Половые особенности митохондриального метаболизма в условиях покоя и острого стресса

Леонтьев, Данила Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Половые особенности митохондриального метаболизма в условиях покоя и острого стресса
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Половые особенности митохондриального метаболизма в условиях покоя и острого стресса"

На правах рукописи

Леонтьев Данила Сергеевич

ПОЛОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА В УСЛОВИЯХ ПОКОЯ И ОСТРОГО СТРЕССА

03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Астрахань - 2005

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

Анищенко Т.Г.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Кандидат медицинских наук

Воробьев В.И. Наумов В.З.

Ведущая организация:

Саратовский государственный медицинский университет

Защита состоится 3 ноября 2005 г.

в 1200 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, ул.Шаумяна 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20а.

Автореферат разослан «_» _ 2005 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, доцент —-^ Нестеров Ю.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одним из самых ярких проявлений феномена полового диморфизма является меньшая по сравнению с женщинами, продолжительность жизни мужчин, а также большая уязвимость последних к действию стрессорных и патологических факторов (Анищенко Т.Г., 2001, Vina J, Sastre J, Pallardo F, Borras C., 2003). Несмотря на имеющиеся сведения о различиях в стресс-устойчивости самок и самцов, вопрос о причинах этих различий остается открытым, а экспериментальная биология продолжает описывать механизмы стресса на примере самцов, что в конечном итоге скрывает от исследователей значительную часть проблемы.

Возможно, именно возникновение в процессе эволюции разных ролей мужского и женского пола в популяции определило их различную устойчивость к стрессу. Самки, обладая более пластичными адаптивными системами, лучше приспосабливаются к действующему негативному фактору, в то время как самцы ищут выход из неблагоприятных условий, в большей степени, чем самки, подвергаясь прессингу естественного отбора (Геодакян В. А., 1991).

Известно, что реакция на действующий стресс-фактор носит типовой характер и заключается в последовательной активации стресс-реализующей и стресс-лимитирующей систем, основными представителями которых являются соответственно адреналин и серотонин (Меерсон Ф.З., 1979). Каскад этих реакций в конечном итоге направлен на перераспределение энергетических ресурсов и повышение эффективности преобразования энергии окисляемых субстратов в форму АТФ митохондриями.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ i

БИБЛИОТЕКА,_ j С Петер 09

IIBUltIM |

процессы окисления в митохондриях (Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В., 1985). Открытие многих уникальных свойств сукцината позволило обособить его в ряду субстратов цикла Кребса и охарактеризовать его как наиболее мощный источник энергии в митохондриях (Кондрашова М.Н., 1991). Обнаружено, что мужские стероидные гормоны при добавлении in vitro существенно повышают сопряжение в дыхательной цепи, поддерживаемое окислением сукцината. Высказано предположение, что обеспечение максимального сопряжения под действием стероидных гормонов формирует резерв для развития более интенсивной работы мужскими особями (Starkov А.А., 1997). Учитывая зависимость скорости образования активных форм кислорода от величины мембранного потенциала митохондрий (Владимиров Ю.А. и др., 1972; Иванова Е.В., 1991) можно предположить, что такое преимущество может обернуться для самцов усилением повреждения ДНК и, как следствие, уменьшением продолжительности жизни (L. Borras, 2003).

Наличие открытых вопросов относительно участия митохондрий в реализации стрессорной реакции и возможной роли половых гормонов в регуляции митохондриальных функций определило цель и задачи наших исследований.

Цель исследования: Изучение влияния гормонов стресса и фактора пола на митохондрийльный метаболизм в условиях покоя и острого стресса, а также исследование возможного влияния половых гормонов на ферментные системы митохондрий с предварительной модификацией метода получения митохонд-риального препарата.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить влияние введения гормонов стресса - адреналина и серотонина in vivo на интенсивность окисления ключевых субстратов цикла Кребса -сукцината и а-кетоглутарата в митохондриях.

2. Выяснить возможность исключения хелаторов (ЭГТА) из среды выделения для наилучшего сохранения свойств митохондрий при их получении.

3. Исследовать половые особенности фосфорилирующего и разобщенного дыхания митохондрий в условиях покоя и острого стресса.

4. Изучить половые особенности в активности сукцинатдегидрогеназы, цит-ратсинтазы и АТФ-азы митохондрий в условиях покоя и острого стресса.

5. Выявить влияние кастрации на особенности фосфорилирующего и разобщенного дыхания митохондрий самок и самцов в условиях покоя и острого стресса.

Научная новизна:

Нами был модифицирован метод получения митохондриального препарата, что позволило впервые применить для представленных исследований гомо-генаты тканей без использования ЭГТА в качестве хелатора. Получены оригинальные данные о стимулирующем влиянии адреналина и подавляющем действии серотонина на окисление сукцината.

Впервые проведен комплексный анализ особенностей митохондриального метаболизма в условиях покоя и острого стресса с учетом полового фактора. Обнаружено, что митохондрии самцов обладают исходно более высоким сопряжением и отзываются на стресс усилением окисления сукцината, в то время как митохондрии самок, находясь в более активном состоянии в покое, не проявляют выраженной реакции на острый стресс.

Новыми являются данные о влиянии кастрации на половые особенности фосфорилирующего и разобщенного дыхания митохондрий в условиях покоя и острого стресса. Выявлено, что уровень половых гормонов влияет на сопряженность митохондрий, но различия по параметрам фосфорилирующего дыхания, по-видимому, определяются другими факторами. Положения, выносимые на защиту:

1. Действие адреналина и серотонина проявляется соответственно в усилении и ингибировании окисления сукцината, что может являться отражением работы стресс-реализующей и стресс-лимитирующей систем на уровне митохондрий.

2. Митохондрии самцов, обладая исходно более высоким сопряжением и низким дыханием, отзываются на стресс усилением окисления сукцината, в то время как митохондрии самок, находясь в более активном состоянии в покое, не проявляют выраженной реакции на острый стресс.

3. Половые различия в параметрах разобщенного дыхания митохондрий определены наличием андрогенов в организме самцов.

4. Половые гормоны не играют принципиальной роли в обеспечении половых различий по параметрам фосфорилирующего дыхания митохондрий в покое и в условиях стресса.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Проведена модификация метода получения митохондриального препарата и показана целесообразность исключения ЭГТА из среды выделения с целью наилучшего сохранения физиологического состояния исследуемых митохондрий.

мощности окисления сукцината, в то время как окисление НАД-зависимых субстратов не увеличивается или даже снижается.

Предотвращение гиперактивации митохондриального аппарата при длительном стрессе может обеспечиваться торможением сукцинатдегидрогеназы серотонином - гормоном стресс-лимитирующей системы.

Обнаруженные нами половые особенности метаболизма митохондрий и их стресс-реактивности позволяют включить данный фактор в комплекс причин, определяющих различную продолжительность жизни мужских и женских особей. '

Апробация работы.

Основные результаты диссертационного исследования были доложены и обсуждены на заседаниях кафедры физиологии человека и животных, Всероссийской научной конференции с международным участием, посвящённой 150-летию со дня рождения И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 1999), Российской конференции «Нейроэндокринология - 2000» (Санкт-Петербург, 2000), 5ft Symposium «Free Radical in Biology and Medicine»(Poland, Lodz, 2000), Восьмой международной конференции «Математика, компьютер, образование» (Пущи-но, 29 января-4 февраля 2001 года), Всероссийской конференции «Митохондрии в патологии» (Пущино, 28-31 мая 2001 года), XI европейском конгрессе по гипертензии «13th European Meeting on Hypertension» (Италия, Милан, 2001 г), Научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 6-10 мая 2004 года).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 работ в центральной и местной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, выводов и списка литературы, включающего 78 отечественных и 93 иностранных источника. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 18 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования были проведены на 80 самках и 110 самцах беспородных белых крысах массой 220-250г. Животных содержали в виварии кафедры физиологии человека и животных в контролируемых условиях: 12-ти часовой период освещения, температура воздуха - 20 ± 2°С, влажность 50-70 %, корм и вода ad libitum.

В первой серии опытов исследовали влияние введения адреналина и се-ротонина на параметры дыхания митохондрий интактных животных. Опытным животным вводился адреналин (30 мкг/100 г веса) или серотонин (4 мг/100 г веса) за 30 мин до забоя. Исследования проводились на митохондриях гомоге-натов мозга и печени. Гомогенаты готовили по методу Кондрашовой М.Н. (КопёгазЬоУа М.Ы. е1 а1., 2001) с модификациями. Скорость дыхания митохондрий при окислении сукцината и а-кетоглутарата изучалась полярографическим методом. Измерение поглощения кислорода митохондриями проводилось в герметичной термостатируемой ячейке объемом 1,2 мл с постоянным перемешиванием магнитной мешалкой при 28°С. Уровень кислорода измерялся при помощи электрода Кларка, подключенного к аппаратно-программному комплексу «ЯесогсМ». Среда инкубации содержала 125 мМ КС1, 10 мМ НЕРЕ8, 1,5мМ КН2РО4, рН 7,4. Добавление гомогената в ячейку, содержащую среду инкубации и субстрат окисления приводит к медленному потреблению кислорода со скоростью У2. Внесение в реакционную смесь 200 мкМ АДФ вызывает активацию дыхания (УЗ). После фосфорилирования добавленного количества АДФ дыхание митохондрий снижается до уровня У4. Отмечено, что эндогенный сукцинат окисляется значительно интенсивнее добавленного. С целью выявления вклада эндогенного сукцината в дыхание в пробах была использована добавка специфического ингибитора сукцинатдегидрогеназы - малоната (МАЛ).

В специальной серии опытов изучали, как влияет наличие ЭГТА в среде выделения на проявление эффекта введенного адреналина. Для этого сравнивались параметры дыхания гомогената, получаемого без использования ЭГТА с гомогенатом, при получении которого использовалась среда выделения, содержащая 125 мМ КС1, 10 мМ НЕРЕБ, 1 мМ ЭГТА, рН 7,4.

Следующая серия опытов была посвящена комплексному исследованию метаболизма митохондрий самок и самцов в условиях покоя и острого стресса. Стресс моделировался путем иммобилизации животного на спине в течение 30 минут. Были исследованы параметры дыхания митохондрий по методу, аналогичному в первой серии опытов. Измерялась активность сукцинатдегидрогеназы по скорости восстановления феррицианида (Покровский А.А. и др., 1968), активность цитратсинтазы по скорости образования цитрата (Прохорова М.И., 1982) и активность митохондриальной АТФ-азы по нарастанию неорганического фосфата (Р„) в пробе, который накапливается во время инкубации в результате гидролиза АТФ. Следует отметить, что несмотря на преимущества использования тканевых гомогенатов, в митохондриальных иследованиях нельзя обойтись без выделенных митохондрий при изучении активности митохондриальной АТФ-азы. Митохондриальную фракцию тканей сердца, печени и мозга

получали по методу Шнейдера (Shneider C.W., 1948). Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури (Lowry О Н. et al., 1951).

