Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение комбинированного биопрепарата для борьбы с нефтяными загрязнениями на основе иммобилизованной аборигенной микрофлоры

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение комбинированного биопрепарата для борьбы с нефтяными загрязнениями на основе иммобилизованной аборигенной микрофлоры"

На правах рукописи

Федорова Ольга Семеновна

ПОЛУЧЕНИЕ КОМБИНИРОВАННОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ БОРЬБЫ С НЕФТЯНЫМИ ЗАГРЯЗНЕНИЯМИ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Красноярск - 2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии.

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор Рязанова Татьяна Васильевна

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Гуревич Юрий Леонидович,

доктор технических наук, профессор Чиркина Тамара Федоровна

Ведущая организация: Институт леса им. В. Н. Сукачева СО РАН

Защита диссертации состоится «29» декабря 2005 г. на заседании диссертационного совета Д 212. 253.01 при ГОУ ВПО «Сибирский государственный университет», по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 82

Отзывы (в двух экземплярах с заверенными подписями) просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет»

Автореферат разослан «28у>НОЛ£рЯ 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета „

кандидат химических наук, доцент Исаева Е. В

и

ZOQ6-4 22ЙР41

TJiqlo

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Воздействие на природу факторов техногенного характера за последние десятилетия возросло настолько, что природа не справляется с возросшей нагрузкой. Неизбежные технологические аварии, происходящие как при добыче, так и транспортировке нефти, выводят из оборота тысячи гектаров плодородных земель, загрязняют водоемы, нарушают естественные зоны формирования биоценозов на всех уровнях. Естественное восстановление нарушенных территорий происходит крайне медленно, особенно в северных регионах, где в основном добывается нефть.

Применяемые в настоящее время механические, химические и физико-химические методы борьбы с нефтяными загрязнениями не отвечают требованиям экологической безопасности. Поэтому применение естественных методов - важная и актуальная проблема как с точки зрения экологии, так и с позиции снижения материальных и трудовых затрат на восстановление биоценозов.

Наиболее приемлемым и перспективным является комплексный подход к процессу ремедиации загрязненных территорий, включающий систему мер по сбору и биодеструкции нефти, агрономические приемы восстановления почв. Для борьбы с нефтезагрязнениями используются микроорга-низмы-нефтеокислители, относящиеся к родам Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Arthrobacter и ряду других, позволяющие проводить деструкцию углеводородов без дополнительного вмешательства.

В этом процессе может быть использована биодеструкция с применением для этих целей аборигенной микрофлоры, иммобилизованной на пористом материале, обладающей неоспоримыми преимуществами по сравнению с ее использованием без носителя.

Используемые в настоящее время биопрепараты Дестройл, Деворойл, Деградойлас и другие способны работать только при невысоких концентрациях захрязнителя, кроме того, внесенная микрофлора подвержена вымыванию почвенными водами, что приводит к снижению её содержания в почве ниже уровня, необходимого для быстрого биоокисления загрязнителя. Известны примеры применения в качестве иммобилизующего носителя керамзита, цеолита, вермикулита, растительных отходов, но все они имеют низкую пористость и сорбционную емкость и не обеспечивают микроорганизмам благоприятных условий. Эти недостатки можно устранить, если для сбора нефти, иммобилизации и закрепления биомассы нефтеокислителей в почве применять полимерный сорбент на основе карбамидной смолы. Он имеет высокопористую структуру, содержит основные биогенные элементы и способен трансформировать массу нефти в пленку, расширяя зону ее контакта с кислородом, не требует последующего ciflOUd и уттптиппцц», тпк как с

] РОС нАционаоЙная!

БИБЛИОТЕКА I

течением времени подвергается естественному разрушению без вторичного загрязнения среды.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Интеграция» 2000-2002 гг., проект А-023 «Научно-учебный центр по проблемам лесных ресурсов Сибири», а также по плану НИР кафедры Химической технологии древесины и биотехнологии.

Цель работы Разработка технологии комбинированного биопрепарата для ликвидации нефтяных загрязнений на основе иммобилизованной на полимерный сорбент аборигенной микрофлоры и оценка его эффективности.

Основные задачи работы:

1 Выделить из нефтезагрязненных почв чистые культуры микроорганизмов, обладающих высокой нефтеокисляющей способностью в условиях иммобилизации на полимерном сорбенте.

2 Изучить основные морфологические и физиологические свойства штаммов - нефтеокислителей, провести их идентификацию.

3 Подобрать состав сред для культивирования штаммов и иммобилизующий агент, разработать оптимальные условия для получения активной биомассы для биодеструкции углеводородов в условиях иммобилизации на полимерном сорбенте.

4 Установить влияние воздействия отдельных штаммов нефтеокислителей и их ассоциаций на состав углеводородов нефти.

5 Разработать технологическую схему получения биопрепарата для утилизации нефтезагрязнений..

6 Провести испытание биопрепарата для ликвидации нефтяных загрязнений.в производственных условиях.

Научная новизна. Из почв Сибири выделены нефтеокисляющие штаммы 11 аб Pseudomonas sp., 2 сп Bacillus subtilis , 4 сп Rhodococcus sp. 2 аб Enterobacter sp. адаптированные к высоким концентрациям нефти. Наряду с известными углеводородокисляющими микроорганизмами, в предложенных условиях выявлена способность к деструкции нефти у штамма 2 сп Enterobacter sp. В качестве иммобилизующего компонента биопрепарата и источника биогенных элементов предложено использовать карбамидный поропласт - высокопористый материал, который способен трансформировать нефть из объемного состояния в пленку, когда окислительные процессы идут со значительно большей скоростью, благодаря доступности кислорода. Показано изменение фракционного состава нефти в процессе биодеструкции выделенными штаммами в моно - и смешанной культуре. Установлено, что нефтеокисляющие микроорганизмы способны полностью утилизировать фракции до С и, другие фракции углеводородов - на 67 - 91 %.

Практическая значимость работы Собрана коллекция нефтеокис-ляющих штаммов, включая 2 сп Bacillus subtilis, 4 сп Rhodococcus sp, 11 аб Pseudomonas sp., 2 аб Enterobacter sp., устойчивые к высоким концентрациям нефти в среде. Определены оптимальные условия культивирования этих штаммов. Разработана технологическая схема получения биопрепарата. Наработана опытная партия и проведены испытания полученного биопрепарата в модельных опытах и производственных условиях при ликвидации розливов нефти на 555-м километре магистрального нефтепровода Омск-Йркутск и Федоровском месторождении Сургутского нефтедобывающего региона, которые показали более высокую эффективность биопрепарата по сравнению с существующими средствами борьбы с пефтезагрязнениями и подтвердили возможность его широкого применения для этих целей.

Апробация работы Основные результаты работы докладывались и обсуждались на I Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2003),«Fems congress of European microbiologists», (Ljubljana, 2003), на 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии и развития городов» (Красноярск, 2001 ); ежегодных Всероссийских научно-практических конференциях «Лесной и химический комплексы: проблемы и решения (экологические аспекты)» (Красноярск, 2002-2004.),на Всероссийской научно-практической конференции «Новые экологобезопасные технологии для устойчивого развития регионов Сибири» (Улан-Удэ,2005 ). на краевых конференциях «Новые технологии для управления и развития региона» (Красноярск,2000, 2001),

На защиту автором выносятся результаты исследований по получению комбинированного биопрепарата на основе аборигенных штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов, иммобилизованных на полимерном пористом сорбенте; разработка условий их культивирования и иммобилизации; оценка тгефтеокисляющей способности выделенных штаммов в экспериментальных и производственных условиях.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в которых изложено основное содержание выполненных исследований.

Объем и структура работы Диссертационная работа изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок, 14 таблиц, 9 фотографий. Работа содержит введение, четыре главы, общие выводы, библиографический список, состоящий из 158 наименований, и 12 приложений.

Основное содержание работы

Введение Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, ее вклад в решение проблемы борьбы с нефтяными загрязнениями, обоснование применяемых микробиологических методов для интенсификации этого процесса.

Аналитический обзор В аналитическом обзоре проведен анализ отечественной и зарубежной литературы, касающийся процессов получения биомассы нефтеокислителей, состава неф! и и его изменения при биоокислении, методов борьбы с нефтяными загрязнениями, применения биопрепаратов для устранения розливов нефти в разных климатических зонах, использования нефтесорбентов для иммобилизации микроорганизмов. Исходя из полученных сведений определено, что существует необходимость в биопрепарате, сочетающем биологический и минеральный компонент, обеспечивающий нефтеокислителям иммобилизацию и преимущества в доступе кислорода, работающий при высоких концентрациях нефти и не требующий дополнительных затрат на уборку и утилизацию.

Методы проведения эксперимента Выделение чистых культур неф-теокисляющих штаммов, проводили из нефтезагрязненных почв с использованием питательных сред методами, принятыми в микробиологии [Егоров, 1983; Звягинцев, 1991; Шлегель, 1987]. Скрининг штаммов проводили по нефтеокисляющей способности при высокой концентрации нефти и в условиях иммобилизации на полимерный сорбент. Особенностью полимерного сорбента является развитая пористая структура. Он сорбирует от 40 до 50 г нефти на 1 г, достаточно гидрофилен и содержит биогенные элементы -азот (28,9 %) и фосфор (2,1 %). Оценку эффективности нефтеокисления штаммов проводили 1равиметрическим методом, определяя содержание остаточной нефти путем экстракции ее гексаном и хлороформом. Физиологические характеристики и систематическое положение выделенных штаммов 2 сп Bacillus subtilis, 4 сп Rhodococcus sp., И аб Pseudomonas sp„ 2 аб Enterobacter sp., проводили по общепринятым методикам [Берджи, 1997] и путем ампфликации и секвенирования1.

