Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Получение гаплоидов в культуре пыльников некоторых видов из родов TRITICUM и AEGILOPS и их характеристика

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Получение гаплоидов в культуре пыльников некоторых видов из родов TRITICUM и AEGILOPS и их характеристика"

Р Г Б к&йюкий ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

„ П Ч^П i0,r-5

На правах рукописи

ХА1УН ФАТЕМА

УДК 633.11 : 631.521: 575

ПОЛУЧЕНИЕ ГАШ10ВДОВ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ НЕКОТОРЫХ ВЗДОВ ИЗ РОДОВ ТЯ1Т1СИМ И Л EG 110 PS И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА ■

Специальность 06.01.05 - селекция и

семеноводство

Ав тореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Краснодар, 1995

Работа выполнена в Краснодарском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте сельского хозяйства им.П.П.Лукьяяенко в 1990 - 1993 гг. и на кафедре селекции и семеноводства Кубанского государственного

кандидат с.-х.наук, профессор ЕФРЕМОВА В.Б.

кандидат биологических наук ИВАНОВ Г.И.

доктор биологических наук,профессор ДЗЮБА В.А.

кандидат биологических наук ОБРАЗЦОВ И.О.

Краснодарский НИИ овошного и картофельного хозяйства. .

Защита состоится " 25 " мая 1995 г. в 9.00 час. на заседании диссертационного совета Д 120.23.02 при Кубанском государственном аграрном университете.

Адрес: 350044, г.Краснодар, ул.Калинина, 13,ученый совет КГАУ. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГАУ. Автореферат разослан апреля 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета с.-х.наук, доцент

аграрного университета. Научные руководители

Официальные оппоненты:

Ведущее предприятие -

кандидат

^(¡^ ЕФРЕМОВ А.Е.

I. 0Б1ДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Акт^альносгь_иесле,дований. Для успешного осуществления современных программ селекции пшеницы важное значение имеет проб -лема поиска методов создания исходного материала.

По мере возрастания требований к новым сортам и интенсифи -кации селекционного процесса возникают и трудности решения ря -да селекционных проблем с подошью одной лишь внутривидовой гибридизации. Возможности этого метода ограничены генетическими ресурсами самого вида .Часто этих ресурсов недостаточно для улучшения таких признаков, как им^нитчт к болезням, зимостойкость .качество зерна и др.

Одним из перспективных направлений расширения генетической изменчивости пшеницы является путь привлечения растительных ресурсов ее диких и культурных сородичей. Среди важных в агроно -ыическом отношении признаков у сородичей пшеницы обнаружены:ус-тойчивость к грибным и вирусным болезням, вредителям, засухе , полеганию, 'повышенное содержание белка и др. (Тютерев С.Ji. и др., 1973, Якубцинер Ы.М., 1969, Je£drr?QH M.j ЕЛ981).

Однако этим решение проблемы исходного материала не огра -ничивается. Первоочередной задачей на современном этапе селекции пшеницы становится разработка методов передачи полезного чужеродного генетического материала в геном ппеницы. Селекционеру для выведения нового сорта важно иметь наряду с исходным мате -риалом и представление об оптимальном пути передачи определен -ного гена новому сорту. Эту работу можно осуцествить с помощью культуры пыльников, что позволит сократить сроки выведения сор -тов на 3-4 года. Решение таких задач позволяет вовлечь в селек -ционный процесс все разнообразие диких видов и расширить гено -фонд пшеницы. Исследования проведены в соответствии с планом НИР КНИИСХ, № госрегистрации 01910041559.

• Цель и задачи исследований. Основной целью данных исследо -ваний является изучение закономерностей морфогенеза в культуре пыльников некоторых видов из родов и 1

разработка методов получения андрогенетических гаплоидов Т'¿¿6сС.и/77 и .

Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние геномного состава представителей родов ¿¿¿-'$-¿///7 к на выход каллуса и регенерацию рас -

тений в культуре пыльников.

2. Исследовать влияние условий выращивания донорных расте -ний на частоту каллусообразования и регенерацию растений.

3. Определить уровни плоидности растений - регенврантов.

4. Цитозмбриопогически изучить развитие каллуса из ыикро -спор в процессе культивирования пыльников на питательной среде.

5. Провести исследования по оптимизации компонентов.пита -тельной среды с целью максимального получения каллуса и реге -нерантов.

Цаучная новизна исследований. В кулмуре пыльников, испольг зуя различные виды ¿/^¿^-¿Зуй-, впервые в Российской

Федерации были решены следугаие задачи:

- установлена закономерность влияния геномного состава диплоидных, тетраплоидных и гексаплоидных видов и

на частоту каллусообразования и регенерацию растений;

- проведено сравнительное изучение условий выращивания до -норных растений на каллусообразование и регенерацию растений-В' культуре пыльников и на дан -ном наборе образцов;

- определены размеры замыкашшх клеток устьиц у видов 7с.

