Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и изучение эпитопной специфичности моноклональных антител к углеводным детерминантам с использованием синтетических антигенов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и изучение эпитопной специфичности моноклональных антител к углеводным детерминантам с использованием синтетических антигенов"



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 547.458.41.057

ВЛАСОВА ЕКАТЕРИНА ВАЛЕНТИНОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ЭПИТОПНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К УГЛЕВОДНЫМ ДЕТЕРМИНАНТАМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ

Специальность 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 199'Т

Работа выполнена в Институте биоорганической химии нм. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель: достор химических наук Н.В.Бовин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.В. Филатов;

кандидат химических наук Л.А. Фонина

Ведущая организация: Институт экспериментальной диагностики и

ОПУЧОА&й 1Л1Ч. Soikufli. OHU, РАИН

Зашита состоится ¿8 Н Л 1997 года в 1000 часов на заседании Специализированного совета Д 002 35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: II7S71, Москва. В-437, ул. Миклухо-Маклая. 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 2 5 ОПр, 1997 года.

Ученый секретарь специализированного совета

ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН кандидат химических наук

В,А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Углеводные детерминанты в составе гликолипидов и гликопротеинов клеточной поверхности являются ключевыми структурами, во многом определяющими характер межклеточных контактов в норме и патологии. Широкое распространение получило представление об углеводах как "детерминантах узнавания", задающих адрес миграции клеток. Углевод-опосредованная адгезия является одной из стадий инициации оплодотворения, инвазии лейкоцитов через эндотелий сосудов, взамодействия клеток-киллеров с патогеном, а также метастазирования злокачественных опухолей.

Изменения в составе углеводов на поверхности клетки, сопутствующие как нормальной дифференцировке клеток, так и онкотрансформации выявляются с помощью углеводсвязывающих белков, прежде всего, моноклональных антител (МА). Использование МА, обладающих высокой специфичностью, позволяет изучать изменения в гликозилировании мембранных и сывороточных белков и липидов.

Получение высокоспецифичных МА против углеводных детерминант осложнено гетерогенностью, малой доступностью и низкой иммуногенностью природных гликоконъюгатов. Использование гомогенных синтетических антигенов позволяет решить эти проблемы и открывает возможности изучения механизма формирования иммунного ответа к углеводным антигенам. Цель работы. Основной задачей данного исследования являлась разработка конкретного подхода к получению МА с помощью полностью синтетических углеводных антигенов и изучение иммунохимических свойств полученных антител. В соответствии с этим работа подразделялась на следующие этапы :

1) получение МА против антигенов Ьеу и 51аЬеа при иммунизации мышей неогликоконъюгатами;

2) определение эпитопной специфичности полученных антител и изучение их взаимодействия с опухолевыми клетками;

3) определение с помощью широкого спектра синтетических углеводных антигенов эпитопной специфичности МА, полученных другими исследователями;

4) сравнение иммунохимических свойств МА, полученных к синтетическим и природным углеводным детерминантам.

Научная новизна. Разработан подход к получению МА к углеводным антигенам, в основе которого лежит использование нового типа иммуногена, представляющего собой олигосахарид, ковалентно присоединенный к иммунологически инертной матрице - липофилизованному полиакриламиду. Получены гибридные (слетки, продуцирующие антитела к тетрасахаридам Ley и SiaLe", для цитологических и гистологических исследований отобраны наиболее специфичные МА. С помощью синтетических антигенов проведено исследование эпитопной специфичности МА, полученных другими исследователями, При этом показано, что эпитопом для антитела LU-G7, специфически связывающегося с клетками рака молочной железы, является дисахарид Lec. В результате анализа МА, предоставленных участниками V и VI Международных Рабочих Совещаний по типированию лейкоцитов человека, выявлено несколько десятков анти-углеводных антител, для некоторых из них определена эпитопная специфичность.

Апробация полученных данных. Результаты работы были представлены на XI Международном симпозиуме по углеводам (Париж, Франция, 1992), XII Международном симпозиуме по гликоконъюгатам (Краков, Польша, 1993), на V Международном Рабочем Совещании по типированию лейкоцитов (Бостон, США, 1993), на IV Российско-Корейском симпозиуме по биотехнологии (Москва, 1994), на III Международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, Россия. 1995), Международной конференции по биологии и химии сиаловых кислот (Москва, 1994), на III Школе по клеточным и молекулярным аспектам иммунологии (Пущино, 1996). на VI Междунаром Рабочем Совещании по типированию лейкоцитов (Кобе, Японня. 1996).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссератация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части и выводов. Содержание диссертации изложено на 1¿0 страницах машинописного текста, включающих 25 рисунка, 29 таблиц и список цитируемой литературы из 240 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. I Получение моноклонапьных антител к синтетическому антигену Ley и их характеристика.

Гликолипиды, гликопротеины и неогликоконъюгаты типа Sug-BSA слабоиммуногенны (Kannagi, 1983). Для получения выраженного гуморального иммунного ответа к углеводным антигенам была предложена специальная методика (Galanos, 1982), согласно которой перед иммунизацией гликолипиды сорбируют на поверхности убитых бактерий. Иммунный ответ на антиген, присутствующий в избытке на поверхности бактериальных клеток, усиливается, благодаря адъювантным свойствам, которыми обладает Salmonella Minnesota (мутантный штамм R595, дефицитный по углеводам).