Титр жизнеспособных клеток (КОЕ) определяли путем высева серийных разведений клеточной суспензии на плотных питательных средах.

Пригодность сорбента для иммобилизации устанавливали по нефте- и влагоемкости, содержанию свободного формальдегида, адсорбционной активности по йоду и метиленовому голубому, который определяли фото-электроколориметрическим методом по ГОСТ 4453-74.

1 Идентификация проведена в центре «Еиоинженерия» РАН, г. Москва д.б.н. Кузнецовым Б.Б.

Концентрацию биомассы в суспензии определяли нефелометрически, после длительного отстаивания и разделения с применением фотоколориметра КФК-2 при 590 нм с использованием калибровочного графика.

Состав нефти определяли методом ГЖХ и хромато-масс-спектрометрии углеводородных экстрактов на приборе -ICD-Plus (Heulett Paccard) USA.

Культивирование выделенных штаммов в периодическом режиме осуществляли на средах, содержащих нефть (10 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии со следующим минеральным составом:

Среда № 1: (NH4 )2S04 - 3 г/л; KN03 - 3 г\л; КН2Р04 - 0,6 г/л; Na2HP04 -1,5 г/л; MgS04 • 7Н20 - 0,5 г/л;

Среда № 2: (NH4)2S04 - 5 г/л; КН2Р04 - 0,85 г/л; К2НР04 - 0,15 г/л; NaCl - 0,1 г/л; СаС1 - 0,1 г/л; MgS04 • 7Н20 - 0,5 г/л;

Среда № 3: NH„N03, КН2Р04, К2НР04 по 1 г/л; MgS04 ■ 7Н20 - 0,2 г/л; СаС12 - 0,02 г/л; FeCl3;

Спеда № 4: NH4C1, КН2Р04 по 0,5 г/л; 0,1 г/л СаСОэ.

Обогащение сред микроэлементами проводили в виде смеси солей (г/л): НзВОз - 5, (NH4)2Mo04 - 5, И - 0,5, NaBr - 0,5, ZnS04 • 7Н20 - 0,2, A12S04 • 18 Н20-0,3.

Культивирование проводили в колбах на качалках со скоростью вращения платформы 180 об/мин и ферментерах емкостью 0,2; 0,5; 1,5; 5,0 л с аэрацией воздухом с расходом 1-5 л/мин на 1 л среды.

Эксперименты проводили в пяти повторностях, со статистической обработкой результатов по стандартным методикам с использованием программного пакета Microsoft Excl 2000 для Windows 2000. Достоверность различий рассчитывали при доверительной вероятности Р = 0,95.

Экспериментальная часть

Изучение не<Ьтеокисляющей способности штаммов Используемые в работе штаммы микроорганизмов были выделены из почв Сургутского нефтедобывающего региона и Кемчугской нефтеперекачивающей станции Красноярского края. Было получено 60 изолятов. Отбор штаммов, имеющих высокую нефтеокисляющую способность, проводили на жидких средах при начальной концентрации нефти 100 г/л и наличии в среде полимерного сорбента. Устойчивые результаты по биодеструкции внесенной нефти показали 10 выделенных штаммов. Методами, принятыми в микробиологии, и секвенсорного анализа определили, что исследуемые штаммы 2 сп Bacillus sub-tilis, 4 сп Rhodococcus sp, 11 аб Pseudomonas sp., 2 аб Enterobacter sp., относятся к родам Bacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Enterobacter.

Оценку влияния иммобилизации на нефтеокисляющую способность штаммов проводили при культивировании в течение 18 сут на жидкой питательной среде при температуре 25°С, содержащей 20 г/л нефти без сорбента и 100 г/л с сорбентом. Результаты показали, что в условиях иммоби-

лизации штаммы утилизируют более 80 % нефти, в то время как без иммобилизации в 1,5-2 раза ниже (таблица 1). Увеличение степени биодеструкции нефти иммобилизованными штаммами связано с наличием биогенных элементов и уменьшением толщины нефтяной пленки на его поверхности в результате поглощения нефти сорбентом. Это улучшает условия доступа кислорода и увеличивает эффективность микробного воздействия на углеводороды нефти.

Таблица 1-Влияние иммобилизации на утилизацию нефти

микроорганизмами

Наименование штаммов и их композиций Содержание остаточной нефти, %

без сорбента с сорбентом

2 сп Bacillus sub. 53 82

2 аб Enterobacter sp. 41 72

11 аб Pseudomonas put 52 76

4cn Rhodoccocus er. 47 78

Д (Candida) +2cn + 2 аб 56 88

Очевидно, что жесткий предварительный отбор в условиях высоких концентраций нефти и в присутствии полимерного сорбента, значительно влияющего на микроокружение клеток, позволил выделить ферментативно сильные штаммы.

Влияние условий культивирования на накопление биомассы Выход биомассы микроорганизмов определяется рядом факторов, главными из которых являются: состав питательной среды, кислотность, температура, интенсивность аэрации, продолжительность культивирования. Получение биомассы активных штаммов микроорганизмов-нефтеокислителей для последующей иммобилизации на полимерный сорбент проводили в условиях глубинного периодического культивирования на питательных средах различного состава. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали сырую нефть в концентрации 10 г/л, инокулят вносили с титром 108 в количестве 1 мл на 100 мл среды.

Влияние состава среды Сравнительный анализ процесса культивирования штаммов на средах разного состава в колбах на качалке показал, что максимальный выход биомассы (1,8-2,5г/л) для всех штаммов достигается на среде №3 с добавлением микроэлементов. Результаты накопления биомассы штаммами 11 аб Pseudomonas sp., представлены на рисунке 1а, 2 сп Bacillus sub-tilis на рисунке 16. Наибольший рост культуры исследуемых штаммов наблюдается на среде №3 с микроэлементами.

Продолжительность, cyr

О 2 4 6 8 10 Продолжительность, сут

среда 1

среда 1 —*— среда 2 —А— среда 3 X среда 4

а) 11 аб Pseudomonas sp.

б) 2 сп Bacillus subtilis

Рисунок 1 - Влияние состава среды и продолжительности культивирования на накопление биомассы штаммов

Из графиков видно, что при культивировании в течение 6 суток максимальное значение концентрации биомассы составляет 2,45 г/л. Дальнейшее увеличение продолжительное i и не приводит к накоплению биомассы.

Влияние аэрирования Известно, что рост клеток аэробов в жидкой среде определяется не только наличием в ней источников углерода и энергии, минеральных компонентов, но и аэрированием в первую очередь, так как процессы окисления органических веществ, а углеводородов особенно, как глубоко восстановленного субстрата, сопровождаются большими затратами молекулярного кислорода. Однако требовалось определить потребности отдельных штаммов в аэрировании среды для получения биомассы.

Влияние аэрации на процесс накопления биомассы нефтеокисли-тслей представлен на рисунке 2, где на примере роста штамма 11 аб Pseudomonas sp. представлен график изменения концентрации в различных условиях аэрации (в колбах на качалке и в ферментере с бар-ботажем) и температуре 25°С. Результаты показали, что общая скорость роста в течение первых трех суток в ферментере 0,0563 г/час, на качалке 0,0198 г/ч ас, то есть превышает в 2,85 раза. Интенсивная аэрация в ферментере приводит к увеличению скорости роста, что сопровождается сокращением продолжительности культивирования на 1-2 суток.

При переходе в стационарную фазу роста культуры несмотря на стабильное значение концентрации биомассы количество клеток, образовавших колонию на агаризованной среде в этой фазе снижается. При ведении процесса более 8 сут при интенсивной аэрации начало роста колоний после рассева на чашкц Петри проявляется только на вторые сутки, что косвенно подтверждает снижение общего уровня активности и адаптационных возможностей клеток. Для других штаммов интенсивная аэрация в режиме

периодического глубинного культивирования также благоприятно сказалась на общем уровне накопления биомассы, в среднем она в 1,5-2 раза выше, чем при культивировании в колбах на качалках.

Известно, что микробная клетка, находящаяся в периодической культуре на стадии экспоненциального роста, подвергается частым делениям и не создает резервные запасные вещества, неустойчива к изменяющимся условиям среды. Поэтому процесс культивирования нефтеокисляющих штаммов с целью получения биопрепарата должен ограничиваться по продолжительности и соответствовать началу достижения максимальных значений биомассы в стационарной фазе роста.

Существенное влияние на выход биомассы оказывает продолжительность аэрации. На практике при использовании мобильных установок не всегда представится возможность вести процесс культивирования при непрерывной аэрации. Поэтому необходимо было установить, как повлияет на выход биомассы периодическая подача воздуха для аэрации. Результаты показали, что непрерывная аэрация в течение суток с расходом воздуха 3 л/мин на литр среды приводит к большему накоплению, чем 5 л/мин на литр среды в течение 12 ч/сут. Общая скорость роста штамма [Бирюков,2004]. при температуре процесса 25°С в интервале от 1 до 4 сут в первом случае составляет 0,053 г/ч во втором-0,037 г/ч (рисунок 3).

Продолжительность, сут качалка —■—ферментер

Рисунок 2 - Влияние аэрирования на рост биомассы штамма 11аб Pseudomonas sp.

Однако следу ei отметить, что продолжительность стационарной фазы в первом с г. ч меньше, концентрация шю\и сы снижается уже черсч с\1кп. чю, по-видимому, объясняется интенсивно протекающими в л их условиях метаболическим ■ процессами и изменениями ч составе среды, о чем свидетс и -ствуе! снижение pH среды ^ > 4,5-5.

Влияние температуры Наряду с другими факторами, температура существенно влияет на рост микроорганизмов.

Температуру варьировали в пределах от 22 до 32 °С. Как показали результаты культивирования штаммов на среде № 3 в колбах на качалке при температуре 22 °С, высоких значений концентрация биомассы не достигает: на 5 сутки она составляет 1,2-1,3 г/л; на 8 сутки - 1,5-1,6 г/л. На других средах значения ещё ниже.

