Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и изучение рекомбинантных Fab'-фрагментов антител к афлатоксинам

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и изучение рекомбинантных Fab'-фрагментов антител к афлатоксинам"

Калиниченко Артем Андреевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ Глв'-ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ К АФЛАТОКСИНАМ

Специальность 03.01.04-«Биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010 г.

004600723

Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета им. МБ. Ломоносова и в лаборатории инженерии белка Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинников РАН.

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор

Д.А. Долгих

Официальные оппоненты: Доктор химических наук,

С.А. Еремин

Кандидат биологических наук, C.B. Беневоленский

Ведущая организация: ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии»

ФМБА России

Защита состоится « » ^ ¿¿4' ГФ 2010 г. в « ^ » часов на заседани диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академи наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москв Ленинский проспект, д. 33, стр. 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литератур РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ стр. 1

Автореферат разослан:« 13 »(¡уЛ^Шг010г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук I А.Ф. Орловский

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Афлатоксины - группа токсичных веществ небелковой природы -вторичных метаболитов грибов. Обнаруживаются при поражении грибами Aspergillus flavus и A. parasiticus семян злаковых и масличных культур, орехов, сухофруктов. Афлатоксины - гепатоканцерогены, и являются серьезной проблемой пищевой промышленности и сельского хозяйства во многих странах. Токсичность различных типов афлатоксинов сильно различается. Афлатоксин Bi наиболее токсичный и часто встречающийся в пищевых продуктах и кормах отнесен к первой группе канцерогенов Международным Агентством по изучению Рака.

В настоящее время основным, наиболее простым и эффективным методом детекции афлатоксинов в пищевых продуктах и кормах является иммуноферментный анализ на основе моноклональных антител. Высокая токсичность, небольшой размер молекул и незначительные структурные отличия между молекулами разных типов афлатоксинов затрудняют получение специфичных моноклональных антител к ним. В литературе имеется много работ, описывающих получение моноклональных антител к различным типам афлатоксинов с достаточно высокими значениями аффинности. Но большинство этих антител обладают и высокой кросс-реактивностью. Один из наиболее перспективных подходов изменения функциональных параметров антител состоит в использовании методов белковой инженерии. Существует несколько простых (замена CDR-областей моноклональных антител, направленная замена аминокислот с использованием мутагенеза) и более сложных (фаговый, рибосомный или клеточный дисплей) методов, применяемых в белковой инженерии антител. Однако, применение таких методов нецелесообразно без знаний о структуре генов антител и взаимодействия антител с афлатоксинами. Таким образом, изучение структуры генов антител против различных афлатоксинов может открыть новые перспективы для модификации этих антител и создания новых, более совершенных и специфичных способов определения этих токсинов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью данной работы было изучение панели моноклональных антител к

афлатоксинам, и их экспрессия в виде Fab'-фрагментов.

В рамках поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Тестирование моноклональных антител.

2. Выделение мРНК из отобранных клеток гибридом.

3. Обратная транскрипция и получение кДНК библиотек.

4. Амплификация вариабельных и константных участков легких и тяжелых цепей антител, определение их нуклеотидной последовательности. Анализ полученных данных.

5. Получение экспрессионных векторов, выделение и анализ рекомбинантных Fab-фрагментов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

С помощью реакции обратной транскрипции получены, секвенированы и

проанализированы гены вариабельных областей 10 моноклональных антител к трем различным афлатоксинам.

Получены экспрессионные вектора для генов антител. Показана возможность получения функционально активных рекомбинантных антител против афлатоксинов в виде Fab'-фрагментов.

Впервые были секвенированы гены вариабельных областей 10 моноклональных антител к афлатоксинам. Анализ генов показал высокую гомологию последовательностей легких цепей антител и позволил предположить, что аффинность к антигену преимущественно определяется структурой тяжелых цепей антител.

Полученные с помощью обратной транскрипции гены антител против афлатоксинов могут быть использованы для получения рекомбинантных антител с измененными параметрами аффинности и кросс-реактивности методами белковой инженерии и создания на их основе эффективных систем детекции.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Работа была представлена на международной конференции «Новые

информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2008); 33-ем Конгрессе FEBS «Biochemistry of Cell Regulation» (Афины, Греция, 2008); 11-ом семинаре SAC ISTC "New Trends in Chemical Toxicology" (Москва, Россия, 2008); 21-ой школе молодых ученых «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2009); 34-м международном конгрессе FEBS «Life's molecular interactions» (Прага, Чехия, 2009).

ПУБЛИКАЦИИ.

По основным результатам диссертации опубликовано 7 работ, из них 2

статьи в рецензируемых российских журналах и 5 тезисов в сборниках материалов российских и международных конференций.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертационная работа изложена на ^¿"странице и включает: введение,

обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Работа иллюстрирована А/^ рисунками и ГЗ таблицами. Список литературы содержит /&9 источника.

СОКРАЩЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ

АфлаТ - афлатоксины; МА - моноклональные антитела; БСА - бычий сывороточный альбумин; CDR - complementary determining regions, - области, образующие антигенсвязывающий центр; РаЬ'-фрагмент - антиген, связывающий фрагмент антитела; ИФА - иммуноферментный анализ; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ФИО- а - фактор некроза опухолей- а; ПААГ -полиакриламидный гель.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение моноклональных антител против афлатоксинов Вь В2,

С2

Иммунизация животных АфлаТ затруднена из-за их высокой токсичности и низкомолекулярной природы (Рис 1).

U—1

чД-е-

II

и.

G,

ег

dbifc м,

В»

¿i

лох

G„

АХ

стх

л

Parasiticol (В3)

t> «

<АА Д>

1-methoxy-aflatoxin Вг 2-methoxy-aflatoxin В,

А>

Мг 1-ethoxy-aflatoxin Вг 1-ethoxy-aflatoxin

. . <» о n а

[ ii j

GM, 1-acetoxy-aflatoxin Вг

Рис. 1. Строение молекул различных АфлаТ и некоторых их метаболитов.

Конъюгирование с белковым носителем в значительной степени позволяет

решить обе проблемы. Для иммунизации использовали конъюгаты трех токсинов (АфлаТ Вь АфлаТ В2, АфлаТ 02) с бычьим сывороточным альбумином. Сыворотки мышей, иммунизированных АфлаТ, тестировали с помощью вариантов непрямого и конкурентного ИФА на наличие антител к АфлаТ. Связывание антигена с антителами сыворотки крови иммунизированных животных значительно превышало контрольные значения для неиммунизированных животных. При этом антитела сыворотки иммунизированных мышей связывают конъюгат АфлаТ-БСА более чем в 3 раза эффективнее, чем БСА. Титр сывороток иммунизированных животных составил около 1:10000 для соответствующих коньюгатов трех афлатоксинов АфлаТ В2, АфлаТ В] и АфлаТ .

Конкурентный ИФА антител сывороток иммунизированных мышей подтвердил наличие антител, специфичных к АфлаТ Вь В2 и 02. Клетки подколенных лимфоузлов выделяли из мышей с наибольшим титром специфических антител в сыворотках и гибридизовали с клетками линии миеломы Бр2/0 по стандартной методике. После первичного скрининга не менее ста линий гибридом, полученных в результате иммунизации мышей каждым из конъюгатов, отбирали по 10-20 положительных клонов, секретирующих специфичные к АфлаТ антитела. Отобранные клетки дополнительно клонировали 3-4 раза методом лимитирующих разведений, контролируя продукцию ими антител. Отобранные клоны выращивали и вводили в брюшную полость мышей для получения асцитов. Критерием отбора клонов было взаимодействие продуцируемых ими МА со свободными АфлаТ, коньюгатами АфлаТ-БСА и отсутствие связывания с БСА. В результате были получены и отобраны 10 гибридом, продуцирующих специфичные МА против АфлаТ В! (К15.458, К15.200, К15.22, К15.727, К15.226), АфлаТ В2 (К33.1Е7, К33.302), АфлаТ (К95.Е11, К95Ш, К95.В12). Все перечисленные МА были выделены из асцитных жидкостей мышей методом одностадийной аффинной хроматографии на белок О-сефарозе. По данным электрофоретического анализа в денатурирующем ПААГ было показано наличие высокоочищенных антител с молекулярной массой около 25 и 45 кДа, для легкой и тяжелой цепей соответственно (рис. 2).

кДа 1 2

Рис. 2. Электрофореграмма (12% БОЗ-ПААГ) аффинно-очищенных МА К33.302 против АфлаТ В2 (2); 1 - белковые маркеры молекулярной массы.

Изотипирование антител

Анализ субизотипов МА против АфлаТ проводили методом прямого

твердофазного ИФА с использованием диагностических антител против различных субизотипов мышиных антител. Из 10 отобранных антител половина содержит у1-изотип тяжелой цепи, четыре - у2а-изотип, и одно антитело - у2Ь. Однозначные результаты по изотипированию легких цепей были получены только для 5 к-легких цепей. Поэтому было решено подтвердить соответствие аминокислотной последовательности легких цепей МА и нуклеотидной последовательности их генов, полученных обратной транскрипцией на мРНК матрице, с помощью методов масс-спегфометрии, а также ПЦР-амплификации с использованием набора специфических праймеров. Для анализа легких цепей МА масс-спектрометрией они были разделены в 15% ПААГ в присутствии [3-меркаптоэтанола. Полосы, соответствующие легким цепям всех антител, были вырезаны и подвергнуты гидролитическому расщеплению трипсином. Анализ

смеси пептидов проводили на тандемном MALDI-MS/MS масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером. Анализ масс-спектров полученных фрагментов с помощью программы Mascot и идентификация белка методом сравнения с пептидными базами данных показали наличие пептидов, соответствующих последовательностям константных участков МА. Для пяти легких цепей MA К15.226, К15.727, К33.1Е7, K33.3D2, К95.В12 была подтверждена принадлежность к к- подклассу. В их спектрах были идентифицированы пептиды, соответствующие последовательности варибельного и константного доменов к- легких цепей антител мышей (рис. 3).