В настоящей работе вместо природного гликолипида использовался полностью синтетический гликоконъюгат типа Sug-PAA-PE, где к полиакриламиду (РАА) присоединены в равных количествах (по 17 мольных % на полимерную цепь) олигосахарид (Sug) и фосфатидилэтаноламин (РЕ). Выбор конструкции неогликолипида определялся следующими основными соображениями:

1) РАА не иммуногенен и устойчив к действию клеточных ферментов;

2) соотношение Sug и РАА выбиралось с таким расчетом, чтобы неогликоконъюгат оставался водорастворимым;

3) липофильный РЕ способен встраиваться в клеточные мембраны, при этом несколько остатков РЕ в составе одной молекулы конъюгата обеспечивают более сильное связывание с клеточной поверхностью бактериальной клетки.

Для получения МА против опухолеассоииированного антигена Le-V неогликолипид Le'-PAA-PE сорбировали на убитых уксусной кислотой бактериях Salmonella mimiesota в весовом соотношении 1:10, после чего инъецировали в ретроорбитальный синус мышей линии BALB/c. В первый день вводили суспензию, содержащую 16 мкг иммуногена, на 6 сутки инъецировали удвоенное количество иммуногена; остальные три инъекции на 11, 17 и 23 сутки после начала иммунизации производили 64 мкг иммуногена на мышь.

Через три дня после последней инъекции сыворотки мышей были проверены с помощью прямого ИФА на наличие антител к Ley. Для этого серийные двукратные разведения иммунной и контрольной сыворотки инкубировали с сорбированным на поверхности планшета гликоконъюгатом Ley-РАА, а также параллельно с Leb-PAA (структуры олигосахаридов, использованных в работе, приведены в Табл. 1).

В качестве контрольной использовали сыворотку неиммунной мыши. Конъюгат Leb-PAA применяли для подтверждения специфичности иммунного ответа к заданному при иммунизации антигену.

Для получения гибридом были отобраны животные, титр сыворотки которых был максимальным (в прямом ИФА соответствовал разведению 1: 8 ООО).

Спленоциты иммунных животных гибрндизовали с клетками мышиной миеломы Х-63 .8 Aza в соотношении 4:1 по стандартной методике Келера и Мильщтейна. Отбор положительных клонов проводили на 10-14 сутки после слияния с помощью прямого ИФА, в качестве антигена использовали Le-V-PAA. Отрицательным контролем при отборе гибридом был гликоконъюгат Aih- РАА, содержащий структурно отдаленный антиген, трисахарид А.

После четырех слияний и трехкратного клонирования методом лимитирующих разведений из 28 первичных клонов, продуцирующих МА к заданному при иммунизации антигену, было отобрано семь, стабильно продуцирующих МА (см Табл 2).

Табл. 1. Структура олигосахаридов, использованных в работе.

Антигены Lewis Le" Gaipi-lGlcNAcp-11.2 I 1.3 Fuca Fuca Le' Gaipi-lGlcNAcp-11.3 Fuca Le" Galpl-3GlcNAcP- 1ы Fuca Lec Galpl-3GlcNAcp- Leb Gaipi-3GJcNAc(i-11,2 I 1.4 Fuca Fuca SiaLe" Galp1-3GlcNAc[i-12,3 11.4 Neu5Aca Fuca SiaLe" Gal01-4GlcNAcp-I2,3 |1,3 Neu5Aca Fuca 3'SiaLact Gaipi-4GlcP-12,3 Neu5Aca 6'SiaLact Gal|)1-4Glcp-12,6 Neu5Aca 3'SiaLactNAc Gaipi-4GlcNAcp-12,3 Neu5Aca SiaLe° Gal|31 -3GlcNAcP-1 2,3 Neu5Aca

Группоспецифическне антигены Aw GalNAcal-JGaip 11-2 Fuca H (тип 2) Fucal-2Gal|3 MGIcNAc-H (тип I) Fucal-2Gaipi-3GlcNAc- Дисахарнды Lactose Gaipi -4Glc(3-LactNAc Gaipi -4GlcNAcp-Fuca1-4GlcNAcP-Fuca1-3GlcNAcp-

Олигосахариды человеческого молока LSTa Neu5Aca2-3Gal(J l-3GlcNAc|l l-ЗСаф 1-lGlc LNT Galp l-3GlcNAc(t l-3Gaip l-4Glc

С целью наработки препаративных количеств МА гибридные клетки вводили внутрибрюшинно мышам линии ВАЬВ/с, получивших за три недели до этого инъекцию прнстана. Иммунноглобулины класса О,из асцитной жидкости осаждали сульфатом аммония, после чего проводили хроматографию на колонке с Б-сефарозой. Для единственного антитела класса ^М использовали другой способ выделения - двухстадийную очистку асцитной жидкости с помощью тиофильно-

адсорбционной хроматографии с последующей гель-фильтрацией на колонке Toyopearl HW-50 (Toya-Soda, Япония). Полученные препараты проверяли на активность в прямом ИФА, чистоту оценивали с помощью SDS-электрофореза в блоке полиакриламндного геля в градиенте концентрации акриламида 4-30%.