При глубинном культивировании в ферментере с периодической аэрацией воздухом (2 л/мин на литр среды ) в течение 12 ч/сут, при температуре 28 °С результаты показали, что накопление биомассы исследуемых штаммов происходит более интенсивно - уже на 2 сутки она составила 1,8-2,0 г/л. Максимальная концентрация биомассы штамма 11 аб Pseudomonas sp. (5.2 г/л) отмечается на 6 сутки. Повышение температуры среды до 30-32 °С ускоряет рост биомассы только при увеличении расхода воздуха и непрерывной аэрации Аналогичное влияние оказывает аэрация и температура на рост биомассы других штаммов.

Для штамма «2 аб» рода Enterobacter на рисунке 4 представлена диаграмма накопления биомассы в процессе культивировании на среде № 3 с микроэлементами в периодической культуре при аэрировании 12 ч/сут, по которой прослеживаются закономерности, подобные выявленным для других штаммов.

012345678 Продолительность. слт

♦ "¡.[/цин. непрерывно —•— 5 т/мин. периодически

* 1 1,'мин. непрерывно —х—3 л/мин периодически

Рисунок 3 - Зависимость накопления биомассы от расхода воздуха, подаваемого на аэрирование

Увеличение температуры приводит к увеличению накоп-

1 ления биомассы. А одновре--J менное увеличение температу-

ры до 30 °С и расхода воздуха до 3 л/мин на лнгр среды приводит к повышению концентрации биомассы на 37 % и со-

кращению продолжительности процесса до достижения максимума биомассы на сутки по

! сравнению с культивировапи-

0 1 2 3 4 5 6 Продолжительность, сут

ем при 28 °С и расходом воздуха 2 л/мин.

Поскольку исследуемые

—♦—2л/мвн, 25°с 2 л/мин, 28°с —з л/мяя, зовс штаммы предназначены для

работы в полевых условиях, а

высокий урожай биомассы за счет этого фактора очевидно не следует.

Влияние кислотности среды В число факторов, влияющих на процесс культивирования, относится и pH среды. Влияние pH среды на рост рассмотрено на примере штамма 2 сп рода Bacillus, культивирование которого проводили в ферментере на среде № 3 при температуре 25 °С и расходом воздуха 2 л/мин на лтр среды. Результаты показали, что среда со значением pH 6,5 наиболее благоприятна для развития этого штамма, рост биомассы в 1,4 раза превышает значения, полученные при начальном значении pH 6,0 и достигает максимума на 6 сутки культивирования. При дальнейшем увеличении продолжительности процесса происходит значительное снижение этого показателя до pH 4,5.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что на процесс культивирования выделенных штаммов - нефтсокислителей влияет минеральный состав среды, температура, длительность ведения процесса, аэрация и кислотность. Эти факторы в целом определяют выход микробной массы и качественные характеристики активности и адаптационной способности клеток нефтеокислителей в микробной суспензии для их иммобилизации на полимерный сорбент.

Рисунок 4 - Влияние аэрирования и температуры на накопление биомассы штаммма 2 аб Enterobacter sp.

культивирование при повышенных температурах может снизить их устойчивость к суточным перепадам температур, то стремиться получить более

Оптимизация процесса культивирования При разработке технологии получения биопрепарата необходимо решение вопроса о выборе оптимальных значений основных факторов, влияющих на процесс накопления биомассы при культивировании микроорганизмов. Разработку оптимального режима культивирования нефтеокислителей проводили для штамма 11 аб Pseudomonas sp. с использованием математических методов планирования эксперимента по плану Бокса-3. Исследование вели на среде № 3 при содержании нефти 10 г/л, поскольку более высокая концентрация нефти в среде без сорбента подавляет рост биомассы. Основываясь на ранее полученных результатах по культивированию и литературных данных, в качестве независимых переменных выбраны следующие факторы: X] - продолжи-i тельность культивирования, сут; Х2 - температура, °С; Хз - аэрация,

л/мин/л. Уровни варьирования факторов: по продолжительности - 2, 5 и 8 сут с шагом 3, основной уровень - 5 сут; по температуре + 22 °С, +25 °С и i +28 °С, с шагом 3 °С, основной уровень +25 °С; аэрации - 1, 3 и 5 л/мин на

литр среды с шагом 2, основной уровень - 3 л/мин на 1 литр среды.

В качестве выходного параметра (параметр оптимизации) выбран: Yi - выход биомассы. Задача оптимизации сводилась к определению значений технологических параметров, обеспечивающих максимальный выход биомассы.

В результате математической обработки экспериментальных данных получено уравнение регрессии и определен оптимальный режим.

Уравнение имеет вид:

Y = 2,83 + 0,87Xi + 0,54Х2 + 0,88Х3 - 0,42Xj2 - 0,25Х,Х2 + + 0,59XiX? - 0,14Х22 + 0Д9Х2Хз + 0,12Х32.

В оптимальном режиме переменные имеют следующие значения: продолжительность - 8 сут, температура + 28 °С, расход воздуха - 5 л/мин на литр среды. Расчетный выход биомассы в оптимальном режиме -5,21 г/л. Практический выход составляет 5,23 г/л, что достаточно хорошо совпадает с теоретическим и еще раз подтверждает адекватность модели.

Кроме того, были установлены зависимости выхода биомассы от технологических факторов (рисунок 5).

Графики выявленных зависимостей имеют практически линейный характер, то есть увеличение значений всех факторов приводит к возрастанию выхода биомассы. Поскольку наиболее существенное влияние на выход биомассы оказывает степень аэрации, а оптимуму соответствует пограничное значение, то дополнительно был проведен эксперимент с непрерывной подачей воздуха со скоростью 5 л/мин на литр среды, при соблюдении оптимальных значений других независимых переменных.

-1,5 -1 -0,5 О 0,5 1 1,5

- Продолжительность» cy i Темперагура, С

Аэрация, л/мин

Рисунок 5 - Зависимость выхода биомассы штамма Pseudomonas

Put «11аб». от технологических параметров

Результаты приведены на рисунке 6. Экономический коэффициент непрерывного режима аэрации с расчетом на воздушно сухую биомассу, т.е соотношение полученной биомассы к используемому субстрату (в граммах) составляет 0,84. Для периодического режима- 0,62. Как видно из полученных результатов, при интенсивном непрерывном режиме аэрации максимального значения (7,2 г/л) накопление биомассы достигает уже на третьи сутки культивирования, что выше , по сравнению с периодическим (4 г/л), почти в два раза. Расчеты показали, что при культивировании в оптимальном режиме в течение вторых и третьих суток удельная скорость роста составляет 0,06 [ чи 0,016 [ ч"'], время генерации 11,5 ч и 43,12 ч соответственно. Следовательно, в этих условиях основной рост культуры происходит на вторые сутки процесса. Для периодического аэрирования удельная скорость роста за этот период составляет 0,011 [ ч"'].

Кроме оценки влияния условий аэрации на накопление биомассы, рассматривали влияние этого параметра на состояние культуры и утилизацию субстрата. Как показали результаты исследования, в непрерывном режиме аэрирования возрастает количество КОЕ, максимальное значение которого (3,20 • Ю10 кл/мл) достигается на третьи сутки, что в среднем на трое суток ранее, чем в периодическом режиме. При дальнейшем культивировании происходит заметное снижение титра, что, вероятно, можно связать с недостатком доступного субстрата и накоплением продуктов распада.

Использование субстрата в непрерывном режиме аэрации протекает значительно быстрее; за 3 суток потребляется 92 % внесенной нефти (10 г/л) при периодическом за семь суток - 88 %. Таким образом, интенсивная аэрация позволяет не только увеличить выход биомассы нефтеокислителей, но и ускоряет процесс деградации субстрата (рисунок 6).

. 1 ^ , I 1 ' 1 1

\ч / | 1

\' \ 1 ; ! , '

1А 1

/ х

У —* -

—_1-1- —*— --- --н -

12 ю

е

ю

а>

6 1 ^ !з

3 4 5 6 7 8 9 10 Продолжительность, сут

- непрерывная

- непрерывная

- периодическая -периодическая

Рисунок 6 - Влияние продолжительности аэрации на выход биомассы и концентрацию субстрата

Другие исследуемые штаммы в этом режиме показали аналогичные закономерности роста культуры. Поэтому процесс культивирования при периодическом режиме аэрации можно завершить на 5-6 сутки, а непрерывном - на 3-4 сутки, когда концентрация активной биомассы достигает максимального значения.

Исходя из вышеизложенного, наиболее благоприятными условиями получения качественного мшфобного материала для иммобилизации па гранулированный полимерный сорбент являются: минеральная среда № 3 с микроэлементами и значением рН 6,5, температура 28-32 °С, непрерывное аэрирование с расходом воздуха 5 л/мин на литр среды. Длительность процесса при соблюдении приведенных условий не должна превышать 3-4 суток и отбор полученной биомассы и нанесение ее на гранушфованный сорбент следует делать одновременно, не допуская хранения суспензии без аэрирования.

Иммобилизация на сорбент. В качестве иммобилизующего агента использовали сорбент, полученный на основе карбамидной смолы, по технологии, разработанной в Сибирском государственном технологическом университете. Сорбент обладает развитой пористой структурой: пористость по воде - 2,8 см3/г, адсорбционная активность по йоду - 13,5 %, ад-

сорбциоштая активность по метиленовому голубому - 538,4 мг/г, объемная масса - 26,6 кг/м3, сорбционная емкость по нефти от 20 до 50 кг нефти на 1 кг сорбента, плавучесть 100 %. Сорбированная нефть и нефтепродукты из пеносорбента пе вымываются даже при длительном пребывании их на водной поверхности.

