Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА (HELIANTHUS ANNUUS L.).

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА (HELIANTHUS ANNUUS L.)."

А-ШФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК: 577.21:581.143.6:633.854.78

САНГВАН ХАРПАЛ СИНГХ

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА

(НеМап^из аппиия Ь.).

Специальность — 03.00.12 — Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва— 1993 год

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ УНИВЕРСИТЕТ имени U.В,ЛОМОНОСОВА биологический факультет

На ершах рукописи УДК;' 577.21;561Д43,6:633.654,78

САШАН ХАРОАД СИНГХ

Получен»э я мссладошшв трайсгеннкх растений * подссштвика / Heilert hu« *шкш* i* Л

Свецяаяьность »'03,00.12 - Фииадогкя растение

АВТОРЕФЕРАТ Двссертадии иа соискание ученой ствавня кандидата биологически! наук

Москва - 1993 гад

Г" цеч ТРАЛЬНАЯ*

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА

Meett, ач ядами*

Работа выполнена в Иаучнсл центре "Биояшкенерия" • ■ . Российской Академий наук .

Научный руководитель г член-корреспондент РАСКН доктор биологических наук, профессор К.Г.Скрябин

Официальные олпоненты: доктор бяологпгческях наук, профессор Е.А.Тарасов кандидат бнологичесних наук ■* Т.А.Йшсова '

. Ведущее учреюшние; ВНИИ.сельскохозяйственной 1 биотехнологии РАСХН

"Зощйтй состоится "0,3"^^¿^¿1993 года в Д

- Ва »асеДания специализвровакногосОвота К.053.05.14 по присужденио учёной степени мищидата биологических наук в ' Московской Государственно« университете по адресу119699, ■ Москва, Воробьев» горн, МГУ, биологический факультет.

■../■ ,,С диссертацией можно ознакомиться'в библиотеке биологического факультета М17. '

Автореферат разослан »'{,"■ - . _"1993 г.

' ОДннй секретарь л сляшшлязнров&нвого совета

каададм. саслогжческкг наук-- 0.Г.Полесская

Введение

Актуальность теш. Вдетой ;'э важных сельскохозяйствен них культур является подсолнечник, используемый дня получения масла с высоким содержанием жирных кислот и витаминов. Подсолнечник выращивают в различных регионах мира; »та культура хорошо адаптируется к неблагоприятном условиям среди. В России созданы высокомасличные сорта подсолнечника, которые по-слуулли источником создания ценных гибридов и изучения явлений мужской цитоплазма™ чес кой стерильности. Однако, частная генетика зтого объекта по сравнению с другими сельскохозяйственными культурами разработана недостаточно. Широкие возможности для решения многих задач генетики и селекции подсолнечника, в частности, создания форм устойчивых к пестицидам, иксекти-цида1/1 и патогенам открывает сельскохозяйственная биотехноло-' гкя, основанная на применении методов генетической инженерии,.

Принципиальная возкояность переноса чужеродных генов в клетки подсолнечника рри использовании Tt-плазмид A.tuaefa-'Ciena^¡БШа показана рядом-авторов / Uptake et al » „ I9B4, Goldabrcugh et al '( 1Э85, Everett et al , * 19S?/. Однако;' из-за неспособности k регенерации опухолевых трансформированных клеток эта система не получила применения а генетической инженерии аодсолнечника. Использование "обезоруженних", лишенных опухолеобразуюших генов векторних систем, сконструирован)) ух т. основе Т^-щазккд A. turaeiaciene ■ iT разработка способов регенерации растений подоолкечпика из каллуса / Patterson, Everett , v 1985/ z зарод шей / M.preyeeinet, OjPreyeeinet, , et al , 1991/ открмзагт

пути к созданию трансгенных растений пожсолнечника с поуоиьэ ь.етода генетической трансформаии'*. Э^а задача uoj.pt быть рощ-ка при исполь?ошнки векторных плазь-кд с удобними гегетичег-кя^и

кпркераки и штам/ов А. 1;ш&Гае1епв . 1толучешт№й с Помоги трркродительских скрещиваний. Поскольку эффективность различных векторных потазмид к штаыкоЬ бактерий неодинакова для различии* растений и зависит от их гепотГита и физиологического состояния, то необходимо осуществить поиск способных к транс-0р:.',ацив лин"И подсолнечника и выявить наиболее удойные лля трансформации итакми А£»Ъао1ег1ш11 ШтеГаЫепв.