Очищенные МА полностью сохраняли свою антиген-связывающую активность в ИФА, а электрофореграмма свидетельствовала о практической их гомогенности [2, 6].

Табл. 2. Характеристика МА к Ley.

Гибридизация N Высоко продуцирующие клоны Концентрация МА в супер-натанте мкг/мл Концентрация МА в асците мг/мл Изотип Kj (no Beatty. 1986)

1 SY11 80 2 IgG, 106 M'1

2 SYI2 100 8-9 IgG, 107 M'1

SY13 но* н.о. IgM H 0.

3 SY1-PL 100 7-8 IgG; 10® M"1

SYI-F н.о. н.о. lgG2„ и.о.

4 SYI4 SYI5 80 80 н.о. 6 IgG2k IgGl 10* M"' 10a M"'

* н о. - не определяли

Специфичность полученных антнтел исследовали с помощью ИФА, опираясь на широкий набор олигосахаридов и их конъюгатов с полиакриламидом.

а также группоспецифических антигенов из слюны доноров. Было показано, что все семь антител лучше всего связываются с заданным при иммунизации антигеном Le*. Однако, как в прямом, так и в ингибиторном ИФА были выявлены отличия в характере взаимодействия МА с детерминантов Ley и антигенами, имеющими родственную структуру.

Два atmi-Le1' MA SYII и SYI3 показали абсолютную специфичность в прямом и ингибиторном ИФА к заданному при иммунизации антигену (Рис. 1 и Табл. 3). Остальные пять МА в той или иной степени взаимодействовали с родственными олигосахаридами. Связывание антитела SY1-PL с Le*-PAA, сорбированным на поверхности планшета, слабо ингибировалось трисахаридом Н (тип 2). МА SY12, SY14 и SY15 показали небольшие перекрестные реакции с трисахаридами Lex и Le*. Антитело SY15 слабо взаимодействовало с днсахаридами Fucal-3GlcNAcP и Fucal-4GlcNAcP как в свободной, так и в конъюгированной форме.МА SY1-F оказалось наименее специфичным и взаимодействовало практически со всеми антигенами семейства Lewis и родственными структурами.

Одновременно с данной работой, МА к синтетическому Ley пытались получить другие авторы (Kitamura, 1994), используя в качестве иммуногена конъюгат Ley-HSA. В результате систематического исследования было показано, что большинство из полученных антител в прямом ИФА хорошо реагировало как с Ley-HSA, так и с Ley-BSA, Le'-BSA и Н (тип 2)-BSA. В то же время, природную детерминанту Ley в составе гликолипида и на поверхности клеток линий MCF-7, А431 и НСТ-15 эти антитела выявляли плохо, в отличие от других анти- Ley МА, полученных этими же исследователями при иммунизации клетками линии MCF-7. По-видимому, иммунизация Ley-HSA привела к получению МА, направленных против смешанного эпитопа, включающего углеводную и белковую составляющие. Именно этого мы стремились избежать, когда выбирали в качестве матрицы-носителя полиакриламид, а не белок.

s

12 О. П. SYI1HSVI3 492 нм

0.6 0.4 0.2

0,6 0.4 0.2

0.3 0.6 1.2 2.5 5 10 Концентрация антигена (мкг/мл)

—»—1

■3-8

0.07 0,15 0,3 0,6 1.25 2.5 Концентрация антигена (мкг/мл)

1.2 I

0.8 0.0 0.4 0.2-О

SV-PL

0.07 0.15 0.3 0.6 1,25 2.5 5 Концентрация антигена (мкг/мл)

0.3 0.6 1,25 2.5 5 10 20 Концентрация антигена (мкг/мл)

-4- 8

0,07 0,15 0,3 0.6 1,25 2.5 Концентрация аатшена (мкг/мл]

0,3 0,6 1.2 2.5 5 10 Концентрация антигена (мкг/мл)

-2 -5-8

-3 -6- 8

Рис. I.

Прямое связывание моноклональных антител, полученных к [.е*. с синтетическими гликоконъюгатами: I - Ьс'-РАА (10%), 2 - и"-РАА (30%), 3 - Ье'-РАА (10%). 4 - Ье'-РАА (10%), 5 - Ьеъ-РАА (10%). 6 - Н (тип 1)-РАА (10%), 7 - Риса1-ЗС!сМАср-РАА (10%). 8 -Риса 1-20аф-РАА (10%). Величина стандартной ошибки не превышала 2-5% от измеряемой величины оптической плотности (О.П.). поэтому она не приводится.

Табл. 3. Ингибирование связывания анти-Ьеу моноклональных антител олигосахаридами и их полиакриламидными конъюгатами.