K33 3D2

VTMSCKSSQSLLNSR NYLAWYQQKPGQSPKLLIYW

LLIYW

NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYW ASTR

ASTRESGVPDR

ASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSWTFGGGTK

ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPK QNGVLNS

QNGVLNS

LEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNS

WTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVK WTDQDSK DEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVK

WTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

Рис. 3. Последовательность аминокислот вариабельной и константной областей к- легкой цепи МА (выделена черным цветом) и пептиды (выделены красным цветом), обнаруженные при MALDI-TOF масс-спектрометрическом анализе МА K33.3D2, производимыми клетками гибридом.

Для других пяти легких цепей антител К15.458, К15.200, К15.22, K.95.D2, К95.Е11 было установлено, что они относятся к Х- подклассу, поскольку в их спектрах обнаружены пептиды, соответствующие константному домену Х- легких цепей антител мышей.

Изотопическую принадлежность легких и тяжелых цепей исследуемой панели МА также определяли на основании результатов амплификации фрагментов генов. Получение генов вариабельных и константных областей МА

9

проводилось с использованием пар праймеров, специфичных к разным изотипам легких и тяжелых цепей. Наличие продукта ПЦР лишь в одном из вариантов реакций с различными парами праймеров позволяет судить о изотипе МА. Кроме того, полученные таким образом гены вариабельных и константных областей МА были секвенированы. Окончательные результаты изотипирования представлены в таблице 1.

Таблица 1. Изотипы моноклональных антител, полученных против трех АфлаТ.*

Иммуноген МА Тяжелые Легкие

(тип AflaT) гибридомы цепи цепи

в, К15.458 у2а X

К15.200 yi X

К15.22 yl X

К15.226 у2Ь к

К15.727 Y1 к

в2 К33.1Е7 yl к

K33.3D2 Yl к

G2 К95.В12 у2а к

K95.D2 у2а X

К95.Е11 у2а X

*По результатам ИФА, масс-спектрометрии, ПЦР и анализа нуклеотидной последовательности для каждого МА.

Такая большая доля А.- легких цепей значительно отличается от типового распределения к- и Х- подклассов мышиных антител (95% и 5%, соответственно).

Получение и анализ свойств Fab'-фрагментов из природных МА путем гидролитического расщепления

Одной из задач работы было получение рекомбинантных Fab'-фрагментов и изучение их свойств. Исследование Fab'-фрагментов целесообразно проводить на основании сравнительного анализа антигенсвязывающих свойств рекомбинантных моновалентных Fab'-фрагментов, получаемых в бактериях, и их аналогов, образующихся в результате ферментативного гидролиза полноразмерных моноклональных антител.

Природные Fab'-фрагменты всех МА исследуемой панели с чистотой не менее 80% (по данным электрофореза в денатурирующем ПААГ, рис. 4) были

получены путем ограниченного протеолиза трипсином и последующим восстановлением дисульфидных связей 2-меркаптоэтиламином. Разработан метод тестирования их функциональной активности.

12 3 4

кДа

Рис. 4. Электрофореграмма (10 % SDS-ПААГ) Fab'-фрагментов MA K33.3D2 против АфлаТ В2, полученных в результате протеолиза в невосстанавливающих условиях: 1 - маркеры молекулярной массы, 2 - K33.3D2 Fab', 3 - K33.3D2 F(ab)'2, 4 - MA K33.3D2.

Для MA трех различных подклассов yl, у2а и у2Ь условия протеолиза (рН буфера, соотношение пепсин/МА и время реакции) оптимизировали индивидуально. Аффинность полученных Fab'- и F(ab)'2 -фрагментов изучали с помощью непрямого ИФА. МА и полученные из них F(ab)'2- и Fab'-фрагменты при их различной концентрации тестировали на связывание с соответствующим коньюгатом, к которому они получены. По результатам такого титрования было обнаружено, что аффинность МА и полученных из них F(ab)'2- и Fab'-фрагментов практически не отличается от аффинности исходных полноразмерных антител (рис. 5). Такая же закономерность обнаружена для всех исследуемых антител.

концентрация белка нг/мл

Рис. 5. Непрямой ИФА. Тестирование исходных MA K33.3D2 (7) и полученных из них F(ab)V (2) и Fab'-фрагментов (3) на связывание с коньюгатом АфлаТ В2-БСА.

Это свидетельствует о сохранении функциональных свойств, полученных F(ab)V и Fab'-фрагментов, что позволяет использовать их в качестве контроля для сравнения аффинности рекомбинантных Fab'-фрагментов.

Амплификация кДНК вариабельных и константных доменов моноклональных антител

Для получения вариабельных и константных доменов МА из клеток

соответствующих линий гибридом была выделена суммарная мРНК, проведена обратная транскрипция и получены кДНК-библиотеки. Используя кДНК-библиотеку гибридомы в качестве матрицы, с помощью ПЦР в несколько стадий были амплифицированы кДНК вариабельных и константных доменов МА. При амплификации кДНК тяжелых и легких цепей антитела использовали набор ген-специфичных праймеров, комплементарных областям константных доменов различных подклассов МА. При этом ПЦР-фрагменты необходимой длины (550600 п.о. для фрагментов легких, и 600-650 п.о. для фрагментов тяжелых цепей антитела) (рис. 6) обнаруживались только в реакционной смеси, содержащей праймеры, соответствующие изотипу МА, установленному с помощью ИФА (табл. !)■

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификаций вариабельных областей легких и тяжелых цепей антитела КЗЗ. ЗЭ2 (1% агарозный гель). 1,4-маркеры молекулярной массы. Амплификация с праймерами для генов легких цепей к- (2) и Х- (3), для генов подклассов тяжелых цепей у2а (5), у1 (6) и у2Ь (7).

Амплификация вариабельных и константных участков генов МА и дальнейший анализ их нуклеотидной последовательности подтвердили достоверность результатов проведенного ранее изотипирования. В случае амплификации кДНК легких цепей некоторых МА наблюдали появление транскрипта, так называемой аберрантной к-легкой цепи антитела. Наличие такого аберрантного транскрипта легкой цепи с коротким константным доменом объясняется присутствием соответствующего гена в клетках миеломной линии Бр 2/0. Применение конкурентной ПЦР помогло избежать ко-амплификации этой последовательности из кДНК-библиотек, быстро и эффективно получить необходимые гены, кодирующие вариабельные домены МА. Анализ нуклеотидной последовательности вариабельных фрагментов легких и тяжелых цепей МА подтвердил результаты проведенного с помощью ИФА изотипирования. Аминокислотные последовательности, соответствующие нуклеотидным, были картированы для определения гипервариабельных участков (СЭЯ) варибельных областей. Выяснилось, что 4 из 5 к- легких цепей и 3 из 5 Х- легких цепей полностью совпадают по аминокислотной последовательности (рис. 7).

Каппа - легкие кепи

CDR-I CDR-2

22 6 NIJ^eSPSSIAVSAGEKVTMSCKSSQSVLyCSNQJOfyiAWyQQKPGQSPKLLiyWAS

727 NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSCCVLYSSKQtCn'LAW'YQQKPGQSPKLLIYWAS ЗД2 NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVIjYSSNQKXYLAWYQQKPGQSPKLL IYWA3 1Е7 NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKN'YLAWYQQKPGQSPKLLIYWAS B12 DIVMTQCQKFM3T3VGDSVCVTCKASQKVGTNVA------KYQQKPGÜSPAALIYSAS

CDR-3

226 TRSSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS5VQAEDLAVYYCHQYLSSST-FGGGTKLEIKRADAA 7 27 TPESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSWT-FGGGTKLEIKRADAA ЗД2 TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSWT-FGGGTKLEIKRADAA 1E7 TRESGVPDRFTGSCSCTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSÍ'iT-FGGGIKLEIKRADAA B12 YRYSGVi^RFTG:jCSiV14;r'T¡j;4SNVQ:-i::^AEVFCQ0YNSYPRTFGGG:! .KLMb'KAÑAA

Лямбда -Легкие цени

CDR-I

4 58 IMAWISLILSLLALSSGAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRS5TGAVTTSNSANKVQEK

200 imawislilsllalssgaiscavvtqesalttspgetvtltcrsetgavttsnsanwvqek

22 imawislilsllalssgaiscavvtqesalttspgetvtltcrsstgavttsnsanwvqek

El 1 :MAWISLII^bIAl3SC^tSCftVVTgBSAbTTSPGETV7tTCI>.SSTGAVTTSflYANWV0F.K

D2 :MAW7SLXLSLLALCS<JASSCAWTÜESALTTSP(JG7VTtTCBSSTGAVrrSMYANWVÜEK

CDR-2 CDR-3

4 58 PDHLFTGLIGGTNMIÍAPGVPARFSGSLIGDKAALTlTGAQTEDEAlYb'CALWYSNHLVFG

200 PDHLFTGLIGGTNMRArGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCAI.WYSNHt.VFG

22 PDHLFTGLIGGTMNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAI YFCAI.WYSMHLVFG

Ell PDHLFTGLIGGTMNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTlTGAQTEDEAIYFCALWYGNHr'VFG

D2 PDHLFTGLIGGTSNRAPGVPVHFSGGL,1GDKAVLTITGAQTE3DAKYFCALWYS'1HFVFG

4 58 GGTKLTALRHHKSS PSVSLPRDN 200 GGTKLTALRHHKSSPSVSLPRDN 22 GGTKLTALRHHKSSPSVSLPRDN Ell GGTKLTVLGQPK3SPSVTLPRDN D2 GGTKVTVLGOPKSTP'rs.'rvi'PP;;

Рисунок 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных участков генов легких цепей антител. Необходимые для построения разрывы отмечены «-».

Легкая цепь антитела В12 имеет наибольшие различие в аминокислотном составе CDR- участков по отношению к другим к- легким цепям. В то же время, легкие цепи антител Е11 и D2 имеют лишь по одной аминокислотной замене в каждом CDR- участке, по сравнению с другими Х- легкими цепями. Были обнаружены также аминокислотные остатки, консервативные для к- и Х- легких цепей. Так, в первом CDR- участке обоих подклассов легких цепей во 2-ом, 3-м и 10-ом положении находится серин. В CDR-2 в 5-ом положении - аргинин, а в CDR-3 в 5-ом положении - серин.

Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей фрагментов вариабельных участков генов тяжелых цепей антител показал, что некоторые из них имеют определенный уровень гомологии, однако все три СБЯ - участка тяжелых цепей отличаются аминокислотным составом (рис. 8).

С1Ж-1 сок-?.

К".-»-')* 8

к: :>-2оо нкг/к,;

г: >2 кун1.ук.зссс1.уккх»1ж1лсаазс!п>£.)глнзкук0'.'.->ккк1.ь'»!уал зззсзу л-уисуп-:-

юые'» «-««»»«^^«(^ииткзсклзоу^тр.?^^

у <г,-к". 1 1 • г [:)•:'■■ "

к'>5-;г2 К^КЬУЕЗССС1-УКРСС51-КЬЗСААЗГ,К 1 ьмз 'ЛМЗХУР.О^рекоьекуаз 1 .>.''.с<;м-: унги'л-'-т

зси-з

_ - 1и ■ какьтаутзтзтаумзьз:;гл зхззауу у"Т¡._I' -; г- у :[ л г^;^у,г:у/тукаа;-.ттарзуурзлр

к: '>-200 кгпзгчо^Акт'зуьс'МззькзЕРГАмзуСАв-----нгА1КАН-и\'Кй0вТ8УТУ83АКТТРр0УУ?1Л1'

к" к -'г; зкп^лкпт.л'зомззркзглгамуузлр-----н :л ^ам-:у1^с£гл'зу^ззактгррзуур!.ар

к. вг,зтзк1)чзкзаУ1т,кммз1,ит:^г;тлмуусл':'--уому------с;аумсостзуТ\'ззлкттррзуур1.АР

кзз-1еу катьтзпкзззтаг'меьззьтзег-заууузаз-----?т7суу!;:<от»30сттьтул5лктт?р5уу?1лр

кзз-лзг кат1-автпзита!'10ьззьтзе:!та\'ууза?----------у03 : 3'г,-оссатт зтуззакттррзуурьар

к»5-в; 1 ук.:- г :екикакн:ьу]лм331ркезтамуусакзг-;у.з----оз^кауи'зостьутузаакттарзуурьар

к"»5-п? кг аузяпиаки 1 :.у1,омзз1.кзк:;гамнускка.-нг:;-----алнагкоостьутузаактгарзууркар

Рисунок 8. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных участков генов тяжелых цепей антител. Необходимые для построения разрывы отмечены «-».

Таким образом, несколько антител, имеющих различные параметры аффинности и кросс-реактивности, содержат одну легкую цепь. Это может говорить о том, что эти параметры определяются разными тяжелыми цепями в их составе, а точнее различием в антигенсвязывающем центре, образуемым ими с легкой цепью. Можно также предположить, что легкие цепи в составе антител выполняют каркасную функцию, стабилизируя трехмерную структуру антигенсвязывающего центра.

Получение плазмидных конструкций для экспрессии рекомбинантных антител

Для получения экспрессионных конструкций нуклеотидные последовательности

фрагментов вариабельных и константных участков МА были амплифицированы и объединены методом ПЦР с перекрывающимися областями (БОЕ-РСЯ). При этом

сохранена изотипическая принадлежность генов иммуноглобулинов - для каждого антитела получали ген константной области из библиотек кДНК. Гены Fab'-фрагментов МА были клонированы в экспрессионный вектор рТгс в виде бицистронной конструкции. Для упрощения процесса выделения Fab'-фрагментов перед легкой и тяжелой цепью (на 5'-конце) в этих конструкциях вставлены последовательности, кодирующие лидерный пептид stll термостабильного энтеротоксина II E.coli, для секреторной экспрессии целевого белка в культуральную среду. Для последующей очистки белков с использованием метал-аффинной хроматографии на З'-конец генов тяжелых цепей помещена синтетическая последовательность, кодирующая додекагистидиновый таг. По данной схеме в экспрессионный вектор были клонированы гены пяти МА: К15.458, К 15.200, К15.226, К33.1Е7, K33.3D2 (рис. 9).

(а)

[Ncol] Ndel

stll

BamHI Ndel

SD stll

Xhol

Hindll I

pTrc-stIILH12His

Trc term

H

12xHis

(б)

KcxRV (538!) Apd( 5142) Bspi20l (5138) laclq

мы (4931)

SpH (4492)

JVd<JC4226) ___ replication start

ColE1 ori

Ptrc

pTrcLH12his

Около 5700 bp

bla

NdiI (330)

Легкая цепь

■"Я ßcmHI (982) JVdd (1062)

¿f Тяжелая цепь

Xhd (1802) 12His

нши C1847) Term

Рисунок 9. Схемы бицистройной конструкции для экспрессии генов Fab'-фрагментов антител (а) и вектора pTrcLH12His, содержащего VC-фрагменты генов легкой (VCL) и тяжелой цепей (VCH) пяти МА: К15.458, К15.200, К15.226, К33.1Е7, K33.3D2 (б).

Биосинтез и выделение рекомбинантных Fab' - фрагментов МА

В результате проведенных ранее исследований было показано, что

наибольший уровень продукции Fab'-фрагментов различных МА при их секреции

в культуральную жидкость наблюдается в клетках Е. coli BL-21 (DE3), поэтому

данный штамм был выбран для проверки экспрессии полученных конструкций.

Проведены индукция и культивирование при трех различных температурах (23°С,

30°С, 37°С) в небольших объемах. Результаты дот-блот-гибридизации

свидетельствуют о том, что наибольшее количество рекомбинантного Fab'-

фрагмента обнаруживается в культуральной жидкости при температуре инкубации

30°С (рис. 10 а). Больший выход рекомбинантных Fab' - фрагментов при

17

температуре 30°С может быть связан с замедлением биосинтеза белка клетками Е. coli , что важно для сворачивания белка и образования необходимой трехмерной структуры Fab' - фрагментов. Это и приводит к повышению выхода полноценных, функционально активных Fab' - фрагментов антител.

(а) (в)

КДа 1 2 3

Рис. 10. Результаты дот-блот анализа накопления Fab'-фрагмента МА K33.3D2 в культуральной жидкости клеток Е. coli BL-21 (DE3). (а) -нетрансформированные клетки (/); клетки, трансформированные плазмидой, содержащей легкую цепь Fab'-фрагмента (2); клетки, трансформированные плазмидой pTrcLH12His при 23°С (3, 4), 30°С (5, б), 37°С (7, 8) (по данным двух независимых экспериментов). Контроль наличия Fab'-фрагмента MA K33.3D2 при его очистке и выделении из культуральной жидкости клеток Е. coli BL-21 (DE3). (б) - Культурапьная жидкость клеток, трансформированных плазмидой pTrcLH12His, до центрифугирования (1); супернатант культуральной жидкости после центрифугирования (2); культурапьная жидкость нетрансформированных клеток (3), культурапьная жидкость клеток, трансформированных плазмидой с легкой цепью Fab'-фрагмента (4); культуры клеток, продуцирующих Fab'-фрагменты антител против ФНО (5, 10); сконцентрированная культуральная жидкость (6); жидкость, удаленная при концентрировании (7); диализованный концентрат культуральной жидкости (8); буфер после диализа (9). (в) -Электрофореграмма (12 % SDS-ПААГ) аффинно-очищенного Fab'-фрагмента антитела КЗЗ 3D2 (2 - в буфере с меркаптоэтанолом, 3 - без меркаптоэтанола); 1 -маркеры молекулярной массы.

Экспрессию рекомбинантных Fab'-фрагментов проводили при температуре

18

30°С, после чего культуры центрифугировали, а супернатанты концентрировали в 50 раз. Причем при очистке Fab'-фрагментов, содержащих Х- легкие цепи, на стадии концентрирования добавляли детергент Tween-20 до концентрации 0.05%. Процесс выделения контролировали дот-блот-гибридизацией аликвот раствора белка, отобранных после каждой стадии очистки (рис. 10 б). Для очистки рекомбинантных Fab'-фрагментов использовали аффинную хроматографию на Со2+ИДА-сефарозе. В случае с Fab'-фрагментами, содержащими Х- легкие цепи, данный этап очистки так же проводился в присутствии 0.05% Tween-20. По данным электрофоретического анализа в денатурирующем ПААГ получены высокоочищенные Fab'-фрагменты с молекулярными массами легких и тяжелых цепей около 25 кДа (рис. 10 в). Таким образом, продемонстрировано, что разработанный метод наработки, выделения и очистки позволяет получать рекомбинантные Fab'-фрагменты для анализа их функциональной активности (аффинность и кросс-реактивность) (рис. 11).