Падь и задач;; исслежшзти;. Работа посвящена разработке система генетической трансформации подсолнечника на основе использования ТЧ-плазмкдних векторов, способных осуществлять ш-роиос чужеродных генов в клетки табака к других растений.

Р д/ссертации йили поставлены следующие задачи:

1. Анализ взаимодействия различных штаммов 1. гишоС-аЫеоэ с различным* линиями /генотипами/ подсоли ечшпса.

2. Ызработха котсща генетической трансформации у подсолнечника с поьойью и -плазмядного вектора, содержащего маркер-нъ'Я ген устойчивости к кянамигущу.

3. Определение экспрессии маркерного гена.вКШ в, клетках трпнсгенииу растенг.Й.

4. Сравнительное изучение эЗдюхтивностя трансформации табака и подсолнечника при использовании различных штампов

А, 1илеГас!елв •

1)АУЧ;:ап к тактическая з;!ачга;ость ьаботн. В работе

оеукг'стыгстй герптгчреиая транс^оркмюя у полсолнечника при нсводьэочлнпг. векторной системы А. гитеГ^еиэ • Иолученк тцшки^тпи» раоюния подолянечипса сорта Гкакскнскк?,, в котор;' изус) гка ^кспрсгсия гона в ГШ, V ■и'^юлкруиего устоЕ Ч1*пость и

1'с , -что способность к тус^о ¡ор м1^ л за-

ггсгг от : лпотгп' р.сгечя£. 3 эультатз с таимого ыг^гя

миимод-ейстиня различим штаи.юв A.tumefaoiene , c подсолнечником нимало it штамм'/ А с илази.идой pBI 121/, обладайте более высокой трансформирующий активность«.

Нилучоннив результаты свидетельствует о виз: ли юности НОЛу-чишш трансгешшх растоиим подсолнечника с: чужеродным генами, что расширяет возможности созван lift пиний перспективных wm сьлеинии. Разработанная сангина гчмшти ческой трансформации ьо^вт бить использована для получения трансгениьк растений с различпш сочетанием признаков. Эти методика поз волн от таю* в i:cследовать особенности экспрессии наличных генов, введенных В составе векторных нлазмид, в зависимости от генотипа, гормонального статуса и различны* физиологических параметров объект»

Структура и объем диссертации■ Диссертация состоит из введения , обзора литераторы, посвященного системам генетической ' тралс-Цорьаши У растений, разделов с описанием материалов и методов, главы с результатам и обсуждением; в завершении работы приведена выводи. Работа изложена на страшяш, содержит Ш рисунков si-таблиц; список ли геритури вклычаег 140 наименований. ' • "

МАТЕРИАЛЫ ¿1 ni Е Т О Д Ii

Растительной материал, (ьате риалов саулжли растеши табака /• Hie»tien¿ tabaoum л1'ния ev"Petlt" Натаюа SR-I , .а также подсолнечника / Hellanthus штииа L» /, сорта

4

Енисей, Надежный, РнакскнсгаЙ, и ¡бредшая линия 3S29, / люЗеаио предоставленные А.И.Гундаеиыч/; ядерйке мутанты и chlorina 3 ; n ohl о ti na 4 ; пласт иднъ'е t/yTatlTU eti cblorina б,en Chi о riña 7 / любезно предоставленные Ю.Д.Бедшгким/.

3 качестве эксплантов использовали незрелые зародыши на 9-21 день после ощмения: сегменты гклокотиля, перьу» пару листьев, апексы побегов 5-13-дневных аселтэтscккх проростков. ИнцукШ'я к.чллуса под^ол^ечн^ка. Образованна каллуса индуцярова-. ли кз незрелых зарод^тей размером 0,1-0,0 см на питательной среде ЫЗ /iturashige , SJcoog 195Й/, модифицированной I'ano-венко и Зорониной / Гапоненко, Воронина, 1990/, рИ 6,6. Стерилизацию сомянок проводили / 9-21—ü день после опыления/ в 10? р-ре гилохдорида а, в течение 30 к'ин. Бактепкальтге дтяша и поаэрядн. йспользоыци супервярулентнЫЗ агрош'новкй гга?.« А 36 i / предоставленный М.С.Гордоном/ и-разоруженной октопиковый штахи ЬCA 4404 / предо о-гавлэннвй 'Л.Ю.Бо-* ' »-

веном/. Wa Йтэмка A^roliecterium timefaciea* , ссг.ер'сата

вектор с?ймерного тpina р31 121 / созданный на основе вектора . püln 19/, с каркерпыки генами не оьшцгафос.$ют ране:};? разы /bFlií/ü &»в" / лредостаипенный Г.А.д^ей'ерссном/. Плаз- -кеда pol 121 Сила перенесена в итаюты A. ttiesf sel en* путем тралродЕтаа-оких скрещшмыий /Лотэютейа, Дрейгер, 19S&/ с рспллъзоэашши клн.'мглы-лодастлй: рГК *Х>13.

Ятя jcj.nbTBBfj or^iií-F, ЛактердЛ <1цди г.слользсваль' среда AJ

- ь -

УТ, Бактерии Е. ooli для последующего выделения плазглидной ДНК вымащивали при 37°С на богатой среде JT. Агробактерии для Последующего выделения плаэвидной jjiK вышивали при 28°С на богатой УЕВ-среде.

"'panc'k>№u4um клеток Ь'. coll и выделение длаз^ипной ШЖ. Трансформацию 0акт^рг;Й проводили по методу Mandel и

Шел /1970/. D ряде случаев использовали также компетентные клетки Е, ooll , приготовченние по методу Hanahaa /1983/, Для выделения плаэмидной Д1Ж использовали модифицированный метод Birnboim к Doly /1979/.

ферменты.Большая часть ферментов, включая зндонуклеаэы рестрикции, получена из НПО "Фермент" / Вильнюс/.

Клвновскяй фрагмент ДКК-полимеразы 1 Е. coli , ДЩ-лигаэа и полинуклеотидкинаэа фага Т4 были получены от фирмы ' " Amet-sham н /Великобритания/,

рестрикция ДНК. Рестрикцию ДНК проводили в буферах, рекомендуемых фирмамя-реютавщиками. Концентрация ДНК в рестригашонной смеси не превышала 0,1 мкг/мкл раствора. Рестрикцию останавливали, смешивая образец о половиной объема 7,5 М раствора аммония ацетата и двух объемов этанола. Посла 15 минутного инкубирования нуклеиновые кислоты осаждали центрифугированием при 12 ООО е в течение 15 минут и растворяли а требуемом объеме стерильной воды.

Лягкоованя. фрагментов ДНК. Фрагменты ДЛК легировали в смеси объемом 10 мкл, содержащей однократный 6yJ«p следующего состава: 50 мМ Тр с-С1, pH 7,5, 10 мМ N^Clg, 1U кМ ОТ, 1 t-ii сгер-цшлина, 0,5 ni,i pnöo AW- и 100 ккг/кл LOA.

Количество векторной ДНК в реакционной емчеи не превьгшало 20 мг. Если в р°акцки лигиро№Н"т р.; поль зо вал с я jiiHociop-^po-

ванный векторный фрагмент, то молярное соотношение вектор/ фрагмент составляло 2:1, во всех.остальных случаях - 1:2 -1:3. - ' •

При лигировании фрагментов с липкими концами концентрация -ДЦК-лигаэы бактериофага 14 в ctfeca составляла'0,006 ед/мкл/ единицы »«¿ее ; реакцию проводили в течение ночи при 4

Выделение ДНК из клеток Д, tua«facl»na_ t Выделение

тотальной ДНК из клеток A. tumef»oi«ae проводили со-

гласно методике Draper J. /1986/.

