Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных кроликов с тканеспецифическими для молочной железы генными конструкциями

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных кроликов с тканеспецифическими для молочной железы генными конструкциями"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИЕ1СТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

на правах рукописи.

Зиновьева Наталия Анатольевна

ПОЛУЧЕНИЕ . И МОЛЁКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ■ТРЛНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ С ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИМИ ДЛЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ГЕННЫМИ КОНСТРУКЦИЯМИ

03.00.13 - ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

1 9£4

Работа выполнена в лаборатории, клеточной .инженерии отдела трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Научные руководители:

иностранный член РАСХН профессор Г. Ерем академик РАСХН JL.K. Эрнст.

Официальные опоненты:

доктор биологических наук профессор Ю. Д. Кяинский кандидат биологических наук. С. Т. Джапаридзе

Ведущая организация: ,

Московская ветеринарная академия им. К И. Скрябина

Защита диссертации состоится «И» Mfo^Tfc 19эУ года в '\0 часов на заседании специализированного Совета Д. 020.16. 02 по защите "диссертаций на.соискание ученой степени кандидата биологических наук при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства. 1

Адрес института: 142012 Московская область

Подольский район п. Дубровицы, ВИЖ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БИЖа.

i

Автореферат разослан 9\ 199^года.

Ученый секретарь специализированного Совета к. б. н.

• И. И. К/ыгин

I. ОЕИАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

г1.1 Актуальность темы '

Традиционным методом' получения протеинов для фармацевтического (например, альбумин, факторы свертывания крови), а те.': же технического использований (химозин) является экстракция из тканевых жидкостей и органов человека и животных. Однако, при таком способе получения кроме недостаточного выхода протеинов сущеот-вует вероятность контаминации вирусами и другими организмами, а так же риск иммунологических реакций. Возможность получения р<,-комбинантных протеинов с помощью генноинженерных методов пред», -тавляет собой источник для экономически оправданного производства целого ряда протеинов. Но и этот метод имеет недостатки, такие как небольшой выход функциональных протеинов (вследствие их неправильной складчатости или отсутствия гликозили. шания и .других-посттрансляционных модификаций), а так же трудоемкая и дорогостоящая процедура очистки.

Альтернативой этим методам может служить использование молочной железы животных в качестве продуцирующей системы гетерогенных протеинов", так называемые "генные фермы" ("Gene farming").

1. 2 Дель и задачи' исследования

Целью данной работы было получение трансгенных киготных с тканеспецифическими для молочной железы генными конструкциями к их анализ.

Для достижения этой цели необходимо было решить еле дутаре задачи:

1. Получить трансгенных кроликов методом микроинтгкши с

использованием техники лапароскопии для пересадки зигот.

2. Отработать методику анализа животных на трансгенность посредством полимеразной цепной реакции.

3. Провести анализ экспрессии интегрировавшихся генных конструкций химозина на уровне мРНК (ИТ-РСЮ и на уровне протеи-

г

на (Уез1егп-блот анализ).

4. Подтвердить биологическую функциональность синтезируеще-гося в молочной железе протеина химозина.

1. 3 Научная новизна работы

В работе показаны • вовмо).лости использования техники лапароскопии для пересадки эмбрионов у кроликов, что значительно ускоряет и упрощает процедуру пересадки зигот, применение метода • полимеразной цепной реакции для анализа интеграции генных конструкций с использованием капиллярного термоциклера, что позволяет иметь результаты исследований в течение суток с момента взятия проб тканей. Данной работой демонстрируется, что молочная железа сельскохозяйственных животных, в частности кроликов, может служить источником получения биологически-функциональных протеинов в количествах от нескольких миллиграмм до более'одного грамма в литре молока.

4 практическая значимость

Полученные результаты показывают возможность использования молочной железы сельскохозяйственных животных в качестве продуцента биологически-активных гетерогенных протеинов , что в будущем может стать новым путем производства протеинов, применяемых в медицине, ветеринарии, а так же с техническими целями (напри-

- 5 - '

мер, для переработки продуктов питания).

