Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика кДНК копии гена, кодирующего белок семявыносящей луковицы Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика кДНК копии гена, кодирующего белок семявыносящей луковицы Drosophila melanogaster"

АКАДЕМИЯ .НАУК ЬХхШ

ИШШУТ РИОЛОГИИ РАЗНИГИЯ им. Н И ШлЧЬЦиЬА

На нравах рукописи УДК Б7в: !;.У'Л \?>

ДОЛОЙ Христем Minw.ii

1ШУЧКШЕ И ХАРАКШ'ЙСГИКА кДОК (и'НИИ Ш1Л , кодитшч) БЕЛОК Сё.ШШХЩЕЙ ЛУКОЕИЩ1 1Ш«Р1П!.Л »Ь1.мт-5ТЕК

03.00.16 - сенег им

. Д»к:се.ртаиин на соискание ушн^й ет-иени кандидата биологических наук В форме научного дослана

Ц.гкьа

РаГюта типична в .Наборе, гории молекулярной биологии развития Института биологии извит ил им. Я. И. Кольцова Г ЛИ, г. .

Научные руководители:

член-кореспснденг РАН,

доктор биологически* нлук П И. Нпрьчюш

кандидат биологически* наук М. 3. Людвиг

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А. И. Иванов кандидат биологических наук 0. И. Городецкий

Ведущее учреждение:

Наг^елра генетики и селекции Московского Государственного Университета имени М. R .Ломоносова

Зашито состоится "22" апреля 16921'. в____часов.

но заседании специализированного совета П 00?. при Институте биологии рапгигия РАН по адресу: 117 308 . MvKpa. ул. Варилова, ГГ. .

С диссертаций можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития .

Автореферат разослан " 2! " марта 199Яг.

Уч°ннЯ секретарь специализированного сорита ,

кандидат биологических наук F.. М. Г|;">Т'>попоьч

актуальность проблеш. в основе индивидуального развития организма лежит дифференциальная активность генов , сопровождающаяся, в частности, синтезом тканеспециФических белков . Ввиду уникальной генетической изученности дрозофилы, этот организм широко используется в качестве объекта при разработке экспериментальных моделей для изучения молекулярно-генетических механизмов тканеспецифической экспрессии. Наиболее подробно изученими в этом плане явлются ген-белковые систему хориона, слюнных .ъелез и гемолимфы. Удобной экспериментальной моделью для изучения клеточной дифференцировки и тканеспецифической экспрессии генов является семявыносяшдя луковица (сл) самцов дрозофил , что отра.глно в работах Л И. Корочкина и соавторов. Белки половой системы самцов дрозофил занимают особое место среди модельных систем дли анализа дифференциальной экслресии генов. Это связано с тем, что, во-первых, внутренние гениталии представлены тремя основными отделами (парагониями, передним ссмлвыпослщим протоком и "•млриносящсй луковицей) , которые образуются из общего зачатка, но че'тко различаются по ультраструктуре слагающих их эпителиальных клеток, и специализированы для синтеза большого количества глико-протецдного секрета . Во-вторых , секреторные белки репродуктивных органов обладают необычайно высокой генетической изменчивостью и межвидовыми различиями. В-третьих, участвуя в репродуктивных процессах и обладая видоспецифическими свойствами, эти белки могут обеспечивать посткопулятиЕную репродуктивную изоляцию между видами дрозофил . Все это обусловливает интерес к сравнительно-видовому анализу белков репродуктивной системы . Кроме того, поскольку Филогенетические отношения видов группы те1апоиаа1ег детально исследованы, а геном вида 0. П1elalю^;asteг подробно охарактеризован на молекулярном уровне , эти виды представляют собой уникальную модель для сравнительного молекулярно генетического анализа и для анализа эволюционных изменений генома в группе те1аиоцзз1ег . Задачи НаСТОНШрЮ ИССЛеДОИсШИН Щ<ОД111ЛЧЛ1ШШ ЛОГИКОЙ ООЛсе Н,-.МНОГО

описания данной экспериментальной системы.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАВОШ В данном исследовании проведен анализ белков одного из отделов гешпалиев , сьшьинотщлй .аукоиши , у представителей различных таксонов рода Вт.с.ор1и1л и, в частности, группы лЫаподан! ег с целью поиска ген белковых систем, способных

сдужить маркерами изшнений онтогенетических программ дифференщ роики IOIPTOK, возникших в «оде органо-, ткано-, и/или видообрг еовапия. Для достижения этой цели били поставлены следующие вадг

Uli:

1. Ноиак специфических белков п СЛ самцов I). melonogaater

2. Конструирование 1сЛ1й1 -бибилиоте!Ш самцов D. melanogaster поиск и выделение кДШ-копий генов органо-специфических белков.

3. Характеристика транскрипции гена органо-специфического ' белка ОЛ РЕРпЫ) и его срапнительное изучение (n vivo.

4. Определение нерьичной последовательности кДНК-копиЙ Гена бел!и PEBme 11 для компьютерного сравителыгаго анализа гена (тран скрипта) и его белкового продукта и для использовании этой кДНН последовательности при будущем изучени геномного гена и его регу ля ции.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Кроме ранее описанного РЕВше , впервые иммуно-химически были обнаружены ев*? два белка , специфических для СЛ самца D. melanogaster -PEBme 11 (hPEBme 11 - парная фракция юл. весом в области 40 кДа и 1PEBme11 - три Парные фракций мол. весом в области 10-15 кДа ) и PEBmelll (мол. вес в области 10-15 кДа) , что согласуется с результатами Успенского И. Г. (1990), описавшего белки, присутствующие в разных органов половой системы самца . Из приготовленной кДШ-библиотеки самЦов D. melanogaster были отобраны в результате скрининга 42 самец-специфических клона, из которых 2 группы(5 клонов) кодируют продукты, специфические для СЛ Показано, что одна группа клонов (No 18, 19 и 39) кодирует белок , иммунохими-чески соответствующий белку PEBmeИ.Даиа характеристика транскрипции in vivo гена белка PEBmeII. Определена первичная стуктура кДШ-копии гена белка РЕВпю II и проведен компютерный сравнительный анализ , который показал с одной стороны наличие большой внутренней гомологии в кодирующей и в "антшсодируиаей" (по отношении PEBmeI I-гена) цепи, а с другой стороны - гомологии между кодирующей цепью гена PEBmelI и гена Drosophila. FMRFaMHfl-родственного белка (экзон 2) и между "антикодирупцей" цепью и 3'-областью транспозабильного элемента Fl4, принадлежащего к семейству F транспозабильных элементов дрозофила

ПРАК'ГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Почти все использованные ь работе методы - авторские модификации , имеющие часто значительное преимущества перед стандартнши процедурами , что позволяет их использование в учебно-методической и научно-исследовательский деятельности. Отработана модифицированная процедура нерадиоактивного мечения с использовании uigoxlgenin-ll-dlJTT и гибридизация на нитроцеллшезе и in situ гибридизация на гистологических срезах и тотальных органах, которая может бить нонользавана во всех лабораториях, так как имеет ряд преимуществ: чувствительность как радиоактивного мечения (детекция до 0,1 пг. ДНК-мишени), отсутствие радиоактивности , низкая концентрация зонда в гидриди-зационной смеси (30-100пг./мл.) и быстрота выполнения. Впервые в мировой практике решена проблема приклеивания препаратов для микроскопии на предметных стеклах - авторская методика обеспечивает самое быстрое наклеивание (5-10 секунд), выполннение при комнатной температуре и свыле 95Х надежности ьеотклеивания при последующих обработках. Эта методшса мо,«эт быть использована при всех микроекопских. гистохимических и гибридиэациошшх экспериментах в разных лабораториях.

Приготовленная кДНК- библиотека и отскринщювание самец-специфические клоны могут быть использованы при поисках специфи-ческх генов самцов D. melancgastcr . Полученные кДНК-тлпш гена белка PEBmell даст возможность выделения геномного гена и исследование его структура и регуляции . а также выделения поли-А-РНК для изучения транскрипции и трансляции гена.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Научные результаты работы докладывались на: 6-ом Всесоюзном совещании по проблемам биологии и генетики дрозофилы (Одесса, 1989), 7-ом Всесоюзном симпозиуме "Шлекуляр-ные механизмы генетических процессов" (МоокЕа. 1990). l-oft Всесоюзной коифе|)е1ши>1 по генетике насекомых (Москва, 1901).

ПУНЛИКАЦИИ. Материалы диссертации (Лраллни в 9 печатных ра ботах .

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертация состоит из введения описания материалов и методов исследования , результатов и их оС суждения, ьиволов и список.опубликованных работ. Работа изложен на я? страницах машинописного текста, величая 11 рисунков .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

В процессе клеточной дифференцировки во всех организмах происходит морфологическая и функциональная специализация клеток и это находит отражение в синтезе тканеспециффических белков. Изучэние регуляции синтеза этих белков в ходе развития могло бы дать преставление о механизмах клэточной дифференцировки. Чрезвычайно удобно исследовать эти процессы у дрозофилы . Кроме того , посколько филогенетические отношения видов группы melanogaster детально исследованы , а геном вида D. melanogaster подробно охарактеризован на молекулярном уровне , эти виды представляют собой уникальную модель для сравнительного молекулярно-генети-ческого анализа эволюционных изменений генома в трупе melanogaster.

Внутренние гениталии самца очень удобные среди модельных систем для сочетания генетического и биохимического подходов в анализе механизмов регуляции и дифференциальной активности генов так как морфология и биохимический состав отделов половой системы самца различаются у разных видов Drosophlla (Chen et al. ,1985). Можно предполагать, что определенные биохимические процессы, связанные с размножением, являются видо-специфическими Ген-белковые системы . функционирующие в репродуктивных органах , могут, таким образом, служить обгектом для изучения факто ров стабильности онтогенеза в пределах вида и изменчивости онтогенетических программ в процессе эволшшонной дивергенции.

Хорошо изученной системой , подходящей для такого рода исследований, является СЛ самца дрозофилы . Этот секреторный орган

поставляет ряд белковых .Компонентой спермы , в числе которых у Drosoptula обнаружены органоспенифические протеиды: зстьраза S (Koroclikin, 1974) и превалирующий подинентид секрета СЛ - белок РЕВ (protein of ejacuiatory bulb) (Людвиг и еоавт., 1G84), для которых было показано , что они входят в состав гетерогенных белково липидних комплексов , образуыплх секрет СЛ ( Людвиг и соавт. , 1085), а Ениколоповым и соавторами (Yenikolnpov et al. ,1983) , был выделен ДНК-фрагыент, кодирующий белок , гомоло-гичний эстеразам - локализация гена на хромосомах I). yirjlis показала, что он расположен в области 2G5 , где ранее бцл картирован ген эстерази-S (Корочкин, 1982). калорный органоспепнфическлй белок СЛ РЕВте описан также у Drosopln la nelanogaater ( Успенский И соапт. , 1ЯР8) . Дальнейшее изучение генита.гиЯ I). melano^nstfi- с точки зрения проблемы выявлении механизмов , учасгвунщлх н iui«-точной и органной дифференцировки, вызывает необходимость н более летальном исследовании специфических ген белковых иИ'.-ь-н О.Ч

UATKPI1AJ0J И ЫКГОДи

Аутбредные линии Гл osopln 1а, использованные в наших исследованиях были люоезно предоставлены В. 1\ Митрофановы*, 1L b. Оидо(ю вой UIW, Москва), U В. Еьгеньевим ( ИМБ, Москва), 0. Сер да (Иона чин), li Лшернеры* < Великобритания), Д. Эснидьм.'ером (Испания) и Национальным центром разведения дрозофилы (Боулинг-Грин, США). В ннстояпрй раооте использованы еледулище виды и линии дрозофилы: Виды Dtosophila группы virills аутбредные, дикого типф . D. 1 utiáitei, (). nontana. Drosoplula imlanogaster - линия üregon RCJ, аутбредная, дикий тин. Линии видов Diosophila группы melanogastei, аутбредные, дикий тип: |). rrniiritiana, D. sinulans, П. yal.tiba, П. I eissiei i, 0. erecta, р. orena, J). ananassa-*. Линии видов Hi csoptii la группы obscura, аутбредные, дикий тин: И. t 'iüiuloobscinъ, Lt azteca Линии видов btoeouhila подгруппы mullen, аутпредные, дикий тип: D peninsular 1Я, П. di rriiirii^is, D. по jfiveoais, 11. inai Innsis, l)i oscphi la liyile i, l)i оч.рЫ I а нчшргйч-; II. fiiiic-l i ií, ¡t. giim ;ií/i - аутбредные линии, дикий mu.

- б -

Для разведения была использована стандартная питательная среда, юлеряашая агар. Кукурузную крупу, дрожли и патоку.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ МИКРОСКОПИИ

Гистоло1 Нческие срезы D. melanoKaster для гибридизации in situ были приготовлены следующим образом: Фиксировали материал в 100% этаноле при -76°С в течение 24 часа Затем проводили последовательно в: 100% спирт (50 мин.), 100% спирт (30 мин), 100% спирт» хлороформ - 2:1 (30 мин) , 100% спирт »хлороформ - 1:1 (30 мин.), хлороформ (30 мин.) , хлороформщарафнн - 1:1 (30 мин.) , параФин 1 (40 мнк.). парафин 2 (ПО мин.). Для ускорения пропитывания использовали интенсивное качание. Заливали в парафин/12% воск и залитые блоки оставляли в воде 24 часа. Срезы приготовляли толщиной по 20 мкм на ротационном микротоме при 25°С и наклеивали на стекла обработанные bind-si lane (Si lane Л 174; l.KB: 1850-251 ; Sweden) и белок- глицерином - ллл расплавления срезы наносили на каплю волы и стекла со срезами помешали на 56° О, после чего высушивали ночью в термостате на 37°С или 2 часа пол моншнм вентилятором . Для удалении парафина стекла помешали на 15 мин в термостат на 56°С (расплавление) и сразу п°реносили в: ксилол 1 (б мин.) , ксилол 2 (5 мин.), ксилолюпирт 1:1 (3 мин.), спирт 100% 1 (б мин), спирт 100% 2 (5 мин.). После высыхания спирта срезы быстро покрывали слоем bind si lane и подсушивали.

Препараты из тотальных органов были приготовлены, следующим образом: Органы выделяли в F'BS и переносили на стекло, обработанное bind stlane, высушивали вентилятором, покрывали снова bind si lane и высутпвапи. flvKCiipoBarttt в 100% этаноле при -70°С за 2-12 ч. FasMopawmanii и высушивали . Препараты готовы для иредгибридизации , хранили при 4° 0 в гилрг"*юбной бумаге или в сухой камере.

МИКРОБИОЛОГИ'К'ЖИЕ МЕТОДЫ.

Компетентна клетки F. col i JM 103 были приготовлены по еле-душней процедуре: Инокулирс-рапи отдельной колонией 5 мл. среды LB. Выращивали на качалке при 37° с в т»ч»нии ночи. Отбирали

0,5мл ночной культуры и переносили в 100ыл среди SOB, содержащей ЮмМ bfeCl. Микробную культуру инкубировали на качалке при интенсивной аэрации до ОДаоо - 0,2-0,3. Охлаждали бактериальную культуру на льду. Осаждали клетки центрифугированием на центрифуге К-23 при 4000 об/ мин., 0°С, в течение 10-15 мин. Добавляли 50 мл. охлажденного стерильного раствора, содержащего 50 мЫ СаС1. и 10 мМ трис-HCl pH 7,5. СусиендироЕали клетки и выдерживали во льду 10-15 мин . Центрифугировали 15 мин на центрифуге К123 при 4000 об/мин, оРс . Удаляли супернатант и суспендировали клетки в 6 мл. того же раствора.

Компетентные клетки Е. coli Kl2 У 1090 iisd R были приготовлены по следующей методике: В 50 мл. LB--среди с ампицилином ( 50 мкг./мл.) и 0,4% мальтозой вносили 1 мл. клеток из ночьной бактериальной культуре и инкубировали при 37° С до Пооо »0,5 (2,5.10. клеток/мл.) . Центрифугировали Ю мин. ¡ipn 4000 об./мин. и ресуспендировали в 15 мл. охлажденном во льду 10мУ МогЗОч (до Deoo = 2). Сохраняли при 4° С до 3 недель.

Трансформация клеток Е. coli плагмидной (и RF М 13-) ДНК била проведена в стерильных стеклянных или пластиковых пробирках , при этом тщательно следили за соблюдением температурных условий. 200 шел. клеточной суспенсии из несколько колоний в буфере ТсВ (БОмЫ CaCl; 50iiiM Ii is-llCl pll=7,6) инкубировали 10 мин. при 0°С и затем добавляли 10-200 нг. ДНК в обеме меньше 20 мкл . Выдергивали смесь на льду в течении 10 мин . Бистро переносили пробирки в воденой термостат при 4'f С, выдерживали там 1,5 мин. и помещали на 2 мин. в лед. Добавляли 1 мл. среды I.B и выдерживали в течение 1 часа при 37° С без качания. Высевали на чашки с 1В ага ром с антибиотиком и инкубировали при 37°С .

Упаковка молекул лямбда gt. II ДНК была выполнена набором для упаковок "Унипак 1" ПШКО "Диагностикум" Москва) но протоколу.

НЕ\ОЦН АНАЛИЗА ШИУЖ

Электрофоре! и чес кий аншшг белкс-в ь дснатурирутам условиях был пронеиен по методу Лиммии (laenanli lü?0) с модификациями . Еуфер для рааиы1-ч1ия и наиео.-иия (образцов содержал 5% JH'il и 5/, меркапточ!анолн, остальные условия были выполнены согласно с.ри

гинашюй методике: Электрофорез проводили в геле, где соотношение сополимеров акриламила и метиленбисакриламида составляло 30:0,8 . В разных случаях непользовали концентрацию акриламила в геле от 7,52 до 122 . Толщина геля составляла обычно 0,8 мм, длина концентрирующего геля - 2 см, разделяющего - 15 см . Концентрация буфера в разделяющем геле была увеличена в 2 раза по сравнению с оригинальной методикой и составляла 0,75 M трие-НС1 pH 0,9. Иногда для улучшения разделения в разделяющий гель добавляли мочевину в концентрации 7,5 - 8 M В этом случае концентрация ЛСН в геле и в электродном буфере составляла 0,22. НеспециФическую окраску на белок Coomassie R-250 проводили по С Vesterber g 1971). Для определения молекулярных масс белков их подвижность сравнивали с подвижностью маркерных белков. Для приготовления образцов индивидуальные органы имаго Drosophi1а и це-лнх особей гомогенизировали в буфере для нанесения образцов, а затем поме вили пробы на 5 мин на кипящую водяную баню. В ряде случаев лля улучшения результатов разделения применяли предварительное обезжиривание органов з смеси хлороформ: метанол (2:1). Перед нанесением образцы пек рифугировали 10 мин. 10 ООО об./мин. Для приготовление образцов для электрофореза белков СЛ D. melanogaster органы препарировали под бинокулярным микроскопом. На одном блоте наносили материал 2-5 СЛ В ходе работы было установлено, что результаты разделения сильно зависели от условий приготовления препаратов и/или использования разных экстрагирующих растворов . Использовали следующие условия: 1. гомогенизация в буфере нанесения (D - 0.0625М трис-HCl pH 6,7; 10% глицерин ; 0,012 бромфеноловый синий), 2. гомогенизация в буфере D с 0,52 Тритона Х-100, 5. гомогенизация в буфере D с 12 дезок-сихолата натрия . Препараты перед нанесением центрифугировали 10 мин при 10000об/мин.

Гибридные белки рекомбинантных клонов были выделены методом Carol1, Logon, 1089 и Rio et al. ,1986 с модификациями: В 1 мл среды LB с ампициллином в концентрации 50 miît/мл инокулировали материал из одной лизогеной колонии и перемешивали интенсивным встряхиванием. Бчктериальую культуру инкубировали при 37°С с интенсивной аэрацией и. когда Dono становилась равным 0,4-0,6, отбирали 1 мл в другуш нроПцрку . к этой части культуры добавляли

- у -

ШТГ до концентрации 1 Mil . Обе пробы инкубировали еще 2 часа . Клетки из обоих частей культуры (индуцированной и контрольной) осаздали центрифугированием на центрифуге Eppendoi Г в Течение & мин. Супернатант сливали,а клетки суспендировали в 100 мкл. дистиллированной воды . К суспензии быстро добавляли LOO шел буфера образца для электрофореза белков (5 ЯДСН; 5% бета-меркаптоэта-нол; 0,062М трис-1101 рН 6,8; 10% глицерин; 0,1% бромфеноловий синий) и инкубировали 2 5 мин. ¡¡а кипящей г.одной бане . Анализ белков проводили методом электрофореза в 7,5?. ПААГ с ЛОЛ (La-iiiínli 1970) .

Во ьсех случаях иммунизация была проведена по схеме Дорфма-на (1967) - ибычни использовали антисыьорстки 3-го - 4-го циклов иммунизации. Антнсыворотка к суммарным антигенам ОЛ D. rnelaoo'¿.v,-ter была л1ибсзно предоставлена И Р. Людвигом.

Получение а<}фпнно-очищенных полиг.лональных ашигел пыло проведено но стандартной методике (Gireid el al., J085j о набольшими модификациями. После иЛеКТ{.0'|юреГИЧеСКОГО раЗДеЛеНИЯ белков Е. col i -A¿t11 рекомб. в Д» *li-' ÍL-ЧЛГ и и.-к-ктг>"'11е1'ёНоса на нит-роцеллкиьау ИХ СКраШИВс.ЛИ О, IX рас'ТГОрОМ Понсо-0 в 1% уксусной кислоте . После ОТМЫВКИ ВОДОЙ ВЫреЗаЛИ Ghp.tlix-HHyiü ПОЛОСУ , СООР-ветствунцую гибридному белку. Вырезанные 2- 4 гюЗюски, измельченные на куски размером ЗхС-мм, инкуг,провали с иммунной СЫВирОТКиЙ анти-ОЛ (1: L'úü) в течение 1,5 ч. ;игмыьку or несвязавшихся антител вели так Ае, КлК пр.п иммунном окрашивании б пота . 0|1еШ1фП Чески СВЯЗ.И'й'ИОСЯ ЛНИПеЛН СМ11ВЛЛИ oy«t*rрон 5 ill' гдшшн-HCl рН 2,а . При Необходимости После Централизации pacTBOpa ¿HTllleJla осаадали по лунасыщ-'нным раствором сульфита аммоиня с добавлением 0,25/1 6ЫЧ1 ей СЫВОриТКИ . ОСеССПЛИЬаНИе p.iCTBi.'pa аНТИ'1'еЛ После осаждения ЦеНГрИ^'УГИроВаИИеМ И paC'TBi (рения в PBS проводили на колонке с t.V-фадекс (j 25 .

К|»«уноэлект|»^ол(лтш!Г белков бил осуществлен , как описало ГоуОИНЫМ И |Ч'РЛ1.-Ш<!( ( l'GWtui!, 60|Ч|0|. i£lti4). ЯйеКТрОПереМоЛ белков На 11чЛИаКр||Л:1!'||Д1п.| I 1 eJbi II. t llil 11i|l> ЛЛЬ'х'К ■ гМУЬ> м-йбрану проводи пи в грис I ЛИНИИ.-l ull П- | , m.jifp/f.iii^-M : Oí отанола И ОД; И l|'Li Нр<.Д|.| l-.p.lill HlU II'.-1. Ii'.llll I il'i'-' 'I.I ! >' CBii. i 41 -ililbl aHTHie.il OJH iT ИН

куоир -i- i hi • 1 ч ii ; iii i-iu-.'P .1|.ч i -1 ■ j 111 ¡ -' i о p..i iii,io cr.-in rp. • при I'lí |' Им.!!) lili!. . и»- .pul I'll p ¡¡-l:..Jtl1Hll ь !:ilO l'"> I'-iH I !••;. 'II

держащим 10% сыворотки крупного рогатого скота и 0,05% Твин-20, инкубацию проводили в течение 4 часов при 20РС. Отмывку блота от несвязавшихся антител осуществляли последовательно растворами РВЗ-Т: 0.6 М ИаС1' 0,02 М трис-НС! рН-В,9;РВБ-Т. Отмывку каждым раствором повторяли 3 раза по 5 10 мин. на качалке. Дли выявления связывания кроличьих антител испольаовапи аффинно очищенные козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, коньюгированиые с пе-роксидазой хрена (Ш1К "ЕиоС"), разведенные в 1000 раз; время инкубации - 2 часа при ?.0"С . Дня визуализации п»роксилазной активности использовали реакцию с 1-хлорончфтплои или дпампио-?ензндином в кач°стве субстратов (Наикр? »>1 а!. 19^?).

МЕТОДЫ ДЛЯ РАБОТЫ О ГНК

ГНК из Drosopbila nvlanogaster получали по следующему метолу: Мух гомогенизировали в жидком азоте пестиком в ступке. Переносили в ручном гомогенизаторе о 15мл. 4M гуани&инизотиоциана-том. гомогенизировали на ледяной бане/15 тракний/. добавляли 15мп. кислого эабуфорироьанног > Фонола (6(Г С!) / 5 тракций / и 15мл. буфера (0.1М СНзНООНа рН-4.0 ; ЮмМ Tr iivlii.'l pll-7,4; 1мМ ЕОГА) /5 тракций/ , или переносили и гомогенизировали в 15:15 мл. холодном , насыщенном водой, кислом Феноле/лиэируип^м буфере (0,ЗМ ацетат ншрил pH- 5.5; lOir.M ГОТА; 0.8% SPS; 0,1% Р1ТГЛ. Добавляли 15мл. ненасыщенного хлоро>1прма , стл'пно , но хороню п0р°мен!ивали и центрифугировали ?.0 минут при П СР<) об. /мин. Родную фалу экстрагировали однократно ф?нол-'хлорп:1ормом и "-кратно хлороформом ; ратем к Н"й добавляли равный обем 1-пропанол/ 1,5мл./ . Оставляли на |ючь при -РОТ. Осаждали центрифугированием 20 мин. при 5 СЯО об./мин. г»:ад-Mi растворили в 1 мл лист. волн. 2 раза п°р°г>сажлали О. Т'М pii-5,0 / i пропчнпл,

1 раз - о.ЯМ ац°тата натрия/ 100% --татла и •. »оммнапи 70% этанолом . Осадок KHK pa,,TP"i'!,nii в диет. p'W. изхо;ы из нредпаригел-ннх данных что из 1с мух н-'.чучапи при^пиаит^лып I"« IHK , и хранили при -?0(-7г>)°С .

РНК ПЛ бнча тлуч^нч m с.п*луткй нр-чг лур^: К r-rvn ''Л добавляли P.fim.i. лидируют«-1 >> (4Пр.м Тм- 1!'"1 рН-''.4: lOnil RH Г А; О.ГЛ -.П';: п. И t>i "fi--- Г: i'i" 'Г'"' V ир'ч'-цчщо Гч г; и

для самонереваривания) и инкубировали 45 минут при 25° С и Юмин. при 37°С. Экстрагировали кислым фенол/хлороформом и интенсивно перемешивали. Осалд&ди 0,3 м ацетата натрия/2,Г обьема этанола в присуствии 50мкг. т РНК-носителя. Переосаждали 2-кратно, промывали "0Z этанолом и растворяли в диет, воде, обработанной DEPO-см.

Поли-А обогащенная РНК была получена, пропусканием выделенной ДНК через колонку с олиго-дТ-целлюлезой 2-кратно и затем пе-реосадцанием 2-кратно 0,ЗМ ацетатам натрия/ этанолом (2 обьема)

Электрофорез РНК проводили в 1,2% агарозе в 2,2 М формаль-дегнде/25мМ фосфате натрия рН-7,0 - 16 часов при 0,8V/em в 25мМ фосфатном буфере рН»7,0. Пробы растворяли в: 2Си.Ч фосфите натрия; 50% формамид; 2,2мМ формальдегид ; 0,41 оромфенолоЕО синий и прогревали 15 минут при 55°С. Окрашивали после переноса на нитроцелюллезу (без щелочьной денатурации) в 0,04% метиленовим синем в 0,5М ацетате натрия. Качество полн-А+ - FHK оцениьали, проверяя на электрофорезе качество поли-А- - РНК после колонки .

МЕТОДЦ ДЛЯ РА )ТЫ С ДНК

ДНК бактериофага лямбда gtll была получена но методу: В 1л. 2хУТ-средой с антибиотиком добавляли БО мкл. из ночника Е. coli К12 Y1090 lisdR и одне фаговую бляшку диаметром 1 мм . Инкубировали одну ночь (14 ч.) при 37°С. Определяли тйтр фага . Центрифугировали 15 минут при 3 ООО об. 'мин. К сунернатанту добавляли РНК-азу и ДНК-азу до 1 мкг. /мл. Инкубировали 1 час при 25оС (или 1 ночь при О С) . Добавляли ПЭГ 6 ООО до 10% и llaCl до 1Ы. Держали 1 час <до 1 ночь) при 0йС. Центрифугировали 20 минут при 3 ООО об. /мин. Хорошо удаляли остаток жидкости . Осадок растворяли в 5-10 мл. ТЕбуфер + 20тМ Ь^'.ЗОч (MgCl). Экстрагировали равным объемом хлороформа'j- амиловый спирт-24:1 до полного от-суствия осадка в интерфааы (около 2 рлз) . Добавляли ЭДТА до 2üniM и экстраги[ювали равным объемом фенол/хлороформ до полного, отсуствия осадка , а затем еще 2 раза хлороформом. J1HK оса.кдали добавлением ацетата натрия до 0,Н! и равного обч-ема i-нропанола.

Для анализа рекомбинантннх клонов лямбда gtll, рокомпин. ДНК была пил>чена по протоколу "АшеггЬат" о модификациями: К 4 20 мл. фигового лизата вобивлили р.чрнмй оСем "ОХ ГШ РООС»: '¿).\ NaiM в SM 6yi[epe н инкуЛировнли I чао при 0Ü«\ очл^ачп (Г'О

мин. при 4000об/ мин. /, растворяли в 750 мкл. SM, добавляли 750 мкл. DEAE 52 целюллозы в SM и инвертировали 30 мин. Центрифугировали, к 1 мл. супериатанта добавляли лротеинаэу К и SDS соответственно до 2,5 мкг. /мл. и 0,42%, перемешивали 5 мин. и добавляли 173мкл. ЗМ ацетата калия. Прогревали 20 мин. при 88°С, охлаждали при 0°С 10 минут, центрифугировали и ДНК из супериатанта осаждали этанолом .

ДНК бактериофага М 13 была получена по методу Лезина (нео-публ. ,1991) : В 10-100ml богатой среде добавляли ночная культура Е.coll К12 JMl03, разводя ее 100 раз, и 1 фаговая плака М 13, диаметром lim Выращивали 6 часов при 37°С. В 100ml богатой среды добавляли 1ml от этой суспензии и 1ml ночной культуры Е. coll К12 J Ml 03. Выращивали 8 часов. Центрифугировали стерильно 1-5 минут при 4 ООО об./мин. , супернатант переносили в новую (или в первоначальную) стерильную колбу, петлей вносили клетки из полученного осадка и выращивали до стационарной фазы. Центрифугировали 15 минут при 4 ООО об. /мин. Можно повторить еще раз этап наращивания биомассы (количества фаговой ДНК), Осажденные клетки лизировали для получения RF ДНК по методам получения плазмидной ДНК, а к супернатанту добавляли PEG 6 ООО и NaCl для получения одноцепочечной ДНК пс стандартным процедурам - осаждали фаговых частиц 0,25 объема 3,5М ацетата аммония/20% PEG 6000 (30 мин. ;0Г'С), осадок растворяли в ТЕ , экстрагировали 1 раз фенолом и 2 раза хлороформом, осаждали этанолом и растворяли в ТЕ. По этой процедуре получали очень большой выход Фаговой ДНК из очень маленького обема средой.

Ориентация вставок рекомбиантных фагов М 13 пр8 была определена по методу Гарднера (Gardner et al. ,1981): В пробы с 20 мкл. дистиллир. воды вносили попарно по 0,5 мкг. одноиегочечной ре-комбинантной ДНК во всех возможных комбинациях (в контрольной пробирке - только ДНК одного рекомбинанта) . Вносили по 2 мгл. 2% SDS, инкубировали 5 минут при 65°С, добавляли по 2 мкл. 0.5М МаС1 и инкубировали еще 1 час при С5°С . После добавления по 5 мкл. гельсодержашлй буфер, сепарировали на электро(}о[>°з° е 0,7% агарозе - комплементарные цепи образуют более мелл°нные 8-подоб-чых структур.

Реакции расщепления ДНК рестршггазами Pstl. Bamiil и Hindi П

бшш провеждени ь буфера ЫЬО (ЮпМ трис-НОЧ р!Р-7; 5/50пИ N301/101111 14>С1. /5г<тМ р-мер|- и)тоэта;юл/2мМ спермидтп . На 1 мкг ДНК добавляли 5-10ед рестрикта.ш. реакции рестрикции ДНК в* л и при 37°О в течение 1 ••£ часов . Пшюту рестрикции контролировали электрофоретическн . Донорпие Фрагменты и векторы перед лигиро-ванием очинили электрофорезом ь агаров« (0,5 - 1,5%, бу;)».-р ТАЕ) в прнсуствнн бромистого зтидий. Н качесгее маркера длин <lf.ii центов ДНК использовали продукты {¡«единения ДНИ фа[а . реотрикга-аамн НшсИП и ЕооК|, а так«.- ДНК расщепленную рестр;ж-

тааой К^с! . Яону , ссдержаяуы нужнь.й ».:ент Д1!!(, определили в ультрафиолете с длиной волны 304 н. и. и нире;.'^!! ь минг.мал! ном объеме агаро-ьы. йрагменты ДНК полу ц-иш к; рюикнроьанием в ди ализном мешке или ь "бутербродик..-" : "Ч'а^Птои 31.И"/диалиаНп^ мембрана с последующей 3-кратной элвдшг-и буфером 1'Е в мпиропент-рифуге. Д15К очищали циализой 12-24 часов против .

Линеалиэованная векторная ДНК бич-! дефосфорилиропана ь буфере С1Р (0,5М Тмь-НС1 рН-9,0; Юг.М 1Д;С1 ; 1иМ 71,01 ; ЮпМ сиермидин) палочной фосфатазой (0,015 И/1 рпо! ДНК кипишь) после инкуцбации 1- 2 часа при 37°0, и после прогревании 10 мим. при 68°С , 1 рой экстракции фенол/ хлороформом и 2 раза хлирчфирмом и осаждения этанолом, растворена в 1СмМ Тг1з-П<-1 рН-8,0 .

При составлении смеси для лшироьанн* , в пробирку ь иоьеме 5 мкл. било внесено: 50-400 нг. раствора Дсфиорфнвнрованной векторной ДНК, 4-кратный молярный и;-П)тск долорноги фцагчентз , 10-ти кратный буфер для лигирования (О,£!:.),( трис-НГЧ рН 7,4' 50мМ МгС1./ 50тМ дитиотрейтол/ЮмМ ДНО и 101) Д1Ш лш азы фага Т-1/1 тег. векторной ДНК . Затем пробы переносили на полную оаню (12-15°С), инкубировали 12 24 час« л реакцию истанагшиваии добавлением ЕОТА рН-8,0 до ЮтМ. 1!е{-еД трансферм 1Цн- ¡1 пробы инкубировали 10мин при 65оС для инак-гкишии лигами, а ант>м олбгем доводили деионивованной водой до 2и0 mic.ii.

Зонд для 1юзер- и Риуаерн - гибридизации г.ыл нриют"в.чен достраиванием концов рестршчи*'Ванной вставки Фрагментом "Ю^нола" ДИК-пол. 1 в присутствии Р-к.еченного <*1Ш-> в буФ-т* с добавлением 2 311 ф»'рМеНГ ''1 мкг. ДНК КЧ':«-!'»!

оонц д.1Я НерН,ПМ0.1кт1и'н(.й пюрнли: нии) |1| и| • •н-ык.-н ьюч»ч«>.

нием в Ц.-11И ДНК .)ц{0Х1Ке|.1П 11 <ШП- • ан-тч Н И'.- , ■ ш-м лис-

траиванил второй цени рекомбинантн-М'О f}-ira M 13 пр 8 с "прямим" примером при помпе» фрагмента "Кленова" ДШ'лоя.-I . Затем вставку выиепляли при помощи рестрпктагы EccR ! или рестриктаза-ми Smal и Exe i /у^нас г c:i:V;' рестрикции liar I /.

Sparменты ГШК были выделены сепарированием в 0,6-1,5% ага-роэе, перенесены н-. "бутербродике": "Vhat.man" ЗММ/диали&ная мембрана и алюированн 3 раза 50 мкл. ТЕ-буфером в 1 мл-вую пробирку "Eppendci f" че ре о 200 мклоьой каконечшк - центрифугированием 10 секунд при 3 5 ООО об. /мин.; хранили при -20°С.

иммуН'.хжришш;'.

Иммуноскрининг лямбда i:t 11 i-екомбинантных клонов был выполнен по следующему метолу: К 150-200 мкл. компетентных клеток (Г)ссю-2) добавляли по 100 мкл. Фаговых частиц (при первичном скрининге - по около 20 ООО ; при вторичном и т.д. - по 1-2000; при последнем - по 50- 200 ф. ч.), инкубировали 15 млн. при 42° С, добавляли Змл. верхнего (0,7?-) агара в l.B-среде с температурой 47-50 С и быстро залипали на ннжном (1,2%) нтлом агаре в L.B. Инку'нпювали Яч. при <12°С. Сразу после появлении бляшек бистро накладывали сухие нит|к)!рлкглезт'е фильтры , заранее пропитанные Шм.Ч IPTQ и нронум"рованы, б"? образования пузырей. Продолжали инкубации) еще 3 часа при 37°С . Отмечали положение фильтра на чашке тремя асимметрическими проколыми . Фильтры промывали 30 мин. в буфере ТГ-о Г50пИ Trir--IICl pi 1-0,0; 150п>М ЯаП1) на качалке и инкубировали 2 ч. п 20% телячьей сыворотке в PBS, а затем -ещр 30 мин. с добавлением 0.05% TVecn-20 (TBS-T). Инкубировали 4 часа в анти-с.пк*>-кроличь»й антисыворотке (раав^доние 1:200) и Е. coll - лямбда pt 11 - белковом зкетракте в РВЗ-Т С 20% телячьей сывороткой . Дальше обрабатывали как при и^муноэллектробло-типге (см. выш°).

Определяли местоположение позитивных бляшек на чайке "Петри", вырезали содержащие их куоочи агара ( Пх-1 >rri) и помешали в 1 мл. бу1»-ра 5М. Хранили при 4°С.

Лмпли'Ьшировчнную библиотеку зкстраги^>вали из агара отмыванием" оМ 12 ч. при 4°0 и хранили с лабамрни-м 1/50 об-ма хло-рофирм при 4°С.

МЕТОДЫ ГИБРИДИЗАЦИИ.

ДШ (ДОТ-; Блот-) гибридизация била проведена в формаыид-ном буфере . ДНК-мишень для ДОТ-гибридизации была обрабатана и нанесена на ВА-85-нитронелпллозу (d»0,2-0,45 wo,0 по следующей процедуре: В 20 мкл диет, воды вносили no 1 мкг. ДНК каждого ре-комбинанта и прогревали 10 минут при 100 С для разделения цепей. Сразу охлаждали в ледяной бане, осаждали капли центрифугированием 5-10 секунд на микроцентрифуге ь заново ставили в леденой бане. Добавляли 1/3 часть объема IM МаОН и инкубировали 20 минут при 20оС . Нейтрализовали 211-им ННчООССНз pll-7,0 добавляя его до 1Ы (3 обема). (Иногда использовали: IM HaCl; 0,3M Na-су trat; 0,5Н TrislICl; IM НС'1). До нанесения хранили в ледяной бане. Пробы ДНК наносили на нитроцеллюлозу в обеме для нанесения 100 мкл. (разводили водой или ТЕ-буфером ) на ДОТ-аппарате - под нитроцеллюлозой закладывали "Whatmann" ЗИМ, пронокнутый водой. Нитро-целюялозу сушили 1 час на воздухе или 10 минут под лампой. Про-шзали 5 минут в 6 х SSC при 2СРС и высушивали на воздухе. Фиксировали в вакуумной печи 2 часа при 80 Ci или ночь при комнатной температуре) и 0,6-0,9 bar. - нитроцелюллозний фильтр закладывали между 2 фильтр, бумажками. Предгибридизацню проводили 4 часа при 42?С (или ночь) в полиэтиленовым пакете в буфере для пред-гибридизации (0,2ml буфер на 1 квадратный сантиметр нитроцелш-лоае). Состав буфера для предгибридизащш: 507. формамид (дейо-низ. ),5х Деихард: (0,1% фикол-400, О,IX BSA, поливинилпиролидои. бх SSC, БОпМ На-фосфат рН-6,5, 250 мкл/мл. сонифицирована Д1П1 спермы лосося или крупного рогатого скота, 0,1% SDS, 10 мкг. /мл. поли-А, 10 мкг. /мл. полн-С. 1'ибридиэащш проводили 48 часов при 42° С в запаянном полиэтиленовым пакете. (50 мел. гибр. буфер на 1 квадр. сантиметр нитроцелюллозы). Состав буфера для гибридизации: 50% формамид, 1 х Денхард, 5х SSC (можно 0.5х S3C), 50пМ Na-фосфат рН-6,5 , 0,5 nç/ml сонифицированная ДШС спермы лосося ( кр. рог. скота), 0,1% SDS . 30 мкг./мл. поли-А (U.T) , 10 »лег. /мл. полн-С, ДНК меченного зонда , прогретая 5 минут при lOOoC и охлажденная сразу при 0°С. Для гибридизации использовали Р (ШТР-эонд с уделышой активностью 5.10 - 1.10 на 1 мкг. меченной ДИН или 26 нг./мл. (lig-dUTP-меченной ДНК размером f>00 1000 н.н. в 2,5 мл. буфере для гибридизации на Ш) квад(>. см. филь-

тра Максимальная чувствительность метода имеет место при проявлении цветной реакции больше 2 «асов и концентрации сНе-ОНА-зон-да 50 нг. /мл . В гибридизационный буфер добавляли 3% ВБЛ (обезжиренное молоко , или 5% блокирующий реагент). Высушенный нитро-целюллозный фильтр запаивали п полиэтиленовый пакет . Отрезали уголок , вносили зонд , буфер , выгоняли воздух и запаивали. Инкубировали во влажной камере при 42°С. После гибридизации несгиб-ридизовавшийся зонд отмывали по следующей процедуре: 3 раза по 20 минут при 20 С в 2х 53С; 0,17. БВЗ В объеме 200-500ш1;1 раз 30 минут при 65°С в О,1х 55С ; 0,1% БСб в объеме 400-500ш1 - при использовании высоко гомоложные гибридизационнные пробы или 1 раз 30 минут при 20°С - при использовании кДИК- зонд. Высушивали на воздухе. Рентгеновские плешей экспонировали 20-40 часов при -70 С. Для повторного использования специффический зонд снимали с нитроцеллолезного фильтра кипячением 5 минут в 500 мл. 0,1х БЗС; 0,1% 503. Высушивали 5 минут под лампой, промывали 5 минут в бхБЗС. Высушивали под лампой и дальше обрабатывали по протоколу.

В случае'мечения сИд-сИЯР и Ыо-сШР детектирования гибри дов меченная ДНК проводили следующим образом : Фильтры промывали 3 раза по 15 минут при 20°С В 2х ББС; 0,1% ЗОБ и 2 раза по 15 минут при 65°С в 0,1х Б5С; 0,1% БЕБ. Затем либо использовали сразу, либо высушивали на воздухе для болего поздное детектиро-ванп. Дальше все процедуры выполняли при комнатной температуре. Фильтры замочивали н?. 1 минуту в буфер-1: 100тМ Тг1з-НС1; 150тМ НаС1; 0,05%Т»ееп-20 рИ-7,5(20оС) . Инкубировали 20 минут в 100 мл. буфер-2: 37. (*/у) ВЗА в буфер-1 . Высушивали 10 минут при 80°С, замачивали еще 10 минут в буфере-2 и снова высушивали. Заново замачивали в буфере-1 на 5 минут. Инкубировали 30 минут в 20 мл. разбавленного раствора антитело-коньюгата /1:5000/ . Отмывали несвязанного специфически антитело-коньюгата 2х по 15 минут в 100мл. буфер-1 и 2х по 5 минут в буфер-1 без Твина Уравновешивали мембрану 2 минут в 20 мл. буфера-3: 100тМ Тг1з-НС1; 1СЮтМ НаС1; 50тМ МгС1 ; рН-9,5(20оС). Инкубировали фильтры в темноте в 10 мл. свежеприготовленного раствора для окрашивания в запечатанной пластиковой пробирке : 45 к.«, раствор НВТ ; 35 кот. раствор Х-фосфата в 10 мл. буфер-3. Цветной преципитат на-

чииает образовыватся через, несколько минут, но реакция заканчиьа-ется через 1 день.После появлении лолос или пятен реакцию останавливали погружая мембрану на 5 минут в 50 мл. буфер-4 /ТЕбуф-фер/ : ЗОнМ Tris-HCl; <Ш EDTA; |,1!-<),0(20оО) . Смльтри можно высушить при комнатной температуре и ни при 80° С и сохранить . При высушивании окраска ослабляется . Ш высушивали, если било необходимо использовать их заново. Цвет ш>жно восстановить замо шьая мембрану в буфере-4.

ДНК-P!iK in situ гибридизации на гистолог, срезах и тотальных органов была выполнена по протоколу Oephalon Inc. .Vest Cester, PA,USA с нашими модификациями: Предггбридпзацию приводили 1 час при 42-45°С в бу^ре для нредгиоридизиции, содержащий 0,25 ng/ml tRfM (»ложно еде Мз-лаурил-с.фкпмин, для предотвращения неспецифического связывания». Накрывали енликонировгишым покроишь стеклом или полисгилыюной мле iKoii. Денатурировали венда кипячением (2 шшути). у охлаадгили во льеду. Хранили при -20°С. Гибридизацию проводили в обьеме 20-Гр0 мкл. СЛ Ш'Л. (Эпг) die-меченного зонда в 50 мкл. предгибридизационном буфере) при 42-45°С ночью (12 30 часов) иод енликони^ивашнм стеклом , запечатанном резиновым цементом, во влажной камере . Удаляли цемент , снимали осторожно покровные стерла и промывали предметные стекла в обт-еме 20 30мл. соответственно: Зх но J5 минут В 2xSSC при комн. темр. (КТ) / 1х минут в 50% ¡{ормнмид, 2xSSC при 42°С. / 2х по 10 минут в 2x^GC; 0,1% Ж при КТ. / 1х 10 минут В O.lxSSC; 0,1% Ж при КТ. /1x5 минус н 2х Cr¿J при КТ. / 1х б минут в РГ£. при КТ. / 1у 5 минут в FB5 ; 0,05% Tween-20 (PBS-TntonX-100) при КТ. / 2х по 5 минут в IBS. Для детекции связанного зонда сперва отмывали в об^ме 20-30 мл. соответственно: 1х 5 минут В 6y<t*?f>e I (lGOuM Ti i-j-HCl plB-7,6; ШЬМ HaCl). / lx б минут в буфере 1 * О,MX Tween-20 (Triton X-100) / ÍX 5 МИНУТ В буфера 1 + G.3Í lot-en * 1U.Í СрЫЧЬЯ сыьо'.ЧЗТКа. It» каждом стекло наносили по 50 шел. раствора анти dif-ангигслового конюгата (Fub fragment) и Pí.l в разведении 1:5000 (150mli/ml). Накладывали сверху сииикл вир«.iашк пощ-овно« cti-кло , стараясь избежать п; fuju'rt . Инкубировали tV) минут И) и комнатной температуре . Ирр-дметни-: г текла почивали раза пи 20 минут в W) мл. I t'c; Т . rvít.-m их np'pMiiBMiH 'р ¡("ну в оур|> (*• ;> (n,¡M

Трис-HCl; 40nW Ц;П1; 0,1 M liai'i; р.Ч-Я;51. В эпнендорф добавляли 1,&мкл. раствора МБГ /n:tro blue tetrazol luir/ К 300 мкл. буфе-ра-2, смелшвг..ли переворачиванием, добавляли 1 мкл. раствора Х-ФосФат (ООП') и иорсм^шинали. Наносили но 20-50 мкл. на отек-то 22x40мм и следили за проявлением черев 12-48 часа После того, как окраска становиться достаточно интенсивной, промывали 2-24 часа в дистиллированной воде (хорошо отмывается неспецифич. окрашивание). Реакцию останавливали промывал b минут в ТЕ-бу1чре (1С iiM Tri:; HCl рИ-С.0; 10 EDTA; и подсушивали на воздухе или заключали в глицерин .

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИЛЬИХ ГЮ0ЛЕД0ВЛТЕЛ110СТЕЯ ДЖ

Определение первичной структуры ДНК было вьгаолноно методом Сэнгера по протоколам и наборами для секвенирования Н1Ю "Еиопол" (Фрагментом "Кленорл" ДИКнол. 1) и ИНЗ "Фермеитас" (модифицированной ДНКпол. фага Т7) . ^акционирование продуктов терминации бы по выполнено в Ь- ЬХ денатурирующих 11AAI в lx TBE .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение кЛНК-библиотеки D. mulanogastor н скрининг специфических клонов

Для получения кЛНК библиотеки D. melariogastei была получена лямбда Bt 11 ДНК в препаративных количествах . Из всех известных приемов была исползована оптимизированная методика , включающая минимгиьное число обработок, максимальный выход и достаточно высокую степень очистки - после ресусиендирования фага, осажденого 1ûà см. П|х)водилась экстракция балластных белков Е. coll хлороформом до отсутствия осадка в интерфозе, а затем РНК и d^iroBMe белки были экстрагированы пабуфереиным фенолом /рН-Н.О/ и фенол- хлириформом . Ди; с,ыла ос<члг,ена 0.3 М ацег'.том натрия и рчв 'ым обемом изощюпанола или двух-кратным nrv-ммм этанола после

6-10 - кратного переворачивали просирки . Особенно важно било не осаждать центрифугированием, так как при препаративном выделением это приводить к очень тяжелой растворимости и высокой степени физических повреждений ДНК. По этой же причине при {.¿Лоте с лямбда ДНК была использована силнконировалная стеклянная посуда, иэ-за высокой адгезионной склонности Д5Ш . Осажденная ДШ была осторожно перенесена полиетиленовой или тефлоновой палочкой, или одноразовым наконечником в пробирку с деиониэованной водой . Средний выход - 100-200 мкг. ДНК из 100 мл. 2xTY или другой богатой среды при оптимальном заражении клеток и интенсивной аэрации. Препаративно была расцеплена 50-100 мкг. лямбда ДНК рест-риктазой EcoR I и после разделения "липких" концов прогреванием 10 минут при 65°С и немедленном охлаждением при 0°С "плечи" Фаговой ДНК были сепарированы препаративна электрофорезом в 1.БХ агаровом геле в ТАЕ-буФФере за 48 ч. при напряженности поля 0,5-1 V/cm. В разных партий ДНК, при разные концентрации фериен-та и времена инкубации, постоянно наблюдалось присутствие 20-30* неразиепленной ляибда ДНК, вероятно вследствии потери рестригаш-онного сайта. Это обуславливает необходимость в электрофоретичес-кой очистки плечей. После электроэльции в диализный мешок, осаждения , ресуспендирования в ТЕ-буфере и диализа против ТЕ-буфера "плечи" лямбда вектора были дефосфорилированы щелочной фосфата-вой/Boehrln- ger mannheim;713 023/для предотвращения саыоэамыка-ния и получения нерексмбинантов.

Тотальная РНК из самцов D. nelanogaster была получена стандартным методом с использованием гуанидин-иво-тиоцнаната и была пропущена двукратно через колонки с олнго-<1Т-иелгшюэой для получения поли-А-обогащенной РНК . кДНК была синтезирована при помощи cDJIA Synthesis Systems Plus RPH 1?бб /AinershaW с использованием одновременно олиго-dT и "случайного" праймеров , что приводит к вероятному уменьшению длины полученных фрагментов ДНК, но и к увеличению юс представительности (Рис. 1 ) .

7 -1»

«й -» ,

-и

УН -II

-II

- м

-II

\

Г-! м

к

Гкс. 1. Электрофорез в 1,2% агароэном геле с 2,2М Формальдегидом, 25мМ фосфатном буфере р11-7,0. 1 - кЛНК самцов й. те1апоказ1ег, использованная для приготовлении кД1П'-библиотеки. 2 - маркеры молекулярного веса (размера). Размер указан в 1000 нуклеотидов.

Затем плечи и кДПК с "пришитыми" лигазой и вылепленными рестриктазой ЕсоР I линтерами (с последундпм метилированием) были лигировани лнгазой бактериофага Т4 в 4-кратном молярном избытке "плечей" по отношению к молекулам кДНК - для достижения максимальной инкорпорации молекул кД11К в Л!К вектора лямбда к1 11.

Упаковка библиотеки была проведена с использованием наоора для упаковки "Униклон-1" /Ш1КО"Диагностикум" / , который в наших условиях давал эффективность 10 ф. ч. /1мкг. ДШ фага лямбда дШ.

Скрининг кДНК-библиотеки в экспрессируемом вегаоре лямбда 11 был выполнен с использованием полученной нами кроличьей антисыворотки против суммарного антигена СЛ . Предварительные титро-вочпые эксперименты показали, что максимальное уменьшение фона на нитроцелюллозных репликах можно получить при инкубировании фильтрогреплик в 200-кратно разведенной кроличьей антисыворотке

(в PBS-T) с добавленным 5-кратно разведенным эабивочным ?кстрак том иа Е.coll (лизогенной no?gt. 11) или если до замачивали ifim тров-реплик антисыю ротка была прекшсубиронаиа вместе с оябнрпч ньгм экстрактом 30 минут. Отскринировпнн были 42 нммупо-пояитип-

FTÍJX (СЛОНОВ .

ДОТ-гибрилизациониые ркспериментн с использованием па-лиА-РНК- и кДНК- (синтезированным на поли-Л-FRIO зондами из пл , и кЛНК-еонд из самок (Рис. 2) показывает что все А2 клона не гибридиэуктгся с меченными кДШ-копиями FHK-трпнокриптов из самок, т. е. их вставки вероятно специфически этепрессируптся только у самцов. 5шст ,что не все югопн четко гибрилизуттся с моченной поли-Л-РНК и кДНК из СЛ обыясняется или неполной прелставнтряь-íioctмо зондов, или тем, ото иммуноскршшнгсм пнтиснвороткой против антигенов СЛ были выявление и клоны. соответствует0 Силковые продукты которых присуствуктг, но не транслируются tn vivo n СЛ. ( Fhc. 2 - Л, В,С и D).

-О-

к 7

_í—t О__

п Га

___y-, j

о о

• г

. г.

JL=>_

/с

1 !

7 I 13,

19

j 25

I 31 '

37!

43- О

О 1

О

о

J

Pire. 2. ДОТ-гибридизанил иа нитроцелпллозиых мембранах с нанесенными пробами ДНК из всех 42 лямбда gtll рокомбинан тшге клоков; негативный 1сонтроль ДНК нерегамбинантого лямбда gtll (позиция 43). Д - использован зонд поли-Л-FIIK из СЛ самцов , меченной при пошщи полинуклеотид-кинаян r.Nira Т 4. D и С - зонд меченный кДНК соответственно го самцов и самок. П - зонд меченной вставки клопа По 18 с повторным использованием фильтра го позиции П .

Доказаны оба предположит : 1) ДОГ-гибридизашот с использованием печенного зонда ДШ!-клона Mo 18 выявляет ¡моны »о 18,19,33 на том

ли ДЛ'-фнлтре , на которым кДНК-эонд из СЛ не выявлял клон Но 18 (Рис. 2, позиций В и D). 2) Частичный анализ гибридных белков некоторых клонов показал , что соответствующие ни продукты ni vivo ■ специфичные для самцов, а не только для СЛ . кДНК-вонды Сшш син-тьнированы с использованием олиго-сП'-аатравки, а вонд ДНК клона No 16 был м«чен достраиванием но концам фрагментом "Клеиова" ДНК-иоли-ыеразой I 1 "Amersliam", Т. 2141Z) .

Характеристика иммуио-позитивних рекомбинатних клонов лямбда ди 11

Ь:е иммуно-позитивние лямбда ^ 11 рекоиб1шантние клони, по-лучинпие иаии, были охарактеризованы в отношении размера вставки. Вставки были выщенлени но сайту встраивания рестриктааой ЕсоИ I , мечены диитршшашшм но концам фрагментом "Кленова" ДНШшл. I и сепарированы элещюфореаом в 1.5Х агарозном геле, а экспозиция высунутого геля проводилась в течении 8 часов при -70°С (Рис. 3 - А). Шрокрестной ДШ гибридизацией клони били сравнены и сгрунироважш по приоуствни общего участка ДНК (Рис. 3 - В) .

JL ни

i

i Ml ! и» ni ! -Í... i »•» i....

* *

I || 1 . I I I .1 1. " IIII1« Ц I. II I. I. IIII IIIII. 1111 IIII» IIII И IIIIIIH lili U И >111 II кш

Л I группа: клоны Но

II группа: клоны Но

III группа: клоны Но

IV группа: (слОны Но

V группа: клоны Но

VI группа: клоны Но

VII группа: клоны Но VIЛ группа- клоны N0

18. 19, 39 29, 35

1.6, 26. 27. 30 5 . 22. 28. 29 4 , 7 , 8 . 11, 15, 31 3 , 40 14

2, 9, 10, 12, 13, 16. 17. 20, 21, 23. 24. 25. 32, 33, 34, 36, 37, 38, 41, 42.

Рис. 3. Характеристика ДИК-вставок рекомбинантных ! лонов лямбда Et.ll . А - Схема размера вставок , определенного электрофорезом в 1,5% агарозном геле после мечелия Р достраиванием ЕсоЯ1-концов рестрнктов Фрагментом "Кленова" ДНКпол. I. В - Группы (слонов, содержащих общий участок ДНК, присуствие которого детектировано перекрестной ДОТ-гибридизацией . Зонды - вставки , меченные достраиванием по Есо(?1 -ганцам Фрагментом "Кленова" ДНКпол. I .

Характеристика кДНК-копии гена белка PEBmeII

Кроме pairee охарактеризованного белка РЕВте на иммуноблотах В. melanopaster нами были обнаружены еде два белка , специфичных для СЛ самца - PF.Mine II (мол, вес в области 40 кДа) я РЕВте III (мол. вес в области 24 кЛа) (Рис. 4). Из кДНК-библиотеки В. mola- nogaster в экспрессирушем вектопе ба!Стериофага лямбда gt. 11 , иммуиоскринингом и перекрестной ЛОТ-гибридизацией , были выделены 3 клона , белковые пролусты котор!« соответствуй по антигенной специфичности белку ГЕВтеП, что показано очищенными полшитональными антителами, полученными к гибридным белкам клонов Но 1П. 19. Г«.

!А:4-2ЭД_____

1

1 :

П,

»—30 1 ---+€»„111 —20 : —

•к

В'а 12 3 23 С123 _„^1 23._...■>

« «а

2

Рис. 4. Электрофореграыма 12,6Х ДСН/ПААГ-электрофореза белков Б. те1апо£аз1ег после ишуноблотинга на нигроцелхлеа-ной мембране, к - детекция специфических белков била про-веадена при помощи анти-СЛ кроличьей атисывороп;и. Пробы; 1 -самка, 2 - саыец беа СЛ. 3 - самец с СЛ, 4 - СЛ. В - детекция била проведена с использованием очищенных поликлональ-ных антител к гибридным белкам соответствено: Ь - клона N0 16.с - клона Но 19, с! - клона N0 39; а - контрольная детекция анти-СЛ кроличьей антисыворотки . Пробы: 1 - СЛ , 2 -самцы без СЛ, 3 - самки. Указан моллекулярный вес маркеров.

Очинённые поликлональные антитела к гибридному белку ¡иона Но 19 выявляют на ннтроцеллллозних белковых иммуноблотах 0. ше1аповаз-1ег (после ДСН-ПМГ-электрофорез в системе Лэммли) две белковые Фракции : высокомолекулярная, соответствующей белку РЕЕяшП - в области 40 кДа -.названная. 11РЕВтеЛ <подставлении двумя субф-ракциимш и нивкомолекулярная - в области 10-1Б кДа - . названная 1Р№|)«*И (пи-дставлена тремя парными субфракциями) (Гпс. 4 В) . Этот наттэрн сохранялся и в случае , когда образцы для элек-1 (кефире а & били приготовлены в пристуснши набора нротназныч ии-I иби-горов - 1 мкМ лейшмпин, 1 пМ Н.Г.Г, ЮгМ метабисульфит нат-

рия, 1 мкг. /мл. пепстатин и 10 мкг. /мл. трипсин-ингибитор ("Reanal") , что предполагает его существовании in vivo .

Используя меченные зонды, специфические к каждой из двух цепей вставки клона Но 19, Шзерн-гибридизацией был выявлен один FHK -транскрипт , мигрирующий в 1,2% агарозном Формальдегидном гелэ в области 3 500 пар нуклеотидов и другой FHK-транскрнпт - в области 350 пар нуклеотидов, кодирующий белка РЕВгтиП (Гис. 5) .

Pia:. 5. Нозерн - гибридизация при помоыи Р-меченных зондов к "антикодируюяей" ( А ) и кодирующей ( В ) цепи вставки клона Но 19. Пробы: 1 - тотальная РНК самцов D. те-lanogaster, 2 - тотальная FHK самок D. me] anotaste г. Указан молекулярный вес маркерных фрагментов ДНК бактериофага лямбда, расщепленной рестршстазами EcoRI и HiridlII .

Специфические мечеиие каллой цепи вставки ¡слона tío 19 было осуществлено после переклонирования вставки в бактериофаге М 13 шрЮ в обеих ориентациях (Рис. 6), достраиванием второй цепи од-ноцепочечной рекомбинантной ДНК фага фрагментом "Клено-ва"ДНК-пол. 1 "прямого" прайм°ра и внгеплением полученной 2-цепо-чечной вставки рестриктазой EcoR ! . Вставга была элгаровзна из 1,5% агарозного геля (Рис.7) и цепи были разделены прогреванием 10 минут при 95°С, а г?ат°м - ''^пользованы для гибридизации. Этот метод с одной стороной снижает чувствнтелность детекции мнпенн из-за конкуренции с нрмечешюй цепью, но с другой стороной обеспечивает высокое включение метки и облегчение при контроля рп количеством и качеством (чистотой) ''-лученного зоила.

А _______21______1 2__R I

II

t

2

' • ,-t. Г!-'

1_

____2__^

' 5tc. 6. Эшекгрофореграмма Рыс. 7. Зле кг рофоре г раму.а препаратив-¡.лектрофореза ДНК в 1Х-ом ного электрофореза ДНК ШЗ рекоыби-

парного отжига одноцепо- них рестриктазой EcoRI: А - до элюции чечных ДНК рекоыбииантных вставок ; В - после элюции вставок . клонов фага U13 тр8 Но 19 Пробы: 1 - клон Но 19; 2 - ¡ион Но 35 соответственно: И2( а); ИЗ lb); 1 (с) .

Таким образом один из возможных путей транскрипции ДНК-последовательностей D. melanot/aster. содержащих ген белка PEBmell приводит к считыванию (транскрипции) одной цепи ДНК и получению транскрипта размером около 3 500 пар оснований. При помощи dig-dUTP- нерадиоактивного ыечения и in situ гибридизации ца то-талышх органах было локализовано место транскрипции этой цепи в глазах. Второй путь транскрипции "обеспечивает" синтез белка РЕВшиП в результате считывания второй (комплементарной) цепи ДНК в СД самцов, что било показано dig-сИЯР- in situ гибридизаг цией иа гистологических срезах (Рис. 8) и тотальных органах t Рис. Taiaiw же методом была исследована динамика транскрипции гена белка РЕБ»«э 11 у D. ir«lanogaster и сравнително-генетическое исследование транскрипции У разных видов . дрозофил . У D. nelaiioyasLoi присуствне транскринта было обнаружено на 1-ого . 4-ого и В ого часа и 1-ого (12-ого ч.), 3-его, 6-ого и 12-ого дня после иыл-та имаго (рис.9). У всех 17 нроанализируемых нами видов Diusoplula разных групп и у D. virllis, D. lunimel и D. Boataiia транскрипция 1ьна белка РЕВшеП была установлена в СЛ.

агароэном геле после по- нантных клонов No 19 и 35 расщеплен

но у 1 вида она происходила преимущественно в дугггусе, и у 1 ви Лй - в парагониях ; вероятно парал-льно с присуствием слелгвыч количествах транскрипта и в СЛ . (Рис. 9) . У разные видов дро зо'ил присутствие транскрплта обнаруживается в разных стру>пурах СЛ. У Р. rol anonast er - зто апикальная сторона клеток ОЛ (Fnc. 8. - 3) . Было обнаружено присутствие интенсивно окрашенных глобул на апшсалной поверхности клеток в ОЛ П. lrwtgtan:; и в пространстве между слоем клеток и секрета СЛ, которое образуется в результате сжатия секрета при дегпдратационной обработке. &ги глобулы Г'^юятно следствие экстракции цитоплазмы из клетск (или микроворсинок апикальной части клеток) при обработке или ;изио-лопггеские отложения в купткуле апиг-атной части так как подобные глобулы были обнаружены у всех препаратов СЛ D. i migrans и ни у какого другого Енда (Рис. 10 ). В качестве отрицательного контроля на тотальных препаратах ОЛ был использован <1 ig-ilUTP-меченный зонд гона ро-кристадина травяной лпгутпки.

[> л--'- - ■]}.. -.• <<

( ■ .Щ

•3 ,;• • - ; ^ V« Vi л* 1 v -e—r^ffi^l________¿g

РЖ * г г^

•V -» и-■:>Ч>*) С*;«.-' ' * \ ь . ' \

" ■. - Г У- { й .• , V« i - ^ ' ■ '' VLJ>*

Г-. -.V-* ...

pkc. 0. iii situ гибридизация на гистологических срезах. 1 - в. virllts; 2 - СЛ 0. virllis; 3 - СЛ D. пеКапсгя ^г. Зоцл к ка • диругагй цени клоча Но 1Я. 4 - П. ррЬтпсгат.Мч . ПочЛ ю)ли-pyirarfl 1мч! клона По .'5 . Увеличен« .

pi Чл íf

?

Л i •

group ist»r- V

Пк.а</Ш<В1а .< simlœix

group Mttanefcister

Д^иХиЬа. JD.eeiiipria

{roup /«tíltwotaate»- ItrLup M*la»o#ast»r fr ou fi OUscura D. отела P. <r«c(a С- (юшшззо« j). p^nrtfwhycurg

y

с

t'fup OUseuru coup J>wi(i-œit group l'irilij» crou/j Hiciiie' " --------- п.-.-!---- -p virilis _ AluMMi

|r«»c Virilia /*u««t»-i.9 (roup Guarani fraup ttcplmia

D. - -------•

A guarani

D. hydei

.4

|»uup B+fUmlu. X Ihüitiu M»,>j«tta

''•Mix iMarii " s 'HHIIICMIJ Ъ (irumeHSii

group Hel anogcist er D. mel anognsi t*r~

I

'M

аю i

14Ю,

( ЯМ I

I Jri)

CfZdJ

4<5dJ

Рис. 9. in-situ гибридизация на тотальных органах половой системы самцр. рчзннх видов Drosophtla ( А ) и разного возраста ( В ) П. melanogaster с использованием зонда к кодирующей ценит клона No 19 . Уврличршю 32 х .

А

Гиг. 10. In (-.^рилн^-митя на тотальных органах половой систру» гямт D. lmistniv: ; яочд к колирута?*! кепи клопа Но 10. Ур.а.ппчони? 400х. Ридин глобулы, интенсивно mwma-гта;" гснл I А ) и контуры ¡глоток с накопленном м°псн э ялг,= н ппри1!итоплп?млтичоск"м пространгти» ( R ). Четка с инг^нснрностьп пЛрилизрттся только в готв-

кпльн^й ччсти ощрклрточн'.то гчштрля СЛ. ( Л ) .

ГиСридиз&цня in situ с использованием d igaxi gen in-dllTP-иконного зонда на гистологических срезах и тотальных органов была выполнена в соответствии с модифицированными нами иетодаыи,предложены фирмой Boehr mger nanntioim. В работе был создан авторский метод приклеивания препаратов на стекол с использованием Bind Si lane (Si lane A-174; кат. Ho 1650-251; LKB, Sweden), обеспечивающий максимально известную скорость (10 секунд), надежность неотклеивания при последувдэй 24-48-часовой гибридизацией в форш-ииде и отмывок (больше 95%),доступность мишени и отсуствие фоновой. реакции. Таким образом решена проблема сохранения целостности препаратов при гибридизациошюй обработке, существующая во всех мировых лабораториях.

Вставки клонов gt 11 No 18, 19 и 39 были переклонированы в бактериофаге Ы 13irpl0 и отсеквенированы с использованием фрагмента "Кленова" ДНК-полпмеразы I. Оказалось, что они различаются лишь по размерам . Первичная последовательност вставки клона По 10 (самой длинной) была определена и при помощи секвеназы - для улучшения прочитывания по дороже "С" (Рис. - 11) . Длина вставки - 330 пар оснований . Сравнение нуклеотидной последовательности и размера вставки с размером транскрипта показывает, что вставка вероятно ве содержит поли-А~прилежащэго участка ыРНК-и белка FEBüfc11. Тот факт.что подобный участок отсуствует у всех трех отсканированных нами клонов , указывает на вероятную невозможность его "щючитиьаний" обратной транскриптазой с оли-годТ-прайме ¡.а это доказывает правильность соображений об использовании в реакционной смеси одновременно олиго-дТ- и "ста-пютичеекого" прайме].ов.

Бее представленные реьультаты имели минимум 3-кратные иодт-ьерждуння.

Компьютерным сравнительным анализом было установлено наличие большого процента гомологии с одной стороны между кодирующей цепью гена PEBimll и гена Drosophila FMRFaMim-родственного белка, siiüii 2, и и;вду "аншкодируьцэй" (но отношении гена l!f'iw) 11 Цснш и 3'-обласчь») 114-гранспоьаоильного элемента дро-зофикы, а с другой стороне - иалгчие большой внутренней гомологии в кодируни^й и ь "ашиклдируш^й" цени, что указывает и на ьозии.и! ¡е ьы11'|дн,--|ш>..' каких то ^гуляторных Функций "кроме транс-

ггорэбилыюй íFm\ 11) .

А: 10 20 30 40 50

Б' OTCAAGCTAG ATTCGAATTT GGTIÏAATGT ТАСАГТСДСТ CTAATGACTQ Г?ЛГ?ГТ!7БЛТС ТЛАОПТГЛАЛ гслллтглгл лпзтллгтшл влттлствлс

60 70 80 90 100 110

GTAGCGOTCT ТТСТТОТЛТС ОЛОСАЛСТТА TGOGGOrCTT TGGCQQTGGA TCTGiïTGQAQ ПЛТ^ОСОЛВЛ ЛАОЛАПЛТАО ОТОЗТТОЛАТ ЛГТТ'ТТ!ЛТДЛ АСТТССАСОТ АПЛСЛАССТС

120 130 140 150 160 170

GAG6TTCTAG GCTGGACATC AACAGAAGOG TAAOTATAGT АСЛЛСССОАА GGCGAACTCT ГКТЛЛПЛТС ГЯЛОСТГТГЛП ИОТОТТССС АТТПЛТЛТГЛ TGTTGGGCTT CCÎCTTGAGA

180 190 £00 210 220 230

(ШТТОСЗЛТЛ ТГЙОТТТСПТ CfÏÏGQATTCT АТТПАТТТЛЛ ТПСОСЛТСТЛ TATTATTTGT ОГЛАЛ'ТТАТ АСОПЛААПСА ООЛПОТЛАОЛ ТАЛ'ТЛЛАТТ A WOT АОАТ АТАЛТЛАЛСЛ

240 250 260 270 280 290

тттеготгал п-тглоггоо тттслтотас лозгллло?: ттгатлатат тташатас

ллагагаагт ГТГОТППАГГ лллптагато tt'altthf'g лалтлтглта алгттатлто

300 310 "<20 330

г ли глотал лтг/;тл!-ллл гл''ллтгллт ^ттстнлгтла з-

Л1АЛАГГ,ЛГ,Г Т A.I'Í А107 П Л1ЧГГЛПГТЛ СЛА<'ЛГ;ТП]П

в:

"Mhnl Г'М1пг:

«

3. 979

3. 7t>3

6'

30

ATO AAOí íAAGQG --■ - -

AjC AAAA 171U

140

1 AAC'fAi A

IAIÍJ113 TAÍXXii 1720

lx>

16Ú

ir AOAAiJCCQAA QíjJüA; JTCT

¡TACTAiAiT TOTCAT 1730

4. 408

170

- rrAl

17-J J

b. 917

Cüi I

CA1I 1

/60

160

t'GGATA TOi'l' ¡"1 lAAÍ/JliiV , I' AüuATl 1

17Ü0 4. 059

190 2UJ

:GT OUTÜÜAiTOT A

',00 ATI AICAAAT 1770 IV

1 ATT

AiT

)0

5.

i 372

230 240 .'50 260

ATITGT i l"li: i til IQA Üíüí.'Ali IÜG Til CAI 01AO 1, 3'

II Al Oí Allí',...... - lüA 1T1AA1AIAI A 3

lblü 1820

DSF1RKB2 lli.l.iiuiiii

(|| (isopln id t-lí;í lelatfcü ixrptldc. telij, ci-U 2

a

SiiUil liigiitiit (-oiic-i; 9-357

10 20 30 40 50

3' GAGTTCGATC TAAGCTTAAA ССЛЛАТТАПЛ ATGTAAGTGA GATTACTGAC

60 ! 70 R0 00 100 110

CATCGOGAGA AACAAGATAG CTCGTTGAAT АСГСППАТЛЛ ACOTCCACCT AGACAACCTC

120 130 140 150 160 170

CTCCAAGATC OGAOCTGTAG TTGTCTTCCC ATTGATATCA TGTTGGGCTT CCTCTTGAGA

5. 919

180 190 200 210 220 230

GCAAACCTAT ACOGAAAGCA GGAOCTAAGA TAACTAAATT A 3GCGTAGAT ATAATAAACA

3' 3GC6TAATA AAAAAAAAAA

260 250

4. 777

ЛЛЛСЛ0ЛЛ ААЛЛЛЛЛ/

240

i50

CT CCCGTO^CC AAAGTACAi

ЛЛЛЛЛТЛ AAATGAA 10 230

2f

ДСП AAAATAAAT

220

4. 357

270

1 TGCATTTGCG АДМАТТАТА AATTT

\ GOT AGAAGA АГШТТСТТ GATTG

210

280

?no

190

3. 679

29 Г] 300

ЛТЛТ GATAAATHAGT TACI

ТГАТ - - • - TÇAA 1

310 АТПТТТ A|

мгттт л

Î0

lAATTGATAI 170

320 TGITAGTTA CA

ПТТСАТАЛ AA

160

330 7то

\CAGTGTC 5' 3' о

г\ЛС1 15C

IGTC! 5-3' A

з. е?а

3. 981

4. 108

з. б?й

Ж--.Л. ¡вп от Лл: гллслга л.

АСА

зао

1

гю

10

лэо

-----щсмт!

1'ААТААА АА ЖЮАСААШЛ

130

А САААТ'И

¿4Ю МС М

гво я лллпт

НО

юса (зё ШАТТЛА

100

3. 666

—

дх АШ.

РМП1П4В

ОгозорЬИа иё1аиова51«1' (пии Пу)

игозорЫ1а Р-Гапи1у ЬгшерозаЫе е1ыпиГ1(.Б П4 З'-ге^оп

Рис. 11. [Ьрвичная структура кДНК-копаи гена белка РЕВпиП и результаты компьютерного сравнительного анализа. Прямоугольниками указаны области гоиологий . А - Первичная структура кДНК-кошш гена релка РЕВивП: Б'-->3' цепь с нумерацией нук-лсошдов 1—>330 - кодирующая цепь. О - Сравнение кодирующей цепи (верхняя последовательность) с экаоноы-2 гена ПКГаыидс-вльцваыиэго белка.дрозофилы (нижняя последовательность). С -Сравнение антикодирумдзй цени (верхняя) с 3'-областью Р14 трансноз&билного элемента дрозофилы (ншшян); тшшш а^аа^аа^ шри^гои тллаана первичная структура кодирующей цепи.

Известны случаи , когда консервативной характеристикой ткани является наличие в ней определенных белков', в то время , гак набор конкретных генов, |:оптро-mpvinrnix синтез этих белков, может ва рнровать . lb пилимому . пример такога рода обнаружен нами у дрозофилы. |Ь;-т'1лппя работа дает нозможлость дальше исследовать механизмы К'чпр-чя синтеза белка ITPrr.-II на основе изучения геномного грца, ргс регуляции и степень консервативности .

В II В О Л Н

1. НАДГ ЛОН эле!ггр<.''{орезом и иммуно-Олотингом, кроме ранее описанного РЕВпм, были обнаружены еш.е два ie.mta, специфические для СЛ самца Г), rml плохая t er - ГЕВт I! (hPFBmell - мол. пес 40 кЛа и и'грпрп - мо.ц. г-о 10 ir кЛа) и ггргтя ш (мол. вес 24 i'Jta) .

2. Пкоиструироганна кЛПК-'Ч1г'Л№'ТРПа Pio--ophila melanoRaster на ос цок» ;nt!-'пресс И'чпгп'о Виктора лямбда 11. Инмуно-скринин-гом с использованием кр--пичь»й эптисмгюроткн против суммарного антигена гемлрыиосипшх лугориц Р. т°]ппо»тл:;1 рг были отскршшрора-нн 42 mwyüo- позитивных клопов . Они были охарактеризованы по размрру вставок и сгруппированы по принципу взаимно-перекресной ЛИК ЛПКгнбрилизпчии.

3. Охар'иттгриг>пвгшн иге группы клонов, кодируицие транскрипты, ГПРПНфПЧ"г-КИ^ лля СЛ , что иокяялич in situ ЛНКППС-гиб-рилипапн^й на гигтол'Ч ич<*ских ^р°зах и тотальных органах; первая группа - клоны Но 1В, t«, 39 и вторая группа - клопы 27 и Я5 .

4. Создана авторская методика для приклеивании препаратов на стеклах С исноляпранипм biti'l si lau« (Milane Л-174 "PK'-''.Шпе-пия. кат. tlo: 1Р.Р0 251). которая обеспечивает максимально изпест-ной скоростью (1Н-15 секунд) и иаде.тноетып неоткленрания (свыше ЯП*) при последумтгй 12 4-4 часорой iи^рипизацчий п 50? фпрмччнд" И длительной отмывки .

5. Очищенными поликлопалними аптнт°лами покапано . что ил" пы tlo: 14, Hl и кпднругг ги^ридны^ б^лкн, иимунохичич"ски сп

• об -

иТЬе'ЮТЪуилЦЛМИ белКУ FL'BilU 11 .

6. Нозерн riiGjiiWHaaiUlufl иридеионотрИ|<оьацо. что ИМ транс:к , 1пт D. DulajlOHaSUr, К0Д1;ру»^цИЙ белка PEBnw II. ЫМШЫвТСЯ в об

- iCTit 350 tiyia. пар. Коднрувдш / но отношении PtBn*> II / цепь ыюна Но 19 гибридиаируется с Р1Ш транскрнитом размером в области 3 1500 нар оснований- Видимо, с участка ДНК D. iit-laiioyaster, содержащего гена белка РЕБни H , 'транекриоирунгся обе антипара лелыше цепи . Оба транскрипта нриеуствуш' у самцов и не обнару аены у самск .

7. Г!ри помощи in sjtu гибридизации па гистологических ере зах и тотальных органах локализовано место эксщ есии гена белка РЕйие 11 в ОЛ самца . Сделана временная и сравнительная характеристика транскрипции и показано , что РНКтранскрипт присует вуег на 1-оы, 2-ом , 4-ом , 12 ом часу и 1-ого. 3-его, 6 ого, 12-ого дня после вылета имаго . Во всех проанализиронных наш видов дрозофилл разных группы, на 6-1è день после вылета имаго транскрипт нрисустьовал с ОЛ . К|юме того, у П. ai iiia^ae транск puni преимущественно выяь.шлси в семнвиносащем щотоке, а у О bifecia - в нарагониях.

t). Вставки рскомопиатнык клонов 4«! а лямбда gt 11 IJo lb, 19 и К9 были нереклышривани в бактериофаге Ml3 141 10 в обеих ориентациях и их первичная cipyiciypa определена . Они показали различия лишь по размеру вск-шки . Ьстаыса i;ic.ua Но 19 была от-секьеннрована |1ри номоиш фрагмент "Кленова" ДНК Полны«.-раной I и "ceiii,. назой" - ее размер 330 пар оснований . Результаты компь-и/те[|Ного сравнительного анализа даш «снование предполагать, что г» ^ ..--.'nia PEBikîII обладал1 транспонабииишми свойствами

СПИСОК ОИУБЛИКОВАШШХ l'Afj« il l|i) ДИ00КИЛЩ1И

1. M Z. I udwig, (I. A VbiiaJ ilia, I. I. Uspen^ky, A. I. Ivanov, Hi LLUi^iyv, M. К Popaiitzeva, V. A. Zati > ui, 1.1. K01 oolikib "l'^m.cijat I vfe fcu'.et ic aiid biochemical cliara 'eilzation of PU' -il», uc.j.,1 protein component of ejacnlaloiy Uilb in ditfeienL lu i.^i.iJii la f.peoles" Oeil cllf f erent lal ion an 1 |jevelc.niii;i't, l'jtu, v..,' I Snpi'1 ) ,p 1№ .

2. ПЛ. Тамарина, М. 3. Людвиг, И. И. Успенски, М. Р. Копанце-ва, Е А. Патрян, X М. Дянов, Л. И. Норочкин. "Сравнительный анализ мажорного белка семявыносяпшх луковиц у разных видов дрозофил". VI Всесоюзная конференция по Drosophlla. Одесса, 1989, стр. 84-85 .

3. Н.А. Тамарина, М. 3. Людвиг. И. И. Успенски, ПР. Копанце-ва. а А. Патрян. X. № Дянов, Т. Г. Бакаева, Л. И. Корочгаш. "Сравнительная генетическая и биохимическая характеристика малэрного белка семявыносящих луковиц дрозофил". Моллекулярные механизмы генетических процессов, VII Всесоюзный симпозиум. Москва, 1990, стр. 56-57 .

4. Michael Z. Ludwlg, Ilya I. Uspensky, Andrey I. Ivanov , Marina R. Kopantseva , Christem M. Dlanov , Natalia A. Tawarlna and Leonid I. Korochkln. "Genetic control and expression of the major ejaculatory bulb protein (PEBme) in Drosophlla melanoga^ter". Biochemical Genetics, 1991, v. 26,-No 5/6, P. 215239 .

5. X M. Дянов, Т. Г. Бакаева, Е А. Тамарина, М. 3. Людвиг, Л. И. Корочкин. "Белки семявыносяших луковиц (PEBme) Drosophlla melanogaster" . Первая Всесоюзная конференция по генетике насекомых. Москва, 1991, стр. 38-39 .

6. Ch. М. Dlanov, L. I. Korochkln, Т. G. Bakayeva and G. Т. Lvoin. "Evidene for two different ways of transcription of DNA sequences contal-lng PEBmell protein gene in Drosophlla melanogaster". Abstract. Transcriptional Regulation in Cell Differentiation and Development Conference. Brighton, 1992. In press .

7. Ch. M. Dlanov, LI. Korochkln, T. G. Bakayeva and a T. Lyozln. "Organ-specific expression PEBmell protein gene in Drosophlla males". Abstract. 9th Workshop on Development and Function of the Reproductive Organs. Edinburg, 1992. In Press .

8. Ch. M. Dlanov. T. G. Bakayeva, M. Z. Ludwig, N. A. Tamarina, G. T. Lyozln and L. I. Korochkln. "Characterization of cDNA copy of the gene coding for a protein of Drosophlla melanogaster ejaculatory bulb (PEBme ID". Abstract. 33rd Drosophlla Research Conference. Bethesda. 1992. In Press .

9. Ch. M. Diatiov, L.I. Korochkln. T. G. Bakayeva and a T.