Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и свойства А-каротин - 15,15'-диоксигеназы из мукозы тонкого кишечника

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и свойства А-каротин - 15,15'-диоксигеназы из мукозы тонкого кишечника"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК . ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. А.Н.БАХА

На правах рукописи ЕРШОВ ЮРИИ ВЛАДИМИРОВИЧ

УДК 677.161.I

ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА Л-КАРОТИН-15,1з' -ДИОКСИГЕНАЗЫ ИЗ МУКОЗЫ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА.

03.00.04-Окологета екая химия

АВТОРЕЯЕРАТ диссерташш на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1992

Диссертационная работа выполнена в лаборатории витаминов и физиологически активных соединений Института биохимии им.А.Н.Баха РАН.

Научные руководители:

кандидат биологических наук,

A.А.Дмитровский доктор биологических наук.

B.Я.Быховский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

М.С.Крицкий

доктор химических наук, профессор И.А.Рубцов

Ведущая организация: Институт питания АМН России.

Защита диссертации состоится <10 кС-Мн-'Д 1992 года в

V

часов на заседании специализированного совета (К 002.96.01.) по присуждению степени кандидата неук в Институте биохимии им.А.Н.Баха РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1).

Автореферат разослан

1992 года.

Ученый секретарь Специализированного совете доктор биологических наук

'М.И.Молчанов

--1-

Обиая характеристика работы.

4к129'?ьность_пЕо(Злемы. Изучение биохимии каротиноидов как физиологически активных соединения имеет важное практическое и теоретическое значение. При окислении ^-каротина по центральной двойной связи образуется ретиналь, который энзиматически восстанавливается в ретинол и окисляется в ретиноевуто кислоту. Эта соединения играют критическую роль в жизненно важных процессах -зрении, дифференцировке клеток, „выполнении половой и иммунной функции и др..

Эизимятическое превращение ^-каротина в ретиналь было открыто в 1<*ь*5 году. Показано, что оно идет с включением в молекулу ретиналя меченного молекулярного кислорода" (О1*оп, Науа1«м,19ьз, оо<нт»п, ни»п7,19в"5. Вартапетян, Дштровский и Др.,196в) и с участием гш2* (В1г>^ь,сата,1974). Осуществляющий эту реакцию фермент г»-каротин-1%1з'-диоксигвназа (КФ 1.13.11.21) (КДОГ) весьма лабилен и многочисленные попытки получить высскоочищенлый препарат КДОГ успехом не увенчались. Более того, в работах последнего времени был поставлен под сомнение предложенный механизм действия фермента и отрицалось дата само наличие его в природе сы«ро1у, раСв, 1<гвв, Нвщ»п, 1<>831. Отсутствие воспроизводимой методики получения

КДОГ. сдеришзло исследования свойств и субстратной специфичности

>

этого Феркэнта. Эффективность превращения л-каротина б витамин А до последнего времени исследовали только в опытах на животных, в оценка действительного влияния на этот процесс антиоксидактов, плпгОиторов и активаторов становится доступным при использоерния препаратов КДОГ.

Превращение ксантофиллов.в витамин А у рыо происходит при юс предварительном восстановлении в каротины (т. ма^ипо, 1-у<н). Однако, нельзя Сило исключить возможность непосредственного расщепления ксантофиллов КДОГ-азой.

В связи с вышеизложенным, в работе бит поставлены задачи! 1.Разработать хорошо воспроизводимый метод получения препаратов КДОГ.,2. Исследовать свойства ферментных препаратов КДОГ, действие антиоксидантов, ингибиторов и активаторов для подхода к механизму действия фермента, з. Изучить характер взаимодействия Фермента с различными каротиновдами, в том числе с ксантофиллами, и проьерить на провитаминную активность торулин и торулародин.

_Науадая_новизна_и_практическая_зна^^ • Предложен

надежный метод получения препаратов КДОГ, характеризующийся стабилизацией и защитой фермента каротиноидамн, дитиотреитолом (ДТТ) и ингибиторами протеиназ. Были изучены свойства КДОГ, определены оптимальные условия измерения ферментативной активности. На основании совокупности данных, свидетельствующих о возможной генерации свободных радикалов в активном центре КДОГ в ходе окисления каротиноидов в ретиналь (ингибированиз алтиксидантами. влияние ионов .железа и меди, кинетические данные), предлсхена схема механизма действия КДОГ. Также изучался характер взаимодействия КДОГ с различными каротиноидамн. Отсутствие пр¿дуктов энзиматического расщепления ксантофиллов свидетельствует о необходимости предварительного восстановления ксантофиллов ъ тех случаях, когда они выступают предшественниками А ь

организме животных.

