Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Парагидроксибензоат гидроксилазы Rhodococcus: кинетические и спектральные свойства

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жадан, Андрей Петрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ПАРАГИДРОКСИБЕНЗОАТ-З-ГИДРОКСИЛАЗЫ -ПРЕДСТАВИТЕЛИ ФЛАВИНОВЫХ МОНООКСИГЕНАЗ.

2.1 Общая информация.

2.2 и-Гидроксибензоат-З-гидроксилазы [КФ 1.14.13.2].

2.3 Функция ферментов.

2.4 Основные каталитические свойства ПГБГ.

2.5 Механизм реакции катализируемой и-гидроксибензоат-3-гидроксилазами.

2.6 Восстановительная часть каталитического цикла.

2.7 Окислительная часть каталитического цикла.

2.8 Ингибирование.

2.9 Изменение конформации флавина в ходе катализа.

2.10 Структура и-гидроксибензоат-3-гидроксил аз.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1 Реактивы и материалы.

3.2 Штаммы.

3.3 Условия культивирования.

3.4 Очистка ферментов.

3.4.1 Очистка и-гидроксибензоат-3 -гидроксилаз.

3.4.2 Очистка протокатехоат-3,4-диоксигеназ.

3.5 Аналитические методы.

3.5.1 Измерение активности ферментов.

3.5.2 Определение стехиометрии реакции.

3.5.3 Получение апофермента и определениие Кт¥АТ>.

3.5.4 Определение рН зависимой стабильности ферментов.

3.5.5 Электрофорез и электроблоттинг.

3.5.6 Аналитическая гель-фильтрация.

3.5.7 Спектральные измерения.

3.5.8 Определение коэффициента молярной экстинкции при 450 нм.

3.5.9 Спектральные изменения при связывании субстрата.

3.5.10 Определение спектров флуоресценции свободного фермента и ферментсубстратных комплексов с ПГБ и его производными.

3.5.11 Определение констант диссоциаций производных ПГБ с ферментом.

3.5.12 Анализ продуктов методом ВЭЖХ.

3.5.13 Анализ продуктов методом Р19-ЯМР.

3.5.14 Расщепление ПГБГ трипсином.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Выбор микроорганизмов.

4.2 Выращивание биомассы для выделения ферментов.

4.3 Выделение w-гидроксибензоат гидроксилаз.

4.4 Выделение и свойства протокатехоат диоксигеназы из R. rhodnii 135.

4.5 Молекулярная масса и гидродинамические свойства и-гидроксибензоат гидроксилаз.

4.6 Стабильность и-гидроксибензоат гидроксилаз.

4.7 Кинетические свойства и-гидроксибензоат гидроксилаз с естественными субстратами.

4.8 Ингибирование ферментов.

4.9 Спектры нативных ферментов.

4.10 Выбор ферментов для дальнейшего изучения.

4.11 Спектральные свойства ферментов и фермент-субстратных комплексов ПГБГ из Rhodococcus opacus 557 и Rhodococcus rhodnii 135.

4.11.1 Спектры поглощения свободных ферментов.

4.11.2 Спектры поглощения при связывании естественного субстрата (ПГБ) с ферментами.

4.11.3 Изменения спектров поглощения при связывании замещенных ПГБ.

4.11.4 Зависимость конформации флавина в фермент-субстратном комплексе от рН.

4.11.5 Флуоресцентные свойства ферментов.

4.11.6 Связывание замещенных парагидроксибензоатов ПГБГ из Rhodococcus opacus 557 и Rhodococcus rhodnii 135.

4.12 Субстратная специфичность ПГБГ из Rhodococcus opacus 557 и Rhodococcus rhodnii 135.

4.13 Региоспецифичность гидроксилирования замещенных ПГБ ферментами из Rhodococcus opacus 557 и Rhodococcus rhodnii 135.

4.13.1 Региоспецифичность гидроксилирования дигидроксибензоатов.

4.13.2 Региоспецифичность гидроксилирования монохлорзамещенных ПГБ.

4.13.3 Региоспецифичность гидроксилирования монофторзамещенных ПГБ.

4.13.4 Региоспецифичность гидроксилирования тетрафторпарагидроксибензоата.

4.14 Анализ N-концевых последовательностей ферментов.

4.15 Действие трипсина на ПГБГ из Rhodococcus opacus 557 и Rhodococcus rhodnii 135.