Антигены Форма * Концентрация 50% ингибирования (мкМ)

вУ11 вУ12 вУЧЗ БУ14 БУ15 вУ-Р1- вУ-Я

Ьеу -О-зр'-РАА -О-эр' 68.7 5.4 4x10'3 4 2x10-6 18 10 2x10° 5 1x10' 2 18 21

их -О-зр'-РАА -0-!ф! 300" (40%) 850 150 но. 75 850 38.4 125

Ье" -О-зр'-РАА -О-эр' - 300" (35%) 1700 . 150 850 н.о. 425

иь -О-зр'-РАА 137

Н (тип 1) -о-5р! - - - - 1700** (20%)

Н (тип 2) -О-зр1 850** (40%) но. 425 850" (20%)

Риса1-4С1сЫАср -О-вр1 - 900 - но.

Гиса1-ЗС!сМАс -0-5Р1 - 900 900 но

Н,; -0-зр; - - - И.О.

Ат -О-вр1 - - - -

Н слюны но. и.о.. +

В СЛЮНЫ но. но. и.о. - -

"Плотность гаптена на РАА матрице 10 мольных %. Спенсер для конъюгированных форм: - эр1 = -СН2СН2СН2-; для мономерных форм: - 5р2 = -С^ОЪОЬЫНСОСРз или -СН2СН2СН2НН2.

** В скобках приведена степень ингибирования связывания МА в % при указанной концентрации.

н о. - не определено, +■ соответствует 20%-ому ингибированию связывания при концентрации ингибитора 500 мкг/мл.

Данные прямого и пнгибиторного ИФА свидетельствуют о высокой специфичности МА, полученных при иммунизации неогликолипидом Ley-PAA-PE. Эти результаты подтверждают правильность выбора РАА в качестве иммунологически инертного полимера-носителя при конструировании иммуногена.

Чтобы получить ответ на вопрос, способны ли антитела, полученные к синтетическому Le-', выявлять этот антиген на поверхности клетки, были проведены цитофлуориметрические и иммунно-гистохимические исследования совместно с лабораториями: Иммунохимии ИБХ РАН (Москва), Экспериментальной диагностики опухолей Института Экспериментальной Онкологии РАМН (Москва), Лаборатории Патологии Института Физиологической Химии (München, Germany),

Данные цитофлуоримегрического анализа свидетельствуют о наличии связывания антител SY11, SY12 и SY1-PL с клетками А431, на которых согласно литературным данным, экспрессирован Ley (Табл. 4). Интересно, что MA SY14. показавшие в ИФА низкую афинность к тетрасахариду Le-\ не взаимодействовали с клетками А431, а процент позитивных клеток для остальных трех антител был различным. MA SYI-PL, наиболее аффинные к тетрасахариду Lev окрашивали более 90% клеток линии А 431, два других антитела окрашивали около половины клеток.

С клетками миелобластного лейкоза HL-60 взаимодействовало только одно MA SY12, причем очень слабо. Это может быть объяснено наличием на поверхности этих клеток детерминанты Le', которую также может узнавать антитело SY12. Детерминанта Ley была обнаружена на поверхности клеток линии HeLa (аденокарцинома шейки матки), что несколько позже показано в работе Sasaki (1994). Иммунохимические исследования, выполненные совместно с ВОНЦ РАМН на раковых клетках легкого, желудка, молочной железы, свидетельствуют о наличии детерминанты Lev на клетках эксудата и первичной опухоли при мелкоклеточном раке легкого, на клетках аденокарциномы молочной железы и желудка, что соответствует литературным данным (Rosen, 1984; Вага. 1988,

Х1ер1еш5к1, 1990). Использованные в качестве отрицательного контроля клетки нейроглиомы (N0), которые не имеют на своей поверхности детерминанты Ье" ([Мпкаша, 1992), ни с одним из исследованных анти-1_еу МА не взаимодействовали.

Табл. 4. Взаимодействие анти-Ье* МА с клеточным» линиями.

Клеточные линии Моноклональные антитела (% позитивных клеток)

SY11 SY12 SY14 SY1-PL

А 431 65 50 - >90

HeLa 45 10 - -

HL-60 - 20 но. -

NG - - - -

МА SY12 были официально представлены для исследования на VI Международном Рабочем Совещании по типированию лейкоцитов человека и изучались в течение 1995-96 гг. в 15 различных лабораториях. Обнаружено сильное связывание МА SY12 с клетками эндотелия кровеносных сосудов, капилляров и лимфатических узлов в норме (Pizcueta, 1996) и слабое связывание с активированным эндотелием (Haraldsen, 1996) Впервые показано, что при обработке антителами против Le* посткапиллярных венул наблюдается увеличение адгезии нейтрофилов, которое также сопутствует активации эндотелия (Diño, 1996).

Таким образом МА, полученные при иммунизации мышей синтетическим иммуногеном Ley-PAA-PE, высоко специфичны к заданному при иммунизации антигену и способны узнавать природную детерминанту Ley.

2. Получение моноклональных антител к синтетическому антигену SiaLe' и их характеристика.

Антиген SiaLe1 в составе углеводных цепей высокомолекулярного сывороточного гликопротеина СА 19.9 обнаруживается на ранних этапах онкотрансформации клеток поджелудочной железы, молочной железы, желудочно-кишечного тракта и некоторых других (Magnani, 1984).