Впервые показано, что торулин является провитамином. А. В опытах in vitro показано также оОразование ретиналя из торулародина, что подтверждает полученные ранее данные о провитаминной активности этого каротиноида. Учитывая, что торулин и торулародин Образуются дрожжами PhatMa rhodoiym« при тепловом шоке, обосновывается их использование в качестве кормовых витаминных добавок.

Апробация_Еабдта.Основные результаты работы были доложены на t конгрессе по витаминам и биофакторам (Киото, 1991) и на конкурсе ваучных работ Института биохимии им. А.Н.Баха в 1991г. По материалам, представленным в диссертации опубликовано л научных работы, з работы сданы в печать.

Ст^гкт^ра_и_объем_5иссертации. Диссертационная работа состоит из введения , обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками,

таблицами и схемами. Список литературы включает наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Получение ферментных препаратов КДОГ из мукозы тонкого кишечника кролика породы Советская шиншилла вели или по обычно используемому методу (Оооамп, о»ton,i<«><>) или по модифицированному методу, используя стабилизацию и защиту КДОГ с i Ш ДТТ , о.з мг/мл соевого ингибитора трипсина (СИТ) и, если это не противоречило задаче эксперимента, ю мкг/мл лютеинэ (Дмитровскиа и др.,1992). Схема получения ферментных препаратов КДОГ приведем низга.

Ыукоза тонкого кишечника

1 среда

гомогенизации

гомогенат

| 22 ТЫС. д, 1 Час

супернатант

j 20Х <NHd>2S04

1 22 ТЫС. g, 10 МИН.

супернатант

I 60* <NH4>2SO4

I 10 ТЫС. 9, 10 МИН.

осадок (ферментный препарат)

Схл. Схема получения ферментных препаратов КДОГ.

Препараты хранили при -2о°С. В работе , использовали синтетические /э-каротин, 15,1з'дегидро-г5-каротин и астаксантин (Hoffoan-La Roch«, Швейцария), а также выделенные природные каротшоида - лютеин, лютеин-пальмитат, ликопин (Дмитровский и др., J992). торулин И торулародин (Полулях И др., 1991).

Ницеллярные растворы субстратов и карогшюидов получали следующим образом. Готовили раствор, содержащий необходимое для опыта количество каротиноида в диэтиловом эфире, добавляли Твин 20 до конечной концентрации в пробах - о,5-о,еД, отгоняли на роторном испарителе ' растворитель и добавляли ю мл 0,01-0,4 Ы калий-фосфатного буфера, pH 7,8, (содержащего ингридиенты соответственно задаче эксперимента), или ю мл среды инкубации.

Среда инкубации содержала! 2 мМ ДТТ или z мМ osh, о,з мМ feso4 в o,i И K-фосфатном буфере, если не указано иначе.

• Реакцию проводили следующим образом! суспендировали зо - зо мг

íopíoirraoro нропаратф К-фосфгтш буфере, pH 7,0, соогяэтстьупцеЗ

.*ол'!рхюсп1 *ип в срздо шткубзщги, вносили oí,o* .пколеЯ Р-коротгшз 1/иля других îcspoTifflo^noB <оаш не указано лгачо), а тснгэ юотввтстнуижо доЗовки', доведали объем до is пл и тшкуоярэваш при ;7°0 (осет во укеош> улпчо), Через 3 часа рэаюда остапавжшали РбОВЛ0Ш!?И СО ИЛ ОТШЮЛЗ. ЭКС'.-рйКЦИГ) продуктов рогшшп проводом 4 ¡орцяямя гокссна по 10 т. кедюя. ОЗёедкнешшй экстракт угшрявала юд вскуу:.г:л досуга, остаток; растворяли в I мл гексапа я шжссши (а гшеуппу « ю;; у; у: ¿тлели у; слссм Xpa^roi'psí'.reecKc;}

шдэдопго учу: c:ycy¡ чч-ул учууучзу; г-5-;»- уучу! 70» 25t 5,. Юласть :q}0rn;'0x'p: у, -.-очуч^сууу чу .у.уучуостл

^•¿яолл-сугч учу; от"" :i г.-.": уу-" : УУУУУУ

T::pc:î njp,j;v;n ру-чцу;, зуучл „укчлчу; ,-o> ; ;y, - -yyy ; n - ¡y; ухуола, У"'чуу::: уучч;чт -y ,:ччч; чччч: -"У1, ч-ч- утчр;'к-уг

пу уро" *0?с"у у;; j ; "¡t ur uv-'/,'; ччч - гчч ч ч. у 1 : ' ууч"- ""кгц.у

руууу" - , у у¡yy:/ прочо/уу; чч: '.-..уч. ■ - . i."''-' у ч ¿rn., "у:уусу;э у ууу:: уччрлу?

