Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение гиперицинов в клеточных культурах зверобоя продырявленного (HypericumperforatumL.)

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение гиперицинов в клеточных культурах зверобоя продырявленного (HypericumperforatumL.)"

RU3UUSUlih ^UbPU^bSnhiaaUb Qhsnhf33nhbbbph UQQU3hb UMUIbUhU UhiiPnPhnLn<*hU3h hliUShSRhS лг - л.

РГ b ОД

3UPQoaL3Ub ириьь Qbannq^O £J0]

^hTlbPhShbbbPh USUSnMJC UPnRfW) oUMflSLibbh {Hypericumperforatum I.) P22U3hb MnHSnhPUbbPnH/

Q-.00.14. «MbQuiumb|-uQninqtiuj» iluiuOuiqfiuirupjLutfp

L|bOuujpiJuQiuliujQ qfiinrupjnL(jGbp|i pbl)Qiudnifi q|iuiujljiuO uiuui{i6ujG|i hiujgtiiuQ uuwbQujfijnurupjujQ

иь auu^hp

иргмзиъ 2000

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУКРЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

ЧАРЧОГЛЯН АРМЕН ГЕВОРКОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ ГИПЕРИЦИНОВ В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО (Hypericum perforatum L.)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на сонскаппе учено if степепп кандидата Биологических паук

по спецяальпоста 03.00.14 - "Биотехнология"

АБОВЯН -2000

UinUQuilununipjuiG pbiSuiG huiituiujuiilbit« ЧЦЦ UJilipnpJininijJimj}i fiCiuinfimmmniü:

Q-Jimiuliuiü цЫ^ш^шр' ЦЬОишршОш^шО qJiinmpjniOöbpJi ijnlpnnp,

u[pn."¡)t¡iinp <.n.. 4uipijunqhmjuiG

п]ш2иш0ш1[шй Q0tir¿iiJui}unuühp~ IjbüuuipuiGuiljuiG qJiuinipjniüCbpJi qnlpnnp

ицтфЬипр &.Ь. -iujljnpjuiG

l)b(tuuipiuduiliuiQ qtiwnipjniüübpíi phljßuiöm t/V. UuipqujuiG

Uniujuiwmp ljuiqúuiljhpu¡mpjniG' ■« ЦМ.ЩШМи 4-<h «иъЕишшЬ^Ощпфш»

«ПЬтш^ша Фш1) PC

rr)ui2inupuünipjmüpi Ijuijuiüuiim1 «3 / » fus/tyi/и 2000p. (Juiiíp ^ « Q-UU U]ilipnpfininqjiuijli (Шиифитшф 018 iriuuGiuqlunuilpuQ tunphpipuü, í¿, Ч-ЦЦ. üuifuuiquihnipjiuü 2bQpniii (РйшЦиШ q¡immpjniGCbp[i ршЛшййтйр), huiugbü 375019, «, bpbuiG, Uoip^iui. PiunpuiiSjuiG щпц.24:

Uinhüuitimunipjuiü|i Ipupbiji t üuißnpuiüiui « Q-UU Ulitipnptminqtiiujli (ifiuinfiitimuiti qpuiquipuiüiuii, huiugbG 378510 «, p. UpniljiuC, Upqünt {uinuili, hbn/фшри (37461) 23240, t-фпиш microbio@ptias.sci.am

UhipSuiqfipG итшр^шй1 «¿9 » /¿¿У^/ЦУ*/

2000p.

Uiuuiiiuqjiuiuiliuiü (unphpnJi q[imuiljiuü ршритщшр ^

l|hGuwpiuQuil(uiG q[imnipjmüübp}i ptl}Guiöm (j^ U.4. Q-iuuaiujpjuiü

Тема диссертации утверждена в Институте микробиологии HAH РА.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Г.Р. Вардапетян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Ж.И. Акопян

кандидат биологических наук

Э.Д. Саркисян

Ведущая организация: РА МИНПРОМТОРГ Государдственное

АОЗТ НИИ "Биотехнология"

Защита состоится " 3 / " 2000г. в часов, на заседании

Специализированного Совета 018 Института микробиологии HAH РА в здании Президиума HAH РА (Отделение естественных наук), по адресу: 375019, Республика Армения, Ереван, пр. Маршала Баграмяна 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии HAH РА по адресу: 378510, Республика Армения, г. Абовян, Арзнинское шоссе, тел/факс: (37461) 23240, э-почта: microbio pnas.sci.atn

Автореферат разослан " Z3 " 2000г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандитат биологических наук JQ JfaC ijC,~j A.B. Гаспарян

£SU. fi О

г '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальное» проблемы. Изучение способности растительных клеток к синтезу различных вторичных метаболитов in vitro является одной из актуальных проблем современной биотехнологии. Изучение вторичного метаболизма в культуре клеток может выявить ряд закономерностей, таких, как синтез практически всех классов соединений вторичного обмена, общие тенденции связи между сложностью структуры и специфическими этапами синтеза, вероятность биосинтеза этих соединений в культуре клеток и, наконец, обратную связь между синтезом вторичных соединений с клеточной пролиферацией (Носов, 1994). Выход различных веществ in vitro можно увеличить в 10 раз и больше, по сравнению с интактным растением, но для этого необходимо разработать новые стратегии скрининга, селекции, регуляции вторичного метаболизма на всех уровнях (гены, энзимы, продукты, транспорт и компартменты), а также сопоставления вторичного метаболизма in vivo и in vitro, особенно если искомый продукт образуется в малых количествах:

Hypericum perforatum L. является традиционным фитофармацевтическим растением, экстракты которого обладают выраженной антидепрессивной (Раук, 1994; Hubner et al., 1994), а также анттаковой и антивирусной активностью (Moraleda et al., 1993; Anker et al., 1995).

