Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных кроликов с тканеспецифическими для молочной железы генными конструкциями

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных кроликов с тканеспецифическими для молочной железы генными конструкциями"

йсероссийсний научно-исследовательский

институт 'животноводства

\ - ' - ,. • V

-. ■ . ■ - • - \ 4

на правах рукописи Зиновьева Наталия Анатольевна

\ ^ ПОЛУЧЕНИЕ , " 1

.И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ : , \ .ТРАНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ • С ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИМИ ДЛЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ГЕННЫМИ КОНСТРУКЦИЯМИ

- - оз.оолз — физиология человека и животных

а в тор е ф е р а т ' ;" . ^ : - диссевтации

на соискание ученой степени . кандидата биологических наук

У. '

Дуарс.ни!;« ■ 19&4 ,

ли ис<. ; :

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии отдела трансплантации эмбрионов сельскохозяйственны*' животных Все--российского научно-исследовательского .института животноводства.

ручные руководители: -' , V' •

иностранный член РАСХН профессор Г.Брем . ■ академик РАСХН Л .К. Эрнст.

Официальные опонентьк ' ■..-...

: 1 доктор биологических наук профессор Ю. Д- Клинский ^

• -"'' кандидат ' биологических . наук. .СЛ. Джаларилэе

" ' Ведущая организация: .... - '-'■:.":

. ЬЬсковсвая ветеринарная академия им, К.И.Скрябина ;

.'■■ ' ,-Защита диссертации состоится "Э&'* »»КСТРу '■■ 199Й года, в АО часов на заседании специализированного - Совета ■: Д, 020.16.02 по защите диссертаций на. соискание. ученой степени кандидата биологически^ наук.при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства. ■ .

Адрес института: 142018' Московская область

, _ .Подольский район- ' .

. ' - _ ■. "' ; ■: . ■ ' п. Дубровицы,' ВИЖ , ;

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИШа.

Автореферат разослан" года.

• Ученый'секретарь л

спе- амдавмрове«"-:' • " • " .'./■■

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАРАБОТ«

■ "1.1 Актуальность теми '

' Традиционным методом'получения' протеинов для фармацевтического (например, альбумин/ Факторы свертывания крови), а теч же /технического использований (химозин) является экстракция из тка-: невых жидкостей и органов человека и животных. Однако, при таком способе получения крош недостаточного выхода протеинов существует вероятность контаминации вирусами к другими организмами, а V так ш рис к иммунологических реакций. Возможность'получения комоинантных протеинов с помощью генноинженерных методов представляет собой источник для экономически оправданного производства целого ряда протеинов. Ш и.этот метод имеет недостатки, такие как небольшой выход Функциональных' протеинов- (вследствие их неправильной складчатости или отсутствия гликозили. шания и ' .других- псюттранслящюнныхдадификаций), ; а так же трудоемкая и дорогостояаей процедура очистки.

Альтернативой этим - методам может служить использование *мо-/ло«йюй шлевы - животных в качестве продутшрушэй системы гетерогенных протеинов, так называемые "генные- фермы" ("Gene farming"). ; : •• . . ' . '' • ; ■ ' ■■

1.2 Сель и вадвчй'исследования ' •

' Целью данной работы было получение траиегелных 'míjotüüx с Тодеспецифи^киш^ конструкциями и

их анализ. ' •'. \:V . :. .■''

Для достижения'этой'цели необходимо''было i решить '.следующие •' задачи:; / • ••; . - v . V"'.'• л - i ." '

. 1, Получить трансгевшдс кроликов методом .ник'ройигекиии с

Í: г,-' Ц£И TP АЛЬП АН ."НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск.ссльскохоз академии

им. К. A-/J*'ñCs??fh X Инв.

использованием техники лапароскопии для пересадки вигот.

2, Отработать методику анализа животных на траясгенность посредством полимеразной цепной реакции.

а Провести анализ экспрессии интегрировавшихся генных конструкций химозина на уровне мРНК (ВТ-РСК) и на уровне протеина (Уез1егп-блот анализ).

4. Подтвердить биологическую функциональность синтезирующегося в молочной железе протеина химозина.

1.3 Научная новизна работы. ..-*,-'. ' .'-

В работе показаны • возможности использования техники лапароскопии для пересадки эмбрионов у кроликов, что значительно ускоряет и упрощает процедуру пересадки аигот, применение метода - полимеразной цепной реакции для анали&аинтеграшш генных конст трукций с использованием капиллярного термоциклера,;что позволяет иметь результаты исследований в течение суток с момента: взятия проб тканей. Ланной:работой демонстрируется, что молочная_ железа сельскохозяйственных животных;': в частности кроликов,может служить источником получения биологически-функциональных протеинов в количествах от нескольких миллиграмм.до более-одного грамма в литре молока.

: 1^4 практическая значимость ■' ' ! ^ Полученные результаты показывают, возможность; использования молочной железы сельскохозяйственных животных,в ; качестве продуцента биологически-активных гетерогенных протеинов что в будущем может стать новым путемпроизводства' протеинов*применяемых в медицине, ветеринарии, а так же.с техническими целями.(напри-

мер, для переработки продуктов питания).

1.5 'Апробация работы ■■■'/. цзтёркалы диссертации изложены на 46-ой научно-методической конференции * аспирантов* и молодых ученых по проблема интенсификации животноводства, ВЙЖ. п. Дубровицы, 17-18 ишя 1993 г., на конференции немецкого обиества селекционеров и ученых животноводов, "Aus c(er Arbeit der Forschungsstaetten fuer Tierproduktion", Университет имени Георга-Аугуста; V, ' Геттинген, .20-29 сентября 1933 года. 'у

По теме диссертации опубликована одна работа,- две работы находятся в печати. Кроне того, вапериод аспиаантуры опубликовано три реценеии на книги-известных ученых из Германии по специальности. дяссертационной раСоты. две раСоты находятся в печати.

~ II ИАТЕРМАЛЦ К ЦЕТОДККА ИССЛЕДОВАНИЯ

'. • В качестве объекта исследований были выбраны кролики, кото-• рш, с. одной стороны,' явдагася, лабораторными (модельными) животными. а с другой стороны. -сельскохозяйственными яквогнь.-ми. Было проведено три программы по переносу генов/эмбрионов:; 08/92 : 19.0?. 92 - 21. 08. 92 : ВИЙ, ..'••. П. Дубровкцы • . 70 доноров. 40 реципиентов. ■.■

. 01/93' 04.01.93 - 07.01.93 • ВНИИЛМ,' г. Оболеток : :. \\ 138 доноров, 103 реципиентов •

06/93 07.06.93 - 10.06.93 ВНИКШИ г.' Оболеяск / 144 донора,.' 113 реципиентов

В качестве доноров использовались половозрелые самки пород шиншилла и белый великан в возрасте 6-7 месяцев со средней живой массой а 89 кг. » У, крольчих-доноров еа 72 часа до искусственного осеменения вызывали суперовуляцию. инъецируя внутримышечно 20 ЫЕ на кг,живой массы гонадотропина сыворотки жеребой кобылы (PM3Q, Intereonan, Vernie), дважды с интервалом в один час осеменяли свежеполученной разбавленной спермой с внутривенной инъекцией при первом осеменении 180 ЫЕ хорионического гонадотропина человека (НССЗ, Eklutoiv Verni е) для индуцирования овуляции. Черев 20 часов после инъекции HCG доноров вобивали, половые органы транспортировали в лабораторию, вырегали яйцеводы и промывали их со стороны воронки 1-2 мл среды. (PBS+20KFC3) ç целью ;извлечения эмбрионов. Поиск яйцеклеток осуществляли под световым микроскопом при увеличении МО, после чего их переносили в'кашш той же среды под,слоем парафинового масла в чалке Петри, где их культивировали при t- 32* С до момента микроинъекции. Микроинъекция выполнялась при увеличении *400 с йспольэованием интерференционно-контрастной оптики, двух микроманипуляторов, прибора для регулирования инъекционного давления и микроинъекто^а, после чего зиготы культивировали в капле среды до пересадки их1 в-яйцевод реципиентов. ■

Для микроинъекции были использованы следующие генные' конструктив ^ .

PI 5/34 - геномная последовательность генахимозина крупного-' рогатого скота под контролем .¿si-казеинового промотора крупного рогатого скота; , ' , .'■

PI37, PI38, PI39, PI40, PI59, PI75 - кЛНК ИНСуЛИНОПОДОбНОГО Доктора роста-1 под контролем промотора ^sl-казеина крупного' рОГОТОГО скота;

■■'■ - 7 - , . '

В - структурный : ген гормона'роста крупного рогатого скота под контролем промотора фосфоэжшшруваткарбоксикинагы (РЕРСК);

Туг4 - структурный ген тироанцааы под контролем гомологичного " промотора; *

Реципиенты синхронизировались с донорами путем внутривенной инъекции- ISO ME HCG(Ekluton. Vemie) на 2 часа позже доноров. Пересадка эмбрионов выполнялась.с кспольэованием техники лапароскопии в оба яйцевода (Besenfelder U., Brem а 1993). В каждый яйцевод было пересажено в среднем по Ю микроингецированьсг эм-■■ Орионов. ■'■■'■■'. ■ ■ ■

• На il-14-ый день после пересади/ проводили пальпацию рецит пиентов с цель» диагностики.беременности. Вели четкий.учет числа окролов и числа родившихся крольчат. Черев четыре недели - после рождения было проведено мечение живых крольчат и от всех потом-■ ков ( в том числе от.абортированных" плодов, мертворожденных и павших) были взяты - пробы тканей уха для анализа на интеграцию . генных конструкций. .. ' ■ ;■

, Из взятых проб тканей методом.фенольно-хлороформовой экстракции (Blin N.. Stafford D. W. 1975) была выделена ДНК. Кон: центрация ДИК определялась на спектрофотометре при длине волны 260 а Для характеристики степени очистки использовался показатель ¿^отношения оптической плотности раствора ДНК при длине волны ¿60 й £80 нм (Sambrook J. et al. 1989). : Анализ на интеграцию проводился методом, полимеразной цепной; реакции (Satki et al.. 1980) с использованием капиллярного термо; цикяера FT3-1S. Разделение продуктов амплификации выполнялось 'электрофоретически .в ZZ - агарозном геле, а их детекция при рассмотрении геля, в ультрафиолетовом свете с "длиной волны 366 им.

Для анализа экспрессии были взяты трансгенные сайки иг ранних программ с генными конструкциями Р43, Р77. Р99 (структурный ген химозина крушого рогатого скота под контролем промотора /sl-казеина крупного рогатого скота). Анализ проводился на уровне мРНК (транскрипция) и на уровне протеина трансляция). ; ДМ выделенияТНК использовался метод кислой экстракции гуаяидиум-. фенол-хлороформом (Chomczynski P. etal, 1987). Доказательству присутствия специфической мРНК проводилось методом RT-PCR: (по протоколу В.ВгепЦг). то есть с выделенной мРНК с помоиьюфермен^ та реверсивной транскриптазы сначала была синтезирована кДШС которая ватем использовалась для амплификации путем полимеразво* цепной реакции^ Доказательство трансляции мРНК'проводилась методом Western-б дот анализа (Towbin Н. et al. 1079),: а именно посредством иммунологической реакции меяду имобилиэованиши на яит-роцеллюлозной мемСранв . ЧБю-йаси протеинами сыворотки молока трансгенных" самок и специфическим к химозину первьы антителом о последующей инкубацией мембраны с видаспецифическим-; маркированным пероксидазой вторым антителом (Gt-v^-Rb, Sigma). Для детекции продуктов реакции был испольвован.принцип хемилшинисценцш! (ECl,1; Detection Reagents. Amersham). • ■/;--.'.,.■■'- *-v.":)•■}.'у-

С целые доказательства.функциональности. синтезирундегося в; молочной желеве .кроликов химозина выполнялся тест По выявлению его биологической активности, основанный на способности этого протеина после соответствующей активации при низких, рН вызывать осаздение казеиновой фракции молока. С помощью калибровочной кривой, постороенной с использованием известных. концентраций химо&ина (зависимость между концентрацией химозина и временем сворачивания коровьего молока).' была определена концентрация хи-м>31>а в могоке тго:ктенйых' 1фолпкоз. --'' :,; ; 'Vч'/V

XII РЕЗУЛЬТАТУИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Суперовудяция, извлечение эмбрионов, микроинъекция . Реакция доноров на суперовуляцию, характеризующаяся числом желтых те л- не* яичниках, в' среднем на донора' составила 33.34. Степень извлечения яйцеклеток, определяемая как соотношение меж-' ду числом извлеченных яйцеклеток и числом желтых' тел на яичниках, выраженное в процентах, равнялась 81.49Х (Таблица 1).

Таб; 1' Реакция доноров на . суперовуляцию и ' степень .извлечения яйцеклеток

Программа Число Средняя Число ж. т. Число Степень ■ -' ; доноров живая на донора ■ яйцеклеток извлечения . •п ; масса КГ. ^ ...;'. на донора " яйцеклеток X

08/.92 . 70 • 3.03 42.04

01/эз *'135 V 4.23 ; зг.96

06/93 ' 144 3.98 29.49

31.79 23.62 26. 41

75.60 77.75 . : 89. 57

, Всего . 352 3.89 33.34 27.17 • 81. 49 :

В та&ице 2 приведены данные .об оплодотворяемости яйцекле-; ток в трех различных програмшх. Гак показывает таблица, 88. 01Z от обивго числа извлеченных яйцеклеток были - одноклеточные на. сталии двух пронуклеусов (только такие' виготы использовались для микроишьекции). Из 8417. таких, яйцеклеток 5695 было микроинъеци-■' ровано. vlv.-''-М'.-- ■.. .-' - ■

- , 10 -

» , -

Таб. 2 Степень оллодотворяемости яйцеклеток

Программа Число . Число Число оплодотворенных яйцеклеток доноров яйцеклеток всего . в т.ч. одноклеточных ■всего,-" п X п X \ ■

08/92 -70 2225 01/83 138 ' . 3536 06/93 144 : 3903

1885 84.72 1879 84.45 3242 91.69 3140 8а 80 3484 91.61 3398. 89.35

Всего

352

9564

,вб11 дО. 04 8417

88.01

Число 'микроинъецироваиных зигот в зависимости от.генной конструкции распределилось следующим образом (Таб." 3). < .

Таб. 3 Генные конструкции, используемые для микроингекции

Программа . Генная /. ■'■ Ыикроинъецировано . яйцеклеток : : ; V конструкция всего, от.числа одноклеточных,-

V-. ."'." -.л; ■ ■ ■ "

08/92

Туг4 Р138 Туг4 Р139 Туг4 РВ337 'Туг4■РВ139 Всего

144 180 429 310 1063

I 50. 23 ( 324/ 702)-

64. 71 ( 429/ 663)

' 69.31 ( 310/ 514)

57.32 (1063/1879)

' ... ' .'. , - ц -

01/ЭЗ Р15/34 424 62.£6 . ( 424/ 661)

.". '■ Г .; РВ140 644 ' 77.8? (• 644/ 827)

• . ' • V' РВ139 707 80.71 ( 707/ 876)

' .':';. РВ15/34 610 Ш. 88 ( 619/ 7?6)

Всего ■ 2394 . ' 76.24 ( 2394/3140)"

( 679/ 880) ( 604/ 719) ' { 435/ 633) [ 520/1166) С 2238/3398)

Всего:.'• - .5696 67.90 ( 5695/6417)

3-2 : Пе&есадка эмбрионов ■'.,. ■ 3*2.1 Синхронизация реципиентов '. " _ . : /; --,•;*;' ■ ' .Таб. • 4 Влияние статуса реципиентов на,синхронизацию

Огатус '•• ;.' • *' - ЧИСДО / Число желтых тел

рещшиевта: ^ ; кл?- '■ реципиентов' : .. на реципиента

Ииюдда у. самки . .6.26 ( 238/38)

Рожавшие' самки; : '. ' 5.84 (1250/214)

Всего'..-- /Г ••. " ;. Л.:;- 252;.- ' ^Уг'' 5.60 (1480/252)

Л. ; ( ■■■

06/93 • РВ12/34 679 77.16

РБ59/75 -604 . ' 84.01

-'-Л.-,'".'.'-/ РВ140 . 435 ; . 68.72

РВ159- 520 . • . 44.60

'.'■■.. \ Всего- 2238 65.86

Как показывают данные таблицы 4 число при обработке хорю-ническим гонадотропшом число желтых тел на'яичниках у молодых самок было в среднем на: реципиента на 0,42, больше по сравнению с рожавшими самками1, .-■■■■';

Отмечено влияние сезона-года на обусловленную гормонами реакцию реципиентов на индукцию овуляции: в зимнийпериод (январь) . число мелтых тел на яичниках было в среднем на самку на 1,08 больше, чем в летний период (июнь, .август) (Таб. 5).

Таб.. 5 Влияние се бона-года на реакцию реципиентов на ЮЗ

Сезон * Число : Число явдтых тед

реципиентов . на реципиента *

Зима (январь) 113" . 6.60 ( 734/113)

Лето.(ишь, август) 139 . Б. 42 * ( 754/139) .

Всего - . 252 ■ 5.90 (1488/262)

3.2.2 Беременность .-""'■''

Степень беременности вычислялась как.< отношения числа абор-' тировавших и окролившихся реципиентов« общему-числу реципиентов выраженное в процентах, . " ; .

3.2.2.1 Влияние синхронизации реципиентов

В зависимости от времени синхронизации реципиентов (20 ча- . сов раньше доноров, 2 часа после доноров*: 20 часов после доноров) наблюдались различия в степени беременности реципиентов.

■ (Тг>з. б). ' "■ ■■'■:'■'..'"■ ■■ " ■ 1 V, '.

. , / - 13 '

. Таб. б Влияние синхронизации реципиентов на степень беременности при пересадке контрольных эмбрионов •

Синхронизация .Число реципиентов Степень

реципиентов V Вгего Сукрольных беременности,X

20 ч. до доноров 5 1 20.00.

2 ч. после доноров 20 15 75.00

20 Ч. после-доноров 12 • 9- „/ ■'. 75.00

Всего ' 37 . 25 ' ' ■ 67.57

. 3.2. 2.2 Влияние статуса реципиентов .

Проведенные опыты показали, что статус реципиентов оказывал влияние на степень беременности. Как следует из Жданных представ--ленных в таблице 7, еукрольность у молодых самок.наблюдалась на 10.842 чаще, "чем у рожавших самок. . . - :

Таб.. 7 ..Влияние.статуса реципиентов на степень беременности при пересадке микроинъешфоьанньгх зигот '

Статус . • • Число реципиентов' '■ >: Степень ; .

■.реципиента.; л' Всего. Сукрольных ■ : Убеременноети, %

Цолодые -самки 35^ V ^ 68. 57

-Рожавшие' самки':! 56.70

14 - V

3.2. 2. 3 Влияние сезона года В степени беременности реципиентов по сезонам года;наблюдались незначительные различия: на 2.892 больше в летний; чем в: зимний периоды (Таблица 8).

Таблица 8 Влияние сезона года на.сукрольность реципиентов

Сезон . ' Число реципиентов - ■ Степень

года ' Всего .-■''. Сукрольных беременности, X

Зима (январь) 102 ."■ 59 57.74

Лето (ишь, август) 127 77 ".;■■- ; бо-бз ■;; \

3.2.2.4 Влияние микроингекции О целью выяснения влияния микроинъекции на сукрольность реципиентов кроме мдафоинъецированньос: пересаживал» конторольные ; (немикроинъецированные); виготы. Степень беременности самок при трансплантации контрольных: зигот была на1Б.61Х выше» чем :при, пересадке мжроинъецированных зигот (Таблица 9). V. ' :

Таб. 9 Влияние микроинъекции на степень беременности

Статус . Число реципиентов" • Степень ■;.'■.•

эмбрионов Всего . Сукрольных : беременности,*.

Микроииъецированнш 229 . 1зе .... 09.39 .

Контрольные ; ; 20 15 : 75.00.

" - синхронизация реципиентов на 2 часа пояже доноров '•/;•' •..'

■ 3.2.3 Выживаемость эмбрионов

; За показатель выживаемости зигот принимали отношение числа родившихся крольчат, в том числе мертворожденных, и абортирован-, ■ных эмбрионов к общему числу-пересаленных вигот, выравненное в процентах. V: - ,.

3.2.3.1 Влияние статуса реципиентов -- АнЕишэ показателя.:выживаемости вигот по группам молодых и рожавших самок показал, что выживаемость зигот, ..пересаживаемых молодым самкам,, была на 2.18%'выше по сравнению.с рожавшими самками (Таблица 10). . .- :;: . ~ .•■<■'.,.

"Таб.. 10 Влияйие статуса реципиентов ка выживаемость микроинъецированных эмбрионов -

Статус . Число пересаженных/ , ЧИСЛО . : . Выжив; мость

реципиента V ; зыбрионов потомков : эмбрионов, 2 '

молодые самки • 696 ■Г:"-'';- ;■ ' 84 12.07 ■.'

рожавшие, самки 3735 ' ■ ;369 9.68 ; ■■

"57"

3.2.а2 Ешшие сезона года' . ■ сравнительный; анализ степени. выаиваемосуи эиго в экмной' (январь) и летний (июнь, август) периоды (Таблица 11) показал повьйвеннуивыживаемость. вигот;{на 3.76Х) в зимний период. '

" - 16 -Таб. 11 Влияние .сезона года на выживаемость ' ыикроинъециро-ванных эмбрионов "

Сезон Пересажено . *&1СЛО 1 Выживаемость

года эмбрионов потомков X

Зима . 2003 ' 246' 12. 23

Лето 2428 207 .. 6.52* . .

3.2.3.3 Влияние микроннъекции

В таблице 12 представлены сравнительные данные жизнеспособности микроинъецированных и "контрольных (немикроин-ьецированных) зигот. Л-

Таб. 12 Влияние микроинъекции- на выживаемость эмбрионов.

■ ■ \ ■ :- Статус . Пересажено ■ Число' : Выживаемость, •

эмбрионов эмбрионов потомков

микроинъецированные 4431 453 ; : '10.22 ' •

контрольные 236 • 01 •25.85

. Поскольку все операции« выполняемые над контрольными' эмбрио- : наш. исключая микроинъекцию, бьши идентичны с микроинъещфрвая- - • ными эмбрионами, 'уменьшение.степени выживаемости.инъецированных Л■ зигот на 15.63* можно считать• следствием микроинъекции.. • •'

Анализ этого показателя, в 'зависимости'\ от. ^инъецированных.1'''. *

генных конструкций . (таблица 13) выявил широкий спектр изменчивости: 'значения степени,выживаемости зигот колебались от 2.392 до 20.15Х. '

Таб. 13 Выживаемость зигот в аависимости от .микроинъецированной генной конструкции ; " . * . ■.

Программа Генная ...'-" . - Пересалено Число Выживаемость

конструкция зигот потомков X

08/92 Туг4-Р138 103 ■ 12 11.65

Туг4-Р139 ' 100 7 " 7.00

В-Р137 240 1 28 . 11.67

Туп4-В-Р139 60 9 11.25

01/93 '' Р15/34 377 26 . 6.90

> ■ ; В-Р140 510 ; ■ - '71 1а 92

В-Р139 570 .39 6.84

' - ' .' ' В-Р15/34 ' 546 ' . но 20.15

06/93 , В-Р16/34 ' ■ 460'.' ^ 11 2.39

: В-Р159-Р175 480 ', 64 . 13.33

.: В-Р140 ■ 445 25 5. 62

. В-Р159 : 520 . ■ :' 51 ■ 9.81

Интересен тот факт, что как минимальная,, так. и максимальная степени выживаемости зигот наблюдались при инъекции одной и той же 'генной конструкции (В-Р15/34), ' причем с различием почти в 10 раз. Это дает основания полагать, что жизнеспособность инъецированных зигот зависит, .прежде всего, от биологических и физиоло-

' гических показателей-доноров и реципиентов! на которые огромное . влияние; оказывают внешние "•еловия, которые несомненно различались, поскольку в каждый из дней во всех „трех'; программах иаъеци-, ровалась лишь одна; генная', конструкция. '•'■'■■'.:

3^3 Молекулярно-генетический анализ ' .

3.3.1 Исследование интеграции /. ; Исследование интеграции методом полимераэной цепной, реакции выявило у 9-ти'потомков (1.99Х от числа родившихся крольчат и .■.'■■ , 0.16% от числа пересаженных зигот) положительный сигнал^' 'что говорит о трансгенносги данных особей (В - два"; И39 - один; 1 Р15/Э4 - четыре; В-Р140 - один; Туг4-Р138 - один), в том числе у -. 'двух трансгенных кроликов- произошла коинтеграциа двух генных' ■ конструкций. Результаты, полученные методом рср-анадиза, были.. / ■* • подтверждены методом ЗоиЪЬегп-блот анализа.

■ ■ 3.3.Z Исследование экспрессии ^ ' '-1

"Исследование экспрессии проводилось на кроликах, трайсген- ' • них по гену химозина крупного рогатого скота под контролем ■ промотора ^з1-кавеина крупного рогатого скота. ■ 7, ■'■<

■ . 3.3.2.1 Анализ транскрипции ДНК у.;-::-.^''

Методом (?Т-РСЙ было показано-присутствие специфической мРНК ; •' в молочной желеэе трансгектя сашк во время: • лактации. : Вило обнаружено, "что в молочной железе трансгенньа самок присходит • ^ альтернативный сплайсинг'химо8ин-мРНК, то есть кроме нормальной -мРНК присутствуют, транскрипты более тороткой длины. Исходя /из': • . длины ?л®л;!фидируемых фрагментов, был сделок вывод» что з случае

альтернативного сплайсинга в химозин-мРНК отсутствует шестой экзон.. '■ ' ' ■ ■■ ■ .

а 3. г. 2 Анализ трансляции мРНК

Методом ЮезЬегггСлот-анализа было установлело присутствие прохимозина (Мг ■ около ;' 43 кЗО в молоке трансгенных самок. Было показано, что в результате активации при рН-2.5 происходит укорочение протеина, что соответствует литературным данным, касающимся сычужного химозина телят, : а'именно.- что при активации при низких рН происходит- отщепление на Н-конце аминокислотного Фрагмента, в результате чего малоактивный прохимозин переходит в активный псевдонимовин^ а затем в химозин. Таким образом, трансгенный химозин обладает тем же свойством, что и нативныя химозин телят. Структура прохимозина представлена на рисунке 1, Рис. 1. Структура прохимозина . ■-. ;

. 16 27 15 323 — число аминокислот

■ I_____:—___—_препрохжмозин _I-1

' • " - ' 1 ' прохимозин < ■ ' 1 ' .....у_1. псевдохимозин__1

; а 3,2. 3 Анализ биологической активности химозина Биологический тест, основанный .на : способности химозина . осаждать кэ^тны ■■■ молока, ■ .показал, что находящийся в молоке трансгент.- ' ль чих прохимозин обладает незначительной активностью, и лишь посде активации при рН-2.5;(30*С) происходит его переход, в' биологически-активную форму. При более длительной &к-

тивации (до 48 часов) значительных изменений в активности химозина не обнаружено.' с помощью калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям химозина, в молоке трансгенных самок был установлен уровень экспрессии от нескольких, миллиграмм до более 1 грамма в литре молока (Таб. 14).

Таб. 14 Концентрация химозина (мг/л) в молоке трансгенных кроликов

Геньая N трансгенной ; Концентрация химозина

конструкция самки • : (мг/л) V

Р43 3332 •.. 10

■ 3531 ■'■ .. около юоо ;."■/.■,/, . :". .

.2290 : . ю -;■ I1'';

Р77 3845 • ; ■ 3.5-;;.

■■ . 2848 • .. ' - 250 ::>/;;'-..Т.;

..; ■ 3872 ■ ■ •"_ 1100

2847 ■ ДС'ДЛЛОД^.'''';-/

Р99 // 4302 " ,; ■■ до' 1500 \• ' ' 'л■■/-Л''.

У трансгенной самки Н 4382 пробы молока отбирались на каждый второй день лактации в течение 42 дней (21 проба). Как показал анализ, содержание химозина в.молокеколебалось:в ходе лактации от 210 до 1500 мг/л молока (Рисунок 2).

Тис. 2 Лактационная кривая трансгенного кролика N 4382

21 ДОЕНИЕ - 1.64 л молока

' НАДОЙ ЗА дань

ыыниыалышй 39 ил - иахсииа^кыа 17В ил в средней 02 ил

• От этой самки было получено 1;.94 л молока, чтопри средней

- , коЩ^нтра«ии яиыо81ша около 800 мг/д составляет более 1.5 г хи-. моаина ва;; лактацию.Таким • количеством химозина можно осадить V •. казенны в более 15000 литрах коровьего молока.

■ ,

IV НЕОДЫ

1. Использование лапароскопии является эффективным методом для трансплантации зигот у кроликов и позволяет сократить время пересадки от 40-60' минут (при хирургической пересадке) до 5-ю минут. С применением такой техники пересадки беременность крольчих составила 59.392 для микроинъецированных и 76. ООХ для контрольных эмбрионов, а выживаемость - -10.22Х и 25.851, соответственно. ■ '.

2. Метод полимеразной цепной реакции является удобным и надежным методом анализа животных ла трансгенность. 9 животных были идентифицированы как трансгенные (1.08Х от числа родившихся потомков), б том числе у двух произошла {«интеграция.

3.'Показана возможность .применения метода.СТ-РСВ для анализа экспрессии- на уровне мРНК. Доказано присутствие в молочной

железе трансгенных кроликов специфической мРНК (химовин-мРНЮ;

■ ■ ■ * * ■. -

При этом установлено, что кроме нормального происходит альтернат тивный сплайсинг химозин-МРНК (выпадает б-ой экзоя). ; :

4. В молоке трансгенных крольчих доказано присутствие химозина крупного рогатого скота в концентрациях от-иесмольки*. миллиграмм до~ более 1 грамма в литре'молока.