5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6 ВЫВОДЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Жадан, Андрей Петрович

6 Выводы.

1. Из шести грам-положительных штаммов рот Rhodococcus, интенсивно растущих на 4-гидроксибензоате в качестве единственного источника углерода, выделены, очищены и охарактеризованы парагидроксибензоат-3-гидроксилазы. Все ферменты являются гомодимерами с массой 95 кДа и содержат нековалентно связанный FAD в качестве простетической группы.

2. По каталитическим свойствам выделенные ферменты имели значительные отличия от ферментов этого семейства, описанных ранее. Оптимум активности ферментов сдвинут ближе к нейтральной области рН. У ПГБГ из Rhodococcus кажущиеся константы Михаэлиса для естественного субстрата наименьшие среди ферментов этой группы, причем они на порядок меньше, чем у ферментов, способных использовать NADH в качестве восстановителя. Все ферменты способны использовать как NADH, так и NADPH, причем первый с немного большим предпочтением.

3. Исследованные ферменты, также как и другие ПГБГ, ингибируются моновалентными анионами, однако имеют тенденцию к усилению субстратного ингибирования в присутствии ионов хлора. Данная способность отмечена для пяти из шести выделенных ферментов. Мы предполагаем, что связывание хлорид иона в активном центре приводит к стабилизации С4-гидроксифлавинового интермедиата с субстратом (окислительная часть каталитического цикла).

4. В отличие от ПГБГ из Pseudomonas, ферменты, выделенные нами, способны эффективно дефторировать З-Р-ПГБ. Кроме того, впервые было показано, что ПГБГ из Rhodococcus способны осуществлять гидроксилирование 3-С1-ПГБ с замещением атома хлора, что доказывает принципиальную возможность дегалогенирования хлорпроизводных субстрата данным типом ферментов.

5. Изменения в конформации флавина в активном центре фермента при связывании с субстратом и его замещенными производными не соответствуют изменениям, наблюдаемым для ферментов из Pseudomonas fluorescens и Pseudomonas aeruginosa. Следовательно, последовательность событий в восстановительной части каталитического цикла для ПГБГ из Rhodococcus отличается от таковой для ферментов из Pseudomonas.

6. Основываясь на полученных кинетических и спектральных свойствах выделенных ферментов, а также их субстратной специфичности и региоселективности гидроксилирования замещенных ПГБ, мы полагаем, что строение активного центра ПГБГ из грам-положительных бактерий рода Rhodococcus отличается от строения активного центра ПГБГ ПГБГ из грам-отрицательных бактерий рода Pseudomonas.

7. Сравнение N-концевых последовательностей ферментов, а также анализ фрагментов, полученных при протеолизе ПГБГ из R. opacus 557, позволяет предположить, что несмотря на различия в строении активного центра, организация третичной структуры ПГБГ из Rhodococcus opacus 557, подобна третичной структуре ферментов из Pseudomonas.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жадан, Андрей Петрович, Пущино

1. Головлев, Е. JI. Биохимия сапрофитных микобактерий. 1983. ИБФМ, РАН. диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук.

2. Anderson J.J. andDagley,S. (1980) Catabolism of aromatic acids in Trichosporon cutaneum. J. Bacteriol. 141, 534-543.

3. Bardsle, W. G. SimFit. 5.x. 2002. A package for simulation, curve fitting, statistical analysis and graph plotting,URL: http://www.simfit.man. ac.uk

4. Beadle,C.A. and Smith,A.R. (1982) The purification and properties of 2,4-dichlorophenol hydroxylase from a strain of Acinetobacter species. Eur. J. Biochem. 123, 323-332.

5. Bellamacina,C.R. (1996) The nicotinamide dinucleotide binding motif: a comparison of nucleotide binding proteins. FASEB J. 10, 1257-1269.

6. Boersma,M.G., Solyanikova,I., van Berkel,W.J., Vervoort,J., Golovleva,L. and Rietjens,I.M. (2001) ,9F NMR metabolomics for the elucidation of microbial degradation pathways of fluorophenols. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 26, 22-34.

7. Bull,C. and Ballou,D.P. (1981) Purification and properties of protocatechuate 3,4-dioxygenase from Pseudomonasputida. A new iron to subunit stoichiometry. J. Biol. Chem. 256, 1267312680.

8. Detmer,K. and Massey, V. (1984) Effect of monovalent anions on the mechanism of phenol hydroxylase. J Biol. Chem. 259, 11265-11272.

9. DiMarco,A.A., Averhoff,B.A., Kim,E.E. and Ornston,L.N. (1993) Evolutionary divergence of pobA, the structural gene encodingp-hydroxybenzoate hydroxylase in an Acinetobacter calcoaceticus strain well-suited for genetic analysis. Gene 125,25-33.

10. Entsch,B. and Ballou,D.P. (1989) Purification, properties and oxygen reactivity ofp-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas aerugenosa. Biochim Biophys Acta 999, 313322.

11. Entsch,B., Ballou,D.P., Husain,M. and Massey,V. (1976a) Catalytic mechanism ofp-hydroxybenzoate hydroxylase with p-mercaptobenzoate as substrate. J Biol Chem 251, 73647369.

12. Entsch,B., Ballou,D.P. and Massey,V. (1976b) Flavin-Oxygen derivatives Involved in Hydroxylation by p-Hydroxybenzoate Hydroxylase. J Biol Chem 251, 2550-2563.

13. Entsch,B., Nan,Y., Weaich,K. and Scott,K.F. (1988) Sequence and organization of pobA, the gene coding for p-hydroxybenzoate hydroxylase, an inducible enzyme from Pseudomonas aeruginosa. Gene 71, 279-291.

14. Entsch,B. and van Berkel,W.J.H. (1995) Structure and mechanism ofpara-hydroxybenzoate hydroxylase. FASEB J 9,476-483.

15. Eppink,M.H.M., Bunthol,C., Schreuder,H.A. and van Berkel,W.J.H. (1999) Phel61 and Argl66 variants ofp-hydroxybenzoate hydroxylase. Implication for NAPH recognition and structural stability. FEBS Lett 443, 151-155.

16. EppinkJM.H.M., Schreuder,H.A. and van Berkel,W.J.H. (1995) Structure and function of mutant Arg441Lys of p-hydrohybenzoate hydroxylase. Implications for NADPH binding. Eur J Biochem 231, 157-165.

17. Eppink,M.H.M., Schreuder,H.A. and van Berkel,W.J.H. (1997b) Identification of a novel conserved sequence motif in flavoprotein hydroxylases with a putative dual function in FAD/NAD(P)H binding. Protein Sci 6, 2454-2458.

18. Eppink,M.H.M., Schreuder,H.A. and van Berkel,W.J.H. (1998b) Lys42 and Ser42 variants ofp-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens reveal that Arg42 essential for NADPH binding. Eur J Biochem 253,194-201.

19. Eschrich,K., van der Bolt,F.J.T., de Kok,A. and van Berkel,W.J.H. (1993a) Role of Tyr201 and Tyr385 in substrate activation byp-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluoprescens. Eur J Biochem 216, 137-146.

20. Eschrich,K., van der Bolt,F.J.T., de Kok,A. and van Berkel,W.J.H. (1993b) Role of Tyr201 and Tyr385 in substrate activation byp-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens. Eur J Biochem 216, 137-146.

21. Fernandez,J., DiMarco,A.A., Ornston,L.N. andHarayama,S. (1995) Purification and Characterisation of Acinetobacter calcoaceticus 4-hydroxybenzoate 3-hydroxylase after its overexpressions in Escherichia coli. J Biochem 117, 1261-1266.

22. Fraaije,M.W., van Berkel,W.J., Benen,J.A., Visser,J. and Mattevi,A. (1998) A novel oxidoreductase family sharing a conserved FAD-binding domain. Trends Biochem. Sci. 23, 206207.

23. Frederick,К.К., Ballou,D.P. and Palfey,B.A. (2001) Protein dynamics control proton transfers to the substrate on the His72Asn mutant ofp-hydroxybenzoate hydroxylase. Biochemistry 40, 3891-3899.

24. Fujii,T. and Kaneda,T. (1985) Purification and properties of NADH/NADPH-dependent p-hydrohybenzoate hydroxylase from Corinebacterium cyclohexanicum. Eur JBiochem 147, 97104.

25. Gatti,D.L., Entsch,В., Ballou,D.P. and Ludwig,M.L. (1996) pH-dependent structural changes in the active site of p-hydroxybenzoate hydroxylase point to the importance of proton and water movements during catalysis. Biochemistry 35, 567-578.

26. Gatti,D.L., Palfey,B.A., Lah,M.S., Entsch,В., Massey,V., Ballou,D.P. and Ludwig,M.L. (1994) The mobile flavin of 4-OH benzoate hydroxylase. Science 266,110-114.