^ Л, Ю&йЪи^е, УеяЪисМси с цельо иденгифи -

тции по плоиднЪсти растзний-регенерантов;

- выявлено, что жизнеспособность микроспор у 12 видов J<u£lt?zi/r? и резко падает на первой неделе культивиро -эания их на питательной среде;

- найдены пути регенерации некоторых видов Tbiiteitsr? и

в культуре пыльников;

- определены оптимальные концентрации и сочетание ростовых зешеств в питательных средах, которые могут увеличивать частоту каллусообразования и выход регенерантов в культуре пыльников,что позволит повысить эффективность получения гомозиготных линий.

Практическм_ценность_рабо ты. Выявлены виды ItiitG^^ и 'ilet^L-Spp-i, (Тетрабеотикум, Кихары, дикая араратская, Тимофеева, Эребуни,^, И^г^ЗР/^ Jk. С-уИшс/пссС), обладающие по -вышенной частотой образования каллусов и регенерантов. Дигапло -идные растения указанных видов рекомендуется использовать в ка -честве исходного материала в программе межвидовой гибридизации с целью улучшения пшеницы.

Разработаны оптимальные сочетания и концентрации ростовых веществ для максимального выхода каллуса и регенерантов на жид -кой, питательной среде fht -2 в культуре пыльников пшеницы Урарту 363363 и пшеницы Эребуни.

Апробация_работы. Результаты исследований докладывались .на заседаниях кафедры селекции и семеноводства и на научных конфе -ренциях агрономического факультета Кубанского государственного аграрного университета в I99I-I994 гг.

Цубяикация_даботы. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 2 находятся в печати.

Ст2укщра_и_об;ьем_работы. Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 18 рисунков. Дис -сертация состоит из введения, краткого обзора литературы, уело-

вий, материала и методики исследований, экспериментальной части, выводов и приложений. Список литературы содержит 265 источников, в гом числе 195 зарубежных авторов.

2. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТСДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Вырашвание донорных растений проводилось в полевых условиях и в теплице Краснодарского НИИСХ им. П.П.Лукьяненко.

Почвы КНИИСХ представлены западно-предкавказскими выщелоченными черноземами. Среднегодовая сумма осадков составляет 604 -607 ыы. За годы испытаний погодные условия для возделывания пшеницы были типичными для района и вполне удовлетворительными.До -норные растения в теплице выращивали при температуре 14 °С ночью и 20 °С днем с освещенностью 30 тыс.люкс при 16 - часовом фотопериоде, которые соответствовали оптимальным условиям для пшеницы.

Материалом для исследования служили 38 образцов различных

видов пшеницы и эгилопсов из коллекции КНИИСХ: Тс. игмг1и^

I 71 упопосссс.иу??; Гра€-/??оь-ае^ Т.Ысасоош/?

7, Т. ЬеЬжво^оЬссиитг^ Т, Г^агэд^^, ^

ъс^аъ-гся^ Ле, Ле. уа

(^(^¿^ггЫ^^ е^?, Со-та&а и «р.

Срезанные побеги подвергались обработке холодом при температуре + 5 °С в течение 7-14 дней. До инокуляции пыльников колосья подвергали стерилизации 0,1 % раствором диоцида в течение 15 минут с последующей прошвкой их дистиллированной и автоклавиро -ванной водой.

Пробирки с инокулированными пыльниками выдерживались в термостате при температуре + 32 °С в течение 5 суток. После этого пробирки помешали в ростовую камеру при температуре + 26 °С без

эсвещения, где они находились около месяца. Потом их выдержи -вали в камере с 14-часовым фотопериодом освещенностью 10 тыс. люкс при температуре 18 °С круглосуточно.

Для культивирования пыльников использовали питательную сроду Ро± -2 (СЯи б. в. ,1978, Ч'си^ Йи На,п- ,1984) .За время культивирования проводили два анализа: первый - на 30-й и второй - на"60-й день. Среду Иурасиге и Скуга Т. 1

ъЬоо^ т, ,1962) использовали для регенерации растений из каллуса и змбриоидов, полученных в культуре пыльников. Во время культивирования каллусов и змбриоидов наблюдения проводили один раз в неделю в течение 2 месяцев.

Для изучения влияния условий выращивания донорных растений на изменчивость признаков использовали метод дисперсионного анализа.

С целью идентификации растений - регенерантов по плоидности (гаплоиды и дигаллоиды) подсчитывали число их хромосом в клет -ках кончиков корешков ( У, , 1965), а также измеря-

ли длину замыкающих клеток устьиц ( Ху Даофен и_д р., 1991).Данные опыта подвергали статистической обработке.

Для определения жизнеспособности микроспор использовали 12 различных видов пшеницы и эгилопсов.

Для увеличения частоты каллусообразования и растений-реге -нерангов в культуре пыльников проводили исследования по опти -мизации питательных сред с использованием методов дробного и полного факторного эксперимента.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Изучение видовых особенностей каллусо -образования в культуре пыльников пшеницы и эгилопсов

Из 38 изучаемых видов каллусы образовали только 25. Частота

каллусообразования изменялась от 0,0 до 28,3%. Анализ трех -летних данных показывает, что пыльники, полученные из растений выращенных в поле, характеризуются более высокой частотой каллусообразования. Максимальная частота каллусообразования (28,3% была у Полбы дикой - араратская 31628. Мы установили, что в образовании каллуса решающую роль играют генотип и условия выращивания донорных растений. Средняя частота каллусообразования из донорных растений, выращенных в поле в 1991 г. была в 2,2 раза выше, чем репродуцированных в теплице и в 1,5 раза она была больше, чем в 1992 г. (табл.1).

3.2. Регенерация растений из гаплоидного каллуса у представителей родов пшеницы и эгилопсов

Из 25 видов, образовавших каллус, регенеранты были получе -ны у 17. Причем среди них не все виды регенерировали зеленые растения (табл.2). "По первой группе геномного состава наиболь -нее число каллусов получено у пшеницы Гетрабеотикум 267963.Частота образования зеленых и альбиносных регенерантов составляла, в 1991 году 61,6 % и 33,3 %, а репродуктивных пыльников - толь ко 19,6 %.

Во второй группе все три вида показали хороший выход реге-нерантных растений. Среди них максимум регенерантов получен у вида пшеницу Кихары 47897 - 134 % в 1991 году. Выход зеленых и альбиносных растений у этого вида был 76 % и 58 % соответственно, а репродуктивных пыльников - 44,7 %. В третьей группе об -разование регенерангных растений было больше у ¿/¡2. У&нЬгСееба, 196, что составляет 58,3 % зеленых и 31,2 % альбиносных расте -ний. Частота репродуктивных тальников была 14,3 %.

Анализ способности регенерации растений при различных уело

Таблица I

Образование змбриоидов в культуре пыльников пшеницы -и эгилопсов при различных условиях выращивания донорных растений,%

:__Услдвия_вырааиван1м___

Ьид, сортообразец :поле 51991 : тепли-:ца : поле :1992г. : среда :НС£05

:г. 1.1991 г ^ •

Пшеница Урарту 363363 7,0 4,3 .7,0 6,1

363364 3,3 5,7 5,7 4,9

Однозернянка культурная 98203 0,7 1,3 0,0 0,7

Пшеница Синской 3,3 0,0 1,7 1,7

ф 452 2,3 1,0 3,0 2,1

Полба Двузернянка 15840 1,7 0,0 5,0 2,2

Пшеница Тургидум 41930 0,7 0,3 0,0 0,3

Пшеница Эфиопская 192061, 3,0 0,0 1,0 1,3

Пшеница Синскоураргикум 8,7 3,0 4,4 5,4

Пшеница Эребуни 5,0 5,3 7,3 5,9

Пшеница Палмовой 8,0 2,7 0,3 3,7

Пшеница Тетрабеотикум

267963 20,0 ■ 17,3 10,9 16,1

Пшеница Петропавловского

51433 0,3 0,3 0,0 0,2

Полба дикая араратская

31628 28,3 5,4 2,7 12,1

Пшеница Тимофеева 29540 6,0 4,7 2,0 4,2

Пшеница Кихары 47897 22,3 9,7 21,7 17,9

¿е. аотисШа. 642 8,3 2,0 4,8 5,0

206 Ле, \/еиЬгС<и>4а~ 196 19,0 3,7 9,3 10,7

10,3 5,0 8,7 8,0

Полба дикая араратская

30216 ' 6,4 7,3 1,7 5,1

Пшеница Беотикоурартикум 2,3 0,0 3,0 1,8

Пшеница Синскобеотикум 0,0 0,3 2,4 0,9

Пшеница Твердая 43310 ' 4,1 0,0 1,0 1,7

Пшеница Карамышева 28205 3,9 0,0 • 1,0 1,6

Пшеница Тимофеева 46881 3,9 0,0 1,3 1,7

Среднее, НСР05 =2,2 7,1 3,2 4,8

вкяк выращивания донорных растений показывает,что лучшими ва риантами являются естественные условия.

На основе полученных данных можно сказать, что регенерация ' растений находится под. контролем генотипа. Норма реакции гено -типа по этому признаку зависит от агроклиматических условий, в которых выращивались донорные растения.

Результаты наших исследований впервые дают основание реко -. мендовагь в качестве доноров признака каллусообразования и ре -генерации растений следующие виды: пшеница Тетрабеотикум 267963, пшеница Кихары 47897, Полба дикая араратская 31628, Уг-Ик^Ша 196, е^Вьп&г^й 206.

3.3. Определение плойдности растений-регенерантов, полученных в культуре.пыльников, по длине замыкающих клеток устьиц

Общепринятые методы определения плоидности растений с по -мощью подсчета числа хромосом в давленных препаратах кончиков корня под микроскопом ^являются сложными и трудоемкими. Поэтому

большой интерес представляет косвенный метод определения плоид- ,

\ ■

но ста растений регенерантов' с шмощыр маркерных признаков, в частности, по размерам длины замыкающих клеток устьиц (ДЗКУ)•

0 возможности использования размеров элементов поверхности листа растений, в частности ДЗКУ, сообщено в работах, посвященных экспериментальному получению гаплоидов у кукурузы (Зайце -ва М.И., 1968, В,, 1964); Однако, только недавно появи-

лось статистически обоснованное сообщение о разделении растений-регенерантов на гаплоиды и даплоиды по ДЗНУ у. мягкой пшеницы (Ху Даофен и др., 1991).