В заключительной серии опытов за три недели до начала исследования проводилась кастрация самок и самцов. По истечении трех недель после кастрации проводилось полярографическое изучение дыхания митохондрий самок и самцов в условиях покоя и после иммобилизационного острого стресса.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью компьютерной программы «Sigma Plot». Для оценки достоверности различий применяли парный критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при вероятности ошибки р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.1 Влияние введения адреналина и серотонина на окисляемость сук-цината и кетоглутарата

Как видно из рисунка 1А, введение адреналина in vivo вызывает активацию фосфорилирующего дыхания при окислении сукцината (V3) с 31,8 ± 2,4 до 40,1 ± 2,9 нг-ат Ог /мин /мг белка (р<0,05), что составляет 126% от исходного. При этом наблюдалось и увеличение коэффициента дыхательного контроля с 2,1 ± 0,2 до 2,8 ± 0,3 (р<0,05). Скорость поглощения кислорода при дыхании на а-кетоглутарате тоже повышалась с 19,2 ± 2,0 до 23,4 ± 2,1 нг-ат Ог /мин /мг белка, однако это повышение было недостоверным (рис. 1Б). Эта активация снималась добавлением в ячейку малоната, что указывает на значительный вклад эндогенного сукцината в потребление кислорода. В присутствии малоната выявлено, что введение адреналина не изменяет скорость окисления а-кетоглутарата (рис. 1В).

V2_ П"

•§»

Я I

Oto >

Рис. 1 Влияние введения адреналина на интенсивность окисления сукцината и кетоглутарата Примечание- в качестве субстрата окисления сукцинат 4 шМ (А), кетоглутарат 4 тМ (Б), кетоглутарат 4 шМ + малонаяг 2 тМ (В) Добавки 200 мкМ АДФ (А), 10* М С1-ССР (Б, В), гомогенат 50 мкЛ, * - р<0,05 относительно контроля, - контроль --адреналин

Предполагается, что серотонин, являясь гормоном стресс-лимитиругощей системы, оказывает на митохондрии обратное адреналину действие.

Действительно, в проведенных нами опытах обнаружено, что введение серотонина значительно снижает скорость окисления сукцината в митохондриях (р<0,05). Так, в митохондриях печени опытных животных скорость поглощения кислорода в состоянии 3 снизилась с 45,9 ± 3,3 до 34,5 ± 3,2 нг-ат Ог /мин /мг белка, что составляет 75% от исходного значения (р<0,05) (рис. 2А). Добавление глутамата in vitro снимало эффект серотонина на митохондрии печени и мозга (рис. 2Б). Это свидетельствует о том, что в митохондриях под действием введенного серотонина развивается торможение сукцинатдегидрогена-зы щавелеуксусной кислотой (Кондрашова М.Н., 1985), которое снимается усилением процессов переаминирования при добавлении глутамата.

Избирательное действие реципрокных гормонов на окисление этих двух субстратов может объясняться тем, что ферменты их окисления - сукцинатде-гидрогеназа (СДГ) и кетоглутаратдегидрогеназа (КГДГ) являются ключевыми в

50 •

S *

•§30 ■

! > ■

о >

10 ■

Г"

""1

____I

50 ■

■|зо

®20 Г-J

О >

_V2_

Г'

0 20 40 60 80 0 20 40 60 80

Рис. 2 Влияние введения серотонина на интенсивность окисления сукцината митохондриями печени

Примечание- в качестве субстрата окисления сукцинат 4 мМ (А), сукцинат 4 мМ + глутамат 2 мМ (В) Добавки' 200 мкМ АДФ (А), гомогенат 50 мкЛ * - р<0,05 относительно контроля, -контроль--серотонин

регуляции дыхания. Подобно тому, как СДГ является ключевым ферментом, определяющим поток электронов в дыхательной цепи в энергизованных митохондриях, КГДГ является общим входом для всех НАД-зависимых субстратов (Olson M.S., 1985) и доминирует при деэнергизации митохондрий. Активация окисления сукцината адреналином может являться механизмом поддержания энергетического статуса организма при адаптации к неблагоприятным условиям. Специфическая роль сукцината в обеспечении активной работы подтвер-

ждается фактом его ингибирования серотонином - физиологическим антагонистом адреналина. Принадлежность адреналина к стресс-реализующей, а се-ротонина к стресс-лимитирующей системам (Меерсон Ф.З., 1988) позволяет предположить, что адаптивная мобилизация энергетических ресурсов на уровне митохондрий обеспечивается через усиление окисления сукцината адреналином, а действие серотонина предотвращает гиперактивацию митохондриально-го аппарата.

1.2 Влияние ЭГТА в среде выделения на выявление эффекта адреналина

Все эксперименты, описанные в данной работе, за исключением определения активности АТФ-азы (гл. 1.6), были выполнены на гомогенатах, полученных без использования ЭГТА в среде выделения. Как мы выяснили, это позволяет лучшим образом сохранять нативные свойства и физиологические особенности митохондрий в ходе эксперимента, поскольку кальций является неотъемлемым компонентом внутриклеточной сигнализации и его удаление из среды добавлением ЭГТА может исказить эффекты гормонов на митохондрии.

Наши результаты показали, что наличие 1,0 Мм ЭГТА в среде выделения снижает активирующий эффект адреналина. Так, если митохондрии были получены без использования ЭГТА, введение адреналина in vivo активировало фосфорилирующее дыхание при окислении сукцината на 26%. В случае добавления в среду выделения 1,0 Мм ЭГТА активирующий эффект адреналина не проявлялся. Как предполагается, это может быть связано с тем, что связывание ионов кальция нарушает работу сигнальных систем в клетке и митохондриях.

1.3 Особенности фосфорилирующего дыхания митохондрий самок и самцов в условиях покоя и острого стресса

Исследования показали, что в покое скорость дыхания, активированного добавлением 4 мМ АДФ (V3), у самцов составила 35,8 ± 3,5, а у самок 45,9 ± 4,2 нг-ат 02 /мин /мг белка, что на 28% выше (р<0,05), чем у самцов (рис. ЗА) Дыхание в состоянии 4 у самцов было также ниже, чем у самок (р<0,05).

Величина коэффициента дыхательного контроля в покое была практически одинакова для самок и самцов, составляя 2,9 ± 0,2 и 3,0 ± 0,3 Учитывая хорошую сопряженность митохондриальных препаратов, можно было предположить, что более высокой скорости поглощения кислорода у самок по сравнению с самцами будет соответствовать более высокая скорость фосфорилирова-ния, что должно выразиться в меньшем у самок времени фосфорилирования. Действительно, для митохондрий контрольных самок данный показатель в расчете на 50 мкМ добавленного АДФ составил 45,0 секунд на мг белка, а в митохондриях контрольных самцов на фосфорилирование 50 мкм АДФ уходило 58,8 секунд на мг белка (р<0,05).

Таким образом, результаты наших исследований показали, что у самцов по сравнению с самками снижено дыхание в состояниях У3 и У4, а время фос-форилирования увеличено. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что в покое митохондрии самцов обладают более высоким мембранным потенциалом (А р!-Г) и более значительным, по сравнению с самками, пулом АТФ, что проявляется в более выраженном энергетическом контроле дыхания у самцов.

60 §50

|40

о Й ti, К

é>,

зо

120

Д ---1________

________L

- 1л

время, сек

--- 60

350 fI

£40

"й s

■530 s

¿20 +-

время, сек

100

120

60 80 100 120 t Рис. 3 Параметры фоефорилирующего дыхания митохондрий само!с и самцов в условиях' покоя и острого стресса

Примечание - в качестве субстрата окисления сукцинат 4 шМ Интакгные животные (А), после острого стресса (Б) Добавки 200 мкМ АДФ, гомогенат 50 мкл,

* - р<0,05 относительно контроля, Д - относительно самцов,--самки - самцы

Обнаруженные нами половые различия в параметрах дыхания митохондрий интактных животных могут быть объяснены двумя причинами. Если принимать во внимание выявленную в наших исследованиях положительную связь между тонусом симпатической системы и интенсивностью окисления сукцина-та (см. раздел 1.1), то причиной повышенного дыхания митохондрий самок может являться повышенный симпатический тонус последних, отмечавшийся в ряде работ (Siddiqui A., Gilmore D., 1988; Vaccari A. et al., 1977). С другой стороны, сниженное дыхание и высокий мембранный потенциал митохондрий самцов могут быть в значительной степени обусловлены ресопрягающим действием мужских половых гормонов (Skulachev V.P., 1997). Важно отметить, что такое состояние митохондрий мужских особей может оказаться небезопасным для клетки. Обнаружено, что наличие высокого потенциала и более низкого дыхания митохондрий приводит к накоплению продуктов перекисного окисления (Иванова М.В., 1990). Как было показано другими исследователями, в митохондриях самцов интенсивность процессов перекисного окисления выше, чем в митохондриях самок (Vina J. et al., 2003).

Наши исследования показали, что характер реакции на острый стресс зависит от пола животных (рис. ЗБ). Так, после острого стресса, скорость поглощения кислорода в состояниях 2 и 3 увеличилась у самцов на 52% и 58% соответственно (р<0,05). У самок эти показатели остались практически на прежнем уровне.

Острый' стресс повлиял и на скорость поглощения кислорода в состоянии 4. Крайне важен тот факт, что эти изменения носили для самок и самцов разнонаправленный характер (рис. ЗБ). У самцов интенсивность дыхания повысилась на 69% от контрольного значения (р<0,05), а у самок после 30-минутной иммобилизации скорость поглощения кислорода в состоянии 4 понизилась на 25% от исходного(р<0,05).

Таким образом, нами обнаружено, что функционирование митохондрий самок и самцов имеет свои особенности, которые проявляются в покое, и в условиях стресса. В покое, митохондриальный аппарат самок находится в более активном состоянии, что, скорее всего, связано с более выраженным у них тонусом симпатической системы. Острый стресс не вызвал ожидаемой активации дыхательной цепи митохондрий самок. По всей видимости, это является результатом торможения сукцинатдегидрогеназы щавелеуксусной кислотой, что является механизмом, предотвращения избыточной активации митохондриаль-ного аппарата при стрессе или патологических состояниях (Кондрашова М.Н., 1969).

1.4 Особенности разобщенного дыхания митохондрий самок и самцбв в условиях покоя и острого стресса

1.4.1 Параметры дыхания митохондрий самок и самцов при разобщенном окислении сукцината в условиях покоя и острого стресса

Скорость дыхания, активированного добавлением разобщителя (10"6 С1-ССР), у самок составила 60,3 ± 6,7, а у самцов 46,7 ± 3,4 нг-ат 02/мин /мг белка (р<0,05), что на 29% ниже, чем у самок (табл. 1, рис. 3). Мы обнаружили, что митохондрии самок и самцов различались не только по абсолютным значениям скорости разобщенного дыхания, но и величиной прироста дыхания в ответ на добавку разобщителя (р<0,05). Степень активации дыхания после добавления разобщителя, выраженная в процентах, составила 108,6% для контрольных самок и 86,8% для самцов (табл. 1). Важно отметить, что в экспериментах, проведенных в весенний сезон (март, апрель), различия в чувствительности митохондрий к действию разобщителя проявлялись в еще большей степени. В этот период процент активации дыхания составлял для самок 85,7%, а для самцов 37,8% (р<0,05). Независимо от сезона, у самцов состояние разобщенного дыха-

ния сменялось ингибированием, и скорость поглощения кислорода возвращалась к исходному значению, в то время как у самок ингибирования не наблюдалось, либо выражалось в значительно меньшей степени (рис. 4А).