1у::уу=:у,у7уузс:п, чепуууу i:}¿yyy ччу*;, 'лучу : "сур:;. yyyyyy. "yo;1 -уру-лч: чсгугусууу

учу"; jyyyyy, суууу; учел ч чоу-уч - -г:-:- ч учууу СО г.у

УУО np-l ЧУУСГ'ПУ ОТУЦУрТУГ: ЧСУУУЧ Ч

рьзуу/УП ::ССУО:Г:Л:

у |'су.т0пч1 л7псплуу'эччч'л уулуууч,

'з ^тгртертгг. Л^ПУЛ: У;УУ:-/;:,:;„ •' УЛ.У.ГУ") iry-nvy.r:: Злуу-" ччосчсЛ ::сб:тль':сс':ьп :п;ч лчгу:;: ч сччст/-.

:--o!-;¡in, гчу 5, п '.с::, "то чслгучч-j i*"0" :п erууууусу

ШТОДИКв (Ooodman, 01«on,J969) H6 ПОЗВОЛЯОТ ПОЛУЧИТЬ ВКТИВНЫЙ

фермент (н*п»вп, м^-и, itee). привели к необходимости разработать воспроизводимый метод получения ферментных препаратов КДОГ (ex. i). t.1. факторы, обеспечивающие стабилизацию и защиту КДОГ_в_процесе

выделения.

1.1.1. Вли^е_тидльршх_соедаениЯ. На рис.1 приведены данные по влиянию ДТТ на выход КДОГ. По сравнению с контролем (препаратом, полученным по методу Good«««, Olson,1969) введение в среду гомогенизации i мМ ДТТ повышало активность КДОГ в 5 раз.

; Максимальный выход активности фермента наблюдался при использовании . 5 мМ ДТТ.

1.1.2. &ш™е_ингабиторов_протешаз. Влияние ингибиторов протеиназ 'на выход КДОГ тага» приведено на рис.1. Фенилметилсульфонил^торид (ФМСФ) незначительно увеличивал активность фермента (на гох в оптимальной 'концентрации 200 мкМ). Лучший результат был получен при использовании о,7 мг соевого

' ингибитора трипсина (СИТ) на i мл среда гомогенизации (увеличение выхода КДОГ более, чем в 2 раза), хотя и концентрации СИТ на 'порядок меньшие, повышали активность ферментного препарата более чем в i,s раза. Использованная в дальнейших опытах концентрация СИТ - о,з иг/мл давала промежуточное значение. Добавление оптимальной концатрации СМОФ.на фоне СИТ не вызывало дальнейшего увеличения активности КДОГ.

1.1.3. Влияние каротиноидов. Влияние на выход КДОГ введения в среду гомогенизации каротиноидов - ^-каротина, ликопинз, лютенэ и дютеин-пальмитата, а также совместного применения ксротиноидов и

У.

гоо

40

во

а

л

а

и

'«■ 1. ВЧЯЯЯЯ« ДЯТЯОГртМГЛЛЯ Я яягявяторо» пртгин»! | ср«4 ! ГОЧОГТИИМЦИЯ М КТИРИОСТЬ

яарптяи-13,!3*-липасяген«|ы- / — яоигрлчя с фосфагямм буфером 0,1 М, рН 7.1 бс> ЛТТ яжябятороя: 1 - ДТТ, Ы — I мМ. Н - 3 мМ. 7• — 10 мМ; ) _ фяиялмятялсуль. ляяяфторял. и - 50 МяМ. <6 — 100 м*М. }« — I мН; 4 — со»ы) иягнвиор, 44 — .03 МГ1И.1, 4$ — 0.) мг/«ая, 4* — 0.7 иг. мл: I — гам! яягябятор 0.1 мг/мя с фятлмлял-гяяфояялфтораллм • аомияятраияа«' )< — 30 мяМ, - 300 м«М, и — I нМ. Вярлаяти пито» 3—5 ня фояа ДТТ I нМ

210 * _

но - -]