Материалом для исследования служили растения-регенеранты

Таблица 2

Регенерация растений в культуре пыльников пшеницы и згилопсов различных геномов

Вид, сортообразец.

:Коли- : Год :Частога регенера-:Частога :чество:изуче:ции растений из :регене-Геном: кал - :ния :эмбриоидов (кал -:радаи :щ.оов\_х_%_______:расте

¿[усов,, шт. :

:зе - :альби-:все-:™^. •.леныхгнос -:го

I 2 3 : 4 : 5 : 6 : 7 : 8

1-я группа

Пшеница Урарту

363364 ' • А 15 199 Г 0,0 6,6 6,6 0,3

5 1991т* 0,0 0,0 0,0 0,0

18 1992 0,0 5,5 5,5 0,3

Пшеница Синской а' 7 1991 0,0 14,2 14,2 0,3

I . 1991т 0,0 0,0 0,0 0,0

6 1992 0,0 0,0 0,0 0,0

Полба двузернянка , - АаВ 4 1991 0,0 50,0 50,0 0,7

15840 14 • 1992 0,0 0,0 0,0 0,0

Пшеница Исфаханс- АиВ • 6 1991 0,0 33,3 33,3 0,7

кая 43064

Пшеница Эфиопская .' А" В " 7 1991 0,0 14,3 14,3 0,3

19206 5 1992 0,0 . 0,0 1о,о 0,0

Пшелица Тетрабеотит а'а* 60 1991 . 61,6 33,3 94,9 19,0

■кум- 267963 57 1991т 82,4 24,5 106,9 20,3

Пшеница Эребуни 37 1991. 0,0 51,3 51,3 0,3

19 1991т 0,0 63,0 63,0 4,0

32 1992 ■ 0,0 21,8 ¿1,8 2,3

Пшеница Палмовой Л 30 1991 0,0 20,0 20,0 ¿,0

9 1991т 0,0 0,0 0,0 0,0

Пшеница Спельта I 1991т 0,0 0,0 0,0 0,0

20380 II 1992 0,0 27,3 27,3 1,0

к - теплица

Продолжение таблицы 2

I : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 : 8

2- я группа >

Полба дикая араратская А г А б ИЗ 1991 15,0 6,1 21,1 8,1

31628 18 1991т 5,5 16 £ 22,1 1,3

Полба дикая араратская а'б 22 1991т 9,1 9,1 18,2 ■ 1,3.

30216 6 1992 0.,0 0,0 0,0 0,0

Пшеница Тимофеева 18 1991 5,5 5,5' II,С 0,7

29540 14 1991т 0,0 0,0 0,0 0,0

6 1992 0,0 . 16,6 16,6 0,3

11шеница Кихары 47897 А 100 1991 76,0 58,0 134,0 44,7

40 1991т 92,5 30,0 122,5 16,3

88 1992 62,5 29,5 92,0 27,0

3-я группа

Лг, 642 М 48 1991 0,0 62,5 62,5 10,0

7 1991т 0,0 26,5 26,5 0,7

4е . С^шс/г^са 206 72 1991 1,3 58,3 59,6 14,3

15 1991т 0,0 26,6 26,6 1,3

52 1992 0,0 17,3 17,3 3,0

Де., ОоРат/Юъб 173 и с С м 106 1991 0,0 14,1 14,1 5,0

, 196 1) м 48 1991 58,3 31,2 89,5 14,3

34 Л991т 29,4 ' 11,7 41,1 4,6

32 1992 31,2 15,6 46,8 5,0

X ±е1га£аго^Си/7? 269763, Г ¡СиЬмае. 47697, Ф, \'гяЬгс<и4е} 196, полученные методом культуры пыльников в 1991-1992 годах.

Пшеница Тетрабеотикуй 269X3 ,

Сравнение эмпирических и теоретических частот гаплоидов и диплоидов по критерий )£, подтвердило нормальное распределение

растений-регенерантов по ДЗКУ (табл.3).

Таблица 3

Распределение гаплоидных и диплоидных растений -регенерантов Ъ •Ш.соЛо^аЫасып 269763

в зависимости^* ДЗКУ ( 1991 - 1992 гг.)

______Гаплоиды..

ДЗКУ,мкм

частота ,шт.

эмпири-:теоре-ческая :тичес-

______Диплоиды_______________

частота, шт.

ДЗКУ, мкм .

змпири -:теоре ческая :тичес

• :кая • :кая

36,8 - 38,8 3 2 53,6 - 55,8 2 I

39,0 - 41,0 5 4 56,0 - 58,2 3 3

41,2 - 43,2 7 8 ; 58,4 - 60,6 6 7

43,4 - 45,4 9 II ■60,8 - 63,0 9 8

45,6 - 47,6 II II 63,2 - 65,4 6 6

47,8 - 49,8 9 9 65,6 - 67,8 2 3

50,0 - 52,0 7 6 ' 68,0 - 70,2 I I

52,2 - 54,2 4 3

X + 5* = 46,0 +0,6 мкм X + 61,5 +0,6 мкм

X ±¿6 = 46,0 + 8,4 мкм X + 61,5 + 7,1 мкм -

На этом основании были определены границы доверительного интервала ДЗКУ для гаплоидов ( 37,6 - 54,4 мкм)"и диплоидов (54,468,6 мкм) на уровне значимости Р = 05. Так как значение верхней границы гаплоидов и величина нижней границы диплоидов совпадают, то можно принимать размер ДЗКУ 54,4 мкм в качестве косвенного теста при идентификации плоидности растений-регенерантов данно ■ го вида.

Пшеница Кихары 47897

Сравнение эмпирических и теоретических частот гаплоидов и диплоидов по критерию подтвердило нормальное распределение . растений-регенерантов по ДЗКУ и у этого вида пшеницы.

Здесь также были определены границы доверительного интервала ДЗКУ для гаплоидов ( 37,2 - 54,4 мкм) и диплоидов (53,4 -70,2 мкм) на уровне той же значимости.

Так как значение верхней границы гаплоидов и значение нижней границы диплоидов не совпадают, можно считать растения с ДЗКУ до 53,4 мкм гаплоидами и выше 54,4 мкм - диплоидами, а у расте -ний, которые попадают на границу 53,4 - 54,4 мкм для уточнения надо считать число хромосом с помощью микроскопа.

¿/е. \'ек£р-ьаа8а 196

8 этом опыте все расчеты и сравнения проводили аналогично предыдущим. Сравнение эмпирических и теоретических частот у га -плоидов и диплоидов по критерию' ^ подтвердило нормальное рас-, пределение растений-регенерантов по ДЗКУ.

Границы доверительного интервала ДЗКУ для гаплоидов находи -лись в пределах 34,8 - 47,0 мкм, для диплоидов - 46,9 - 71 мкм на уровне значимости Р =05. Итак, 47,0 мкм можно использовать для идентификации плоидности растений-регенерантов.

Таким образом, нами установлена закономерность распределе -ния ДЗКУ и определена граница' доверительного интервала этого признака, позволяющего определить плоидность растений,, полученных в культуре шnъmv.o$.i^гtlЧxJ>c■eot¿£¿¿/77 , 7. ¡СИлаг-Фе. , а^Р. СО-3(Х- # эти данные позволяют быстро и с минималь-

ными затратами классифицировать растения-регенеранты указанных видов на гаплоиды и диплоиды.

3.4. Определение жизнеспособности микроспор пшеницы и эгилопсов в процессе их культивирования ( 1991 г.)

Материалом служили 12 различных видов пшеницы и эгилопсов. Все эти виды пшеницы и эгилопсов по геномному составу подразделялись на две группы. В первой группе у большинства видов жизнеспособность микроскоп была 90 % в день культивирования. Через I день и дальше жизнеспособность падала и достигала ну -ля на 21-, 26 - и 31-й дни культивирования.

Во второй группе геномного состава в день культивирования жизнеспособность наблюдалась на уровне 80-90 %. Однако пшеница Кихары 47897 имела жизнеспособность микроспор только 51 % в день культивирования. Через день и дальше жизнеспособность в этой группе падала и достигала нуля на 21-, 26-, 31-й дни культивирования.

Из этого можно заключить, что жизнеспособность микроспор изученных видов пшеницы и эгилопса резко падала в первую неделю культивирования и достигала нуля на 26-й и 31-й дни.

3.5. Изучение развития микроспор в процессе

культивирования пыльников различных видов пшеницы и эгилопса ( 1993 г.)

3.5.1. Пути-развития микроспор пшеницы и эгилопса га питательной среде

При описании результатов мы опирались на схему путей разви -тия микроспор Ш vitro , предложенную Сандэрлендом ( 1980г.). Однако,картина эмбриогенеза, особенно момента равного деления ядер, в нашем опыте оказалась более разнообразной. С этим связано внесение нами некоторых дополнений.

Исходя из наших данных мы сделали выводы о происхождении

эмбрион нов в культуре пыльников для изучаемых видов.

Процессы, происходящие в пыльцевых зернах in- vitf*? для всех исследуемых видов, в общем, оказались сходными.

Б первые дни культивирования нами отмечены многочисленные митозы, которые в большинстве своем были симметричными и приводили к образованию двух ядер, не различимых ни по величине,ни по интенсивности окраски. Развитие пыльцевых-зерен в основном шло по -пути Б и. Bj, Б^ У всех изучаемых видов. Однако есть различия для видов пшеницы Тимофеева 29540 и Синской. У этих ви -доа'наблюдались равные и неравные деления микроспор. У пшеницы Тимофеева 29540 наблюдалось слияние ядер, которое приводило к увеличению плоидности.

3.5.2. Динамика развития микроспор при культивировании пыльников пшеницы и эгилопса

Изучение жизнеспособности пыльцы в процессе культивирования и появления новообразований, возникших в пыльцевых зернах,позволили нам представить процесс андрогенеза в динамике.

На протяжении всего эксперимента характер изменения жизнеспособности пыльцы для всех изучаемых видов оказался сходным . Наблюдается резкое снижение жизнеспособности в первые 7 дней для всех изучаемых видов. В дальнейшем резкое снижение живых клеток в первые дни культивирования сменялось более плавным . После 7-го дня культивирования в среднем по 10-20 клеток в каждой пробе оставались живыми. Этот уровень был\более - менее стабильным, хотя и низким.

Что касается сроков появления новых эмбриоструктур, то между исследованными видами обнаружены-различия.

Процессы эмбриогенеза у <Uf£c*tdrib(X 206 и пшениц:

Палмовой проходили брлее платно. Пыльцевые зерна у этих видов приступили ко второму и по?ледушим делениям на 2-3-й дни куль -тивирования, тогда как у остальных видов на 2-й день опыта нами отмечены уже многочисленные-многоядерные образования.

Очень быстро'прошли деления ядер пыльцевых зерен у пшеницы Кихары 47897.

Анализ каллусообразования показывает, что виды, которые образуют и сохраняют больше многоядерных и многоклеточных структур, в конце эксперимента давали увеличенное количество ново -образований. Это подтверждается на пшенице Кихары 47897.

3.6. Оптимизация питательной среды в культуре пыльников пшеницы и эгилопса

Среди факторов', влияющих на каллусообразование и регенера -цию растений в культуре пыльников,важную роль играет питатель -нал среда и ее состав, в том числе ростовые вещества и их сочетание. Поэтому основным ц/тем повышения каллусообразования у растений-регенерантов в культуре пыльников злаков считается оптимизация компонентного состава питательных сред.

Для повышения эффективности исследований.по оптимизации питательных сред мы применяли метод планирования экспериментов по плану Хартли, который имеет следующие преимущества: число опытов сводится к минимуму, одновременно .по специальным правилам варьируют все переменные, определяется математическая-мо -дель и на ее основе принимается решение после каждой серии экспериментов.

В качестве питательной среды была выбрана среда РоЬ-2, а . в качестве исследуемых факторов оптимизации - регуляторы роста 2,4-Д,р£~НУК, кинегин и ВАЛ, которые определяют направле -ние процесса дифференциации клеток и органов.

Сочетание уровней

Рис. I. Образование эмбриоидов в'зависимости от сочетания регуляторов роста в культуре пыльников пшеницы Урарту 363363

-среда на фоне кинетина

— — — среда на фоне БАП

Факторы и уровни мг/л Факторы и уровни мг/л

- 0 + - 0 +

Х: 2,4-Д 0,25 0,50 0,75 Хц 2,4-Д 0,25 0,50 0,7

х2/-нук 0,10 0,30 0,50 х2 ¿¿-НУК 0,10 0,30 0.Е

Х3 кинетин 0,25 0,50 0,75 Х3 БАП 0,25 0,50 0,7

3.6.1. Образование каллуса и растений-регенерантов при различных сочетаниях регуляторов роста в культуре пыльников пшеницы Урарту 363363

В исследовании, проведенном в 1992 году, были поставлены 1 две серии экспериментов, составленных по плану Хартли. В одной серии экспериментов в основную среду.Ро£-2 добавляли регуля -горы роста: 2,4-Д, -НУК, кинетин, а в другой - 2,4-Д, аС -НУК и ВАЛ.

Решение множественных регрессионных уравнений второго порядка позволило теоретически определить частоту образования кал -луса при культивировании пыльников-для всех возможных сочета -ний изучаемых факторов на трех уровнях 3^.

В результате двух серий опытов на основании регрессионной модели нам удалось найти максимум выхода каллуса ( 12,4 %) при сочетании уровней факторов 2,4-Д и кинетина с концентрацией 0,5 мг/г на фоне кинетина и 13,3 % на фоне ВАЛ при концентра -ции 0,75 мг/л 2,4-Д'и 0,5 мг/л БАЛ (рис.1).

Каллусы, полученные в опыте дробного факторного эксперимента по плану Хартли, через 60 дней культивирования пересаживали на питательную среду Мурасиге-Скуга {Мил&л/ьс^ Г, ЗКЬо^Т, 1962) с добавлением^ регуляторов роста.

Анализ опытов по регенерации растений в 1992 году показы -вает, что из II вариантов различных уровней факторов среды на фоне кинетина растения из каллуса были получены в пяти случа -ях (рис.2), частота регенерации варьировала от 0,4 до 2,0 % от числа посаженных пыльников. Максимальный выход растений -регенерантов получен на 8-ом варианте. В опыте регенерации растений из каллуса, выращенного на фоне БАЛ, регенеранты были получены для 6 вариантов. Частота регенерации колебалась от

zl

II-

20-<?-

16

г (V-

■s <1-

fS

о

а >j

10

М-

Хз + Хг-X, -

- - + о о о о - + о

- + + о о - о о о

+ - + - + о О о О О

1 2 3 'f S 6 7

9 10 Ц

Рис. 2. Образование каллуса и регенерантов . в культуре пыльников пшеницы Урарту 353363 при различных: сочетаниях уровней факторов среды на фоне кинетина и БЛП по Д*>Э

каллус на фоне кинетина

— -- каллус на фоне БАП

•......* регенеранты на фоне кинетина

«— , — , -»регенеранты на фоне БАП

¿акторы и уровни ^ Лг/л Ху аС -ПУК 0,20

q ■■ факторы и уровни 0,<5 0,50 Otvo Xj 2,4-Д 0^25

0,30 0,50 Хо <<-НУК 0,20 X;j кинетин 0,4Ъ . 0,50 0,75 Х3 БАЙ 0,25

0мг/Л 0,50 0,71

0,30 0,5(

0,50 о,?;

0,8 до 1,2 %. Максимальное значение получено в 8-ом варианте, то есть при сочетании уровней факторов: 2,4-Д, ¿С -НУК, кине -тин и 2,4-Д,¿С -НУК, БАЛ с концентрацией 0,5 мг/л.

Таким образом, с помощью математического планирования зк -спериментов мы впервые увеличили частоту каллу (»образования в культуре пыльников пшеницы Урарту 363363 в 2 раза и растений -регенерантов в 6 раз по сравнении с простым методом получения гаплоидных растений.

3.6.2. Образование каллуса и растений-регенерантов при различных сочетаниях регуляторов роста в культуре пыльников ^пшеницы Эребуни

В результате постановки двух серий экспериментов были получены' два уравнения регрессии второго порядка неприведенного вида в 1992 г.

Поскольку модель уравнения регрессии для среды с хлнети -ном не имеет связи между изучаемыми факторами, нам не удалось найти сочетаний факторов, влияших на частоту каллусообразова-ния,.

Для этого.же вида опыт был выполнен на другой среде, кото -рая включала : 2,4-Д, ¿хГ-НУК и БАЛ на трех уровнях.

В результате серии экспериментов на основании уравнений регрессии нам удалось определить сочетание уровней факторов 2,4-Д (0,75 мг/г),с/ -НУК, БАБ С0,5 ыг/г) и максимум выхода каллуса (38,5 %) на фоне БАЛ (рис.3).

Каллусы, полученные на основе дробного факторного эксперимента по плану Хартли, через 60 дней культивирования переса -живали на питательную среду Мурасиги-Скуга с теми же добавка -ми, которые были для вида пшеницы Урарту 363363.

Анализ результатов по регенерации растений в 1992 году

1 й V 1 5 6 7 в 9 Ю 11 й й ЙМ5 16 » « 1?2021

Сочетание уровней

Рис. 3. Образование эмбриоидов в зависимости от сочетания регуляторов роста в культуре пыльников пшеницы Эребуни на фоне ВАЛ

Факторы и уровни - мг/л О +

Х1 2,4-Д 0,25 0,50 0,75

Х2 оС-НУК 0,10 0,30 ■ 0,50

Х3 БАП 0,25 0,50 .0,75

показывает, что на всех II вариантах сочетаний уровней факторов со средой 'на фоне кинетина о'ыли получены растения из калл/сое. Частота регенерации варьировала от 0,8 до 8,0 %•

Максимальный выход растений регенерантов получен на 8-ом варианте (3,0 %), затем следует 2-й вариант - 5,6 % (рис.4).

6 эксперименте по регенерации растений из каллусов, вы -рааенных на фоне ¿АН, регенеранты были получены для 9 вариантов, частота которых колебалась от 1,Ь до 10,0 1> (рис.4). Максимальное значение получено в ¿-ом варианте.

Таким образом, сочетание уровней факторов 2,4-Д (0,75 мг/л), ¿С - .чУК (0,Ь мг/л) и Бш! (0,5 мг/л) обеспечивает максимум вывода каллуса (33,о '%) на фоне БАн. Однако для увеличения выхо -лз ,.аетений-регенерангоь' лучшими сочетаниями факторов являются кинетин и ¿,4-Д,с£-НУК ,БА11 при концентрации 0,5

'.¡г/л.

С помощью этого метода нам удалось увеличить частоту каллу-зообразованил в у раз, растений-регенерантов в 4 раза.

К сожалению, на; так и не удалось получить каллусы из 5о00 .шльников у вида ^¿¿(ЛГ-р-О^Сь- 900 в аналогично состав -генных дробных уровнях факторов.

ВЫВОДЫ

1. Образование каллуса и растений-регенерантов в культуре пыльников находится под контролем генотипа изучаемых видов.Норна реакции генотипа по это^ признаку зависит от агроклимати -веских условий, в которых выращивались донорные растения.

2. Естественные условия выращивания донорных растений являются лучшими в сравнении с тепличными.

3. Установлена зависимость ДЗКУ от числахромосои растений,

сц о ь; з Ж

нн

Но-36 31-П-24201612.-

ь о

„ + -

о &

к й К

-•(0

*3 +

х2 -

- — + о о о о - 4 0

- + + 0 о - О 0 0

+ — + - - -V о о О 0 о

га о к

X •а

■8 а

о

еъ ф ж

ш ^

О)

л г _ з ч £ в 7 у 9 10 -и

Рис. 4. Образование каллуса и'регенерантов в культуре пыльников пшенищ Эребуни при различных сочетаниях уровней факторов среды на фоне кинетика и БАП по ДФЭ

■--каллус на фоне кинетина

— — каллус на фоне БАП

.-----, регенеранты на фоне кинетина

• . . . « регенеранты на фоне БАП

Факторы и уровни,

2,4-Д 0,25 Х2 с^-НУК 0,20 Хд кинетин 0,25

мг/л Факторы и уровни, мг/л

0 + - 0 +

0,50 0,75 Хх 2,4-Д 0,25 0,50 0,75

0,30 0,50 Х2 {¿-ПУК 0,20 0,30 0,50

0,50 0,75 Х3 БАП 0,25 0,50 0,75

полученных методом культивирования пыльников у видов Т, 'ßgtrtx-SceC^ace-sfr 269763, Т ¡üJiazae. 47897,0/1?, VertirlC-OSCu 196. Различия-гаплоидных и диплоидных растений по данному признаку весьма существенны.

4. Жизнеспособность микроспор у 12 изучаемых видов пшеницы и эгилопса резко падает на первой неделе культивирования и достигает нуля на 26-й - 31-й дни.

5. Процессы, происходящие в пыльцевых зернах для 5 изучаемых видов оказались сходными. Каллусы образуются от клеток с равным делением ядра. Развитие пыльцевых зерен происходит по пути Б и Бр Б^ у всех изучаемых видов. У пшеницы Тимофеева 29540 наблюдалось слияцие ядер, которое приводит к увеличению плоид -тости.

6. Деление клетки происходит внутри экзины до 16-го дня культивирования. С 16 -го дня начинается разрыв экзины и про -эмбриоиды выходят из клеточной оболочки пыльцевого зерна.

7. Низкая частота андрогенеза объясняется массовой гибелью тыльцевых зерен и многоклеточных структур при выходе из экзины з процессе культивирования, пыльников.

8. С помощью математического планирования экспериментов ш впервые увеличили частоту каллусообразования в .культуре пыль-шков пшеницы Урарту 363363 в 2 раза, а у пшеницы Эребуни в ) раз и выход растений-регенёрантов - в 6 и 4 раза соответсгвен-го по сравнению с простым методом.

9. Впервые найдена математическая зависимость образования •лллу-са и регенерантов в культуре пыльников пшеницы Урарту 63363 и пшеницу Эребуни от концентрации и сочетания изучаемых акторов (2,4-Д НУК, кинетин и БАП) в жидкой питательной реде Fbt - 2.

10. Добавление 2,4-Д, -НУК, кинетина и ВАЛ с концентрацией 0,5 иг/г в питательную среду РоЬ -2 стимулировало регенера -цию растений у пшеницу Урарту 363363 до 15,8 % и у пшеницы Эре-буни до 48,8 1о.

приложения да СЕИЭДШ

1. Гаплоидные растения, полученные в культуре пыльников пли ницы Тетрабэотикум 267963, Кихары 47897, Полбы - араратская 31622«, Тимофеева 29540, Зребуни, Л<г. Кб и

Л<? Ос^яс/ыса'^до рекомендуется использовать как исходный мате риал при межвидовой гибридизации с целью улучшения пшеницы.

2. С целью идентификации гаплоидных и диплоидных растений регенерантов можно использовать длину замыкающих клеток устьиц (ДЗКУ) у видов пшеницы Тетрабеотикум, Кихары и

3. Для максимального образования каллуса и последующей регенерации растений в жидкую питательную среду Рс-'б - 2 в нуль туре пыльников пшеницы Урарту и Эребуни необходимо добавление следующих концентраций (мг/л) и сочетаний ростовых веществ :

1. 2,4-Д - 0,5 2,4-Д - 0,75

2.'«¿-НУК - 0,5 К -НУК - 0,5

3. Кинетин- 0,5 БАП - 0,5

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Хатун •л., Ефремова В.В., Иванов Г.И. Жизнеспособность микроспор пшеницы и эгилопсов в культуре пыльников // Сб. нау^ ных работ молодых ученых / КГАУ. - Краснодар, 1993.-С.21-26.

2. Хатун , Иванов Г.И., Ефремова В.З. Регенерация гаплоидов в культуре пыльников пшеницы и эгилопсов // Сб.научных работ молодых ученых / КГАУ. - Краснодар, 1993.- С.26-32.

3. Хатун Ф., Ефремова В.В., Иванов Г.И., Сумбаева Н.Ю. 0п

ределение уровня плоидности по длине замыкающих клеток устьиц у растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников Х'Ы-го-Воео^Сгг/^ Т, к" ¿М) га ^ V<гh^¿rc.<l■02c¿ [/ Адаптация возделываемых растений к экологическим и технологическим факторам: 36.раб. /КГАУ. - Краснодар, 1993. Вып.Ш. - С.160-169.

4. Хатун Лопатина Л.М., Иванов Г .И., .Ефремова В.В.Применение теории планирования эксперимента для определения оптимального условия нарастания каллуса Т. при об -работке разными фитогормонами // Тр. /КГАУ. -Вып.355 (363). -Краснодар, 1993. - С.128-131.