Кфнъюгационцый паоекоо рлазмид из Е. <">И р A.ttu»»f»ol«n« проводили согласно методике Ch«ye»n и Dip loiter /1SEJ?/,

Эффективность конътогапяи составляла 10 - 10 , -Трансформация сегментов листьев табака,

1. Растения табака выращивали ln *itre и» побегов, на половинчатой среде М , с конпбнтрацией агара 0,7%. Брали листья

ст 4-х недельных растений ляняи " i«tit н&т«па 8ft- I ',

2. Отрезали сегменты листьев площадью - 0,5 см^ и переносили . в чашки Петри с 10 мл жидкой .полной среды МЗ -

3. Добавляли 10 мл бактериальной культуры: Агробактерии выращивали в течение ночи на минимальной среде с .TOO V.r/wui снекти-номонина / / и/йлп 10С0 мг/ш ст1>егттскялша / /.

4. Инкубировали образцы в течение 48 »асов при 25°С в комнате для культивирования растении.

5. Йнфгцироваинне образцы дваад» пробовали жилкой полной МЗ средой / в 2-х исходных объемах./'*

6. Переносили сегменты лкстьеи в пробирку со средой для хидукшш побегов путем помешеккя нижнего эпидер(ляса ка агар, Для регеке-parjtH лебегов табака в гол ну» среду Ms с концентрацией агара U,6;f лобагллла 1,0 w/л ^енэмакзкнопуркна / /, и

L,1 мг/л ПУК / eigma /. Кроме того, 5СЮ мг/мл сс^ютаксиь'а /igrobeoteri««/ добавляли в среду, чтобы элиминировать клетки l.tumefaoleae , Добавляли нйьа1»шш /100 мг/щ / / aigjaa / в качестве селективного агента для получения трансформированных побегов кабака,

7. Образцу инкубпредали при 25°С в режиме 16 часов освещения / 2L0 люкс / 8 часов темноты.

8. После появления маленьких побегов / через 3-4 недели/ листовые диски переносили на свежую среду и выращивали в течение 3-х недель.

9. 5 побегов / - 0,5 см длины / переносили в стеклянный контейнер, содержащий агаризованный МС среду без фитогормонов, но с добавлением 500 мг/мл сефотакснма. Побеги последовательно переносили на среду МС, в которой концентрацию евфотакеша гра-диентно уменьшали до нуля в течение следующих 2-х переносов, для получения'аксе ниче с ких растений.

Определение активностиН FT XT. проводили методом Pettcca о соавт. / Reiee et al ,*1984/ в модификация, описанной в работе

Ре. Bloojt et al /1а84/. ' - "

*

С^лекпяя и регенерату траяейомантов. После 2 шш 3-х дней кокультивированяя, листовые диски переносили в среду, содержащую 500 мг/мл карйенициллина / чтобы ликвидировать клетки A,tumefaclena / и 30 мг/мл канамицмн сульфата, для селек-

ции трансформированных клеток растения и побегов. Карбеницидлин применяется для подавления бактериального роста; другие антибиотики, такие как сефотаксим при 500 мг/мл могут быть заменены вия использованы в сочетании с карбенкциллином, чтобы обеспечить эффективный контроль селекции. Через 3-4 недели каллус i »обеги появляются на листовых да. -кал табака, культивируемых на

селективной среде вместе с клетками А. гшвГас1впв содержащими химерную конструкцию с геном устойчивости к кана-мицину. В контрольных листовых лисках рост не наблппался.

Побеги переносили в почву., через 4 недели, когда корни достигали не менее 3 мм длвни. Корня дромнвали для удаления среды к молодые рЕ*"¡тения помещал» в стерильных условиях в ростовые камеры с освещением в контролируемой влажностью. Важным фактором выживания молодых растений является защита их от высыхания. Трансформация у подсолнечника. Для трансформации подсолнечника незрелые зародыши культивировали с ночной культурой А.

ае1»пэ . Ночные культуры агробактерий выращивали на двукратной среде УТ или АВ с канамщшном / 50 мг/л /.

Селекцию трансгенсой ткани вели на безгормональной среде М 3 , содержащей 100 мг/л канамицинсульфата / я*1"*« / и 500 мг/л' клафарона /йт^в» / ври использовании вектора А281 / рВ1 121/, и на среде того же состава с фитогорвоками' при использовании вектора ь ВА 4404 / рЕ1 121 /. В качестве контроля, использовали пеобработайние незрелые-зародыша, домешенные на модифицированную и селективную браду, а также незрелые зародыши, обработанные агробактериаяьными штаммами А 281 и ЬВА 4404, лишенными плазм ид, с последующим культивированием на селективной среде. Результаты и обсуждение.

1. Равнение и анализ трансгеини шстеняЗ табака. Для селзк-нии клеток растения и побегов через 2-3 д.чя кокультивкроваши листовые дсски переносили в ту же среду, содержащую 500 их/л карбе!2'^шша г 30 иг/мл кань-глщгн сульфата. Чтобы обеспечить ^М^кточный ко.'-трсль с^гкщгг лспользуется се^отЕкс]^, / Ж1 Г-гДл / в*.'¿с то кагЗенпг.лл^а, кли р сочэтп;:,^ с карбчн-

Ржо. X, Опрвдалюдг» аитканостя

/Ьрт u/h раомют табака» I. iba 4404 (поитра-); - щщщшмк • р» «ужьппв трввофоравци A.tiiu¿f»ÓI«íV iai44¿* ; ( pBI 121 )| 7-12 * аоцгчвнши я i^iroww rp ОфОрющ! A,tum»fMi«na А 2М (j»I Ш ) * 13 - А 281 ( ююрОА )*

цшшшом. Через 3-4 дня, в отличие от контрольных вариантов, на среде для культивирования с нлеткаг„и итадл.а A, tuewfecieoe LBA 4404, содержащими химерную конструкцию с геиогл устойчивости к каиамищну, наблюдался рост ¡камусов и побегов.

Селекцию растений, способных к экспрессии чужеродного гена, проводили на среде /солевой состав МЗ , и витамины, 30 г/л сахароза/, содержаще it 600 мгЛл карбеидидлина и ЭСкгЛл ванамицяна. Отбор проводили по признаку укоренения побегов.

По результатам определения неомкпинтраисЗ-еразкой актив-кости было установлено, что в 6 растопил иэ 12 / Рис. 1 / обнаруживается экспрессия гену И РТП, что свидетельствует о трансге.чкой природе этих растений,

2. Сравнение эффективности трап слотами и табака различимым штампами'ягппбвктеоий, 'Для трансформации фрагментов листьев табака 6*аия использованы штаммы ВА 4404 и А 281, в которое путем трехродительских скрещиваний бал перенесен бинарный вектор рВ1 121. Т-Д11К плазмидм р'й.Во542 штамма А 281 содержит ■ гены синтеза фитогоршнов, .а Т-ДНК рВ1 121, содержит ген . *РТ II, т.е. устойчивости к каламицину. Таим образом, ври' трансформации шташом А 281 / рВ1 121 / на среде без фито-гормонов с 100 кг/л канамкцина происходит отбор де oil ну к транс-формантоь. Результаты опытов по определению эффективности трансформации при использовании различные штаммов агробакте-рий представлены в таблице 1.

При трансформации фралиентов листьев штаммами ЬСА 44U4 и LBA 4404 / рВ1 121/, рост устойчивых к канаикцину ткано?, происходил на среде с фйтогоркопак и. При ^^гшсфорьыит а 281 /рВ1 121/ наблюдался сплошной .(юет устойчивой к канаикипу Ткаия у 14 гксллаят^в на сррде е Ф/тргн^опиш, и у :15 рис-

Таблица 1.

)

Сравнение эффективности трансформации ШсоНааа ъ&ь»еит различными иташаки егробактернй / ЬБА 4404 и А 261 /

Штамм Совпа М 8

Г(?ШОШ1+ 1ри+ К»" гормоны" ЦЯ1"

ЬВА 4404 Рост кадлус- Сплоеной ' Нет роста

/рВ1 121 / ной ткани в рост на всех

отдельных точ- эксплантах

ках експлан-

*ов. 4,2 точ-

ки на 20 эк- ■ о \ ;

сплантах

А 261 Сплошной Сплошной Салопной рост -

/рВ1 121 / рост на кра- рост на яа 15 яа Яр

рПВо 542 ях 14 экс- всех тэкс- вксшюнтов.

плантов яа таантах

120 , •

I Кщ - каяамишш; в качестве гормонов жепохьзавахл^>

НУК /¡*Г -кафтилуксусная клслвта / БАЛ /6-й енэилаисшо пурин '/

- -

плантов в среде без фггогор.юнов / табл. 1 /.

Такш образом, трансформация листовых пластинок табака при использовании штампа Ag гоbacterium д 281 /рВ1 121/ происходит эффективнее, чем при использовании штамм LJiA 440) / р31 121/, то есть вирулентность urmtu.a Л 281 выше, чем ■ J-ВЛ 44U4.

3. Генетическая траио^юршиня незислыу зг^юнктей 'иолсолнечикка рри использовании -плазккд Agro bacterium tume facie аз. Впервые а 1987 году Эверетт с соавторами получили трансгенные растения подсолнечника / Everett et el , 1987/. Ма-

териалом служили участки гипокотиля олерилышх 7-дневных асептических проростков» которые инокулпровали ночной культурой неонкогенного штамма A.tuniefaci0ne С 288 / WAL 715/.

В качестве доминантного селективного маркера использовали устойчивость к аминогликозидному антибиотику канат; шишу. Однако эти опыты позднее воспроизвести не удалось / Peerboltej,

Dek , 1991/. Трудности в осуществлении трансформации у ■ подсолнечника, по нашему мнению, связаны с тем, что клетки подсолнечника отличаются высокой чувствительностью к воздействию агробактерий п процесс трансформации в большей степени зависит от исходного генотипа растений и возраста эксгианта. ' Нами совместно с И.П.Ворониной и А.К.Гапоненко была изучена возможность трансформации незрелых зародышей яри использовании восьми различных генотипов подсолненичка с помощью со-культивирования с НОЧНОЙ культурой A. twnefaciena .

Прежде всего исследовала влияние антибиотиков va процесс валлусогенеэа в регенерация растений при подборе селективной среды. Как известно, влияние антибиотика зависит от генотипа растений. 6 связи с ьтим, в работе анализировали действие

различных антибиотиков / ванкокшшн, рифамшаиш о тетрациклином, кл&^оран, кана\ищин / на растения подсолнечника с различным генотипом. Только клафорам не оказывал заметного угнетающего алияния на рост каллуса и регенерацию растений. При концентрации канамщадна 1U0 мг/л 36-60$ незрелых зародышей показали способность к росту.

Учитывая получение данные, в ¿дяьнейшей работе в качестве селективной среди была использована среда, содержащая в каче- . отве селективного агента кааамицин ДСОмг/л/ и клафоран / 500 vx/л 1 как агент подавляющий рост агробаетерий.

Селекшда трансформированных тканей проводил;: на безгормо--' налькой среде, так как в Т-ДНК рТ-хВо 542 находятся гены бис- ■,■ синтеза фктогсрмонов. Отбор двойных трансформантсв, при вве^з-нии Т-ДНК pîibo 542 а Т-ДНК рВ1 121 проводили на среде боа фитогормонов, но в присутствии 100 мг/л тал амидам. На 7—ÈJ " сутки после с а культквнро ванля незрелых зеролдеюй со штатом ; агробактерки А 201 и селекции на среде без фятогормонов в ка-' намиглна наблюдали интенсивный опухолевый рост на семясслях. ■ ' 3 результата трансформации при использовании А 281 /рВ1 ■'

и дальнейшего культввярсвашя на среде без канамивдна били . 1 получены сходные результаты. 37 из 123 эксплантсв подсолнечника сорта ГяаксинскиВ при культивировании на среде с lGOwr/л .. канакгасшш, ироявляли способность образовывать опухоли /табл.2/. Однако трансформация била обнаружена не у всех ясследсЕалных сортов к линий подсолнечника. Способность к генетической трансформации зависит от, генотипа растения. Как видно из таблица 2 образования трансгенной тгани происходило только у одного кз восы.ж используемых генотспсв.при это* аффект явность трене-

-tu-

формации шташа A 281 / piíl 121/ бнли нише, чем при использовании штамма ЫЗА 44и4 / рВ1 121/. :)и в одном, из случаев использования ткани гипокотиля / включая растения сорта Ржаксинсккй/ трансформаций не наблюдалась. 4. Сравнит? льни ft анализ пФФективностн трансформации незорлых зарошиеА подсолночника различи ми штатами а^го bacterium -

tugte facie na_# Повышенная вирулентность штампов

A. tuniefaolena . к допорныы растениям является необх&лнш.; условием для увеличения частоты трансформации. В этом oTi;o:j;e-нии штамм А 281, по сравнению с вдтии) штатам! применяется чаще, так как обладает вирулентностью ко ь-нопя.. видаы растении / Hood et al > 1984/. Данний штамм несет cyne¡.-вирулентную шгаэмиду pllBo Ь42. Было показало, что при использовании плаэ-миды pTißo Ь42 в качестве плазмиды-помощника в бинарной систем-частота трансформации существенно возрастает /Ал et al , 198Ь/. В результате трансформации незрелых зародышей сорта Ржаксинский штаммы к. tuné Гас lan а , А 2dl /рВ1 121 / частота образования опухолерых линий составляла После сокуль-

тивировония с ЬБЛ 44ü4 / piil 121/ частота образования морфо-генннх каллусных линий составляла 5,33^ / табл. 2 /. Таким образом, трансформация незрелых за родине Н данного сорта происходит более элективно при использовании штамма А 281 /рВ1 '121/, чем со штам.юм LBA 44U4 /jiil 121/. ¿ля осуществления тралов орг.ании и изучения хщйкте[й экспрессии ¡снов, колосообразно применять в^-улентьый штам.» A. tumefaoiene , A Uj I. Однако, в дин ног., случае, регенерация ¡-астеш-Г; из опухолевых клеток непозможпа. '

При |:огкл1ЬЗ(.Ч'ании гы.,ма LRA 44 Ы транс 1oj ифгчл-шие экс~ плантн помечали на селоктирпзу прегу е i(i"¡vi i р.онами, ra-t fear

-iff-

Таблица 2 •

Частота трансформации неэрелик зародышей /Н3/ и Гипокотиль /V/ подсолнечшпса различидаи штаммами A^wbacterlum tumefacíaos.

Генотшш подсолнечника Штаммы агробактерий

A28I (pBI 121 ) Ш4404(рВХ 121)

Кол-во Число часто-эксплан- транс- та тран татов генных сфорга-опухо- ШЕИ левше /я; i линяй VAI ' Кол-во Число Час--эксплаи-трая- тота татов сген- тешках сфор-каллу- мация сишс , ы \ линий v/( '

ЙШС8Й ^э Г •137 120 ' - - 135 - -145 -

Нч Надежный Г 137 ' -197 - К 7 - 215 '■ - ' .

3629' 9 Г 217 151 IS7 - - íes

Ич Рхаксинсккй Г КЗ 37 • 30 151 75 4 5,33Й во - , . - *'*

я chlorine 3 Г 107 - 103 • - 198. 165 -

к о chlorine Э 4 Г 124 147 - - 144 131

en chlorina-^з 6 Г 133 - -146 - 147 151

«п chlorineЦ, 7 г3 135 -15 Г 147 161

. данная плазм ада является разоруженной. Полученные ?;ирф01еш[,у; каллусы росли на среде с 100 мг/л кшы.нпина и были способны к регенерации растений.

На среде с добавлением фитогор&.оног-, но без канаи-:ци:й после с о куль тивмрован ия 1>ВЛ 4404 / рУ 121 / индукция к^плусов происходила /4 кз 75 экснлантов сорта Р-каксинскмй мнодш:ровьцш

мсрфогенный каллус/, но каллусные линии росли медленно.

Результаты по трансформации гипокотидя были отрицательными.

5, удределение неолита [jfocftoT ракрйе р^з >:ой активности в клетках транс^ормантов рОЕсолнечника. Для доказательства осуществления трансформации с помощью плазщпы, содержащей маркерный ген И РТ II) были поставлены опыты по определению неомкщтнфосйятранс-феразной активности в клетках каллусов, полученных в опытах по трансформации с сортом Ркак' кнсккй. Проводилась проверка растительной ткани на присутствие клеток агробактерки. Части каллусов, выращенных на среде с канамицилом и кдафораном, подвергали разрушению в стерильных условиях и -высевали на бактериальную питательную среду ЛВ с 50 мг/л канамштна. Отсутствие роста бачтериальиык колоний на поверхности среды свидетельствовало о том, что каллусныв ткаки. не содержали жиэнеспособных бактерий . Agrobaeteriura ttmefaei«QB • Активностьы РТ Л определяли в опухолевых линиях, полученных в результате со-культявнрсвания эксплантов со штдаьт А 281 / рБ1 121 /, а также в 4 каллусных линиях, выделении после трансформации or-штаммом ь ВА 4404 / рБ1 121 /. Оба тша линий выращивали на среде с канамкцяном. В отллчш от контрольных образцов /без

использования И-цпазмлд/ у всех опухолевых линяй в кз.-иу^*, #

полученных Посла процедуры трансформация, была обнаружена BFT П -активность. Это указывало на то, что все етк линии яелл-¿тся тр&нсформаятами,'обладающими новым-признаком устойчк1 стл к канамящшу за счет эясорессяя гена нРТ П/ Та с.2/.

<2 3 4 S 6 7 В 9 10 1.1 12 13 14 IS 16

Txo. 2 . Овладел мш« ажтмаостя наомииапфосфогравофа;«*»

t»A*

/ ют Ii / ■ кашогвша я опутодаяи* оолнвчвим сорта ГиакодноюаД» 1-8 - «хотрвхтм я* onyioiel» шцгчмошх я pi»'. ; яу«и*$* т^аяефоцва»ж A.ttuwfaoisne t 7 «• АЯ1 \

, /»атиш/i г* 6» в .А»1ЛШ21Л ; % i - 16 - «кздант ш пмуоов» шлтчмйп » К ДОМЖМ ТриофгрЖвВ A.ttHwfael*n» S S - SJ ШММ /&£1шЛ и - It - ьШ404 /ми1<зв/. '

-4t-

выводы

1, На модельной системе генетической трансформации у табака

с использованием бинарного 1 -влазкиднога вектора исследована трансформирующая аффективность различи!« штаммрв Agrebeaterlum

tumefacitna •

2, Разработана система генетической трансформации незрелых зародышей подсолнечника с помощь» И-плазмидного вектора и получены трансгенные растения, устойчивые к канаыицину, в соматических клетках которых экспрессируется ген ИРГ II.

3, Способность к трансформации у подсолнечника зависит от генотипа растения; трансформация обнаружена у сорта Ржаксян-

, СКНй,

. -(. Установлено, что эффективность трансформации незрелых за-роднюей подсолнечника выше при.использовании оупервврулентного-агрошпк аего штамма A. tumfaoleae , А 281 /рВ1 121 /, по 6равнении о октопиновым штаммом LB1 4404,

Заказ 730 Тираж 100

Типография M H ПО «МИОПИЮ» 3-;i Неглншшй пер., 5