1. 5 Апробация работы

Материалы диссертации изложены на 46-ой научно-методической конференции аспирантов"и молодых ученых по проблемам интенсификации животноводства, БИЖ, п. Дубровицы, 17-18 июня 1993 г. , на конференции немецкого общества селекционеров и ученых животноводов "Aus der Arbeit der Forschungsstaettea fuer Tierproduktion", Университет имени Георга-Аугуста, г. ' Геттинген, .28-29 сентября 1993 года .

По теме диссертации опубликована одна работа, две работы находятся в печати. Кроме того, за период аспирантуры опубликовано три рецензии на книги известных ученых из Германии по специальности. диссертационной работы, две работы находятся в печати.

11 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА КСОЛЕДОВАШЛ ■ В качестве объекта исследований были выбраны кролики, которые, с одной стороны, являются лабораторными (модельными) животными, а с другой стороны, - сельскохозяйственными животными. Было проведено три программы по переносу генов/эмбрионов: 08/92. 19.07.92 - 21.08.92 ВИЖ, п. Дубровицы • 70 доноров. 40 реципиентов.

, 01/93 04.01.93 - 07.01,93 ВНШПМ, Г. Оболегок 138 доноров, 108 реципиентов 06/93 07. 06. 93 - 10. Об. 93 ВНИИПМ. г. Оболенск 144 донора, 113 реципиентов

В качестве доноров использовались половозрелые самки пород шиншилла и белый великан в возрасте 5-7 месяцев со средней живой массой 3. 89 кг. У крольчих-доноров за 72 часа до искусственного осеменения вызывали суперовуляцию, инъецируя внутримышечно 20 ME

на кг живой массы гонадотропина сыворотки жеребой кобылы (РШЗ,

t

Intergonan, Vernie), дважды с интервалом в один час осеменяли свежеполученной разбавленной спермой с внутривенной инъекцией при первом осеменении 180 ME хорионического гонадотропина человека (HCG, Ekluton, Vernie) для индуцирования овуляции. Черев 20 часов после инъекции HCG доноров забивали, половые органы транспортировали в лабораторию, вырезали яйцеводы и промывали их со стороны воронки 1-2 мл среды. (PBS+20%FCS) с целью извлечения эмбрионов. Поиск яйцеклеток осуществляли под световым микроскопом при увеличении МО, после чего их переносили в каплю той же среды под.слоем парафинового масла в чашке Петри, где их культивировали при t- 38* С до момента микроинъекции. Микроинъекция выполнялась при увеличении *400 с йспользованием интерференционно-контрастной оптики, двух микроманипуляторов, прибора для регулирования инъекционного давления и микроинъектора, после чего зиготы культивировали в капле среды до пересадки их в . яйцевод реципиентов. .

Для микроинъекции были использованы следующие генные конструкции:

Р15/34 - геномная последовательность гена химозина крупного рогатого скота под контролем «¿si-казеинового промотора крупного рогатого скота;

Р137, Р138, Р139, Р140, Р159, Р175 - кДНК инсулиноподобного фактора роста-j под контролем промотора »¿sl-казеина крупного рогатого скота;

В - ■ структурный ген гормона роста крупного рогатого скота под контролем промотора фосфоэнолпируваткарбоксикиназы (РЕРСК);

Туг4 - структурный ген тирозинаэы под контролем гомологичного промотора;

Реципиенты синхронизировались с донорами путем внутривенной инъекции 120 ME HCG (Ekluton, Vemie) на 2 часа позже доноров. . Пересадка эмбрионов выполнялась с использованием техники лапароскопии в оба яйцевода (Besenfelder U., Brem 3. 1993). В каждый яйцевод было пересажено в среднем по 10 микроинъецированых эмбрионов.

На 11-14-ый день после пересадки проводили пальпацию реципиентов с целью диагностики беременности. Вели четкий.учет числа окролов и числа ро'дивпгахся крольчат. Через четыре недели после рождения было проведено мечение живых крольчат и от всех потомков ( в том числе от абортированных плодов, мертворожденных и павших) были взяты пробы тканей уха для анализа на интеграцию генных конструкций.

Из взятых проб тканей методом фенольно-хлороформовой экстракции (Blin N.. Stafford D.W. 1976) была выделена ДНК. Концентрация ДНК определялась на спектрофотометре при длине волны 260 нм, а для характеристики степени очистки использовался показатель соотношения оптической плотности раствора ДНК при длине волны 260 и 280 нм (Sambrook J. et al. 1989).

Анализ на интеграцию проводился методом полимеразной цепной реакции (Saiki et al. 1988) с использованием капиллярного термо. циклера FTS-1S. Разделение продуктов амплификации выполнялось электрофоретически в ZZ агарозном геле, а их детекция при рассмотрении геля в ультрафиолетовом свете с длиной волны 366 нм.

Для анализа экспрессии были взяты трансгенные самки из ранних программ с генными конструкциями Р43, Р77. Р99 (структурный ген химозина крупного рогатого скота под контролем промотора /si-казеина крупного рогатого скота). Анализ проводился на уровне мРНК (транскрипция) и на уровне протеина (трансляция). Для выделения РНК использовался метод кислой экстракции гуанидиум-фенол-хлороформом (Chomczynski Р. et al. 1987). Доказательство присутствия специфической мРНК проводилось методом RT-PCR (по протоколу B.Brenig), то есть с выделенной мРНК с помощью фермента реверсивной транскриптазы сначала была синтезирована кДНК, которая затем использовалась для амплификации путем полныеразной цепной реакции. Доказательство трансляции мРНК'проводилось методом Western-блот анализа (Towbin Н. et al. 1979),. а именно посредством иммунологической реакции между имобилизованными на нит-роцеллюлозной мембране .'(Bio-Rad) протеинами сыворотки молока трансгенных самок и специфическим к химозину первым антителом с последующей инкубацией мембраны с видчспецифическим маркирован-, ным пероксидазой вторым антителом (Gt-^-Rb, Sigma). Для детекции продуктов реакции был использован принцип хемилюминисценции (ECL Detection Reagents, Amersham).

С целью доказательства функциональности синтезирующегося в молочной железе кроликов химозина выполнялся тест по выявлению его биологической активности, основанный на способности этого протеина после соответствующей активации при низких pH вызывать осаждение казеиновой фракции молока. С помощью калибровочной кривой, постороенной с использованием известных концентраций химозина (зависимость медду концентрацией химозина и временем сворачивания коровьего молока), была определена концентрация хи-k.03i:«a в молоке трг:ктенкых кроликов.:

III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Суперовуляция, извлечение эмбрионов, микроинъекция Реакция доноров на суперовуляцию, характеризующаяся числом желтых тел на яичниках, в среднем на донора составила 33.34. Степень извлечения яйцеклеток, определяемая как соотношение между числом извлеченных яйцеклеток и числом желтых тел на яичниках, выраженное в процентах, равнялась 81.49% (Таблица 1).

Таб. 1 Реакция доноров на . суперовуляцию и степень извлечения яйцеклеток

Программа Число Средняя Число ж. т. Число Степень

доноров живая на донора яйцеклеток извлечения п масса, кг. на донора яйцеклеток %

08/,92 70 01/93 138 06/93 144

3.03 42. 04 4.23 32.96 3.98 29.49

31.79 29.62 26. 41

75. 60 77. 75 89. 57

Всего

352

3. 89

33.34

27.17

81. 49

В тас9шце 2 приведены данные,об оплодотворяемости яйцеклеток в трех различных программах. Как показывает таблица, 88.01% от общего числа извлеченных яйцеклеток были одноклеточные на стадии двух пронуклеусов (только такие'зиготы использовались для микроинъекции). Из 8417 таких яйцеклеток 5695 было микроинъеци-ровано.

Таб. 2 Степень оплодотворяемости яйцеклеток

Программа Число Число Число оплодотворенных яйцеклеток

доноров яйцеклеток всего в т. ч. одноклеточных

• всего, п п У. п %

08/92 70 2225 01/93 138 3536 06/93 144 3803

1885 84.72 1879 84.45 3242 91.69 3140 88.80 3484 91.61 3398 89.35

Всего

352

9564

8611 90.04 8417

88. 01

Число микроинъецированных зигот в зависимости от генной конструкции распределилось следующим oбpaзqм (Таб. 3).