Благодаря своей структуре и химическому составу (соотношение С:М:Р = 0,5:0,24:0,03 ) сорбент увеличивает содержание азота и фосфора в среде, когда их количество в условиях нефтезагрязнения резко снижается. Одновременно он структурирует почву, закрепляет интродуцированную микрофлору, предотвращает вымывание внесённых клеток, создаёт благоприятные условия микроокружения. Сорбент способен трансформировать нефть из объемного состояния в пленку, когда окислительные процессы идут со значительно большей скоростью, благодаря доступности кислорода.

Иммобилизацию проводили путем орошения гранулированного сорбента (гранулы случайной формы размером 2-5 см) культуральной жидкостью из расчета 108 клеток па грамм сорбента.

Сорбент с нанесенными на него микроорганизмами сушили при атмосферном давлении при температуре 25-28 °С до достижения относительной влажности 8-10 %. Высушенный биопрепарат упаковывали в многослойные бумажные мешки.

В процессе хранения проверяли титр КОЕ. Результаты показали, что хранение в течение полугода при температуре 20-23 °С приводит к снижению титра на 30-35 %, а при температуре ниже 0 °С титр живых клеток остается в пределах 108 кл /г сорбента.

Испытания биосорбента при ликвидации розливов нефти

Апробацию биосорбента в производственных условиях проводили на аварийном розливе нефти на 555-м км магистрального нефтепровода Омск-Иркутск согласно плану мероприятий по ликвидации последствий аварии. По плану после удаления нефти механическими способами, которыми удалось снизить уровень загрязнения до 220 г/кг почвы, была предусмотрена обработка известными биопрепаратами, в частности Дестройлом и предлагаемым биопрепаратом, одновременно на весь участок розлива производили жидкофазное внесение минеральных удобрений (аммофоска).

Проведенные наблюдения за изменениями концентрации нефти в почве показали, что после обработки биопрепаратами, которую проводили 17-20 мая 2000 г., уровень загрязнения снижался значительно быстрее, чем на контрольном участке, не обработанном биопрепаратами (таблица 3).

Качественные изменения произошли и на уровне микробного сообщества. К концу летнего периода возросло не только общее количество уг-леводородокисляющей микрофлоры на опытном участке до 1,М0 9 , но и общий титр гетеротрофов до 1,6-1010, что свидетельствует о наличии здесь органических веществ углеводной и белковой природы, в доступной для

них форме. На фоновом пространстве численность этих микроорганизмов оставалась в пределах 0,6-108. Следует отметить большое количество осадков, выпавших в этот период, что несомненно улучшало условия жизнедеятельности внесенной микрофлоры.

Таблица 3 - Динамика содержания нефти в поверхностном слое в полевых испытаниях биосорбента (г/кг почвы)

Срок после обработки, месяц. Содержание нефти, г/кг почвы после обработки

нанесение биосорбента нанесение Дестройла контрольный участок

1 8,5 - 193,2

2 7,4 - 182,3

3 14,4 110,0 206,1

4 12,2 81,4 131,0

12 10,4 95,3 160,2

24 8,5 76,4 155,2

36 следы 63,6 148,6

Особенно быстро основная масса нефти разрушалась на участке с биосорбентом. Через месяц количество нефти составило 8,5 г/и, что соот-ветструет 3,86 % от исходного количества, в течение лета происходил дополнительный вынос нефти дождевой водой из временных сборников нефти, что немного увеличивало ее содержание в почве. Через 4 месяца концентрация нефти на опытном участке была ниже контрольного в 10 раз и в 7 раз меньше, чем на участках, обработанных коммерческим препаратом Дестройл. То есть в течение сезона удалось снизить концентрацию загрязнителя на 90,8% больше, чем на контрольном участке, где вносились только минеральные удобрения. Это дает основание утверждать, что предлагаемый комбинированный биопрепарат существенно эффективнее.

Через год на опытном участке произошло полное восстановление травяного покрова, и он практически не отличался внешне от неповрежденных соседних территорий (рисунок 7).0 том, какие фракции и в каком количестве утилизируются выделенными штаммами аборигенной микрофлоры можно судить по результатам фракционирования нефти до и после биодеструкции методом отгонки по температуре кипения.

■•■и—ш.—— лштташш —II ■е.яя ч» гтт^я^^т^^ш ни п и ■■ и н ч и * .'«хшмы'ьч •яшшш

Рисунок 7 - Опытный и контрольный участки через год после обработки

Изменения в составе фракций углеводородов в процессе биодеструкции приведены на рисунке 8.

□ 180-210 а 210-270 □ 270-300 □ 300-350 ■ 350-500

1 - исходная нефть; 2 - нефть с контрольного участка; 3 - нефть после обработки Дестройлом; 4 - нефть после обработки исследуемым биосорбентом

Рисунок 8 - Изменения фракционного состава нефти в полевых испытаниях за 4 месяца

Как видно из рисунка 8 более существенные изменения во фракционном составе нефти наблюдаются на опытном участке (4) и после обра-

ботки Дестройлом (3), чем на контрольном (2) относительно его начального состава (1).

Следует отметить, что испытания в природных условиях показали более высокий уровень утилизации нефти, чем в модельных опытах, даже при более значительных концентрациях загрязнителя, что можно объяснить дополнительным воздействием местной микрофлоры, активизированной внесенными с биопрепаратом минеральными компонентами.

Очевидно, что предлагаемый биопрепарат способен эффективно разрушать углеводороды нефти и практически восстанавливать нарушенный загрязнением биоценоз в течение одного сезона.

Исследования состава нефти, проведенные методами ГЖХ и хромато-масс-спектрометрии показали, что под действием биосорбента практически полной деструкции подвергаются легкие алканы, изоалканы, содержащие до 15 атомов углерода, С16.26, деструктируются на 92-94 %, С27.35 - на 75-80 % относительно содержания их в исходной нефти, по изомерам С« и C2i эти изменения менее выражены, хотя их массовая доля в нефти после биодеструкции также снижается.

Интродукция микроорганизмов-деструкторов нефти особенно необходима в неблагоприятных климатических условиях севера, где формирование природной микробной ассоциации идет крайне медленно

На рисунке 9 представлена динамика содержания нефти на опытном участке в районе скважины Р-57 Федоровского месторождения.

1

2

3

4

Дата

□ экспериментальная проба ■ контрольная проба

Даты отбора проб: 1 -13.07.01; 2 - 31.07.01, 3 - 16.08.01; 4 - 14.09.01

Рисунок 9 - Изменение содержания нефти на опытном участке в районе скважины Р-57

Испытания разработанного биопрепарата в Сургутском нефтедобывающем регионе показали, что выделенные штаммы можно применять и на более высоких концентрациях загрязнителя.

Содержание нефти перед обработкой составляло 600 г/кг почвы, тем не менее, обработка биопрепаратом на опытном участке позволила за два летних месяца снизить концентрацию нефти на 66,7 % больше, чем на контрольном. Это позволяет утверждать, что выделенные аборигенные штаммы, иммобилизованные на сорбенте, обладают высокой ферментативной активностью и эффективны в процессах окисления углеводородов нефти.

При проведении испытаний биопрепарата оценивали изменение как общего содержания нефти, так и отдельных фракций и индивидуальных компонентов.

Следует отметить также, что не все штаммы в одинаковой степени утилизируют компоненты нефти. Наибольший эффект во всех фракциях нефти наблюдается у биопрепарата № 2, полученного на основе ассоциации штаммов цефтеокислителей 2 сп Bacillus subtilis, 2 аб Enterobacter sp.(pncynoK 11).

1 группа штаммов: «4сп», «2аб» 2 группа штаммов: «Д», «2 сп», «2аб»

Рисунок 10 - Состав нефти до и после биодеструкции разными штаммами

Существенной биодеструкции подвергаются легкие л-алканы и изо-алканы. Полностью утилизируются компоненты, составляющие лигроино-вую фракцию. Наиболее устойчивой оказывается смолисто-асфальтеновая фракция, но основная масса углеводородов под воздействием биопрепарата утилизируются до количественно низкого уровня. Происходит процесс относительного накопления изомеров С19 и С21 за счет разрушения более доступных, что согласуется с результатами, полученными при анализе со-

става нефти после биодеструкции как в лабораторных испытаниях, так и по литературным данным.

Результаты лабораторных экспериментов с моделированием условий нефтезагрязнения с применением смешанных культур показали, что на конечный результат по утилизации внесенной нефти оказывают влияние несколько независимых факторов: тип загрязненной поверхности, предварительная подготовка почвы, состав и начальная концентрация нефти, внесение сорбента, соотношение штаммов в смешанной культуре, влажность, длительность воздействия, дополнительное внесение минеральных солей.

Описание технологической схемы

На основании результатов исследований разработана технологическая схема получения биопрепарата, которая приведена на рисунке 11. Получение микробной суспензии в периодической культуре ведётся методом глубинного культивирования с активной аэрацией среды стерильным воздухом и последующей иммобилизацией микроорганизмов на гранулированный карбамидный сорбент путем орошения его разведенной до требуемой концентрации микробной суспензией.

Приготовленная из растворов минеральных солей и стерилизованная среда № 3 после охлаждения на теплообменниках (9) подается в основной ферментер (11). Активация посевного материала ведется в отделении чистой культуры (1), где масштабируется и готовится засевной материал. Затем по трубопроводу подается в основной ферментер (11), снабженный рубашкой для обогрева. Перед инокуляцией в ферментер задается стерильный субстрат (минеральная среда № 3, содержащая нефть в количестве 1-2 % объем.). Процесс наращивания биомассы ведется в течение 3-4 суток при температуре 30 °С в режиме активной аэрации среды стерильным воздухом, подаваемым с компрессорной установки (6).