гоо - .,

т - —

по -

ео

*е - 1

Г / и --< Л »г и'-лг < '7 ■1

яс 2 Вчиям*» ааротямлялтя я яяп»Яя»ороя и рпт * ■»»1 я срялс гомлтяиип я а атганостя ■яр"1яя 13 13' дяояеигяи«1м I — яоятрлчя с ф<хфягяым буфером 0,1 М, рН 74 ве» ЛТТ яягяЛятпр^я. — ЛТТ I нМ. За — яаротяя 10 ш/ »4«. Зв — ааротяя !э чл с феяильи* т хунфлмячфторяаом 200 я>М. '» — «ярлгям 10 мяг мл с сояямяя яягявятором 0.3 "Г и1; — яягггяя — 1 мат. мл. — 10 мяг мл, — 30 мяг'мл; 3* — лятяя 10 маг, мл фаил*мятя.ягуляфояялфторя.к*м 200 маМ. М — яятгяяя 10 мяг/мя < сояямм яигябягором 1 мт Я1 в — люгяяя л^1ямятаг 10 маг мл. 7в — яяяотпаи 10 мат'мл, М — -чяяиняя 3 мяг мл с сояяым я>яяфятором 0.) мг мч Варяяятм опыт«« ) —1 я* фея« 2ТТ 1 мМ

шхглбуторос протоиаоз - прнъодеш на рис'. 2. Из использозашшх каротшовдов ваилучиео действие оказывал лготоин. В концентрации ю икг/нл лютоин увеличивал активность фзркентяих препаратов в 2,з, лятоин-польмитат в 1,9, /-¡-каротин в i,s, а ликогаш в i,6t> рааа. ЕФФэкт лэтеина зависит от его концентрации. Дополнительное введение е сроду гомогенизации сит или ФМОФ вызывало дашюйзео увеличение . шхода активности КЛОГ. При одновременном применении ДТТ, ингибиторов протеиьаз и каротиноидов активность препаратов КДОГ превышала контроль почти в is раз. Действие зтих факторов аддитивно.

2._Свойства_$ермвнтдад_щепаратов_Ш[ОГ.

Помимо изучения влияния ДТТ, ингибиторов протеиназ .и каромшоидов з ходе выделения активных препаратов КЕОГ, исследовали тага:а свойства различных препаратов НДОГ, эффект различных факторов гш ферментативное образование ретиналя и определяли еггшлалышо условия карокшдиоксигепазной реакции. Препараты КДОГ, получошшо по' стандартному или по кодифицированному методам, хотя и значительно отличались по активности, но имели близкие свойства.

2.1. _Ьшщтио_тюльщх_сое£теш1й_и_ион^

Восстановленное в определенной степени состояние sh-rpyim КДОГ saaao и при проведении реакции с субстратом - ^-каротином. При введении в среду инкубации (на фоне 0,5 кМ feso^) ДТТ или gsh Наблэдалн увеличение активности фермента (рис.з). Максимально аффект достигался при использовании 2 мМ ДТТ или 5-6 мМ osh. ДТТ бал более эффективен, оели сравнивать оптимзльные концентрации ДТТ и gsh. В случае gsh наблюдается медленное нарастание активности

й 5"

Н ко

У

м

I:

['С м 10

• * « ' » ' "5 ' То """ мМ

Рис.з. Зависимость активности КДОГ от концентрации ДГТ (1) и озн (2)

КДОГ при увеличении его концентрашгаи и кривая имеет пологий максимум. Резкое уменьшение активности КДОГ при увеличении концентрации ДТТ свидетельствует о том, что активность фермента связана с определенным соотношением зн- и дисульфкдных связей. Это соотношение, вероятно, зависит такгэ от концентрации двухвалентного телэза, которое окисляется в р»3* и реагирует с вн-группаш белков» тиолыше же соединения восстанавливают г«^* до гв2*. По-видимому, г»2* и эм-группы необходимы для активного центра фермента как источник электронов для активирования кислорода в реакции образования ротиналя.

Нз рис.л приведена зависимость активности КГЮГ от концентраций г»5о4 в среде инкубации. Видно, что 'фермент активируется довольно высокими концентрациями ионе в г» - 0,~5-1,0 кУ рвео^. При увеличбнип концентрации г«2" в среде до А кЫ еыход рэткналя в присутствии экппмоляршх ила больна концентраций сулъСгидрильнш: соединений снизался, а при их отсутствии или при каяьспх

Рие. а. Зависимость

активности /»-каротин--15,13'-диоксигеназы от концентрации г®2*.

концентрациях ретиналь не образовывался, а наолсдались превращение /»-каротина в впо-каротинали, которое носило нс-ферм«нтатшшй характер (табл. I). Введение в среду инкубации о,ч «п г«1* не активировало КДОГ.

Дальнейшее подтверждение важности ионов и состояния

5н-грутш для работы КДОГ получено при ингибиториом. анализе. Применение 0,5 мМ йодацетата или парахлормеркурибензоата подавляет активность фермента на 90%, однако этот эффвкг предотвращается введением в инкубационную смесь 20 мМ 05н. ЭДТА в концентрации 2 мМ оказывал ' меньший эффект, чем а.а-дигагрвдил и 2,9-диметил-1,Ю-фенантролин в концентрации 0,5мМ. (табл. г).

2.2. В®ягае_катионов_и_ащонов_на_актта^

Полученные данные указывают на важную роль двухвалентного шлеза в реакции, катализируемой КДОГ. Другие ' использованные катионы - с*2+, ма2+, Со2+, мп2+, ш2* - в концентрации I мМ снижали активность КДОГ на 10-20%, а си2+ и с</ в концентрации о,5 ыМ - на 5о*. Возможная роль ионов меди обсуждается ниже. Сильный ингйбирущий эффект (90% подавление выхода ретиналя) наблюдался в

ГоОл. i. Влияние на активность КДОГ'соотношения концентраций н тиольных соединений

1о0авки к 0,1 И К-фосфатному Удельная

буферу, рН 7,8 активность

0,5 мМ F»so4......................14

♦ 2 мМ озм 29

♦ 2 МЫ ДТТ 64

♦ 4 мМ оон 34

♦ 4 мМ ЛТТ 48

♦ б мМ osh 33

♦ 8 Ш ДТТ 15

4 ММ F. SO, ......................- **

а

♦ 1 «и osh - **

♦ 4 «и gsh 27

♦ ДТТ' 17

♦ а в« osh 26

♦ 8 «и ДТТ 10

** - образуется апо-кврсгиналн

уяав I ш ел2", вероятно, связанный с взаимодействием с тяолышв!

уппами. Нэ оонарухеяс влияния а концентрации I Ш хатаонсв (гн*,

► * ♦ 2 ♦ 2+ 2* - —

, n» ,к , в. , in ,5r , ai , а такге анионов ci , i ,

Табл.2. Влияние ингибиторов на активность КДОГ

Добавленный ингибитор

Удельная активность

среда инкубации 27,6

+0,6 мМ йодацетат 2,1

+ 0,5 мМ йодацетат + 20 мМ свн 28,2

+ 0,б мМ парахлормеркурибензоат 2,1 + 0,5 мМ парахлормеркурибен-

• зоат + 20 мМ озн 25,2

+ 0,5 мМ дициклогексилкарбодиимид 7,8

+ 0,6 мМ а,а-ДШШриДИЛ 13,2

+ 0,5 мМ 2,9-диметил-1,Ю-фенантролин 13,8 + 2 мМ ЭДТА ' 23,2

+ I нд!чо3 следа

Было также показано, что увеличение концентращш К-фосфатного буфера повышает выход ретиналя. Максимальная активация наблюдалась при 0,4 М.

2.з. Вжяще_£втвргентов_на_активндсть _Кда .

Исследовали влияние на активность КДОГ диспергирования субстрата с помощью Твина го, 40 и ьо, а таете смесями Твина го и раличных детергентов (табл.з).

При использовании разных концентраций Твина го максимальная активность наблюдалась при о,ьх-Твина го. Твшш разных фирм и марок

Табл. з.

-13-

Влияние детергентов на активность КДОГ.

ДобЕ-вка к среде инкубации при Удельная

получении эмульсии /i-каротина активность

0,6% ТВИН бО 23,7

0,6% ТВИН 40 34,3

О,Ь% ТВИН 20 (K«rak> 33,9

0,6% ТВИН 20 (Schuchardt) 33,6

,+ 0,1$ дезоксшсолат 46, i

+ 0,1% холат Na 45,4

+ 0,1% лецитин 41,0

+ 0,1% лецитин + 0,1% холат Na 62,4

+ 0,1" Тритон Х-100 14,2

давали примерно одинаковую активность фермента. Введение при приготовлении субстрата наряду с о,6% твиноы 20 холатов или лецитина повышало активность фермента на 20-35%, что -перекликается

С ДаННЫМИ ОПЫТОВ Ir» vivo (£1 Gorab ».а., 1976). ЫаКСШ&ЛЫШ!

активация КДОГ была достигнута при одновременном использовании для получения мицелл субстрата 0,6% Твина 20, o,i% холата Na и o,i% лецитина - 186% от контроля (только о,б% Твил го). Эффект лецитина и холатов, вероятно, свидетельствует о важной роли природных детергентов в процессе превращения /»-каротина в ретииаль. Тритон х-100 ингибировал КДОГ.

-142-4. Акттность_ПЕвпаратов_ВДОГ_и_п^ реакции. Стабилизированный в процессе выделения лютеином препарат КЛОГ имеет оптимум рН 8,0-8,1 при использовании К-фосфатного ara трис-о буфера| кажущаяся К^ для /э-каротина составляла - П мкМ, vm«*" нмоль ретиналя/ч на 1мг белка. Препарат, полученный без стабилизации лютеином, но с использованием ДТТ и СИТ, имеет К^ 10 мкМ и то ко значение максимальной скорости'реакции.

Проверена возможность стабилизации КЛОГ лютеином по отношению х действию повреждающих факторов не только в ходе выделения ферментного препарата, но и при инкубации фермента с субстратом. Активности нестабилизированного и стабилизированного лютеином препаратов КДОГ существенно не отличались.

Введение в среду инкубации is мЫ никотинамидэ в наша опытах поткало выход ретиноля, что находится в противоречии с рекомендацией (Ooud«*n, ouon, i<x>9).

Оптимальная температура работы КДОГ в нагих опытах - 45°С (табл.л). Дальнейшее повышение температуры инкубации приводило к ум&ньашт» .активности фермента, а 3-х минутный прогрев препарата . при 5&°С, в отличии от данных L«v»h»«n*п *.*. (»072) н» увеличивал, р снижал его оОау» шшшяссть rtpa последующей инкубации при 37°с в течение Зч, вероятно вледствие частичной денатурации фермента. Кнкубеция фармэпта с А-каротяном при 45е с в течение Зч в оптимальных (исходя из вышеизложенных результчтоз! условиях, а внегаю, в 0,4 U К-фгсфатноы буфере, рН 8,1, согер*ая?м 2 tói гг: (ели 5 »31 qsm Я 0,5 мУ r,soa, увеличивала виход р»т;шчля по сравнению с осйгшой инкубационное cpezca s 2.6 раза (та?л. л к

ТйОл.й. Влияние температуры инкубационной среды па активность КДОГ.

Температура инкубационной среды* Удельная активность

о

37 . 42

45°. ' . 61

60°. 32

37°, (с предварительным прогревом при 55°, 3 кип) 36 оптимальные условия**,104

0 - срема инкубации содержала. 2 № озн, о,з ®н газоа, 34 тИ

¿»-каротина, 30 № Оелка, 0,1 Ы К-фосфатныВ буфер, рН 7,8.

** - среде инкубации содержала! 2 Ш ДТТ, О.Б иМ Кв&04, 34 мкМ

/1-коротина, 30 мг белка, 0,4 М К-фоефатный буфер, рН 8,0.

з • _1^я™е_антиоксиа§нтов_на^актквнос

Так как имелись данные опытов на аивотных по отрицательному действию антиоксвдантов на превращение каротина в витамин А, то исследовали влияние нескольких антиоксидантов на активность КДОГ (рис.з). Из использованных соединений только а-токоферол повышал выход ретаналя (при о, 7 мМ а-токоферола выход ре «шаля увеличивался а 1,5 раза). Бутилгидроксианизол (ВНА), бутилгидрокситолуол (ВНР) и аскорбиновая кислота в разной степени ингибировали образование эегинлля з каротиндиоксигеназной реакции. Соответственные константы шгибировз!шя для ВНТ - 0,036 мМ, для аскорбата - 0,45 мМ. Сио. :акя? ингибировала КДОГ, константа ингибирования 0,35 мЫ. Введение

%

-41-ок

аскорбиновой кислоты (2), ВНА (з) и ВИТ и ).

в сроду инкубации 11,02 для инициации образования свободных радикалов в среде - вызывало уменьшение выхода ротиналя, что подтверждает разрушещее действие образующихся в среде свободных радикалов на фермент, л-каротин и ротиналь. С другой стороны, аскорбиновая кислота прооксидантного действия на ретикиль в контрольных опытах с прогретой (100°, в течете 3 минут) Енактивированной КДОГ не оказывала, а си2+ в концентрации 0,5 кМ шзывзла разрушение ротапаля на 2ОХ в течение З-чзсоес.й инкубации.

Ингибиронаниэ КДОГ антиоксидантами различной природы может свидетельствовать о возможности участия свободных радикалов в превращении ^-каротина в ретиналь. Аналогичный фермент липоксигеназа, механизм действия которой включает образован!« свободгш радикалоа жхрннх кислот, ты<ге кнгкбируотся ВНТ к аскорспноесй кислотой. Действие о-тскоферолв hs лнпсксягекззу мож«т нсспть как пнгибпрупзй, .так и активирующий характер в зависимости

-1707 ЯСТОЧШКЭ форМЗНТГ.. (Нат-.íy е.а., 1991 ). РйЗЯЮТЭ В ДеЙСТВЩ ВНТ,

Е!И и аскорбиновой кислота с , одной стороны. и а-токофэрола о другой, очевидно, связано с их рззллчпоЯ способностью взегсзодейстЕовзть с радшшлагот, образущшгея п активном цэптрэ форманта при участии ионов Fe21'.

Рис.6. Шгглбировашю 1СД0Г аскорбиновой кислотой, ВИТ ■ п ионами мэди.

1. контроль t/э-каротин без ингибиторов).

2. аскорбиновая кислота, 0,35 ММ.

3. ВНТ, о,1 мМ.

•1. CuCl, 0,3 мМ. ____________

"W f.oí ОМ о'ТГ'шЛ

Иянетичзские данные по влиянию антиоксидантов (0,1 г-М ЕСТ л 0,35 v.M аскорбата), а также 0,5 мМ cuci на активность КДОГ приведены на рис.6. В координатах Лайнуивера - fcepiía в случеэ ВНТ,аскорбиновой кислоты и cuci графики зависимости 1/и от I/o параллельны, т. е. иле ют вид, характерны!! для случая бесконкурентного ингпбирования. Такой тип зависимости наблюдается при ипгхбировашш на уровне фермент-субстратного комплекса, который, по нашему мнению, представляет собой тройной комплекс ■|'¿p.v6HT-Fc2+ -^-каротин *, аналогичный комплексу липсксигэаазн о л'люлевой кислотой <соппог o.e., 1986). Медь п аитиоксвдаяш.

по-видимому дезактивируют на разных стадиях комплекс КДОГ - г»2* с перекисным радикалом ^-каротина, аналогично тому, как это было показано для шггохрома Р-450 (Метелица, 1<»ог). Эти представления отражены на приводимой нижа схеме г предполагаемого механизма действия КДОГ (Б). На схеме таххе приведен механизм (А), предложенный Ooodiaan, Huang (1965).

I

Сх.». Схема предполагаемого механизма действия КДОГ. (где« ft * fl-каротин» А = t з)

-194. Вз а™ддеРстви9_^0Г_5_кардтиндщамй.

4.1. Реакция КДОГ___с__ксантофиллами, ликопином___д

¿§*1ь1:а§ЕЩфо-£;кв1»тш!он. Била предпринята попытка обнаружить продукты реакции препарата КДОГ с . ликопином, лютвинаы, астаксантином и 15,15'-дегидро-^-каротином. При з-часовой инкубации препарата КДОГ астасксантин, лютеин, 15,15*-дегидро-/э-каротин а ликопин не метаболизировачись. В случае ликопина и литвина наблюдалось нефермеьтатинное образование малого количества продуктов - ю' и 12* апо-каротиналей. Таким образом, показано отсутствие продуктов энзиматического расщепления использованных каротиноидов по центральной 16,15' двойной связи. Поскольку превращение ксантофиллов в витамин А в организма рыб и, слабее, у крыс все-таки происходит (пенило, 1991), то, вероятно, необходимо их предварительное восстановление до каротинов . или местом протекания этого процесса является не кишечник, а другие органы.

4.2. Влияние каротиноидов на реакцию КДОГ о ^-каротином. На рис.7 приведена зависимость влияния некоторых каротиноидов на образование ретиналя из ./э-карстина препаратами КДОГ. Изученные каротиноиды оказывали ингибирувдее действие " в^ " диапазоне концентраций - 6,2 - 37,2 ыкМ, на фоне 37,2 мкЫ /»-каротина. Ингибирование ликопином и 15,16*-дегидра-гз-каротином происходило по конкурентному, а лютеином и астаксантином по конкурент» неконкурентному типам. Наибольший ингибируюций эффект наблюдался а. случае 15.15'-дегидро-^-каротина и ликопина, что, вероятно, является следствием их большего структурного сходства о субстратом - о-каротином. Введение гидрофильных групп в /»-аояоновые кольца.

a/i »8,6 л* 8 -V

Рис. 7. Зффзит р^ожчш.; кощргл-рзцгд карошгац&оз из црэврааешэ р-кьротшш в рлчшаль tf-Kcponsi-is,

1.Лжош;п. 2. 15,Ï5* -дзгя'фо-^-кррот:с.

з. Лвтош. л, лоуьксевткй.

сгжг^гт ц?:л*ро;; ît£.0;\ nvo сбгясияс? cin^iipoL;;;;^'.^ ь/р:.'

fiiiù'Szio:: :,i Wî&iciV;*, Dji:jr:r:;o» 4\ù a'ij;^;.;;«- д.'«-.a

r: ïir. îiponpa^ai;:;^ /з-ксрзтсг: n рот::;;;.;^ о;; м,

Vi V^¡ЩЗЛЖП'гЯ ïOJVinO ¡3 00ЖКЗ: ксэд0нгрг.ц;иг/; (м 1 <;■'■. D-чч

tr. vit va e иряитеяся КПОГ öüso иоказа:;о oöpxouu::'.; ко коториЛ по спектру

.с&о&ств&*г б;«; . исеитк^зсфтозг: ix.: pY.aia::?,. гси^с.-.ьствуо? о тс:.:, что vop-'jr.::¡, с v.'...

вззастйыш каротиноидвмн, является провитамином А. Образование некоторого количества ретинадя наблюдали такие из метилового зфира торулародина и, в меньшей степени, из торулародина,

вывода.

1. Разработан воспроизводимый метод защиты а стабилизация ¡ферментной системы, участвующей в превращении ^-каротина в рвтинадь, при ее выделении, основанный на использовании сульфгидрллышх протекторов, ингибиторов протеиназ и лютеина. Эффект этих зоединеЕий зависит от их концентрации и носит аддитивный характер, fit совместное применение позволяет повысить удельную активность Серментвого препарата в is раз.

2. Определены оптимальные параметры инкубации фермента при зпределении его активности! концентррция tf-каротина - 34 мкЫ, ДГТ -е ыМ (или osh -з мМ), f«bo4 - о,э мУ, 0,4 М К-фосфатшй буфер, pit »,1, температура инкубации - 4з°с. Оптимальную доступность зубсграта в мицеллах дает смесь детергентов» о,6« Твина 20, o.ix солата n* и o,ix лецитина.

3. Показано, что ликогган и is, i з'-дапщхь/э-каратин ингибирувт »-каротин-iзиз'-диоксигеназу по конкурентному, а лютеин в ютаксантин по конкурентно - неконкурентному типу. Продуктов ¡ерментативного расщепления этих каротиноидов по центральной [войной связи не обнаружено, что свидетельствует о необходимостй 1аличия в молекуле субстрата незамещенного иононового кольца

4. На основании данных по илгибирующему действию 1нтаоксидантов - бутилгидрокситолуола, бутилгидроксианизола я

аскорбата, а также ионов меди на активность гэ-каротин-13,13* -диоксигеназы предложена модифицированная схема механизма действия л-каротин-i з, i з'-диоксигеназы, учитывающая участие свободных радикалов в процессе превращения ^-каротина в ретиналь.

5. С помощью выделенной ферментаттгай системы г>-каротин-13,is*-диоксигеназы установлена про витаминная активность торулина.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Подулях О.В., Подопригора О.И., Елисеев С.А., Ершов D.B., Быховский В.Я., Дмитровский A.A. Биосинтез торулина и

торулародина дрожжами рь«та rhodozy»».// Прикл. биох. и иикробиол. 1991. Т. 27. A4, с.541-645.

г. Дмитровский A.A., Ершов Ю.В., Быховский В.Л. Стабилизация и ващнта ферментной системы, участвующей в превращении гэ-каротина в ретиналь, при ее выделении, it Прикл. биох. и кикробиол. i9<»2.

Т.2Я. В.2. С.199-204.

3. Ершов D.B., Дмитровский A.A., Быховский В.Я. Ферментативное превращение торулина и торулародина в ретиналь. // Прикл. биох и микробнол. 19«. Т.28. В.5. С.

4. Ервов D.B., Ддатровский A.A., Быховский В.Я. Сройствз Л-кпротЕН-13,1з'-д»оксиген9зы, стабилизированной в процессе вплелания яотеином и дитиотреитолом. и Биохимия. io<>2. в печати.

в. Дмитровский A.A., £ршов D.B. О возможности участия свободных радикалов в энзиматическом превращении ^-карйтина в ретиналь. // Прикл. Оиох и микробиол. 1992., в печати.

взаимодействия /?-каротин-13,1з'-диоксигеназы из тонкого кишечника кролика с ликопином, 13, is' -дегидро-/»-каротином, литейном и встаксантином. н Биохимия, в печати.

7. Daltrovikil A.A., Erahov Vu.V/., Polulyah O.V., PodoprlQOra O.I. üitabollc atpact* of vltutn A. // Tha Flrat International Congrasa an Vltanin« and Biofactor* In Life Be lene» (1CVB>. Abstracta. -<oba, Japan, 16-20 Saptambar, 1991.

ь. Ершов D.B., Дмитровский A.A., Быховский В.Я. О характере

I

о

Зак. 180 Объои 1,5 п,л. Тир. ио

Тип. СП "Центр-Юи", Москва, ул. Павла Ко;чсг^ >*•.,22