Подход, разработанный при получении МА против Ley, был использован для получения МА к тетрасахариду SiaLe'. При иммунизации мышей по аналогичной схеме использовался сорбированный на убитых бактериях Salmonella minnesota неогликолипид SiaLe'-PAA-PE. Тигр сыворотки для трех из пяти иммунных животных составлял всего лишь 1:600. Низкий иммунный ответ на SiaLe', по-видимому, был связан с описанным в литературе общим супрессивным сиалогликоконъюгатов (Hakomori, 1994).

При уменьшении дозы вводимого иммуногена до 10 мкг и увеличении времени между инъекциями до 24 дней удалось получить выраженный ответ на SiaLe', инъецируемый внутривенно в виде неогликоконъюгата, сорбированного на клетках Salmonella minnesota. Титр сыворотки для пяти мышей, иммунизированных двукратно с трехнедельным интервалом составил 1:6400, при полном отсутствии ответа на неогликоконъюгат, вводимый внутривенно без бактериальных клеток.

После трех слияний и трехкратного клонирования из 17 первичных гибиридом было отобрано пять клонов, стабильно продуцирующих антитела к заданному при иммунизации антигену (Табл. 5).

Все полученные гибридомы продуцировали антитела класса М, для их очистки использовали тиофильно-адсорбционную хроматографию (сорбент был получен из Института питания, РАН) и последующую гель-фильтрации на колонке ToyopearI HW-50 (Toya-Soda, Япония) [6].

Табл. 5. Характеристика МА к 51а1^е\

Гибридизация N Высоко продуцирующие клоны Концентрация МА в супер-натаите мкг/мл Концентрация МА в асците мг/мл Изогни Ко (по Веаму. 1986)

1 5УЗ-07 80 6 18М 107М"'

2 БУЗ-Е5 БУЗ-О 80 40 4 2 1ВМ ^м Ю'М'1 но.

БУЗ-ЕЮ но. 4 18м Ю'М'1

5УЗ-Н9 но. но.. [8м но.

При определении эпитопиой специфичности полученных антител было обнаружено только одно МА БУЗ-ЕЮ. высокоспецифичное к 5!а1*е'. Другие четыре МА лучше всего связывались с 51аЬе', но показали в большей или меньшей степени перекрестные реакции с тетрасахаридом 51аЬе\ трисахаридами Ье' и Н (тип 1), а также пентасахаридом ЬЭ'Га (Рис. 2 и Табл. б).

0.03 0,00 0,12 0,25 0,5 I Концентрации антигена (мкг/мл)

0,03 0,06 0,12 0.25 0,5 I Концентрация антигена (мкг/мл)

-3- 8

-4- 8

Рис. 2.

Прямое связывание моноклональных антител, полученных к вгаЬе*, с синтетическими гликоконъюгатами, содержащими 20 мольных % сахара:

1 - 51аи'-РАА , 2 - Б^аЬЛРАА, 3 - Ьс'-РАА, 4 - Ье'-РАА, 5 - Н (тип 1)-РАА. 6 - Ьес-РАА, 7 - Ьеь-РАА , 8 - Н (тип 2)-РАА .

Величина стандартной ошибки не превышала 2-5% от измеряемой величины оптической плотности (О.П.). поэтому она не приводится.

Табл. 6. Ингибирование связывания анти-51аЬе° МЛ олигосахаридами и их полиакриламидными конъюгатами.

Олигосаха-риды Форма * Концентрация 50% ингибирования (мкМ)

БУЗ-07 SY3.ES 5УЗ-Е10 БУЗ-а 5УЗ-Н9

51а1.е' -0-5р'-РАА|10%) -0-зр'-РАА(20%) -0-зр'-РАА(30%| -О-эр2 2.9 8.3 10 250 122 72 80 545 0.3 1 1.2 2.7 и.о. 0.2 2.7 н.о. 88.8 272.5 250

-О-зр'-РАА -О-эр2 150 850 300 1700

3'-3031_е* -О-эр2 - - - Н.о. -

31а1_е* -0-зр'-РАА(10%) -0-5р'-РАА(20%) -О-эр2 12.2 15 25 86.3 - 0.5 109 •

1-е" -0-5р'-РАА(10%) О-яр2 н.о. н.о. н.о.

Н (тип 1) •0-зр'-РАА(10%| - - 600** (10)

(.БТа 1000** (351 ■ 1000 (10) 500 (401 1000 (25)

Н (тип 2) -0-5р! - - и.о. н.о. н.о.

1-е5 •О-гр'-РАА -О-зр2 н.о. н.о. н.о. н.о.

1_ас1ИАс -О-вр2 - - н.о. н.о.

№и5Аса -О-вр'-РАА - - • 600 130%) -

* В скобках указана плотность гаптена на РАА матрице. Спейсср для конъюгированных форм - эр' = -СН2СН2СН2-; для мономерных форм: - 5р" = -СН2СН2СН2МНСОСРз или С^С^СНг^

** В скобках приведена степень ингибирования связывания МА в % при указанной концентрации.

Полученные моноклональные антитела были исследованы в лаборатории Экспериментальной диагностики опухолей института Экспериментальной Онкологии МАН и лаборатории Патоморфологии ВОНЦ РАМН (Москва) для определения их способности взаимодействовать с природной детерминантой на поверхности опухолевых клеток и в составе СА 19.9. MA SY3-D7 и SY3-E5 были опробованы в гистохимических исследованиях на криосрезах различных злокачественных опухолей: желудка, сигмовидной кишки, толстой кишки, яичка, предстательной железы, молочной железы и лимфогрануломатоза. Выявлено связывание MA D7 с раковыми клетками ~ протоков поджелудочной

железы и малигнизированными клетками толстого кишечника. Показано, что с помощью антител SY3-D7 и SY3-C1 можно выявлять сывороточный маркер С А 19.9 у больных раком поджелудочной железы, молочной железы и желудочно-кишечного тракта.

Описанные в литературе МА к SiaLe1 получены при иммунизации мышей раковыми клетками человека. При изучении иммунохимических свойств этих антител были обнаружены различия в эпитопной специфичности, которые, по-видимому, являются причиной отличий в диагностической специфичности тест-систем, используемых для выявления СА 19.9. Насколько справедливо это предположение покажут дальнейшие сравнительные исследования, выполненные с помощью анти-SiaLe1 антител различной эпитопной специфичности.

MA SY3-D7 было представлено на VI Рабочем Совещании по типированню лейкоцитов человека и были рассмотрены в нескольких лабораториях, участвующих в работе секции "Молекулы адгезии". Показано связывание этого антитела с клетками эндотелия посткапиллярных венул (Autschbach, 1996).

3. Определение специфичности моноклональных антител LU-G7.

Моноклональные антитела серии LU-BCRU были получены Phil Rye (1989) при in vitro иммунизации клетками аденокарциномы молочной железы. Одно антитело LU-G7 (IgM) из тринадцати МА взаимодействовало с

высокогликозил про ванным гликопротеином с М, 230 kDa, который появляется на ранних этапах малигнизации клеток (Rye, 1993). Поскольку при обработке карциномы гликозидазами связывание MA LU-G7 с клетками значительно уменьшалось, возникло предположение, что это МА направлено к углеводной цепи гликопротеина.

Для проверки данной гипотезы нами был использован прямой и ингибиторный варианты ИФА на основе РАА-конъгогатов различных сахаридов, а также мономерных олигосахаридов (Табл. 7). В результате выявлено, что MA LU-G7 связываются с антигеном Le: (Galßl-3GlcNAc) и некоторыми другими олигосахаридами. Взаимодействие исследуемых антител с Lec-PAA было наиболее сильным, а фукозилированная форма этого дисахарида (Le') оказалась второй по своей активности структурой в ИФА. Тетрасахарид SiaLeJ был менее активен в прямом ИФА. Как SiaLe\ так и LNT (Galßl-3GlcNAcßl-3Galßl-GlcNAc) слабо ингибировали связыванияе MA LU-G7 с Le"-PAA, сорбированным на поверхности планшета в концентрации 5 мкг/мл.

Слабое взаимодействия с LNT и отсутствие взаимодействия с нормальными клетками (многие из которых имеют гликоконъюгаты с терминальным Galßl-3GlcNAc), позволяет предположить, что антитело LU-G7 на опухолевых клетках и муцине узнает необычный ("абберантный") эпитоп, который может быть либо фрагментом необычной углеводной цепи, либо гликопетттидом. либо составлен по принципу конформационной детерминанты [5].

Табл. 7. Характеристика связывания МА G7 с олигосахаридами и их полиакриламидными коньюгатами (плотность гаптена на РАА матрице 10%).

Антигены Структура Форма Прямое связывание (в % по отношению к связыванию с Le'-PAA) Концентрация 50% ингибирова ния (мкМ)

Le° Gaipi-3GlcNAc -O-sp'-PAA -0-sp: 100 3.8 11

u" Gaipi-4GlcNAc-tl,2 tl.3 Fuca Fuca -O-sp1 -PAA

Lea Gaipi-3GlcNAc-tl.4 Fuca -O-sp'-PAA -O-sp2 35 39.6 171)

SiaLe3 Gaipi-3GlcNAc- Í2.3 t¡.4 Neu5Aca Fuca -O-sp'-PAA -O-sp" 15 800 (30%)

SiaLe* GalfiMGIcNAc- Í2.3 tl.3 NeuSAca Fuca -O-sp'-PAA -O-sp2

H (тип 2) Fucal-2Gaipi-4GlcNAc- -0-sp: -

LactNAc Gal(il-4GlcNAc- -O-sp'-PAA -O-sp1 - 335*(15)

Td.S Gaipi-3GalNAcp- -O-sp'-PAA -O-sp3 - +

TF Gaipi-3GalNActx- -O-sp'-PAA - -

Fucai-3GlcNAc- -0-sp: -

Fucctl-lGlcNAc- -0-sp: -

CA50 Neu5Aca2-3Gaipi-3GlcNAc -0-sp: -

LSTa Neu5Aca2-3Gaipi-3GlcNAcpi-3Gaipi-4Glc -OH -

LNT Gaip l-3GlcNAc(i l-3Gal|» l-4Glc -OH 800 (30%)

* В скобках приведена степень ингнбирования связывания МА в % при указанной концентрации.

4. Изучение специфичности моноклональных антител, полученных с V и VI Международных Рабочих Совещаний по типироваиию лейкоцитов человека.