27. Harwood,C.S. and Parales,R.E. (1996) The 6eta-ketoadipate pathwayand the biology of self-identity. An. Rev. Microbiol. 50, 553-590.

28. Higson,F.K. and Focht,D.D. (1989) Bacterial metabolism of hydroxylated biphenyls. Appl. Environ. Microbiol. 55, 946-952.

29. Hosokawa,K. and Stanier,R.Y. (1969) Crystallization and properties of/>-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas putida. J Biol Chem 241, 2453-2460.

30. Howell,L.G., Spector,T. and Massey,V. (1972) Purification and properties ofp-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens. J Biol Chem 247,4340-4350.

31. Husain,M., Entsch,В., Ballou,D.P., Massey,V. and Chapman,P.J. (1980) Fluoride elimination from substrates in hydroxylation reaction catalised by ^-hydroxybenzoate hydroxylase. J Biol Chem 255,4189-4197.

32. Husain,M. and Massey,V. (1979) Kinetic studies on the reaction of p-hydrox yb enzo ate hydroxylase. Agreement of steady state and rapid reaction data. J Biol Chem 254, 6657-6666.

33. Maeda-Yorita,K. and Massey,V. (1993) On the reaction mechanism of phenol hydroxylase. New information obtained by correlation of fluorescence and absorbance stopped flow studies. J. Biol. Chem. 268,4134-4144.

34. Massey,V. (1994) Activation of molecular oxigen by flavins and flavoproteins. J. Biol. Chem. 269,22459-22462.

35. Matsudaira,P. (1987) Sequence frompicomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. J. Biol. Chem. 262, 10035-10038.

36. Mewies,M., McIntire,W.S. and Scrutton,N.S. (1998) Covalent attachment of flavin adenine dinucleotide (FAD) and flavin mononucleotide (FMN) to enzymes: the current state of affairs. Protein Sci. 7, 7-20.

37. Moran,G.R., Entsch,B., Palfey,B.A. and Ballou,D.P. (1996) Evidence for flavin movement in the function of p-hydroxybenzoate hydroxylase from studies of the mutant Arg220Lys. Biochemistry 35,9278-9285.

38. Moran,G.R., Entsch,B., Palfey,B.A. and Ballou,D.P. (1999) Mechanistic insights into p-hydroxybenzoate hydroxylase from studies of the mutant Ser212Ala. Biochemistry 38, 62926299.

39. Muller, F. (1987) Flavine radicals: chemistry and biochemistry. In Free radical biology & Medicine, pp. 215-230. USA: Pergamon Journals.

40. Muller,F. and Berkel,W.J.H. (1982) A study on p-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas jluorescens. A convenient method of preparation and some properties of the apoenzyme. Eur. J. Biochem. 128, 21-27.

41. Muller,F., Berkel,W.J.H. and Steennis,PJ. (1983) On the inhibition ofp-hydroxybenzoate from Pseudomonas fluorescens by adenosine nucleotide and metal ion complexes. Biochem. International. 7, 115-122.

42. Muller, F. and van Berkel, W. J. H. (1991) Methods used to reversible resolve flavoproteins into the constuents apoflavoprotein andprostetic group. In Chemistry and Biochemistry of Flavoproteins ed. Muller,F. pp. 261-274. Boca Raton: CRC Press.

43. Nakamura,S., Ogura,Y., Yano,K., Higashi,N. and Arima,K. (1970) Kinetic studies on the reaction mechanism ofp-hydroxybenzoate hydroxylase. Biochemistry 9, 3235-3242.

44. Neujahr, H. (1991) Phenol hydroxylase. In Chemistry and Biochemistry of flavoenzymes. ed. Muller,F. pp. 65-85. Boca Raton: CRC Press.

45. Neujahr,H.Y. and Gaal,A. (1973) Phenol hydroxylase from yeast. Purification and properties of the enzyme from Trichosporon cutaneum. Eur. J. Biochem. 35, 386-400.

46. Ornston,L.N. and Stanier,R.Y. (1964) Mechanism of b-ketoadipate formation by bacteria. Nature 26, 1279-1283.

47. Palfey,B.A., Ballou,D.P. and Massey,V. (1997) Flavin conformational changes in the catalytic cycle ofp-hydroxybenzoate hydroxylase substituted with 6-azido- and 6-aminoflavin adenine dinucleotide. Biochemistry 36,15713-15723.