Таблица 1 Интенсивность разобщенного дыхания митохондрий при

Группа животных Единицы v2 Vci-ccp Степень активации (%) Степень ингибиро-вавия (%)

Самки контроль Самцы контроль нг-ат Ог /мин % 28,9 ±3,1 100 ±10,7 60,3 ± 6,7 А 100 ± 10,6 49,3 ± 4,2 А 100 ±8,5 108,6 ±7,3 А 16,4±6,5 А

нг-ат Ог /мин % 25,0 ± 3,3 100 ± 13,2 46,7 ±3,4 100 ±7,2 29,5 ± 3,5 100 ± 11,8 86,8 ± 5,6 36,8±9,5

Самки 30' иммоб. Самцы 30' иммоб. нг-ат Ог /мин % 31,7 ±4,2 109,6 ±14,5 62,2 ± 5,2 А 105,4 ±8,8 А 42,0 ±3,5 94,8 ± 7,9 96,2 ± 6,8 32,5±4,3 А *

нг-ат Ог /мин % 37,7 ±3,6* 150,8 ±9,5* 72,5 ± 4,8 * 155,2 ±10,5* 39,7 ± 23 * 134,5 ±5,7* 92,3 ± 7,1 45,2±5.1

Примечание - * р<0,05 относительно контроля;

А р<0,05 относительно самцов

I60

"а

|40

5 20 >

О----

§60 ю

"i s

|40 g

0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120

Рис. 4 Разобщенное дышне на сукцинате митохондрий самок и самцов в ус.говимх покоя и oci poro стресса Примечание в качестве субстрата окисления сукцинат 4 тМ Контроль (А), острый стресс (Б) Добавки 10 М CI-CCP, гомогенат 50 мкп,

* - р<0,05 относительно контроля, А - относительно самцов,--самки - самцы

Полученные данные указывают на то, что в покое митохондрии самцов обладают более мощными механизмами для поддержания трансмембранного потенциала. В целом, половые различия по устойчивости потенциала митохон-

дрий к действию разобщителя могут быть обусловлены ресопрягающим эффектом андрогенов (Starkov А.А , 1997). Это объясняет и то, что весной, в период повышенного фона половых гормонов, различия в чувствительности митохондрий самок и самцов к действию разобщителя проявлялись в еще большей степени. Запись типичной пары полярограмм, полученных при инкубации митохондрий' самок и самцов с разобщителем, приведена на рисунке 5

После стрессорного воздействия у самцов увеличилась интенсивность разобщенного окисления сукцината. У самок, в отличие от самцов, после стресса разобщенное дыхание осталось практически неизменным. Наличие половых особенностей в реакции митохондрий на острый стресс привело к тому, что интегральный показатель разобщенного дыхания -степень активации на добавку разобщителя - стал практически одинаковым для самок и самцов, составляя 96,2 ± 6,8 и 92,3 ± 7,1 соответственно.

Таким образом, нами обнаружено, что митохондрии интактных самок и самцов обладают различной устойчивостью к действию разобщителя. Большая у самцов по сравнению с самками способность митохондрий к поддержанию мембранного потенциала, скорее всего, является следствием ресопрягающего действия андрогенов (Starkov A.A., 1997). Реакция на острый стресс выражена только у самцов и заключается в усилении разобщенного окисления сукцината.

1.4.2 Параметры дыхания митохондрий самок и самцов при разобщенном окислении а-кетоглутарата в условиях покоя и острого стресса

Интенсивность разобщенного дыхания митохондрий (Vccp) составила 37,3 ±4,6 для самок и 31,4 ± 5,5 нг-ат Ог /мин/мг белка для самцов. Из этих данных видно, что у интактных самок разобщенное дыхание на а-кетоглутарате выше, чем у самцов, однако, из-за выраженной индивидуальной вариабельности эти различия не достигают достоверных значении (р>0,05).

О 50 100 150 200 250 300 350 Рис. 5 Типичные кривые поглощения кислорода митохондриями самок я самцов при добавлении разобщителя

самки самцы

Интересно, что при окислении а-кетоглутарата в условиях ингибирован-ной сукцинатдегидрогеназы процент активации дыхания на добавку разобщителя для митохондрий самок значительно ниже значения, полученного без добавления малоната (р<0,05). Для митохондрий самцов, наоборот, степень активации дыхания в присутствии малоната была выше, чем без него (р<0,05). Результаты свидетельствуют о том, что у интактных самок преобладает окисление сукцината, а доля окисляемого а-кетоглутарата относительно невелика, в то время как у самцов окисление сукцината и а-кетоглутарата сбалансировано. Особенно ярко выявляются эти половые различия при сравнении малонатчув-ствительной фракции дыхания самок и самцов (табл. 2). В условиях покоя процент дыхания снимаемого малонатом у самок выше, чем у самцов (р<0,05).

Таблица 2 Вклад эндогенного сукцината в потребление кислорода при разобщенном окислении а-кетоглутарата _

Группа Интактные Кастри] >ованнме

самки самцы самки самцы

контроль 38,0 ±2,2 А 30,5 ± 1,7 30,2 ± 2,5 Д. 18,6 ± 1,2»

стресс 30 мин 28,0 ±1,5* А 41,8 ±2,0 * 28,8 ± 1,8 А 45,2 ± 3,0 *

Примечание - Показатели даны в процентах к общему дыханию;

* р<0,05 относительно контроля;

Л р<0,05 относительно самцов;

• р<0,05 относительно животных не подвергавшихся кастрации

У стрессированных самцов в отличие от самок наблюдается значительная активация разобщенного окисления а-кетоглутарата. Скорость поглощения кислорода (Усср) у самцов возрастает после стресса до 48,0 ±3,8 нг-ат Ог /мин /мг белка, что достоверно выше, чем у самок и на 52,8% выше, чем у интактных самцов. Интересно, что после острого стресса митохондрии всех опытных животных полностью перестают реагировать на добавку разобщителя при окислении а-кетоглутарата в присутствии малоната. Это говорит о снижении окисления НАД-зависимых субстратов в условиях острого стресса и у самок, и у самцов. Острый стресс приводит к значительному увеличению малонатчувстви-тельной фракции дыхания у самцов и уменьшению этого показателя у самок (табл. 2). Снижение окисления НАД-зависимых субстратов подчеркивает ключевую роль сукцината в мобилизации энергетических резервов при стрессе.

1.5 Активность митохондриальных ферментов самок и самцов в условиях покоя и острого стресса

Нами было проведено исследование активности цитратсинтазы - фермента начального этапа цикла Кребса, сукцинатдегидрогеназы - фермента, имеющего особое 'значение при мобилизации энергетических ресурсов в условиях стресса и митохондриальной Н-АТФ-азы, активность которой отображает интенсивность энергетического обмена в целом.

Исследования показали, что активность сукцинатдегидрогеназы у ин-тактных самок на 37,7% больше, чем у самцов, составляя 184,9 ± 17,8 нМ мин /мгпротив 134,2 ± 11,8 нМ мин "'/мгбелка соответственно (рис. 6). У самок, по сравнению с самцами, на 20% повышенной оказалась и активность цитратсинтазы (рис. 6). Повышенная активность митохондриальных ферментов печени у самок в покое соответствует более интенсивному дыханию их митохондрий, которое было обнаружено нами (см. раздел 1.3 и 1.4).

контроль стресс контроль стресс

Рис. 6 Активность СДГ в покое и после Рнс. 7 Аетивность цитратсинтазы в покое

острого стресса у самок и самцов и после острого стресса у самок и самцов

Примечание - 9-самки, с? - самцы; *- р<0,05 относительно контроля,

Л - р<0,05 относительно самцов Активность АТФ-азы в митохондриях кардиомиоцитов составила 0,168 ± 0,016 мкмоль Фн/ мг белка в час у самок и 0,164 ± 0,015 мкмоль Фн/ мг белка в час у самцов. С меньшей интенсивностью идет энергетический обмен в митохондриях печени. Уровень АТФ-азной активности в печени у интактных самок и самцов достоверно не отличался, составив у самок 0,083 ± 0,013 мкмоль Фн/мг белка в час, а у самцов - 0,065 ± 0,012 мкмоль Фн/мг белка в час (рис. 8).

В митохондриях мозга активность АТФ-азного комплекса у самок составила 0,153 ± 0,015 мкмоль Фн/мг белка в час, а у самцов - 0,070 ± 0,002 мкмоль Фн/мг белка в час.

Из приведенных данных видно, что интенсивность энергетического обмена в мозге у самок в покое выше, чем у самцов, в 2,1 раза (р<0,05). Под воздействием острого стресса активность сукцинатдегидрогеназы у самцов увеличивав гся в большей степени по сравнению самками. У самок этот показатель достигает 147,5%, а у самцов 160,2% от контроля (р<0,05), что соответствует 272,7 ± 19,5 и 214,9 ± 20,2 нМ мин /мг белка соответственно (рис. 6). Необходимо отметить, что по абсолютным значениям активность сукцинатдегидрогеназы у самок, по сравнению с самцами, выше и в покое, и после стресса (р<0,05).

Иной характер носят изменения активности цитратсинтазы у самцов и самок в ответ на острый стресс. У самок активность этого фермента возрастает после стресса до 351,9 ± 28,5 нМ мин "'/мг "' белка, что составляет 130,1% от контроля (р<0,05).

У самцов, в отличие от самок, увеличение активности цитратсинтазы после стресса не достигает достоверных значений (рис. 7). Эти различия можно объяснить тем, что протекание полного цикла Кребса характерно для состояния покоя, а обход его начальных этапов, катализируемых цитратсинтазой, приводящий к ускоренному образованию сукцината, характерен для возбуждения. Как было показано, возбуждение мощнее реализуется у самцов, поскольку у них в условиях стресса в большей степени активируется сукцинатдегидрогена-за, что в совокупности с переаминированием представляет механизм ускоренного притока электронов в дыхательную цепь (Кондрашова М.Н., 1991).

В условиях стрессорного воздействия наблюдалась интенсификация энергетического обмена во всех изучаемых органах, как у самок, так и у самцов При этом наибольшее увеличение активности АТФ-азы отмечалось в сердечной мышце, по сравнению с тканями печени и мозга. Этот факт является наглядным подтверждением того, что основная нагрузка по энергообеспечению клеток в условиях стресса ложится на АТФ-синтезирующий аппарат митохондрий и успешность преодоления неблагоприятных условий во многом зависит от эффективности его работы (рис. 8).