Таб. 3 Генные конструкции, используемые для микроинъекции

Программа . Генная Микроинъецировано яйцеклеток

конструкция всего, от числа одноклеточных,

п X

08/92

Туг4 Р138 144 1

Туг4 Р139 180 -1 50.23 ( 324/ 702)

Туг4 РВ137 429 64.71 ( 429/ 663)

Туг4 РВ139 310 69.31 ( 310/ 514)

Всего 1063 57.32 (1063/1879)

01/93 -V Р15/34 424 62.26 ( 424/ 681)

РВ140 644 . 77. 87 (■644/ 827)

РВ139 707 80. 71 ( 707/ 876)

РВ15/34 ■ 619 81.88 ( 619/ 756)

• Всего 2394 76. 24 (2394/3140)'

08/93 • РВ15/34 679 77.16 ( 679/ 880)

РВ59/75 ■ 604 84. 01 ( 604/ 719)

РВ140 .435 ■ 68.72 ( 435/ 633)

РВ159- 520 - . 44. 60 ( 520/1166)

Всего 2238 65. 86 (2238/3398)

^ ,

Всего

5695

67.90 (5695/8417)

3.2 . Пересадка эмбрионов

3.2.1 Синхронизация реципиентов

Таб. ■ 4 Влияние статуса реципиентов на синхронизацию

Статус реципиента

Число' реципиентов

Число .желтых тел на реципиента

Молодые самки Рожавшие самки-

38 214

6.26 ( 238/ 38) 5.84 (1250/214)

Всего

252

5.90 (1480/252)

Как показывают данные таблицы 4 число при обработке хорио-ническим гонадотропином число желтых тел на'яичниках у молодых самок было в среднем на реципиента на 0. 42 больше по сравнению с рожавшими самками.

Отмечено влияние сезона года на обусловленную гормонами реакцию реципиентов на индукцию овуляции: в зимний период (январь) число желтых тел на яичниках было в среднем на самку на 1.08 больше, чем в летний период (июнь, август) (Таб. 5).

Таб. 5 Влияние севона года на реакцию реципиентов на ШЗ

Сезон Число Число желтых тел

реципиентов на реципиента

Зима (январь) 113 6. 50 ( 734/113)

Лето (июнь, август) 139 . 5.42 * ( 754/139)

Всего 252 5. 90 (1488/252)

3. 2. 2 Беременность

Степень беременности вычислялась как> отношения числа абортировавших и окролившихся реципиентов к общему числу реципиентов выраженное в процентах.

3. 2. 2.1 Влияние синхронизации реципиентов

В зависимости от времени синхронизации реципиентов (20 часов раньше доноров, 2 часа после доноров, 20 часов после доноров) наблюдались различия в степени беременности реципиентов (Таб. СО.

Таб. 6 Влияние синхронизации реципиентов на степень беременности при пересадке контрольных эмбрионов

Синхронизация реципиентов

Число реципиентов Всего Сукрольных

Степень

беременности,%

20 ч. до доноров 5

2 ч. после доноров 20 20 ч. после доноров 12

1

15 9-

20. 00 75.00 75.00

Всего 37 . 25 ' • 67.57

3.2. 2.2 Влияние статуса реципиентов

Проведенные опыты показали, что'статус реципиентов оказывал • влияние на степень беременности. Как следует из данных представленных в таблице 7, сукрольность у молодых самок наблюдалась на 10. 84% чаще, чем у рожавших самок.

Таб. 7 Влияние статуса реципиентов на степень беременности при пересадке микроинъецированных зигот

Статус .■ Число реципиентов Степень

реципиента Всего Сукрольных беременности, %.

Молодые самки 35 '■' 24 68.57

Рожавшие самки 194 110 56. 70

- 14'-

3.2. 2. 3 Влияние сезона года

В степени беременности реципиентов по сезонам года.наблюдались незначительные различия: на 2.89% больше в летний, чем в зимний периоды (Таблица 8).

Таблица 8 Влияние сезона года на сукролыюсть реципиентов

Сезон Число реципиентов Степень

года Всего Сукрольных беременности, %

Зима (январь) 102- 59 57.74

Лето (июнь, август) 127 77 60.63

3. 2. 2. 4 Вшшие микроинъекции С целью выяснения влияния микроинъекции на сукролыюсть реципиентов кроме микроинъецированных 'пересаживали конторольные (немикроинъецированные)• зиготы. Степень беременности самок при трансплантации контрольных зигот была на 15.61% выше, чем при пересадке микроинъецированных зигот (Таблица 9). •

Таб. 9 Влияние микроинъекции на степень беременности

Статус Число реципиентов" Степень

эмбрионов Всего Сукрольных беременности, %,

Микроииъецированные 229 136 59.39

Контрольные 20 15 75. 00 \

~ - синхронизация реципиентов на 2 часа поаже доноров

3.2. 3 Выживаемость эмбрионов

За показатель выживаемости зигот принимали отношение числа родившихся крольчат, в том числе мертворожденных, и абортированных эмбрионов к общему числу-пересаженных зигот, выраженное в процентах.

3. 2.3.1 Влияние статуса реципиентов

Лналиэ показателя выживаемости 'зигот по группам молодых и рожавших самок показал, что выживаемость зигот, пересаживаемых молодым самкам, была на 2.19% выше по сравнению с рожавшими самками (Таблица 10). .

Таб. 10 Влияние статуса реципиентов на выживаемость микрЪинъецированных эмбрионов

Статус Число пересаженных Число . Выживг мость

реципиента эмбрионов потомков эмбрионов, %

молодые самки ■696 84 12. 07

рожавшие самки 3735 369 9.88

о

3.2. 3.2 Влияние сезона года

Сравнительный анализ степени выживаемости зиго в зимной (январь) и летний (июнь, август) периоды (Таблица 11) показал повышенную выживаемость зигот.(на 3.76%) в зимний период.

Таб. И Влияние .сезона года на выживаемость микроинъециро-ванных эмбрионов

Сезон Пересажено Число Выживаемость

года эмбрионов потомков %

Зима . 2003 246 12.28

Лето 2428 .207 8. 52'

3. 2. 3. 3 Влияние микроинъекции

В таблице 12 представлены сравнительные данные жизнеспособности микроинъецированных и контрольных (немикроинъецированных) зигот.

Таб. 12 Влияние микроинъекции- на выживаемость эмбрионов

\ Статус эмбрионов Пересажено • эмбрионов Число потомков Выживаемость, X

микроинъе цированные контрольные 4431 236 453 61 10. 22 '25.85 ;

Поскольку все операции, выполняемые над контрольными' эмбрионами, исключая микроинъекцию, были идентичны с микроинъецирован-ными эмбрионами, уменьшение степени выживаемости инъецированных зигот на 15.63% можно считать следствием микроинъекции.

Анализ этого показателя в зависимости от. инъецированных.

генных конструкций (таблица 13) выявил широкий спектр изменчивости: значения степени.выживаемости зигот колебались от 2.39% до 20.15%.

Таб. 13 Выживаемость зигот в зависимости от .микроинъецированной генной конструкции

Программа Генная Пересажено Число Выживаемость

конструкция зигот потомков %

08/92' Туг4-Р138 103 12 11.65

Туг4-Р139 100 7 7. 00

В-Р137 240 28 11.67

Туг.4-В-Р139 80 9 11.25

01/93 Р15/34 . ■ 377 26 6. 90

В-Р140 510 '71 13. 92

В-Р139 570 39 6. 84

В-Р15/34 546 110 20.15

06/93 В-Р15/34 460 11 2. 39

В-Р159-Р175 480 64 13. 33

В-Р140 445 25 5. 62

0 В-Р159 520 . 51 9. 81

Интересен тот факт, что как минимальная, так и максимальная степени выживаемости зигот наблюдались при инъекции одной и той же генной конструкции (В-Р15/34), причем с различием почти в 10 раз. Это дает основания полагать, что жизнеспособность инъецированных зигот зависит, прежде всего, от биологических и фигиоло-

гических показателей доноров и реципиентов, на которые огромно влияние оказывают внешние "словия, которые несомненно различа лись, поскольку в каждый из дней во всех .трех программах инъецировалась лишь одна,генная конструкция.

3. 3 Молекулярно-гедетический анализ

3. 3.1 Исследование интеграции

Исследование интеграции методом полимеразной цепной реакциг выявило у 9-ти потомков (1.99% от числа родившихся крольчат и 0.16% от числа пересаженных зигот) положительный сигнал, что говорит о трансгенности данных особей (8 - два; Р139 - один; Р15/34 - четыре; В-Р140 - один; Т.уг4-Р138 - один), в том числе у двух трансгенных кроликов- произошла коинтеграция двух генных конструкций. Результаты, полученные методом РСИ-анализа, были подтверждены методом БоиЬЬегп-блот анализа

3.3.2 Исследование экспрессии . .

Исследование экспрессии проводилось на кроликах, трансгеи-ных по гену химозина крупного рогатого скота под контролем промотора казеина крупного рогатого скота

3.3.2.1 Анализ транскрипции ДНК , - .

Методом НТ-РСЙ было показано-присутствие специфической мРНК в молочной железе трансгенных самок во время лактации. Было обнаружено, что в молочной, железе трансгенных самок , присходит • альтернативный сплайсинг' химозин-мРНК, то есть кроме нормальной мРРК присутствуют транскрипты:более короткой длины. Исходя из длины ?.ыпллфицируемых фрагментов, был сделан вывод, что в случае

альтернативного сплайсинга в химозин-мРНК отсутствует шестой зкзон. . '

3.3.2.2 Анализ трансляции мРШ

Методом Western-блот-анализа было установлело присутствие прохимозина (Mr около 43 кД) в молоке трансгенных самок. Было показано, что в результате активации при рН-2. 5 происходит укорочение протеина, что соответствует литературным данным, касающимся сычужного химозина телят, а именно, - что-при активации при низких рН происходит отщепление на N-конце аминокислотного фрагмента, в результате чего малоактивный прохимозин переходит в активный псевдохимозин) а затем в химозин. Таким образом, трансгенный химозин обладает тем же свойством, что и нативный химозин телят. • Структура прохимозина представлена на рисунке 1.

Рис. 1 Структура прохимозина

16 27 15 323 — число аминокислот

препрохиыозин

_ прохимозин

псевдохиыозин

I_1 химозин__I

3.3.2.3 Анализ биологической активности химозина Биологический тест, основанный на способности химозина осалщать ка" ^»нн молока, показал, что находящийся в молоке трансгенн, ¡ьчих прохимозин обладает незначительной актив-

ностью, и лишь после активации при рН-2.5 (30*С) происходит его переход в биологически-активную форму. При более длительной ак-

' - - 20 -

тивации (до 48 часов) значительных изменений в активности химозина не обнаружено. С помощью калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям химозина, в молоке трансгенных самок был установлен уровень экспрессии от нескольких миллиграмм до более 1 грамма в литре молока (Таб. 14).

Таб. 14 Концентрация химозина (мг/л) в молоке трансгенных кроликов

Геньая N трансгенной Концентрация химозина

конструкция самки (мг/л)

Р43 3332 10

3531 около 1000 ' _

2290 . 10

Р77 3845 3.5 '

2848 250

3872 1100

2847 75

Р39 4382 до 1500

У трансгенной самки N 4382 пробы молока отбирались на каждый второй день лактации в течение 42 дней (21 проба). Как показал анализ, содержание химозина в молоке колебалось в ходе лактации от 210 до 1500 мг/л молока (Рисунок 2).

- 21 -

Рис. 2 Лактационная кривая трансгенного кролика N 4382 иг/л

■ ДНИ ЛАКТАЦИИ

От этой самки было получено 1..94 л молока, что при средней , концентрации химоэина около 800 мг/л составляет более 1.5 г химозина за лактацию. Таким количеством химозина можно осадить казеины в более 15000 литрах коровьего молока.

IV ВЫВОДЫ

1. Использование лапароскопии является эффективным методом для трансплантации зигот у кроликов и поззоляет сократить время пересадки от 40-60 минут (при хирургической пересадке) до 5-10 минут. С применением такой техники пересадки беременность крольчих составила 59. 39% для микрошгьецированных и 75.00% для контрольных эмбрионов, а выживаемость --10. 22% и 25.85%, соответственно. .

2. Метод полимеразной цепной реакции является удобным и надежным методом анализа животных на трансгенность. 9 животных были идентифицированы как трансгенные (1.99% от числа родившихся потомков), в том числе у двух произошла коинтеграция.

3.' Показана возможность применения метода .ИТ-РСК для анализа экспрессии' на уровне мРНК. Доказано присутствие в молочной железе трансгенных кроликов специфической мРНК (химоэин-мРНК). При этом установлено, что кроме нормального происходит альтернативный сплайсинг химозин-мРНК (выпадает 6-ой экзон).

4. В молоке трансгенных крольчих доказано присутствие химозина крупного рогатого скота в концентрациях от- нескольких миллиграмм до более 1 грамма в литре молока. •

5. Показана биологическая функциональность химозина, синтезирующегося в молочной железе трансгенных кроликов.

V ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Исходя из полученных результатов могут быть сделаны следующие предложения: .

1. С целью упрощения- процедуры пересадки зигот у кроликов, а так же повышения степени беременности самок и выживаемости эмбрионов рекомендовать использование тохники лапароскопии.

2. Использовать метод полимеразной цепной реакции для быстрого анализа животных на трансгенноль и метод RT-PCR для доказательства экспрессии интегрировавш псся генных конструкций.

3. Использовать кроликов в качестве объектов в опытах по получению трансгенных животных, р. частности с тканеспецифически-ми для молочной железы генными конструкциями.

VI СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

По теме диссертации опубликованы следующие научные работы:

1. Zlnovieva N. , Brem G. Molekulargenetische Analyse milchdruesenspezifischer Genkonstrukte. - Gemeinschaftstagung der DGfZ/GfT, 28,-29. September 1993, Goettingen

2. Зиновьева E А. Применение PCR для тестирования животных на интеграцию генных конструкций. - Материалы 46-ой научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых по проблемам интенсификации животноводства, 17-18 июня 1993 г., Бюллетень ВИЖа, 1993, в печати

3. Brem G. , Hartl P., Besenfelder U. , Wolf E. , Zinovieva N. , Pfaller R. Expression of syntetic cDNA sequences encoding human insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and its analogue

CGln58]IGF-1 in the mammary gland of transgenic rabbits. -Gene, submited

Другие работы:

1. Врем Г:, Зиновьева а , Эрнст JL К "Генные фермы" - новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными. - Сельскохозяйственная биология, в печати

2. Besenfelder U., Dietrich Е.. Sohnrey В.. Zinovieva N. , Holz W., Brem a Tubal transfer of goat embryos by way of endoscopy.- Veterinary Record,. submited

3. Эрнст JL К , Хэлманов A. II, Зиновьева E А. Рецензия на книгу: Brem G. , Kreausslich K., . Stranzinger G. Experimentelle Genetik in der Tierzucht. - Генетика, т. 28, N 8, с. 174-175

4. Холыанов А. Ы.. Зиновьева Е А. Рецензия на книгу: Brem G. , Kreausslich Н. , Stranzinger G. Expefimentelle Genetik in der Tierzucht. - HK3K, 1992, n 5-6. c. 58-61

5. Холманов А. M., Зиновьева Е А. Рецензия на книгу: Brem а Genetische Vielfalt, von Rinderrassen.J HK3K, 1992, N 5-6, с. 62-63

VII EHWHOTPA-HNECKHfl CIJHOOTC

1. Besenfelder U., Brem G. (1993) Laparoskopie embryo transfer in rabbit.'- J. Reprod. Fértil., 99, 53-56

2. Blin N.. Stafford D.W.. (1976) A general method for isolation of high molecular weight DNA from eucaryotes. - Nucl. Asivs Res. , 3, 2303-2308

3. Chomczynski P., Sacci N. (lil87) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatr-phenol-chloroform extraction.- Anal. Biochem. , 162, lr 5-159

4. Sambrook J. , Fritsch E.., Maniatis T. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York •

5. SaikiR. K. , Gelfand D. N. , Stoffel S. , Scharf S. J. , Higuchi R. , Horn G.T. , Mullis K-.B. , Erlich H.A. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA. with a thermostable DNA-polymerase. - Science, 239 , 487-491

6. Towbin H. , Staehelin T. , Gordon J. (1979) roc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 4350-4354

o