Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика моноклональных антител к вибриону вируса ящура подтипов OI и CI

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика моноклональных антител к вибриону вируса ящура подтипов OI и CI"

РГ6 од

, _ Л ',ППЧ . .

}• о ты . . ■

¿СЕРОССИЯСКШ НАУЧКО-ИССЛЕЛОЕАТЕЛЬСШ ИНСТИТУТ ‘ • ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ

. ’ На правах- рукописи . УДК 619: 578.835.1: 575. 8. 097

■КИРКЗЗЯН Сергей Рудольфович

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЮЮШЮИАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К К1РИ0ЯУ ВИРУСА ШУГА ПОДТИПОВ Ох И С1

• , 03.00.05 ’'Вирусология” . .

. ' . АВТОРЕФЕРАТ ' . '.

диссертации ка соискание ученой степени кандидата биологических, наук

Едадамир - 1993

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте заэд?ы .животных МОХ РФ

НАУЧШЕ РУКОВОДИТ ЕЛЬ .

- БУРДОВ А. Н., доктор Еогеринарних наук,

■ профессор ;

- ГЛОБЕНКО Л. А., кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: . ,

- РЫБАКОВ С. С. , доктор биологических наук, старший

научный сотрудник (ЕНИИЗЖ, г.Владимир);

- РЕУТОВА Е. Г., кандидат биологических наук, старшк

научный сотрудник (ВНШШВиМ, г. Покров).

ВЕДЩЕЕ УЧЕРЕШЕНИЕ - Научно-исследовательский ветери-. . нарный институт, г. Казань.

Защта диссертации состоится »¡4' шшшЖж г. в 10 часов на заседании спедаализированйого совета К 120. 60.01 при .Всероссийском научно-исследовательском институте зашдты квотных до адресу: 600900, г. Владимир, п. Юрьевеи,, ВНШШ. . .

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных. <7 . ’

Автореферат разослан "О ’’ НСі.ІушЛ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета - Узшов Е'Л.

• - 2 -

Актуальность тел Ящур остается одним из самых опасных заболеваний сельскохозяйственных животных. Это связало с высокой способностью.генома возбудителя к мутациям, которые приводят к возникновению новых вггашов, способных вызвать эпизоотию. Поэтому разработка быстрых и чувствительных методов диагностики и изучения антигенной структуры вируса с гаданью моноклональных антител (МАт) представляет большой интерес.

Первое сообщение о.получении Ш.т появилось в печати в 1982 году (McCullough K.С. , 3utcher R.). '

Анализ литературных данных, касахщихся изучения вируса ялзура с !юмо!ць!0 МАт, показал, что проводимые исследования направлени на тмшрование и субтиг.ирование вируса ящура.прк диагностике и изучении его антигенной структуры (КЫоеп R.Н. , 1383; Brocchi E., 1986; Stave

J. W. , 1936; Crowther J. R., 1984, 1988).

В последние годы МАт получены к различным изолзтаы вируса ящура: Oj Швейцария (Sinone F., 1983, 1984), Ог

BFS (McCullough К. С., 1983; 1Ыоеп R.H. , 1983; Ouldr idge

Z. j. >' 1984),. 0| Аулендорф (Duchesne U , 19S4), От Кауф-бойрен (Thiel H. , 2S87), Cj Брешия (Capucchi L, 1984),

Oj Детмол, Cj Санта-Ш (Knowles M. J., 1990), 0[ Вогезы, Оз Индайал (Matsu M.G., 1990), A 5Вестервальд (Thiel H,, 1984), A3 Парма (Have P. , 1983), AiQ (McCullough K.C.,

1933; Msloen R. H. 1Q83),'AI2 (Baxt B. , 1936; Robertson

B. H. , 1G84), A24. Крузейро (McCul lei/ßtl K. C. , 1983), A¿2

M550- (Давыдова H.JL , 1987), Азня-l. (Batchairv К. a,

1989), SAT-1, SAT-3 (KfcCullough K. Q., 1SC3). .

‘ В то »? время. раЗот no получению MAT к вирусу ящура o'l N194, Ox N1613/ Cl N564 не йроводклось. МехАУ тем ДЛЯ нас эти штаммы представляют наибольший интерес, так как используются в стране в качестве производственных для приготовления диагностических и вакишных препаратов.

©уш и задачи юсяедоваюеа. Цель» настоящего хссле довзния было получеюк шЗридвьа клеток и моноклональны антител к вирусу ящура 0| N194, 0х N1618 и СI N564., ?акае изучение возюязшсти их кспод- зования для диффе ренпизауад итамтв возбудителя.

Дая достижелия поста?..пенней цели были определен; следущие задачи: ~

- получить гибридомы, секретирующие МАг различно; эпитоиной специфик эсти к вирусу ящура типов О и С;

- полупить коллекция моноклональных антител дет диф-ф^кци&дии егтглмов вируса нщура От и С^;

- изтчи'ж'ь возулжность использования диагностически: прзпа,'-:л’ов на огниве ыоношоноаьн^х антитеп при определении вируса ящура и противояцурных антитех

Научная кшшзнз. Подучены не имеющие аналог эв I стране к па рубе?.ж ¡н&мш гибридных клэток, продуцирующих Мат к вирусу яиура типов ©I (штамм N194 и N1618} 1 Ст (жгахм N564) (авторские свидетельства N 1692146 и > 159П147). . /

Сказана принципиальная бозшйность использования моноклональных антител для дифференциагши штгляйов возбудители. ' . . ■ ■

Проведено-зпктопное кгртлфоаеяме Ега’йюв вируса ящура типов.О и С с .помощью М&т и синтетических'пептидов с известной аминокислотной последовательностью. Построена гипотетическая пространственная модель расположения эпитопов на антигенах вируса яиура 0| и 01.

Проведено изучение' а:"гигенной структуры вируса яшура,

О- N1618 и Ст N554 и идентификация его гпитонов.

Яранггнчандаая ценность рабой* Получена коллекция ■цтаммсв гибридом, секретирутда ¡14? к 1465 кошоне::ту вируса яиура 0^ и С}. * .

' ' . ‘ 4 ■ . . Отобрали наггбэ.гэе перспективные ктокы е высокой сг i~

¡льнооть» м антитсдопродущ рущей акпшьостъю. На ото5-

мные клоны составлены паспорта и i.poi едено их .и пони-

>впние »о Все эозсийской галлеге;ни клеточных чул'>т'/о

¡ститута цитология РАН, г. Санкт-Тетзрбург.

Отсбоакы МАт, пригодные пля дифу^рзнциацил штаммов

фуса $»цура Oj иCj, ■ -

Получены азу,кие и шгофшмзиро зишые препз! аты л) ти-

Ш1ьурнух моноклональлнх антител и их конъюгаты с пе-

жслдазой хрена. *

АлрсОацка работа. Результаты- исслеговэн/rt по теме

¡ссертации доложены на заседаниях ученого совета ВНИЯИ

198? - 1991 гг., на лапшой конференции " Актуальные

х>б::?ш ветерикарзюй вирусологии" .ВНИЯИ, г. 1аадимир,

’88), научно - теоретической конференции молодых ученых

Актуальные вопросы ветеринарке й вфусолопш " vВНИЯИ,

Владимир, 19ЭС), на семинаре, специалистов стран - чле~

зв СЭВ "Разработка к испольвованкг новых адьзезактов для

ютехнологи*еских целей’* (Вдздоар, .1990), на Всесош-

:й ваучно -. технической конференции "Соврешнние проб -

змы иммунологии, биотехнологии тента и щ еточной иняз-

грии в ветеринарной медицине" (г. '-imiHft Новгород,

?Э0), на Республиканской кояфер -*нци1! ’’Ветер)« фнзл ме~

яцина, зколог пгескйе, социальные к экономически проб-

гыы” (г.Харьков» 19S0 ). .

' ПуСшвсщяз резульгзтез sгйждеззкяй. Основные- поло-

гнкя диссертации отралены а девяти опубликованных науч-

ых работах. ' * • .

Структура и работ Диссертация- содержит еле-

уюшие разделы: введение, обзЬр литературы, материалы к

этоды, результаты исследований, обеудаеняе» выводы,

п>:сок литергтуру, вклгчаиций 110 источников литера? урн.

абота изложена на 129 страницах иашнопхеного •. екста.

Диссертация содержит 30 таблиц, 16 рисунков к 5 приложений. ' ■ -

На ззхяту шносятся. . .

1. Получение штаммов гибридных клеток, продуцирующих

моноклональные антитела к вирионам вируса яяура От N194, Ог N1618 и N564. •

2. Характеристика моноклональных антител к вирусу яшура ‘>|М194, 01М1618 и С£М564. вошедших в коллекцию, для дифференциации штаммов вируса

3. Результата экспериментов по дифференциации штаммов Еируса ящура 0£ N194, N1618 и N564,

4. Результаты экспериментов пс пртгэнеий» монокло-

нальных агл итэл в диагностических наборах при выделении вируса ящура и прогивоящурных антител. ’

5. Штоды получения жидких и лиофилизированных препаратов моноклональных антител. ,

6. Результаты изучения антигенной структуры вируса я.’зура с помощью' моноклональных антител.

7. Методические подходы построения модели пространственного взаиморасположения эпитопов вируса ящура на антигене и С| с. помощью шяоклональних ентитчл. .

А - ' - ' -

ШЗСТВШШЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

. . ШЕРШШ1 И Й5Т0ЛЫ

V • * ' *

Шю*гъш Использовали 145Б, 125 компоненты антигена ЕИруса >,кура 0^ N1618, 0 ^ Н194 и 1483 антиген вируса.С£ N554. ' ' .

В опытах по ксследокш» специфичности МАт использовали антигены типов 0 (01 Кауфбойрек, 02,. 0% 0^ 05,

°10 °Ц>* ¿12'* 0 ’(С2* ¿1 65/57•

С1-ТЛ-112), Азил-1 и САТ-1. , - ' • -

Б работе по эпдаошюму картированию использовали \ . '

- б - ' . свободный пеп?;ц с аминокислотной иоследоват?льностмо

140-150, соотве-гству’огггй сек >вкой антигенной детерминанте з'»'руга ясура 0x^194, я клгысгаги пелгидеэ. i40^160. 142-1СЭ, i44-15.f и 200-21'. с гемогазнинои УЛИТКИ CKUi).

Йгаямса«.- клсяях В работе приняли --сгелоилые клетки д:шииРА1 от инбредьых »еж»ft ЛИНИИ £? -.LB/C, получение из ЖБ5> -АН Эстониу. (“Таллинз:■. - ’ . ,,

^жя!пиз. Дал шшугизацш а получения асцитической жидкости к'пользовал? инбредных мь$? лгг-ик BALB/c обоего яола с массой тодз 18-2С г, получеякьк из Сшггно-яле-шмнего литомямез лаборатории« чтаотных РЛШ "Светлые горы” : Московская сблаогъ) и Иа^гао-экопертгснтальной базы (г. .;екроз, Владимирская область).

Г.-хг/чез;ш гйбрзри. Сл«яапе модоииик и селъ-зеночикх клгток проводили по метода» Глебом«). JL А. с соазт,. С19£б).

©чкеткз миюгсяжатазл ятя’яуод. Mir выделял:? из мы-аашей асцитической жадности методом трехкраткого осаждения иасвдвкным рзстгорои сульфата и&юния с последующи: -диализом против воды я фосфатно-буферного .раствора (ФБР). , . ' ' ■ ’ .

. еврэйояззг» ipS'tsHccco М*.г. Подюгл.-совув ппияаддга*: псеть Шт определяли в непрямой КА, ксполь-чуч набор фирмы "SorotsK". ' • ■ .

. С&ргодттссяа рэг&щ ^»водили, как описано э : тодическах укзгзнкях. ::э зцд&.шгяо п Кцэнтифжадазг. птам-,изз вируса яцтрз". Яачкуреладга КАР еярвдвжш с 'Ьрмоаьо 1й>А согласно иитсликб,' .првйлозюнвьй 0. Гriquot • etv al. • :Ц972). ■ ■-■ _ • , :■ ■ - , /: ■•;

; ’Шшгзвряши? ЗДг проводили, ыгтеда • пэр:5£ола?вого';

CKHCJiSKHH. ■ '

' • йггяис^есйув обгоняет? рэдгаяю» проводи®\ яо; 'кетод/ Огьюяекта Ввмижгкий, 1«б45.

РЕЗЖэТАТШ КССЩДШЖЙ

При получении гибридом наші былл использованы рекомендации . " Ь этодики получения и поддержания гибридных

кяонов, секретирукяцн М&т к парусу ящура”, разработанной во ВНІШ (1986). Получено 76 гибридных клонов -с тину О^ и 43 клона к типу Ср которые были заложены на хранение Я ЖИДКИЙ О 5 от. ' -

Произведена наработка пзргичЕКХ препаратов Ы/.т в виде асіїигі ч '-ской жидкости и супернатантов с яосдедутш ВЫД5ЛЙН1 эм очздценнчх и концентрированных иммуноглобулинов, ; такій их ::е,хжокдазньк конъюгатов.

Часть препаратов б*га лиофидьно вкеувена, анализ ж в КОЛ показа с. что у - осдьишетва ©л активность посла внеунвгеаяня не - вд&яядгвь л сохранялась в течение

года (срок, наблюдения). - ’

Установлено, что подученные Мат -сблада.”!! различной стелеяью взаимодействия с гоьо- и гетерологичиьш штаи-ыамя «¡руса ящура, а также способность» нейтрализовать

ЕИр;)о ' '

Так, из яселедозачных 45 Шт к вирусу От Зі обладало вируске.йт'раяіізуад&Я активностью СЗНА), а к вирусу С£ из.

1-1 - 5> ■ Серозазаткые свойства проявляли 6 из азученньа МАт, полученных к варианту А, шдекс'защиты (ЙЗ) ужи составлял от 2,& до 5,3 1е (таол. 1) • ’

• . . • • Таблица 1

Характеристика активное, и моноклональных антктел

в. PH и РЗ с гомологичным вирусом (01 41618) .

. ,--------------1------------г----------!

| МАТ ' | ВНА | из Г

• ( ■ ( (1о22> | ("в) !

гввз 1 7,0 1 4,0

ГВЕ4 1 ■ 9,5 ! 1 3,7

ГВСЗ . I 8,5 1 5,1

ГВС5 1 7,0 Г 2,8

19ВЕ2 1 6,6 I 3,5

ГЕ6 1 7,5 1 5,3

I_________________________________________________1_____________________________________________I________________________________________I

Выявлено наличие МЛт, обладавших узкой специфичностью в отношении гомологичных антигенов: так, из- 30

антител К 7'у.пу 0| 25 проявили ВЫСО.'У» ТКЛОСГЭЦИфИЧНОСТЬ в ИИС Часть. МАт обладали ипирогао! спектром и взаимодействовали с разными ти':ат вируса ящура. . ’

Полученные дачные подгзерждают уже существуете сведения о том, что вирус яаура разных типов 1.меет как сходные, так к уникальные.детерминанты (ЕгиЬпвп М ]. еЬ а1. ,1966). • . .

Так, моноклональное автизало 18С4 (к варианту 0^) ыошт .быть примером, ¿емонс7риру5ос!Км ¡шроту спектра взаимодействия кАт с раз ли шши антигенами вируса яшура. Око реагировало .в ША с четырьмя гигами вируса А, С, Азия-1,• САТ-1, включая-гомологичный тип О , с четырьмя вариантами тича О - 0^, Од, Ол, с тремя огамками

гсшлогичиого вируса - 0^ N194, 0 ^ N1616 и ОгК ' П[иугроы антител, реагирую®« с уникальными аял’ген-

. _ 9 - • '

ными детерминантам!!, шгут служить МЛТ 4/15, ГАб, 7Д6._ Е реакции/; на перекрестную активность с различными типами вируса ящура они прояпти высокую гипосиецифмчность.

При изучении свойств антител в реакциях с различил; хариантами вируса типа О было усташвленно, что большая часть ъ!Ат реагировала с вариантом 0^(16 из 20 исследо-ва>ньк МАт). Шьяскоть этот случай, возможно, помогут результаты исследований, прэнэденнкх ранее С-нуфриевым EIL, Муравьезым а К» с сотр. (1970). Авторы определяли степень родства между штаммами 0^ N194 и О g • Степень родства уетанавлизади пс разнице титров , и индексов иммунных сыво;лотс к против гомологичных и гетерэлогичныг. штаммов зкруса, а также определением серологических отношений (г) и антигенного тоадесгза (R) на основании данных, полученных в РОК, РЯ и' РЗ. По их результатам серологическое ОТНОИсЕИс г ыояду кгашзш Öji}194 И 0£ было равно в РОК - 1,0, в PH - 0,83, а антигенное родстзо R -

70,77., 54,5% соответственно.

Нами бала отмечена положительная реакция некоторых ЫАт с вариантами вируса 05, Ojo, 0Ц. но не удалось выявить ни одного антитела, перекрестно реагируадего с вариантами и Q-,. . •

Ма исследовали взаимодействие-МАт, ' полученных к вирусу Oj, с антигенами различных вариантов вируса типа О, разрушенных действием 1М соляной кислотн до. 123 частиц. Целью исследований было установление присутствия эпито-поь :вязьтзкия МАт'на 125 субъединицах, а также пщт--верядение данных по иерекрэстноку взаимодействию МАт с гетерологячнши вариантами вируса в ИФА. '

Установлено, что картина адсорбции }1Ат на 12S комло-.-:ент вируса лщура О] ,во многих случаях является близкой таковой для це.Еьногс вириона Возмодко, это свидетельствует о нгличии одних и тех г© сайтов адсорбции МАт на ^ .. ' -

. • . - 10 -

обоих субъединицах вируса (1463 И 12S) 5Í ó .том,• что эти сайты не разрушается в процессе гидролиза и во время прикрепления этих частиц к лолистироловой поверхности плашек при лссгановк» ИФА ’ .

Отмечены и случаи, когда ачгивюстъ Зйт с IES частицами была значительно ниже, чем со 14GS (актитсдл ГВС5 и 19Ш), .что, по-видимому, свидетельствует-о влиянии'целостного состояния пирисна на Езанмодействие антигена с антителами. . .

Отсюда сладует, что большинство полученных на\5и МАт к вирусу Oj направлены на эпитолк, имеющие, вероятно, линейную структуру. JЪ для подтверздения сказанного про-ьедено дальнейаее исследовали-? МАт в зидкофазиом варианте ИФД, ¡torra s нс-мгят образования комплекса ЛГ-АТ устраняется влияние 1:3 15ЭНфОрмаи.ИО сороционяых свойств пластика, так это показано KfcCullou^h К. С. et- al. ,1986.

При изучении взаимодействия МАт, полученных на вирус Oj, был установлен высокий уровень их активности со итаммаки гомологичного вируса (Oj N194 и Oj ,41618 2,1 5,6 'lg), причем реактивность со пггашсм Oj Нзуфбойрен была ниже или отсутствовала всобз? (табл.2). . ■ , '

Несмотря на тс, что . штаммы 0j?ílS4 a ójNIGia бьао трудно дифференцировать друг от друга это- -удалось сделать с помсаыо антител 7Д5.ЕВ2 и 12В1 путей сравнения уровня их активности с каждым из вташов. Например, активность МАт 32ВА со Етаммсм Oj.Nl94 в дна раза превышала таковую с вирусом О¡N1618. Следует такие указать; ва то, . что активность МАт 7Д6 и ЕВ2\ • помученных на штамм Oj М1618, как отмечалось pairee, была существенно вит в реакциях со штаммом 0¡N194.' Можно лредпололить, что антигенные детерминанты, на которые направлены МАт, могут быть более доступными на одном вирусе и менее - на другом. -

ТаОлица 2

Характеристика взаимодействия МАт к типу Ох со ^гаммами гомологичного вируса в ИЗЛ

Антитела

I г

АЕТИГеН, |

1..Ч ког. иолуч. МАт

АКТИВНОСТЬ в ИФА (1р)I

Ст Ш94 0!; N1618 Ох К1

! 2Д2 | От N194

| 1234 | - // •

1 12В6 (

) 4,© ! -//-

I 13А4- I

1 12Е? | V -

1 ЕБ£ 1 От М161П

| 19.£6 ! -//-

! 18Б6 , -//-

I РВб | -//-

I ГВВ5 1 -//-

| рз£}4 ! -//-

1 19ВБ5- - 1 г//~

! т | -//-

1 17Ш | -//-

1 ГА6 ' . |. : -//-

! 7т :. 1 -//- ■

1 18С4 1 . -//-

I 13^6 | -//-

I БА4 | -//г

I ГБС5 1 -//- "

I ГВСб 1 -//.

\ Я1’Р02 ! -//-

5,6

4.2 2,1

3.5

4.2

3.5

3.5 4.0

4.2

5.6

4.9

4.9

5.6

3.5

3.5

3.5

3.5

4.2

4.2

3.5 5,4 4.8 '5,5

4.9 2,1

4.9 2,8 2,8 2,8

1.4

О С , и

2,3

4.9 4,2

4.9

4.9

3.5

3.5

3.5

\л

5,2

4,8

4,6

м

2,1 2,8 X, *

- I

1.4

3.3 | 2,8 !

3.5 |

3.5 •

2.1 I 2,8 !

4.2 |

1.4 !

3.5 1 2,8 | 1,4 \

отсутствие аетивяостл \ .

' ■ - 12 - •, При алаляе дачных PH вьявнть а?М'ж- ме.чзт шта1.«. I •К вируса О х па уровкй шсгш кости с кики Мат Сило затруднительно. Однако, такте 11Ат, как ГВВ-: и ГВВЗ, 2:аимо лейг'тлов.хпи с г омздэгнчил« ?ггг.мш.: в полтора-дб а >аз агггивнееч чем с гегерслогкчнкми (тзбд. 3).

Тзолшг-

/»сгявнооть 1Ат си игаммзми гомологичного вируса Oj в РБ

¡Антиген, на 1 Антитела ¡кот.получ. } I ЫАт I

ЕНА (logg)

0j N194 Oj Hl6i8 Ol A\

1 2Д2 ! « Oj N19-4 \ 5.7 4,9 6,0!

i 4© ! -■/- | 5,2 4,0 - 1

I ?Л5 i t } -//- ! 1 3,5 6,3 - ! 1

r ' f | ГВ5 i . j -От N1518 i 7,5 5.-: 1 5,4|

j 18C4 | -//- ! 4,2 6,2 8,3!

i ГЕЗЗ i -//- | 4.0 7,0 В, 9}

1 Г23В6 ! -//* | 4,7 9,5 &Л\

| ГБСЗ j -//- i 5,3 8,5 3,2!

; гвсб i -//- i 7,0 5,9 3. 2|

! гвсб j -//- . i 8,2 4,7 . 7,7)

I ГБС2 i -//- i 6,3 2,9 2,3|

! Г5Б5 ' i -//- ( 7, С 7,0 • 3,7 j

I ГЕС1 ! I ! -//- ! . , , i •5,4 ' 3,0 . 3,9! „ J

. orc утстви? активное?!!

’ Способность l'&v нс-йтрзлигс гагь вирус лодт ВерХ*?ЗЛЗ£Ь

И В Р&СЛСЦИИ с ;розад;;'ГМ иа- а::-сосупах. Ьс^ ИССЧ^^уг-

Mbfö Б ГС1 ЫАт зблацлли лротектквным действием при яарад'-

- 13 - - .

ник мызат гомологичным вирусом, Издекс завиты составлял 2,60-5,27 lg. . ' '

Аналогично приведенным вьке работам были выполнены исследования с одиннадцатью МАт, полученными к вирусу С (стами С]N554). Шм удалось выявить ккть строго типоспе--цифичных IvAt, .из которых три оказались зпруснейтралпгуку-щими (активность 2,3 logg). Кроме этих МАт, ешр два антитела обладали вируснейтрализуюЕЭй активностью, но одно из них (С8БЗ) давало перекрестную реакцию с вирусом Agg. Наибольшая перекрестная активность наблюдалась у МАт с вирусом Азия-1 (пять из одиннадцати МАт) (табл. 4).

Аналогичные результаты получены зарубехныш иссдэдо-вателяш. По данным Butchainh S. и Rao В. ü. (198Q), из шеотй моноклональных антител, полученных к вирусу Азия-1, два перекрестно реагировали только с типом С и ее взаимодействовали с типами О и А. Эти дакнкз ех,е раз указывает на то, что. на поверхности вируса яцурз раьнюс типов присутствую обзде или стЕ)ш> noxoxtö ант;;гекны& детерминанты.

В реакциях со стамшыи гомологичного гируса ь наиболее ■ русский тигр отмечен у пяти' иэйтраги&уючих НА? CO gTä!,üiOf,i Gj N554 О' гКТИВНОС-ГЬЮ 4,5-6,0 Четыре из ‘ этих антител сади активны гахаз- со штатом C¡-TJ;-íl2. . Все остальные- ненейтраяпэуяайс МАт и одно нейтрализуйте взаимодействовали со аеёкм тремя нгашам». -с ''активностью от 2,5 до 5,0 1еЧ?абл, 5). л .

£5*4»ренцщ>02а?ь варианты вируса CjN5S4 OT'Cjr-TJI-112, .' по-видимому,момо только ио уровню взакмэдгйс!БИЯ с ними , нескольких нёйгрализугшх антител, гапрмтр, С2С4, С5СЗ.

Наш были отмечены такте, три 1,!Ат, взаиыодейетвукциа ■. С вирусом С'£ ' ' •'

Tsi:3.s/i:ia 4

Актіїві:пст і моіюїслонндьіі:

ТЧ;->.ГрГ> рологичиьмі

1 1 АіСРИГІЮОТі -

1 Антитела ! і І . . . .

г ! От Аоо і

і і C2CS 1 ел ! Ь і

1 С5СЗ 1 5,0 -

! сзвз - І 4.5 3,0

j Со A3 І 6,0 -

! С;’С4 і 5,0 -

! С51/.3 ! 4,0 -

І С8С5 ! 4.0 -

Г '.’5Д1 ' О і

! С5А0 ! 4.0 -

І С51В1 ! 4,0 -

!• С5С4. 1 5,0 -

Í PÎI

2.3 і

2.3 !

З, Ü [

й, з і

fi і

2, 5

3.0

3.0

- і

отсутствие активности

; ктивиостъ 1ÁV?

A.-ÍIJl/.HOf. Til

ГОМСЛиГИЧКС í'ri

атп’їіги.чамк ь

я:::нтеж f И'.’-д, ( іі>: І PH (log¿)

І г ■ г *- — г ~t - ■

! Cj U5G4 1 |Cr-TJi-ii£MjT ‘і- 1 6F./6? ! с2 і Cj МБ64 1

i 1 ! Є, С Í ?.£ ¡ - ! - » í 2,о

СК» I 5,0 ' 3,0 : * І - ! 2,2

CS&J. і 4.5 і í.o ; - . і - ! 3,5

1 6, и 'І 4,5 І ■ ! - 1 2.3

aæ< і 5,0 1 3.0 ! 3,3 ! 2.5 1 2.5

''".ЕГ* ‘ > Ov.Ji. iï. і 1,0' ! 1.0 ! 3,0 і 3.0 1

esas ! 4,0 1 4,0 і 2,0 і 2,5 t • -

СБдІ І 4,0 1 4.0 1 3,0 і - і -

С6Л5 ! 4.Ü і 4,0 І 3,0 і - - .

Col El І 4,0- ! 4,0 1 2,5 1 ** і -

C5C4 ! 5,0 і -4,0 ! j .. і з,п і і і - і _

**- м « ОТСУТСЇЬ№ активности

, Коллекции, или ¡шнели, шноклональкых air.’m-ел широко применяются ка•практике для типироваякя, субтишфсвания У, «лучения ïiOJldtitUi ИоОЛиЧ'ОВ nHpyCS, et ТйКлб В Л 5йрЗТ0{<“ ї:із' гаг^дегаяиях, ::асавсихся изучения зктягекной струк-■Г'уъи з'.-руеа ящур* (Broeohi £. et al. .1S8G: Crotte r J. R.. с- ьі. ,1984; Knoxles S..t., Sarüuel A.K. ,1S9J;' Thomas 'A/M. e?. al. .19ÎÏS). . . • '

Ъ кэллгкцию йАт к антигену о гоедл четырнадцать ак-

- 15 -

тител. tft« они обл-'їлали в» кокой їипосп1 «• пиЁК’даоетъ ¡o в lito И Шесть По НИХ В РЕ О ПОМОЩЬЮ ДеЬЦ’Ш MÄT ;-13ТЫК; B<v” -

акта вируса О (От . Og.Ojgí ) ’да^сь отличить ¡руг ст друга (табл.6).

?•"•' ЛгЧ,':. G

Свойства вгж'Дшях ь ко ало к;’!'.о «сжимуэтльн:::’' антител к Еирусу яч.,-з. ; і *. ;.э ;г.шЫ”М

Г і і /J-П ;:r ¿ t s ' L - . ’ ‘ - ' ■ 1

I -u‘T 1 I 1 •sr. I N1618 llK Os A. 0;< ° J 'j 7Л ■

t_ . .. і 4Д5 f t- - H/H \j \\ H/if a/:: Н/ :: - - - :

ІГА6 + + -H - - - - - !

ІГВС4 •f + i- - - - - i- - - - - - :

I13B6 r + + п/п и/и Н/И H/îï Ч/И п/и - - -- - !

І18С6 + + f - - - - + _ - - - - ;

І12Б4 + + - + - ' - J. - - - * - 1

¡12E5 + ( + -• - - - -f- - - - -i

І19Б6 + + - + - - - - -!

\2Д2 -r + f -Ь - - - - -1

17 да -»• + r + ii/í: - ïï/ïl - - - - - - !

ігво .+ + + + H/ïl -

It SM ■r + - -K + - - ■ - _ - _ - -

11804 f '+ + • - - f - + *- •*• - *• . ¡

1ГВБ4 і 1 -i- Я/И H/îî Н/И Н/Л H/îi - - - - - і і

"л/и” - не исследовали -- наличие .їіілленсст!:

' — отсутствие агетилнсста . .

Лис tope кшацчю штаммов* 0; - ¡.U:4 и .>¡ Mi 61G от

; — îv - • . ■ • -

мзгао ^ б::ло проводт. при лссольс-ювании пяти МАт в PH ;) Я':'д.' . ' • '

, ’ ?тлшьй урош-н актлшюсти ‘антиа-ела 12В4 со штам-«а;м т-.inv/oa От К124 и 0^ N1618 поаволял дифференцировать, ути ь?а>.;уь5 дт.уг сс дгуга.

L’. пг.кй,и ,*;аг к Güï’jîrüHv С били включены семь антител. 'Ai них Плть .6y.Ti! ^«¿специфичны V. ЙФА и три - в PH. Различать штажи ьир;уса Срмсжо было с помощью трех МАт. МАт С51ЛУ было гклшево в чанел;., тш; как взаимодействовало с вирусом С{улбл. ?).

s Таблица 7

Свойства вотеднмх » коллекцию антиг&л -к- ьируеу яцура гялз С, по г.аннш ИФА и PH

Актквкость с антигенами в-

I Ь

¡МАт i

; Ь

®'A

i C’i k2Z

Лакя-! CAT-1

ûj С g С j ^ ЗГ ^“1

N564 ТЛ-112 65/67

SC2CÜ 1 + - - - - - + + - j +

■СйОЗ 1 + - - - - - + + - ! +

¡Ой До 1 + - - ' ~ . - - + ■ T - ! +

i CnA?. l + * . - - + ' + + + ’ j -

•ЦЧ'У, • - - - ~ - T + + 1 -

! 051Ы i - +. * ~ - + , + + | -

| 0uj/:5 *+ - + - ■ - + . + | -

PH

N564

" - наличие активности - отсутствие активности. jiüü^cthOv что во многих зарубежных странах 'МАт киро-

' . - 13 -

ко используют для быстрой идентификации \\ характеристики вирусных инолятов. .

Нами была изучена-возмолясзть использования кснгюга-тов МЛ? при определении вируса ящура я противоааурных антител. Еирус гыяЕЛПдн в объектах ветеринарного -надзора (вода, воздух, зернофураж) и в прсбах антигенов различного происхождения. Влрусслецифичсснив анінгсла определяли в пробах сивороток от : ачшінирозаяньк и кевакцини-рэванных животных. ’

Проведенні© исследования конъюгатов МАт показали их пригодность для обнаружения вируса ящура а объектах зе-. теринарного надзора, для определена вида возбудителя и при типизации вируса ящура. ЫЬиоклснгльикэ антитела к вирусу О]- ч С}, обладайте высокой специфической жгив-носз-ью, могут быть пспользозани в качестве реагентов з ИФА при определении вируса ящура и нротнзояжурньк антител в сызсротко крови КРС. •

С целью длительного хранения подученных МАт наш были приготовлены их лисфилизированные препараты и изучен?, активность в КФА до и после высугшвання. Исследования показали, что - у большинства препаратов МА.'Г активность после высушивания не изменялась и только у трех МАт к ьирусу От И у двух - К вирусу С X титр снизился в б раз, Снижение титров у этих препаратов, возможно, произошло г; результате погреішоетей в режимах лиофияьнЬй сушки..

' Антителам класса Б отводится основная роль з. нейтрализации вируса. В организме взрослого животного они содержатся .в иг «большей концентрация (75%) ст общего ко.;;: честна ,все:с. йймуногдобулинов. По сравнению с друг:;:/;/, классами антител, ’ например- іям, ІдЯ 'обладают 5з.)^о высоким-аффинитетом и наиболее легко выделяется и очига-кяся.- •, ■ •

Наш: проведено, определение классої и подклассов

- 19 - . ,

двадцаг/:і посът Шт к і. 'пусу яэдра .типа 0. и юес?к МАт -типа rJ. .... •••"

■ Было установлено, эдо все исследованные наші гийра-доккые линии клеток секретировади 'иммуноглобулины класса ^ . ' ' •Среди гибридом, полученных из вирус О, преобладали гибридомы, ськрєтиру хлше ишуноглобулины подкласса IgCi (двадцать две из двадцати восьми). Ufc-сть клонов-секрети-ровади ІдСійа У гибридом, получениях к вирусу C¿, набл»-гддзеь обратная картина четыре клона секретировали IgGSa и два - IgGl. . , '

’ По данным зарубезкныу исследователей, УАт накли широкое применение в изучении антиг-жной структуры вирусов. Большое количество работ г этом направлении было выполнено к с вирусом яцфа (Barteling S. j. et al. ,198G; Baxt Б. et al.'.1984; Duel ftsno W. et al. ,1984, Grubnan M. J. , Метені D. 0. , 1986).

Шми были проведены исследования по зяитоянсму картированию вируса ящура Or и Cj с использование >, соот-ве-гстпувдга: МАт к конкурентного ИЗЛ по методу В. Friquet at al. (1972) (MÍA-аддитивный тест). .Этот метод был успешно применен в изучения антигенних детермінант энге-ротоксинов холерных вибрионов и основывался на анализе данных при конкуренции WAr за один и то? же-эпитоп Спреев R It и др. ,1991).

Наш было . предложено применение аддитивного теста для изучения антигенного профиля вируса яцура.. Данных литературы, касахщихся применения этого метода к вирусу яцурз. наш н? обнаружено. • . ' . ■

Характеристик профиля.ка пергом этапе давали по параметрам взаимного расположения эпитопов ча поверхности лГ. При этом результаты конкурентного анализа Шя были представлены комплексно в виде пространственноА ‘мої,ели,

где каждый эпитоп обозначался ТОЧКОЙ.

Затем, і.ри ас пользовании ряда фрагментов белка урт (к вирусу 0-П194), было идея-;¿^пдаровано четыре гоитр.ч лизуиюс эяктола и устаної деко соответствие пространственного расположения эт’лх эпктопсв к к:с V -ст-і .чи. аминокислотной последозательноети.

Прэджмюннк» методячеекчй пода д дозволяет <-• токовый МАт достаточно просто подучг 'Ь ішфоої.¡¿цко об ач.-.(; „'йч<>* профиле. ся им быть ».’юдьзееаа в дспі-лнєйлс к /;"э известным ¡.¡етодам изучения структуры гіункили ДГ.

Для Сбоях ЕЙРУС0£ У.ОДЄЛТ.. ПреДСТаЗЛЯЛа Г“Ч^;ГР’:ЧЙСКуК: фигуру с гершшой. опреде-гкечіоа ш. йгрализутагалч ¿Ат ГВ136 (вирус типа О) и СЗВЗ (ькрус типа С). По нашим їак-тзл. ;-.тя э;;итокы ;шелл дг-а сайта адсорЗиан. что л,о‘«о-л осі на графике завясиости ,|аоза-:->.&?кт‘*.

По знежему Е’.'ДУ модели вирус03 От и ГОКУТ Ке.-'С -торое сходство. Отличи-э проявятся з рас!тс.ко;*-нкк *зйг-ралкзуктих и вепейтрадят/хзаш эаигоиов. В модели дг 0-нейтражізующке эпигоны находятся на вершине тетраэдра, н в модели ДГ С- они расположены а основании' геометрической модели ск^метрэтно эпитопу С2П4, !і;;торий находится на верішіїе данной фтуры. Различие двух моделей также проявляется з ксдичестгв выявленных эпитопов и з плотности их расположения в пространстве;

<7 псмоеью конкурентного ША ні вирусе я сура 0|. нам*.; было вклзлеко рссемь этатспоз, четыре из которых бши нпйтрадіїзукздш. Из вирусе С г было г.пргделеяо семь о:;;:-топозз, четыре из- которых тага® бали нейтрааі;<гушй!ми. •

' Шйтрзлтзукхдие ЗШГГОПЫ на вирусе О і были ЙДеіІТИч'йіІЛ • Рсеэны путем постановки ИФА с фрагмектаг/, синтетического пептида УР1 гируса 0^ N194.

Так, Мчт ГБЗб реагировало с пептидами 140- 1'Ю 144-160. Эти же пептиды, шниогирсва:пп к с К!,ь. взгдко-

" - 21 - ' ' девств/ ;е,ли с МАт еще, е>дивнее. и г.о характеру'.кривых ’’доза-: ифект” приближались. к .контролю (реакция'Uät со. i4f.S компонентом}. Эти результаты согласуются .с дантми литератуэы о возрастании игй.!ушгеаности пептидов,.' нахо-давдкся г ковалентном соединения с KLH (Uebdinian H. et* ai. ,1930; Piccoae М. et al. , 1988}.' .

Бр^/исследовании реакции' ЫАт ГЕБб (реагировало с,

141-150-KLH) с лептвдсм 200-214-KLH яоло&ительного взан-модййсткт установлено не было-. Возмоааое объяснение этому - отдаленность даьтых областей друг от друга.или несоответствие конформациоыний структуре вируса.

Исходя ив уфвдстазлеюшх результатов Езакмодейстпня с яепгидгш МАт ГБШ, ‘шмнс сд.*лать следуют закладе-ике. На пепгаде 140-160 к кснъэг&тах 140-1G0-KLH,

144-!6i> |(LH еуаесТЕГеТ ТОТ JSS эпитоп, что и ка 14.55 компоненте цел^лого виркона, причем конъвгиропание, пептида с Ш; несколько улучизет коифэр^эдиэнное подобие контролю. На конъюгате 200-214-KLH даяний эпитоп отсутствует. ПрШЖЗЙЯ 20 БШ!ШНК$ перекрызашиеся Облает}! у конъюгатов пептидов 34‘.1~löO-KLH и 14i5-160-KLH, мохно тредпо-.яохятъ, что глагол, определяемой АТ ГВВ5, pacnojossir на участке 1M-16Q. . • , . ■ . ■

- Аналогично Было . установлено соответствие эютода, определяемого МАт 'ГВС5, яепгиду 144*160 "и эгоетона,' определяемого аятзггелом 1SB6, пептиду 14.2-160. Подобные результаты в JiäA, ползгчбийые при взаимодействии МАт -ГВВ5 и. ГБС-5 г поптидоу .140-160 и его . жшгхзгатом • 140-160-KLH,. г^роятяо, говорзт о;то«„ что определяете $тжа \1А? эли-топы яьла*?тся лйьейнаа:, •• в то время как эпитопы, опреде-. meiasz .антителами ЕД4 и 19Б6, - козфэрю:и»иныма.- •.

Дга непе^рализуода ЫАт соотвехетзия агштопов каю-; му-жбо из пептидов, ¿еппльэовашшг в paLote,- ие :гдбж-

Как уже было отмечено, на вируса Oj N564 было выделено семь различных эпитолов, причем четыре из них взаимодействовали с нейтрализующими Ш. Эпитопу определяли tsm «е методом, что и для вируса. 0Т (конкуренция межцу парами МАт), с использованием восьми антител. На основе данных конкурентного МА, -графиков зависимостя "доза-эффект" к активности в PH было установлено, что два МАт (С?.05 и С5СЗ) конкурировали за один сбклй эпитоп на AF С’і N564., Остальные ІЛАт были идантшЬицирозани жвс вэанмо-дсйстауювде с различными эпитопами.

. Таким образом. проведение исследования позволили дать характеристику МАт, раскрывающей возможность тоогл наиболее специфичных антител. «оотзететвутанс каждому иммункзирушиэму сайту. . ,

Изучение зпіітопсв вируса ящура с помошью моноклональных антител показало, что выбранные методич-эс-кий подходи дата ' возможность оценить распожшшкг еп?шфи-ческих сайтов адсорбции на вйрасио и и:< функціонал/»:«»» особенности. Кроме того, лавсли ИД2НТИфЯЦЯР0ВпШІ«Х МА? является уникальным инструментом п могут б:-гь цс:толь:-о ■ вааы при исследовании мутантов .антигенов, а ?акж> ари изучении структурно изменений зириэна в результат« действия на нзго различных Физико-химических факторов.

' - - шюдн

1. Шлучены- штаммы .гибридных клеток, про;:';;,';.’1' ;v -аоноклональные- антитела к зириону вируса яздуои ' г « Oj. N1513 - 76 клонов; 0¡. N564 - -ІЗ клена.

' - 2. Составлена коллекция шнеклечальньк антител к ви-

■ русу. Лсура 0£ N194, OI N151S И С[ N564 о ачгазясегьк

- В ЙФА И РИА ОТ 1: 100.до 1: J00C0G;

- РЕ от 2,0 до 10,0 1о£2;

. - в Р8 индекс защиты согталийд 2,8 - 4,5 1п-

• 3. Отобраны моноклональные антитела, обладающие

вьюЬкой дггаммоспе«ифи«»ской активностью, что позволяем; использовать их в ь составе дчагностичееких наборов о применением КМ. ' , '

. 4. Моноклональные антитела 7Д5, БВ2 и 12В4 дают воз-¡.ожность ренцировать игамыы вируса ящура 0j N194 и

0£ N1518. . ' ,

5. Больоая часть изученных мояошюналъных антител к

подтипам вируса ящура От и Cj относится к подклассу IGgl ' к IG?2a. , ■ . .

6. Идентифицированы эгитопы вириона вируса ящура -

подтипов Oj i; Сj п использованием моноклональных ?нти-thj\ к синтетических пептидов. ' '

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЖНЕШЯ

Ка основании прозеденных исследований были составлены:

- "НТК на h&6jp для определения типов вируса жура

в УЛк на основе голи- к моноклональных антител11; ■

- Паспорта на штаммы гибридных »ультивируемых кле-

ток живоаных nuscuius, испсыьэуемых для получения . моноклональных' антител к вирусу кщ/ра От N1618 и Ст N554. ' ■ - . ' ' . .

- и -

СПИС05С FAEOT, ОПУБЖОВ.» ШУХ

ПО TESrS даХЕРТЩИ

1. Глобенмо Л А. , Давыдова Н.Л , Иванщепков а Ч ,

Еурдов Д. Е , Kapjox'îH С. Р. Клонирование гибридных клотг'Л.

продуцирухщих моко;-:лоь’алькы ; антитзла против зируса згду-ра. - В кн. : Акт. пробд зет. вирулсл. : Тез. докл. научн. кокф. ЕНКЯй. Владимир, 1988 ч. I, 0.15-15.

2. Гдобенчо Л. д.. Да^ь эва ЕЛ., Иваяоденков В, Е ,

Бурдсв А. Е , Хуг;якг>з Г. А. , Молчанова А. И., Яирюхин 1 ?. йаучениэ з иммуташшиче^сих реакциях' активности моноклональных антител против вируса ящура 0^. - В кн. : ?кт.

пробл. вет. вирусол. : Тез. докл. иаучн. конф. ЫШЙ.

Владимир,'19S-8, ч. I, с. 54-55..

3. Синякова О. Е , Глобеико JL А. , Иванюэдэнков Б, Н. , Рыбагаз с. С., Кирюхин С. Р., Молчанова А. И. Изучение моноклональных антител' з радиоиммулном анализе к вирусу ящура О N1618. - В кн. : Акт. проба, вет. вирусол. : Тез. докл. научн. конф. ВНИЯИ. Владимир, 1988, ч. 1, с. 55-56.

4. Глобенко JL А. , Давыдова Е .1, Иванзсщ&нков Б. Н.,

Бурдов А. Е , Худяков Г. А., Молчанова А. Я , Кирюхин С. Р. Опыт выращивания гибридом-продуцентов противоящурных моноклональных антител. - В га.: Акт. . пробл. зет. вирусол.: Тез. докл. научн. кснф. ВНЙЯИ. Владимир, 1988,

ч. II, с. 12-13. • • . •

' 5. Глобенко JL А. , Еиршин С. Р. , Давыдова -Е Л. , Баранов С. Г. Шматкулова JL У. , Иваняхтгиков В. Е , Дудпжов А. И. Сравни?? лькое изучение влияния некотсрах сенсибилизирующих агентов на«образование олухолей. у мышей при -по-лученли'.црогивоящурных моноклональных антител. Б та. : Шт ¿риалы семинара специалистов стран .- членов СЭВ "Разработка и использование новых адъюБантоз для биогехколс-гическиг целей”.. Владимир, 1990. с.-13-1-..

6. Давыдова Н. Л , Аминева С. П.', Глобвйко Л. А., Кирю- • хин О Р. Конкурентний анализ связываний моноклональнш . ангиті-л г; антигенами вируса каура 0^. ■ В кн.: Акт.

пробл. ьег. вирусол.Тез. докл. науч.-теорёт. конф. молодых ученых 2КИЛЙ. Елалгшир, 1990, с. 58-59. '

. . 7. Глобеико Л. А., Давудова Н. Л. . Глрюхин С. Р., Аші- ’ .

нова С. 11 , Иванвдгнков ЕЕ,. Худяков Г. А., Бурдов А. II Изучение оенегаой нейтрализующей детерминанты вируса —■ ящура Опомоиью моноклональные антител. - В кн.: Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине: Тез. докл. ..

Всесошн. научн. -техн. кояр. Е Новгород, 1990, с. 31-32.

8. Гдобенко Л А. , Бурдов А. Н. , йпанющенкоЕ Е Е , Ху-

дяког. Г. Л. , Давыдова Н. Л . Кирюхин С. Р. , Молчанова А. М. , Чепуркин А. В. вігамм гиЗридныя культивируемых клеток жи-вртн&х Млзз іяиаоиіир I. - продуцент моноклональных антител К 1463 компоненту вируса ящура О]; / авт. сеид.

И. 1592145 ОТ 03. 05. 89 г. Л

9. Глобенко .1 Л., Бурдов А. Н. , Иьаншэнков В. К. , Худяков Г. А. , Саарма У. Ц , Дзвыдоьа Е Л . Кирпхин С. Р., Молчанова А. К., Аминева С. її Штамм гибридных культивируем! сс клеток Мизк тизеи] иэ Ь. - продуцент моноклональных антител к 1455 компоненту вируса ящура N564 / Дет. свид. N.1692147 от 08. 06. 89 г. /.

К. А в