После достижения стационарной фазы роста часть культуральной жидкости выводится из ферментера через нижний слив в сборник суспензии (12), где проводится доведение ее до рабочей концентрации средой № 3. Далее суспензия подается на иммобилизацию и сушку в аппарат, представляющий собой закрытый блок с многорядным ленточным транспортером (13), снабженный распылительным устройством для равномерного распределения суспензии по сорбенту и системой для подачи воздуха на сушку. Аппарат (13) имеет систему отвода отработанного воздуха и устройство для выгрузки и фасовки готового продукта.

Гранулированный сорбент подается в верхнюю зону аппарата и насыпается тонким слоем (1,5-2,0 см) на транспортер, двигаясь но транспортерной ленте, орошается суспензией микроорганизмов. Далее пересыпается с одновременным перемешиванием на нижние уровни, постепенно сушится и через выходной лоток (14) подается на упаковку в бумажные мешки. Упакованный биопрепарат хранится в сухом помещении без отопления.

Технико-экономические расчеты, проведенные применительно к опытному производству (производительность 40 т биосорбента в год) по-

1 - посевной материал, 2 - инокулятор стерильный, 3 - инокулятор засевной, 4 - фильтр воздуха, 5 - резервуар сж. воздух, 6 - компрессор, 7 - емкость для титрантов, 8 - стерилизатор среды, 9 - теплообменники, 10 - мерник для нефти, 11 - ферментер, 12 - резервуар подготовки суспензий, 13 - блок иммобилизации и сушки, 14 - упаковка, 15,16,17 - центробежные насосы

Технологическая схема производства биопрепарата

>---------

казали эффективность предлагаемого производства, срок окупаемости составит 1,8 года

Основные результаты работы

1 Получены из нефтезагрязненных почв Сибири чистые культуры нсфте-окисляющих микроорганизмов, адаптированных к высоким концентрациям нефти в условиях иммобилизации на полимерном пористом сорбенте.

2 Методами, принятыми в микробиологии, и с применением секвениро-вания установлена родовая принадлежность штаммов: 2 сп Bacillus sub-tilis,l 1 аб Pseudomonas sp., 4 сп Rhodococcus sp., 2 аб Enterobacter sp.

3 Подобраны составы минеральных сред, разработаны оптимальные условия процесса культивирования в периодической культуре, проведена оптимизация технологических режимов получения биомассы.

4 Методами ГЖХ и хромато-масс спектрометрии установлено, что биодеструкции подвергаются все фракции нефти. Практически полной деструкции подвергаются легкие фракции; фракции С15_26, деструктируют-ся на 90-92 %, С27-35 - на 75-80 %.

5 Разработан способ модификации полимерного сорбента для иммобилизации углеводородокисляющей микрофлоры. Рассмотрены варианты хранения и применения биопрепарата в рекультивационных мероприятиях.

6 Наработана опытная партия биопрепарата и проведена апробация выделенных микроорганизмов в производственных условиях на реальных аварийных розливах нефти в Красноярском крае (220 г/л) и Сургутском нефтедобывающего регионе (600 г/л). Показано, что использование биопрепарата позволяет в течение одного сезона снизить концентрацию углеводородов нефти на 90,8 % и 66,7 %, соответственно больше, чем на контрольных территориях. По сравнению с широко применяемым Дестройлом эффективность биопрепарата выше в 7 раз.

7 Разработана технологическая схема получения биопрепарата с высокими показателями нефтеокисляющей активности; проведены технико-экономические расчеты, которые показали экономическую целесообразность создания производства, его рентабельность - 32%, срок окупаемости составляет 1,8 года.

Список публикаций:

1 Рязанова, Т.В., Мелкозеров В.М., Федорова, О.С. Пеносорбенты для ликвидации нефтяных загрязнений / Т.В. Рязанова, В.М. Мелкозеров, О.С. Федорова, [и др.] II «Новые технологии для управления и развития региона». Сб. тр. краевой науч.- практ. конф.: - Красноярск, 2000. - С. 209213.

2 Рязанова, Т.В., Федорова, О.С., Мелкозеров В.М. Разработка и испытания нефтесорбента для очистки загрязненных нефтью водоемов и почв / Т.В. Рязанова, О.С. Федорова, В.М. Мелкозеров, [и др.] /«Проблемы экологии и развития городов». Сб. тр. 2-й Всеросс. науч.-практ. конф.: - Красноярск, 2001.- С.165-169.

3 Рязанова, Т.В., Федорова, О.С., Ольков, В.Н. Биоремедиация загрязненных нефтью ландшафтов микроорганизмами, иммобилизованными на пеносорбенте / Т.В. Рязанова, О.С. Федорова, В.Н. Ольков, [и др.] // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Междунар. конгресса. - Москва, 2002. - С. 242.

4 Рязанова, Т.В, Федорова, О.С., Нагорный, Л.Д. Биоремедиация загрязненных нефтью ландшафтов микроорганизмами, иммобилизованными на пеносорбенте /Т.В. Рязанова, О.С. Федорова, Л.Д. Нагорный, [и др.] // Вестник СибГТУ. - № 2. - 2002. - С. 61-65.

5 Рязанова, Т.В., Федорова, О.С., Стригунова, А.А Разработка и испытания биосорбента Униполимер БИО на основе ассоциации нефтеокис-ляющих микроорганизмов для очистки загрязненных нефтью водоемов и почв / Т.В. Рязанова, О.С. Федорова, A.A. Стригунова, |и др.] //«Лесной и промышленный комплексы - проблемы и решения (экологические аспекты)». Сб. тр. краевой науч.-практ. конф.: - Красноярск, 2002. - Т. 3 - С. 17-22

6 Федорова, О.С., Рязанова, Т.В. Оптимизация процесса получения неф-теокисляющих штаммов в периЬдической культуре / О.С. Федорова, Т.В. Рязанова //«От фундаментальной науки - к новым технологиям. Экологически безопасные технологии».Сб. тр. Междунар. конф. молодых ученых: - Тверь, 2003. - С. 65-69.

7 Fyedorova, O.S. Oil's utilization with an oiloxygenizing microorganisms as-sotiatjon those were immobilized on foamsorbent / T.V Ryazanova, , O.S. Fyedorova // Fems congress of European microbiologists».- Slovenia, Ljubljana: Cfnkarjev dom, 2003,- P. 415.

8 Федорова, O.C., Рязанова Т.В. Получение биосорбентов для очистки нефтезагрязпенных почв / О.С. Федорова, Т.В. Рязанова //«Лесной и промышленный комплексы - проблемы и решения (экологические аспекты». Сб. тр. Всеросс. науч.-практ. конф. - Красноярск, 2004. - Т. 3. -С. 12-18.

9 Рязанова, Т.В., Федорова, О.С., Получение биосорбеита на основе аборигенной микрофлоры для очистки нефтезагрязненных территорий. /Рязанова Т.В., Федорова О.С. //«Новые экологобезопасные технологии для устойчивого развития регионов Сибири». Сб. науч. тр. Всеросс. науч.- практ. конф. - Улан-Удэ, 2005. - С. 65-70.

Сдано в производство 28.11.05. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз.

Изд. № 602. Заказ № 1396. _Лицензия ИД №06543 16.01.02._

Редакционно-издательский центр СибГТУ 660049, г.Красноярск, пр. Мира, 82

►25 0 6 5

РЫБ Русский фонд

2006-4 29970

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Федорова, Ольга Семеновна

Введение.

1. Аналитический обзор.

1.1 Методы устранения нефтяных разливов.

1.2 Характеристика и токсикология нефти.

1.3 Использование У ОМ для ликвидации нефтяных загрязнений.Н

1.4 Получение биомассы микроорганизмов.

1.5 Применение биопрепаратов для рекультивации.

2. Методы исследований.

2.1 Выделение и отбор нефтеокисляющих штаммов.

2.2 Идентификация полученных штаммов.

2.3 Модификация полимерного сорбента.

2.4 Культивирование штаммов-нефтеокислителей.

2.5. Оптимизация процесса культивирования.

2.6 Иммобилизация.49.

2.7 Определение количества нефти после биодеструкции.

2.8 Определение состава нефти до и после биодеструкции.

2.9 Модельные эксперименты на почве.

2.10 Производственные испытания.

2.11 Наработка опытной партии.

3. Экспериментальная часть.

3.1 Выделение и идентификация штаммов нефтеокислителей.

3.2 Периодическое культивирование выделенных микроорганизмов.

3. 3 Иммобилизация биомассы и получение биопрепарата.

4. Испытания полученных штаммов в модельных опытах и производственных условиях.

4.1 Модельные испытания выделенных штаммов.

4.2 Испытания комбинированного биопрепарата при ликвидации аварийных разливов нефти.

5. Технологическая часть.

6.Вывод ы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение комбинированного биопрепарата для борьбы с нефтяными загрязнениями на основе иммобилизованной аборигенной микрофлоры"

Техногенные изменения, воздействующие на природу в последнее время и их возросшая интенсивность, резко ухудшают состояние и устойчивость биосферы. Это проявляется в резком сокращении площади не нарушенных естественных экосистем, уменьшении биологического разнообразия, нарушении природных потоков вещества и энергии, вызывая необратимое количественное и качественное обеднение биосферы.

Потребление и изъятие человеком возобновляемых природных ресурсов - пресной воды, почвенного гумуса, биомассы и продукции растений достигло критической скорости или превышает темпы их естественного воспроизводства.

Загрязнение среды отходами производства создает угрозу здоровью людей, вызывает химическую деградацию экосистем. Появились признаки нарушения биосферного равновесия, ослабления регулирования ее функций и стабильности[1,3,8 ].

Все эти изменения происходят на качественно новом уровне и с высокой скоростью, что вызывает ответную реакцию природы в виде непредвиденных изменений, создающих экологическую опасность на планете в целом и ее отдельных регионах. Особенно там, где воздействие происходит без предварительной оценки возможных последствий и учета конкретных природных условий. Загрязнению подвергаются все элементы природы: атмосфера, вода, почва, живые системы вредными веществами в твердом, жидком, газообразном состоянии.

Нарушаются условия, позволяющие биосфере в прошлом успешно справляться с утилизацией отходов с помощью микроорганизмов, воды, воздуха, воздействия солнечного света, изменяются естественные процессы взаимодействия этих элементов. Отсутствие соответствующих технологий и специального оборудования приводит к тому, что полностью обезвреживается только 3,5% промышленных отходов.

Избавиться от них можно несколькими известными способами: закопать, затопить, сжечь, утилизировать. Последний вариант наиболее предпочтителен, но требует дополнительной научной проработки и материальных затрат. В промышленных зонах образуются значительные по размерам территории, выведенные из естественного состояния, угнетенные по всем направлениям количеством и токсичностью техногенных отходов. В частности, загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами в местах их добычи и переработки превышает фоновое в десятки раз.

Несовершенство технологий добычи, транспортировки, переработки и хранения нефти приводит к ее значительным потерям. При современных объемах добычи, в мире потери нефти достигают 50 млн. тонн в год [1]. В нашей стране потери при добыче, транспортировке, переработки и хранении нефти составляют почти 5 % от общей добычи [2].

Наиболее опасные формы нефтяного загрязнения связаны с многочисленными порывами нефтепроводов: в почве накапливаются стойкие поверхностно-активные вещества, являющиеся концерогенами, нарушается плодородный слой, загрязняются почвенные воды, погибает нативный биоценоз. Тонна разлитой нефти загрязняет 12 км водной поверхности, а 1 литр нефти лишает кислорода 40 тысяч литров воды. Применяемые методы борьбы с этим видом загрязнений малоэффективны, либо требуют огромных энергетических затрат, а такие как механическое засыпание почвой и выжигание просто опасны по своим последствиям.

Поэтому существует необходимость максимально приблизить эти методы к естественным и обеспечить условия, способствующие интенсивному протеканию природных биохимических процессов микробиологического окисления углеводородов нефти. При этом сохраняются ландшафты и не наносится дополнительного вреда экосистемам.

Наиболее перспективным и экологически безопасным является биотехнологический, основанный на интродукции активных углеводородокисляющих микроорганизмов в загрязненную среду [19,20]. В этом случае происходит преобразование углеводородов в экологически безопасные вещества гумусовой природы.

Современные коммерческие биопрепараты, разработанные на основе коллекционных нефтеокислителей, работают в основном на низких концентрациях загрязнителя, не все сохраняют активность и устойчивость в открытых природных системах. Особым преимуществом в этом смысле обладает местный микробиоценоз, компоненты которого наиболее взаимоприспособлены и адаптированы к условиям среды. В почвах, содержащих ранее внесенные углеводороды, всегда есть микроорганизмы, обладающие ферментными системами для деградации и окисления нефтепродуктов.

Этот метод требует выделения, подбора и изучения этих микроорганизмов - нефтедеструкторов, и их сообществ. Возникает необходимость накопления их биомассы и последующего внесения в нефтезагрязненные зоны после предварительного закрепления на специальных носителях, позволяющих обеспечить микроорганизмам благоприятные условия для нефтеокисления.

Известно, что процесс биоокисления нефти требует свободного доступа кислорода к клеткам и возможен только в зоне соприкосновения. Интенсификация этого процесса достижима только при переводе массива нефти в пленку, а также при наличии достаточного количества азота, фосфора, некоторых других микроэлементов и воды. Эти основные требования создаются при иммобилизации выделенных нефтеокисляющих штаммов на карбамидный полимерный сорбент, разработанный на кафедре Химической технологии древесины и биотехнологии[20-21].

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Федорова, Ольга Семеновна

Основные результаты работы

1 Получены из нефтезагрязненных почв Сибири чистые культуры нефтеокисляющих микроорганизмов, адаптированных к высоким концентрациям нефти в условиях иммобилизации на полимерном пористом сорбенте.

2 Методами, принятыми в микробиологии, и с применением секвенирования установлена родовая принадлежность штаммов: 2 сп Bacillus subtilis, 11 аб Pseudomonas sp., 4 сп Rhodococcus sp., 2 аб Enterobacter sp.

3 Подобраны составы минеральных сред, разработаны оптимальные условия процесса культивирования в периодической культуре, проведена оптимизация технологических режимов получения биомассы.

4 Методами ГЖХ и хромато-масс спектрометрии установлено, что биодеструкции подвергаются все фракции нефти. Практически полной деструкции подвергаются легкие фракции; фракции Ci5.26, деструктируются на 90-92 %, С27-35 - на 75-80 %.

5 Разработан способ модификации полимерного сорбента для иммобилизации углеводородокисляющей микрофлоры. Рассмотрены варианты хранения и применения биопрепарата в рекультивационных мероприятиях.

6 Наработана опытная партия биопрепарата и проведена апробация выделенных микроорганизмов в производственных условиях на реальных аварийных розливах нефти в Красноярском крае (220 г/л) и Сургутском нефтедобывающего регионе (600 г/л). Показано, что использование биопрепарата позволяет в течение одного сезона снизить концентрацию углеводородов нефти на 90,8 % и 66,7 %, соответственно больше, чем на контрольных территориях. По сравнению с широко применяемым Дестройлом эффективность биопрепарата выше в 7 раз.

7 Разработана технологическая схема получения биопрепарата с высокими показателями нефтеокисляющей активности; проведены технико-экономические расчеты, которые показали экономическую целесообразность создания производства, его рентабельность - 32%, срок окупаемости составляет 1,8 года.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Федорова, Ольга Семеновна, Красноярск

1. Экология Ханты-Мансийского автономного округа / Под ред. Плотникова В.В.- Тюмень: 1997.- 286с,.

2. Мукатанов, А.Х. Влияние нефти на свойства почв / А.Х Мукатанов., П.Р Ривкин. // Нефт. хозяйство. -1980. -№4.- С.53-54.

3. Акимова, Т.А. Экология / Т.А Акимова, В.В. Хаскин. М.: ЮНИТИ , 1998.- 454с.

4. Исмаилов, Н.М. Нефтяное загрязнение и биологическая активность почв / Исмаилов Н.М. // Добыча полезных ископаемых и геохимия природных экосистем, сб. науч. тр.- М.: Наука, 1982.- С.227-235.

5. Андресон, Р.К. Экологические последствия загрязнения почв нефтью / Р.К Андресон, А.Х Мукатанов, Т.Ф Бойко // Экология. -1980 .- № 6.-С.21-25.

6. Киреева, H.A. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. / Н.А.Киреева Уфа : изд-во Башкирского ун-та, 1994.-171с.

7. Ильин, Н.П. Наблюдение за самоочищением почв от нефти в средней и южной тайге: Добыча полезных ископаемых и геохимия природных экосистем, сб. науч. тр. / Н.П. Ильин, и др..- М.: Наука, 1982.-С. 245258.

8. Миркин, Б.М. Экология России / Б.М. Миркин, Л.Г. Наумова М.: Изд-во АОМДС, 1996. - 272 с.

9. Невзоров, В.М. О вредном воздействии нефти на почву и растения / В.М. Невзоров // Изв. вузов. Лесной журнал.- 1976. №2.- С. 164-165.

10. Ю.Веселовский, A.B. Влияние углеводородов нефти на автотрофный компонент водных систем : Добыча полезных ископаемых и геохимия природных экосистем, сб. науч. тр / А.В.Веселовский и др..- М. : Наука, 1982.- С.259-271.

11. Булатов, А.И. Охрана окружающей среды в нефтегазовой промышленности / А.И Булатов, П.П.Макаренко В.Ю. Шеметов. М.: Недра, 1997.-470с.

12. Гридин О.М. Перспективные технические и технологические решения проблемы ликвидации нефтяных загрязнений. http://www.skype.com/go/getskype

13. Сулейменов, А.Б. О применении некоторых сорбентов для удаления пленочной нефти с водной поверхности / А.Б. Сулейменов и др..// Азерб. Нефт. хоз-во. 1986.- №7. - С. 34-35.

14. Хлесткин, Р.Н. О ликвидации розливов нефти при помощи растительных отходов / Р.Н. Хлесткин, H.A. Самойлов // Экология.-2000. Ж7.-С.84-85.

15. Рубан, В.К. Промышленные испытания устройства для сбора нефти с поверхности воды при аварийных разливах /В.К. Рубан и др.. //Транспорт и хранение нефти и нефтепродуктов.-1976.-№3.- С.22-24

16. Стригунова A.A. Получение пеносорбентов с заданными свойствами на основе карбамидных свойств / А.А.Стригунова, дисс. к.т.н , Красноярск, СибГТУ.- 2001,186с.

17. Способ получения полимерных сорбентов. Патент (РФ) № 2184608 от 10.07.2002 Заявка № 2000118004, приоритет от 06. 07.2000 / Мелкозеров В.М., Чупрова H.A. Мелкозеров М.Г.

18. Панов, Г. Е. Охрана окружающей среды на предприятиях нефтяной и газовой промышленности / Г. Е. Панов. М.: Мир, 1986. - 244 с.

19. Оборин, A.A., Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем / А.А.Оборин и др..- М.: Наука, 1988. 254с.

20. Дияров, И.Н. Химия нефти.// И.Н Дияров. 1990.

21. Химия нефти и газа //под ред В.А. Проскурякова.- СПб.: 1995.

22. Гуревич, И.П. Технология переработки нефти и газа // И.П.Гуревич.-Химия, 1972

23. Мановян, А.К. Технология первичной переработки нефти и природного газа.// А.К. Мановян. М.: Химия, 1991.- 432с.

24. Орлов, Д.С. Химическое загрязнение почв и их охрана // Д.С. Орлов /Словарь справочник.- М.: Агропромиздат, 1991.- 303с.

25. Современные методы исследования нефти / Под ред. Богомолова .- JL: Недра, 1984.-431с.

26. Другов, Ю.С. Экологические анализы при розливах нефти и нефтепродуктов / Ю.С. Другов.- СПб.: 2000. -249с.

27. Свиридова Т.М. Очистка окружающей среды от нефтяных загрязнений / Т.М. Свиридова. Нефтяное хозяйство.- 1995.-№ 3.- с. 24.

28. Тимофеева, С.С. Экологическая биотехнология : учеб. пособие для вузов / С.С. Тимофеева.- Иркутск: Изд-во Ир.ГТУ, 1999 210с.

29. Исмаилов, Н.М. Биодинамика загрязненной нефтью почвы / Н.М.Исмаилов, Ю.И. Пиковский // Миграция загрязняющих веществ в почвах и сопредельных средах: сб.тр. 111 Всесоюз. совещ., Обнинск, сент.1981.-Л.: Гидрометеоиздат, 1985.- С. 195-198.

30. Фильченкова, В.И. Биологическая активность обыкновенного чернозема при нефтяном загрязнении / В.И. Фильченкова // Защита растений и охрана окружающей среды в Тат АССР: сб. науч. тр. -Казань, 1982. С. 74-75.

31. Вебб, К. Экологическая биотехнология / К. Вебб Пер. с англ.; под ред. К.Ф. Фостера, Д.А. Дж. Вейза.- JL: Химия, 1990.- Пер. изд.: Великобритания, 1987.- 384с.

32. Шкидченко, А.Н. Охрана окружающей среды при поисках, разведке, разработке месторождений углеводородного сырья, его переработке и транспортировке / А.Н Шкидченко., В.Г. Грищенков, Н.П. Кузьмин //Тез. докл. межд. конф. СПб.: 1996. - С. 97-99.

33. Шкидченко, А.Н. Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды / А.Н. Шкидченко, И.А.Кошелева, А.Е. Филонов //Тез. докл. конф. Пущино: Изд-во НЦБИ РАН, 2001. - С. 31-33.

34. Чугунов, В.А. Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды.// В.А. Чугунов/ Тез. докл. конф. Пущино: Изд-во НЦБИ РАН, 2001.-С. 41.

35. Андресон, Р.К. Изучение факторов, влияющих на биоразложение нефти в почве / Р.К. Андресон / Коррозия и защита в нефтедобывающей промышленности.- М.: 1979.-№3.- С. 30-32.

36. Славнина, Г.П. Изучение бактериального процесса окисления углеводородов / Г.П. Славнина // Микробиология. -1961.- Т. 30.- №6.-С. 985-989.

37. Пиковский Ю.И. Трансформация техногенных потоков нефти в почвенных экосистемах / Ю.И. Пиковский // Современные проблемы биосферы.- М.: Наука.- 1988.- С. 7-22

38. Казакова, К.Н. Биодеградация углеводородов в нефтезагрязненной почве северной тайги / К.Н. Казакова //Влияние промышленных предприятий на окружающую среду. -Пущино.- 1984.- С.84-85.

39. Капотина, JI.H. Биологическая деструкция нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву и воду / JI.H. Капотина // Биотехнология -1998-№1. -С.85-92.

40. Киреева, H.A. Биоиндикация почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами / Н.А Киреева., И.Е.Дубовик // Мониторинг нефти и нефтепродуктов в окружающей среде: сб.науч.тр. -Уфа: 1985.- С.82-84.

41. Солнцева, Н.П. Особенности загрязнения почв при нефтедобыче / Н.П.Солнцева, Ю.И Пиковский. // Миграция загрязняющих веществ в почвах и сопредельных средах: сб.науч.тр. Д.: Гидрометеоиздат,-1980.- С.76-82.

42. Глазовская, М.А. Скорость самоочищения почв от нефти в различных природных зонах / М.А Глазовская., Ю.И. Пиковский.- Природа.-1980.-№5.- С.118-119.

43. Розанова, Е.П. Микрофлора нефтяных месторождений / Е.П.Розанова.-М.: Наука, 1974.-96с.

44. Громов, Б.В. Экология бактерий / Б. В.Громов, Г.В. Павленко.-- JI.: Ленинградский университет, 1989. 95 с.

45. Луста, К.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов . АН СССР Научный центр биологических исследований, Институт биохимии и физиологии м/о Пущино: ОНТИ НЦБИ , 1990г.-186с.

46. Воробьева, Л. И. Техническая микробиология: учебное пособие для биологических и технических специальностей вузов. М.: Изд-во МГУ, 1987-167с.

47. Методы почвенной микробиологии и биохимии // под редакцией Звягинцева Д.Г.- М.: Изд-во МГУ, 1991 304с.

48. Звягинцев, Д.Г. Почва и микроорганизмы / Д.Г. Звягинцев.- М.: Изд-во Моск. ун-та, 1987.

49. Шлегель. Г. Общая микробиология / Г. Шлегель.- М.: Мир, 1987.

50. Гусев M.B. Микробиология: учебник для вузов / М.В.Гусев, Л.А.Минеева.- М.: Изд. Центр « Академия», 2003,- 464с.

51. Емцев, В.Т. Микробиология: учебник для вузов / В.Т.Емцев, E.H. Мишустин.- М.: Дрофа, 2005.- 445 с.

52. Промышленная микробиология : учеб. пособие для вузов / под редакцией Н.С.Егорова.- М.: Высш .шк., 1989.-688с.

53. Бирюков, В.В. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / В.В. Бирюков.- М.: Наука,1985.

54. Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии. / В.В. Бирюков.- М.: КолосС, 2004.- 296с.

55. Волова Т.Г. Биотехнология Уч. пособие для студентов / Т.Г Волова -Красноярск: КГТА, 1997.- 156 с.

56. Аркадьева, З.А., Промышленная микробиология / З.А. Аркадьева . -М.: Высш. шк., 1998.- 677 с.

57. Варфоломеев, С.Д. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов / С.Д. Варфоломеев.- М.: Высш. шк., 1990.-296 с.

58. Мосичев, М.С. Общая технология микробиологических производств / М.С. Мосичев.- М.: Лесн. пром-сть, 1982. -320с.

59. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: практическое пособие / под ред. Н.С. Егорова. Изд. 2-е.- М.: Изд. Московского университета, 1983.-215с.

60. Лиепинып, Г.К. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии / Г.К. Лиепиныш. Рига: Зинатые, 1986.-158с.

61. Варфоломеев, С.Д. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов / С.Д. Варфоломеев. М.: Высш. шк., 1990. - 296 с

62. Перт, С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Дж. Перт. М.: Мир, 1987. - 331 с.

63. Работнова, И.Л. Процессы культивирования микроорганизмов / И.Л. Работнова.- Изв. А.Н. СССР, сер. Биология -1982.- №4.

64. Позмогова, И.Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях / И.Н. Позмогова. М.: Наука, 1983.

65. Claus, D., Berkeley R.C.W. Genus Bacillus Cohn 1872 // Bergey s manual of systematic bacteriology. V.2 / Eds Sneath P.A. et al. Baltimore: The Williams and Wilkinds Co., 1986. P. 1105-1140.

66. Теппер, E.3. Практикум по микробиологии : учебное пособие для вузов / под ред. В.К.Шильниковой. Изд. 5 -е, перераб. и доп. - М.: Дрофа, 2004.- 256 е.:

67. Громовых, Т.И. Методы выделения, изучения и культивирования микроорганизмов / Т.И. Громовых.- Красноярск: СибГТУ, 2002.- 152 с

68. Fiedler, H. J. Methoden Modenanaliyse . Dresden 1973. T 1-2 c. 239,172 76.3аварзин, Г.А. Введение в природоведческую микробиологию / Г.А

69. Заварзин., H.H. Колотилова.- М.: Книжный дом « Университет»,2001.-256с.

70. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхардта и др..- М., Наука, 1983.-Т.1.

71. Хабибуллина, Ф. М. Исследование способности нефтеокисляющих бактерий утилизировать углеводороды нефти / Ф. М. Хабибуллина, А. А. Шубаков, И. Б. Арчегова // Биотехнология. 2002. - №6. - С. 57-62.

72. Ившина, И. Б. Пропаноокисляющие родококки / И.Б. ИвшинаУ/ АН СССР Уральский научный центр Свердловск : УНЦ АН СССР , 1987 -123с.

73. Пат. РФ 1805097 //БИ 1993. Г.Г. Ягафарова, И.Н. Скворцова и др. Штамм бактерий Rodococcus erytropolisAC 1339Д, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов //Изобретения, №12-1993-С.52.

74. Кронелли, Т.В. Интродукция бактерий рода Rodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью / Т.В. Кронелли// Прикл. биохим. и микробиология. 1997-Т. 33.- № 2.- С. 198-202.

75. Славнина, Г.П. Изучение бактериального процесса окисления углеводородов / Г.П. Славнина // Микробиология. 1961.-Т. 30.- №6.- С. 985-989.

76. Скворцова, И.Н. Методы идентификации и выделения почвенных бактерий рода Pseudomonas / И.Н. Скворцова.- М.: Изд-во Моск. Унта, 1981.

77. Скворцова, И.Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus / И.Н. Скворцова.- М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1983.

78. Смирнов, В.В. Бактерии рода Pseudomonas / B.B. Смирнов. Киев: Наукова думка, 1990. - 221 с.

79. Хоулт, Дж. Определитель бактерий Берджи / Дж. Хоулт, Н. Криг, П. Снит. М.: Мир, 1997. - 368 с.

80. Смирнов, В.В. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов. - Киев: Наукова думка, 1982.-280 с.

81. Назина, Т.Н. Термофильные углеводородокисляющие бактерии из нефтяных пластов / Т.Н. Назина// Микробиология. 1993. - Т. 62.-Вып.З.- С. 583-592.

82. Boronin, A.M. Prosess Biochemistry. 1997. - V. 32. № 1. P. 13-19.

83. Габбасова, И.М. Использование биогенных добавок совместно с биопрепаратом Деворойл для рекультивации нефтезагрязненных почв / И.М. Габбасова.- Биотехнология.- 2002 -2 .-С. 57-65.

84. Сидоров, Д.Г. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата Деворойл / Д.Г. Сидоров // Прикладная биохимия и микробиология.- Т. 34.- №3.- С.281-286

85. Чугунов, В.А. Создание и применение жидкого препарата на основе ассоциации нефтеокисляющих бактерий / В.А. Чугунов // Прикл. биохим. и микробиология. 2000. - Т. 36.- №6.- С.661 - 665.

86. Чугунов, В.А. Разработка и испытания биосорбента Экосорб на основе ассоциации нефтеокисляющих бактерий для очистки нефтезагрязненныхпочв / В.А. Чугунова // Прикладная биохимия и микробиология-2000.-Т. 36.- №6.-С.661 665.

87. Кузнецов, С.О. Способы и средства очистки сточных вод от нефтепродуктов / С.О. Кузнецов. // Экология промышленного производства.-1994.-№1.- С. 27-36.

88. Макарова, М. Ю. Микробиологическая очистка нефтяных загрязненийнефтью водоемов и резервуаров / М. Ю. Макарова, И. Б. Арчегова, В. В.

89. Полшведкин // Химия в интересах устойчивого развития. 1998. - №6. -С. 343-349.

90. Кобзев, E.H. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов нефтедеструкторов в открытой системе / E.H. Кобзев// Прикл. биохим. и микробиология. - 2001. - Т. 37.- № 4. - С. 413-417.

91. Квасников, Е.И. Влияние факторов внешней среды на деструкциюнефтепродуктов ассоциативными культурами / Е.И. Квасников

92. Микробиологический журнал.-1987.-№3. -С.33-38.

93. Семенов, А. М. Оптимизация интродукции микроорганизмовдеструкторов нефти в почве / А. М. Семенов, И. С. Куличевская,

94. Э. М. Халимов // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34.- № 5. С. 576-582.

95. Киреева, H.A. Биодеструкция нефти в почве культурами углеводородоокисляющих микроорганизмов / H.A. Киреева// Биотехнология 1996.- №1.- С. 51-54.

96. Гршценков, В. Г. Исследования способности нефтеокисляющих бактерий утилизировать углеводороды нефти / В. Г. Гршценков, Р. Р. Гаязов // Прикл. Биохимия и микробиология. -1997. Т. 33. №4. - С. 423 - 427

97. Гршценков, В.Г. Бактериальные штаммы деструкторы топочного мазута / В.Г. Гршценков // Прикл. биохим. и микробиология. 1997- Т. 33.-№4.- С. 381-385.

98. Андреюк, Е.И. Исследование микробных сообществ почвы на разных уровнях их организации. / Е.И. Андреюк //Микробиологический журнал.-1998г.-т. 60.-№5.-С.19-24.

99. Шкидченко, А. Н. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов / А. Н. Шкидченко, И. А. Кошелева, С. Б. Петрикевич // Экология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды. -Пущино: Изд во НЦБИ РАН. - 2001. - № 3. - С. 31-33.

100. Стабникова, Е. В. Исследование способности нефтеокисляющих бактерий утилизировать углеводороды нефти / Е. В. Стабникова, М. В. Селезнева, О. Н. Рева // Прикладная биохимия и микробиология. -1995. Т. 31. - № 5. - С. 534-539.

101. Ермоленко, З.М. Влияние некоторых факторов окружающей среды на выживаемость внесенных бактерий, разрушающих нефтяные углеводороды / З.М. Ермоленко// Биотехнология -1997- № 5.- С.33-38.

102. Петрикевич, С. Б. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов / С. Б. Петрикевич, Е. Н. Кобзев, А. Н. Шкидченко // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т

103. Пономарева, JI.B. Биоремидиация нефтезагрязненной почвы с использованием биопрепарата Биосет и пероксида кальция / JI.B. Пономарев // Биотехнология-1998.- №1.- С.79-84.

104. Барышникова, JI.M. Биодеградация нефтепродуктов штаммами деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде / JI.M Барышникова. // Прикладная химия и микробиология.-2001.- Т.37.- №5.- С. 542-548.

105. Грищенков, М.У. Биодеградация нефтепродуктов штаммами деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде / М.У. Грищенков // Прикл. биохим. и микробиология. 2001.- Т.37.- № 5. - С. 542-548.

106. Алексеева, Т.П. Перспективы использования торфа для очистки нефтезагрязненных почв / Т.П. Алексеева и др.. // Биотехнология, 2000.-№1.- С.58-64.

107. Грищенков, В.Г. Бактериальные штаммы деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях / В.Г Грищенков и др.. // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. -Т. 33,- №4.-С.423-427.

108. Андреюк, Е.И. Исследование микробных сообществ почвы на разных уровнях их организации./ Е.И. Андреюк //Микробиологический журнал.-1998г.-т. 60.№5 с. 19-24.

109. Каюкова, Г.П. Преобразование тяжелой нефти в процессах химической и биологической деградации в почве / Г.П. Каюкова // Нефтехимия-2000.- Т. 2- №2.- С.92-102.

110. Капотина, JI.H. Биологическая деструкция нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву и воду / JI.H. Капотина// Биотехнология -1998- №1.- С.85-92.

111. Хабибуллина, Ф.М. Исследование способности нефтеокисляющих бактерий утилизировать углеводороды нефти / Ф.М. Хабибуллина // Биотехнология. 2002. - №6. - С. 57-62.

112. Барышникова, В.Г. Интродукция микроорганизмов в окружающую среду / В.Г. Барышникова. Пущино: ОНТИ НЦБИ РАН, 1994. - С. 10.

113. Бойкова, И.В. Интродукция микроорганизмов в окружающую среду / И.В. Бойкова. Пущино: ОНТИ НЦБИ РАН, 1994. - С. 12.

114. Белоусова, Н.И. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах / Н.И. Белоусова// Прикл. биохим. и микробиология. 2004- Т. 40.- № 4.- С. 312-316.

115. Каюнова, Г.П. Преобразование тяжелой нефти в процессе химической и биологической деградации нефти / Г. П. Каюнова, К. В. Егорова, Р. К. Габимова // Нефтехимия. 2000. - №2. - 92 с.

116. Полануэр, Б.М. Применение хроматографических методов анализа в биотехнологии-проблемы, перспективы / Б.М. Полануэр// Биотехнология -1996.-№4.- С.47-57.

117. Кантере, В.М. Основы проектирования предприятий микробиологической промышленности : учебное пособие для вузов / В.М. Кантере. М. Агропромиздат, 1990.- 304с.

118. Бортников, И.И. Машины и аппараты микробиологических производств / И.И. Бортников. Минск: Высш.шк., 1962.-280с.

119. Пен, Р.З. Статистические методы моделирования и оптимизации процессов целлюлозно-бумажного производства : учеб. пособие./ Р.З. Пен. Красноярск: Изд-во КГУ, 1982. - 192 с.

120. Рязанова, Т.В. Оптимизация рецептур карбамидных пенопластов / Т.В. Рязанова и др.. // Переработка растительного сырья и утилизация отходов: сб. тр.- Вып.1. Красноярск, 1994. - С. 209.

121. ТУ 2223-001-02067907-96. Сорбенты полимерные.с 21.10.96

122. ГОСТ 14.231 88. Смолы карбамидоформальдегидные.

123. ГОСТ 6948. Определение кратности вспенивания пенопласта.

124. ГОСТ 17177-87 определение влажности сорбента, пористости по массе.

125. Методика выполнения измерений содержания формальдегида в пробах природных и очищенных вод фотометрическим методом с ацетилацетоном .-М., «Акватест».- 1997. -С. 13.

126. Дементьев, А.Г. Структура и свойства пенопластов / А.Г. Дементьев, О.Г. Тараканов. М.: Химия, 1983. - 176с.

127. Могилевич, Н.Ф. Иммобилизация микроорганизмов в очистке воды. Преимущества и перспективы Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума « Микробиологическая охрана биосферы в регионах Урала, и Северного Прикаспия.» / Н.Ф. Могилевич. Оренбург: 1991г.

128. Стабникова, Е.В. Скрининг носителя для бактерий, очищающих почву от нефтяных загрязнений /Е.В. Стабникова // Микробиологический журнал. -1998.-№2.-С.85-89.

129. Пирог, Т.П. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти / Т.П. Пирог и др.. // Прикл. биохим. и микробиология. 2005- Т. 41. - № 1. -С. 58-63.

130. Курдиш, И.К. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми материалами и его биотехнологическое значение /И.К. Курдиш // Микробиологический журнал.- 1999.-Т61,-№1-С.60-73.

131. Курдиш, И.К., Антонюк, Т.С. Влияние глинистых минералов на жизнеспособность некоторых бактерий при повышенных температурах / И.К. Курдиш, Т.С. Антонюк //Микробиол. журнал.-1999.-Т61,-№3.

132. Кистень, А.Г. Адгезия смешанных культур метанотрофов к твердым материалам / А.Г. Кистень A.A. Рой, И.К. Курдиш // Прикладная биохимия и микробиология.-1994.-том 36, -№1.с.59-67

133. Титова, JI.B. Влияние высокодисперсных материалов на физиологическую активность бактерий рода Azotobacter / JI.B. Титова, А.Ф. Антипчук, И.К. Курдиш // Микробиол. журнал.- 1994.- Т56, -№3. -С. 60-65.