular epithelial cells// J Clin Invest. 1986. V. 78. P. 1142-1149.

102. Kim S.J., Park J.H., Lee J.E., Kim J.M., Lee J.B., Moon S. Y., Roh S.I., Kim C.G., Yoon H.S. Effects of type IV collagen and laminin on the cryopreservation of human embryonic stem cells// Stem Cells. 2004. V. 22. P. 950-961.

103. Kim S.E., Kim B.K., Gil .I.E., Kim S.K, Kim J.II. Comparative analysis of the developmental competence of three human embryonic stem cell lines in vitro // Mol. Cells. 2007. V. 23. P. 49-56.

104. Kispert A., Herrmann B.G. Immunohistochemical analysis of the Brachyury protein in wildtype and mutant mouse embryos// Dev Biol. 1994. V. 161. P. 179-193.

105. Kleinman H.K., Martin G.R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity// Semin Cancer Biol. 2005. V. 15. P. 378-386.

106. Klim J.R., Li L., Wrighton P.J., Piekarczyk M.S., Kiessling L.L. A defined glycosaminoglycan-binding substratum for human pluripotent stem cells// Nat Methods. 2010. V. 7. P. 989-994.

107. Klimanskaya I., Chung Y., Meisner L., Johnson J., West M.D., Lanza R. Human embryonic stem cells derived without feeder cells // Lancet. 2005. V. 365. P. 1636-1641.

108. Klimanskaya I., Chung Y., Becker S., Lu S.J., Lanza R. Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres// Nat Protoc. 2007. V. 2. P. 1963-1972.

109. Knorr D.A., Kaufman D.S. Pluripotent stem cell-derived natural killer cells for cancer therapy//Transí Res. 2010. V. 156. P. 147-154.

110. Kolhar P., Kotamraju V.R., Ilikita S.T., Clegg D.O., Ruoslahti E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture// J Biotechnol. 2010. V.146. P. 143-146.

111. Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney D.G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains// Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V. 96. P. 10711-10716.

112. Krabbe C., Zimmer J., Meyer M. Neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells~a critical review//APMIS. 2005. V. 113. P. 831-44.

113. Krawetz R., Rancourt D.E. Suspension bioreactor expansion of undifferentiated human embryonic stem cells// Methods Mol Biol. 2012. V. 873. P. 227-235.

114. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of T4// Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

115. Laflamme M.A., Zbinden S., Epstein S.E., Murry C.E. Cell-based therapy for myocardial ischemia and infarction: pathophysiological mechanisms// Annu Rev Pathol. 2007. V. 2. P. 307-339.

116. Lagarkova M.A., Volchkov P.Y., Lyakisheva A.V., Philonenko E.S., Kiselev S.L. Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines. // Cell Cycle. 2006. V. 5. P. 416-420.

117. Lai R.C., Choo A., Lim S.K. Derivation and characterization of human ESC-derivcd mesenchymal stem cells//Methods Mol Biol. 2011. V. 698. P. 141-150.

118. Lavon N. Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells// Methods Mol Biol. 2010. V. 640. P. 237-246.

119. Lee M.K., Tuttle J.B., Rebhun L.I., Cleveland D.W., Frankfurter. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific bcta-tubulin isotype during chick embryogenesis// Cell Motil Cytoskeleton. 1990. V. 17. P. 118-132.

120. Lee A.S., Tang C., Cao F„ Xie X., van der Bogt K, Hwang A., Connolly A. J., Robbins R. C„ IVu J.C. Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells// Cell Cycle. 2009. V. 8. P. 2608-2612.

121. Lee S., Kim J., Park T.J., Shin Y., Lee S. Y., Han Y.M., Kang S., Park H.S. The effects of the physical properties of culture substrates on the growth and differentiation of human embryonic stem cells// Biomaterials. 2011. V. 32. P. 8816-8829.

122. Lerou P.H., Yabuuchi A., LLuo H„ Takeuchi A., Shea J., Cimini T., Ince T.A., Ginsburg E., Racowsky C., Daley G.O. Human embryonic stem cell derivation from poor-quality embryos// Nat Biotechnol. 2008. V. 26. P. 212-214.

123. Levenberg S., Ferreira L.S., Chen-Konak L., Kraehenbuehl T.P., Longer R. Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stern cells// Nat Protoc. 2010. V. 5. P. 1115-1126.

124. Levine A J., Brivanlou A.H. GDF3 at the crossroads of TGF-P signaling// Cell Cycle. 2006. V. 5. P. 1069-1073.

125. Li Y., Powell S., Brunette E., Lebkowski J., Mandalam R. Expansion of human embryonic stem cells in defined serum-free medium devoid of animal-derived products// Biotechnol Bioeng. 2005. V. 91. P. 688-698.

126. Li J„ Bardy J., Yap L.Y., Chen A., Nurcombe V., Cool S.M., Oh S.K., Birch W.R. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells// Biointerphases. 2010. V. 5. P.132-142.

127. Li X.J., Hu B.Y., Jones S.A., Zhang Y.S., Lavaute T., Du Z.W., Zhang S.C. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules// Stem Cells. 2008. V. 26. P. 886-893.

128. Li Z., Qiu D., Xu K., Sridharan L, Qian X., Wang R. Analysis of affinity maps of membrane proteins on individual human embryonic stem cells// Langmuir. 2011. V. 27. P. 8294- 8301.

129. Lim J.W., Bodnar A. Proteome analysis of conditioned medium from mouse embryonic fibroblast feeder layers which support the growth of human embryonic stem cells// Proteomics. 2002. V.2. P. 1187-1203.

130. Lorenz K, Sicker M., Schmelzer E., RupfT., Salvetter J., Schulz-Siegmund M., Bader A. Multilineage differentiation potential of human dermal skin-derived fibroblasts// Exp Dermatol. 2008. V. 17. P.925-932.

131. Lu J., Hon R., Booth C.J., Yang S.H., Snyder M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells // Proc. Natl. Acad. USA. 2006. V.103. P. 5688-5693.

132. Ludwig T.E., Bergendahl V, Levenstein M.E., Yu J., Probasco M.D., Thomson J.A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells//Nat Methods. 2006a. V.3. P. 637-646.

133. Mantel C, Guo Y, Lee MR, Kim MK, Han MK Shibayama H, Fukuda S, Yoder MC, Pelus LM, Kim KS, Broxmeyer LIE. Checkpoint-apoptosis uncoupling in human and mouse embryonic stem cells: a source of karyotpic instability// Blood. 2007. V.l09. P. 4518-4527.

134. Manton K.J., Richards S., Van Lonkhuyzen D., Cormack L., Leavesley D., Upton Z. A chimeric vitronectin: IGF-I protein supports feeder-cell-free and serum-free culture of human embryonic stem cells// Stem Cells Dev. 2010. V.l9. P. 1297-1305.

135. Martin M.J, Muotri A, Gage F, Varki A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. //Nat. Med. 2005. V. 11. P. 228-232.

136. McComb R.B., Bowers G.N., Posen S. Alcaline phosphatase. Plenum Press. New York. 1979.

137. McKinnon R.D., Matsui T., Dubois-Dalcq M., Aaronson S.A. FGF modulates the PDGF-driven pathway of oligodendrocyte development//Neuron. 1990. V. 5. P. 603-614.

138. Meisner L.F, Johnson J.A. Protocols for cytogenetics studies of human embryonic stem cells // Methods. 2008. V. 45. P. 133-141.

139. Meng Y„ Eshghi S., Li Y.J., Schmidt R., Schaffer D.V., Llealy K.E. Characterization of integrin engagement during defined human embryonic stem cell culture// FASEB J. 2010. V. 24. P. 1056-1065.

140. Meng Y, Eshghi S., Li Y.J., Schmidt R, Schaffer D.V., Healy K.E. Characterization of integrin engagement during defined human embryonic stem cell culture// FASEB J. 2010a. V. 24. P. 1056-1065.

141. Meng G„ Liu S., Li X., Krawetz R, Rancourt D.E. Extracellular matrix isolated from foreskin fibroblasts supports long-term xeno-free human embryonic stem cell culture// Stem Cells Dev. 20106. V.19. P. 547-556.

142. Mignone J.L., Kreutziger K.L., Paige S.L., Murry C.E. Cardiogenesis from human embryonic stem cells// Circ J. 2010. V. 74. P. 2517-2526.

143. Mitalipova M., Calhoun J., ShinS., Wininger D., SchulzT., Noggle S., Venable A., Lyons L, Robins A., Stice S. Human embryonic stem cell lines derived from discarded embryos// Stem Cells. 2003. V. 2l.P. 521-526.

144. Mohseny A.B., Hogendoorn P.C. Concise review: mesenchymal tumors: when stem cells go mad// Stem Cells. 2011. V. 29. P. 397-403.

145. Mohr J.C, de Pablo J.J, Palecek S.P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells // Biomaterials. 2006. V. 27. P. 6032-6042.

146. Moody S.A., Quigg M.S., Frankfurter A. Development of the peripheral trigeminal system in the chick revealed by an isotype-specific anti-beta-tubulin monoclonal antibody// J Comp Neurol. 1989. V.279. P. 567-580.

147. Morrisey E.E., Ip H.S., Lu M.M., ParmacekM.S. GATA-6: a zinc finger transcription factor that is expressed in multiple cell lineages derived from lateral mesoderm// Dev Biol. 1996. V. 177. P. 309-322.

148. Muguruma K, Sasai Y. In vitro recapitulation of neural development using embryonic stem cells: from neurogenesis to histogenesis// Dev Growth Differ. 2012. V. 54. P. 349-357.

149. Muolri A.R., Nakashima K, Toni N, Sandler KM., Gage F.H. Development of functional human embryonic stem cell-derived neurons in mouse brain// Proc Natl Acad Sci USA. 2005. V. 102. P. 18644-18648.

150. Nagaoka M., Si-Tayeb K., Akaike T., Duncan S.A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum// BMC Dev Biol. 2010. V.10. P. 60.

151. Nagaoka M., Si-Tayeb K., Akaike T., Duncan S.A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum// BMC Dev Biol. 2010. V. 10. P. 60.

152. Nandivada H„ Villa-Diaz L.G., O'Shea K.S., Smith G.D., Krebsbach P.H., Lahann J. Fabrication of synthetic polymer coatings and their use in feeder-free culture of human embryonic stem cells//Nat Protoc. 2011. V. 6. P. 1037-1043.

153. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells// Nat Genet. 2000. V. 24. P. 372-376.

154. Noaksson K, Zoric N, Zeng X, Rao M.S., Hyllner J., Semb H., Kubista M, Scirtipy P. Monitoring differentiation of human embryonic stem cells using real-time PCR// Stem Cells. 2005. V. 23. P. 1460-1467.

155. Notarianni E., Galli C., Laurie S., Moor RM., Evans M.J. Derivation of pluripotent, embryonic cell lines from the pig and sheep// J Reprod Fertil Suppl. 1991. V. 43. P. 255-260.

156. Odegaard J.I., Vats D., Zhang L., Ricardo-Gonzalez R., Smith K.L., Sykes D.B., Kamps M.P., Chawla A. Quantitative expansion of ES cell-derived myeloid progenitors capable of differentiating into macrophages//J Leukoc Biol. 2007. V. 81. P. 711-719.

157. Odorico J.S., Kaufman D.S., Thomson J.A. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines// Stem Cells. 2001. V.19. P. 193-204.

158. Oh S.K., Kim H.S., Ahn H.J., Seol H.W., Kim Y.Y., Park Y.B., Yoon C.J., Kim D.W., Kim S.H., Moon S.Y. Derivation and characterization of new human embryonic stem cell lines: SNUhESl, SNUhES2, and SNUhES3 // Stem cells. 2005. V. 23. P. 211-219.

159. Olivier E.N., Bouhassira E.E. 2011. Differentiation of human embryonic stem cells into mesenchymal stem cells by the "raclure" method. Methods Mol Biol. 690:183-193.

160. Olmer R., Lange A., Selzer S., Kasper C., Haverich A., Martin U., Zweigerdt R. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors// Tissue Eng Part C Methods. 2012. V. 18. P. 772-784.

161. Osafune K, Caron L., Borowiak M., Martinez R.J., Fitz-Gerald C.S., Sato Y., Cowan C.A., Chien K.R., Melton D.A. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines// Nat Biotechnol. 2008. V. 26. P. 313-315.

162. Ozkinay C., Mitelman F. A simple trypsin-Giemsa technique producing simultaneous G- and C-banding in human chromosomes// Hereditas. 1979. V. 90. P. 1-4.

163. Pankratz M.T., Li X.J., Lavaute T.M., Lyons E.A., Chen X., Zhang S.C. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage// Stem Cells. 2007. V. 25. P. 1511-1520.

164. Park J.H., Kim S.J., Oh E.J., Moon S.Y, Roh S.I., Kim C.G., Yoon II.S. Establishment and maintenance of human embryonic stem cells on STO, a permanently growing cell line// Biol Reprod. 2003. V. 69. P. 2007-2014.

165. Paul S. M., Mylelka D.S., Dunwiddie C.T., Persinger C.C., Munos B.H., Lindbovg S.R., Schacht A.L. How to inprove r & d productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge// Nat Rev Drugdiscov. 2010. V. 9. P. 203-214.