5. Показана биологическая функциональность химозина, синте-зируюиегося в молочной железе трансгенных кроликов* ■:'.-.

v пркялоакнга

Исходя из подученных результатов могут быть сделаны следую-' пне предложения: ■ . ■* '.'-

-1. С - цель» упрощения* процедуры пересадки зигот у кроликов, а так же:повышения степени беременности самок и выживаемости эмбрионов рекомендовать использование техники лапароскопии.

-2. Испольвовать метод полимеравной цепной реакции для быстрого анализа животных на трансгеннодть и метод RT-PCR для доказательства экопрессии интегрировавш-ися генных конструкций^

: 3.- Испольвовать кроликов * в качестве объектов в опытах по получению трансгенных животных, в частности.с тканеспецифически-ми для молочной железыгенными конструкциями.

YI CIIHCOit ОПУВЖНКОБДШШХ . РДБОТ .

. По теме диссертации опубликованы следующие научные работы: I.1 Zinovleva К., Brem О,; Molekulargenetische Analyse milchdruesenspezifischerGenkonstrukte. - Gemeinschaft Stauung der DGf2/GfT. 28.-29. September 1993, Goettingen

S. Зиновьева H.A. Применение PCR для тестирования животных на интеграцию генных конструкций.- Материалы 4б-ой научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых по проблемам интенсификации животноводства; 17-18 июня ' 1993 г., . Бюллетень ВИЖа, 1993, в печати :.

■3. Brem 6., Hartl P., Besenfelder.U., . Wolf £., Zinovieva Pfaller R. Expression of syntetio cDNA sequences encoding pitman insulin-like grovth factor-1 (ISF-1) and its analogue

tGln58] I6F-1 in the -maimary gland of transonic rabbits.-Gane, submited '. ■'",■'.*■'■■

Другие работы: .

1. Врем Г: , Зиновьева &» Эрнст JLK. "Генные фермы*1 - новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными. - Сельскохозяйственная биология, в печати

2. Besenfelder U., Dietrich Е.. Sohnrey В. . Zinovieva N., Holz V., Brem Q. Tubal transfer of ffoat embryos by way of endoscopy.- Veterinary Record,.submited

а Эрнст JL К., Хрлманов А. Ы, т Зиновьева RA. Реценаия на книгу: Brem 6.. Kreausslich H., . Stranzinger Q. Experimentelle Genetik in der Tierzucht.- Генетика. т. 28, N 8, с. 174-175 .

4. Хэлманов A. it, Зиновьева ДА. Рецензия на книгу:' Brem G.. Kreausslich Н., Stranzinger G. ExpeflmnteUe GemtlK In der Tierzucht. - HK3R, 1992, n 5-6, c. 58-61 . ■> ; ,' ;

5. Хэлманов Ä. U.. ЗиновьеваЕ А. Рецензия на книгу: Brem О.. Genetische Vielfalt, von Rindarrassen.- HK3K, 1992, N 5-6, c. 62-63 : ■

' VII EHBBKKTAWIBCnOI cmoaK.

1. Besertfelder U., Brent & (1993) Laparoscopic embryo transfer in rabbi t.- J. Re prod. Fertil., 99, 53-66

2.. Blln; N.. Stafford D.W., (1976) A general method for Isolation of high molecular weight DMA from eucaryotes. - Nucl. Asivs Res.. 3, 2303-2308

a Chomczynski P.,. , SacoY N. (1087) Single-step method of UNA isolation by acid guanidlnium thiocyanatr-phenol-chloroform extraction. - Anal. Biochem.,.' 162, If 5-159 ,

4. Sambrook J., Frltsch E.., Maniatis T, (1989) Molecular oloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbour ; Laboratory Press,' New York • ■■>.. : ' '

5. Saiki R.K., Gelfand D. N., Stoffel S. , Scharf S.J., Hlguchi R.. Horn G. T.. Mull is K..B. / Erlich H.A. (1988)

. Primerr directed enzymatic • amplification ; of■ . DNA, with a thermostable bHA-polymsrase.- Science, 239, 487-491 " , 6. Towbln H., Staehelln T., Gordon J. (1979) roc. Natl. Acad. Sci. USA. 76. 4350-4354 ; : * \ :

:; Подписано к печати; ■ 27.01.94 : ■*; ■ - Заказ ' ■ 551 \ Тираж 75- .' Объем 3.2, уч. изд. л.