0,20

контроль стресс

Рис. 8 Активность АТФ-азы митогандрий печени самок я самцов крыс в покое и в условиях острого стресса

Примечание- ■ самки @ самцы,

* р < 0,05 относительно контроля

1.6 Влияние кастрации самок и самцов на основные показатели ми-тохондриального дыхания в условиях покоя и стресса

1.6.1 Особенности фосфорилирующего дыхания митохондрий кастрированных самок и самцов в условиях покоя и острого стресса

Результаты исследования показали, что интенсивность фосфорилирующего дыхания в'покое у кастрированных самок на 28% выше, чем у кастрированных самцов (р<0,05) (рис. 9А). Важно отметить, что скорости фосфорилирующего дыхания митохондрий кастрированных животных практически не отличались от скоростей, полученных для интактных самок и самцов. Кроме того, по-

i 50 fI

S40

|зо

рю 4-

20 f-sÉb

кг

время, сек

140 £

|зо

о fe ¿20

<5* >10

----- -----Vr— -----

Д 1

-Х-г— ------- - -1-

время, сек

20 40 60 80 100 120

Рис. 9 Влияние острого стресса на интенсивность фосфорилирующего дыхания митохондрий кастрированных самок и самцов

Примечание - в качестве субстрата окисления сукцинат 4 тМ Интактные животные (А), после острого стресса (Б) Добавки 200 мкМ АДФ, гомогенат 50 мкл, * - р<0,05 относительно контроля, А - относительно самцов, х - относительно животных не подвергавшихся кастрации --самки самцы

еле кастрации, половые различия в интенсивности дыхания митохондрий в состоянии 3 остались на том же уровне, что и у интактных животных. Несмотря на это, кастрация привела к снижению энергетического контроля дыхания в митохондриях самцов. Это проявилось в повышении дыхания в состоянии 4 и, соответственно, снижении коэффициента дыхательного контроля. Снижение дыхательного контроля после кастрации у самцов, но не у самок, свидетельствует о том, что в митохондриях самцов сопряженность дыхания и фосфорилирования поддерживается андрогенами.

После стресса скорость АДФ-стимулированного дыхания (V3) осталась у кастрированных самок на прежнем уровне. Таким образом, у кастрированных самок, как и у интактных, отсутствует стрессогенная стимуляция фосфорилирующего дыхания, наблюдаемая у самцов. Аналогично интактным, кастрированные самцы отреагировали на стресс повышением интенсивности митохонд-риального дыхания в состоянии 3 до 53,1 ± 5,4 нг-ат Ог /мин /мг белка (р<0,05),

что на 52% выше, чем в покое (рис. 9Б).

Проведенные нами исследования показали, что половые гормоны не играют принципиальной роли в обеспечении половых различий по фосфорили-рующему дыханию митохондрий в покое и в условиях стресса (раздел 3.3) По-видимому, эти различия определяются другими механизмами, формирующимися еще в эмбриогенезе или в раннем постнатальном периоде.

1.6.2 Особенности разобщенного дыхания митохондрий кастрированных самок и самцов в условиях покоя и острого стресса

Мы обнаружили, что у кастрированных самок прирост дыхания на сук-цинате в ответ на добавку разобщителя практически такой же, как и у интакт-ных и составляет 115,7%. При этом, интенсивность разобщенного дыхания (Ус1-сср) У кастрированных самок ниже, чем у интактных и составляет

60 т

850

Ь40 Та

|зо

•520

>10

Усср

Г"

^__________

время, сек

0 20 40 60 80 100 о 20 40 60 80 100

Рис. 10 Разобщенное окисление сукцината митохондриями кастрированных самок и самцов в условиях покоя и острого стресса

Примечание в качестве субстрата окисления сукцинат 4 тМ Контроль (А), острый стресс (Б) Добавки 10 ~6 М С1-ССР, го.могенат 50 мкл, * - р<0,05 относительно контроля, х - относительно животных не подвергавшихся кастрации,--самки самцы

43,2 ± 4,3 нг-ат Ог /мин /мг белка. Таким образом, кастрация снизила общую интенсивность разобщенного дыхания при окислении сукцината, но не повлияла на устойчивость митохондриального потенциала у самок (рис. 10).

В отличие от самок, у самцов после кастрации значительно снизилась устойчивость мембранного потенциала к разобщителю. Так, после добавления в ячейку 10'6 М С1-ССР дыхание митохондрий кастрированных самцов активировалось на 112,9%. На рис. 10 видно, что у кастрированных самок и самцов скорость разобщенного дыхания (Усср) при окислении сукцината митохондрий практически не отличается. Таким образом, кастрация значительно снижает устойчивость мембранного потенциала митохондрий самцов и не влияет на этот

показатель у самок.

Измерение дыхания митохондрий на а-кетоглутарате в присутствии ма-лоната - ингибитора СДГ показало, что вклад эндогенного сукцината в общее дыхание и после кастрации у самок выше, чем у самцов (табл. 2). После острого стресса интенсивность дыхания митохондрий на сукцинате увеличилась почти во всех исследуемых состояниях и у кастрированных самок и самцов (рис. 10Б). Напомним, что у самок, не подвергавшихся кастрации, не наблюдалось стрес-согенной активации дыхания. Также мы выяснили, что кастрация привела к появлению стрессогенной активации окисления а-кетоглутарата у самок.

Применение малоната в качестве ингибитора СДГ позволило выявить, что половые различия по малонатчувствительной фракции дыхания митохондрий сохраняются и после кастрации животных (табл. 2). В покое вклад эндогенного сукцината в дыхание выше у кастрированных самок, чем у самцов. После стресса этот показатель не изменяется достоверно у самок, но в то же время значительно возрастает у самцов.

Обобщая приведенные выше факты можно отметить, что кастрация животных изменяет параметры разобщенного дыхания митохондрий в условиях покоя и острого стресса. Дефицит половых гормонов вызывает снижение мито-хондриального дыхания при разобщенном окислении сукцината. У кастрированных самок, в отличие от интактных, острый стресс сопровождался активацией разобщенного окисления сукцината и а-кетоглутарата. По-видимому, дефицит половых гормонов снижает устойчивость трансмембранного потенциала самцов и, в конечном счете, уравнивает сопряженность митохондрий самок и самцов. Показано, что у самцов реакция на острый стресс осуществляется за счет усиления окисления эндогенного сукцината и сохраняется и в условиях дефицита половых гормонов.

выводы

1. Адреналин и серотонин опосредуют действие стресс-реализующей и стресс-лимитирующей систем на уровне митохондрий. Это выражается в том, что окисление сукцината активируется под действием адреналина и ингибирует-ся под влиянием серотонина.

2. Использование ЭГТА при получении митохондриального препарата приводит к снижению эффекта адреналина на митохондрии, что, может быть, обусловлено нарушением работы сигнальных систем клетки в результате связывания ионов кальция. Целесообразно исключение ЭГТА из среды выделения для повышения сохранности получаемого митохондриального препарата.

3. В условиях покоя митохондрии самок по сравнению с митохондриями самцов обладают большей активностью сукцинатдегидрогеназы и цитратсинта-зы и более интенсивно окисляют сукцинат при фосфорилирующем и разобщенном дыхании.

4. Устойчивость мембранного потенциала к действию разобщителя в митохондриях самцов выше, чем в митохондриях самок.

5. Острый стресс приводит к усилению окисления сукцината у самцов, но не у самок. Это выражается в активации фосфорютирующего и разобщенного дыхания на сукцинате и увеличении активности сукцинатдегидрогеназы в митохондриях самцов.

6. АТФ-аза сердечной мышцы в условиях покоя обладает наибольшей активностью по сравнению с АТФ-азой печени и мозга При этом, если в сердце у самок и самцов в покое активность фермента одинакова, то в мозге и печени самок этот показатель значительно выше, чем у самцов. Острый стресс вызывает мощную активацию митохондриальной АТФ-азы во всех исследуемых органах.

7. Половые различия по параметрам фосфорилирующего дыхания митохондрий в условиях покоя и острого стресса принципиально не зависят от уровня половых гормонов и, видимо, обусловлены иными факторами.

8. Дефицит половых гормонов снижает устойчивость трансмембранного потенциала самцов и, в конечном счете, уравнивает сопряженность митохондрий самок и самцов. После кастрации исчезают половые различия по параметрам разобщенного дыхания митохондрий в условиях покоя и острого стресса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Половые особенности кардиоваскулярной и глюкокортикоидной чувствительности к острому стрессу на фоне изоляции у белых крыс // Тез. докл. Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения И.П. Павлова. Санкт-Петербург, 1999. С. 342 (соавт.

Якушева Т.А., Анищенко Т.Г., Шорина JI.H.).

2. Gender related differences in cardiovascular, glucocorticoid and lipid peroxidation responses to different types of stressors in rat II Oxidative Pathways in Health and Disease Conference. Sydnay, Australia, 1999. P. 134 (соавт. Anishchenko T.G., Yakusheva T.A., Shorina L.N.).

3. Половые особенности гемодинамических, гормональных и метаболических сдвигов при различных стрессорных воздействиях // Тез. докл. Всероссийской научной конференции «Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия» Астрахань, 1999. С. 68-69 (соавт. Анищенко Т.Г, Якушева Т.А., Шорина Л.Н.)

4 Влияние острого и хронического стресса на кардиоваскулярные, гормональные и метаболические показатели у самок и самцов крыс // Науч. вестник Тюмен.Мед.Академии. Тюмень, 1999. № 3-4. С. 134 (соавт. Якушева Т.А., Анищенко Т.Г., Шорина Л.Н.).

5. The influence of different type of stress on lipid peroxidation levels and mitochondrial ATP-ase activity in female and maile rats // 5th Symposium «Free Radicals in Biology and Medicine». Lodz, Poland, 2000. P. 183 (соавт. YakysheVa T.A., Anishchenko T.G., Dmitrieva O.S.).

6. The influence of gender and type of stress on cardiovascular, glucocorticoid and metabolic responses in rat // Tenth European meeting on Hypertension. Goteborg, Sweden, 2000, Vol. 16, Suppl. 2, P. 131 (соавт. Anishchenko T.G., Yakysheva T.A., Shorina L.N.).

7. Влияние различных видов стресса на глюкокортикоидную активность и метаболические показатели у самок белых крыс // Всероссийская конференция «Нейроэндокринология-2000». Санкт-Петербург, 2000 С 144 (соавт. Якушева Т.А., Анищенко Т.Г, Шорина JI.H.).