Учитывая высокую потребность в физиологически активных компонентах И. perforatum - гиперицине и псевдогиперицине, в настоящее время широко исследуются возможности их получения с использованием растительных клеточных культур (Zdunek , Allfermann, 1992; Kartnig et al., 1996; Cellarova 1995). Однако, удовлетворительная продуктивность гиперицинов in vitro пока не достигнута, что обусловлено лимитированностью наших представлений как о физиологических особенностях этих культур, так и путях биосинтезов диантронов и их производных. Высокая фармацевтическая эффективность И. perforatum, как лечебного растения и ограниченность природных рессурсов приводит к необходимости изучения возможностей получения его вторичных метаболитов в in vitro условиях.

Цель^исследованяя. Основной целью настоящей работы являлось исследование возможности индукции биосинтеза гиперицина и псевдогиперицина в клеточных культурах зверобоя продырявленного (Н. perforatum L.)

Задачи иследовання. В соответствии с целью исследования в работе были поставлени следующие задачи:

1. Получение стабильных, длительно пассируемых каллусных и суспензионных клеточных культур зверобоя продырявленного {Н. perforatum ¿.)-продуцен-тов гиперицина и псевдогиперицина, а также исследование их регенерационных способностей.

2. Индуцирование и стабилизация биосинтеза гиперицина и его производных in vitro.

3. Исследование связи вторичного метаболизма с образованием дифференцированных (морфогенных) структур, а также разработка методов получения высокопродуктивных множественных побеговых культур (multiple shoot) Н. perforatum.

4. Исследование возможности получения длительно пассируемых глобуляр-

ных структур в суспензионных клеточных культурах Н. perforatum, исследование их параметров и закономерностей роста и индукции в них вторичного метаболизма.

5. Определение возможности стимулирования продуктивности клеточных культур по отношению к гиперицину и псевдогиперицину элиситорами различной природы (дрожжевой экстракт, маннан, (3-1,3-глюкан и пектин).

Научная новизна. Впервые исследовано действие элиситоров различной природы, таких как дрожжевой экстракт, маннан, {3-1,3-глюкан и пектин на стимуляцию продукции псевдогиперицина и гиперицина.

Впервые показано, что продуктивность клеточных культур по отношению к гиперицину можно стимулировать различными элиситорами, в особенности маннаном.

Впервые установлено, что исследованные нами элиситоры действуют на разные этапы вторичного метаболизма Н. perforatum, чем и обусловлен разнонаправленный эффект их действия на синтез гиперицина и псевдогиперицина.

Практическая ценность. В настоящей работе нами было разработано получение побеговых культур Н. perforatum, которые являются стабилными продуцентами гиперицинов. Разработана система получения суспензионных культур Н. perforatum в форме глобул, которые являются хорошими продуцентами гиперицинов.

Полученные результаты позволяют расширить наши знания относительно возможности стимулирования биосинтеза гиперицинов, а исследованные элиситоры могут быть использованы для получения гиперицинов в условиях in vitro.

1. Как каллусные, так и суспензионные культуры способны синтезировать гиперицин только в сложных многокомпонентных клеточных системах.

2. Наиболее перспективной по суммарному содержанию гиперицина и псевдогиперицина является суспензионнная культура с преобладанием клеточных агрегатов и глобулярных структур.

3. В исследованных системах стабилизация биосинтеза гиперицина и его производных и индуцирование вторичного метаболизма происходит при переходе культуры клеток к стадии дифференциации и при полном морфогенезе.

4. Регуляция вторичного метаболизма посредством оптимизации условий культивирования, соответствующих потребностям клеток, может приводить к повышению выхода целевого продукта как минимум на уровень, характерный для интактных растений.

5. Продуктивность клеточных культур по отношению к гиперицину можно стимулировать элиситорами, в особенности маннаном.

6. При определенных условиях культивирования и соотношении инокулюм/среда, каллусные культуры показывают способность к образованию специфических глобулярных структур. ----

Апробация работы Основные результаты и положения работы были представлены и обсуждены на заседании ученого совета Института микробиологии НАН РА (Ереван 9 сентября, 1999). Материалы диссертации были

доложены на международных и республиканских конференциях: 4th Dutch-German Workshop on Regulation of Secondary Metabolism, (Bad Herrenalb, Germany 27-29 September, 1998); Symposium zum Gedenken ar> die 100. Wieder-keher der Begründung der Gewebenkultur durch Gottlieb Haberlandt, (Wien, 8-9 October, 1998); International Symposium on Plant Biotechnology, (Kyiv, 4-8 October 1998); International Botanical Congress, (St-Louis, USA, 1-9 August 1999); 18th International Symposium Plant Essential Oils & Extracts (Digne, France 20-22 October, 1999), XIII International Congress, III World Congress in Traditional Medicine, (Lima, Cusco, Ayacucho, Peru, South America October 26-31, 1999); на 3-ей международной конференции "Современные проблемы беспочвенного культивирования растений" (21-23 сентября, 1999 Ереван); на научной конференции посвященной 80-летию ЕГУ (22-26 сентября, 1999 Ереван).

Публикации, По теме диссертации опубликовано 10 научные работы.

Место выполнения работы Кафедра биофизики, биологического факультета Ереванского Государственого Университета.

Стуктура^_о<э:ьем_дис£ертацнн, Диссертация состоит из введения, обзора -литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 154 источников. Работа изложена на 119 страницах компьютерного набора, содержит 6 таблиц и 26 рисунков. Обзор литературы обобщает современные представления о зверобое и его фармацевтическом значении, особенностях культивирования Н. perforatum в условиях in vitro, метаболические пути циклизации поликетидов и стратегические подходы получения и увеличения выхода вторичных метаболитов в суспензионных и клеточных культурах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Обьектом исследования являлся Зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.) из 3 регионов Армении.

Получение_кзлдусных_и_суспензионных_кулиур_Epsifo/atum-a.

Каллусные культуры получали из листьев, тычинок и лепестков Н. perforatum, в среде Nitsch (Nitsch, 1974), содержащей 3 мг/л тиамина, 1 мг/л биотина, 3 мг/л аскорбиновой кислоты, 150 мг/л мезоинизитола, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л фолиевой кислоты, 0,5 мг/л передоксина HCl, 6 мг/л БАП, 2 мг/л а-НУК с добавлением 6% сахарозы; в среде MS (Murashige, Skoog, 1962), содержащей 1 г/л гидролизата казеина, 2 мг/л 2,4 D, 250 мг/л мезоинозитола, 1 мг/л тиамина с добавлением 3% сахарозы, на среде MS, содержащей 3% сахарозы, 1мг/л тиамина, 250мг/л мезоинозитола, 0.5 мг/л БАП и 0.05мг/л а-НУК и в среде Schenk-Hildebrand (Schenk, Hildebrand, 1974), содержащей 0,2 мг/л кинетика, 1,75 мг/л ИУК, 1 г/л мезоинозитола, 5 мг/л никотинамида, 0,5 мг/л пиридоксина HCl, 5 мг/л тиамина с добавлением 3% сахарозы. Инкубирование проводили при 26±1°С и освещенности 200 люкс.

Суспензионные культуры получали в соответствующих средах, из свежих зеленых каллусов и из in vitro регенерированых листьев, перенося каллусы или новооброзованые листья в жидкую питательную среду того же состава. Суспензионную культуру выращивали в 100мл колбах Эрленмейера на качалке (ЭОкач/мин), под освещением 3000 люкс, при температуре 26±1° С и

относительной влажности 70%.

Определение.кинетических парамегрод,роста суспензионых клеточных

Средние диаметры глобул определяли сканированием на автоматическом анализаторе изображений 1ВА5-2 (ФРГ)- Для определения параметров роста учитывали выход свежей массы (сырая биомасса ткани). Общую массу глобул (пМ, где п-число глобул) определяли весовым методом в асептических условиях после чего глобулы возвращались обратно в питательную среду.

производных. Лиофкпьновысушенный материал (0.4-0.5г) обрабатывали хлороформом в течении 2 часов. После фильтрации и удаления хлороформа, осадок повторно сушили и последовательно экстрагировали 20 мл 80% метанола и 20 мл ацетона в течение 48 часов. Экстракты объединяли, сушили в вакуумном роторном испарителе и повторно растворяли в 4 мл метанола. Концентрацию гиперицинов определяли слектрофотометрически при 590нм, принимая коэффициент молярной экстинкции равной 43500. Чистоту гиперициного экстракта определяли флюоресцентной и абсорбционной спектроскопией. Относительное содержание гиперицина определяли принимая их суммарное содержание в интактном растении за 100%.

Флюоресцентный анализ проводили на спектрофлюориметре Р1иоготах™. Возбуждение фракций, содержащих гиперицин и псевдогиперицин, проводили при длине волны 254нм. В качестве гиперицинового пика принимали спектральный максимум - 590нм.

содержания гиперицина и псевдогиперицина проводили жидкостной хроматографией высокого давления (HPLC photodiod-array SPDM-6M system, Shimadzu, Япония), используя колонку Cosmosil 5C18-MS {4.6мм х 250мм, "Nacalaí Tesque", Япония) в градиентной системе:

А=0,5% трифторуксусная кислота в воде, В=70% ацетонитрила, 29,5% метанола и 0,5% трифторуксусная кислота. А/В градиент 50-100% в течении 15 минут, далее 100% В 25 мин, а также на установке Termo Quest (Германия), используя колонки Spherisorb ODS-2 (фирмы^дта", США) в градиентной системе: ацетонитрил (А) -вода (В), содержащей 10 мл/л ортофосфорной кислоты. Условия хроматографии: 0-4 мин - В=30%; 4-5,5 мин - В=20%; 5,5-12 мин В= 10%; 12мин и до конца В=30%; скорость элюции-1 мл/мин, температура колонки 40 °С.

Количество гиперицина и псевдогиперицина измерялись автоматически на основе площади кождого пика при 590 нм. В качестве стандартов использовали препараты гиперицина ("Biomo!", США) и псевдогиперицина ("Haemosan", Австрия). Все пики, соответствующие значениям R, гиперицина и псевдогиперицина, автоматически подвергались спектральному анализу путем сравнения со спектрами поглощения используемых стандартов по специальной программе. (Рис.1)

Приготовление злиснторов. В качестве элиситоров использовали дрожжвой экстракт (Sigma), маннан из Saccharomices cerevisiae, р-1,3-глюкан (curdlan) и пектин ("Wako Pure Chemical Industries Ltd.",Japan) и кусками пробки размерами до 2 мм ("Dainaga Cork Co. Ltd.", Osaka, Japan). Куски

Определение относительного

I I

пробки размельчали и последовательно экстрагировали в течении 4 часов при 70°С в CHCI3i повторяя процедуру 5 раз до исчезновения цветового тона в экстракте. Экстракт отделяли от остатка и выпаривали на ротороном эвапораторе и также использовали в качестве элиситоров. Остатки кусков пробки далее экстрагировали метанолом. Для этого остаток сушили и экстрагировали 4 часа при 70°С 10 раз пока экстракт станет бесцветным. После фильтрации метаноловую фракцию эвапорировали, а куски пробки экстрагировали дистиллированой водой 8 часов при 70°С 3 раза. Куски пробки фильтровали, повторно промывали несколько раз водой и сушили. Для экспериментов использовали пробочный матрикс и другие компоненты пробки, которые экстрагировались в вышеупомянутых условиях. Эти компоненты пробки растворяли в 0,2 мл этаноле и добавляли непосредственно в среду. Лиофилизированную пудру водяного экстракта непосредственно добавляли в

^Статистическая обработк

вариационной статистики с использованием критерия Сгьюдента - ст. Реальные значения радиусов (R) глобул определяли после обработки полученных данных методом сплайн интерполяции (Rump et al., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Содержание гиперицина в тканях и органах Hypericum perforatum L.

При проведении исследований процессов биосинтеза вторичных метаболитов важное значение имеет содержание интересуемого продукта в исходных эксплантатах. Поэтому на первоначальном этапе нами исследовалось содержание гиперицинов в разных органах и растениях Н. perforatum, собранных из различных регионов Армении. Как показали результаты спектрального анализа максимальное содержание гиперицинов обнаруживается в тычинках, а наиболее продуктивными оказались растения, собранные в районе озера Севан (рис.1).

Сравнительный анализ гиперицинсинтезирующей способности первичных каллусных культур, полученных из разных органов Н. perforatum показал, что по биосинтетической способности наиболее предпочтительным является каллус, полученный из тычинок.

2.0собенности роста и биосинтетические способности клеточных культур

Н. perforatum

Иницированный из тычинок Н.perforatum каллус состоял из двух основных групп клеток: паренхимных, образующих мягкий влажный каллус, и погруженных в них блестящих темно-зеленых структур, состоящих из плотных меристематических клеток. При дальнейшем культивировании клетки темно-зеленных структур пролиферировали, формируя более крупные образования -узелки. При длительном культивировании таких каллусов, в условиях интенсивного непрерывного освещения, в них происходило координированое деление клеток, составляющих уплотнение, до достижения определенной критической массы, после чего в части клеток каллуса наблюдался интесивный рост розовато-красных вакуолизированных структур.

Рис.1 А-ВЭЖХ экстракта тычинок H.perforatum. Б-срэвнитальный спектральный анализ гилерициновой фракции полученной ВЭЖХ (----) со спектором поглощения стандартного метанольного раствора гиперицина (-).

При длительном культивировании таких каллусов в условиях непрерывного интенсивного освещения, в них значительно увеличивается синтез и накопление флавоноидов, что в большинстве случаев приводило к торможению роста каллуса. При соответствующем составе фитогормоноа (1мг/л БАП; 0.5 мг/л а-НУК) на агаризованной среде, этот каллус проявляет способность к морфогенезу и образованию листовых побегов. Ацетоно-метанольная экстракция каллусов, инициированных из тычинок, выявила наличие гиперицина и его производных только в регенерирующих каллусах.

На листьях, цветках и тычинках дифференцированных растений обычно обнаруживаются скопления специфических темно-красных групп клеток, служащих вместилищами гиперицинов (Cellarova et al., 1992). Как показали наши результаты, на новообразованных листьях регенерирующего каллуса также в больших каличествах обнаруживаются аналогичные клетки, образующие вышеуламянутые вместелища - "железки". Экстракция показала, что по содержанию гиперицина и псевдогиперицина регенерированные листья не только не уступают, но зачастую превосходят интактные растения. Создается впечатление, что способность к биосинтезу гиперицина коррелирует со степенью дифернциации каллусса и регенерации дифференцированных листьев. Из полученных результатов следует, что каллусные культуры, иницированные из суспензионных культур тычинок Н. perforatum являются сложными многокомпонентными системами, а обнаруженные красные клеточные скопления увеличиваются не посредством деления, а за счет

преобразования других клеток каллуса. Кроме того, показано, что количество гиперицина не четко коррелирует с количеством оброзовавшихся "железок" (Cellarova 1995). Учитывая вышеизложенное мы постарались получить популяцию множественных регенерированых листьев с минимальним каллусом. При постоянном освещении и при сответствующем подборе фитогормонов в среде (0.05мг/л ос-НУК, 0.5мг/л БАП) удается получать культуры множественых побегов (multiple shoot). По сравнению с суспензионными культурами, каллусные или побеговые культуры, выращенные на твердых средах, на наш взгляд, не могут быть столь перспективными для получения гиперицинов в препаративных количествах. По этому молодые зеленые каллусы и побеги с высоким содержанием гиперицина повторно переносили в жидкую питательную среду. В нашем случае, получались различные клеточные линии A{.perforatum, гомогенные, гетерогенные, и с клеточными скоплениями. Химический анализ экстрактов полученных клеточных линий не подтвердил наличие в них гиперицина и его производных. Но, при субкультивирования гетерогенных клеточных скоплений, по мере увеличения их размеров, на их поверхностях образовывались красные клеточные скопления. В последствии эти клеточные агрегаты формировались в компактные глобулярные структуры, где основную биомассу составляли зеленые клетки с погруженными в них красными клеточными скоплениями. Химический анализ экстрактов этих глобулярных структур подтвердил наличие в них гиперицина и его производных

Таблица 1

Суммарное содержание (мкг/r сухого веса) гиперицина (Гип) и псевдогиперицина (Псгип) в тычинках и различных клеточных системах И. perforatum._

Псгип+ Гип* Псгип/ Гил* Псгип+ Гип** Соотношение к интактному растению**

1 Тычинки 540±40 2,00 510+40 1.00

2 Первичный каллус 18+1 1,71 10+3 0.02

3 Суспензионная культура 19±3 0,95 14+2 0.03

4 Глобулярные структуры 473+40 8,40 460+50 0.90

5 Морфогенный каллус 576±50 0,71 560+60 1.10

6 Регенерирующий каллус 45О±50 2,69 460+30 0.90

7 Регенерированные листья 927±20 2,15 870+100 1.70

Примечание:

* =ВЖЭХ анализ ** = Спектрофотометрические данные

В таблице 1 приведены результаты по суммарному содержанию, а также соотношению гиперицин/псевдогиперицин мкг/г сухой массы во всех исследованных системах. Как видно из таблицы, обнаруживается хорошее соответствие между результатами, полученными спектральным методом и

вэжх.

Из полученных результатов следует, что суспензионные культуры клеток способны к биосинтезу гиперицина только в сложных многокомпонентных системах, каждый компонент которой вероятно выполняет определенную роль в процессе биосинтеза. Таким образом, разные клеточные культуры Н. perforatum показывают неодинаковую способность к биосинтезу гиперицинов.

Если в первичном каллусе и суспензионной культуре обнаруживаются лишь следовые количества гиперицина и псевдогиперицина, то в глобулярных структурах и регенерирующих системах их содержание практически достигает 560мкг/г с.в., а в регенерированных листьях даже превосходит содержание в интактных тканях в 1,7 раз. Любопытно отметить, что в различных клеточных культурах варьирует также соотношение гиперицин/псевдогиперицин. Так, если в морфсгенном каллусе содержание псевдогиперицина меньше гиперицина в 1,4 раза, то в глобулярных структурах, наоборот, превосходит содержание гиперицина в 8 с лишним раз (таблица 1).

З.Действие элиситоров на биосинтез гиперицинов в клеточных культурах

Н. perforatum

До сих пор остается неясным, какой из общепринятых механизмов предпочтителен для стимуляции биосинтеза диантронов. Полученные нами суспензионные культуры Н. perforatum были использованы в качестве модельной системы для изучения действий элиситоров, таких как дрожжевой экстракт, маннан, р-1,3-глюкан, пектин и пробковая ткань, на стимуляцию биосинтеза псевдогиперицина и гиперицина.

С этой целью плотные, зеленые структуры из каллусных культур Н. perforatum были повторно пассированы в жидкой среде, в присутствии различных элиситоров.

Было показано, что биосинтез как гиперицина, так и псевдогиперицина ингибировался дрожжевым экстрактом в пределах концентрации 1-8 мг/мл. С другой стороны, клеточный рост не ингибировался.

По сравнению с дрожжевым экстрактом, дрожжевой маннан при концентрации 0,1 мг/мл стимулирует продукция псевдогиперицина 0,82 мг/г сухого веса почти в 4 раза по сравнению с контрольными культурами (0,19 мг/г). К тому же, продукция гиперицина (0,04 мг/г сухого веса) при концентрации 0,1 мг/мл маннана была почти в 2 раза выше по сравнению с контролем (0,02 мг/г сухого веса). Необходимо отметить, что выход гиперицина (0,82 мг/г сухого веса) является достаточно высоким показателем для in vitro культур, по сравнению с результатами других авторов (Karting et al., 1996; Cellarova et al., 1995; Zdunek, Alfermann, 1992).

Р-1,3-глюкан (0,1 мг/мл) также оказывает некоторое стимулирующее действие (около 2,5 раз) на продукцию псевдогиперицина. Однако этот стимулирующий эффект по сравнению с маннаном выражен слабее. Эффект действия Р-1,3-глюкана на биосинтез гиперицина не был обнаружен. Пектин, тоже стимулирует продукцию псевдогиперицина, но гораздо слабее (почти в 1,8 раз), а на продукцию гиперицина не влияет (табл.2).

Необходимо отметить, что ингибирующий эффект всех исследованных элиситоров при концентрации 0,05-0,5 мг/л на рост клеточных культур не выявляется. Во всех экспериментах получалось большое количество биомассы (около 20-22 гр сухого веса на литр).

Экстрагируемые водой и органическими растворителями компоненты пробковой ткани не показывали ощутимого стимулирующего действия на продукцию псевдогипеицина и гиперицина. А при добавлении пробкового матрикса от 1 до 4 мг/мл выход псевдогиперицина увеличивается пропор-

ционально концентрации последнего. Предполагается, что прямой контакт между кусками пробки и культурами - необходимое условие для триггеринга биосинтеза гиперицина. Необходимо подчеркнуть, что куски пробок не адсорбируют гиперицины, хотя они увеличивают продукцию псевдогиперицина в культурах.

Таблица 2

Изменение содержания гиперицина (Гип) и псевдогиперицина (Псгип) мкг/г

Элиситор Концентрация Выход Соотношения Выход Соотношения

элиситора (мг/мл) гиперицина мкг/г к контролю (Гип) Псевдогипери цина мкг/г к контролю (Псгип)

0 23 - 194 -

0.005 11 0.47 253 1.30

Маннан 0.01 14 0.60 274 1.41

0.05 19 0.82 416 2.14

0.1 49 2.13 822 4.23

0 21 - 194 -

0.05 23 1.09 296 1.52

Пектин 0.1 30 1.42 349 1.79

0.5 25 1.19 287 1.47

1 23 1.09 253 1.30

0 23 - 194 -

0.05 20 0.86 327 1.68

Р-1,3 0.1 21 0.91 410 2.11

Глкжан 0.5 21 0.91 438 2.25

1 23 1 525 2.70

0 53 - 136 -

1 , 56 1.05 111 0.80

Пробка 2 58 1.09 193 1.41

3 56 1.05 283 2.08

4 49 0.92 377 2.77

5 47 0.8 205 1.51

Если принимать, что главная функция вторичного метаболизма для интактного растения - экологическая, практически невероятно, чтобы эти соединения имели функциональное значения для пролиферации клеток. Отсюда следует, что при наличии только главной функции вторичного метаболизма он должен практически отсутствовать в процессе культивирования in vitro (Носов, 1994). Однако появление или интенсификация вторичного метаболизма как было показано выше, возможно в культуре клеток под действием сигналов, запускающих вторичный метаболизм в интактных растениях. Более того продукция гиперицина и псевдогиперицина у Н.perforatum в природных условиях зависит как от генетических факторов, так и от условий окружающей среды (Buter et al., 1998). Использование в качестве элиситоров коммерческого дрожжевого маннана, Р-1,3-глюкана, цитрусового пектина и пробки подтверждает данное предположение. Было показано, что продуктивность клеточных культур Н. perforatum-а по отношению к гиперицину можно стимулировать элйситорами, в особенности маннаном и пробковой

12 1 » тканью. Показано также, что стимулирующий эффект пробковой ткани обусловлен высокомолекулярными нерастворимыми компонентами матрикса.

Кроме того, из наших результатов следует, что исследованные нами элиситоры действуют на разные этапы вторичного метаболизма, чем и обусловлен разнонаправленный эффект их действия на синтез гиперицина и псевдогиперицина.

4. Кинетические закономерности роста глобулярных структур в суспензионных культурах Н.рег?огаШт

Суспензионные культуры высших растений, при определенных условиях культивирования, образуют круглые компактные клеточные агрегаты размером от нескольких мм до 2-3 см, которые в литературе зачастую называют глобулярными структурами (Уегроог1е 1996, Хи е1 а1., 1999). Глобулярные суспензионные культуры которые имеют некоторую степень тканевой и клеточной дифференциации, считаются чрезвычайно перспективными как для получения больших биомасс, так и увеличения выхода вторичных метаболитов.

Для клеточных культур растений модели образования и роста глобулярных структур практически отсутствуют. Не известны также факторы, определяющие формирование глобулярных структур. По-видимому в данном случае имеет значение как количество и физиологическое состояние посевного материала, так и состав питательной среды и условия культивирования.

Для анализа роста таких культур особенно важна кинетика образования глобул. При этом учитывается тот факт, что на кинетику роста глобул должны оказывать влияние их размеры, морфология и внутренняя структура. Полученные глобулы представляли собой сферические образования на поверхности которых образовывались множественные мелкие дифференцированные структуры, а биомасса в стенках глобулы настолько компактна, что поступление и потребление субстрата в глобуле лимитируется его диффузией. По мере роста глобулы в ней образуется внутренная полость, (эти структуры внешне напоминали форму малины), что обеспечивает двухстороннее проникновение субстрата внутрь стенки глобулы (рис.2).

Учитывая эту модель, можно сказать, что наружный радиус (Я) глобулы растет за счет утолщения стенки (о) и нарастания внутренней полости (г).

Я0)= © (1)+г(1) (1) Как известно, рост биомассы в форме глобул следует закону (Перт 1978) Рис.2 Модель поперечного (пМ,)1/ = |а+(пМ0) ,/3 (2), при

сечения глобулы. Я-радиус к=(4/Зтфп),/3ц® (3)

глобулы; г- радиус внутреннои 1 ' * .' ^ к '

полости; а-толощина стенки гДе Р " плотность биомассы, ц- удельная глобулы. скорость роста глобулы а в - толщина стенки

глобулы к - коэффицент роста биомассы.

С другой стороны г, = )1ю1+ г0 (4) (Перт, 1978) принимая что г0=0 у исходной каллусной культуры, из уравнений (3) и (4) получаем: г, = к1/(4/Злгл),/3 (5)

Нами исследовалась также зависимость основных ростовых параметров (ц,

к) от соотношения инокулюм : среда. Максимальное значение ц достигается при соотношении инокулюм : среда = 1:5. Из полученных результатов следует также, что рост глобул осуществляется в основном за счет увеличения интерглобулярного пространства (г), а толщина стенок глобул (ю), по достижении определенной величины, (0,22-0,28см) в дальнейшем не увеличивается (Рис. 3).

Если глобулярные структуры представляют собой замкнутое сферическое образование биомассы с внутренней полостью, не имеющей контакт с окружающей средой, то упаковка глобул может быть настолько плотной, что любой путь, кроме поступления субстрата внутрь через стенки глобулы станет невозможным. В этом случае рост глобул может осуществляться только за счет роста поверхностных клеток. В нашем случае было обнаружено, что образование глобулярных структур происходило только если исходный каллус не имел рыхлую структуру, а размеры инокулюма были определенной величины. В рассматриваемой нами модели толщина стенок глобулы (со) также достигает некоторой оптимальной и постоянной величины. Лимитирущий фактор толщины клеточных стенок можно объяснить возможностями диффузии субстрата, что также приводит к аналогичным результатам, однако имея в своей основе совершенно иную причино-следственную связь.

На следующем этапе нами исследовался рост глобулярных структур при

т 0,06

40 60

Дни культивирования

Рис.3 Изменение основных параметров роста глобулярных структур Н.ре^огаМт-а при субкультивировании. Соотношение инокулюм среда 1 /5. Примечание: г-р )-радиус внутренней полости (см); ц-(о)-удельная скорость роста;к- ( коэффициент роста биомассы; га-(«)-толщина стенки глобулы (см); Стрелками показаны

время пересевов

длительном пассировании и, при периодическом субкультивировании, в оптимальных условиях роста. Результаты этих экспериментов приведены в на рис.3. Как видно из рисунка, динамика роста интерглобулярного пространства подразделяется на два этапа: период роста - первые 30 дней и период стабилизации - 30 дней и далее. Стабилизация величины интерглобулярного пространства объясняется как лимитирующим фактором толщины клеточных стенок, так и механическими возможностями самой глобулы. Об этом свидетельствует также достаточно стабильная толщина стенок глобулы.

Таким образом, из наших результатов следует, что при длительном пассировании глобулы достигают некоей максимальной величины, а дальнейший рост биомассы осуществляется только за счет увеличения числа глобул. Образовавшаяся биомасса легко отделяется от среды, а при сохранении оптимального соотношения инокулюм : среда выход биомассы значительно превышает выход биомассы, получаемой на твердой среде и в гомогенных суспензионных культурах, что делает их переспективным для использования в биореакторах.

Из вышеизложенного следует, что использованные нами методы и методические подходы позволяют получать в ¡п уИго условиях гиперицин и псевдогиперицин в количествах сопоставимых с их содержанием в природных условиях. При этом в каждом конкретном случае преимущественным является использование того или иного метода. В общем эти методы можно подразделить на три основные направления: 1)культиврование в биореакторах; 2)культивирование в фитотронах; 3)использование элиситоров. Для культивирования в биореакторах предпочтительным является использование глобулярных структур, которые позволяют резко увеличивать как выход биомассы, так и содержание гиперицинов. Для культивирования в фитотронах предпочтительным является использование лобеговых культур, которые

Minutes

Рис. 4 ВЭЖХ экстракта важнейших вторичных метаболитов множественных побеговых культур H.perforatum.

характеризуются не только очень высоким содержанием гиперицинов, но и позволяют в условиях максимально приближенных к природным, синтезированть весь спектр вторичных метаболитов (Рис. 4). Последнее представляется чрезвычайно важным, поскольку в нестоящее время показано, что фармокологическая активность экстрактов зверобоя во многом обусловлена наличием в них других вторичных метаболитов, в частности гиперфорина (Singer A., et al., 1999).

15

ВЫВОДЫ

1. Как каллусные, так и суспензионные культуры способны синтезировать гиперицин и псевдогиперицин только в сложных многокомпонентных клеточных системах, обладающих способностью к морфогенезу и регенерации.

2. В исследованных системах индуцирование и стабилизация биосинтеза гиперицинов происходит при переходе культуры клеток к стадии дифференциации.

3. Выявлено, что в новообразованных регенерирующих листьях формируются в большом количестве многоклеточные структуры-вместилища с высоким содержанием гиперицина, суммарное содержание которых значительно превышает содержание в интактных тканях.

4. Из суспензионнных культур наиболее перспективной по суммарному содержанию гиперицина и псевдогиперицина является культура с преобладанием клеточных агрегатов (глобулярных структур).

5. Впервые показано, что продуктивность клеточных культур по отношению к гиперицину можно индуцировать элиситорами, в особенности маннаном, а также выявлено, что стимулирующий эффект пробковой ткани обусловлен высокомолекулярными нерастворимыми компонентами матрикса.

6. Выявлено, что исследованные нами элиситоры действуют на разные этапы вторичного метаболизма, чем и обусловлен разнонаправленный эффект их действия на синтез гиперицина и псевдогиперицина.

7. Предложенные методические подходы могут быть использованы для индукции вторичного метаболизма как соединений получаемых путем циклизации поликетидов, так и метаболитов, биосинтез которых связан с образованием специальных железистых структур.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Vardapetyan H.R, Charchoglyan AG., Hovanissyan A.A., Kirakosyan A.B., Tiratsuyan S.G. Biosynthesis of Hypericin and Pseudohypericin in Cell Cultures of Hypericum perforatum L. // 4111 Dutch-German Workshop on Regulation of Secondary Metabolism, Bab Herrenalb.- Germany.- 1998,- P.21.

2. Vardapetyan H.R, Charchoglyan A.G., Hovanissyan A.A., Kirakosyan AB., Tiratsuyan S.G. Investigation of in vitro Biosynthesis of Hypericin and its Derivatives in Cell Cultures of Hypericum perforatum // Symposium zum Gedenken an die 100. Wiederkeher der Begründung der Gewenbekultur durch Göttlieb Haberlandt.- Wien.- 1998,- P. 54.

3. Vardapetyan H.R, Charchoglyan A.G., Hovanissyan A.A., Kirkosyan A.B. Tiratsuyan S. G. Production of Hypericin and Pseudohypericin in cell cultures of Hypericum perforatum L. International Symposium on Plant Biotechnology.- Kyiv.-1998.-P.27.

4. Kirakosyan A.B., Vardapetian H.R, Charchoglyan A.G.. Charchoglian AA. Initiation of Different Organs Cultures of Hypericum perforatum and Obtaining of Hypericin//International Botanical Congress- Saint Louis.- 1999.- 4.18.6.- p.54.

5. Armen Charchoglyan Use of nurse cultures to select for high productive cell lines for H. perforatum ancl B. alba Jl International Botanical Congress.- Saint Louis.-1999.-4.18.6,- P.55.

6. Rabier J., Charcluiglyan AG., Mevy J.P., Viano J., Production of Hypericin and Pseudohypericin in Shoot Cultures of Hypericum perforatum L. Under Several Light Tretments // 18th International Symposium Plant Essential Oils & Extracts in Digne 1999.- P. 29

7. Чарчоглян А.Г., Вардапвтян Г.Р., Киракасян А.Б., Оганесян А.А.

Биосинтез и Аккумуляция Диантронов в Клетках Hypericum perforatum II в сб.: Доклады и тезисы 3-ей международной конференции "Современные проблемы беспочвенного культивирования растений" посвященной 90-летию со дня рождения Г.С. Давтяна Ереван, 1999, С. 91

8. KirakosyanA.D., CharclioglyanAG., Vanlapetyan H.R., WrightМ.А. Hypericum perforatum: in vitro Cultures and Their Perspectives // ХЩ International Congress, Ш World Congress in Traditional Medicine, (Lima, Cusco. Ayacucho, Peru, South America) 1999,- P.245-248

9. Киракосян А.Б., Вардапетян P.P. Чарчоглян А.Г. Содержание Гиперицина и Псевдогиперицина в Клеточных Культурах Hypericum perforatum L. // Физиология растений - 2000.- Т.47,- N2.- С.302-306

10. Ara Kirakosyan, Iliroaki Huyushi, Kenichiro Itwue, Armen Charclioglyan and Hracliik Vardapctyan Stimulation of Hypericin Production by Mannan in Shoot Culture of Hypericum Perforatum U Phvtochemistry.- 2000,- V. 53/3,-P. 345-348.

UWDilOliaM1

Pniuiuljuitt iriuqmü uiühyun bplipnpjpujlitt übinuipni]iinühpli uunugnitfg in vitro ujuijiiuiCQtijiniii diuüiuOmljiuljlKj ljbGuiuinbJiiGnpiq]aujli IjiwpbnpuiqmjG miprpnpjiiiGGbptiç) iShljfi t: bpljpnpipujJiG übuiuipniliuiGbpli niumiiG.uiulipinpjm{i|i in vitro P2?iuj}i(i l)in\im]ipuilib}i:m\5 üupuumnuS t tfji ¿uipp 0]i[i(im^unJmrpjMÜQhpli puiguihuijuiiiuiGp, }iû^u|[iujip bG bpljpiipquijJiG U unnugQuijJifi ühuiuipnj^inßhpji IjüQuuiujiüphwlili iîiuGumiiupliGbpli m Gpuittg îjmjuujqiupà ljiiiuj[i puigtiihuijmiiiiip, Jiü^mliu BtuU hGiupim{u[uiipjaiG t umU^ôniiî nuppipqijuiir Ijbpupul nblpuiliuphi b uuimQiui ijb ipu qnpfnu Ipu G iup<fhp GbplpiijiugGim Gjnipbpli uJiQpbqp:

ll2juiuiniiiQp|| lii{|ijuliii(> t Hypericum perforatuni-\i pjjiujJiü IjmpiunpiuGbpmtf l|iujbplig[ittji I u[uUiinliliu|bp]ig|iQ]i libliuuiujiQphqliii: 1ijipiuni[b[ hü tffi 2UII1P qliinmlpuG tfnmbgmii&bp uiju bjilipri[U|iuj]iQ dhuiiupii|]iiiiGhp]i b]pp tfkdmgGhpii Gu[uiuiuilini|: H. perforatum--^ ipupbp 2'U]miliuil[ oquimqnpöijmi qbipuprnju t, np}i tpumpiuljinChpIi piupdp lmiliimibuiphu]u| liuiuit(mpjiiiü[i [jp i|pui t uUhnb[ ljbttuiuinbluüiiinqQbp}i n^iuqpnipjniGp' umui^liG uj|uiG ûqlipn] Gjmi puiipjuijpmüiuuhp]i l[bGuuimti]uÜB[iiq[iuilluiCi hipiiGuiliniJ uuiiugüuiG i«QIipautb2uuupjinßp:

fliunnJGuiuJipi|h[ U gaijg t uipijb], iip lijuqbpjiglittßbpli l[bSumu]iGpbqp in vitro IpuiiniuuijJiG Ijiiiiuimpiutthiuiii! IjiufmJmi) t lpK]|nii^iiibqhGhpuigluujJimGuitjnipjinGlLg U uiuui]ifiiu&jig: Uju CijniphpJi l|h[iuumliGpbq[i Iiuiihup iuGlipw(tb2Ui t npii2Uil}Ji pglijGbpJi uinliuijnipjiuG, npnGp u|iüpbquuS b Ijminuilpuil bü hliujbpligliüübpp, jiulj ¿qli^hpbQgiluifr P2?uij[iG limiuimpiufibpp, upmbi] ¿IpuG iJhpjili]i2Jnq pjjuijP LpiinnigiJuiiipGbpii, [îGipuGmlj ¿bG JipuitpuGuigübi li]LiqbpjigJiGttlîp|L IjüGuiuuliGpbq: ônijg t in[ii|bk np Lbquili üJijmiliujpuiü mini) H.perforatiun-Ji pgguijliG qppmuuip vuqpbquiuiGbpp GmjGujbu mttbG ij]i.rJ)tijitiGglîuitt npii2Uilj]i uiuinlifiuitt b upupniGuiljiutf bft li]iu)bp]ig[iGGbp u[iGpbqnii pjligGbp: fliumüGumliptlb^ btt tujij. qpipiniGbp{i uifiji lj{lGliU)]iIj giuguiGJ^Gbpji:

lT]i 2iupg llJiuJiuiiijiGhpJi (JuüupiuuGlpujJitt tpuuiptulpn, fui5upuiuGl[iiij]iG üuiGGiuG, ß-1.3 quailpuQ, uihljmJiG, JuqiuGiuj[iG hjiumluiöj) U uijiG) [upmGnq iuqtj.bgiiipjuiG inunulGiuujipmpjmGp Iiliiqbp]igJiG]i b ujubiphJiuibpligliGli i|pui gmjg t imlbj, np JuünpwuGlpjuj{iG tpuul]iiul]ui{i ¿1110)1 ¡iipuiGni| uiqnbgmpjniû, puijg Gpiuttjig uiGgunjuJuic» tfiuGGiuGp Jupiuttniü t h]iujhplig]iG[ibmubijiihliuibpIigliGJi IjbGuxuuIiGphqp in vitro IpiiuinipiuGbpiiui: ß-1.3 qynilpjjûp, u|blpji]iGp, JugmGuijliG hjiuuijuiirpp JupiuGmiî bG üliuijG u|ubijjihliuibplig[iQli IjbQuiuuliGpbqp ¿iuqqbpii[ liJiu|hpligliQli I|bGuiuu{i5pbq[i i[pm: