Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение новых белков на основе интерлейкина-2 человека методами генетической инженергии и оценка их иммуносупрессорных свойств

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение новых белков на основе интерлейкина-2 человека методами генетической инженергии и оценка их иммуносупрессорных свойств"

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ "ВЕКТОР" НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЯЬСКШ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

на правах рукописи

и&гшШ Сергей Викторович

ПОЛУЧШЕ НОВЫХ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ И ОЦЕНКА ИХ ШМУНОСУПРЕССОРШХ СВОЙСТВ -

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 1991

Работа выполнзна в научно-исследовательском институте молекулярной биологии НПО "Вектор"■

Научный руководитель: кандидат химических наук

А.Н. СИНЯКОВ

Официальные оппонэнты: доктор биологических Ееук,

зл.-корр. ASH РСФСР, профос сор . Н.П. Мертвецов

кандидат биологических наук . Е.В. Чэшенко

I .

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва)

Защита состоится п лЬб " Фи^^Хк 1991 г. з° . часов на заседании Специ&пязиразакйого сойета К093.08.01 в научно-исследовательском институте молекулярной биологии. ШО "Бектор" по адресу: 633057, п.Кольцово Новосибирской области, Новосибирского района, ВНИИ МБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института молекулярной биологии НПО "Вектор", п.Кольцово Новосибирской области.

I

Автореферат разослан n/<f " г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

^ Т.Н. Шубина

v^ry

л | ! . СБ-НАЛ ХАРАКТЕРИСТИКА РАбС-ТЫ

—^¿^альность проблемы. Интерлейкин-2 (IL-2) человека - лимфокин, полифункциокальный медиатор кдаунксй системы. ИзЕвсткпЗ как фактор роста Т-лимфоцитов, сн играет ключевую роль з развитии Т-клетсч-ного иммунного ответа организма, в тем числа з развитии реакции отторжения аллотрансплзнтата. Некоторые аутоиммунные заболевания, СПИД, многие вида злокачественных новообразований так пли иначе связаны с нарушения?,и во взаимодействии IL-2 со специфическими рецептора:/® на клеточной поверхности мгйо с нарушениями а эксясвсски как самого IL-2, так я рецепторов к нему.

Таким образом. IL-2 представляется весьма перспективным лмму-яотерапевтическим агентом. В настоящее время ¿-а получены высокоэффективные бактериальные игашн-проэдяенгн IL-2 человека и некоторых его аналогов. На ссково рекомбннгнтного 11-2 га рубежом созданы препараты, пригодные для использования s медицинской практике. Подобные разработки проводятся и з наг?й стране.

Вместе с тем предпринимаются активные попытки получения нсгих перспективных белков на основе JZ.-Z человека. Ссобсе значение приобретает разработка препаратов для нммуносупрессивной repsrain, направленной на рецепторы к IL-2. Этот факт обусловлен crpcjcioit потребностью медицины в надежных имукосупрессорзх сс строгой избирательностью действия и отсутствием опасен побочных эффектоз как для «течения ряда аутоиммунных заболеваний, так и для ярэдотзращэ-ния развития реакции отторжения аллотрансилантата.

Одним из возможных путей решения этой зйлзчи является получение аналогов Ii-2 человека с отсутствием биолспгюской активности IL-2, однако сохраняющих способность связываться сс спэшггичосжга рецепторами к П.-2. Такие белки были бы способны блокировать -эйс-твие эндогенного IL-2 в результате конкурешг.а! за его репситора, проявляя цитостатич-зский эффект по отношению к актншгроЕан^\;м г-лимфоцитам. Однако получение подобных аналогов II-2 сс:гряаеко з рядом объективных трудностей, обусловленных недостаточной r.ayvi:-:--яоетьв структурно-фуккщюнзльксй организаций 11-2 чзлов-кэ.

Другой путь решения зшеуказашог задач?? состоит з Z',,.уж-йс: цлтстоксичеених П-2-содэря8Ейх хишрнше Селсов, изкзслзйхса^зоя

часть молекула; которых выполняет сгаэдзв доменэ, ргспознашего ре-цепторк. йспользуеше для этой даяк бастзриалънш токсины, у которых рецепторшй домен заменен на И-2» адресуются лишь клетка«, эксцрессирушж высокоаЗФпнше реа&птош J- И~2, окаг^зая те« се--«аи строго селективный агтотоксический аффект. Подобные молекула окдк получены за рубехом не остове дафгвриЯного токсина и псевдо-иокаднсг-о экзотоксина, салздгвагтг сходног структурно-фушаионаяь-ноз оргзнкзашей и мзханизком действия, Использование .других токсинов ддя консгруироввЕйй тг-ккх хихерннх молекул аредзтозляется гнтер&гшк и с научное, к с пргкглческой ТОЧЭК зрэкня. Цель к задачи работа. Кастошая работа развивглззь шэпм по вышеуказанным двум неправдонкаа а изла своз£ цель» зодучанке мутент-ннх аналогов IL-2 человека i: x^vopszx Селког, состоящая us гуоъедк-гщы tokceis аггела: и tl-2 человека, исследование их сао-логкчвскс?. активности к сугграослглого дзйствая в отновенкк црола-фередая Т-лимфоцитов человека. Ь соответствии с этем нзоохедаш было ревкть следующие задачяг конструирована, кдэягрозание а экспрессия гек-эквивалвнтов аналогов IL-2 человека (с дзлециэй 1201л

133 а/к сегмента i: с зек-зной Irp на ?iie), гшерных г&вов, кодирующих седки, состоят из а/к последовательностей IL-2 человека и шгтотокскческой А-суОъед._шшы токсина шигедлы, исследование биологической активности продуктов их экспрессии и оценка возможности использования подученных рекомЗЕнантннх белков в ш,шунз супрессивной тернзаг, направленной ка рецепторы к IL-2. Научная новизна и практическое значение работа. Впервые подучены генно-Енкзнерныэ белки, состожцяа из II-2 человека и цитотоксячес-кой ¿-субьешогш токсина шагелды к показана кх бифункциональная (суцрегсярушзя у, стимулфумаая) активность в стносэнаи лролнферь-цди Т-летфоиктов периферической кроья чедэввкь. Опровергнута литературные данные относительно того, что мухалтный IL-2 человека с заменой Егр12' на The является сильным антагонистом XL-2. В процессе выполнения работы была прогс.дена оригинальная реконструкция гкспрессирувщей ген IL-2 плазшды, в результате которой получен васскозффектквадй шгшм-продуцент 1L-2 человека, перспективный для гг:-;шалбккого производства.

¿пробздая работы и ауб -шзгж. дле

апаан на II отрпсчзвсй ко^Ч-рэнс.*".: мозга*; учь-яшг 'чкгузлыше ;:ps-I5JX-I.VH бяоте^Еолт^:" , i .^¡ссэртдтш

спуслпсозгко 2 сготкг твзк-.ь -—ггс 2 г .

Объем и структура дт'сс--?рта.цз:'.. д.. т-зртзркя :uj:c::;sh: ;-„> '.'-2 c.ps-in-цах, согерзя? 2- р?сук:з и ' та"л5щу. Вис.-югр-^л • "5

наккзн5В5нк2. Ксжсялшгсянсв «cstov-h::-1 рг<Гота -y.nyyos-r;; ^г.-.аз.-е-ние, список зскгэсзгзй. 259лгнцэ, сЗзср лз': »аат^'рз. г

методе, рэрт-льтагп л ссу^-нге. аз^о^, • лг::-рзт>г-.

C01i??.fLiI--i'E '-.ЕСТЬ 2.1. Ссза£Еке гэкс-лт-есяга гшн-зтг./лцгл, .-ссх • гзгг^с ¿¿a ru."

TL -cv;bf.jiccti'vr: c.iivs-nzy.-y.^.j

К мсчех-.-у начг-лз >:астсла-"Л : у: -^rro "ул.; . ,• "

рлз.гк'^ьа мутмугд r-f.rr.j. \,ил'т: /,... " "

{1 £0-133 а/?; остатка; адт уутсс:; тлча,

£Д.:зко r;oji.-.' jr. - л.,-. ::: -.v.::: •.;

"Л. С леи ::r;':o.r.i;i с~Ус;У:';';ти v. „с:";* „ „ у:гу утсгу: „-с

11-2 ьчл-г.сга ■!?»;?.,х?го .уз.^у:"":, УГУ 'У - :-

,'.г"та, 4 У: спн^црс-::.:" г~н-

э1Ы23, i, . "У" а/-: 'Гс;:1-;%-у УУС7'. .: -

лент, к лета93-,'- у; ".

с-учт«"...'-* л ,.;~гз

гш era Л'. Вг.тБ1Э рГУ.Г-УУ^-.:., • ;-л - у у.;. .;>-

:учг--пгл и^р.-;:-у р^-;- у: v-.yy-o:

У-ннстутт-'Х^кл h-j.xi ", :г ■ „'-•--i;--;

■;эктл с ::o?ry.y3?ieriTapi:/.; ,:-ус^у "ч лечу :■ .

ПЕ5Г кхсксл и дзлее ы.и: г:? сггпск;,'

'ябрялкз-адя - - поке-.уг^лк: е. i- •

кя ::олэвуго гею к^скгрсна;-: L'r-cHI ~

70 п.а. ) к ?а11-?сК1-^зп,!0кт плакал;: piLtZC г.о»: ;е rfHf25/Вал£1-Рзt'"; з результате салл псу/ч^у- " jll.':;.

(1)

(г:

Фр.КленовЕ, затем ВаиЗА

ЗаиЗА

I

О)

клонирование в

У --

_Ъ

к

(4) БалаШ рРН125/£атН1

Рок!

|( р1Ь4и ||

)^ВагаН1

Рис.1 Схема получения фрагмента гена П.-2т, кодирующего 98-119 а/к сегмент 1Ь-2 человека

-тссь-

3*-

За1С1

3'-

5'-

—АСС-

3'

БаиЗА

Рис.2 Расположение затраЕок, об&сгочивавщее замену кодона Тгр1^ (ТСС) на РЬе (ТТТ > в результате амшшфикации, в начале первого цикла

5

Появившиеся противоречивые результати относительно способности аналога IL-2 с заменой Trp1t"1 на БЬе блокировать трансмемсрак-ный сигнал IL-2 побудили нас осуществить синтез гена этого селе?., полутать продукт экспрессии этего гена к исследсзатъ его соеястз;:.

Для этого ми воспользовались рекомошкшгноЛ плазгацгоа pFLl37. несушей С-концевоЯ фрагмент гэнз 11-2 человека, жстряшг 98 а/к сегмент 11-2, я методом полимеразней ценно,í реакция. Олигокуг--Л90ТИЛЫ, выбранные в качестве затравок для ^аа-полямэрезы, позволили амплиСшшровать участок ДНК плазмиды, содержащий фрагмент г~-на IL-2 и прилегающие к нему участки рестрикции, с одновременным введением необходимой мутации (рис.2Í. 3 результате кдонкрозения амплифицированннх фрагментов (£0 и 55 и.о.) была получена целевая: ялазмида pI14s, содержащая фрагмент гена IL-2 с ззкеиогг колона 'Ггр на кодсн Phe з 121 полокеш.

Следупцим этапом раоота являлось получение генов химернцх белков, состоящих из IL-2 человека и А-еусъелпницы сглгз-тсхснна.

Для получения фрагмента ДКК, кодирующего цитстсхсичзскус А-субъедикицу ¡гига-токсина (А-гена), была использована ядазмида CSKT23, несущая фрагмент генома 31г.disenterias с оперено:.*. сига-токсина. Стратегия получения .4-гека была разработана таким образом, чтобы: во-первыг, иметь возможность удалить сигнальную г.ос?:э~ човатальность; во-вторых, обеспечить возможность удобной стиксе:-:;-, как 5*-, так и 3'-концевой области А-гена с лю5п:»1 фрагментом ДНЯ (регуляторнкм либо гэк-эквивалентом) и в-третьих, свес?:: яг:: отом к минимуму изменения в а/к последовательности ¿-суб'ьедппнцц.

Схема получения 1-гзез представлена аз рис.2. Кедозтз-'гд::;! 3'-концевой участок А-гзка, кодируюсь 253-£?3 а/л сегмент, получали хшако-фбр^нтзтцвакм сянгггсм 4

трансляции был сфоркг.озез йаеН-^чгот;^ zzz-r^'zxzzi д.;:.; ная бескснкгктодаой стнзоигса о геном ZZ-1. 2 -¿з от~;:-кодс::сл - дло яяонирукшх сайга. Клскяагзнззм трех л Д1Д-: г.олуп.

змяду рПШС, 2 кстсрз2 З'-кснцован cCsázt-, zszz

rglll Й -=

tri

BsdR3

^BspRI

Bgll

belli Bgil bsoRI

¡ " 1 ~ I

□B2SSS5SSZ2SZ2SS2D ' /

/

/

/

/

Fohl

у

bgll/ BspRI

IAAAалла I

Í

Bgll Pokl i_

РоЫ ÏB+2

клонирование в p?Hi25/BairHX-ïstI

■EooR.1

(из А олигонукл.)

ргН-410

РЦс-3. Получение рэкомОинантной плазмида pFHAsIC а) Схема конструирования промежуточной плазмида рРНАЮ

Штриховкой выделена область А-гена.

-g-

3co31 .1

5' -CAGTT.UTGTGGXCTCCA4GG TAOAAAAGTCM'mCACGAA.CaCTÍ?CCTTAAATGGAATCl

1 2 3 £92 293 * *

В) КЗ? 3 S A L Stop

- GGíCTCGAAGGAÁTTT - AGCTGÁGCGCTAT-GA -

Signa1 A-gene - OCAGAGCTTCCimAA - TCGAGÍGGGGATAGT -

E0031.I Haell SaiGI PstI

Рис.3 (окончание) Получение рекомбинантной плазмиды рРНАз'С

б) Положение олигонуклеотида-затравки на одкодепочечной ДНК фагг М13шр9А, обеспечивающее введение необходимой мутации

в) 5'- и 3'-концевая область A-гена в плазмида pFHAslC

а) 'Г и Г StopStop

_ ACACTGACTTAÁ'TGAGTGGACGCGTGATCCAGAAíTC

--—'--I__

IL-¿ | -■-—- TGTGACTGMTTACTC^GCTCiCGCACTAGGTCTTAAG

CalGI ücoííl

Hgal

Fokl

z т stop^top ACíjC ТС АСГ xh'l AÜCACC CAG

rCTGACTlGAA'TTACiCGT' GuTCTTAA

1 W— HOORI

?zkZ

Рис.4 Сгроэнкз районе», np:i¡wrsícscix :< 'i'-концу генз П-1 плазыид рП»? (а) л cll¿¿ (б); нертикалыгке стр^л:::: рагдол.-Г'-т сл;:-гснуклеотилн, которые ислользсндглсь дра реконструкции; пунктире/ обозначено маого расцепления реог-пк*лзс»:

р&клонгрэаает в ЛНК бактериофага М12кр9 и метолом одкгонуклеотвд-

направленнсгс кутагекеза образовали участок узнавания для рестрик-"зк 1со21.1 (рдс.З), позволявший вкдзякть А-ген без своей сигнальной последовательности, после чего этот фрагмент был возвращен ь :: сходную гаазмэдг. В результате была получена плазмида p?HAs10, •:?су2ад /:-гън, подготовленный к созданию ллбкх содержания его ге-!;;-т:сческга: конструкций, в том числе химерных генов. Использование р*стргксазк Еоо31Л (как к ?оЫ) позншаэт надвгность при различных гекнот нкзнзрнш: игадаулядаос за счет несимметричности образующихся при ее дейстЕик 5'-выступандшс концов колекул ДНК.

Для конструирования двгершх генов, содержащих на 5'-конце ген IÎ.-2, до реконструировали плззмлду рП2, поскольку она нэ обеспечиваот возможности выделения гена IL-2 бзз стоп-кодонов трансляции (рдс.4). При этом мы попытались получить универсальную конструкцию гена II-2, способную достаточно легко с минимальными искажениям: состыковаться с произвольной нуклеотнднсй последова-тельностьв в целевую химерную структуру. Эту задачу ш решил:: сдвигом ïGkI-сайта относительно гена 11-2 в плазкиде pIL2 влево на расстояние 7 нуклаотидкых звеньев путем замены FokI-PstI-^рзгмента плазмида pIL2 синтетическим коннектором (рис.4).

Таким образом, вами были полностью подготовлены все конструкции, необходимые для получения плазмнд, экспрессирущах целевые мутантные в химерные генк.

2.2. Экспрессия генов аналогов 11-2 к химерных генов ' П-2-А-субъедичица шкга-токсина

Для создания систем экспрессии наших генов № воспользовались нлазмвдой pHIL18 (получена Камыниной Т.Н., НИКТИ БАВ, Бердск), со-дерзащей ген IL-2 человека, ранее синтезированный в нашей лаборатории, под контролем гесА-промотора Proteus mirabilis и являющейся производной pBR322. Эта плазмида была нами реконструирована в пла-змэду рКЕЬЗ на основе pBR327 (рис.5). Причины реконструкции таковы: удаление нежелательных участков рестрикции (PruII- в векторной части плазмида и EcoRI- перед цромогоршм фрагментом); повышение котшйности плазмида в клетках E.coll с целью проявления эффекта

- ю -

дозы гена, т.е. повышения уровня синтеза IL-2 по сравнению о прототипом. Полученная плазмида pfilL3 действительно обеспечила повышение уровня синтеза IL-2 на 30-50%, однако сохранилась существенная зависимость этого процесса от условий культивирования клеток 2.coll и условий индукции (рис.S).

Для получения энспрвсслрущеЯ ген {Phe'21 )-11-2 плазмиды pRIL2s часть гена II-2 в плазмиде pRIL3 была заменена соотзетству-шим мутантнш фрагментом из плазмиды рПЛэ. Уровень синтэзз целевого бежа был сравним с уровнем синтеза IL-2, обеспечиваемым плазмидсй рЯ1ЬЗ (рис.6).

экспрессия гена IL-Zm была достигнута аналогичным образом, зз исключением того, что при конструировании целевой плазмиды pRI12n мы воспользовались участком гголилянкеркой облает;; гектсрнс.1 плазмиды pFH123, несущим инвертированные повторы, в качестве коннектора для стыковки различных 5'-выступающих концов гена и вектора. Во всех анализированных клонах обнаружили высокий уровень синтеза полипептида, молекулярный esc которого был оценен как !б-<7 кЛ, что превышало рассчитанный теоретически (около ü кД;. Рестрикционна.ч картина ЯНН плазмид этих клонов полностью" совпадала с теоретической, секвенирование всей последовательности генз II-2... и пришкахь аих к нему районов также подтвердило соответствие нуклэотшшой последовательности гшазмидных Фрагментов ожидаемой.. Для того, чтобы доказать, что аномальная подвижность белка не связана с самой системой экспрессии, мы приняли решение проверить подвижность полипептида, полученного в результате экспрессии гена в жоп экспрессирующей системе.

3 результате проведенной совместно о Кравченко Б.З.(ННКТИ БАБ, Бердск) работа по созданию альтернативней системы экспрессии гена IL-2m была получена экспрессиружзя плазмида ргЛс, з которой ген IL-2m находился под контролем тандема trp-промсторсз Е.coll в составе биццстрсна перед геном дегидрофелатредуктазн. Зффьк-тивность экспрессии гена обеспечивалась также синтетическим SD-сайтом. Таким образом, конструкция этой зкспрессирухкей гок плазмиды была совершенно отлична от описанной ранее. Однако z здесь продукт экспрессии гена 1Ь-2п обладал аналогичной подвигнос-

Рис.5 Реконструкция плазшды рЯ1Ь18 (пояснение в тексте)

А Т А Т

А m х А Т

G с G С

А ГП А ф

С С С G

С G С G

Г А т А

А ? А Т

С G С G

Г А г А

G С G С

С G . С G

G С G С

С G С G

С G С G

Т А гр А

А Т А Т

G С G С

С с G С

-TAAIGA AAGCTT- Т А

Stop Т А

С G

G С

А т

А т

С G

А т

л G с

С с G

Т А

G А

-TAATGA CGAT——

Stop

Рис.7 Шпилечные структуры, сформированные вслед за стоп-ко-донами генов IL-2m в гоюзмвдэ pRIL2m (а) и XI-2 в плазмиде pRIL7t (О) (Показана только одна цепь ДНК)

fc -M'I'l^ï 1. i

ti'hfTi- У-Tï't

с • lis:- 'i- ■■• * - $ ь- * E'J.

ï ■ i --J , - i'^.f

I гцз

fs^a

S3

:&Д &Л

m *st .. f4»>

«г»

егл

'■I МЛ

" Ш

«за

eg çss

a***I

О,}

Рис.б. Экспрессия гена IL-2 и его аналогов в клетках E.coll ЛИ03, направляемая различными плазю!^!яг. 15S ДСН-ПААГ. Электрофэреграммы

а): 1 - рии, среда ЬВ, -

2 - рЩЬЗ. срэда 1Б, +

3 - рН1Ъ71;, срэда 13, -

4 - р.чшч, среда ьв, +

5 - рГШУП, срэда М9СА. +

6 - маркэрнко болки: 14, 17, 26 кЛ

? - клетки без шшзкиды, среда 13, + о): 1 - рйШЗ. срэда мзса, -

2 - рйш^ среда вдса, +

3 - маркерные белки: и, 17, '26 кД

4 - клетки без плаамида, среда иэса, +

- U -

I' ■■ ■ ^ ■

"ркг в*»

СМ»

»4

Сз®-*

&3

ш

«а»

щ н

ц У) £

мь»**

срз?

«я*

э «м*

ч

ыв

й-Щ Г1

л. -

РФ ¡■4

и?

ал

РЗ

8* Г/ЗГ

е)

\~JTi

Р е

ЬЙЗ.

т

Щ а

«ММ

за*

4=33

Рис. 6 (окончание)

в): 1 - маркерный белок: 14 кД

2 и 3 - рШ2б (2 клоне ), среда Ы9СА, +

4 - Р1Ш.18, среда МЭСА, +

5 - РЕ1ХЗ, среда ¡¿90А, +

6 - клетки баз плазмкда, среда мэса, ■+

г): 1 - маркерные бедки: 12, 14 кД

2 - рММт, среда 1Б,

3 - рР.ГЬ£ш, среда IВ, -

4 - клетки без олазмида, среда ьв, +

■•+" - индукция штомшшном С, 3 ч; - без индукции

- и -

гью в ДСК-ПААГ. Следовательно, это свойства самого рекомСиконтного белка, й ке дефект системы экспрессии.

Результаты иммуноблоттинга убедительно пскасзли, что и тот, и другой белок связывается с моноклональными антителам! к 11-2 человека, указывая на присутствие в них а/к последовательности 1Ь-2.

Интересен тот факт, что плазмида рр.112.и обеспечивает оч°нь высокий уровень синтеза 1Ь-2ш (рис.б), причем зависимость от условий культивирования и кощентрации индуктора не столь велика, как в случае плазмид рКЕЫ8 и рШЪЗ.

Этот факт привел нас к мысли, что именно протяженный инвертированный повтор, следующий непосредственно за гаком 1Ь-2т, образованный за счет использования вышеуказанной полшшнкерной области в качестве коннектора при конструированы! плвзмиды рК1Ь2'ш, определяет названные преимущества полученной гибридной плазмиды. Выполняет ли этот палиндром функцию терминатора транскрипщы или в противне.; случае увеличивает стабильность образующейся информационной РКК, мы не беремся утверждать.

Все вышеизложенное побудило нас проверить влияние 3'-фланкирующего района, состоящего из протяженных инвертированных повторов, на уровень экспрессии других белков; и в первуи очередь 11-2. Для этого в плазмидах рН1ЬЗ и рЯП.18 были сформированы шпилечше участки, близкие по сЕоей структуре ранее полученному (рис.7). Были также получены и плазмида с тандемом шпилек. Уровень синтеза 11-2 существенно возрос в случае производных плазмиды рЯ1ЬЗ. Плазмиды рКШЧ и рЯПЖ (соответственно с одним и двумя шпилечными участками) обеспечивали примерно одинаковый стабильно высот® уровень синтеза 11-2. Причем зависимость от среды культивирования не так велика, как в случае исходной плазмида рЯГЬЗ (рис.б). Подобная реконструкция плазмида рЯ1Ы8 привела к тому же, хотя и мзнее выраженному, эффекту. Сравнительный анализ уровней синтеза пелезк?: белков привел к следующим результатам: мутантный 11-2 (плаз.'.аща рЯ112т) - около 55 мкг/мл бактериальной культуры; 11-2 (плазмида р'ЙИП и рН1141;) - около 45 мкг/мл; 11-2 (плазмида рЯ1ЬЗ) - нэ более 30 мкг/мл; мутантный 1Ь-2 (плазмида рН112а) - 25-30 мкг/мл; 1Ь-2 (плвзмида рКХЫвг) - не бо'лее 20 мкг/мл.

Для получения плазмида pRILA4, содержащей под контролем гесА-промотора ген-эквивалент химерного белка ILA (IL-2 на N-конце, А-субъединица на С-конце) были использованы сконструированные наш рекомбинантше плазмида pII2d и pFHAslQ. Схема получения представлена на рис.8.

В случае плазмида pRAIL3, содержащей ген-эквивалент химерного белка АП. (а/к последовательность А-субъедониш на К-кошде, IL-2 -на С-конце), мы испытали существенные сложности при реализации подобной схемы клонирования. Это склонило нас к мысли о необходимости замены вектора на неэкспрессирущий (ввиду вероятной токсичности продукта экспрессии гена AIL для клеток Е.coll, что может быть причиной существенного уменьшения выхода трансформантов). В качестве такого мы использовали вектор pFH123/EcoRI-SalGI и достаточно легко получили плазмиду рА1Ы. Затем простым реклонированием уже собранного химерного гена AIL в экслрессирующий вектор получили целевую плазмиду pRAIL3.

На рис.9 показано строение химерных генов ILA и AIL в полу-чбнных экспрессирукаих их плазмидах.

Уровень синтеза химерных белков НА и AIL оказался невысоким (по результатам электрофореза и шмуноблоттинга суммарных клеточных белков), причем уровень экспрессии белка AIL существенно ниже, чем у белка ILA, что, возможно, связано с его быстрой протеолити-ческой деградацией в клетках" E.coli. Результаты иммукоблоттинга свидетельствуют о том, что химерные белки ILA и AIL связываются как с моноклоналышми антителами на IL-2 человека, так и с сывороткой против токсина шгвллы, в то время как белки-аналоги IL-2• связывается только в первом случае (рис.10).

Было установлено, что белок ILA в клетках E.coli накапливается б нерастворимых тельцах включения подобно IL-2 и его аналогам, однако белек AIL во фракции нерастворимых клеточных белков элект-рс^оретичвски обнаружить не удалось. Для повышения уровня синтеза химерных белков мы организовали палиндромные структуры за ген-эквивалентами ILA a AIL в плазмидах pRILA4 и pRAIL3 так, как это описано для гена IL-2. В результате были получены плазмида pRILA4t a pKAILSt, которые на обеспечили ожидаемого повышения уровня эксп-

- 1с -

PvuXI

?oi£l

PvuII

PvuIX

PokI

Fckl

Eoo3l.1

Eoo31.I

SalGI

Eoo31.I SalGI

SalGI

(rokI-Eco3l.I-aaanxep)

KJIOHHpOBBHKQ E pRII3/PvuII-3alGI i

E00RI

3alGI

Pnc.8.

Cxbmb HOHCTpynpoüamw pBKOMöHHauraoJi njiaswwji pRILA4

-IT-

а)

* 1 Ii А -GAATiGATGGCG-

133 * 1 2 А К_ Е -ACTGCAAAGGAA-

IL-2

-CTTAAGTACCGC--IGACGTTTCC'PT-

293 * * S А• L Stop —TCAGCGCTATGAGTCGAC-

-AGTCGCQATACTCAGCTG-

EooP.I

SalGI

CO * * 1 2 MAKE --GAATTCATCGCAAAGGAA-

--CT^AAGTACCGTTTCCEF-

293 1 2 SAP -TCAGCGCCT-

133

T stopstop -АСТТААТСАСГССАС-

IL-2

-AGiFCGCGGA-TGAATTACTCAGCTG-

iSOlL-

Has 11

SalGI

Рис.9 Строение химерных генов ILA (а) и AIL (Q) и фланккрую-Щ1х их paitoiioa в гэкомбкнанткых плвзмидах pRILA4 и pRAIL3 соотвзт-стьокно. Цифрами обозначены порядкозыо номера а/к каждого белка, знаком * отмачб-ла а/к не Бродящие в состав природных белков IL-2 человека и Д-субъедишцц токсзяа шигеллк.

<51*2 „

ЕЯ

Я

W

содер-

К рис.10 на стр.18:

а) - связывание с кАГ к IL-2 человека;

б) - связывание с сывороткой против токсина гаггеллы:

1 - гомогенный шига-тсксин; 2 - частично очишэкный белок ILA; ;- -Е.coli YL1201(pRAIL3t); 4 - Е.coli 711201(pEILA4t); 5 - E.coli Jl'1G2(pRIL2ia); 6 - E.coli JM103(pRIL7t); 7 - E.coli Jül03{pBR32T).

рессии. По-видимому, существуют более критические факторы, влил:-?-п:е на уровень экспрессии химерных белков. Такии фактором мскет являться скорость цротеодигической деградации полипзптиднш: цепей.

Анализ полученных результатов привил нас к мысля о необходимости замены бактериального втамма E.coli JIJ103 на птег.сд, обладавший пониженной способностью к внутриклеточному протеолизу. Тьккх ктакмов ваш било использовано два: E.coli VL1201 и VL1222. Дг« трансформации клеток этих птекмов бактерий га использовали практически все полученные нами Бкслрзсафугацно IL-2 и его производное плазмиди. Нам не удалось установить каких-либо заметных различив по уровню экспрессия целевых белков меаду двуня приводеiss:и вше Етам¥.а;а. В результате уровень синтеза белка ILA существенно возрос по сравнегапо со штаммом E.coli JK103 (рис.11). Относительно белка AIL этого сказать нельзя: уровень экспрессии сказался по-прежнему низким; однако нам удалось установить, что в клзткзх штамма E.coli VU201 этот белок частично накапливается в нерастворимой Фракции, что позволило нам его выделить аналогично другим IL-2-содержащим белкам с помощью солюбилизеции гуакидингидрохлори-дом с последующей ренатурэцией (рис.12).

Наряду с этими экспериментами мы создали конструкцию, обеспечивающую секретно белка All в периплазму клеток, в которой химерный ген AIL снабжен сигнальной последовательностью А-субъэдинпцы токсина шигеллы и находится под контролем прсмотора оперона шига-токсина. И хотя, уровень синтеза белка AIL, сбеспечиваекцй целевой плазмидой pPAIL4, оказался по-прежнему невысоким, нам удалось тестировать его биологическую активность как во фракции периплазматп-ческих клеточных белков, так и в суммарной фракции растворимых белков клетки.

I 2. i 4 5" 6

Щ riJSi

HSfëS """

^эсз esess ta.

vi? «ю eag «м»

ts I sr . •

I ^ètiiâz.

' - tr- -

«

■ ï .: • >

ta г ЕЯ

✻ » b.1

ISkS-

Puc. ¿1

Pue. il

Piic.n Экспрессия химерных, генов ILA и AIL в различных штаммах E.coli. 15Ж ЛСН-ПААГ. Электрофореграмма

1 - JM103(pRILA4t}, +■ Во всех случаях использовали

2 - VL1201 (pRAILSt ), - " среду М9СА

3 - те же клетки, + ^ "+" - индукция митомищшом С 4. - VL1201 (pRIlAit ;, - в течение 2 ч

5 - тз жэ клетки, + "-" - без индукции

6 - VIA 222 (pR ILA 4. t}, т

Рис,12 Частично очишзшше рекомб;шон?ныб бэлки IL-2, ILA и AIL. 15л ¿СК-ПААГ. Элзктрэгорегргммь

1 - «Гёлок AIL, выделанный из клеток E.coli YLîZOï (pRAÏL3î>;

2 - II-2, получбнння из клэток S.coii ,TMlC3{pRIL7t};

.3 - Село к ILA, зыделзк-шй из клеток E.ooll ïllSOt (pRILUî); <i - аналогична:.! образом приготовлеккаЯ лиза? E.coli YL12G1 (контроль)-

2.3. Исследование биологической активности рекомбпнантных белков

Для исследования биологической активности IL-2 is ого аналогов использовали моювуклеарпые динфоциты и двукратно сепарированные Т-лимфоциты человека, выделенные из периферической крови здоровых доноров. Эксперименты проводились з лаборатории вторичных иммуно-дефпцитов института клинической иммунологии СО АМН СССР (г.Новосибирск) з соответствии с известным методом Гиллиса. Результаты эти. экспериментов, позволяют сделать однозначный вывод: IL-2 человека, лишенный 13 С-конленкх а/к остатков, к (Fríe12' )-IL-2 не оказывают влияния на хфолаферзиию Т-лзмфоцктсв перйфзриеской крови человека, то есть не обладают Сио лог теской активностью IL-2 и проявляют слабую конкурентоспособность за рецензоры к IL-2.

Таким образом, литературно данные относительно того, что (ГЬе1^1)-11-2 в пятикратной кояцентрггмл по откспонкю к II-2 полностью блокирует скгн.яя II-2 в результате конкурентного связывания со слецприческолг рецепторами, не каала подгвергщэнпя в насто.'-лзй работе. Пэ-нядкксму, истипныкп являются ш.'.с-вча'еся в литературе дгняте о реааэдем значении а/к остатков в районе 120-124 а/к сзг-т/.ента IL-2 для связывания с высокоафияными рецептора?.« к IL-2.

Исходя из литературных данных по организации рецепторов к Пг-2 и полученных нами результатов койно предяокить следудай ке-ханг.1зм действия мутантных аналогов IL-2: будучи неспособными связываться как с Еысокоаффпнным рецептором (комплекс двух субъединкц FT0+P55), так и с рецепторным белком Р70, они, там не менее, сохраняют способность (Еполне возможно, пониженную) связываться с низкоефнкным рецептором Р55, что обеспечивает jai возможность конкурировать с Пг-2 за него и, тем самым, уменьшать количество высо-коафинных рецепторов на клеточной поверхности. Это приводит, в свою очередь, к небольшому ослаблению траксмвмбранного сигнала II-2.

Определение биологических свойств полученных на?,ж химерных токсинов проводили в два этапа. На первом мы установили наличие специфической активности А-субъединицы в составе химерных белков ILA и All In vitro в брсклеточной системе трансляции из ретикуло-цитов кролика. В качестве матрицы нами была использована суммарная

мРНК вируса гриппа. Тестируемый эффект выражался в подавлении бел-ксеого синтеза в зависимости от концентрации химеротоксинов. Результат фиксировали авторадиографически после электрофореза в ДСН-ПААГ, а также определяли уровень включения [3553метионина з белковую фракцию путем подсчета радиоактивности з аликЕотах реакционных сгл-зсей. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что белок AIL обладает несколько большей удельной ингабирущей активностью по сравнению с ILA.

Для проведения второго этапа исследования биологической активности ПОЛуЧЗКНЫХ НИМИ XiMOCHHX бвЛКОВ мы воспользовались сист0-тестлрсзагпя, описанной внес. Эксперименты проводились на двукратно свИ5р:гроЕс.'сш ?-лжфоцитех. Било установлено, что при высоких кошьегггргц.-:;: белков ILA. и AIL (1-5 кит/мл) происходи угне-тени-з i;ro.T,';rop-j:;:ii актированных Г-лимфоцитов человека и сущест-вс-::нге уканьгзякэ проиента зкгзаоспособшх клеток. Причем, активность бодкз AIL в этом отненошш, как правило, оказывалась значительно ьиае, чем у пл в экспериментах с клетката! различных доноров. Оти результата согласуются с полученными на первом этапе тес-т.фовэяия. Степень угнетения пролиферации существенно колебалась с? до::эра к донору, однако общая картина была одна и та же: при высоких концентрациях белка наблюдалось угнетение пролиферации Слпст-трр..чс5ор;,ароваш.!их Т-лял Е-оцктоз, которое с разбавлением ос-лз'ог.ало и далэо сменялось небольшим стимулированием. Пролиферация веактявяроваишл Т-япкфоцятсв (без обработки ФГА) с низким уровнем экспресс*/:; i ¡.-сэкоеЕгсзпа рецепторов к IL-2 существенно не угнеталась дс.л-з при. у.аксклалыд;х концентрациях химеротоксинов, а с раз-биг.глтюя ксблюдился гпде суцаствешюй стимуляции.

При использовании фракций растворимых судааркът. клеточных Зслкоз либо пержгэзмзтических белков, содеряаззпс бзлхи I1A и AIL, осаарухягзлась лкзь сткгулирувдая активность, что является следствие низкой коаизнтраши этих белков в укззаннзх фракциях.

ГТолучекггыз результата свидетельствует с том, что сконструированные на:.гл хкйрстзксяна обладают одновременно двумя протизопзле-нзЕрьвлеиаив активностями, грисутак состззнка частям siaz .'ледскуд: 11-2 к ¿-суладсоща токстка сагеляа. Анализ псязибеихся

по окончании представляемой работы литературных данных показывает, что аналогичными свойствами обладают и другие 11-2-содеркадие хи-мэротоксикы и несмотря на это они хоропо зарекомендовали себя в качестве претендентов на роль селективных аимуносупресоогаых агентов, в частности, показана возможность селективной элиминации пораненных Т-лимфоцитов при Т-клеточной лейкемии взрослых, которые, как известно, репрессируют большое количество высокоаффинных рецепторов к IIr-2, при использовании белка II-2-дифтерийный токсин. Следовательно, несмотря на пониженную активность в отношении активированных Т-лимфоцитов здоровых доноров, химеротоксин успешно мо-г.ет быть использован в качестве иммуносупрессивного препарата. Таким образом, есть все основания полагать, что сконструированные нами химеротсксины перспективны для иммуносупрессивной терапии, направленной на рецепторы к IL-2. Более углубленное и расширенное изучение биологических свойств этих бе.чков, которое, несомненно, следует провести, сможет конкретнее определить возможность их использования при трансплантациях органов и тканей или при различных патологиях, связанных с иммунной системой.

3. ВЫВОДЫ

1. .Методам химико-ферментативного синтеза и полимеразной цепней реакции получены ген-эквиваленты IL-2, кодируыаие мутантные аналоги IL-2 человека с делецией 12D-133 а/к- сегмента (13 С-концэных а/к) и с заменой Тгр в 121 положении на Fhe. Сконструированы гибридные плазмиды, обеспечивающие высокоэффективную экспрессию этих генов в ¡слетках Escherichia coil.

2. Исследованы ' биологические -свойства полученных аналогов ÎL-2 на монснуклеарных клетках периферической крови человека и на двукратно сепарированных Г-лимфоцитах. Установлено, что оба аналога не обладают биологической активностью 11-2 человека и являются очень слабыми антагонистами 11-2.

3. Сконструированы химерные ген-эквиваленты III и АН, состоящие из нуклеотидных последовательностей геноз IL-2 человека и ци-1 тотоксической А-субъединкцы токсина шигеллы в различной последовательности. Получены рекомбшантше плазмиды, обеслечивзкцие эксп-

рэссха ötkx гек--гкЕИ££лентоз s клетках 2.coli.

л. Показано, чтс ззаерогоксгага ILA и Alb кнги-'ируюг синтез белка в бэсклехсганой системе траяагвшя из рэтикулоцатсв 1фолака in vitro, что свидетельствует о сохранении биологической активности ¿-субъедяЕка шта-топсано в составе хшерьы:: белков.

5. Исследовано действие химерных белков ILA и AIL из прслз$е-р£ЦЛ£ Т-Д£2!ф013!Х0В Ч5Л0Е5КЗ, ШДвЛеЬЯЫХ 23 ПЭр:!ф5рНч£ CKO£ КроЗЛ

здоро.-;ах доноров. Установлено, что ьтн хяиврстоксакг обладают в зстнсжсстн от концентрация: двумя прэтквополозш нзгоав.18НЕля ак-т;:нкостд'-о1: игалцфорзгйБКса :: слг,цфолн:*ер£т;гнсй (ал-тотоксичес-ксй!. Остановлено, что более гырзкепней 5йтп!прс.'з?^рат7Вйой активно стьз обладает Се лек AIL.

5. Получена рекомб-лнакхная слзгмцда pHI^Tt, обэепачивехшя в клетках 2.coli стабильно sacoraßt уровень сан?«гь IL-2 человека.

Основное ссдаргадке дассэртаижа изложено з олэгуагих работах:

1. СзрОГКН С.В., ?7.<5ИИ2Я З.А., Сш-ЖОЕ А.К. . ДдЗВДОС Е.К., Позд-н.д-:ов С.Г. Рололсгруколл искусственного гйею человеческого кн-терд-;йхинз-2.// Еиооргш. Хкхш. 19ЭО. I.iu. 6.

2. Дгвдгек К.К.,-Серегтш: С.Б., Скнйксз A.n., Сир'кяскйй О.И., Баб-кж:з й.Н., Урюкоеа "-А., Ркбзнда H.A., Поздняков С.Г. 35Фек-

синтез и кхсшговашо гея-эк:т;ален:'С£ человеческого плтерл'ЗЯкпна-2 и его г.й2лсгг; &ксггрэссл~ в клетках -.coli гене 5ШТч»рлеЯКЙНЕ-2.// Ниооргзя. ХцхйЯ. 1991 . т.17. }'.: S. C.77S-73Ö. CucontH C.B., Псндляксв С'.Г. Получение, клсаироаанае и экспрессия г&н-экЕ;аолонго5 аналогсв «злоеочосксг; ш;тэрлейкпка--2.// ,!Дк;у;;л::,нцэ цребхаиа бцогохнолегш:''. Мате спали 2 отрзел, чепфо-молодых ученых, 25-27.04.90. п.Кольцове. 1590. С.б-Ю,

/