48. Palfey,B.A., Basu,R., Frederick, K.K., Entsch,B. and Ballou,D.P. (2002) Role of Protein Flexibility in the Catalytic Cycle ofp-Hydroxybenzoate Hydroxylase Elucidated by the Pro293Ser Mutant. Biochemistry 41, 8438-8446.

49. Palfey,B.A., Moran,G.R., Entsch,В., Ballou,D.P. andMassey,V. (1999) Substrate recognition by password inp-hydroxybenzoate hydroxylase. Biochemistry 38, 1153-1158.

50. Palfey,B-A., Murthy,Y.V. and Massey,V. (2003) Altered balance of half-reactions in p-hydroxybenzoate hydroxylase caused by substituting the 2-carbon of FAD with fluorine. J Biol. Chem. in press

51. Que,LJr. and Epstein,R.M. (1981) Resonance Raman studies on protocatechuate 3,4-dioxygenase- inhibitor complexes. Biochemistry 20, 2545-2549.

52. Ridder,L., Mulholland,A.J., Vervoort,J. and Rietjens,I.M.C.M. (1998) Correlation of Calculated Activation Energies with Experimental Rate Constants for an Enzyme Catalyzed Aromatic Hydroxylation. J. Am. Chem. Soc. 120, 7641-7642.

53. Rietjens,I.M., Soffers,A.E., Veeger,C. and Vervoort,J. (1993) Regioselectivity of cytochrome P-450 catalyzed hydroxylation of fluorobenzenes predicted by calculated frontier orbital substrate characteristics. Biochemistry 32, 4801-4812.

54. Rossmann,M.G., Moras,D. and 01sen,K.W. (1974) Chemical and biological evolution of nucleotide-binding protein. Nature 250,194-199.

55. Schopfer,L.M., Wessiak,A. and Massey,V. (1991) Interpretation of the spectra observed during oxidation of /7-hydroxybenzoate hydroxylase reconstituted with modified flavins. J Biol Chem 266, 13080-13085.

56. Schreuder,H.A., Hol,W.G. and DrenthJ. (1991) Analysis of the active site of the flavoprotein p-hydroxybenzoate hydroxylase and some ideas with respect to its reaction mechanism. Biochemistry 29, 3101 -3108.

57. Schreuder,H.A., van der LaanJ.M., Hol,W.G. and DrenthJ. (1988) Crystal structure ofp-hydroxybenzoate hydroxylase complexed with its reaction product 3,4-dihydroxybenzoate. JMol Biol 199, 637-648.

58. Schreuder,H.A., van der LaanJ.M., Swarte,M.B., Kalk,K.H., Hol,W.G. and DrenthJ. (1992) Crystal structure of the reduced form of p-hydroxybenzoate hydroxylase ined at 2.3 A resolution. Proteins 14,178-190.

59. Shoun,H., Arima,K. and Beppu,T. (1983) Inhibition ofp-hydroxybenzoate hydroxilase by anions: possible existence of two anion-binding sites in the site for reduced nicotineamide adenine dinucleotide phosphate. J Biochem 93, 169-176.

60. Shoun,H., Beppu,T. and Arima,K. (1979) On the stable enzyme-substrate complex ofp-hydroxybenzoate hydroxylase. Evidences for the proton uptake from the substrate. J Biol Chem 254, 899-904.

61. Shuman,B. and Dix,T.A. (1993) Cloning, nucleotide sequence, and expression of ap-hydroxybenzoate hydroxylase isozyme gene from Pseudomonas Jluorescens. J Biol Chem 268, 17057-17062.

62. Spector.T. and Massey, V. (1972) Studies on the effector specifity ofp-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas Jluorescens. J Biol Chem 247,4679-4687.

63. Stanier, R. Y. andOrnston, L. N. (1973) The b-ketoadipate pathway. In Adv.Microb.Physiol. ed. Rose,A.H. and Tempest,D.W. pp. 89-151. London: Acadenic Press.

64. Steennis,P.J., Cordes,M.M., Hilkens,J.G.H. and Muller,F. (1973) On the reaction of parahydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens with halogen ions. FEBS Lett 36, 177-180.

65. Steijiades,R. (1993) Properties of NADH/NADPH-dependent p-hydroxybenzoate hydroxylase from Moraxella sp. Biotechnol Appl Biochem 17, 77-90.