Полученные с Рабочих Совещаний МА были исследованы в прямом ИФА с помощью синтетических гликоконъюгатов. При первичном скрининге МА неизвестной специфичности панель гликоконъюгатов подбиралась с учетом структуры углеводных цепей поверхности клеток или молекул, которые изучались на данной секции.

Антитела против 51аЬе' и 5'|аЬе\ широко применяемые для исследования экспрессии лигандов селектинов, были представлены на секции "Молекулы адгезии" V Рабочего Совещания (1992-1993). В ИФА были использованы синтетические антигены Б^е* и 51аЬе'< и их асиало-формы в виде свободных Сахаров и полиакрнламидных конъюгатов. При цитофлуориметрическом анализе изучали взаимодействие МА с клеточными линиями А431 и КЬ-бО, которые на своей поверхности несут детерминты Бг'аЬе' и 51аЬе* соответственно. Среди шести антител, зашифрованных под номерами 5071-76, было обнаружено пять МА против антигена 51аЬе". Одно из этих антител (Б074) взаимодействовало также с

В результате обсуждения на Рабочем Совещании специфичности МА к рецепторам селектинов, МА против лакто-цепей типа I ($1а[~е*, 1,е* и Ь5Та) объединены в один кластер и отделены от антнтел против лакто-цепей типа 2 (5'|аЬет и Ьех), которые кластерированы как С015з и СО 15 [4].

Анализ с помощью прямого ИФА более 700 МА, предоставленных участниками семи различных секций VI Международного Рабочего Совещания по типированию лейкоцитов человека (1996-1997), позволил выявить несколько десятков МА, реагирующих с углеводными детерминантами (Табл. 8). Определение эпитопной специфичности для выявленных при скрининге анти-углбводных антител проводили с помощью более широкого набора синтетических и природных олигосахаридов. Было обнаружено несколько высокоспецифичных антител к углеводным детерминантам Б^аие' и Ье\ при этом подавляющее

большинство углевод-саязывающих МА показало перекрестные реакции с родственными структурами.

Табл. 8. Результаты скрининга (с помощью неогликоконъюгатов Б^-РАА) МА, полученных с VI Рабочего Совещания по типнрованию антигенов лейкоцитов человека.

Секция Количество проанализированных в ИФА МА Количество углевод-связывающих МА Наиболее активные олигоса-хариды и МА к ним

1. Молекулы адгезии 33 S Le" SiaLe" 6 (CD 15) 2 (CD 15s)

2. Антигены эндотелия 95 5 Le* 5

3. Антигены миелоидных клеток 80 10 Le* SiaLe' Lact LactNAc 1 (CD15) 1 (CD 15s) 2 (CDwl7) 6

4. Т-клетк» 99 15 Le* LactNAc Lact NeuSAc 6 5 3 (CDwl7) 2

5. В-клетки 188 12 LactNAc SiaT„ 10 2

б. "Нелинейные" структуры 180 19 Ley LactNAc Lact Neu5Ac 12 6 1 2

7. Антигены тромбоцитов 32 2 SiaLe1 2

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Преимущества, которые дает применение синтетических углеводных антигенов при скрининге и анализе специфичности антител общепризнаны: материал индивидуален и доступен. В то же время, вопрос о применимости неогликоконъюгатов в качестве иммуногенов совсем не очевиден. Анализ литературных данных по получению поли- и моноклональных антител с помощью иммуногенов типа Sug-бeлoк (Sug-BSA, Sug-HSA и т.п.) выявляет множество изъянов этого подхода, главный из которых - образование антител к углевод-белковому эпитопу. Использование неогликоконъюгатов типа Б^-РАА полностью исключает возможность образования антител к участку, где соединяются гаггтен с матрицей и позволяет на самых ранних этапах скрининга гибридных клеток отобрать клоны, продуцирующие наиболее специфичные к заданному при иммунизации антигену антитела Антитела, полученные другими методами к природным углеводным детерминантам, в своем подавляющем большинстве, показывают значительно больше перекрестных реакций с родственными углеводными структурами.

Данная работа продемонстрировала целесообразность применения синтетических углеводных антигенов и полиакриламидных неогликоконъюгатов для получения и изучения эпитопной специфичности моноклональных антител к углеводным детерминантам. Изучение механизма формирования иммунного ответа к углеводным антигенам, в дальнейшем позволит направленно усиливать ответ на слабые иммуногены и получать антитела заранее заданной специфичности.

ВЫВОДЫ

1. Разработан подход к получению моноклональных антител к углеводным антигенам, в основе которого лежит использование нового типа иммуногена, представляющего собой олигосахарид, ковалентно присоединенный к иммунологически инертной матрице - липофилизованному полиакриламиду.

2. Получены моноклональные антитела к синтетическим ат-игенам Ьеу и Б^аЬе' и определена их эпитопная специфичность.

3. Полученные моноклональные антитела выявляют соответствующие антигены на поверхности опухолевых клеток.