(а) (б)

КДа 1 2 3 3 2 1 КДа

117

90 117

90

49

Fab-фрагмент ,

35

26 19

49

Тяжелая ч 35

цепь \ .■Легкая

цепь ч 26

I 19

Рис.11. Очистка рекомбинантных РаЬ'-фрагментов с помощью аффинной хроматографии: МА К15.3Э2 с к- легкой цепью (а), МА К15.458 с Х- легкой цепью (б). 1 - маркеры молекулярной массы, 2 - образцы, нанесенные в буфере, содержащем (3- меркаптоэтанол, 3 - образцы, нанесенные в буфере без (3-меркаптоэтанола.

Масс-спектрометрический анализ соответствующих полос на

электрофореграмме подтвердил наличие в них аминокислотных последовательностей легких и тяжелых цепей рекомбинантных Fab'-фрагментов. Кроме того, было выявлено, что Fab'-фрагменты, содержащие X - легкие цепи, совыделяются с бактериальным шапероном GroEL. Выход белка для Fab'-фрагментов с Х - и к- легкими цепями различается и составляет 0.1-1 мг и 1.5 мг с одного литра культуры, соответственно. Такой сильный разброс можно, по-видимому, объяснить существенными различиями в сворачивании к- и X— легких цепей. Для последних, вероятно, необходимо присутствие шаперонов для осуществления правильного фолдинга и образования функционально активного комплекса с тяжелой цепью. Процесс сборки Fab'-фрагментов, состоящих из X-легкой и тяжелой цепей, в этом случае затруднен, что является причиной уменьшения выхода белка при экспрессии в культуральную жидкость.

Определение аффинности и кросс-реактивности МА и Fab'-фрагментов

Данные непрямого ИФА показали, что кривые титрования МА (зависимости степени связывания с антигеном от концентрации МА) имеют традиционную сигмоидную форму. Антитела имеют высокую аффинность к коньюгатам АфлаТ-БСА, значения констант диссоциации находятся в диапазоне от 10*9-10"7 М. Методом конкурентного ИФА показана способность МА связывать свободные АфлаТ. Для каждого из МА исследовали связывание с четырьмя типами АфлаТ (Вь В2, Gb G2) как в свободном виде, так и в составе конъюгатов с БСА (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительная характеристика аффинности и кросс-реактивности

UPUUtlV А пплтип ТПРУ nQQTIUUUUV ЛЛпоТ *

Иммуноген МА Афлатоксины

в, В2 G, G2

\флатоксин К15.200 ++ нд + -

В, К15.22 +++ нд ++ -

К15.458 +++ нд ++ -

К15.727 + нд - -

К15.226 ++ нд + -

Чфлатоксин в2 К33.1Е7 ++ +++ - -

КЗ 3.302 1 1 1 1 1 1 11 +++ +++

\флатоксин о2 К95.В12 + - - +

К95.02 + - + ++

К95.Е11 ++ - +++ +++

*нд- нет данных, прочерк - отсутствие связывания, количество знаков (+) отражает аффинность МА по отношению к соответствующему антигену, по данным непрямого, твердофазного и конкурентного ИФА

Два МА (К33.302 и К33.1Е7), полученные против АфлаТ В2, обладают наибольшей аффинностью. Они способны связывать как свободные АфлаТ, так и конъюгаты АфлаТ-БСА с высоким сродством, однако их специфичность по отношению к АфлаТ значительно различается. МА КЗЗ.ЗЭ2 взаимодействует с АфлаТ всех четырех типов примерно с одинаковой силой связывания, тогда как МА К33.1Е7 характеризуется большей селективностью, т.к. взаимодействует только с АфлаТ В) и В2, проявляя при этом высокое сродство к ним. Аффинность МА серии К15 значительно различается. Все они связываются с АфлаТ Вь против которого были получены, проявляя меньшее сродство к АфлаТ 01. МА серии К95 (иммуноген - АфлаТ 02-БСА) связываются в различной степени с АфлаТ О), (}2 и В). При этом ни одно из них не связывается с АфлаТ В2, а наименее аффинное по отношению к АфлаТ 02 (К95.В12) не связывается и с АфлаТ О). Наименьшими показателями аффинности обладают МА К15.727 и К95.В12. При этом К15.727 связывается только с АфлаТ В], а К95.В12 - с В] и 02. Из приведенных данных следует, что полученные МА обладают широким спектром показателей аффинности и кросс-реактивности, что очень важно для их дальнейшего

21

использования. Так, MA K33.3D2, связывающее четыре типа АфлатТ с высоким сродством, может быть использовано для тест систем и эффективного суммарного определения АфлаТ, a MA К33.1Е7, обладающее высоким сродством к АфлаТ В2, -для специфичного определения данного токсина.

Для восьми полученных путем протеолиза трипсином Fab'-фрагментов на основе результатов конкурентного ИФА были рассчитаны константы связывания с четырьмя типами АфлаТ. Для измерения аффинности использовали метод иммуноферментного анализа. В качестве антигенов использовали свободные афлатоксины Bl, В2, Gl, G2. Для этого строили калибровочные кривые зависимости оптической плотности от концентрации Fab'- фрагментов. На рис. 12 а приведена калибровочная кривая для Fab'- фрагмента MA К15.458. Для ее построения использовали диапазон концентраций от 1000 нг/мл до 50 нг/мл. При этом удалось выбрать диапазон концентраций, при котором зависимость оптической плотности OD 450 нм от разведения К15.458 Fab' - фрагмента имеет практически линейный вид, что позволяет использовать упрощенный метод для расчета Кд.

(а)

(б)

• AflaB 1

Г

< г.5

Концентрация Fab'-фрагмента г мкг/мл (1/а) х 10 '"М '

( В ) го«, 26 ( Г )

<68 (1/а) х 10*М ■'

- (Д)

2 а 6 в 10 12 14 16

(1/а) х 10 'М '

(1/а) х 10 М

Рис. 12. Калибровочная кривая зависимости оптической плотности от концентрации Fab'- фрагментов MA К15.458, непрямой ИФА (а). Кривые Клотца для связывания Fab'-фрагментов MA К15.458 с АфлаТ Bi (б), В2 (в), G] (г), G2 (д).

Константу диссоциации (Кд) рассчитывали по уравнению Клотца: Ао/Ао-А=1+1/а Кд, где Ао - оптическая плотность, измеренная для Fab' в отсутствии антигена, А - оптическая плотность, измеренная для свободных Fab' в смеси антиген-антитело, а- концентрация антигена. Концентрацию Fab' для измерения Кд выбирали на линейном участке калибровочной кривой. Кривые Клотца для связывания Fab'-фрагментов MA К15.458 с АфлаТ Вь В2, Gb G2 приведены на рис. 12 б, в, г и д. Константы диссоциации для других семи Fab'-фрагментов были рассчитаны аналогичным образом и приведены в таблице 3 а.

23

Таблица 3. Аффинность полученных гидролитическим расщеплением трипсином Fab'-фрагментов МА.*

А. Константы диссоциации_

Кд, М

Fab' АфлаТ В, АфлаТ B2 АфлаТ Gi АфлаТ G2

К 15.200 8,3 х10"у 2,4 xlO"8 2,4 xlO"8 6,5 xlO"8

К15.22 3x10" 6,6x10"8 1,2 xlO"8 4,4 xlO"'

К15.458 4,7x10"" 1,8x10"' 2,8 xlO"8 8,3 xlO"'

К 15.727 1,6x10"' 2,1 xlO"' 3x10"' 1,1 xlO"6

К33.1Е7 1,7x10"' 4,5 xlO"8 1,8 xlO'6 6x10"'

K33.3D2 1 х 10"8 6 х10"у 2,3 xlO'8 2,9 xlO"8

K95.D2 6,3 xlO"8 6,3 xlO"8 9 xlO"9 4,5 xlO""

К95.Е11 2,5 xlO"5 5,8 xlO"6 7,5 xlO"8 7x10"'

К95.В12 9,0x10"" 7,8 xlO"6 5,5 xlO'6 3,5 xlO"b

*Приведены значения констант диссоциации (М).

Б. Относительное значение аффинности (минимальная Кд принята за 1, остальные рассчитаны относительно нее)_

Кд, М

Fab' АфлаТ В! АфлаТ В2 АфлаТ Gt АфлаТ G2

К15.200 2771 958 958 354

K15.22 7667 348 1917 52

K15.458 4894 128 821 28

К 15.727 144 110 77 21

K33.1E7 135 511 13 38

K33.3D2 2300 3833 1000 793

K95. D2 365 365 2556 5112

K95.E11 1 4 307 33

K95.B12 3 3 4 7

Связывание с четырьмя типами АфлаТ

Кросс-реактивность, %

Fab' АфлаТ В] АфлаТ В2 АфлаТ Gi АфлаТ G2

К15.200 100 35 35 13

К 15.22 100 5 25 1

К15.458 100 3 17 1

К15.727 100 46 53 15

К33.1Е7 26 100 3 7

K33.3D2 60 100 26 21

К95. D2 7 7 50 100

К95.Е11 0 1 100 11

К95.В12 43 43 57 100

Критерием аффинности для Fab'-фрэгментов являлись значения констант диссоциации, а кросс-реактивность по отношению к четырем АфлаТ рассчитывалась по значениям Кд в % от максимальной.

Как видно из таблицы, Кд Fab'-фрагментов МА варьируют в достаточно широком диапазоне от 2.5 х 10'5 М до 3.0 х 10"9 М. При этом сохраняется специфичность полученных Fab'-фрагментов, поскольку их аффинность к АфлаТ, который входил в состав конъюгата при иммунизации, выше, чем к другим типам. Так, Fab'-фрагменты серии К15, полученные против коньюгата БСА-АфлаТ Вь имеют большую аффинность к свободному АфлаТ Вь чем к АфлаТ В2, Gi, G2. Аналогичным образом МА серий КЗЗ и К95 проявляют наибольшую аффинность к свободным АфлаТ В2 и Gi, соответственно. Таким же способом рассчитаны константы диссоциации для полученных в бактериальной системе экспрессии рекомбинантных Fab'-фрагментов. Их константы диссоциации совпадают с таковыми для Fab'-фрагментов МА. Кд к четырем АфлаТ для рекомбинантных Fab'-фрагментов 3D2 и 458 представлены в таблице 4.

Таблица 4. Сравнение констант диссоциации рекомбинантных РаЬ'-фрагментов КЗЗ.ЗР2 и К15.458 с полученными гидролитическим расщеплением._

Кд, М

Fab' АфлаТ В] АфлаТ В2 АфлаТ Gi АфлаТ G2

K33.3D2 1,15 хЮ"8 2,1 хЮ"8 4 хЮ"8 4,5 xlO"8

Рекомбинантный 3D2 1,1 х 10"" 1,6 хЮ"8 3 хЮ"8 4,5 xlO'8

К15.458 4,4x10"9 2 х 10"7 3 х 10"8 8,5 x 10"7

Рекомбинантный 458 5 х 10"9 5,2 х 10"' 3,5 x 10"8 8,3 x 10"'

Как видно из таблицы, Кд практически совпадают (идентичны) для четырех афлатоксинов, что указывает на идентичность аминокислотных последовательностей, характера фолдинга и функциональных свойств рекомбинантных белков и РаЬ'-фрагментов, полученных из МА. Кд по отношению к АфлаТ В2 в 2-3 раза ниже, чем рассчитанная ранее, что, скорее всего, связано с деградацией АфлаТ В2 при хранении. Таким образом, были получены функционально активные рекомбинантные РаЬ'-фрагменты, сохраняющие аффинность и специфичность по отношению к свободным АфлаТ.

выводы

1. Впервые получены гены панели из 10 моноклональных антител к афлатоксинам Bi, В2, G2, определена их нуклеотидная последовательность, картированы гипервариабельные участки вариабельных доменов легких и тяжелых цепей антител.

2. Обнаружено необычное для мышей соотношение подклассов легких цепей - половина антител содержат легкие цепи лямбда подкласса.

3. Показано ограниченное разнообразие легких цепей антител, как каппа, так и лямбда подклассов. Это позволяет предположить, что основную роль в формирование аффинности по отношению к гаптену вносят тяжелые цепи полученных антител.

4. Разработан метод экспрессии и очистки функционально активных рекомбинантных антител к афлатоксинам в виде Fab'-фрагментов.

5. Показано, что полученные рекомбинантные Fab'-фрагменты обладают аффинностью и кросс-реактивностью, не уступающими по значениям исходным моноклональным антителам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Калиниченко A.A., Топорова В.А., Панина A.A., Алиев Т.К., Крюкова Е.А., Шемчукова О.Б., Солопова О.Н., Позднякова Л.П., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. (2010) Получение антител против афлатоксинов различных типов и их свойства. Биоорганическая Химия (Москва). 36(1) с. 122-132

2. Калиниченко A.A., Топорова В.А., Панина A.A., Алиев Т.К., Крюкова Е.А., Позднякова Л.П., Свешников П.Г., Долгих Д.А. (2010) Особенности экспрессии рекомбинантных Fab'-фрагментов антител к афлатоксинам. Естественные и технические науки (Москва). 45(1) с. 138-148

Тезисы конференций

1. Калиниченко A.A., Топорова В.А., Панина A.A., Алиев Т.К., Крюкова

Е.А., Шемчукова О.Б., Солопова О.Н., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Изучение структуры антител против афлатоксинов. Тезисы докладов Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», с. 232-233 (Гурзуф, 31 мая - 9 июня 2008 г.)

2. Kalinichenko A.A., Panina A.A., Aliev Т.К., Shemchukova O.B., Solopova O.N., Sveshnikov P.G., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Structure of the antibodies against aflatoxins. FEBS Journal V. 275 (1), p. 406 (Abstracts of 33d FEBS Congress, Athens, 28 June - 4 July 2008)

3. Dolgikh D.A., Aliev Т.К., Panina A.A., Kalinichenko A.A., Toporova V.A., Kryukova E.A., Shemchukova O.B., Solopova O.N., Sveshnikov P.G., Quemeneur E., Raoul H., Kirpichnikov M.P. Immunological detection of aflatoxins: functional and genetic analysis of monoclonal antibodies. ll'h SAC Seminar "New Trends in Chemical Toxicology", p. 59 (Moscow, 22-25 September 2008)

4. Калиниченко A.A., Топорова B.A., Панина A.A., Алиев Т.К., Крюкова Е.А., Шемчукова О.Б., Солопова О.Н., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Структурные особенности антител к афлатоксинам. Тезисы докладов 21-й школы молодых ученых «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», с. 9 (Москва, 9-11 февраля 2009 г.)

5. Kalinichenko А.А., Dolgikh D.A., Aliev Т.К., Panina А.А., Toporova V.A., Kryukova E.A., Shemchukova O.B., Solopova O.N., Sveshnikov P.G., Quemeneur E., Raoul H., Kirpichnikov M.P. The influence of chain shuffling on the properties of anti-aflatoxin antibodies. FEBS Journal 276 (1), p. 371 (Abstracts of 34th FEBS Congress Prague, 2-9 July 2009)

Подписано в печать:

18.02.2010

Заказ № 3307 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калиниченко, Артем Андреевич

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7 И. 1 Общие сведения об афлатоксинах.

11.1.1 Открытие афлатоксинов.

И. 1.2 Химические и физические свойства афлатоксинов, их источники. 8 II. 1.3 Воздействие афлатоксинов на организм человека и животных.

11.2 Способы детоксикации афлатоксинов в пищевых продуктах и кормах

11.3 Способы детекции афлатоксинов в пищевых продуктах и кормах.

11.3.1 Аналитические методы.

11.3.2 Скрининговые методы.

11.4 Антитела против афлатоксинов: получение и использование.

11.5 Системы эксперессии антител.

II.5.1 Экспрессия в клетках E.coli.

II.5.1 Эксперессия в клетках дрожжей.

II.5.1 Эксперессия в культурах клеток животных.

И.5.1 Эксперессия в растениях.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43 Реактивы.

Клетки гибридом и МА.

Буферные растворы.

Микробиологические среды.

Олигонуклеотиды, использованные для ПЦР.

Использованные методы:.

Прямой, непрямой и конкурентный иммуноферментный анализ.

Электрофорез белков в ПААГ.

Дот-блот анализ.

Получение функционально активных Fab'-фрагментов из МА.

Выделение мРНК, обратная траскрипция и амплификация вариабельных и константных доменов МА.

Получение генноинженерых конструкций.

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Сборка вектора для экспрессии рекомбинантных антител в виде Fab 'фрагментов.!.

Экспрессия и очистка рекомбинантных Fab'-фрагментов к AflaT.

Масс-спектрометрический анализ МА. и рекомбинантных Fab'- фрагментов.

Расчет констант диссоциации антител к АфлаТ.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ моноклональных антител против афлатоксинов Вь В2, G2.

Определение подтипов легких и тяжелых цепей антител.

Амплификация кДНК вариабельных и константных доменов моноклональных антител.

Получение плазмидных конструкций для экспрессии рекомбинантных антител.

Биосинтез и выделение рекомбинантных Fabфрагментов МА.

Определение аффинности и кросс-реактивности Fab'-фрагментов.

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Калиниченко, Артем Андреевич

выводы

1. Впервые получены гены панели из 10 моноклональных антител к афлатоксинам Вь B2, G2, определена их нуклеотидная последовательность, картированы гипервариабельные участки вариабельных доменов легких и тяжелых цепей антител.

2. Обнаружено необычное для мышей соотношение подклассов легких цепей - половина антител содержат легкие цепи лямбда подкласса.

3. Показано ограниченное разнообразие легких цепей антител, как каппа, так и лямбда подклассов. Это позволяет предположить, что основную роль в формирование аффинности по отношению к гаптену вносят тяжелые цепи полученных антител.

4. Разработан метод экспрессии и очистки функционально активных рекомбинантных антител к афлатоксинам в виде Fab'-фрагментов

5. Показано, что полученные рекомбинантные Fab'-фрагменты обладают аффинностью и кросс-реактивностью, не уступающими по значениям исходным моноклональным антителам.

БЛАГОДАРНОСТИ

Благодарю людей, с помощью которых состоялась эта работа. В первую очередь своего научного руководителя Долгих Дмитрия Александровича за ценные советы и направление в нужное русло, Алиева Теймура Кантамировича за помощь в интерпретации результатов и написании работы, Кирпичникова Михаила Петровича за интересную тему. Большое спасибо Топоровой Виктории Александровне за обучение хитростям молекулярной биологии, генной инженерии и пример целеустремленности. Большую признательность выражаю Паниной Анне Алексеевне и Литвинову Ивану Сергеевичу за многочисленные обсуждения, и редактирование печатных работ. Благодарю Болдыреву Елену Филипповну и Крюкову Елену Александровну за регулярную помощь в работе. Спасибо Шулепко Михаилу Анатольевичу, Копейной Гелине Сергеевне, Балабашину Дмитрию Сергеевичу и Хабибуллиной Нелле Фамзуловне за дружескую атмосферу и поддержку в сложных ситуациях. Выражаю глубокую признательность Петровской Ладе Евгеньевне и Шингаровой Людмиле Николаевне за ценные советы. Отдельная благодарность Шемчуковой Ольге Борисовне, Солоповой Ольге Николаевне и Поздняковой Любовь Петровне за анализ рекомбинантных белков и МА. Большая благодарность Свешникову Петру Георгиевичу за сотрудничество, гибридомы и разъяснение тонкостей иммунологического анализа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калиниченко, Артем Андреевич, Москва

1. Duran, R.M., J.W. Сагу, and A.M. Calvo, Production of cyclopiazonic acid, aflatrem, and aflatoxin by Aspergillus flavus is regulated by veA, a gene necessaiy for sclerotial formation. Appl Microbiol Biotechnol, 2007. 73(5): p. 1158-68.

2. Goldblatt, L., ed. Aflatoxin. scientific background, control, and implications 1969, Academic Press: New York.

3. Malloy, C.D. and J.S. Marr, Mycotoxins and public health: a review. J Public Health Manag Pract, 1997. 3(3): p. 61-9.

4. Robbins, C.A., et al., Health effects of mycotoxins in indoor air: a critical review. Appl Occup Environ Hyg, 2000. 15(10): p. 773-84.

5. Diaz, G.J., E. Calabrese, and R. Blain, Aflatoxicosis in chickens (Gallus gal his): an example ofhormesis? Poult Sci, 2008. 87(4): p. 727-32.

6. Azziz-Baumgartner, E., et al., Case-control study of an acute aflatoxicosis outbreak, Kenya, 2004. Environ Health Perspect, 2005. 113(12): p. 1779-83.

7. Nyikal, J.A., et al., Outbreak of aflatoxin poisoning-Eastern and Central Provinces, Kenya, January-July 2004. Morb. Mortal. Wlcly. Rep., 2004. 53: p. 790-793.

8. Lewis, L., et al., Aflatoxin contamination of commercial maize products daring an outbreak of acute aflatoxicosis in eastern and central Kenya. Environ Health Perspect, 2005. 113(12): p. 1763-7.

9. Asao, Т., et al., The Structures of Aflatoxins В and G. J Am Chem Soc, 1965. 87: p. 882-6.

10. Yu, J., et al., Clustered pathway genes in aflatoxin biosynthesis. Appl Environ Microbiol, 2004. 70(3): p. 1253-62.

11. Do, J.H. and D.-K. Choi, Aflatoxins: Detection, Toxicity, and Biosynthesis. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2007. 12: p. 585-593.

12. Robinson, J. A., Polyketide synthase complexes: their structure and function in antibiotic biosynthesis. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci, 1991. 332(1263): p. 107-14.

13. Goto, Т., D.T. Wicklow, and Y. Ito, Aflatoxin and cyclopiazonic acid production by a sclerotium-producing Aspergillus tamarii strain. Appl Environ Microbiol, 1996. 62(11): p. 4036-8.

14. Klich, M.A., et al., Molecular and physiological aspects of aflatoxin and sterigmatocystin biosynthesis by Aspergillus tamarii and A. ochraceoroseus. Appl Microbiol Biotechnol, 2000. 53(5): p. 605-9.

15. Peterson, S.W., et al., Aspergillus bombycis, a new aflatoxigenic species and genetic variation in its sibling species, A. nomius. Mycologia 2001. 93: p. 689703.

16. Klich, M.A. and J.I. Pitt, Differentiation of Aspergillus flavus from Aspergillus parasiticus and other closely related species. Trans. Br. Mycol. Soc., 1988. 91: p. 99-108.

17. Martins, H.M., M.L. Martins, and F.A. Bernardo, Interaction of strains of non-toxigenic Aspergillus flavus with Aspergillus parasiticus on aflatoxin production. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., 2000. 37: p. 1234-1237.

18. Detroy, R.W., E.B. Lillehoj, and C. A., Aflatoxin and related compounds. Microbial toxins, vol. VI: fungal toxins, ed. A. Press. 1971, New York.

19. Diener, U.L., et al., Epidemiology of aflatoxin formation by Aspergillus flavus. Annu. Rev. Phytopathol., 1987. 25: p. 249-270.

20. Klich, M.A., The degree of susceptibility of nectary-inoculated cotton flowers and bolls to subsequent seed infection by Aspergillus flavus is determined at or before anthesis. Appl Environ Microbiol, 1990. 56(8): p. 2499-502.

21. Dorner, J., Biological Control of Aflatoxin Crop Contamination. Aflatoxin and Food Safety. 2005. p. 333-352.

22. Van Egmond, H.P., Mycotoxins in daily products. Aflatoxin M^ occurrence, toxicity, regulation, in Mycotoxins in dairy products. Aflatoxin Mi: occurrence, toxicity, regulation

23. E.A. Science, Editor. 1989, Elsevier Applied Science: London, p. 11-55.

24. Wang, J.S. and J.D. Groopman, DNA damage by mycotoxins. Mutat Res, 1999. 424(1-2): p. 167-81.

25. Newberne, P.M. and W.H. Butler, Acute and chronic effects of aflatoxin on the liver of domestic and laboratory animals: a review. Cancer Res, 1969. 29(1): p. 236-50.

26. Peers, F.G. and C.A. Linsell, Dietary aflatoxins and liver cancer—a population based study in Kenya. Br J Cancer, 1973. 27(6): p. 473-84.

27. Shank, R.C., et al., Dietary aflatoxins and human liver cancer. IV. Incidence of primary liver cancer in two municipal populations of Thailand. Food Cosmet Toxicol, 1972. 10(2): p. 171-9.

28. Heinonen, J.T., et al., Determination of aflatoxin B1 biotransformation and binding to hepatic macromolecules in human precision liver slices. Toxicol Appl Pharmacol, 1996. 136(1): p. 1-7.

29. Kumara, V., M.S. Basua, and T.P. Rajendran, Mycotoxin research and mycoflora in some commercially important agricultural commodities Crop Protection, 2008. 27(6): p. 891-905.

30. Richard, J.L., et al., Effect of ochratoxin and aflatoxin on serum proteins, complement activity, and antibody production to Brucella abortus in guinea pigs. Appl Microbiol, 1975. 29(1): p. 27-9.

31. Richard, J.L. and J.R. Thurston, Effect of aflatoxin on phagocytosis of Aspergillus fumigatus spores by rabbit alveolar macrophages. Appl Microbiol, 1975. 30(1): p. 44-7.

32. Netke, S.P., et al., Ascorbic acid protects guinea pigs from acute aflatoxin toxicity. Toxicol Appl Pharmacol, 1997. 143(2): p. 429-35.

33. Schlemper, В., et al., DNA binding, adduct characterisation and metabolic activation of aflatoxin BI catalysed by isolated rat liver parenchymal, Kupffer and endothelial cells. Arch Toxicol, 1991. 65(8): p. 633-9.

34. Bingham, A.K., T.D. Phillips, and J.E. Bauer, Potential for dietary protection against the effects of aflatoxins in animals. J Am Vet Med Assoc, 2003. 222(5): p. 591-6.

35. Coulombe, R.A., Jr., Biological action of mycotoxins. J Dairy Sci, 1993. 76(3): p. 880-91.

36. Creppy, E.E., Update of survey, regulation and toxic effects of mycotoxins in Europe. Toxicol Lett, 2002. 127(1-3): p. 19-28.

37. Williams, J.H., et al., Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. Am J Clin Nutr, 2004. 80(5): p. 1106-22.

38. Cancer, I.A.f.R.o., IARC Monograph Supplement 4. 1982: Lyon.40. http://www. iarc.fr/en.

39. Hsieh, L.L., et al., Immunological detection of aflatoxin Bl-DNA adducts formed in vivo. Cancer Res, 1988. 48(22): p. 6328-31.

40. Booth, S.C., et al., The activation of aflatoxin BI in liver slices and in bacterial mutagenicity assays using livers from different species including man. Carcinogenesis, 1981. 2(10): p. 1063-8.

41. Croy, R.G., et al., Identification of the principal aflatoxin Bl-DNA adduct formed in vivo in rat liver. Proc Natl Acad Sci USA, 1978. 75(4): p. 1745-9.

42. Smela, M.E., et al., The chemistry and biology of aflatoxin B(l): fi'om mutational spectrometry to carcinogenesis. Carcinogenesis, 2001. 22(4): p. 535-45.

43. Autmp, H., et al., Metabolism of aflatoxin BI and identification of the major aflatoxin Bl-DNA adducts formed in cultured human bronchus and colon. Cancer Res, 1979. 39(3): p. 694-8.

44. Cupid, B.C., et al., The formation of AFB(l)-macromolecular adducts in rats and humans at dietary levels of exposure. Food Chem Toxicol, 2004. 42(4): p. 559-69.

45. Stark, A.A., et al., Aflatoxin BI mutagenesis, DNA binding, and adduct formation in Salmonella typhimurium. Proc Natl Acad Sci USA, 1979. 76(3): p. 1343-7.

46. Singh, J., et al., Interactions of aflatoxin BI with SRP components can disrupt protein targeting. Cell Biochem Funct, 2005. 23(1): p. 9-13.

47. Singh, J., et al., Inhibition of the biosynthesis of SRP polypeptides and secretory proteins by aflatoxin BI can disrupt protein targeting. Cell Biochem Funct, 2006. 24(6): p. 507-10.

48. Gelboin, H. V., et al., Rapid and marked inhibition of rat-liver RNA polymerase by aflatoxin В-1. Science, 1966.154(753): p. 1205-6.

49. Yu, F.L., Mechanism of aflatoxin Bl inhibition of rat hepatic nuclear- RNA synthesis. J Biol Chem, 1977. 252(10): p. 3245-51.

50. Yu, F.L., Preferential binding of aflatoxin Bl to the transcriptionally active regions of rat liver nucleolar chromatin in vivo and in vitro. Carcinogenesis, 1983. 4(7): p. 889-93.

51. Yu, F.L., M. Cass, and L. Rokusek, Tissue, sex, and animal species specificity of aflatoxin Bl inhibition of nuclear RNA polymerase II activity. Carcinogenesis, 1982. 3(9): p. 1005-9.

52. McKenzie, K.S., et al., Oxidative degradation and detoxification of mycotoxins using a novel source of ozone. Food Chem Toxicol, 1997. 35(8): p. 807-20.

53. McKenzie, K.S., et al., Aflatoxicosis in turkey poults is prevented by treatment of naturally contaminated corn with ozone generated by electrolysis. Poult Sci, 1998. 77(8): p. 1094-102.

54. Pivai, G., et al., Detoxification methods of aflatoxins. A review. Nutrition Research, 1995.15(5): p. 767-776.

55. Ventura, M., et al., Ultraperformance liquid chromatography/tandem mass spectrometry for the simultaneous analysis ofaflatoxins Bl, GI, B2, G2 and ochratoxin A in beer. Rapid Comm. Mass Spectrom, 2006. 20: p. 3199-3204.

56. Piermarini, S., et al., An ELIME-array for detection of aflatoxin Bl in corn samples. Food Control, 2009. 20: p. 371-375.

57. Pal, A. and Т.К. Dhar, An analytical device for on-site immunoassay. Demonstration of its applicability in semiquantitative detection of aflatoxin Bl in a batch of samples with idtrahigh sensitivity. Anal Chem, 2004. 76(1): p. 98104.

58. Nasir, M.S. and M.E. Jolley, Development of a fluorescence polarization assay for the determination of aflatoxins in grains. J Agric Food Chem, 2002. 50(11): p. 3116-21.

59. Ammida, N.H.S., et al., Detection of aflatoxin B-l in barley: Comparative study of immunosensor andHPLC. Anal. Lett., 2006. 39: p. 1559-1572.

60. Pena. R., et al., Screening of aflatoxins in feed samples using a flow system coupled to capillaiy electrophoresis. J Chromatogr A, 2002. 967(2): p. 303-14.

61. Chan, D., et al., Simidtaneous determination of aflatoxins and ochratoxin A in food using a fully automated immunoaffinity column clean-up and liquid chromatography-fluorescence detection. J Chromatogr A, 2004. 1059(1-2): p. 13-6.

62. Cervino, C., et al., Use of isotope-labeled Aflatoxins for1.-MS/MS stable isotope dilution analysis of foods. J. Agric. Food Chem., 2008. 56: p. 1873-1879.

63. Sulyolc, M., et al., Development and validation of a liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of39 mycotoxins in wheat and maize. Rapid Commun Mass Spectrom, 2006. 20(18): p. 2649-59.

64. Otta, K.H., et al., Determination of aflatoxins in corn by use of the personal OPLC basic system. J. Plan. Chromatogr., 1998. 11(1): p. 370-373.

65. Papp, E., et al., Liquid chromatographic determination of aflatoxins. Microchem. J. , 2002. 73: p. 39-46.

66. Nguyen, M.T., et al., Occurrence of aflatoxin Bl,citrinin and ochratoxin A in rice in five provinces of the central region of Vietnam. Food Chem., 2007. 105: p. 42-47.

67. Sheibani, A. and G. H.S., Pressurized fluid extraction for quantitative recovery of aflatoxins

68. Bl and B2 from pistachio. Food Control, 2009. 20: p. 124-128.

69. Blesa, J., et al., Determination of aflatoxins in peanuts by matrix solid-phase dispersion and liqiud chromatography. J Chromatogr A, 2003. 1011(1-2): p. 49-54.

70. Xavier, J .J.M. and V.M. Scussel, Development of an LC-MS/MS method for the determination ofaflatoxins B-l, B-2, G(l), and G(2) in Brazil nut. Intern. J. Envir. Anal. Chem., 2008. 88: p. 425-433.

71. Sheibani, A., M. Tabrizchi, and H.S. Ghaziaskar, Determination of aflatoxins ВI and B2 using ion mobility spectrometry. Talanta, 2008. 75(1): p. 233-8.

72. Hernandez Hierro, J.M., et al., Aflatoxins and ochratoxin A in red paprika for retail sale in Spain: occurrence and evaluation of a simultaneous analytical method. J Agric Food Chem, 2008. 56(3): p. 751-6.

73. D'Ovidio, K., et al., Aflatoxins in ginseng roots. Food Addit Contam, 2006. 23(2): p. 174-80.

74. Daradimos, E., P. Marcaki, and M. Koupparis, Evaluation and validation of two fluorometric HPLC methods for the determination of aflatoxin Bl in olive oil Food Addit Contam, 2000. 17(1): p. 65-73.

75. Garcia-Villanova, R.J., et al., Simultaneous immunoaffinity column cleanup and HPLC analysis of aflatoxins and ochratoxin A in Spanish bee pollen. J Agric Food Chem, 2004. 52(24): p. 7235-9.

76. Oliveira, C.A., et al., Aflatoxin Bl residues in eggs of laying hens fed a diet containing different levels of the mycotoxin. Food Addit Contam, 2000. 17(6): p. 459-62.

77. Sharma, M. and C. Marquez, Determination of aflatoxins in domestic pet foods (dog and cat) using immunoaffinity column and HPLC. Anim. Feed Sci. Technol., 2001. 93(1): p. 109-114.

78. Navas, S.A., M. Sabino, and D.B. Rodriguez-Amaya, Aflatoxin M(l) and ochratoxin A in a human milk bank in the city of Sao Paulo, Brazil. Food Addit Contam, 2005. 22(5): p. 457-62.

79. Micheli, L., et al., An electrochemical immunosensor for aflatoxin Ml determination in milk using screen-printed electrodes. Biosens. Bioelectr., 2005. 21: p. 588-596.

80. Josephs, R.D., et al., Aflatoxin Ml in milk powders: processing, homogeneity and stability testing of certified reference materials. Food Addit Contain, 2005. 22(9): p. 864-74.

81. Govaris, A., et al., Distribution and stability of aflatoxin Ml during production and storage of yoghurt. Food Addit Contain, 2002. 19(11): p. 1043-50.

82. S. M. Maxwell, et al., Aflatoxins in Breast Milk, Neonatal Cord Blood and Sera of Pregnant Women. Toxin Reviews, 1989. 8(1-2): p. 19-29.

83. Oyelami, O.A., et al., Aflatoxins in the autopsy brain tissue of children in Nigeria. Mycopathologia, 2005. 132(1): p. 35-38.

84. Gutarowska, B. and M. Piotrowska, Methods of mycological analysis in buildings. Build. Environ., 2007. 42\ p. 1843-1850.

85. Tuomi, Т., et al., Detection of aflatoxins (G(l-2), B(l-2)), sterigmatocystin, citrinine and ochratoxin A in samples contaminated by microbes. Analyst, 2001.126(9): p. 1545-50.

86. Tari'n, A., M.G. Rosell, and X. Guardino, Use of high-performance liquid chromatography to assess airborne mycotoxins Aflatoxins and ochratoxin A. J. Chromatogr. A, 2004. 1047(1): p. 235-240.

87. Wang, Y., et al., Simultaneous detection of airborne Aflatoxin, Ochratoxin and Zearalenone in a poultry house by immunoajfinity clean-up and high-performance liquid chromatography. Environ. Res., 2008. 107: p. 139-144.

88. Langseth, W. and T. Rundberget, Instrumental methods for determination of nonmacrocyclic trichothecenes in cereals, foodstuffs and cultures. J. Chromatogr\ A, 1998. 815(1): p. 103-121.

89. Zollner, P. and B. Mayer-Helm, Trace mycotoxin analysis in complex biological and food matrices by liquid chromatography-atmospheric pressure ionisation mass spectrometry. J Chromatogr A, 2006. 1136(2): p. 123-69.

90. Nielsen, K.F. and J. Smedsgaard, Fungal metabolite screening: database of 474 mycotoxins and fungal metabolites for dereplication by standardised liquid chromatography-UV-rnass spectrometry methodology. J Chromatogr A, 2003. 1002(1-2): p. 111-36.

91. Krska, R. and A. Molinelli, Mycotoxin analysis: state-of-the-art and future trends. Anal Bioanal Chem, 2007. 387(1): p. 145-8.

92. Lin, L., et al., Thin-layer chromatography of mycotoxins and comparison with other chromatographic methods. J Chromatogr A, 1998. 815(1): p. 3-20.

93. Krska, R., et al., Mycotoxin analysis: an update. Food Addit Contara Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 2008. 25(2): p. 152-63.

94. Stroka, J., R. Van Otterdijk, and E. Anlclam, Immimoaffmity column clean-up prior to thin-layer chromatography for the determination of aflatoxins in various food matrices. J Chromatogr A, 2000. 904(2): p. 251-6.

95. Prieto-Simon, В., Т. Noguer, and M. Campas, Emerging biotools for assessment of mycotoxins in the past decade. TrAC, 2007. 26: p. 689-702.

96. Shephard, G.S., et al., Do fumonisin mycotoxins occur in wheat? J. Agric. Food Chem., 2005. 53: p. 9293-9296.

97. Yu, F.Y., et al., Development of a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of ochratoxin A. J Agric Food Chem, 2005. 53(17): p. 6947-53.

98. Zheng, M.Z., J.L. Richard, and J. Binder, A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia, 2006. 161: p. 261-273.

99. Schneider, E., et al., Rapid methods for deoxynivalenol and other trichothecenes. Toxicol Lett, 2004.153(1): p. 113-21.

100. Krska, R., E. Welzig, and H. Boudra, Analysis of Fusarium toxins in feed. Animal Feed Sci. Technol., 2007. 137: p. 241-264.

101. Mullett, W., E.P. Lai, and J.M. Yeung, Immunoassay offumonisins by a surfaceplasmon resonance biosensor. Anal Biochem, 1998. 258(2): p. 161-7.112. van der Gaag, В., et al., Biosensors and midtiple mycotoxin analysis. Food Control 2003. 14: p. 251-254.

102. Delmulle, B.S., et al., Development of an immunoassay-based lateral flow dipstick for the rapid detection of aflatoxin B1 in pig feed. J Agric Food Chem, 2005. 53(9): p. 3364-8.

103. Li, P., Q. Zhang, and W. Zhang, Immunoassays for aflatoxins. Trends in Analytical Chemistry, 2009. 28( 9): p. 1115-1126.

104. Goryacheva, I.Y., et al., Immunochemical methods for rapid mycotoxin detection: evolution from single to midtiple analyte screening: a review. Food Addit Contam, 2007. 24(10): p. 1169-83.

105. Logrieco, A., et al., DNA arrays, electronic noses and tongues, biosensors and receptors for rapid detection of toxigenic fungi and mycotoxins: a review. Food Addit Contam, 2005. 22(4): p. 335-44.

106. Schnerr, H., R.F. Vogel, and L. Niessen, A biosensor-based immunoassay for rapid screening of deoxynivalenol contamination in wheat. Food Agric. Immunol., 2002. 14: p. 313-321.

107. Ngundi, M.M., et al., Array biosensor for detection of ochratoxin A in cereals and beverages. Anal Chem, 2005. 77(1): p. 148-54.

108. Adanyi, N., et al., Development of immunosensor based on OWLS technique for determining Aflatoxin Bl and Ochratoxin A. Biosens Bioelectron, 2007. 22(6): p. 797-802.

109. Piermarini, S., et al., Electrochemical immunosensor array using a 96-well screen-printed microplate for aflatoxin B1 detection. Biosens Bioelectron, 2007. 22(7): p. 1434-40.

110. Owino, J.H., et al., Modelling of the impedimetric responses of an aflatoxin В (J) immunosensor prepared on an electrosynthetic polyaniline platform. Anal Bioanal Chem, 2007. 388(5-6): p. 1069-74.

111. Cuccioloni, M., et al., Biosensor-based screening method for the detection of aflatoxins Bl-Gl. Anal Chem, 2008. 80(23): p. 9250-6.

112. Mullett, W.M., E.P. Lai, and J.M. Yeung, Surface plasmon resonance-based immunoassays. Methods, 2000. 22(1): p. 77-91.

113. Wang, J.S., et al., Development of aflatoxin B(l)-lysine adduct monoclonal antibody for human exposure studies. Appl Environ Microbiol, 2001. 67(6): p. 2712-7.

114. Sujatha, N., S. Suryakala, and B.S. Rao, Enzyme immunoassay for aflatoxin В1-lysine adduct and its validation. J AOAC Int, 2001. 84(5): p. 1465-74.

115. Haugen, A., et al., Monoclonal antibody to aflatoxin В1-modified DNA detected by enzyme immunoassay. Proc Natl Acad Sci USA, 1981. 78(7): p. 4124-7.

116. Groopman, J.D., et al., High-affinity monoclonal antibodies for aflatoxins and their application to solid-phase immunoassays. Proc Natl Acad Sci USA, 1984. 81(24): p. 7728-31.

117. Fan, T.S., G.S. Zhang, and F.S. Chu, Production and characterization of antibody against aflatoxin 01. Appl Environ Microbiol, 1984. 47(3): p. 52632.

118. Devi, K.T., et al., Production and characterization of monoclonal antibodies for aflatoxin Bl. Lett Appl Microbiol, 1999. 29(5): p. 284-8.

119. Burkin, M.A., et al., Comparative immunochemical characteristics of polyclonal and monoclonal antibodies to aflatoxin B1J. Prikl Biokhim Mikrobiol, 2000. 36(5): p. 575-81.

120. C.Y.G., L., L. P.X., and C. K.J., Monoclonal Antibody-Based Immunoassays for Aflatoxin Isoforms Journal of Clinical Ligand Assay, 2003. 26(2): p. 107110.

121. Kolosova, A.Y., et al., Direct competitive ELISA based on a monoclonal antibody for detection of aflatoxin Bl. Stabilization of ELISA kit components and application to grain samples. Anal Bioanal Chem, 2006. 384(1): p. 28694.

122. Cervino, C., et al., Comparison of hybridoma screening methods for the efficient detection of high-affinity hapten-specific monoclonal antibodies. J Immunol Methods, 2008. 329(1-2): p. 184-93.

123. Zhang, J., et al., Production and characterization of monoclonal antibodies against aflatoxin g(l). Hybridoma (Larchmt), 2009. 28(1): p. 67-70.

124. Li, P., et al., Development of a class-specific monoclonal antibody-based ELISA for aflatoxins in peanut Food Chemistry, 2009. 115(1): p. 313-317.

125. Zhang, D., et al., Production of ultrasensitive generic monoclonal antibodies against major aflatoxins using a modified two-step screening procedure. Anal Chim Acta, 2009. 636(1): p. 63-9.

126. Moghaddam, A., et al., Selection and characterisation of recombinant single-chain antibodies to the hapten Aflatoxin-Bl from naive recombinant antibody libraries. J Immunol Methods, 2001. 254(1-2): p. 169-81.

127. Pansri, P., et al., A compact phage display human scFv library for selection of antibodies to a wide variety of antigens. BMC Biotechnol, 2009. 9: p. 6.

128. Kalinina, N.A., et al., Molecular cloning, expression, and characterization of human mini-antibodies against enterotoxin CI of Staphylococcus aureus., Bioorg Khim, 2009. 35(2): p. 192-201.

129. Ward, E.S., Antibody engineering: the use of Escherichia coli as an expression host. FASEB J, 1992. 6(7): p. 2422-7.

130. Carter, P., et al., High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment. Biotechnology (N Y), 1992. 10(2): p. 163-7.

131. Georgiou, G. and P. Valax, Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol, 1996. 7(2): p. 190-7.

132. Jaeger, K.E. and M.T. Reetz, Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. Trends Biotechnol, 1998. 16(9): p. 396-403.

133. Filloux, A., et al., Protein secretion in gram-negative bacteria: transport across the outer membrane involves common mechanisms in different bacteria. EMBO J, 1990. 9(13): p. 4323-9.

134. Thanassi, D.G. and S.J. Hultgren, Multiple pathways allow protein secretion across the bacterial outer membrane. Curr Opin Cell Biol, 2000. 12(4): p. 42030.

135. DeLisa, M.P., D. Tullman, and G. Georgiou, Folding quality control in the export of proteins by the bacterial twin-arginine translocation pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(10): p. 6115-20.

136. Humphreys, D.P., et al., Co-expression of human protein disulphide isomerase (PDI) can increase the yield of an antibody Fab' fragment expressed in Escherichia coli. FEBS Lett, 1996. 380(1-2): p. 194-7.

137. Levy, R., et al., Production of correctly folded Fab antibody fragment in the cytoplasm of Escherichia coli trxB gor mutants via the coexpression of molecular chaperones. Protein Expr Purif, 2001. 23(2): p. 338-47.

138. Corisdeo, S. and B. Wang, Functional expression and display of an antibody Fab fragment in Escherichia coli: study of vector designs and culture conditions. Protein Expr Purif, 2004. 34(2): p. 270-9.

139. Miller, K.D., et al., Production, purification, and characterization of human scFv antibodies expressed in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Escherichia coli. Protein Expr Purif, 2005. 42(2): p. 255-67.

140. Thomassen, Y.E., et al., Specific production rate of VHH antibody fragments by Saccharomyces cerevisiae is correlated with growth rate, independent of nutrient limitation. J Biotechnol, 2005. 118(3): p. 270-7.

141. Shusta, E.V., et al., Increasing the secretory capacity of Saccharomyces cerevisiae for production of single-chain antibody fragments. Nat Biotechnol, 1998.16(8): p. 773-7.

142. Cereghino, G.P. and J.M. Cregg, Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol, 1999. 10(5): p. 422-7.

143. Zsebo, K.M., et al., Protein secretion from Saccharomyces cerevisiae directed by the prepro-alpha-factor leader region. J Biol Chem, 1986. 261(13): p. 5858-65.

144. Lucas, B.K., et al., High-level production of recombinant proteins in CHO cells using a dicistronic DHFR intron expression vector. Nucleic Acids Res, 1996. 24(9): p. 1774-9.

145. Chadd, H.E. and S.M. Chamow, Therapeutic antibody expression technology. Cuit Opin Biotechnol, 2001.12(2): p. 188-94.

146. Hiatt, A., R. Cafferkey, and K. Bowdish, Production of antibodies in transgenic plants. Nature, 1989. 342(6245): p. 76-8.

147. Ma, J.K., et al., Generation and assembly of secretory antibodies in plants. Science, 1995. 268(5211): p. 716-9.

148. Hood, E.E., S.L. Woodard, and M.E. Horn, Monoclonal antibody manufacturing in transgenic plants—myths and realities. Curr Opin Biotechnol, 2002.13(6): p. 630-5.

149. Kathuria, S., et al., Efficacy of plant-produced recombinant antibodies against HCG. Hum Reprod, 2002. 17(8): p. 2054-61.

150. Vaquero, C., et al., A carcinoembryonic antigen-specific diabody produced in tobacco. FASEB J, 2002. 16(3): p. 408-10.

151. Ma, J.K., et al., Antibody processing and engineering in plants, and new strategies for vaccine production. Vaccine, 2005. 23(15): p. 1814-8.

152. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

153. Chenchik, A., et al., eds. Generation and use of high-quality cDNA from small amounts of total RNA by SMART™ PCR. . In Gene cloning and analysis by RT-PCR, ed. L.J.N. Siebert P. 1998, MA: Biotechniques Books.

154. Marchuk, D., et al., Construction ofT-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res, 1991. 19(5): p. 1154.

155. Friguet, В., et al., Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J Immunol Methods, 1985. 77(2): p. 305-19.