166. Payer B., Saitou M., Barton S.C., Thresher R„ Dixon J.P., Zahn D„ Colledge W.H., Carlton MB., Nakano T., Surani M.A. Stella is a maternal effect gene required for normal early development in mice// Curr Biol. 2003. V.13. P. 2110-2117.

167. Pedersen K. Fetuin, a new globulin isolated from serum//Nature. 1944. V. 164. P. 575.

168. Pelton T.A., Sharma S., Schulz T.C., Rathjen J., Rathjen P.D. Transient pluripotent cell populations during primitive ectoderm formation: correlation of in vivo and in vitro pluripotent cell development//J Cell Sci. 2002. V. 115. P. 329-339.

169. Pera M.F., Herszfeld D. Differentiation of human pluripotent teratocarcinoma stem cells induced by bone morphogenetic protein-2// Reprod Fertil Dev. 1998. V. 10. P. 551-555.

170. Pesce M., Scholer H.R. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development// Stem Cells. 2001. V. 19. P. 271-278.

171. Phinney D.G., Isakova I. Plasticity and therapeutic potential of mesenchymal stem cells in the nervous system// Curr Pharm Des. 2005. V. 11. P. 1255-1265.

172. Phinney D.G., Prockop D.J. Concise review: mesenchymal stem/multipotent stromal cells: the state of transdifferentiation and modes of tissue repair—current views// Stem Cells. 2007. V. 25. P. 2896-2902.

173. Pierce G.B., Stevens L.C., Nakane P.K. Ultrastructural analysis of the early development of teratocarcinomas//J Natl Cancer Inst. 1967. V. 39. P. 755-773.

174. Prokhorova T.A., Harkness L.M., Frandsen U., Ditzel N., Schroder H.D., Burns J.S., Kassem M. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigcl// Stem Cells Dev. 2009. V. 18. P. 47-54.

175. Prowse A.B., McQuade L.R., Bryant K.J., Van Dyk D.D., Tuch B.E., Gray P.P. A proteome analysis of conditioned media from human neonatal fibroblasts used in the maintenance of human embryonic stem cells// Proteomics. 2005. V. 5. P. 978-989.

176. Pruksananonda K.,Rungsiwiwut R., Numchaisrika P., Ahnonkitpanich V., Virutamasen P. Development of human embryonic stem cell derivation// J Med Assoc Thai. 2009. V. 92. P. 443-450.

177. Pruszak J., Sonntag K.C., Aung M.H., Sanchez-Pemaute R., Isacson O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations// Stem Cells. 2007. V. 25. P. 2257-2268.

178. Rajala K., Hakala H., Panula S., Aivio S., Pihlajamciki II, Suuronen R., Hovatta ()., Skottman II. Testing of nine different xeno-free culture media for human embryonic stem cell cultures // Hum. Reprod. 2007. V. 22. P. 1231-1238.

179. Reubinoff B.E., Pera M.F., Fong C.Y., Trounson A., Bongso A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro// Nat Biotechnol. 2000. V. 18. P. 399- 404.

180. Reyes M., Lund T., Lenvik T., Aguiar D., Koodie L., Verfaillie C.M. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells// Blood. 2001. V. 98. P. 26152625.

181. Reynolds N. Collier B., Bingham V., Gray N.K., Cooke H.J. Translation of the synaptonemal complex component Sycp3 is enhanced in vivo by the germ cell specific regulator Dazl// RNA. 2007. V. 13. P. 974-981.

182. Rho J.Y., Yu K, Han J.S., Chae J.I., Koo D.B., Yoon H.S., Moon S.Y., Lee K.K., Han Y.M. Transcriptional profiling of the developmentally important signalling pathways in human embryonic stem cells// Hum Reprod. 2006. V. 21. P. 405-412.

183. Richards M., Fong C.Y., Chan IV.K., Wong P.C., Bongso A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells// Nat Biotechnol. 2002. V. 20. P. 933-936.

184. Richards M., Tan S., FongC.Y., Biswas A., Chan W.K., Bongso A. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells // Stem Cells. 2003. V. 21. P. 546-556.

185. Robertson E.J. Derivation and maintenance of embryonic stem cell cultures// Methods Mol Biol. 1990. V. 5. P. 223-236.

186. Rodin S., Domogatskaya A., Strom S., Hansson E.M., Chien K.R., Lnzunza J., ILovatta O., Tryggvason K. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511//Nat Biotechnol. 2010. V. 28. P. 611-615.

187. Rodriguez R. T, Velkey J.M., Lutzko C„ Seerke R., Kohn D.B., O'Shea K.S., Firpo M. T. Manipulation of OCT4 levels in human embryonic stem cells results in induction of differential cell types// Exp Biol Med (Maywood). 2007. V. 232. P. 1368-1380.

188. Rojas M., Xu J., JFoods C.R., Mora A.L., Spears IV., Roman J., Brigham K.L. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung// Am J Respir Cell Mol Biol. 2005. V. 33. P. 145-52.

189. Rosier E.S., Fisk G.J., Ares X, Lrving J., Miura T., Rao M.S., Carpenter M.K. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions// Dev Dyn .2004. V. 229. P. 259-274.

190. Rosner M.H., Vigano M.A., Ozato K, Timmons P.M., Poirier F„ Rigby P. IV, Standi L.M. A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo// Nature. 1990. V. 345. P. 686-692.

191. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M.C., de la Fuente R., Cigudosa J.C., Lloyd A.C., Bemad A. Spontaneous human adult stem cell transformation// Cancer Res. 2005. V. 65. P. 30353039.

192. Ruggiu M., Speed R., Taggart M., McKay S.J., Kilanowski F, Saunders P., Dorin J., Cooke H.J. The mouse Dazla gene encodes a cytoplasmic protein essential for gametogenesis// Nature. 1997. V. 389. P. 73-77.

193. Scihu S., Tosh D., Hardikar A.A. New sources of beta-cells for treating diabetes// J Endocrinol. 2009. V. 202. P. 13 16.

194. Sanchez-Rcimos J.R. Neural cells derived from adult bone marrow and umbilical cord blood// J Neurosci Res. 2002. V. 69. P. 880-893.

195. Sarkadi B., Homolya L., Szakdcs G., Vdradi A. Human multidrug resistance ABCB and ABCG transporters: participation in a chemoimmunity defense system // Physiol. Rev. 2006. V. 86. P. 1179-1236.

196. Sarkadi B., Orbdn T.I., Szakdcs G., Vc'irady G., Schamberger A., Erdei Z., Szebenyi K, Homolya L., Apdti A. Evaluation of ABCG2 expression in human embryonic stem cells: crossing the same river twice?//Stem Cells. 2009. V. 28. P. 174-176.

197. Sassetti C, Tangemann K, Singer M.S., Kershaw D.B., Rosen S.D. Identification of podocalyxin-like protein as a high endothelial venule ligand for L-selectin: parallels to CD34// J Exp Med. 1998. V. 187. P. 1965-1975.

198. Sassetti C., Van Zante A., Rosen S.D. Identification of endoglycan, a member of the CD34/podocalyxin family of sialomucins//J Biol Chem. 2000. V. 275. P. 9001-9010.

199. Sassoon D.A., Garner I., Buckingham M. Transcripts of alpha-cardiac and alpha-skeletal actins are early markers for myogenesis in the mouse embryo// Development. 1988. V. 104. P. 155164.

200. Sato N., Sanjuan I.M., Ileke M., Uchida M., Naef F., Brivanlou A.II. Molecular signature of human embryonic stem cells and its comparison with the mouse// Dev Biol. 2003. V. 260. P. 404-413.

201. Sato N., Meijer L., Skaltsounis L., Greengard P., Brivanlou A.II. Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor//Nat Med. 2004. V. 10. P. 55-63.

202. Scheele S., Nystrom A., Durbeej M., Talis J.F., Ekblom M., Ekblom P. Laminin isoforms in development and disease// J Mol Med (Berl). 2007. V. 85. P. 825-836.

203. Schopperle IV.M., Kershaw D.B., DeWolfW.C. Human embryonal carcinoma tumor antigen, Gp200/GCTM-2, is podocalyxin// Biochem Biophys Res Commun. 2003. V. 300. P. 285-290.

204. Schrans-Stassen B.H., Saunders P.T., Cooke H.J., de Rooij D.G. Nature of the spermatogenic arrest in Dazl -/- mice// Biol Reprod. 2001. V. 65. P. 771-776.

205. Schwartz S.D., Hubschman J.P., Heilwell G., Franco-Cardenas V., Pan C.K., Ostrick R.M., Mickunas E., Gay II, Klimanskaya /., Lanza R. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report// Lancet. 2012. V. 379. P. 713-720.

206. Sharp J., Frame J., Siegenthaler M., Nistor G., Keirstead H.S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants improve recovery after cervical spinal cord injury// Stem Cells. 2010. V. 28. P. 152-163.

207. Sherr C.J., DePinho R.A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock?// Cell. 2000. V. 102. P. 407-410.

208. Shevinsky L.H., Knowles B.B., Damjanov I., Solter D. Monoclonal antibody to murine embryos defines a stage-specific embryonic antigen expressed on mouse embryos and human teratocarcinoma cells// Cell. 1982. V. 30. P. 697-705.

209. Shimada II, Yoshimura N., Tsuji A., Kunisada T. Differentiation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells: modulation of differentiation by FGF-20// J Biosci Bioeng. 2009. V. 107. P. 447-454.

210. Skottman H., Mikkola M., Lundin K., Olsson C., Slrómberg A.M., Tuuri T., Otonkoski 71, Hovatta O., Lahesmaa R. Gene expression signatures of seven individual human embryonic stem cell lines// Stem Cells. 2005. V. 23. P. 1343-1356.

211. Skottman H., Dilber M.S., Hovatta O. The derivation of clinical-grade human embryonic stem cell lines// FEBS Letter. 2006. V. 580. P. 2875-2878.

212. Sell S. Stem cell handbook// Humana Press Inc. Totowa, New Jersey. 2004.

213. Senju S., Hirata S., Motomura Y., Fukuma D., Matsunaga Y., Fukushima S., Matsnyoshi H, Nishimura Y. Pluripotent stem cells as source of dendritic cells for immune therapy// Int J Hematol. 2010. V. 91. P. 392-400.

214. Sidhu K.S, Tuch B.E. Derivation of clones from human embryonic stem cell lines by FACS sorting and their Characterization // Stem cells and Development. 2006. V. 15. P. 61-69.

215. Siltanen S., Anttonen M, Iieikkilci P., Narita N., Laitinen M., Ritvos O., Wilson D.B., Heikinheimo M. Transcription factor GATA-4 is expressed in pediatric yolk sac tumors// Am J Pathol. 1999. V. 155. P. 1823-1829.

216. Skottman H, Dilber M.S, Hovatta O. The derivation of clinical-grade human embryonic stem cell lines // FEBS Letter. 2006. V. 580. P. 2875-2878.

217. Skottman H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland// In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2010. V. 46. P. 206-209.

218. Skottman H, Hovatta O. Culture conditions for human embryonic stem cells // Reproduction. 2006. V. 132. P. 691-698.

219. Spits C., Mateizel I., Geens M, Mertzanidou A., Staessen C, Vandeskelde Y., Van der Elst J., Liebaers I., Sermon K. Recurrent chromosomal abnormalities in human embryonic stem cells // Nat. Biotcchnol. 2008. V. 26. P. 1361-1363.

220. Stacey G.N., Cobo F., Nieto A., Talavera P., Healy L., Concha A. The development of 'feeder' cells for the preparation of clinical grade hES cell lines: challenges and solutions// J Biotechnol. 2006. V. 125. P. 583-588.

221. Stevens L.C. Origin of testicular teratomas from primordial germ cells in mice// J Natl Cancer Inst. 1967. V 38. P. 549-52.

222. Stewart M.H., Bosse M., Chadwick K., Menendez P., Bendall S.C., Bhalia Ad. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment // Nature Methods. 2006. V. 3 P. 807-815.

223. Stojkovic P., Lako M., Przyborski S., Stewart R., Armstrong L., EvansJ., ZhangX., Stojkovic M. Human-serum matrix supports undifferentiated growth of human embryonic stem cells// Stem Cells. 20056. V. 23. P. 895-902.

224. Strelchenko K, Verlinsky ()., Kukharenko V., Verlinsky Y. Morula-derived human embryonic stem cells// Reprod Biomed Online. 2004. V. 9. P. 623-629.

225. Strom S„ Holm F„ Bergstrom R., Stromberg A.M., Hovatta O. Derivation of 30 human embryonic stem cell lines-improving the quality // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2010. V. 46 P. 337-344.

226. Su Z., Frye С., Bae K.M., Kelley V., Vieweg J. Differentiation of human embryonic stem cells into immunostimulatory dendritic cells under feeder-free culture conditions// Clin Cancer Res. 2008. V.14. P. 6207-6217.

227. Suda Т., Arcii F., Hirao A. Hematopoietic stem cells and their niche// Trends Immunol. 2005. V. 26. P. 426-433.

228. Siltanen S., Anttonen M., Heikkilii P., Narita N., Laitinen M., Ritvos O., Wilson D.B., Heikinheimo M. Transcription factor GATA-4 is expressed in pediatric yolk sac tumors// Am J Pathol. 1999. V. 155. P. 1823-1829.

229. Taapken S.M., Nisler B.S., Newton M.A., Sampsell-Barron T.L., Leonhard K.A., Mclntire E.M., Montgomery K.D. Karotypic abnormalities in human induced pluripotcnt stem cells and embryonic stem cells//Nat Biotechnol. 2011. V. 29. P. 313 -314.

230. Talbot N.C., Powell A.M., Garrett W.M. Spontaneous differentiation of porcine and bovine embryonic stem cells (epiblast) into astrocytes or neurons// In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2002. V. 38. P. 191-197.

231. Tada M., Takahama Y., Abe K., Nakatsuji N, Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells// Curr Biol. 2001. V. 11. P. 1553-1558.

232. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka Т., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007. V. 131. P. 861-72.

233. Tan Z., Su Z. Y, Wu R.R., Gu В., Liu Y. K., Zhao X.L., Zhang M. Immunomodulative effects of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells in vivo and in vitro// J Zhejiang Univ Sci B. 2011. V. 12. P. 18-27.

234. Tatarinov Y.S. Content of embryo-specific alpha-globulin in fetal and neonatal sera and sera from adult humans with primary carcinoma of the liver// Fed Proc Transl Suppl. 1966. V. 25. P. 344346.

235. Tatarinov lu.C., Assekritova I.V., Masiukevich V.N., Perova S.D. Immunochemical tests on embryospecific beta-1-globulin in the differential diagnosis of cancer of the liver// Ter Arkh. 1967. V. 39. P. 43 -48.

236. Tavakoli T., Xu X., Derby E„ Serebryakova Y, Reid Y., Rao M.S., Malison M.P., Ma IV Self-renewal and differentiation capabilities are variable between human embryonic stem cell lines 13, 16 and BG01V // BMC Cell Biol. 2009. V. 10. P. 44-58.

237. Thomson J.A., Kalishman J., Golos T.G., Duming M, Harris C.P., Becker R.A., Hearn J.P. Isolation of a primate embryonic stem cell line// Proc Natl Acad Sci USA. 1995. V. 92. P. 7844-7848.

238. Thomson J.A., Kalishman J., Golos T.G., Duming M., Harris C.P., Hearn J.P. Pluripotent cell lines derived from common marmoset (Callithrix jacchus) blastocysts// Biol Reprod. 1996. V. 55. P. 254-259.

239. Thomson J.A., Ltskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall VS., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.

240. Thomas K.R., Capecchi M.R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells// Cell. 1987. V. 51. P. 503-512.

241. Tiger C.F., Gullberg D. Abscence of laminin alphal chain in the skeletal muscle of dystrophic dy/dy mice// Muscle Nerve. 1997. V. 20. P. 1515-1524.

242. Trivedi P., Hematti P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells// Exp Hematol. 2008. V. 36. P. 350-359.

243. Tsai M.S., Lee J.L., Chang Y.J., Hwang S.M. Isolation of human multipoint mesenchymal stem cells from second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol// Hum Reprod.2004. V. 19. P. 1450-1456.

244. Tsuje S., Yoshimolo M., Takahashi K., Noda Y, Nakahala T., Heike 71. Side population cells contributed to the genesis of human endometrium// Fertil Steril. 2008. V. 90. P. 1528-1537.

245. Ueda Y, Fujita S., Nishigaki 71, Arima Y., Iwata II. Substrates for human pluripotent stem cell cultures in conditioned medium of mesenchymal stem cells// J Biomater Sci Polym Ed. 2012. V. 23. P. 153-165.

246. Valamehr B., Tsutsui H., IIo C.M., Wu H. Developing defined culture systems for human pluripotent stem cells// Regen. Med. 2011. V. 6. P. 623-634.

247. Vallier L., Alexander M., Pedersen R.A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells// J Cell Sci. 2005. V. 118. P. 4495-4509.

248. Varga K, Vereb Z., Rajnavolgyi E., Nemet K., Uher F., Sarkadi B., Apdli A. Mesenchymal stem cell like (MSC1) cells generated from human embryonic stem cells support pluripotent cell growth// Biochem Biophys Res Commun. 2011. V.414. P. 474-480.

249. Vazin 71, Freed WJ. Human embryonic stem cells: derivation, culture, and differentiation: a review// Restor Neurol Neurosci. 2010. V. 28. P. 589-603.

250. Vieyra D.S., Rosen A., Goodell M.A. Identification and characterization of side population cells in embryonic stem cell cultures// Stem Cells Dev. 2009. V. 18. P. 1155-1166.

251. Villa-Diaz L.G., Nandivada II., Ding J., Nogueira-de-Souza N.C., Krebsbach P.H., O'Shea K.S., Lahann J., Smith G.D. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells//Nat Biotechnol. 2010. V. 28. P. 581-583.

252. Vossmerbaeumer U., Ohnesorge 51, Kuehl SI, Haapalahli M., Kluter II, Jonas.IB., Thierse H.J., Bieback K. Retinal pigment epithelial phenotype induced in human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells// Cytotherapy. 2009. V.l 1. P. 177-188.

253. Vuoristo S., Virtanen I., Takkunen M., Palgi J., Kikkawa Y., Rousselle P., Sekiguchi K., Tuuri 71, Otonkoski T. Laminin isoforms in human embryonic stem cells: synthesis, receptor usage and growth support// J Cell Mol Med. 2009. V. 13. P. 2622-2633.

254. Wang 0., Mou X., Cao II, Meng Q., Ma Y., Han P., Jiang J, Zhang H., Ma Y. A novel xcno-free and feeder-cell-free system for human pluripotent stem cell culture// Protein Cell. 2012. V. 3. P. 51-59.

255. Xie C.Q., Zhang J., Xiao Y., Zhang L., Mou Y, Liu X., Akinbami M., Cui T., Chen Y.E. Transplantation of human undifferentiated embryonic stem cells into a myocardial infarction rat model// Stem Cells Dev. 2007. V. 16. P. 25-29.

256. Xu C., Inokuma M.S., Denham J., Golds K, Kundu P., Gold J.D., Carpenter M.K. Feederfree growth of undifferentiated human embryonic stem cells// Nat Biotechnol. 2001. V. 19. P. 971— 974.

257. Xu C., Jiang ,/, Sottile V., McWhir J., Lebkowski J., Carpenter M.K. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth// Stem Cells. 2004. V. 22. P. 972-980.

258. Xu R.H., Peck R.M., Li D.S., FengX, Ludwig T., Thomson J.A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells// Nat. Methods.2005. V. 2. P. 185-190.

259. YangS., Lin G., Tan Y.Q., Deng L.Y., Yuan D., Lu G.X. Differences between karyotypically normal and abnormal human embryonic stem cells // Cell Prolif. 2010. V. 43. P. 195-206.

260. Yamazaki T., Enosawa S., Tsukiyama T., Tokhva T. Presence of side-population cells in an immortalized nontumorigenic human liver epithelial cell line// In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2008. V. 44. P. 6-9.

261. Yen M.L., Hon C.H., Peng K.Y., Tseng P.C., Jiang S.S., Shun C.T., Chen Y.C., Kuo M.L Efficient Derivation & Concise Gene Expression Profiling of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors (EMPs)// Cell Transplant. 2011. 00 00.

262. Yoo S.J, Yoon B.S., Kim J.M., SongJ.M., Roh S„ You S„ Yoon U.S. Efficient culture system for human embryonic stem cells using autologous human embryonic stem cell-derived feeder cells// Exp Mol Med. 2005. V. 37. P. 399-407.

263. Yoo S.J., Yoon B.S., Kim J.M., SongJ.M, Roh S., You S„ Yoon H.S. Efficient culture system for human embryonic stem cells using autologous human embryonic stem cell-derived feeder cells// Exp Mol Med. 2005. V. 37. P. 399-407.

264. Yurchenco P.D., P alt on B.L. Developmental and pathogenic mechanisms of basement membrane assembly// Curr Pharm Des. 2009. V.15. P. 1277-94.

265. Zhang X, Stojkovic P., Przyborski S., Cooke M., Armstrong L., Lako M., Stojkovic M. Derivation of human embryonic stem cells from developing and arrested embryos// Stem Cells. 2006. V. 24. P. 2669-2676.

266. Zhang F., Pasumarthi KB. Embryonic stem cell transplantation: promise and progress in the treatment of heart disease// BioDrugs. 2008. V. 22. P. 361-74.

267. Zweigerdt R., Olmer R., Singh H., Haverich A., Martin U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture// Nat Protoc. 2011. V. 6. P. 689 700.