4. Показано, что эпитопом для моноклонального антитела Ы_Г-С7, специфически связывающегося с клетками рака молочной железы, является дисахарид

5. Проведен скрининг моноклональных антител, предоставленных участниками V и VI Международных Рабочих Совещаний по антигенам лейкоцитов человека. С помощью синтетических антигенов выявлено несколько десятков анти-углеводных антител и для некоторых из них определена эпитопная специфичность.

Основные результаты диссертационной работы изложены:

1. Vlasova E.V., Byramova N.E., Tuzikov А.В , Zhigis L.S., Rapoport E.M., Khaidukov S.V., Bovin N.V. Monoclonal antibodies directed to the synthetic carbohydrate antigen Ler. Hybridoma. (994. V. 13. N4. P. 295-301.

2. Раппопорт E.M., Жигис Л.С., Власова E.B., Пискарев В.Е., Хральцова Л.С., Ворожайкина М.М., Зубов В.П. Применение тиофильно-адсорбционной хроматографии для выделения моноклональных антител к группоспецифическому антигену Н (тип 1). Ж. Физ. Химии. 1994. Т. 68. N 10. С. 1809-1815.

3. Rye Ph., Bovin N.V., Vlasova E.V., Walker R.A.. Monoclonal antibody LU-BCRU-G7 against a breast tumor-associated glycoprotein recognises the disaccharide Gaipi-3G!cNAc. Glycobiology. 1995. V. 5. N4. P. 385-389.

4. Bovin N.V., Vlasova E.V., Galanina O.E., Khaidukov S.V., Tuzikov A.B., Tzvetkov Y.E. and Nifant'ev N E. Specificity of MAbs S071-S076 towards synthetic selectin receptors and cells A 431 and HL-60. Leucocyte Typing V. White Cell Differentiation Antigens. 1995. V. 2. P. 1534-1535.

5. Rye Ph., Bovin N.V., Vlasova E.V., Hoifodt H.-K., Kierulf В., Trones G.-E., Fodstad O. Breast cancer-associated antibody LU BCRU G7 recognises the terminal disaccharide Galßl-3GlcNAc and can be used to isolate tumour cells from body fluids by an immunomagnetic bead procedure. Biochemical Society Transactions. 1995. V. 23. P. 584.

6. Rapoport E.M., Zhigis L.S., Vlasova E.V., Ptskarev V.E., Bovin N.V., Zubov V P. Purification of monoclonal antibodies to Ley and Led carbohydrate antigens by ion-change and thiophilic-adsorption chromatography. Bioseparation. 1995. V. 5. P. 141145.

7. Власова E.B., Ворожайкина M.M., Хральцова Л.С., Тузиков А.Б., Попова И.С., Цветков Ю.Е., Нифантьев Н.Э., Бовин Н.В.. Рецепторы селектинов. 5*. Моноклональные антитела к синтетическим антигенам SiaLe' и SiaLe\ Биоорганическая химия. 1996. Т. 5. С. 358-365.

8. Kayser К., Kaltner Н„ Dong X., Khapp М„ Schmettow Н, Vlasova Е., Bovin N.. Gabius H.-J. Prognostic relevance of detection of ligands for vertabrate galectins and Lewis Y-specific monoclonal antibody: a prospective study of bronhial carcinoma treated surgically. Intern. J. Oncol. 1996. V. 9. P. 893-900.

9. Vlasova E.V., Lukin S.V., Khaidukov S.V., Astapova M.V.. Bovin N.V. Fine Carbohydrate Specificity of anti-CD 15 and anti-CD 15s Monoclonal Antibodies Submitted to the Adhesion Structures Panel. Tissue Antigens. 1996. V. 48. N. 4. P. 358.

10.Vlasova E.V., Lukin S.V., Byramova N.E.. Bovin N.V. Carbohydrate Epitope Analysis of Monoclonal Antibodies Submitted to the Endothelial Cell Antigens Panel. Tissue Antigens. 1996. V. 48. N. 4. P. 412.

/

11.Vlasova E.V., Kovalenko E.I., Nifant'ev NE., Bovin N.V. Carbohydrate Epitope Analysis of Monoclonal Antibodies Submitted to the Myeloid Antigens Panel. Tissue Antigens. 1996. V. 48. N. 4. P. 424.

12.Vlasova E.V.,. Diachkova L.G, Tuzikov A.B., Shiyan S.D., Nifant'ev N.E., Korchagma E. Vu., Ovc/tinntkova T.V., Byramova N.£., Tyrtysh T.V., Simeoni L.-A., Pazynina G.V., Bovin N.V.Carbohydrate Epitope Analysis of Monoclonal Antibodies Submitted to Non-lineage Section. Tissue Antigens. 1996. V. 48. N. 4. P. 452.

!3.Vlasova E.V., Kovalenko E.I., Galanina O.E., Nifant'ev N.E., Bovin N.V. Carbohydrate Epitope Analysis of Monoclonal Antibodies Submitted to the Platelet Panel. Tissue Antigens. 1996. V. 48. N. 4. P. 470 14.Vlasova E.V., Aphonin A.Li., Korchagina E.Yu., Tyrtysh T.V., Bovin N.V. Carbohydrate Epitope Analysis of Monoclonal Antibodies Submitted to the T-cell Panel. Tissue Antigens. 1996. V. 48. N. 4. P. 479.