66. Suemori,A., Kurane,R. and Tomizuka,N. (1993) Purification and properties of 3 types of monohydroxybenzate hydroxylase from Rhodococcus erythropolis S-l. Biosci. Biotechnol. Biochem. 57, 1487-1491.

67. Suemori,A., Nakajima,K., Kurane,R. and Nakamura,Y. (1995a) o-, m- andp-hydroxybenzoate degradative pathways in Rhodococcus erythropolis. FEMS Microbiol Lett 125, 31-35.

68. Suemori,A., Nakajima,K., Kurane,R. and Nakamura,Y. (1996) Temperature- and detergent-dependent oligomeric structures of flavoprotein monohydroxybenzoate hydroxylase from Rhodococcus erythropolis. J of Fermentation and Bioengeneering 82, 174-176.

69. Suske,W.A., van Berkel,W.J. and Kohler,H.P. (1999) Catalytic mechanism of 2-hydroxybiphenyl 3-monooxygenase, a flavoprotein from Pseudomonas azelaica HBP1 .J Biol. Chem. 274, 33355-33365.

70. Vervoort,J. and Rietjens,I.M.C.M. (1997) Unifying concepts in flavin-dependent catalysis. Biochem Soc Trans 24, 127-130.

71. Vervoort,J., Rietjens,I.M.C.M., van Berkel,W.J.H. and Veeger.C. (1992) Frontier orbital study on the 4-hydroxybenzoate-3-hydroxylase-dependent activity with benzoate derivatives. Eur J Biochem 206, 479-484.

72. Vervoort,J., van Berkel,W.J., Muller,F. and Moonen,C.T. (1991) NMR studies onp-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens and salicylate hydroxylase from Pseudomonas putida. Eur. J Biochem 200, 731-738.

73. Vetting,M.W., Earhart,C.A. and Ohlendorf,D.H. (1994) Crystallization and preliminary X-ray analysis ofprotocatechuate 3,4-dioxygenase from Acinetobacter calcoaceticus. J. Mol. Biol. 236, 372-373.

74. Walsh,T. A. and Ballou,D.P. (1983) Halogenated protocatechuates as substrates for protocatechuate dioxygenase from Pseudomonas cepacia. J. Biol. Chem. 258, 14413-14421.

75. Weijer,W.J., Hofsteenge,J., Beintema,J.J., Wierenga,R.K. and Drenth,J. (1983)p-Hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens. 2. Fitting of the amino-acid sequence to the tertiary structure. Eur JBiochem 133,109-118.

76. Weijer,W.J., Hofsteenge,J., Yereijken,J.M., Jekel,P.A. and BeintemaJ.J. (1982) Primary structure of p-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens. Biochim Biophys Acta 704, 385-388.

77. Whittaker,J.W., Lipscomb,J.D., Kent,T.A. and Munck,E. (1984) Brevibacterium fuscum protocatechuate 3,4-dioxygenase. Purification, crystallization, and characterization. J Biol Chem 259, 4466-4475.

78. Wierenga,R.K., de Jong,R.J., Kalk,K.H., Hol,W.G. and Drenth,J. (1979) Crystal structure ofp-hydroxybenzoate hydroxylase. J Mol Biol 131, 55-73.

79. Wierenga,R.K., Terpstra,P. andHol,W.G. (1986) Prediction of the occurrence of the ADP-binding beta alpha beta-fold in proteins, using an amino acid sequence fingerprint. J. Mol. Biol. 187, 101-107.

80. Wong,C.M., Dilworth,M.J. and Glenn,A.R. (1994) Cloning and sequencing show that 4-hydroxybenzoate hydroxylase (PobA) is required for uptake of 4-hydroxybenzoate in Rhizobium leguminosarum. Microbiology 140, 2775-2786.

81. Xun,L., Topp,E. and Orser,C.S. (1992) Diverse substrate range of a Flavobacterium pentachlorophenol hydroxylase and reaction stoichiometrics. J. Bacteriol. 174, 2898-2902.

82. Yano,K., Higashi,N. and Arima,K. (1969)/>-Hydroxybenzoate hydroxylase: conformational changcs in crystals of holoenzyme versus holoenzyme-substrate complex. Biochem Biophys Res Commun 34, 1-7.

83. Благодарю Пермякова Евгения Анатольевича за предоставление прекрасных условий для написания данной диссертации, за помощь в доведении ее до финиша.