8. Половые особенности перекисного окисления липидов (ПОЛ) при остром и хроническом стрессе и их комбинации // Тез. докл. 7 Всероссийской студенческой научной конференции «Экология и проблемы защиты окружающей среды»'. Красноярск, 2000 С. 247 (соавт. Семенова А.В., Кокарева А.В )

9. Gender differences in stress-induced changes in energy metabolism and lipid peroxidation in heart mitochondria // II International Meeting «Oxidative stress: Biochemistry and Pathophysiology». Valencia, Spain, Nov. 30-Dec. 2, 2000. P 23 (соавт. Anishchenko T G., Jakusheva T.A., Dmitrieva O.S.).

10. Половые особенности кардиоваскулярной стресс-реактивности и их механизмы // Вестник РАЕН. Саратов, 2000, Т. 2, № 2. С. 104-112 (соавт. Ани-щенко Т.Г., Игошева Н.Б., Шорина JI.H., Якушева Т.А., Глушковская-Семячкина О.В., Климова О.А.).

11. Cardiac energy metabolism and lipid peroxidation in stressed male and female rats // Current Topics in Biophysics, 2000, Vol.24 (2), P. 7-11 (соавт. Anishchenko T.G., Yakusheva T.A., Dmitrieva O.S.).

12. Половые особенности кардиоваскулярной, глюкокортикоидной и вегетативной чувствительности к стрессам у белых крыс // Материалы Международного форума по проблемам науки, техники и образования. Москва, 2000, Т.2. С. 85-87 (соавт. Анищенко Т.Г., Глушковская-Семячкина О.В., Шорина JI.H., Якушева Т.А., Гаврилова М.Г.).

13. Энергетический метаболизм и перекисное окисление липидов у стрес-сированных самок и самцов крыс // Тез. докл. Всероссийской конференции «Митохондрии в патологии». Пущино, 28-31 мая, 2001. С. 35 (соавт. Якушева Т.А., Анищенко Т.Г., Дмитриева О.С.).

14. Energy metabolism in the heart mitochondria during different stressful situations in male rats // Eleventh European Meeting on Hypertension, Milan, Italy, June 15-18,2001, Vol.19, suppl 2. P. 42 (соавт. Yakusheva T.A., Anishchenko T.G., Kokareva A.B.).

15. Influence of different type of stress and sex of animas on heart energy metabolism // Satellite Meeting of the XVII World Congress «Regulation of Energy Metabolism in the Heart and Vasculature». Banff, Alberta, Canada, July 2-5, 2002. P. 23 (соавт. Anishchenko T.G., Yakusheva T. A., Dmitrieva O.S.).

16. Влияние введенного адреналина и серотонина in vivo на окисление сукцината и а-кетоглутурата в митохондриях печени и мозга // Тез. докл. Всероссийской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущино, 2002, Т. 1, С. 19 (соавт. Лямзаев К.Г., Федотчева Н.И., Кондрашова М.Н.).

17. Роль а-кетоглутарата в антиоксидантной активности митохондрий // Тез. докл. Всероссийского съезда «Биоантиоксидант». Москва, 16-19 апреля, 2002. С. 584 (соавт. Федотчева Н.И., Лямзаев К.Г., Кондрашова М.Н.).

18. Reciprocal effect of adrenaline and serotonin on oxidation of succinate and a-ketoglutarate in rat liver and brain homogenates // Mitochondrion, 2002. №1. P. 519 (соавт. Fedotcheva N.I., Kondrashova M.N.).

19. Переключение бикарбонатом окисления сукцината на окисление а-кетоглутарата как защитный фактор при гипоксии // Тез. докл. III Российского съезда «ГИПОКСИЯ». Москва, 7-9 октября 2002. С. 133 (соавт. Федотчева Н.И., Игнатьев Д.А., Темное А.В., Захарченко М.В., Кондрашова М.Н.).

20. Реципрокный эффект адреналина и серотонина на окисление сукци-ната и а-кетоглутарата в гомогенатах печени и мозга крыс // Материалы I Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва, 16-19 октября, 2002. С. 467 (соавт. Федотчева Н.И., Кондрашова М.Н.).

21. Different resistance to uncoupler of respiration in rat liver mitochondria of males and females // 3rd FEPS Congress. Nice, France, 28 june - 2 july, 2003. P. 76 (соавт. Anishchenko T.G., Fedotcheva N.I., Kondrashova M.N.).

22i Энергетический обмен у самок и самцов крыс в условиях стресса И Тез. докл. конференции к 60-летию Российской академии медицинских наук. Санкт-Петербург, 21 -22 октября 2004. С. 119 (соавт. Быкова И.Ю., Синякова C.B., Кондрашова М.Н., Анищенко Т.Г.).

23. Изменения митохондриального метаболизма у самок и самцов крыс в условиях стресса // Материалы заочной электронной конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии». 20-25 сентября 2004. (соавт. Быкова И.Ю., Кондрашова М.Н., АнищенкоТ.Г.).

24. Влияние стресса на энергетический обмен и перекисное окисление липидов у самок и самцов крыс // Материалы науч.-практ. конференции «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». Астрахань, 6-10 мая 2004. С. 259-263 (соавт. Быкова И.Ю., Кондрашова М.Н., АнищенкоТ.Г.).

25. Половые особенности энергетического обмена у крыс в условиях покоя и острого стресса // Известия Саратовского университета. Сер. Химия. Биология. Экология. Вып. 2, 2005. С. 63-67 (соавт. Быкова И.Ю., АнищенкоТ.Г., Кондрашова М.Н.).

Заказ № /г Объем 1 п.л.

Центр полиграфических и копировальных услуг. Предприниматель Серман Ю.Б Свидетельство № 3117. 4100600, Саратов, ул. Московская, 157, офис 19.

j i

i t

1И8 24 9

РНБ Русский фонд

2006-4 16996

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Леонтьев, Данила Сергеевич

Список сокращений

Введение

Глава I Обзор литературы

1.1 Особенности адаптационной реакции у самок и самцов

1.2 Роль митохондрий в поддержании активной работы и обеспечении стресс-резистентности организма

1.2.1 Строение и функции митохондрий

1.2.2 Проявление стресса на уровне митохондрий

Глава II Материалы и методы исследований

2.1 Объекты исследований

2.2 Методы исследований 29 2.2.1 Получение митохондриального препарата

Р 2.2.2 Методика выделения митохондрий

2.2.3 Измерение поглощения кислорода митохондриями печени

2.2.4 Определение параметров дыхания митохондрий

2.2.5 Измерение активности митохондриальной АТФ-азы

2.2.6 Определение активности сукцинатдегидрогеназы

2.2.7 Определение активности цитратсинтазы

Глава III Результаты исследований

3.1 Влияние введения адреналина и серотонина на митохондриальное окисление сукцината и а-кетоглутарата

3.2 Влияние ЭГТА в среде выделения на выявление эффекта адреналина щ 3.3 Особенности фосфорилирующего дыхания митохондрий самок и самцов в условиях покоя и острого стресса 53 3.4 Особенности разобщенного дыхания митохондрий самок и самцов в условиях покоя и острого стресса

3.4.1 Параметры дыхания митохондрий самок и самцов при разобщенном окислении сукцината в условиях покоя и острого стресса

3.4.2 Параметры дыхания митохондрий самок и самцов при разобщенном окислении а-кетоглутарата в условиях покоя и острого стресса

3.5 Активность сукцинатдегидрогеназы и цитратсинтазы у самок и самцов в условиях покоя и острого стресса

3.6 Активность митохондриальной АТФ-азы у самок и самцов в условиях покоя и острого стресса

3.7 Влияние кастрации самок и самцов на основные показатели митохондриального дыхания в условиях покоя и острого стресса

3.7.1 Особенности фосфорилирующего дыхания митохондрий кастрированных самок и самцов в условиях покоя и острого стресса

3.7.2 Особенности разобщенного дыхания митохондрий кастрированных самок и самцов в условиях покоя и острого стресса

Глава IV Обсуждение результатов исследования Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Половые особенности митохондриального метаболизма в условиях покоя и острого стресса"

Актуальность проблемы Одним из самых ярких проявлений феномена полового диморфизма является меньшая по сравнению с женщинами, продолжительность жизни мужчин, а также большая уязвимость последних к действию стрессорных и патологических факторов (Анищенко Т.Г., 2001, Vina J, Sastre J, Pallardo F, Borras C., 2003). Несмотря на имеющиеся сведения о различиях в стресс-устойчивости самок и самцов, вопрос о причинах этих различий остается открытым, а экспериментальная биология продолжает описывать механизмы стресса на примере самцов, что в конечном итоге скрывает от исследователей значительную часть проблемы.

Известно, что реакция на действующий стресс-фактор носит типовой характер и заключается в последовательной активации стресс-реал и зующей и стресс-лимитирующей систем, основными представителями которых являются соответственно адреналин и серотонин (Меерсон Ф.З., 1979). Каскад этих реакций в конечном итоге направлен на перераспределение энергетических ресурсов и повышение эффективности преобразования энергии окисляемых субстратов в форму АТФ митохондриями.

Однако, существующие данные о влиянии гормонов стресса на метаболизм митохондрий зачастую противоречивы и сделать по ним обобщение затруднительно. Существуют сведения об ингибировании ферментов цикла Кребса в условиях стресса (Покровский А.А. и др., 1968). В то же время сообщалось, что катехоламины активируют митохондриальные ферменты (Кулинский В.И., 1977) и, в частности, сукцинатдегидрогеназу (Вдовиченко JI.M., 1973). Одной из причин этого может являться то, что общепринятые методы работы с митохондриями не позволяют выявлять такие тонкие физиологические эффекты как влияние гормонов на ферментные системы митохондрий. Это побуждает к поиску таких методических подходов, благодаря которым получаемые митохондрии максимально сохраняли бы свои физиологические свойства, присущие им в целом организме. В частности, показано, что использование гомогенатов тканей, а не отмытых митохондрий, позволяет исследовать митохондрии в условиях, значительно приближенных к физиологическим (Kondrashova M.N., 2001). Есть сведения о том, что реакция на стресс или переход к интенсивной деятельности связаны с увеличением вклада сукцината в процессы окисления в митохондриях (Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В., 1985). Открытие многих уникальных свойств сукцината позволило обособить его в ряду субстратов цикла Кребса и охарактеризовать его как наиболее мощный источник энергии в митохондриях (Кондрашова М.Н., 1991). Обнаружено, что мужские стероидные гормоны при добавлении in vitro существенно повышают сопряжение в дыхательной цепи, поддерживаемое окислением сукцината. Высказано предположение, что обеспечение максимального сопряжения под действием стероидных гормонов формирует резерв для развития более интенсивной работы мужскими особями (Starkov А.А., 1997) Учитывая зависимость скорости образования активных форм кислорода от величины мембранного потенциала митохондрий (Владимиров Ю.А. и др., 1972; Иванова Е.В., 1991) можно предположить, что такое преимущество может обернуться для самцов усилением повреждения ДНК и, как следствие, уменьшением продолжительности жизни (L. Borras, 2003).

Цель исследования Изучение влияния гормонов стресса и фактора пола на митохондриальный метаболизм в условиях покоя и острого стресса, а также исследование возможного влияния половых гормонов на ферментные системы митохондрий с предварительной модификацией метода получения митохондриального препарата.

Задачи исследования

4. Изучить половые особенности в активности сукцинатдегидрогеназы, цитратсинтазы и АТФ-азы митохондрий в условиях покоя и острого стресса.

Научная новизна:

Нами был модифицирован метод получения митохондриалыюго препарата, что позволило впервые применить для представленных исследований гомогенаты тканей без использования ЭГТА в качестве хелатора. Получены оригинальные данные о стимулирующем влиянии адреналина и подавляющем действии серотонина на окисление сукцината.

Научная и практическая значимость работы

Полученные результаты расширяют представления о механизмах реализации стресса на субклеточном уровне. Обнаружено, что митохондрии участвуют в формировании стрессорного ответа, что выражается в наращивании мощности окисления сукцината, в то время как окисление НАД-зависимых субстратов не увеличивается или даже снижается.

Предотвращение гиперактивации митохондриального аппарата при длительном стрессе может обеспечивается торможением Сукцинатдегидрогеназы серотонином - гормоном стресс-лимитирующей системы.

Положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Основные результаты диссертационного исследования были доложены и обсуждены на заседаниях кафедры физиологии человека и животных,

Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 1999), Российской конференции «Нейроэндокринология - 2000» (СанктjL

Петербург, 2000), 5 Symposium «Free Radical in Biology and Medicine»(Poland, Lodz, 2000), Восьмой международной конференции «Математика, компьютер, образование» (Пущино, 29 января-4 февраля 2001 года), Всероссийской конференции «Митохондрии в патологии» (Пущино, 28-31 мая 2001 года), XI европейском конгрессе по гипертензии «13th European Meeting on Hypertension» (Италия, Милан, 2001 г), Научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 6-10 мая 2004 года).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, выводов и списка литературы, включающего 78 отечественных и 93 иностранных источника. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 18 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Леонтьев, Данила Сергеевич

выводы

Адреналин и серотонин опосредуют действие стресс-реализующей и стресс-лимитирующей систем на уровне митохондрий. Это выражается в том, что окисление сукцината активируется под действием адреналина и ингибируется под влиянием серотонина.

Использование ЭГТА при получении митохондриального препарата приводит к снижению эффекта адреналина на митохондрии, что, может быть, обусловлено нарушением работы сигнальных систем клетки в результате связывания ионов кальция. Целесообразно исключение ЭГТА из среды выделения для повышения сохранности получаемого митохондриального препарата.

В условиях покоя митохондрии самок по сравнению с митохондриями самцов обладают большей активностью сукцинатдегидрогеназы и цитратсинтазы и более интенсивно окисляют сукцинат при фосфорилирующем и разобщенном дыхании.

Устойчивость мембранного потенциала к действию разобщителя в митохондриях самцов выше, чем в митохондриях самок. Острый стресс приводит к усилению окисления сукцината у самцов, но не у самок. Это выражается в активации фосфорилирующего и разобщенного дыхания на сукцинате и увеличении активности сукцинатдегидрогеназы в митохондриях самцов.

АТФ-аза сердечной мышцы в условиях покоя обладает наибольшей активностью по сравнению с АТФ-азой печени и мозга. При этом, если в сердце у самок и самцов в покое активность фермента одинакова, то в мозге и печени самок этот показатель значительно выше, чем v самцов. Острый стресс вызывает мощную активацию митохондриальной АТФ-азы во всех исследуемых органах.

Половые различия по параметрам фосфорилирующего дыхания митохондрий в условиях покоя и острого стресса принципиально не зависят от уровня половых гормонов и, видимо, обусловлены иными факторами.

113

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Леонтьев, Данила Сергеевич, Саратов

1. Агаджанян П.А., Макарова И.И. Среда обитания и реактивностьорганизма. Тверь: Изд-во «Фамилия», 2001. 176 с.

2. Анищенко Т.Г. К анализу факторов, детерминирующих половыеразличия в стрессовых реакциях у белых крыс // Успехи современной биологии. -1989. -Т. 129. -№11. -С. 616-618.

3. Анищенко Т.Г. Половые аспекты проблемы стресса и адаптации //

4. Успехи современной биологии. 1991. - Т. 111, вып. 3. - С. 460-469.

5. Анищенко Т.Г., Игошева П.Б., Шорина Л.Н. и др. Половыеособенности кардиоваскулярной стресс-реактивности и их механизмы // Доклады РАЕН (вып. 2). Саратов: Сарат.гос.тех. ун-т, -2000.-С. 104-112.

6. Анищенко Т.Г., Мамонтов Б.Н., Шорина Л.Н Половые различияхолинэргического статуса у белых крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1992. -№ 10. -С. 351-353.

7. Анищенко Т.Г., Шорина Л.П., Игошева Н.Б., Глушковская

8. Семячкина О.В. Половые особенности глюкокортикоидной и кардиоваскулярной реактивности к стрессовым воздействиям в условиях блокады холинергической системы // Естественные науки, Изд-во АГПУ. 2000. -Т.2.- С. 99-105.

9. Анохин П.К. Эмоции // БМЭ. 1978. - Т.82. -С. 339-358.

10. Белогрудов Г.И., Ильин Е.Ф., Гринкевич В.А., Медяков Н.И. Изучениетопографии OSCP в Н+-АТФазном комплексе митохондрий сердца быка // Биомембраны. 1988. - Т.5. - № 7. - С. 84-88.

11. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина.1990.-221 с.

12. Вайнштейн И.И., Сомонов II.В. Эмоциональные структуры мозга исердца. М.: Наука, 1974. - 96 с.

13. И. Васильев В.Н., Чугунов B.C. Симпато-адреналовая активность при различных функциональных состояниях человека. М.: Медицина, 1985.-268 с.

14. Вдовиченко JI.M. О действии некоторых нейромедиаторов насукцинатдегидрогеназную активность // Биохимия. 1973. - Т. 38., вып. 1.-С. 22-27.

15. Ведяев Ф.П., Воробьева Т.М. Модели и механизмы эмоциональныхстрессов. Киев: Здоровье, 1983.- 243 с.

16. Ветренко Т.В. Активность АТФазы мозга и сердца в условияхнейроанергии // Тез. докл. Всесоюз. съезда патофизиологии «Механизмы повреждения, резистентности, адаптации и компенсации». Ташкент, 1976. - С. 221-222.

17. Виноградов А.Д. Митохондриальные АТР-синтезирующая машина:пятнадцать лет спустя // Биохимия. 1999. - Т. 64, - вып. 11. - С. 1443-1456.

18. Виноградов А.Д., Лейкин Ю.Н., Липская Т.Ю. Биохимиямитохондрий: руководство к практическим занятиям по биохимии животных. Изд. Московского университета, 1977. - С. 54.

19. Виру А.А. Гормональные механизмы адаптации и тренировок.1. Л.: Наука, 1981.- 155 с.

20. Владимиров Ю.А. Лекции по биофизике мембран: Биоэнергетическиефункции митохондрий. М.: Наука, 1999.- 75-92 с.

21. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление лигшдов вбиологических мембранах. М.: Паука - 1972, 252 с.

22. Вундер П.А., Андронов Е.В., Андронова Т.А. Стрессорные реакции ироль пола в их осуществлении // Успехи современной биологии. -1999.-Т. 119, №4.-С. 335-344.

23. Газенко О.Г., Меерсон Ф.З. Физиология адаптационных процессов.

24. М.: Наука, 1986.- 521-621 с.

25. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции.1. М.: Мир, 1997.-622 с.

26. Геодакян В.А. Эволюционная теория пола // Журнал общей биологии.- 1991,-№8. -С. 14-19.

27. Геодакян В.А. Эволюционные хромосомы и половой диморфизм //

28. Известия Академии Наук, серия биологическая. 2000. - № 2. - С. 133.

29. Гичев 10.П. Роль печени в стрессорных реакциях организма //Успехифизиологических наук. 1990. - Т. 21. - № 1. - С. 23 - 46.

30. Горанчук В.В., Шустов Е.Б., Андреева Л.И. и др. Биохимическиедетерминанты и механизмы развития экстремальной гипоксической гипоксии // Физиология человека. -1999. -Т.25. -№4. -С. 118-129.

31. Гринене Э., Вайткявичус В.Ю., Марачинскене Э. Особенностисердечного ритма у школьников // Физиология человека. 1984.-Т.16.- № 1.-С. 88-93.

32. Гринхалг P.M. Гормоны и сосудистые заболевания. М.: Медицина,1984.-342 с.

33. Губачёв Ю.М., Иовлев Б.В. Эмоциональный стресс в условиях нормыи патологии. М.: Медицина, 1976. -224 с.

34. Добромыслова О.П., Лесняк Г.П. Системная и периферическаягемодинамика у здоровых людей разного возраста и пола // Физиология человека. 1986. - Т. 12. -№ 4. - С. 585-590.

35. Иванова М.В. Взаимосвязь перекисного окисления липидов иокислительного фосфорилирования в митохондриях печени. Канд. дисс. Москва, 1990. - 126 с.

36. Инчина В.И., Зорькина А.В., Костин Я.В. Адаптация к физическимнагрузкам после воздействия иммобилизационного стресса // Вестник PAMI I. -1996. №9. - С. 18-20.

37. Киладзе А.А., Евторненко Ю.В., Сухомудренко А.Г. Зависимость

38. АТФазной активности растворимой Н+-АТФазы от температуры // Биофизика. 1980. - Т. 25. - вып.2. - С. 43-48.

39. Киршенблат Я.Д. Практикум по эндокринологии. М.: Высшаяшкола, 1969. 256 с.

40. Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия. М.: Мир, 2000. 212 с.

41. Кондрашова М.Н. Взаимодействие процессов переаминирования иокисления карбоновых кислот при разных функциональных состояниях ткани // Биохимия. 1991. Т.56, вып. 3. С. 388-404.

42. Кондрашова М.Н. Митохондрии. М.: Наука, 1969. - 23 с.

43. Кондрашова М.Н., Ананенко А.А. Обследование состояниявыделенных митохондрий / В кн.: Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом, под. ред. акад. Г.М. Франка. М.: Наука, 1973. 106-128 с.

44. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В. Проявление стресса на уровнемитохондрий, их стимуляция гормонами и регуляция гидроазроионами // Журнал общей биологии. 1985. - Т.46. - №4. -С. 516-526.

45. Ксенжек О.С., Петрова С.А. Электрохимические свойства обратимыхбиологических редокс-систем. М.: Наука, 1986. - 112 с.

46. Кулинский В.И., Воробьева Л.М. Активация катехоламинами дыханиямитохондрий печени // Бюллетень экспериментальной биологии. -1977.-№6.-С. 675.

47. Ленинджер А. Митохонрия. М.: Мир, 1966. - 313 с.

48. Локтионова С.А., Кабаков А.Е. Роль щелочных фосфатаз вподдержании эндотолиального цитоскелета // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001. - Т. 132. - № 9. С. 350-353.

49. Ляшенко М.М., Бригидина В.Я. Неустойчивость энергетическогообмена при стрессе // Тез. докл. Всесоюз. симпоз. «Метаболическая регуляция физиологического состояния», Пущино, 1984. С. 24-25.

50. Маевский Е. И., Кондрашова М.Н. // Митохондриальные процессы.

51. Пущино: ОНТИ НЦБИ, 1978. С. 24-32.

52. Маевский Е.И., Гришина Е.В., Розенфельд А.С. и др. Анаэробноеобразование сукцината и облегчение его окисления возможные механизмы адаптации клетки к кислородному голоданию // Биофизика. 2000. - Т.45. - С. 509-513

53. Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека / Перевод проф. Горкина

54. B.З.-М.:Мир, 1980.- 368 с.

55. Малеев В.А. Изменение энергетических реакций митохондрий печеникрыс разного возраста под влиянием адреналина / В кн.: Физиология, биохимия и биофизика возрастного развития. Киев, Наук, думка, 1980.- 190-194 е.

56. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека.1. М.: Мир, 1993.- 127 с.

57. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Мир, 1964.235 с.

58. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука, 1981.278 с.

59. Меерсон Ф.З., Каткова Л.С. Сократительная функция миокарда приобратном развитии адаптации к коротким стрессовым воздействиям

60. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1984. -№ 12.-С. 655-657.

61. Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г. Адаптация к стрессу ифизиологическим нагрузкам. М.: Медицина, 1988. - 256 с.

62. Методы биохимических исследований / Под. ред. проф. Прохоровой

63. М.И. Ленинград, 1982. - 207-209 с.

64. Николе Д.Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию.1. М.: Мир, 1985.- 190 с.

65. Панин J1.E. Биохимические механизмы стресса. Новосибирск:1. Наука, 1983.-233 с.

66. Покровский А.А., Арчаков А.И., Любимова Н.А. и др. Современныеметоды в биохимии. М.: Наука, 1968. - 278 с.

67. Покровский А.А., Панченко Л.Ф., Шпаков А.А., Ивков II.II. Изучениеактивности ферментов митохондрий печени белых крыс при полном голодании // Вопросы медицинской химии. 1968. - Т. 15, № 4, С. 421-424.

68. Пшенникова М.Г., Голубева Л.Ю., Кузнецова Б.А. Различия в стрессреакции и формировании адаптации к стрессу у крыс Август и Вистар // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1996. Т. 122. - №8. - С.1 56-159.

69. Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы: новые взгляды. М.: Мир,1979.-С. 85-106.

70. Самарцев В.Н. Жирные кислоты как разобщители окислительногофосфорилирования // Биохимия. 2000. - Т.65, вып. 9. - С. 11731189.

71. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989.- 564 с.

72. Страер Л. Биохимия. М.: Мир, 1984. - Т.2, 64 с.

73. Суворова В.В. Психофизиология стресса. М.: Педагогика, 1975. 206с.

74. Судаков К.В. Психоэмоциональный стресс: профилактика иреабилитация // Терапевтический архив. 1997. - № 1. - С. 70-74.

75. Судаков К.В. Эмоциональный стресс / Повое в физиологии. Серия

76. Биология. 1983. - № П.-С. 36.

77. Тапбергенов С.О. Метаболизм катехоламинов и активностьмигохондриальных ферментов // Вопросы медицинской химии. -1982. -№28. С. 52.

78. Тигранян Р.А. Стресс и его значение для организма. М.: Наука,1988.-175 с.

79. Тимочко М.Ф., Гойда Е.А., Гузар И.Б. Влияние введения микродозадреналина на АТФ-азную активность и оптическую плотность митохондрий различных органов крыс / В кн.: Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции. Пущино: ОНТИ НЦБИ, 1981. -67 е.

80. Тычинский В.П., Вайсс Д. // Биофизика. 2000. Т. 45. - С. 870-877.

81. Фёдоров Б.М. Эмоции и сердечная деятельность. М.: Медицина,1977. -215 с.

82. Федотчева 11.И., Леонтьев Д.С., Лямзаев К.Г., Литвинова Е.Г.,

83. Кондрашова М.Н. Роль окисления а-кетоглутарата в антиоксидантной активности митохондрий // Материалы всероссийской конференции «Биоантиоксидан г». Москва, 2002. - С. 119.

84. Фролов М.В., Свиридов E.II. Амплитуда Т зубца ЭКГ как коррелятэмоционального напряжения // Журнал высшей нервной деятельности. -1974. -Т.24. -№ 5. С. 1052-1055.

85. Фурдуй Ф.И. Физиологические механизмы стресса и адаптации приостром действии стресс-факторов. Кишинев: Шгиинца, 1986. - 239 с.

86. Хайдарлиу С.Х. Функциональная биохимия адаптации. Кишинев:1. Штиинца, 1984.-2272 с.

87. Чазов Е.И. Болезни сердца и сосудов.- М.: Медицина, 1992. Т.1,490 с.

88. Шостаковская И.В., Долиба II.М., Гордий С.К., Бабский A.M.,

89. Кондрашова М.Н. Активация ацетилхолином окисления а- кетоглутарата в митохондриях печени. Украинский биохимический журнал. 1986. - Т.58. - С. 54-61.

90. Юматов Е.А. Сердечно-сосудистые реакции при эмоциональномнапряжении // Физиология человека. 1980. -Т.6.-№ 5. - С. 893-906.

91. Allen М.Т., Matthews К.А. Hemodynamic responses to laboratorystressors in children and adolescents: the influences of age, race, and gender // Psychophysiology. 1997. - № 34. - P. -329.

92. Arnold S, Goglia F, Kadenbach B. 3,5-Diiodothyronine binds to subunit Vaof cytochrome с oxidase and abolishes allosteric inhibition of respiration by ATP // Eur. J. Biochem. 1998. - V.252. - P. 325-330.

93. Arnold S., Kadenbach B. Cell respiration is controlled by ATP, anallosteric inhibitor of cytochrome с oxidase // Eur. J. Biochem. 1997. -V.249. - P. 350-354.

94. Balaban R.S. Regulation of oxidative phosphorylation in the mammaliancell //Am. J. Physiol. 1990. - V.258. - P. 377-389.

95. Bedran-de-Castro M.T. Sex-related differences in cardiovascular responsesto common carotid occlusion in conscious rats // Braz.J.Med.Biol.Res. -1992.-V.25.-P.951-955.

96. Bereiter J. Behavior of mitochondria in the living cell // Int. Rev. Cytol.1990.-V.122.-P. 1-63.

97. Bereiter J., Voth M. Dynamics of mitochondria in living cells: shapechanges, dislocations, fusion, and fission of mitochondria // Microsc. Res. Tech. 1994. - № 27. - P. 198-219.

98. Brookes P.S., Hulbert A.J., Brand M.D. The proton permeability ofliposomes made from mitochondrial inner membrane phospholipids: no effect of fatty acid composition // Biochim. Biophys. Acta. 1997.-V.1330.-P. 157-164.

99. Brown G.C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalianmitochondria and cells // Biochem. J. 1992. - V.284. - P. 1-13.

100. Brunk C.F. Mitochondrial proliferation during myogenesis // Exp. Cell.

101. Res. 1981. - V.136. - P. 305-309.

102. Carlsson M., Carlsson A. Effect of mild stress on adrenal and heartcatecholamines in male and female rats // J. Newral Transmiss. 1989. -У.11- №2-3.-P. 217-226.

103. Carter D.A., Williams T.D. A sex difference in endogenous opioidregulation of the posterior pituitary response to stress in the rat // J. Endocrinol. -1986. -№ 2. P. 239-244.

104. Chance В., Hagihara B. Direct spectroscope measurements of interaction ofcomponents of the respiratory chain with ATP, ADP, phosphate and uncoupling agents. In: Proc. Of the Intern. Congr. Of Biochemistry. V. 5. Moscow: Pergamon Press, 1961, p. 10-43.

105. Chance В., Williams G. The respiratory chain and oxidativephosphorylation //Adv. Enzymol. 1956. - № 17. - P. 65-134.

106. Chen L.B. Mitochondrial membrane potential in living cells // Annu. Rev.

107. Cell. Biol. 1988. - № 4. - P. 155-181.

108. Claude A. Fractionation of mammalian liver cells by differentialcentrifugation //J. Exp. Med. 1946. - V.84. - P. 51-61. • 97. Cleary M.P. Effect of dehydroepiandrostcrone treatment on livermetabolism in rats // Int. J. Biochem. 1990. - № 22. - P. 205.

109. Dhalla A. K., Singal P.K. Antioxidant changes in hypertrophied and failingguinea pig hearts//Am. J. Physiol. 1994.-№ 266. P. 1280-1285.

110. Diaz-Velez C.R., Garcia- Castineiras S. Increased malondialdehyde inperipheral blood of patients with congestive heart failure // Am. I Ieart. J. -1996.-№ 131.-P. 146-152.

111. Dulloo A.G., Samec'S., Seydoux J. Uncoupling protein 3 and fatty acid metabolism // Biochem. Soc. Trans. 2001. - № 29. - P. 785-791.

112. Echtay K.S.,Winkler E., KlingenbergM. Coenzyme Q is an obligatory t cofactor for uncoupling protein function // Nature. 2000. - V.408.1. P. 609-613.

113. Faraday M.M. Rat sex and strain differences in responses to stress // Physiol Behav. 2002. - № 4. - P. 507.

114. Frey T.G., Mannella C.A. The internal structure of mitochondria // Trends. Biochem. Sci. 2000. - № 25. - P. 319-324.

115. Garlid K.D., Jaburek M., Jezek P. Mechanism of uncoupling protein action // Biochem. Soc. Trans. 2001. - № 29. - P. 803-806.

116. Gerra G, Volpi R, Delsignore R, Maninetti L. Sex-related responses of beta-endorphin, ACTH, GH and PRL to cold exposure in humans // Acta Endocrinol (Copenh). 1992. - № 1. - P. 8-24.

117. Glynn L.M., Christenfeld N., Gerin W. Gender, social support, and ф cardiovascular responses to stress // Psychosom. med.-1999.- Vol.61.-P.234.242.

118. Goglia F, Moreno M, Lanni Л. Action of thyroid hormones at the cellular level: the mitochondrial target // FEBS Lett. 1999. - V.452. - P. 115— 120.

119. Gotshal R.W., Aten L.A. Difference in the cardiovascular response to prolonged sitting in men and women // Can J. Appl. Physiol. -1994. -№. 19.-P. 215-225.

120. Hansford R.G. Physiological role of mitochondrial Ca2+ transport // J. Bioenerg. Biomembr. 1994. - № 26. - P. 495-508.

121. Jaburek M., Varecha M., Gimeno R.E., et. al. Transport function and regulation of mitochondrial uncoupling proteins 2 and 3 // J. Biol. Chem. -1999.-№274.-P. 3-17.

122. Jeneson J.A., Westerhoff II.V., Kushmerick M.J. A metabolic control analysis of kinetic controls in ATP free energy metabolism in contracting skeletal muscle // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2000. - V.279. - P. 813-832.

123. Jezek P., Engstova II., Zackova M. et. al. Fatty acid cycling mechanism and mitochondrial uncoupling proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1998. -V.1365.-P. 319-327.

124. Jezova D., Jurankova E. Neuroendocrine response during stress with relation to gender differences // Acta Neurobiol. Exp. -1996. № 3. - P. 779-785.

125. Kadenbach В., Frank V., Rieger Т., Napiwotzki J. Regulation of respiration and energy transduction in cytochrome с oxidase isozymes by allosteric effectors // Mol. Cell. Biochcm. 1997. - V.174. - P. 131-135.

126. Kawahara П., Iloudou S., Inoue T. Scanning electron microscopic observations on muscle cells of experimental mitochondrial myopathy produced by 2,4-dinitrophenol // J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 1991. -№23.-P. 397^*03.

127. Kennedy EP, Lehninger AL. Oxidation of fatty acids and tricarboxylic acid cycle intermediates by isolated rat liver mitochondria // J. Biol. Chem. -1949.-V.179.-P. 957-963.

128. Klaus S., Casteilla L., Bouillaud F., Ricquier D. The uncoupling protein UCP: a membraneous mitochondrial ion carrier exclusively expressed in brown adipose tissue // Int. J. Biochem. 1991. - № 23. - P. 791-801.

129. Klein S.L., Lambert K.G., Durr D., Schaefer Т., Waring R.E. Influence of environmental enrichment and sex on predator stress response in rats // Physiol. Behav. 1994. - № 56. - P. 291.

130. Klingenberg M., Echtay K.S. Uncoupling proteins: the issues from a biochemist point of view // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V.1504. -P. 128-143.

131. Klingenberg M., Winkler E., Echtay K. Uncoupling protein, IГ transport and regulation // Biochem. Soc. Trans. 2001. - № 29. - P. 806-811.

132. Kondrashova M.N., Temnov A.V., Fedotcheva N.I. et al. Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate // Mitochondrion, -2000. P. 238-251.

133. Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria// FEBS Lett. 1997.- V.416. -P. 15-18.

134. Krebs HA, Kornberg IIL. Energy transformations in living matter // Ergeb. Physiol. 1957. - № 49. - P. 212.

135. Light КС, Turner JR, Hinderliter AL, Sherwood A. Race and gender comparisons: I. Hemodynamic responses to a series of stressors // Health Psychol. 1993. - № 12. - P. 354.

136. Lowry O.H., Rosebrough J. Protein measure with the Folin fenol reagent // J. Biol. Chemistry. 1951.-V.l93.-P. 265-275.

137. Luzikov V.N. Quality control: from molecule to organelles // FEBS Lett. -1999.-№448.-P. 201-205.

138. Mannella С., Marko M., Buttle K. Reconsidering mitochondrial structure: new views of an old organelle // Trends. Biochem. Sci. 1997. - № 22. -P. 37-38.

139. Mannella C., Marko M., Penczek P., Barnard D, Frank J. The internal compartmentation of rat-liver mitochondria: tomographic study using the high-voltage transmission electron microscope // Microsc. Res. Tech. -1994.-№27.-P. 278-283.

140. Manson J.E., Gaziano J.M. Antioxidant and cardiovascular disease // J. Am. Coll. Nutr. 1993. - № 12. - P. 426-432.

141. Matthias A, Jacobsson A, Cannon B„ Nedergaard J. The bioenergetics of brown fat mitochondria from UCP1-ablated mice. Ucp 1 is not involved in fatty acid-induced de-energization («uncoupling») // J. Biol. Chem. -1999.-V.274.-P. 150-160.

142. Michael T. Allen; Karen A. Matthews; Frederick S. Sherman. Cardiovascular Reactivity to Stress and Left Ventricular Mass in Youth // Hypertension. 1997. - № 30. - P. 782-787.

143. Mitchell P. A chemiosmotic molecular mechanism for proton-translocating adenosine triphosphatases // FEBS lett. 1974. - V.43. - P. 187-194.

144. Morita Т., Latifrour J., OTIollaren B. et al. Sex differences in function and distribution of alfa 1-alfa 2-adrenoreceptors in rabbit uretra // Am. J. Physiol. 1987. - V.252. - P. 1124 - 1128.

145. Moyes C.D., Battersby B.J., Leary S.C. Regulation of muscle mitochondrial design // J. Exp. Biol. 1998. - V.201. - P. 299-307.

146. Moyes C.D., Matthieu-Costello O.A, Tsuchiya N., Mitochondrial biogenesis during cellular differentiation // Am. J. Physiol. 1997. - V. 272.-. P. 1345-1351.

147. Muller J., Pongratz D., Hubner G. Activation of mitochondrial ATPase as evidence of loosely coupled oxidative phosphorylation in various skeletal muscle disorders. A histochemical fine-structural study // J. Neurol. Sci. -1986.-№74.-P. 199-213.

148. Nedergaard J., Cannon B. The «novel uncoupling» proteins UCP 2 and UCP 3: what do they really do? Pros and cons for suggested functions // Exp. Physiol. 2003. - № 88. - P. 65-84.

149. Nedergaard J., Golozoubova V., Matthias A., et. al. Life without UCP1: mitochondrial, cellular and organismal characteristics of the UCP1-ablated mice // Biochem. Soc. Trans. 2001. - № 29. - P. 756-763.

150. Hl.Nedergaard J., Golozoubova V., Matthias A., et. al. UCP 1: the only protein able to mediate adaptive nonshivering thermogenesis and metabolic inefficiency // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - № 1504. P. 82-106.

151. Palade G. The fine structure of mitochondria // Anat. Rec. 1952. - V. 114. - P. 427-451.

152. Penczek P., Marko M., Buttle K., Frank J. Double-tilt electron tomography // Ultramicroscopy. 1995. - № 60. - P. 393-410.

153. Porter R.K., llulbert A.J., Brand M.D. Allometry of mitochondrial proton leak: influence of membrane surface area and fatty acid composition // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Сотр. Physiol. 1996. - V.271. - P. 1550-1560.

154. Ranki II.J., Budas G.R., Crawford R.M. Gender-specific difference in cardiac ATP-sensitive K+ channels // Am. Coll. Cardiol. 2001. - № 38. P. 906.

155. Rial E., Gonzalez-Barroso M.M. Physiological regulation of the transport activity in the uncoupling proteins UCP 1 and UCP 2 // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V. 1504. - P. 70-81.

156. Roberts J., Insel P., Goldfien A. Regulation of miometral adrenoreceptors and advenergic vesponse by sex steroids // Mol. Pharmacol. 1981. -V.20.-P. 52 - 58.

157. Roger V., Jacobsen S., Pellikka P. et al. Gender differences in use of stress testing and coronary heart disease mortality: a population-based study in Olmsted Country, Minnesota // American College of Cardiology. -1998.-Vol.32. -№ 2. P. 345-352.

158. Selye H. Stress in health and disease // Reading. Mass: Batterwoth. 1976.- P. 228-237.

159. Shneider C.W. Intracellular distribution of enzymes. The oxidation of octanoic acid by rate liver fractions // J. Biol. Chemistry. 1948. - V.176.- P. 259-266.

160. Sivaramakrishnan S., Panini S.R. Influence of epinephrine and norepinephrine treatment on SDH activity // Indian Jorn. of Biochem. & Biopys. 1983. - Vol.20. - P. 23-28.

161. Sjostrand F.S. The ultrastructure of cells as revealed by the electron microscope // Int. Rev. Cytol. 1956. - № 5. - P. 455-533.

162. Sluse F.E., Jarmuszkiewicz W. Uncoupling proteins outside the animal and plant kingdoms: functional and evolutionary aspects // FEBS Lett. 2002. - V.510.-P. 117-120.

163. Starkov A.A, Simonyan R.A., Dedukhova V.I., Mansurova S.E., Palamarchuk L.A., Skulachev V.P. Regulation of the energy coupling in mitochondria by some steroid and thyroid hormones // Biochim Biophys Acta. 1997, № 16. - P. 173-183.

164. Starkov A.A., Simonyan R.A., Dedukhova V.I., Skulachev V.P. Regulation of the energy coupling in mitochondria by some steroid and thyroid hormones // Biochim. Biophys. Acta. 1997. - № 16. - P. 131.

165. Stewart J., Kuchnemann S., Rajabi II. Neonatal exposure to gonodal hormones affects the development of monoamine system in rat cortex // J. Neuroendocrinol. 1991. - V.3 - № 1. - P. 85-93.

166. Stoney C., Davis M., Matthews K. Sex differences in psychological responses to stress and coronary heart disease: a causal link? // Psychophysiol. 1987. - Vol.24. - P. 127.

167. Stuart J.A., Cadenas S., Jacobsons M.B., et. al. Mitochondrial proton leak and the uncoupling protein 1 homologues // Biochim. Biophys. Acta. -2001.-№ 1504.-P. 144-158.

168. Vaccari Л., Brotman S., Cimino J., Timiras P. Sex differentiation of neurotransmitter enzymes in central and peripheral nervous system // Brain Res.-1977.- Vol.132.-P. 176-185.

169. Vaishali II. Shukla, Kunjan R. Dave, Surendra S. Katyare. Effect of catecholamine depletion on oxidative energy metabolism in rat liver, brain and heart mitochondria // Comparative Biochemistry and Phisiology. -2000.-V. 127. P. 79 -90.

170. Vamvakopoulos N.C., Chrousos G.P. Evidence of direct estrogenic regulation of human corticotropin-releasing hormone gene expression // J Clin Invest. 1993. - № 4. - P. 902.

171. Vina J, Borras C, Gambini J, Sastre J, Pallardo FV. Why females live longer than males? Importance of the upregulation of longevity-associated genes by oestrogenic compounds // FEBS Lett. 2005. - № 12. - P. 5.

172. Vina J, Sastre J, Pallardo F, Borras C. Mitochondrial theory of aging: importance to explain why females live longer than males // Antioxid Redox Signal. 2003. - № 5. - P. 549-556.

173. Vorobjev I.A., Zorov D.B. Diazepam inhibits cell respiration and induces fragmentation of mitochondrial reticulum // FEBS Lett. 1983. - V. 163. -P. 311-314.

174. Winkler E., Klingenberg M. Effect of fatty acids on Ню transport activity of the reconstituted uncoupling protein // J. Biol. Chem. 1994. - № 269. -P. 2508-2015.

175. Zukovska-Groges Z., Shen G., Capraro P. Cardiovascular, neuropeptide and adrenaline responses in stress are sexually differentiated // Physiol. Behav.- 1991. V.49. - №4 - P. 771 -777.

Информация о работе

Леонтьев, Данила Сергеевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Половые особенности митохондриального метаболизма в условиях покоя и острого стресса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы