Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы Rhodococcus opacus 1CP: кинетические и структурные свойства

Коломыцева, Марина Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы Rhodococcus opacus 1CP: кинетические и структурные свойства
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы Rhodococcus opacus 1CP: кинетические и структурные свойства"

На правах рукописи

Коломыцева Марина Павловна

ХЛОРПИРОКАТЕХИН 1,2-ДИОКСИГЕНАЗЫ ЯНОООСОССШ ОРАСШ1СР: КИНЕТИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА.

03.00.04 -биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Лаборатории энзиматической деградации органических соединений Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Л.А. Головлбва; кандидат биологических наук, И.П. Соляникова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г Д. Миронова; кандидат биологических наук, М.В. Донова

Ведущая организация

Института фундаментальных проблем биологии РАН

Защита состоится

<2,- Дек А е^А 2005 гв \Ц

час оо

мин на заседании

Диссертационного совета Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г. К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущине, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат разослан" 1 " НаЗСРЯ 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

В.М. Вагабов

J&36

Актуальность проблемы. Ароматические соединения содержатся в биосфере повсюду и имеют как природное, так и искусственное происхождение. Самым большим природным источником ароматических соединений служит растительный полимер - лигнин. Другим не менее масштабным источником ароматических соединений является хозяйственная и промышленная деятельность человека. Большинство ксенобиотиков, обладая высокой токсичностью, используются или образуются в процессе промышленного производства пластмасс, бумаги, смазочных материалов, охлаждающих жидкостей, взрывчатых веществ. В качестве загрязнителей окружающей среды также выступают гербициды, пестициды и инсектициды, применяемые в сельском хозяйстве. Основная нагрузка по разложению ароматических соединений в биосфере ложится на микроорганизмы, имеющие специфические пути деградации. В процессе биодеградации множество ароматических соединений превращаются в относительно небольшое количество интермедиатов, которые содержат две смежные гидроксильные группы в ароматическом кольце. Такие интермедиаты в дальнейшем подвергаются ключевой реакции биодеградации, заключающейся в раскрытии ароматического кольца, которое осуществляется дециклизующими диоксигеназами. В этом случае, оба атома молекулярного кислорода посредством фермента включаются в субстрат с последующим его расщеплением. Такие реакции являются беспрецедентными в органической химии, и в настоящее время проявляется все больший интерес к структуре и механизмам действия децшслизующих диоксигеназ.

1999), протокатехат 4,5-диоксигеназы из Sphingomonas paucimobilis SYK-6 (Sugimoto et al., 1999), 2,3-дигидроксибифенил 1,2-диоксигеназы из Pseudomonas sp. (Uragami et al., 2001, Sato et al., 2002), и двух гомопротокатехат 2,3-диоксигеназ из Arthrobacter globiformis и Brevibacterium fuscum (Vetting et al., 2004). Для интрадиольных диоксигеназ к началу нашей работы были известны структуры только трех ферментов: двух протокатехат 3,4-диоксигеназ из Pseudomonas putida (Orville et al., 1997a) и из Acinetobacter sp. ADP1 (Vetting and Ohlendorf, 2000) и одной пирокатехин 1,2-диоксигеназы из Acinetobacter sp. ADP1 (Vetting et al.,

2000). К 2005 году в совместной работе нашей лаборатории и Флорентийского

университета была расшифрована трехмерная структура гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы из Nocardioides simplex ЗЕ (Ferraroni et al., 2005). Однако ни одной структуры хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ не было известно.

Ранее в нашей лаборатории был выделен активный штамм Rhodococcus opacus 1СР, разлагающий 2- и 4-хлорфенолы (Горлатов с соавт., 1989; Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт., 1999, 2001). Изучены пути биодеградации этих соединений и выделены ферменты, участвующие в этом процессе, клонированы и секвенированы опероны, кодирующие эти ферменты. Показано наличие разных интрадиольных 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, существенно отличающихся от ранее известных пирокатехин 1,2-диоксигеназ этого штамма (Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт., 2001). Неизвестными оставались причины функционального различия 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ между собой и отличия от других интрадиольных диоксигеназ известной структуры и функции. Ответить на этот вопрос стало возможным благодаря изучению трехмерной структуры данных ферментов и проведении структурно-функционального анализа.

Цель и задачи исследования. Целью работы было выявление взаимосвязи структуры и функции 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы из штамма R. opacus 1СР, утилизирующего 2-хлор и 4-хлорфенолы в качестве единственных источников углерода и энергии соответственно, и выяснение причин субстратной специфичности ферментов при сравнении с структурой и функцией других интрадиольных диоксигеназ.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получение гомогенных препаратов 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ.

2. Детальное изучение кинетических свойств ферментов.

3. Получение кристаллов 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, пригодных для проведения рентгеноструктурного анализа.

4. Расшифровка с помощью рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры ферментов.

5. Проведение сравнительного структурно-функционального анализа 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ из штамма R. opacus 1СР параллельно с интрадиольными диоксигеназами известной структуры, с целью выяснения причин субстратной специфичности ферментов.

Научная новизна. Впервые закристаллизованы 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы среди известных хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ.

Впервые расшифрованы трехмерные структуры 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. Показано, что хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы являются гомодимерами, состоящими из двух каталитических доменов и одного связующего домена, представляющего гидрофобный тоннель, внутрь которого погружены с обеих сторон две молекулы фосфолипидов. В каждом каталитическом домене хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ содержится активный центр с трехвалентным железом, в координационной сфере которого найдена дополнительная структура: молекула бензоата у 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы и молекула бензогидроксамата в структуре 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы.

На основе кинетических свойств ферментов и структурных свойств субстратных аналогов показано, что связывание последних в активном центре фермента определяется характером взаимодействия, образующегося между заместителем в молекуле субстратного аналога и внутренней поверхностью активного центра. Установлена прямая зависимость каталитического процесса от величины заряда на кислороде первой гидроксильной группы субстрата. Показано прямое соответствие рассчитанной последовательности депротонирования смежных гидроксильных групп субстрата с ранее известной последовательностью связывания субстрата с железом активного центра интрадиолыгах диоксигеназ.

Проведенный сравнительный структурно-функциональный анализ хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ между собой, а также с интрадиольными диоксигеназами известной структуры показал, что различия в их субстратной специфичности вызваны соответствующими изменениями в аминокислотном составе активных центров ферментов и их входов.

Практическое значение работы. Полученные данные открывают широкое поле деятельности для белково-инженерных работ с целью получения ферментов с высокой субстратной специфичностью и заданным спектром атакуемых субстратов. Это позволит оптимизировать процессы деградации ряда ксенобиотиков путем конструирования эффективных штаммов деструкторов методами генной инженерии, а также получать высокочувствительные биосенсорные пленки, используемые для тестирования пирокатехина и его производных в почве и сточных водах.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на ежегодных сессиях научных работ ИБФМ РАН (Пущино, 2002, 2003, 2004), конференциях молодых ученых (Пущино, 2002, 2003), на международных конференциях: "Oxizymes in Naples. 2nd European meeting" (Naples, 2004) и "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 2005).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 4 статьях и 4 тезисах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 151 странице и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 315 источников. Работа содержит 16 таблиц, 1 схему и 51 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали клетки штамма R. opacus 1СР, длительное время поддерживаемые с 4-хлор- и 2-хлорфенолами в качестве единственных источников углерода и энергии соответственно на агаризованной и в жидкой средах. R. opacus 1СР выращивали в 10 л ферментере на минеральной среде (Горлатов с соавт., 1989) с 0.3 мМ 4-хлорфенола или 2-хлорфенола в качестве единственных источников углерода и энергии. По мере утилизации субстрат вносили до конечной концентрации 0,3 мМ.

Определение активностей ферментов проводилось спектрофотометрически на спектрофотометрах Shimadzu UV-160 и Shimadzu UV-2501PC (Япония) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм, при 25°. Активность хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ определяли по модифицированному методу Хаяиши (Hayaishi et al., 1957).

Удельные активности ферментов с пирокатехином и его замещенными аналогами рассчитывали по скорости образования соответствующих продуктов, используя при расчете коэффициенты молярной экстинкции (Stanier and Ingraham, 1954; Tiedje et al., 1969; Dorn and Knackmuss, 1978; Ito, 1993; Saeki and Nozaki, 1980).

Все процедуры очистки хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ осуществлялись в присутствии 0,05М трис-HCl pH 7,2. Бесклеточный экстракт получали путем разрушения клеточной массы на прессе типа Хьюза. Препарат 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксгеназы (4-ХПК 1,2-ДО) получали в 5 стадий, включавших анионообменную хроматографию на Q-Sepharose Fast Flow с линейным градиентом 0-0,5М NaCl, гидрофобную хроматографию на Phenyl Sepharose CL-4B с линейным градиентом 1,6-ОМ (NH^StXt, гель-фильтрацию на Superdex 200 prep grade, анионообменную хроматографию на Mono-Q с ступенчатым градиентом 0-1М NaCl (0-10%, 10-20%, 20-100%), гидрофобную хроматографию на Resource ISO с линейным градиентом 1,6М (NH^SO^ Очистка 3 -хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы (З-ХПК 1,2-ДО) включала три последовательных стадии с применением Q-Sepharose Fast Flow, Phenyl Sepharose CL-4B и Superdex 200 prep grade и осуществлялась по аналогичной схеме, описанной для 4-ХПК 1,2-ДО.

Концентрация белка определялась по модифицированному методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Чистота белковых препаратов контролировалась с помощью SDS-электрофореза при десятикратной перегрузке ферментом 12% полиакриламидного геля по модифицированному методу Лэммли (Laemmly, 1970). Гель окрашивали Кумасси G-250 (Diezel et al., 1972).

Константы Михаэлиса (Km) и максимальные скорости реакций (V^) определяли по методу Лайнуивера-Берка (Lineweaver and Burk, 1934). Значения км рассчитывали на основе субъединичных масс ферментов: 26.5 (4-ХПК 1,2-ДО) и 28.5 кДа (З-ХПК 1,2-ДО). Константа ингибирования (K¡) определялась графически по методу Диксона (Dixon, 1953). Для расчета каждого параметра использованы данные как минимум трех экспериментов.

Кристаллизацию ферментов осуществляли методом выпаривания в сидячей капле посредством первоначального скрининга условий кристаллизации с использованием двух коммерческих наборов Hampton Research Crystal (Screen и Screen2) и последующей оптимизацией выбранных условий. Скрининг условий кристаллизации проводили в 96-ти (8x12) камерных планшетах Cryshem HR3-160 (Hampton Research).

Рентгеноструктурный анализ кристаллов ферментов был проведен на синхротронах DESY (Гамбург, Германия) и Elettra (Триест, Италия) с помощью метода аномального рассеивания рентгеновских лучей различных длин волн (Multiple wavelength anomalous dispersion (MAD)). Сбор данных и их обработку осуществляли с помощью программных пакетов Denzo и Scalepack (Terwilliger and Berendzen, 1999), Solve (Otwinovski and Minor, 1997), CCP4 (Collaborative Computational Project 4, 1994), Quanta (QUANTA Simulation, Search and Analysis, 1997).

Координаты атомов молекулярных структур 4-ХПК 1,2-ДО и З-ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1СР размещены в электронной базе данных (Protein Data Bank) под идентификационными номерами: ls9a и 2boy соответственно.

Структурный анализ ферментов проводили с использованием программных пакетов PyMolVO.95 (DeLano, 2002), HEX 4.1 (Ritchie and Kemp, 1999). Выравнивание областей активных центров ферментов осуществлялось методом наименьших квадратов с помощью мах-лахлановского алгоритма (McLachlan, 1982) программы ProFit2.3 (www.bioinf.org.uk/software/profit/), используя заданные координаты четырех аминокислотных остатков, являющихся лигандами железа в активных центрах. Для сравнительного анализа структур хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ из R. opacus 1СР с известными структурами других интрадиольных диоксигеназ использованы электронные данные из Protein Data Bank: пирокатехин 1,2-диоксигеназы из Acinetobacter sp. ADP1 -ldlm (нативный фермент), ldlt (комплекс фермент-пирокатехин), ldmh (комплекс фермент-4-метилпирокатехин); гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы - ltmx (комплекс фермент-бензоат); протокатехат 3,4-диоксигеназы из Acinetobacter sp. ADP1 - 1ео2 (нативный фермент), leob (комплекс фермент-протокатехат).

Расчет зарядов на кислородных атомах реакционных гидроксильных групп молекул субстратов и их аналогов осуществляли с помощью HyperChem 6.03 (http://www.hyper.com) с использованием полуэмпирического метода AMI (Dewar étal, 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На начальном этапе для улучшения качества получаемых ферментативных препаратов были модифицированы ранее использованные в нашей лаборатории методы очистки ферментов (Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт., 2001) с помощью замены ряда носителей и с применением дополнительных этапов очистки, что позволило получить препараты хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, пригодные для последующей кристаллизации.

Кристаллизация хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. Осуществление первоначального скрининга условий кристаллизации обоих ферментов с использованием двух коммерческих наборов для кристаллизации (Hampton Research Screen и Screen2) и последующей оптимизации выбранных условий позволило получить дифракционно-качественные кристаллы хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ правильной, но отличающейся друг от друга формы (Рис. 1).

Рис. 1. Микрофотографии кристаллов 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы (А) и 3 -хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы (Б).

Оптимальные условия кристаллизации 4-ХПК 1,2-ДО включали 1.6 М сульфат аммония, 0.1 М хлорид натрия, 100 мМ Трис-HCl, рН= 9.0, 5-15% глицерин. Были получены гексагональные кристаллы 4-ХПК 1,2-ДО размером 0.4x0.4x1.0мм с параметрами элементарной ячейки (А): а = b = 90.42, с = 307.53. Объем элементарной ячейки составил Vm=3.13 А3/Да, 61% из которого был заполнен растворителем. Ассиметрическая единица содержала одну молекулу фермента. Буфер с оптимальными условиями для кристаллизации 3-ХПК 1,2-ДО содержал 0.3М Mg(CH3C02)2, 0.1 М Хепес с pH = 7.5, 15% ПЕГ 8000, 5% глицерин. Были получены кристаллы 3-ХПК 1,2-ДО примитивной триклинной формы размером 0.2x0.5x0.5мм с параметрами элементарной ячейки: а = 83.18 А, Ь = 86.61 А, с = 93.44 А, а = 85.4, ß = 66.5, у = 76.9. Ассиметрическая единица кристалла содержала 4 молекулы 3-ХПК-1,2-Д0. Объем элементарной ячейки составил 2.59 А3/Да , из которого 52% было занято растворителем.

Общая молекулярная структура. Последующий рентгеноструктурный анализ кристаллов 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО с разрешением в 2.5 А и 1.9 А соответственно показал, что молекулы ферментов имеют схожую структуру и являются гомодимерами размером в длину около 100-105А и в ширину 40А (Рис.

Каждая молекула состоит из двух каталитических доменов,

представленных ß-складчатой

структурой и петлями беспорядочной структуры, и одного связывающего домена в виде гидрофобного тоннеля, образованного а-спиральными

участками N-концов обеих субьединиц в полость которого погружены две молекулы фосфолипида.

Полость активного центра в каждой субъединице содержит трехвалентное железо и расположена в области беспорядочных петель между ß-складчатой структурой каталитического домена и a-спиральным участком связывающего домена.

Из всех интрадиольных диоксигеназ известной структуры исследованные хлорпирокатехин 1,2-Рнс. 2. Структура молекулы 4- диоксигеназы были близки к ферментам хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы. семейства 1,2-диоксигеназ (пирокатехин Атом железа обозначен в виде сферы. 1,2-диоксигеназе из Acinetobacter sp.

ADP1 (Vetting and Ohlendorf, 2000) и гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназе из Nocardioides simplex ЗЕ (Ferraroni et al., 2005)) и отличались от протокатехат 3,4-диоксигеназ из Pseudomonas pulida и Acinetobacter sp. ADP1 (Ohlendorf et al., 1994; Vetting et al., 2000).

каталитический домен

домен каталитическии домен

фосфодипиз

Координационная сфера железа активного центра. Как известно, у всех интрадиольных диоксигеназ в образовании координационной сферы трехвалентного железа участвуют два тирозина, два гистиднна и гидроксил экзогенной воды (Схема 1а), с образованием пятикоординированного состояния (Ohlendorf et al., 1994; Vetting et al., 2000; Vetting and Ohlendorf, 2000). При бидентантном связывании молекулы субстрата с железом происходит диссоциация одного эндогенного тирозина и экзогенного гидроксила из координационной сферы с сохранением координационного числа 5 (Схема 16). Однако, возможно существование шестикоординированного железа (Схема 1в) при последующем связывании железо-субстратного комплекса с молекулярным кислородом (Vetting et al., 2000).

Схема 1. Координационные сферы трехвалентного железа хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ из R. opacus 1СР и интрадиольных диоксигеназ известной структуры (на примере протокатехат 3,4-диоксигеназы из Acinetobacter sp. ADP1). См. в тексте.

Рентгеноструктурный анализ хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ показал, что координационные сферы трехвалентного железа исследуемых ферментов близки к таковым известных интрадиольных диокисгеназ (Схема 1г, д). Исключением явились слабо связанные дополнительные структуры, бидентантно координирующие железо: молекула бензоата в структуре 4-ХПК 1,2-ДО (Схема 1г) и молекула бензогидроксамата в структуре 3-ХПК 1,2-ДО (Схема 1д). При этом железо последнего фермента оставалось пятикоординированным с сопутствующей диссоциацией одного тирозина и гидроксила, а железо 4-ХПК 1,2-ДО было шестикоординировано с сохранением всех четырех эндогенных лигандов и с диссоциацией гидроксила. Но возможность пребывания координационной сферы железа 4-ХПК 1,2-ДО в пятикоординированном состоянии в нативном ферменте (Схема 1а) и в фермент-субстратном комплексе (Схема 16) показана ранее с помощью рентгено-абсорбционной спектроскопии (Briganti et al., 1998). Возможно, такие структуры как бензоат и бензогидроксамат могут захватываться ферментами в процессе роста культуры. Данное предположение подкрепляет тот факт, что у интрадиольных диоксигеназ известной структуры изменение рН раствора ведет к захватыванию дополнительных экзогенных молекул с целью сохранения нулевого потенциала Fe3+ в новых измененных условиях (Vetting et al., 2000). Кроме того, у ряда микроорганизмов найдены гидроксамато-подобные

НМ«2(1М) б

структуры, выполняющие роль сидерофоров - переносчиков ионов железа (Саггапо et al. 2001; De Voss et al. 1999), имеющие меньшую аффинность к железу, чем пирокатехины (Hider and Hall 1991).

Но такое строение координационной сферы хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ не может объяснить их высокую избирательность к субстратам, несущим в своем ароматическом кольце гидрофобные хлор- и метил-заместители. Было очевидно искать другие причины функциональных особенностей ферменов.

Кинетические свойства хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. В работе были протестированы пирокатехин и 26 его аналогов (Рис. 3): замещенные аналоги пирокатехина, замещенные производные фенола и бензойная кислота.

jTjTí<A6-T«Xni[ '

& Ь ¿5* ¿Jr & ¿GejÍS*™

^^Хма« (^Гмш (^Гггх C^raL ^Д^Гд.з-дапк

6. ¿с ¿c Д Д IJ +*• (J 4-М*

т X ¿r J!f4y 2,6-ДХФ ад» Тм-ДХФ "^Тьи-тхф |2А6-ТХФ

ó"* Ь Ь Ь

у-0« ш

Рис. 3. Пирокатехин и его аналоги: I - замещенные аналоги пирокатехина, П - замещенные производные фенола, III - бензойная кислота. Сокращения: ПК - пирокатехин, ХПК -хлорпирокатехин, ДХПК - дихлорпирокатехин, ТеХПК - тетрахлорпирокатехин, МПК -метилпирокатехин, ПГ - пирогаллол, ГТХ - гидроксигидрохинон, ПКК - пропжатехоаая кислота, ДГБК - дигидроксибензойная кислота, Ф - фенол, ХФ - хлорфенол, ДХФ - дихлорфенол, ТХФ -трихлорфеиол, МФ - метилфенол, БК - бензойная кислота.

Согласно субстратной специфичности (Таблица 1) ферменты активно связывали и расщепляли пирокатехин, хлор- и метилпирокатехины, причем, чем больше хлор-заместителей имелось в бензольном кольце субстрата, тем

Таблица 1. Влияние природы заместителя и его положения в бензольном кольце пирокатехина и его аналога на субстратную специфичность 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы и 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы.

Субстраты 4-ХПК 1,2-ДО 3-ХПК 1,2-ДО

Кщ мкМ или Кь мкМ ^^пмх, ед/мг ^(ТТНОС! % кш, мин'1 кем/Кщ, мин'1- мкМ1 Кщ, мкМ или К,, мкМ' ^гшх, ед/мг V^пlюc) % кем, мин"1 ксм/Кщ, мин'1- мкМ"'

пирокатехин 22 10.1 100 268 12.2 2.1 16.1 100 458.8 218.5

3-хлорпиркатехнн 2 1.4 14 37 18.5 1.4 11.5 71 327.7 234.1

4-хлорпирокатехин 1.2 9.5 94 252 210 3.5 10 62 285 81.4

З-метилпирокатехин 27 21 208 557 20.6 1.9 45.5 283 1296.8 682.5

4-метнлпнрокатехин 4.2 24.5 243 649 155 3.4 43.4 270 1237 364

пирогаллол (1,2,3-тригидроксибензол) 28 15.1 150 400 14.3 4 1.2 7.5 34.2 8.6

гидроксигидрохинон (1,2,4-тригидроксибензол) 71 4.3 42.6 114 1.6 13.8 1.31 8.1 37.3 2.7

2,3-дигидроксибензойиая кислота » * - - - - 610 (3000*) 0.168 1 4.78 0.0078

протокатеховая кислота (3,4-дигидроксибензойная кислота) 86* - - - - 223 (1515*) 2.4 15 68.4 0.307

3,5-дихлорпнрокатехин 1.2 1.8 18 49 41 3.04* - - - -

4,5-дихлорпирокатехин 1.9 0.5 5 13.25 7 0.0102*- - - -

3,4,5,6- тетрахлорпирокатехин 0.6* - - - - 0.059* - - - -

* - конкурентное ингибирование

сильнее было связывание такого соединения в активном центре ферментов, при этом скорость расщепления снижалась вплоть до полной отмены каталитического процесса. Соединения, содержащие гидроксильный или карбоксильный заместители в бензольном кольце еще хуже связывались и расщеплялись, за исключением высокой активности 4-ХПК 1,2-ДО с пирогаллолом. Следует отметить особую избирательность ферментов к хлор- и метил-заместителю в мета- и паря-положениях ароматического кольца субстрата. Так 4-ХПК-1,2-ДО активней связывала и расщепляла хлор- и метил-замещенные пирокатехины в положении 4, а 3-ХПК 1,2-ДО наоборот - в положении 3.

Фенол и его хлор- и метилзамещенные аналоги, содержащие только одну реакционную гидроксильную группу, являлись конкурентными ингибиторами. Характер связывания таких соединений в активных центрах ферментов имел как схожие, так и отличающиеся черты по сравнению с аналогично замещенными пирокатехинами (Таблица 2).

Таблица 2. Константы ингибирования 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО.

К,, мкМ

Субстратный аналог -

4-ХПК 1,2-ДО 3-ХПК 1,2-ДО

бензоат » »

фенол 1800 91

2-хлорфенол 38 0.55

3-хлорфенсш 70 1.02

4-хлорфенол 150 30.7

2-метилфенол 1566 535

3-метилфенол 943 4.6

4-ыетилфенол 878 65.4

2,4-дихлорфенол 6 0.23

2,5-дихлорфенол 6 0.127

2,6-дихлорфенол И 1.43

3,4-дихлорфенол 15 0.44

3,5-дихлорфенол 41 0.026

2,4,5^трихлорфенол 1.1 0.297

2,4,6-трихлорфенол 0.9 34

Так, увеличение количества хлор-заместителей в ароматическом кольце фенолов приводило к повышению связывания последних в активных центрах ферментов также как и в случае с пирокатехинами. Замещенные фенолы имели худшее связывание в активных центрах ферментов, чем аналогично замещенные пирокатехины. Следует отметить наличие закономерности в связывании хлор- и метил замещенных фенолов в положении 2,3,4 ароматического кольца: наибольшее связывание в активных центрах обоих ферментов имел фенол с хлор-заместителем в орто-положении, напротив для фенола с метальной группой в орто-положении показано наименьшее связывание. Такое явление подчеркивает наличие донорно-акцепторной природы координационной сферы железа активного центра ферментов. Различная избирательность хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ к замещенным фенолам в мета- и пора-положениях найдена только для метил фенолов.

Чтобы лучше понять процесс связывания и расщепления субстрата ферментом необходимо знать реакционную способность и молекулы фермента и молекулы субстрата, то есть их структурные свойства.

Структурные свойства субстратов и их аналогов. Как известно, реакционными группами субстрата, взаимодействующими с электрофильным железом координационной сферы, являются смежные гидроксильные группы. Поэтому для оценки нуклеофильности субстратов были рассчитаны величины зарядов на кислородных атомах реакционных групп в протонированном и депротонированном состоянии (Таблица 3).

Таблица 3. Расчетные величины зарядов на кислородных атомах реакционных гидроксильных групп пирокатехина, фенола и их аналогов в протонироваиной и депротовированной формах для одного из гидроксилов. Субстратные аналоги размещены в таблице по мере уменьшения заряда депротонированного кислорода при С1 атоме ароматического кольца.

Соединения протонированное состояние депротонированное состояние

0-С1 0-С2 о-с„ 0-С1 0-С2 О-Са

4-метилпирокатехин -0,249 -0,272 - -0,271 -0,192

З-метшширокатехин -0,250 -0,274 - -0,269 -0,188

пирокатехин -0,249 -0,272 - -0,268 -0,188

пирогаллол -0,225 -0,226 -0,269 -0,262 -0,177 -0,276

4-хлорпирокатехин -0,245 -0,268 - -0,260 -0,188

З-хлорпирокатехин -0,246 -0,266 - -0,258 -0,178

4,5-днхлорпирокатехин -0,241 -0,265 - -0,253 -0,184

3,5-дихлорпирокатехин -0,241 -0,263 - -0,250 -0,172

2,3-дигидроксибензойная кислота -0,221 -0,225 -0,326°" -0,277°" -0,248 -0,180 -0,329°" -0,270°"

протокатехат -0,220 -0,226 -0,367°" -0,316°" -0,245 -0,180 -0,358°" -0,312°"

3,4,5,6-тетрахлорпирокатехин -0,225 -0,260 - -0,225 -0,177

гидроксигидрохинон -0,249 -0,267 -0,248 -0,217* -0,216 -0,264*

бензойная кислота - - -0,365°" -0,317°" - - -0,266"" -0,266°-

2-метилфенол -0,254 - - -0,291 - -

4-метил фенол -0,253 - - -0,289 - -

3-метилфеиол -0,253 - - -0,285 - -

фенол -0,253 - - •0,283 - -

4-хлорфенол -0,248 - - -0,279 - -

3-хлорфенол -0,248 - - -0,272 - -

3,4-дихлорфенол -0,244 - - -0,271 - -

2-хлорфенол -0,245 - - -0,265 - -

3,5-днхлорфенол -0,243 - - -0,262 - -

2,4-дихлорфенол -0,241 - - -0,261 - -

2,5-дихлорфеиол -0,240 - - -0,257 - -

2,4,5-тряхлорфенол -0,237 - - -0,254 - -

2,6-дихлорфенол -0,230 - - -0,245 - -

2,4,6-трихлорфенол -0,226 - - -0,241 - -

О" - заряд на кислородном атоме ОО составляющей карбоксильной группы ОН - за рал ■■ кислородном атоме ОН составляющей карбоксильное группы * - дсаро! они |ижаиные группы у пцроксн! троими

Оказалось, что в протонированном состоянии кислород первой гидроксильной группы несет наименьший заряд, что облегчает начало депротонирования именно с этой группы, вызывая последующее возрастание заряда на этом кислороде и сопутствующее снижение заряда на кислородном атоме второго гидроксила, что облегчает его последующее депротонирование.

Описанный процесс совпадает с последовательностью связывания субстратов и их аналогов у интрадиольных диоксигеназ (Vetting et al., 2000), согласно которой вначале кислород первой гидроксильной группы связывается с железом с диссоциацией тирозина, затем происходит связывание кислорода второго гидроксила с сопутствующей диссоциацией гидроксила воды из координационной сферы.

Связь структуры субстратного аналога с функцией хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. Анализ зависимости степени связывания замещенных фенолов и пирокатехинов, а также расщепления последних от величины заряда кислорода первой гидроксильной группы позволил выявить дополнительные закономерности. Так для замещенных фенолов было показано (Рис. 4), что:

1) основную роль в связывании субстратных аналогов в полости активного центра хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ выполняет заместитель в ароматическом кольце, что отражается в общей обратно пропорциональной зависимости InKi замещенных фенолов от величины заряда на кислородном атоме единственной гидроксильной группы;

2) поверхность активного центра 3-ХПК 1,2-ДО, соответствующая заместителю в положении 3 и 4 бензольного кольца замещенного фенола, более гидрофобна, чем у 4-ХГЖ 1,2-ДО, что следует из большего угла наклона первой половины кривой исследуемой зависимости 3-ХПК 1,2-ДО по сравнению с аналогичным участком для 4-ХПК 1,2-ДО;

3) существует конфликт поверхности активного центра 3-ХПК 1,2-ДО с фенолами, имеющими хлор-заместитель в положении 6, отражающийся в отклонении второй половины кривой зависимости, выведенной для 3-ХПК 1,2-ДО.

А Б

1 л „ 4 V 5 \ * 14

з х 7 J 10 "у » и 7ь

-0,30 -0,29 -0Д8 -0,27 -0,2« -0,25 -0,24 -0,23 -0,30 -0,29 -0,28 -0,27 -0,26 -0,25 -0,24 -0,23 »рщО~-С1 »puO-Cl

Рис. 4. Влияние величины заряда депротонированного кислородного атома при С1-атоме ароматического кольца замещенного фенола на степень его связывания с 4-ХПК 1,2-ДО (А) и 3-ХПК 1,2-ДО (Б). (1)- 2-метилфенол; (2) - 4-метилфенол; (3) - 3-метилфенол; (4) - фенол; (5) - 4-хлорфенол; (6) - 3-хлорфенол; (7) - 3,4-дихлорфенол; (8) - 2-хлорфенол; (9) - 3,5-дихлорфенол; (10) - 2,4-дихлорфенол; (И) - 2,5-дихлорфенол; (12) - 2,4,5-трихлорфенол; (13) - 2,6-дихлорфенол; (14) - 2,4,6-трихлорфенол.

По сравнению с замещенными фенолами связывание аналогично замещенных пирокатехинов в активных центрах ферментов усиливалось (Рис. 5), что может быть обусловлено появлением в структуре таких соединений второй смежной гидроксильной группы, вносящей дополнительный вклад в связывание пирокатехинов в активном центре ферментов.

-0,28 -0,27 -0,26 -0Д5 -0,24 4>& -0,22 -0,21 -0,28 -0Д7 -0,26 -0,25 -044 -0ДЗ -0,22 -0,21 зарод 0--С1 заряд 0--С1

Рис. 5. Влияние величины заряда депротонированного кислородного атома при С1-атоме бензольного кольца аналогов пирокатехина на степень их связывания с 4-ХПК 1,2-ДО (А) и 3-ХПК 1,2-ДО (Б): (1)- 4-метялпирокатехин; (2) - З-метилпирокатехин; (3) - пирокатехин; (4) - пирогаллол; (5) - 4-хлорпирокатехин; (6) - 3-хлорпирокатехин; (7) - 4,5-дихлорпирокатехин; (8) - 3,5-дихлорпирокатехин; (9) - 2,3-дигидроксибензойная кислота; (10) - протокатеховая кислота; (11) - 3,4,5,6-тетрахлорпирокатехин; (12) -пздроксштщрохинон.

Прямая зависимость скорости расщепления ферментами замещенных пирокатехинов от заряда кислорода первой реакционной группы (Рис. б) указывает на основную роль первой реакционной группы субстратов в каталитическом процессе.

-0,28 -0,27 -OJ6 -0,25 -0,24 -ОД? -0,22 -0,21 -0,2« -0,27 -0,2« -0,25 -0,24 -0,23 -0,22 -0,21

заряд 0--С1 заряд 0"-С1

Рис. 6. Влияние величины заряда депротонированного кислородного атома при С1-атоме бензольного кольца аналогов пирокатехина на скорость расщепления субстрата 4-ХПК 1,2-ДО (А) и 3-ХПК 1,2-ДО (Б): (1)- 4-метилпирокатехин; (2) - З-метилпирокатехин; (3) -пирокатехин; (4) - пирогаллол; (5) - 4-хлорпирокатехин; (6) - 3-хлорпирокатехин; (7) - 4,5-дихлорпирокатехин; (8) - 3,5-дихлорпирокатехин; (9) - 2,3-дигияроксибензойная кислота; (10) - протокатеховая кислота; (11) - 3,4,5,6-тетрахлорпирокатехин; (12) -гидроксигидрохинон.

Согласно рассмотренной ранее реакционной способности субстратов, скорость их расщепления хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназами снижалась в ряду с некоторым отклонением: метилпирокатехины, пирокатехин, пирогаллол, хлорпиро кате хины, соединения с карбоксильным заместителем в ароматическом кольце и гидроксигидрохинон.

Таким образом, не все кинетические свойства хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ легко объясняются структурными свойствами субстратов и их аналогов. Обратимся непосредственно к структуре активных центров ферментов.

Связь структуры активных центров хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ и других интрадиольных диоксигеназ известной структуры с их функцией. В первую очередь следует обратить внимание на поверхность входа в активный центр хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, который является гидрофобным и образован: у 4-ХПК 1,2-ДО остатками Leu49, Phe78, Ilel71, Рго172 и боковыми остовамии Туг134 и Туг169; у 3-ХПК 1,2-ДО остатками Leu49, Туг78, Пе169, Рго170, Туг167 и боковым скелетом Туг133. Рассмотренные структуры очень близки с входом в активный центр пирокатехин 1,2-диоксигеназы (ПК 1,2-ДО) из Acinetobacter sp. ADP1, ограниченный остатками Leu73, Рго203, Туг200 и боковым скелетом Туг164. Подобные структуры могут участвовать в дополнительном привлечении субстратов, чье бензольное кольцо несет гидрофобные хлор- и метил-замесгители. Напротив ферменты, высокоизбирательные к субстратам, содержащим гидрокси- и карбокси-заместители в ароматическом кольце (т.е. гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназа (ГТХ 1,2-ДО) из Nocardioides simplex ЗЕ и протокатехат 3,4-диоксигеназа (ПКК 3,4-ДО) из Acinetobacter sp. ADP1) имеют более гидрофильные входы в активные центры, особенно протокатехат 3,4-диоксигеназа. Так ГТХ 1,2-ДО имеет два входа в полость активного центра. Один из них - гидрофобный и идентичный входу 4-ХПК 1,2-ДО сформирован остатками Leu80, Phelll, Ilel99, Рго200 и боковым остовом Туг197. Другой - более заряженный, образован остатками Asp83, Arg75, Glyl09, ProlIO, Phel08. Вход в активный центр ПКК 3,4-ДО сильно заряжен и образован остатками Argl33, Arg450, Туг 16, боковой остов Туг447 и Рго15.

Теперь на примере 4-ХПК 1,2-ДО рассмотрим полость активного центра, которая представляет собой карман (Рис. 7а), состоящий из основания, заполненного координационной сферой железа, над которым возвышается полый купол, способный вмещать молекулу субстрата или его аналога. Стенки купола параллельные плоскости ароматического кольца формируют консервативные для всех интрадиольных диоксигеназ остатки пролина и аргинина, участвующие в позиционировании субстрата. Вершину полости (Рис. 76) образуют Asp52 и А1а53, которые находятся в области С4 атома кольца субстратного аналога. Предполагается, что со стороны СЗ-атома стенку полости формируют 11е74 и Cys224 (Рис. 7в). Такая гипотеза основывается на данных рентгеноструктурного анализа субстрат-ферментных и ингибитор-ферментных комплексов протокатехат 3,4-диоксигеназы и пирокатехин 1,2-диоксигеназы (Orville et al., 1997; Frazee et al., 1998; Vetting and Ohlendorf, 2000), согласно которым исследованные субстраты и ингибиторы позиционируются в активных центрах ферментов так, что СЗ-С4-заместители в бензольном кольце всегда ориентированы во внутрь полости активного центра. С противоположной стороны субстратного аналога в полости

Рис. 7. Форма активного центра 4-ХПК 1,2-ДО (а) и виды его молекулярной поверхности, образованной аминокислотными остатками с различных сторон: (б) - свод полости над С4 атомом бензольного кольца, (в) - боковая стенка полости напротив СЗ-атома бензольного кольца, (г) - стенка полости, примыкающая к Сб атому бензольного кольца.

4-ХПК 1,2-ДО к Сб-атому ароматического кольца примыкает Phe78 и частично Рго77 (Рис. 7г).

При наложении структур активных центров исследуемых хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ оказалось, что Asp52 консервативен для обоих ферментов и смещен в сторону от С4-атома (Рис. 8а). Однако СЗ-С4-область активного центра 3-ХПК 1,2-ДО образована более гидрофобными остатками - Va153 и А1а221, чем аналогичная структура у 4-ХПК 1,2-ДО, образованная А1а53 и Cys224. Это совпадает с ранее изложенными кинетическими свойствами.

В Сб-области активного центра 3-ХПК 1,2-ДО находится более гидрофильный остаток Туг78, чем Phe78 у 4-ХПК 1,2-ДО (Рис. 86), что может объяснить конфликт данной структуры 3-ХПК 1,2-ДО с хлорзамещенными фенолами в положении 6 ароматического кольца.

Ллч4.«П1ГиЯО» - -TJffiL- -ЯЧВЧИПИПда! МАМ»

ЛЫ2Ц1-ХПК 1J ДО)

Рис. 8. Наложение структур активных центров 4-ХПК 1.2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО. В центре активного центра 4-ХПК 1,2-ДО молекула бензоата обозначена ВЕХ, молекула бензогидроксамата 3-ХПК 1,2-ДО - ВНА. ИЗ - атом железа в активных центрах ферментов.

Но почему же молекула пирокатехина, имеющая в этом положении хлор не встречает конфликта в молекуле 3-ХПК 1,2-ДО. В работе (От11е й а1., 1997) показано, что молекула конкурентного ингибитора, имеющая только одну реакционную гидрокси-группу, связывается посредством кислородного атома

последней с железом, в то время как молекула пирокатехина хелатирует железо кислородами двух смежных гидроксильных групп. В нашем случае в комплексе фермент-субстратный аналог молекула замещенного фенола, будучи конкурентным ингибитором, может связаться с железом активного центра только посредством кислорода единственной гидроксильной группы при С1-атоме ароматического кольца (Рис. 9). Образование же второй связи железа с кислородом смежной гидрокси-группы пирокатехина вероятно приводит к небольшому повороту ароматического кольца субстрата относительно внутренней поверхности активного центра так, что Сб-атом субстрата оказывается смещенным. Вследствие этого, ранее существующий конфликт гидроксильной группы Туг78 активного центра 3-ХПК 1,2-ДО с хлорным заместителем в положении С6 ароматического кольца фенола исчезает при связывании активного центра с аналогично замещенным хлорпирокатехином, в связи с их пространственным разобщением.

Проведенный сравнительный структурно-функциональный анализ активных центров 4-ХПК 1,2-ДО и интрадиольных диоксигеназ известной структуры (Рис. 10) показал, что у ГГХ 1,2-ДО из Nocardioides simplex ЗЕ в С4-области активного центра находится похожая ветка Asp83-Val84, но смещена в сторону таким образом, что непосредственно над С4-заместителем находится заряженный остаток Asp83, в то время как у 4-ХПК 1,2-ДО в этом месте позиционируется гидрофобный А1а53 (Рис. 10а). Возможно, наличие именно аспартата позволяет ГГХ 1,2-ДО дополнительно удерживать свой субстрат, содержащий гидроксильный заместитель в этом положении. Неисключено, что присутствие Asp52 в С4-области активных центров 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО позволяет им связывать и расщеплять гидроксигидрохинон. Но происходит это значительно слабее, чем у ГГХ 1,2-ДО, что возможно связано с частичным смещением Asp52 в полости хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ относительно ароматического кольца субстратного аналога.

Чтобы удержать протокатеховую кислоту, несущую более заряженный карбоксильный заместитель, ПКК 3,4-ДО требуется наличие дополнительных гидрофильных остатков в С4-области активного центра, таких как Argl33, Thr326 и Туг324, которые образуют сложную сеть водородных связей с карбоксилом (Рис. 106).

внутренняя поверхность активного центр«

Рис. 9. Предполагаемая ориентация в полости активного центра хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы из R. opacus 1СР молекул фенола и пирокатехина, замешенных в Сб-положеняи.

✓ Ч

Как известно, пирокатехин 1,2-диоксигеназы более избирательны к незамещенному пирокатехину. Возможно поэтому над С4-атомом пирокатехина в активном центре ПК 1,2-ДО из АстегоЬа^ег ер. АОР1 находится жесткая гидрофобная структура Рго76, препятствующая правильному позиционированию пирокатехинов, содержащих заместитель в этом положении (Рис. 10в).

Рис. 10. Наложение структур С4-областей активных центров 4-ХПК 1,2-ДО ишрадиольяых диоксигеназ известной структуры: а - ГГХ 1,2-ДО из Nocardioides simplex ЗЕ, б - ПКК 3,4-ДО из Acinetobacter sp. ADP1 и в - ПК 1,2-ДО из Acinetobacter sp. ADP1. Черным цветом выделены аминокислотные остатки, принадлежащие 4-ХПК 1,2-ДО, темно-серым - сравниваемого фермента. Атомы железа активных центров сравниваемых ферментов обозначены сферами.

Несмотря на явную взаимосвязь структуры и функции исследуемых ферментов, все же остается немало неразрешенных вопросов. Следует отметить, что кроме непосредственного участия структур субстратов и активных центров немаловажным в функционировании ферментов может оказаться ряд других факторов, таких как льюисовская кислотность железа координационной сферы, которая, как показано пока только на искусственных железо-лигандных комплексах (Costas et al., 2004), напрямую влияет на скорость расщепления субстратов, а также ориентация субстрата в полости активного центра в процессе

связывания и последующие конформационные изменения всего образуемого

комплекса.

Выводы

1. Получены гомогенные препараты 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы (4-ХПК 1,2-ДО) и 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы (3-ХПК 1,2-ДО) из клеток штамма R. opacus 1СР, утилизирующего 4-хлор- и 2-хлорфенолы в качестве единственных источников углерода и энергии соответственно. Ферменты были пригодны для последующей кристаллизации и проведения рентгеноструктурного анализа.

2. Впервые получены правильные кристаллы 4-ХПК 1,2-ДО- и 3-ХПК 1,2-ДО, дающие дифракцию рентгеновского излучения и позволяющие провести рентгеноструктурный анализ с целью разрешения пространственной структуры ферментов.

3. Детальный сравнительный анализ кинетических свойств ХПК 1,2-ДО позволил выявить различия в их избирательности к субстратным аналогам, имеющим заместитель в мета- или пара- положении ароматического кольца. Показана ббльшая гидрофобность области активного центра 3-ХПК 1,2-ДО, соответствующей мета- и пара-заместителю в молекуле субстратного аналога, по сравнению с 4-ХПК 1,2-ДО.

4. На основе кинетических свойств ХПК 1,2-ДО и структурных свойств субстратных аналогов показано, что связывание последних в активном центре фермента определяется характером взаимодействия, образующегося между заместителем в молекуле субстратного аналога и внутренней поверхностью активного центра. Основная роль в осуществлении каталитического процесса принадлежит первой гидроксильной группе субстратного аналога. Расчет величин зарядов на кислородных атомах реакционных гидроксильных групп позволил определить направленность процесса депротонирования последних и объяснить последовательность связывания субстрата с железом в активном центре интрадиольных диоксигеназ.

5. Впервые расшифрованы трехмерные структуры 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО. Координаты атомов молекулярных структур ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1СР размещены в электронной базе данных (Protein Data Bank) под идентификационными номерами: ls9a и 2Ьоу.

6. Сравнительный структурно-функциональный анализ изученных хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ и интрадиольных диоксигеназ известной структуры показал, что различия в их субстратной специфичности вызваны изменениями в аминокислотном составе внутренней поверхности активных центров ферментов и их входов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор приносит искреннюю благодарность Марте Феррарони (Dipartimento di

Chimica, University di Firenze) за помощь в кристаллизации 4-хлор- и 3-

хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ и расшифровку их трехмерных структур.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Ferraroni М., Ruiz Tarifa M.Y., Briganti F., Scozzafava A., Mangani S., Solyanikova I.P., Kolomytseva M.P., Golovleva L. 2002. 4-Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from the chlorophenol-utilizing gram-positive Rhodococcus opacus 1CP: crystallization and preliminary crystallographic analysis. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., V.58, pp. 1074-1076.

2. Ferraroni M., Ruiz Tarifa M.Y., Scozzafava A., Solyanikova I.P., Kolomytseva M.P., Golovleva L., Briganti F. 2003. Preliminary crystallographic analysis of 3-chlorocatechol 1,2-dioxygenase of a new modified ortho-pathway from the Grampositive Rhodococcus opacus 1CP grown on 2-chlorophenol. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., V.59, pp. 188-190.

3. Solyanikova I.S., Moiseeva O.M., Boeren S., Boersma M.G., Kolomytseva M.P., Vervoort J., Rietjens I.M.C.M., van Berkel W.J., L.A. Golovleva. 2003. Conversion of 2-fluoromuconate to cis-dienelactone by purified enzymes of Rhodococcus opacus 1CP. Appl. Environ. Microbiol., V.69, pp. 5636-5642.

4. Ferraroni M., Solyanikova I.P., Kolomytseva M.P., Scozzafava A., Golovleva L.A., Briganti F. 2004. Crystal structure of 4-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from the chlorophenol-utilizing gram-positive Rhodococcus opacus 1CP. J. Biol. Chem., V.279, N26, pp. 27646-27655.

5. Коломыцева М.П. Сравнительная характеристика хлорпирокатехаз модифицированного и нового модифицированного орто-путей у Rhodococcus opacus 1СР. Биология - наука XXI века. Сб. тез. VI-й Путинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 20-24 мая 2002, стр.259.

6. Коломыцева М.П., Соляникова И.П., Головлева JI.A. Изофункциональные диоксигеназы Rhodococcus opacus 1СР: структурно-функциональные свойства. Биология - наука XXI века. Сб.тез. VII-й Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 14-18 апреля, 2003, стр.343.

7. Solyanikova I., Kolomytseva М., Ferraroni М., Scozzafava A., Briganti F., Golovleva L.. Chlorocatechol 1,2-dioxygenases from Rhodococcus opacus 1CP: kinetic and structural aspects. Oxizymes in Naples. 2nd European meeting. June 3-5, 2004, p. 23.

8. Головлева JI.A., Травкин B.M., Соляникова И.П., Коломыцева М.П., Феррарони М., Бриганти Ф. Биодеградеградация хлорфенолов и хлорфеноксиалкановых гербицидов: биохимические, генетические и структурные аспекты. "Проблемы деструкции техногенных загрязнителей окружающей среды", Материалы международной конференции, Саратов, 1416 сентября, 2005, с. 4-5.

I- ~ ' 2 6 9

РНБ Русский фонд

2006-4 22896

Подписано в печать 26 октября 2005 г. Заказ 510. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коломыцева, Марина Павловна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Структурно-функциональные аспекты иитрадиольного расщепления ароматического кольца - ключевой реакции микробной деградации ароматических соединений.

1.1. Метаболические пути деградации ароматических соединений, ведущие к образованию ключевых иптермедиатов.

1.2. Пути разложения ключевых интермедиатов.

1.3. Генетические, физико-химические и структурные аспекты интрадиольных диоксигеназ.

1.3.1. Степень идентичности аминокислотных последовательностей.

1.3.2. Физико-химические свойства.

1.3.3. Структурные свойства.

1.3.3.1. Физические свойства кристаллов.

1.3.3.2. Архитектура молекул.

1.3.3.3. Координационная сфера Fe3+ активного центра.

1.3.3.4. Механизмы связывания и расщепления субстрата.

1.3.3.5. Взаимосвязь кинетических параметров и структуры ферментов. Характер взаимодействия субстратов и их аналогов с активным центром.

Экспериментальная часть

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Штамм, использованный в работе.

2.2. Культивирование штамма.

2.2.1. Состав сред.

2.2.2. Приготовление субстратов.

2.2.3. Проведение ферментаций и получение биомассы.

2.3. Выделение ферментов.

2.3.1. Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка.

2.3.2. Определение активности ферментов.

2.3.3. Очистка 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы.

2.3.4. Очистка 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы.

2.4. Определение кинетических характеристик ферментов.

2.5. Кристаллизация ферментов.

2.6. Рентгепоструктурный анализ.

2.6.1. Предварительный рентгеноструктурный анализ кристаллов ферментов.

2.6.2. Рентгеноструктурный анализ, проводимый для разрешения трехмерной структуры ферментов.

2.7. Методы структурного анализа.

2.7.1. Структурный анализ белковых молекул.

2.7.2. Структурный анализ молекул субстрата и его аналогов.

Глава 3. Результаты.

3.1. Очистка ферментов.

3.1.1. 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа.

3.1.2. 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа.

3.2. Кинетические свойства хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ.

3.2.1. Субстратная специфичность ферментов.

3.2.2. Ингибирование ферментов фенолом, его замещенными производными и бензоатом.

3.2.3. Структурные свойства субстратов и их аналогов.

3.2.4. Связь функционирования хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ с структурой субстратов и их аналогов.

3.2.4.1. Связывание замещенных фенолов ферментами.

3.2.4.2. Связывание замещенных пирокатехинов и его аналогов ферментами.

3.2.4.3. Катализ замещенных субстратных аналогов.

3.2.4.4. Избирательность хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ в отношении заместителя в положении СЗ-С4 бензольного кольца субстрата.

3.4. Кристаллизация ферментов.

3.4.1. Получение кристаллов 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигепазы.

3.4.2. Получение кристаллов 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы.

3.5. Трехмерная структура молекул хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, связь структуры и функции.

3.5.1. Общая структура молекул.

3.5.2. Молекулярная поверхность входа в активный центр хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ в сравнении с подобными структурами интрадиольных диоксигеназ известной структуры.

3.5.3. Координационная сфера железа хлорпирокатехин 1,2диоксигеназ.

3.5.4. Форма и структура активных центров хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ.

3.5.5. Сравнительный анализ структуры активного центра 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы с структурами активных центров известных интрадиольных диоксигеназ.

3.5.5.1. Структуры активных центров, соответствующие С4-атому бензольного кольца субстрата или субстратного аналога.

3.5.5.2. Структуры активных центров, соответствующие СЗ-атому бензольного кольца субстрата или субстратного аналога.

3.5.5.3. Структуры активных центров, соответствующие Сб-атому бензольного кольца субстрата или субстратного аналога.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы Rhodococcus opacus 1CP: кинетические и структурные свойства"

Актуальность проблемы. Ароматические соединения содержатся в биосфере повсюду и имеют как природное, так и искусственное происхождение. Самым большим природным источником ароматических соединений служит растительный полимер -лигнин. Другим не менее масштабным источником ароматических соединений является хозяйственная и промышленная деятельность человека. Большинство ксенобиотиков, обладая высокой токсичностью, используются или образуются в процессе промышленного производства пластмасс, бумаги, смазочных материалов, охлаждающих жидкостей, взрывчатых веществ. В качестве загрязнителей окружающей среды также выступают гербициды, пестициды и инсектициды, применяемые в сельском хозяйстве. Основная нагрузка по разложению ароматических соединений в биосфере ложится па микроорганизмы, имеющие специфические пути деградации. В процессе биодеградации множество ароматических соединений превращаются в относительно небольшое количество интермедиатов, которые содержат две смежные гидроксильные группы в ароматическом кольце. Такие интермедиа™ в дальнейшем подвергаются ключевой реакции биодеградации, заключающейся в раскрытии ароматического кольца, которое осуществляется дециклизующими диоксигеназами. В этом случае, оба атома молекулярного кислорода посредством фермента включаются в субстрат с последующим его расщеплением. Такие реакции являются беспрецедентными в органической химии, и в настоящее время проявляется все больший интерес к структуре и механизмам действия дециклизующих диоксигеназ.

Состояние вопроса. На данный момент известны два типа дециклизующих диоксигеназ, различающихся по месту расщепления ароматического кольца -интрадиольные и экстрадиольные (Lipscomb and Orville, 1992; Lange and Que, 1998; Bugg, 2001, 2003). В зависимости от проявляемой ферментами специфической избирательности к тому или иному субстрату каждый тип подразделяется на группы. К интрадиольиым диоксигеназам относятся протокатехат 3,4-диоксигеназы, пирокатехин 1,2-диоксигеназы, хлорпирокатехии 1,2-диоксигеназы и гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы. В свою очередь экстрадиольные диоксигеназы делятся на пирокатехин 2,3-диоксигеназы, протокатехат 2,3-диоксигеназы, гомопротокатехат 2,3-диоксигеиазы, протокатехат 4,5-диоксигеназы и 2,3-дигидроксибифенил 1,2-диоксигеназы. Накоплены данные по физико-химическим свойствам ряда иптрадиольных и экстрадиольных диоксигеназ. Однако существуют единичные работы, посвященные структуре этих ферментов. Так расшифрованы трехмерные структуры лишь пяти экстрадиольных диоксигеназ: пирокатехин 2,3-диоксигеназы из Pseudomonas putida (Kita et al., 1999), протокатехат 4,5-диоксигеназы из Sphingomonas paucimobilis SYK-6 (Sugimoto et al., 1999), 2,3дигидроксибифенил 1,2-диоксигеназы из Psendomonas sp. (Uragami et al., 2001, Sato et al., 2002), и двух гомопротокатехат 2,3-диоксигеназ из Arthrobacter globiformis и Brevibacterium fuscum (Vetting et al., 2004). Для интрадиольных диоксигепаз к началу нашей работы были известны структуры только трех ферментов: двух протокатехат 3,4-диоксигеназ из Pseudomonas putida (Orville et al., 1997a) и из Acinelobacter sp. ADP1 (Vetting and Ohlendorf, 2000) и одной пирокатехин 1,2-диоксигепазы из Acinelobacter sp. ADP1 (Vetting et al., 2000). К 2005 году в совместной работе нашей лаборатории и Флорентийского университета была расшифрована трехмерная структура гидроксигидрохипон 1,2-диоксигеназы из Nocardioides simplex ЗЕ (Ferraroni ct al., 2005). Однако ни одной структуры хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ не было известно.

Ранее в нашей лаборатории был выделен активный штамм Rhodococcits opticus 1СР, разлагающий 2- и 4-хлорфенолы (Горлатов с соавт., 1989; Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт., 1999, 2001). Изучены пути биодеградации этих соединений и выделены ферменты, участвующие в этом процессе, клонированы и секвенированы опероны, кодирующие эти ферменты. Показано наличие разных интрадиольных 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, существенно отличающихся от ранее известных пирокатехин 1,2-диоксигеназ этого штамма (Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт., 2001). Неизвестными оставались причины функционального различия 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ между собой и отличия от других интрадиольных диоксигеназ известной структуры и функции. Ответить на этот вопрос стало возможным благодаря изучению трехмерной структуры данных ферментов и проведении структурно-функционального анализа.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получение гомогенных препаратов 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ.

2. Детальное изучение кинетических свойств ферментов.

3. Получение кристаллов 3-хлор- и 4-хлорпирокатехип 1,2-диоксигеназ, пригодных для проведения рентгеноструктурного анализа.

4. Расшифровка с помощью рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры ферментов.

5. Проведение сравнительного структурно-функционального анализа 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеиаз из штамма R. opacus 1СР параллельно с интрадиольными диоксигеназами известной структуры, с целью выяснения причин субстратной специфичности ферментов.

Научная новизна. Впервые закристаллизованы 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы среди известных хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. Впервые расшифрованы трехмерные структуры 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. Показано, что хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы являются гомодимерами, состоящими из двух каталитических доменов и одного связующего домена, представляющего гидрофобный тоннель, внутрь которого погружены с обеих сторон две молекулы фосфолипидов. В каждом каталитическом домене хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ содержится активный центр с трехвалентным железом, в координационной сфере которого найдена дополнительная структура: молекула бензоата у 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы и молекула бензогидроксамата в структуре 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеиазы. На основе кинетических свойств ферментов и структурных свойств субстратных аналогов показано, что связывание последних в активном центре фермента определяется характером взаимодействия, образующегося между заместителем в молекуле субстратного аналога и внутренней поверхностью активного центра. Установлена • прямая зависимость каталитического процесса от величины заряда на кислороде первой гидроксильной группы субстрата. Показано прямое соответствие рассчитанной последовательности депротонирования смежных гидроксильных групп субстрата с ранее известной последовательностью связывания субстрата с железом активного центра интрадиольных диоксигеназ. Проведенный сравнительный структурно-функциональный анализ хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ между собой, а также с интрадиольными диоксигеназами известной структуры показал, что различия в их субстратной специфичности вызваны соответствующими изменениями в аминокислотном составе активных центров ферментов и их входов.

Практическое значение работы. Полученные данные открывают широкое поле деятельности для белково-ипженерных работ с целью получения ферментов с высокой субстратной специфичностью и заданным спектром атакуемых субстратов. Это позволит оптимизировать процессы деградации ряда ксенобиотиков путем конструирования эффективных штаммов деструкторов методами генной инженерии, а также получать высокочувствительные биосенсорные пленки, используемые для тестирования пирокатехина и его производных в почве и сточных водах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Коломыцева, Марина Павловна

122 Выводы

1. Получены гомогенные препараты 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы (4-ХПК 1,2-ДО) и 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеиазы (3-ХПК 1,2-ДО) из клеток штамма R. opacus 1СР, утилизирующего 4-хлор- и 2-хлорфенолы в качестве единственных источников углерода и энергии соответственно. Ферменты были пригодны для последующей кристаллизации и проведения рентгеноструктурного анализа.

3. Детальный сравнительный анализ кинетических свойств ХПК 1,2-ДО позволил выявить различия в их избирательности к субстратным аналогам, имеющим заместитель в мета- или пара- положении ароматического кольца. Показана большая гидрофобность области активного центра 3-ХПК 1,2-ДО, соответствующей мета- и «ара-заместителю в молекуле субстратного аналога, по сравнению с 4-ХПК 1,2-ДО.

4. На основе кинетических свойств ХПК 1,2-ДО и структурных свойств субстратных аналогов показано, что связывание последних в активном центре фермента определяется характером взаимодействия, образующегося между заместителем в молекуле субстратного аналога и внутренней поверхностью активного центра. Основная роль в осуществлении каталитического процесса принадлежит первой гидроксильной группе субстратного аналога. Расчет величин зарядов на кислородных атомах реакционных гидроксильных групп позволил определить направленность процесса депротонировапия последних и объяснить последовательность связывания субстрата с железом в активном центре интрадиольных диоксигеназ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коломыцева, Марина Павловна, Пущино

1. Бландел Т., Джонсон JI. 1979. Кристаллография белка. Под ред. Стручкова Ю.Т., пер. с англ. Шкловера В.Е., Мир, Москва, с. 620.

2. Головлева JI.A., Катаева И.А., Ильченко В.Ю., Беляева Р.Х. 1983. Диоксигеназы пирокатехина у Pseudomonas aerugenosa 2х: обнаружение изофункциональных белков. Биохимия, Т.48, вып.4, сс. 463-532.

3. Горлатов С.Н., Мальцева О.В., Шевченко В.И., Головлева JI.A. 1989. Разложение хлорфенолов культурой Rhodococcus erythropolis. Микробиология, Т.58, сс. 802806.

4. Дьюар М., Догерти Р. 1977. Теория возмущений молекулярных орбиталей в органической химии. Под ред. Яновской JI.A., пер. с англ. Руденко Б.А., Серебрякова Э.П., Чижова О.С., Москва, Изд-во Мир, с. 695.

5. Мальцева О.В., Соляникова И.П., Головлева JI.A. 1991. Пирокатехазы штамма Rhodococcus erythropolis деструктора хлорфенолов: очистка и свойства. Биохимия, Т.56, вып. 12, сс. 2188-2197.

6. Маррел Дж., Кеттл С., Теддер Дж. 1980. Химическая связь, Москва, Изд-во Мир, с. 387.

7. Моисеева О.В., Линько Е.В., Баскунов Б.П., Головлева JI.A. 1999. Деградация 2-хлорфенола и 3-хлорбензоата Rhodococcus opacus 1СР. Микробиология, Т.68, вып.4, сс. 461-466.

8. Моисеева О.В., Белова О.В., Соляникова И.П., Шлеманп М., Головлева JI.A. 2001. Ферменты нового модифицированного орто-иут Rhodococcus opacus 1СР. Биохимия, Т.66, вып.5, сс.678-686.

9. Соляникова И.П., Мальцева О.В., Головлева JI.A. 1992. Очистка и свойства пирокатехазы II из штамма Pseudomonas putida 87. Биохимия, Т.57, вып. 12, сс. 1883-1891.

10. Степанов Н.Ф., Пупышев В.И. 1991. Квантовая механика молекул и квантовая химия. М., Изд-во МГУ, с. 384.

11. Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Карасевич Ю.Н. 1986. Метаболизм хлорированных анилинов Pseudomonas diminuta. Микробиология, Т.55, сс.591-595.

12. Зайцев Г.М., Карасевич Ю.Н. 1985. Подготовительный метаболизм 4-хлорбензойной и 2,4-дихлорбензойной кислот у Corynebacterium sepedonicum. Микробиология, Т.54, вып.З, сс. 356-359.

13. Adachi К., Iwabuchi Т., Sano Н, Harayama S. 1999. Structure of the ring cleavagevproduct of l-hydroxy-2-naphthoate, an intermediate of the phenanthrene-degradative pathway of Nocardioides sp. strain KP7. J. Bacterid., V. 181, pp. 757-763.

14. An H.-R., Park H.-J., Kim E.-S. 2001. Cloning and expression of thermophilic catechol 1,2-dioxygenase gene (catA) from Streptomyces setonii. FEMS Microbiol. Lett., V.195, pp. 17-22.

15. Anderson J.J., Dagley S. 1980. Catabolism of aromatic acids in Trichosporon cutaneum. J. Bacterid., V. 141, pp. 534-543.

16. Aoki K., Konohana Т., Shinke R., Nishira H. 1984a. Two catechol 1,2-dioxygenases from an aniline-assimilating bacterium, Frateuria speshies ANA-18. Agric. Biol. Chem., V.48, N8, pp. 2097-2104.

17. Aoki, K., Ohtsuka K., Shinke R., Nishina H. 1984b. Rapid biodegradation of aniline by Frateuria species ANA-18 and its aniline metabolism. Agric. Biol. Chem., V.48, pp. 865-872.

18. Aoki K., Konohana Т., Shinke R., Nishira H. 1984c. Purification and characterization of catechol 1,2-dioxygenase from aniline-assimilating Rhodococcus erythropolis AN-13. Agric. Biol. Chem., V.48, N8, pp. 2087-2095.

19. Apajalachti J.A., Salkinoja-Salonen M.S. 1986. Degradation of polychlorinated phenols by Rhodococcus chlorophenolicus. Appl. Microbiol. Biotechnol., V.25, pp. 62-67.

20. Apajalachti J.A. 1987a. Chlorophenol metabolism of a polychlorophenol degrader, Rhodococcus chlorophenolicus sp. PhD Thesis, Department of General Microbiology, University of Helsinki, Finland.

21. Apajalachti J.A., Salkinoja-Salonen M.S. 1987b. Complete degradation of tetrachlorohydroquinone by cell extracts of pentachlorophenol-induced Rhodococcus chlorophenolicus. J. Bacteriol., V.169, pp. 5125-5130.

22. Apajalachti J.A., Salkinoja-Salonen M.S. 1987c. Dechlorination and para-hydroxylation of polychlorinated phenols by Rhodococcus chlorophenolicus. J. Bacteriol., V.169, pp. 675-681.

23. Arciero D.M., Lipscomb J.D., Huynh B.H., Kent T.A., Munck E. 1983. EPR and Mossbauer studies of protocatechuate 4,5-dioxygenase. Characterization of a new Fe environment. J. Biol. Chem., V.258, N24, pp. 14981-14991.

24. Armstrong S.M., Patel T.R. 1993. 1,3,5-trihydroxybenzene biodegradation by Rhodococcus sp. PPG-8. Can. J. Microbiol., V.39, pp. 175-179.

25. Armstrong S.M., Patel T.R. 1994. Microbial degradation of phloroglucinol and other polyphenolic compounds. J. Basic. Microbiol., V.34, N2, pp. 123-135.

26. Bachofer R., Lingens F. 1975. Conversion of aniline into pyrocatechol by a Nocardia sp.: incorporation of oxygen-18. FFEBS Lett., V.50, pp. 288-290.

27. Bayly R.C., Wigmore G.J. 1973. Metabolism of phenol and cresols by mutants of Pseudomonasputida. J. Bacteriol., V.l 13, pp. 1112-1120.

28. Bertini I., Briganti F., Mangani S., Nolting H.F., Scozzafava A. 1995. Biophysical investigation of bacterial aromatic extradiol dioxygenases involved in biodegradation processes. Coordination Chemistry Reviews, V.144, pp. 321-345.

29. Bollag J.M., Helling C.S., Alexander M. 1968. 2,4-D metabolism. Enzymatic hydroxylation of chlorinated phenols. J. Agr. Food. Chem., V.16, pp. 826-828.

30. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem., V.72, pp. 248-254.

31. Briganti F., Pessione E., Guinta C., Scozzafava A. 1997. Purification, biochemical properties and substrate specificity of a catechol 1,2-dioxygenase from a phenol degrading Acinetobacter radioresistens. FEBS Lett., V.416, pp. 61-64.

32. Briganti F., Pessione E., Guinta C., Mazzolini R., Scozzafava A. 2000. Purification and catalitic properties of two catechol 1,2-dioxygenase isozymes from benzoate-grown cells of Acinetobacter radioresistens. J. Protein Chem., V. 9, N8, pp. 709-716.

33. Broderick J.В., Halloran V.O. 1991. Overproduction, purification and characterization of chlorocatechol dioxygenase, a non-heme iron dioxygenase with abroad substrate tolerance. Biochemystry, V.30, pp. 7349-7358.

34. Brown C.K., Vetting M.W., Earhart C.A., Ohiendorf D.H. 2004. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase. Annu. Rev. Microbiol., V.58, pp. 555-585.

35. Buchan A., Collier L.S., Neidle E.L., Moran M.A. 2000. Key aromatic-ring-cleaving enzyme, protocatechuate 3,4-dioxygenase, in the ecologically important marine Roseobacter lineage. Appl. Environ. Microbiol., V.66, N11, pp. 4662-4672.

36. Bugg T.D.H. 2001. Oxygenases: mechanisms and structural motifs for О г activation. Curr. Opin. Chem. Biol., V.5, pp. 550-555.44

Информация о работе

Коломыцева, Марина Павловна
кандидата биологических наук
Пущино, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы Rhodococcus opacus 1CP: кинетические и структурные свойства - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы