Полиморфные маркеры генов, ассоциированные с психологическими признаками и риском развития психических расстройств

Монахов, Михаил Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиморфные маркеры генов, ассоциированные с психологическими признаками и риском развития психических расстройств
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полиморфные маркеры генов, ассоциированные с психологическими признаками и риском развития психических расстройств"

3 5-

На правах рукописи

Монахов Михаил Владимирович

ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ПСИХОЛОГИЧЕСКИМИ ПРИЗНАКАМИ И РИСКОМ РАЗВИТИЯ ПСИХИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ

Специальности 03.00.03 - молекулярная биология; 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003463548

Работа выполнена в Лаборатории структуры и функции хроматина Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардга РАН (Москва) и в лаборатории клинической генетики Государственного учреждения Научный центр психического здоровья Российской академии медицинских наук (Москва).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор ВЛ. Карпов;

доктор биологических наук В.Е. Голимбет

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ПЛ. Иванов;

кандидат биологических наук М.Г. Аксенова

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится » ^ 2009 года в О на заседании

диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардга РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга.

[« К»

Автореферат разослан « Д-^у^'Л 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

,М. Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Функционирование центральной нервной системы определяется взаимодействием большого числа различных белков и белковых комплексов, включая рецепторы нейромедиаторов и нейромоду-ляторов, ферменты, обеспечивающие синтез и распад этих веществ, трансмембранные переносчики, поддерживающие необходимые концентрации нейромедиаторов в клеточных компартментах и синаптических щелях, факторы роста нейронов и многие другие. Первоочередное значение имеет активность таких нейротрансмиттеров, как моноамины (дофамин, серотонин, но-радреналин, глутамат) и гамма-аминомасляная кислота. Их трансмиссия в нейронах определяет выраженность всевозможных психических проявлений, включая особенности темперамента и когнитивные функции, а нарушения в работе моноаминергических систем являются причиной развития ряда психических заболеваний, например, аддиктивных, тревожных и личностных расстройств, а также эндогенных психозов (биполярного аффективного расстройства и шизофрении).

За последнее время появилось много работ, в которых были получены доказательства связи между генами моноаминергических систем и психическими проявлениями. Были обнаружены конкретные полиморфные участки в этих генах, с которыми эти проявления ассоциированы. Так, показано, что полиморфизмы гена, кодирующего дофаминовый рецептор 04, вносят вклад в межиндивидуальные различия по чертам личности, связанным с экстраверсией и поиском новизны, а полиморфизм Уа1158Ме1 гена, кодирующего фермент катехол-О-метилтрансферазу, который принимает участие в распаде дофамина в передней коре, связан с функциями внимания и рабочей памяти, а также ассоциирован с шизофренией. Выявлены аллельные варианты генов серотонинергической системы, в том числе переносчика серотонина и рецепторов серотонина типа 2А и 2С, которые связаны с выраженностью признаков тревожного ряда, а также предрасположением к развитию клинической депрессии.

Следует отметить, что одни и те же полиморфизмы некоторых генов могут быть связаны с различными сферами психики и соответственно с нарушениями в функционировании этих сфер. Этот факт свидетельствует в пользу теорий единого механизма, лежащего в основе разных психических нарушений, который выдвигается в последнее время в психиатрии. Активно обсуждается проблема генетической общности эндогенных психозов, в том числе шизофрении и биполярного аффективного расстройства.

Учитывая исключительную сложность нервной системы, очевидно, что подтверждение этих гипотез требует проведения большого числа исследований. В частности, информативность такого рода исследований может быть повышена, если определенный набор молекулярных маркеров будет проверен на ассоциацию как с различными психическими проявлениями в норме, так и с психическими болезнями.

Для анализа такого набора маркеров в больших выборках необходима надежная и воспроизводимая методика генотипирования. Современные методы молекулярной биологии, такие как метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и другие технологии, основанные на ПЦР, позволяют с большой точностью различать аллельные варианты различных полиморфных сайтов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлся поиск полиморфных маркеров набора генов-кандидатов, ассоциированных с функционированием центральной нервной системы, в выборках психически здоровых людей, а также в выборках больных шизофренией, алкоголизмом и лиц, совершивших самоубийство.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать полиморфные маркеры, имеющие ключевое значение для функционирования нейрохимических систем, либо локусы, сцепленные с предполагаемыми функциональными вариантами.

2. Разработать методики определения генотипов по данным полиморфным маркерам.

3. Провести генотипирование образцов ДНК и установить распределение частот аллелей, генотипов и гаплотипов полиморфных маркеров в выборках психически здоровых людей и страдающих психическими расстройствами.

4. Провести статистический анализ полученных данных для выявления возможной ассоциации между психическими нарушениями, психологическими признаками и генетическими вариантами.

Научная новизна результатов исследования. Разработаны методики определения аллельных вариантов выбранных маркеров с помощью 5'-нукле-азного анализа, аллель-специфической ПЦР, ПЦР с распознаванием температур плавления ампликонов. Надёжность методик подтверждена с помощью прямого секвенирования и процедуры однонуклеотидного удлинения прай-меров (PEP).

Впервые было проведено генотипирование ряда полиморфных локусов генов DRD2, СОМТ, HT2CR, NPY, DBH, DTNBP1, GABRA6, DAAO, INMT, HTRIB, DISCI в выборках из российской популяции. Данные полиморфные маркеры были проанализированы в выборках больных шизофренией, алкоголизмом, людей совершивших самоубийство. Была проверена ассоциация между маркерами и различными характерными симптомами данных расстройств. В выборке психически здоровых людей проанализирована ассоциация с особенностями темперамента, оцененными с помощью психологических тестов. Методами генетического анализа определены частоты гаплотипов и исследован характер сцепления между маркерами. Для нескольких маркеров была обнаружена ассоциация с риском развития шизофрении, алкоголизма, с когнитивными характеристиками.

Впервые был проведён анализ ассоциации ряда маркеров гена рецептора дофамина второго типа (DRD2) с результатами экономической лабораторной

игры «Диктатор», оценивающей склонность к альтруистическому поведению. Выявлена ассоциация особенностей поведения в игре с гаплотилами В НО2.

Практическая ценность. Полученные результаты свидетельствуют о корреляции между рядом генетических полиморфизмов и психическими заболеваниями. При дальнейшем подтверждении универсального характера данных корреляций в рамках определённой популяции результаты могут быть использованы при диагностике психических заболеваний, в генетическом консультировании, а также при медицинском обследовании лиц, профессиональная деятельность которых требует повышенной стрессоустойчивости.

Работа демонстрирует применимость методов 5'-нуклеазного анализа и НГШ (измерение температур плавления ПЦР-продуктов) для генотипирова-ния широкого спектра полиморфных маркеров типа (однонуклеотидные замены).

Апробация работы. Работа апробирована на семинаре Лаборатории структуры и функции хроматина ИМБ РАН им. В.А.Энгельгардта. Результаты работы были представлены:

1) на 10-й Международной конференции «Стресс и поведение», Санкт-Петербург, Россия, 16-20 мая 2007 года;

2) на Конференции молодых учёных, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 20-22 сентября 2007 года;

3) на 15-м Всемирном конгрессе по психиатрической генетике, Нью-Йорк, США, 7-11 октября 2007 года;

4) на 1-й Конференции международного сообщества по исследованиям шизофрении, Венеция, Италия, 21-25 июня 2008 года.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 115 страницах, содержит 10 рисунков и 7 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения и выводов. Список литературы цитирует 142 работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Общий ход работы

В нашем распоряжении имелось несколько выборок, охарактеризованных по различным психологическим и психиатрическим показателям: выборка больных шизофренией; выборка больных алкоголизмом; выборка людей, склонных к суицидальному поведению, и контрольная выборка, состоящая из психически здоровых людей. От каждого участника были получены образцы биологических тканей (кровь либо волосяные луковицы) и выделена геномная ДНК. Таким образом, мы имели возможность проверить наличие ассоциации генов-кандидатов с тем или иным фенотипом.

Для этого были выбраны полиморфные маркеры ряда генов, активных в центральной нервной системе. Основаниями для выбора служили данные

литературы. В первую очередь в список вошли хорошо известные маркеры, такие как СОМТ Уа158МсЧ или ПН02 Тая1А, для которых накоплено много данных об их возможной связи с поведением. Также были выбраны менее известные полиморфизмы, предположительно имеющие функциональное значение (0к02 ге6277), и несколько маркеров, которые ранее не анализировались ни в одной выборке (В1Ю2 гэ 1800498, маркеры гена ШМТ).

Для каждого маркера была разработана методика генотипирования. Предпочтение отдавалось методу 5'-нуклеазного анализа, как наиболее удобному и эффективному для генотипирования небольших количеств полиморфных сайтов. В тех случаях, когда особенности последовательности геномной ДНК, окружающей полиморфный локус (например, низкий вС-состав), или иные обстоятельства препятствовали созданию эффективных праймеров и зондов, создавалась альтернативная методика на основе технологий НИМ или аллель-специфической ПЦР. Для проверки валидности метода часть образцов дополнительно анализировалась с помощью секвенирования или РЕР.

Часть образцов была дополнительно генотипирована по ряду маркеров с помощью методик, разработанных в Исследовательской лаборатории им. С. Герцог (Иерусалим, Израиль). При этом использовались методы РЕР (для анализа однонуклеотидных замен) и ПЦР с флуоресцентными праймерами с последующим капиллярным электрофорезом (для анализа вариантов микросателлитов).

После генотипирования проводилась статистическая обработка результатов: сравнивались частоты различных аллелей, генотипов и гаплотипов. Для анализа количественных признаков проводился дисперсионный анализ.

2. Разработка методик генотипирования с помощью 5'-нуклеазного анализа. Проверка точности генотипирования с помощью прямого секвенирования геномной ДНК

Одним из наиболее популярных современных методов генотипирования единичных полиморфных локусов является 5'-нуклеазный анализ с использованием аллель-специфических зондов.

Метод основан на способности Taq-ДHK-пoлимepaзы с 5'-экзонуклеазной активностью гидролизовать олигонуклеотид, препятствующий реакции полимеризации, либо вытеснять его с матрицы, в зависимости от «прочности» взаимодействия олигонуклеотида с матрицей.

Для различения аллелей какого-либо ЭКР используется два аллель-специфических зонда (олигонуклеотиды, несущие на 5'-конце флуорофор (БАМ для одного аллеля и У!С либо Кбй для другого), а на З'-конце - гаситель флуоресценции ВН(?1). Первый зонд комплементарен последовательности одного аллеля (и будет отжигаться на этой последовательности наиболее эффективно), второй зонд - последовательности второго аллеля. Наряду с флуоресцентными зондами в реакционную смесь добавляются праймеры для амплификации участка матрицы, на котором будут отжигаться оба зонда. Проводится ПЦР, в ходе которой Тац ДНК-полимераза гидролизует преиму-

щественно зонд, соответствующий аллелю, представленному в ДНК образца (то есть, наиболее прочно связанный с матрицей). Флуорофор отделяется от гасителя, и флуоресценция его может быть зарегистрирована с высокой чувствительностью (рис. 1).

аллель 1

несларивание

аллель 2

мсспэривзние

спвриванмс

Рис. 1. Схема работы 5'-нуклеазного анализа

Таким образом, для образцов ДНК гомозигот будет наблюдаться преимущественно флуоресценция одного из красителей, для гетерозигот - флуоресценция обоих красителей приблизительно в равной мере.

Для эффективного генотипирования с помощью данного метода необходимо подобрать оптимальное сочетание двух зондов и двух праймеров, соответствующий температурный режим и оптимальное количество добавляемой геномной ДНК. Полученная в результате диаграмма, на которой по координатным осям отложены значения флуоресценции аллель-специфических красителей, должна чётко отражать распределение образцов между группами, соответствующими разным генотипам (рис. 2).

Контроль 9са

ТЬыаздыгмЛА

Ь. А

ОС

гомоиюти са

Рис. 2. Образец диаграммыраспознавания аллелей (группа из 35 психически здоровых людей). Полиморфный маркер А158С гена СОМТ. По оси абсцисс - флуоресценция зонда с меткой РАМ, по оси ординат - флуоресценция зонда с меткой 1160

С помощью данного метода нами были налажены процедуры определения генотипов полиморфных маркеров СОМТ G158A, DAAO rs39I8347, DISCI rsl322784, DISCI Ser704Cys (rs821616), DRD2 TaqlA, DRD2 C939T (rs6275), DRD2 C957T (rs6277), DRD2 Ser311Cys, DRD2 rsl800498, DTNBPI rs2619522, HT2CR Cys23Ser, HTRIB C861G, INMT Gly219Glu (rs2302340), INMT Asn28Asp (rs4723010), NPY L7P rs!6139, NPYIVS1-I00 T= G rsI6I4I, NRG I rs6994992.

Воспроизводимость была проверена в серии последовательных (3-4) реакций с одинаковыми образцами, чувствительность - с помощью анализа серии последовательных разведений. Методика позволяет работать с количествами геномной ДНК от 1 нг без потери точности генотипирования.

Для генотипирования по одному полиморфизму брали 0,5 мкл раствора ДНК из 45 мкл, полученных при выделении ДНК из 100 мкл крови с помощью стандартного набора для выделения. Для всех исследованных полиморфизмов интенсивность флуоресценции зондов находилась в одном и том же диапазоне, что позволяет говорить об одинаковой чувствительности метода в случае разных SNP.

Таким образом, данная методика позволяет при использовании 100 мкл крови определить генотипы до 90 разных SNP при условии, что каждый полиморфизм будет проанализирован только один раз. С учётом необходимости воспроизведения результатов и других факторов можно утверждать, что 100 мкл крови достаточно для анализа 20-30 SNP.

После того, как для нескольких маркеров гена DRD2 были получены статистически значимые результаты в анализе ассоциации, возникла необходимость проверки данных генотипирования с помощью независимого метода. Был выбран метод прямого секвенирования. Секвенирование позволяет анализировать несколько расположенных рядом полиморфных локусов одновременно (рис. 3).

ЗЙ З^О ,380 390 ' 1ЙО 410 - Ш «О

>RD2-Z k179i ic DRD2-Zk188f 1RD2-Z k188i (с DRD2-Z ¡er DRD2-Z k193f 0RD2-Zi7[ DR02-Z ¡7i ic DR02-Zk183f DRD2-2 MSOf )RD2-Zlc130r rc 311 330 298 333 306 302 235 337 321 237 3<Б pACTCTCCCCGACCCGICCCi.CCiTCO.TCTqCilCAGC*CTCCCOACiGCCCCC'CCJUACCi.GAOA4GlAT GACTCTCCCCGJLCCCGTCCCACCATCOTCTCCItCAOCiCTCCCGjLCJLGCCCCGCCAAACCAGAGAAGAAT CACTCTCCCCGACCCGTCCCACClTGGTCTCCACAGClCTCCCGACAGCGCCGCCJUACCi.GAGJLlGAA'I' gactctccccgacccgtcccac.catcgtctgixcagcactcccgacagccc.ccccaaAccagagaagaat GACTCTCCCCaACCCGTCCCACCJTGGTCTCCAeAGCACTCeCGJtCAGC.CCeGCCAAACCtCAGAlGAA'E GACTCTCtCCGACCCG-ICCCACClTOGTCTCOACAGCACTCCTGACAGCCeCGCOAAACCAGAGAAGAAT pACTCTCCCCGACCCGTCCCACCiCGGTCTCIiCiGCKTCCCSACAeeCCCOCCAiAeemOAAaAAT GACTCTCCCCOACCCC-ICCCACCiCGGTCTCCACAGCACTCCCGKi.GCCCCC-CCJJACCAGAGAAGtAT GACTCTCCCCGACCCGTCCCACCACGGTCTCCACAG«ACTC«TGACAOCCCCCCCAAACClx;AGAAGAtT CACTCTCCCCGACCCG-tCCCACClCGGTCTCCACAGCACTCCCGACAGCeCCGCGtAACCAGAGAJLGAAT fcACTCTCCC,CGACCC«CCCACCKfcTCTC:acagcactc;ccgai4g.CCCCC-CC«accaeagaagaai; CSMT C9SJT

Contentui 3 К GACTCTCCCCGACCCGTCCCACCATGGTCTCCACAGCACTCCCGACAGCCCCCCCAAACCAGAGAAGAAT

Рис. 3. Пример сравнения результатов секвенирования участка гена DRD2, включающего полиморфные сайты С939Т, С957Т, в различных образцах ДНК (выравнивание проведено в программе Vector NTI)

Было проанализировано 46 образцов. Выяснилось, что методы 5'-нуклеаз-ного анализа и прямого секвенирования дают полностью совпадающие результаты.

Таким образом, разработанные методики представляют ценный инструмент анализа вышеперечисленных полиморфных маркеров, позволяющий работать с небольшими количествами ДНК и производить различение генотипов с высокой точностью.

3. Разработка методик гснотипнровашш с помощью метода HRM

Среди недостатков 5'-нуклеазного анализа можно отметить относительно высокую стоимость флуоресцентных зондов и сложности при выборе зондов для участков ДНК с низким GC-составом. Во многих случаях нельзя гарантировать, что выбранные зонды позволят различать генотипы. Таким образом, резко возрастают затраты на разработку условий генотипирования.

Существуют альтернативные методы, также основанные на ПЦР-РВ, но использующие только ^модифицированные олигонуклеотцды и неспецифические красители. Одним из таких методов является метод HRM (high resolution melt), основанный на измерении температур плавления ампликонов, отличающихся на одну пару оснований.

Первый этап анализа заключается в проведении ПЦР, праймеры для которой подбираются таким образом, чтобы полиморфный сайт оказался приблизительно в середине ампликона. При этом размер ампликона должен быть небольшим (100-200 пар оснований), чтобы разница в нуклеотидных последовательностях в одну пару оснований оказалась достаточной для различения продуктов по температуре их плавления.

В реакционную смесь добавляется флуоресцентный краситель CYTO-9 (или другой краситель с аналогичными характеристиками), связывающийся с двуцепочечной ДНК. После завершения ПЦР производится медленный (0,1 °С в секунду) нагрев смеси до 94 °С. При этом измеряется флуоресценция красителя, которая падает по мере плавления ДНК-дуплексов. Вычисление производной от флуоресценции по температуре позволяет определить температуру плавления как значение, при котором производная достигает максимума. В случае ДНК, полученной от гомозигот, производная имеет один чётко выраженный пик (рис. 4).

В случае гетерозигот наблюдается широкий сглаженный пик, поскольку флуоресценция падает постепенно за счёт присутствия в смеси ампликонов с различным нуклеотидным составом (рис. 5).

К недостаткам данного метода можно отнести трудности в различении аллелей и возможную амплификацию нецелевой ДНК. В отдельных случаях пики производной от флуоресценции, соответствующие разным генотипам, располагаются настолько близко, что для правильного определения генотипов необходим повторный анализ.

% 0 .3

............1............ !

| / \ V Г

/ \

_ / .3 \

/ V

/ \

/ V

ч, N

о.«-0.«

0.06'

872 87,4 В7.6 87.8 88

9.2 88.4 88.6

9.6 89 8 90 90.2 90.4 90.6 904

Рис. 4. Пример определения генотипа с помощью метода Н1Ш. Гомозиготный образец

87.2 87.4 бТе 87.8

90 90.2 90.4 90.3 90.8

Рис. 5. Пример определения генотипа с помощью метода НЯМ.

Гетерозиготные образцы

На основе метода НИМ нами были разработаны альтернативные методики анализа полиморфных маркеров С957Т и ОКВ2 Тац1А. Полученные с

их помощью результаты генотипирования были подтверждены более специфичным методом РЕР («процедуры удлинения праймеров»).

4. Анализ полиморфного маркера С8бЮ гена НТШВ с помощью аллель-специфической IIЦР

Метод аллель-специфической ПЦР представляет собой простейший вариант генотипирования с помощью полимеразной цепной реакции, В реакционную смесь добавляются один универсальный праймер (прямой или обратный) и один из двух аллель-специфических, последовательности которых отличаются на один нуклеотид. В идеальном случае амплификация будет происходить, только если в реакционную смесь добавлен праймер, комплементарный присутствующей последовательности ДНК. В реальных условиях, как правило, амплификация происходит даже при наличии однонуклеотидного неспаривания. Таким образом, судить о составе исследуемой ДНК приходится по разнице темпов амплификации в двух реакциях, отличающихся добавленными в них аллель-специфическими праймерами. Для устранения указанного недостатка могут быть использованы различные приёмы, например, введение в праймер дополнительных сайтов неспаривания с целью понизить эффективность неспецифичной ПЦР.

Достоинством метода является то, что он не требует модифицированных зондов и оборудования, способного с высокой точностью измерять температуры плавления ампликонов.

С использованием аллель-специфической ПЦР была разработана методика генотипирования полиморфного маркера С86Ш гена НТШВ, отличающегося низким ОС-составом последовательности ДНК, окружающей полиморфный локус. Методика позволяет различать генотипы путём сравнения кривых амплификации (рис. 6,7).

Rnvs Cycle

С (w С-алпвпя

, //.С npu&jitgXHl [¿У iewO-aiVwt»»

6*э ширм* .

12 3 4 5 8 7 8 9 10.11 12 13 И 15 16 17 16 19 20 21. 22 23 24 25 2Б 27 28 23 3031 32 33 3* 35

..........................;..................... _.....' Суйв МгоЬег • .........._______........ . ..........„..-с

Рис. 6. Кривые амплификации при аллель-специфической ПЦР. Определение

1 2 3 4 5 0 7 8 9 10 11 12 13 К 1: 16 17 18 19 20 2t 22 23 И 25 ÎS V 3B H 30 31 32 33 3t 55 C/:le Number

Рис. 7. Кривые амплификации при аллель-специфической ПЦР. Определение аллелей SnP С86!G Н> RIB. По оси ординат - флуоресценция красителя SYBR Green I. Гомозиготный образец СС

5. Анализ полиморфных маркеров с помощью процедуры удлинения праймера (PEP)

PEP (primer extention procedure) - метод определения генотипов, основанный на использовании флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов, соответствующих разным аллелям одного полиморфного локуса. Метод включает три основных этапа:

1. Амплификация участка, содержащего данный полиморфный локус.

2. Проведение реакции включения флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов (рис. 8) В реакционную смесь добавляется один праймер, комплементарный участку ДНК, который предшествует полиморфному локусу. Затем при участии ДНК полимеразы происходит удлинение праймера на один нуклеотид, после чего дальнейшее удлинение становится невозможным из-за отсутствия у данного нуклеотида З'-гидроксильной группы. По сути эта реакции аналогична секвенированию ДНК с помощью меченых дидезоксинуклеотидов. Таким образом, результатом реакции являются короткие фрагменты, меченые по З'-концу, причём флуоресцентные красители, присоединённые к ним, соответствуют нуклеотидам, находящимся в полиморфном сайте (или одному определённому нуклеотиду, если образец ДНК был получен от гомозиготы).

3. Проведение капиллярного электрофореза для детекции продуктов реакции удлинения праймера.

Результатом анализа является электрофореграмма. Наличие только одного пика соответствует гомозиготам, двух пиков разных красителей - гетерози-готам.

Anneal Primer

SNP

Extend and Terminate Primer

CCATGACTGATTCC Target dna-> NNNNNNAGCCTGGTACTGACTAAGGCNNNNNNN ddGTP

SNaPshot Ready ddCTP Reaction Mix ddUTP

rid ATP

CCATGACTGATTCCG N N N NNN AGCCTGGTACTGACTAAGGCN NN NN N N

Electrophoresis

Color = genotype

Рис. 8. Схема генотипирования с помощью РЕР

Основным преимуществом метода является возможность анализа нескольких полиморфных маркеров одновременно. Для этого необходимо выбрать пары праймеров таким образом, чтобы праймеры для разных маркеров отличались друг от друга по длине на 5-10 нуклеотидов. Таким образом, при капиллярном электрофорезе можно анализировать одновременно несколько продуктов, отличающихся по длине, что существенно экономит время и ресурсы.

С помощью данного метода были проанализированы образцы из коллекции ДНК больных психозами и здоровых людей, охарактеризованных с помощью ряда психологических тестов.

Анализировались полиморфные маркеры: СОМТ Val58(158)Met, DRD4-616, DRD2 -809, DRD2 -521, IGF2 АРА1 820 G/A, IGF2 1156 "Г/С, IGF2 2207 С/Т, SNAP25 T1065G, SNAP-25 Т1069С .

Благодаря высокой специфичности, процедура удлинения праймеров может быть использована для проверки данных генотипирования, полученных другими методами. В частности, нами были проверены результаты генотипирования полиморфных маркеров гена DRD2, полученные с помощью метода HRM. Сравнение показало полное соответствие между результатами двух методов.

6. Ассоциация полиморфных маркеров и гаплотипов гена ОШ)2 с шизофренией, алкоголизмом и альтруистическим поведением

Наиболее интересный результат, полученный в ходе данной работы - ассоциация между полиморфизмами гена В/Ю2 и рядом различных психологических признаков. Ген ВКВ2, кодирующий рецепторы дофамина второго типа (132), представляет большой интерес с точки зрения нейрофизиологии. В первую очередь, данный тип является наиболее распространённым вариантом

дофаминовых рецепторов. Он встречается как в коре головного мозга, так и в лимбической системе. От правильного функционирования данных рецепторов зависят такие функции как моторная активность, зависимость от вознаграждения, рабочая память и другие.

Особенное внимание было привлечено к D2 рецепторам после того, как выяснилось, что они являются основной мишенью антипсихотических препаратов, применяемых для лечения психозов. У больных существенно повышена концентрация данных рецепторов, хотя надо учитывать, что увеличение концентрации рецепторов может являться ответом на воздействие нейролептиков.

С развитием генетики и молекулярной биологии ген DRD2 стал излюбленным объектом для анализов ассоциации и функциональных исследований.

Ассоциация DRD2 с шизофренией была обнаружена с помощью маркеров TaqIA, Ser/Cys311, С957Т, С939Т, -NlCIns/Del. Изменения в последовательности нуклеотидов, характерные для некоторых из перечисленных маркеров, имеют функциональное значение, т.е. связаны с активностью (экспрессией) гена или вызывают замещение аминокислот в белковом продукте; связь других с экспрессией и функциями рецептора не установлена, и наблюдаемая ассоциация может быть объяснена с помощью предположений об опосредующих биохимических процессах. Например, предполагается, что SNP TaqIA является полиморфизмом гена киназы с неизвестной функцией, кодирующая последовательность которой находится в З'-области гена DRD2.

Часто сообщения о статистически значимых отличиях частоты тех ми иных генотипов либо аллелей у больных шизофренией не подтверждаются при проведении исследований на выборках из других популяций. В связи с этим ведётся поиск характеристик, которые при исследовании в рамках анализа ассоциации давали бы более воспроизводимый результат, чем диагноз шизофрении сам по себе. Например, в различных работах было обнаружено, что эффективность лечения нейролептиками, в частности, длительность физиологического ответа, ассоциирована с полиморфизмами -I41CIns/DeU TaqIA и A-24IG; наличие экстрапирамидных симптомов - с -141С Ins/Deh хроническое течение болезни - с TaqIA; преобладание позитивных либо негативных симптомов - с -141С Ins/Del и Ser/Cvs31L

В настоящее время продолжается поиск полиморфных маркеров, которые могут быть связаны с риском возникновения шизофрении. Недавно были опубликованы работы, к которых использованы синонимичные, т.е. не меняющие аминокислотную последовательность кодируемого белка, однонук-леотидные замены (SNP) С939Т(в кодоне His313) и С957Т (кодон Рго319). В одном исследовании была найдена ассоциация полиморфизма С939Т с шизофренией, а в другом - с поздними дискинезиями. Полиморфизм С957Т также ассоциирован с шизофренией, а, кроме того, существенно влияет на стабильность мРНК гена в клетках и на экспрессию белка.

Мы провели анализ ассоциации пяти полиморфных маркеров гена DRD2 с шизофренией. Опытная выборка состояла из 311 пациентов, контрольная - из 364 здоровых людей (табл. 1).

Таблица 1

Частота аллелей, генотипов и гаплотипов полиморфных маркеров гена ВЯ02

Шизофрения (и = ЗП) Контроль (п = 364) %2 р-уровеиь (¿1= I) ОК (95% С1)

п % п %

С939Т

СС 140 45 173 47,5 0,43 0,51

СТ 121 38,9 161 44,2 1,95 0,16

ТТ 50 16,1 30 8,2 9,86 0,0017 2,13 (1.32-3,451

С аллель 401 64,5 507 69,6 4,08 0,0435 0,79 (0,63-0,99)

Т аллель 221 35,5 221 30,4

С957Т

СС 99 31,8 78 21,4 9.38 0.0022 1,71 (1.21-2.421

СТ 152 48,9 183 50,3 0,13 0,72

ТТ 60 19,3 103 28,3 7,42 0,0064 0,61 (0.42-0,871

С аллель 350 56,3 339 46,6 12,64 0.0004 1,48 (1,19-1,831

Т аллель 272 43,7 389 53,4

Тац1А

СС (А2А2) 189 60,8 238 65,4 1,54 0,22

СТ (А1А2) 104 33,4 116 31,9 0,19 0,66

ТТ (А1А1) 18 5,8 10 2,7 3,9 0,048 2,17(1,21-5,88)

С аллель (А2) 482 77,5 592 81,3 3,02 0,082 0,79 (0,61-1,03)

Т аллель (А1) 140 22,5 136 18,7

С957Т-Тац1А гаплошипы

СС 34,8 29,7

СТ 21,4 16,9

ТС 42,7 51,6 5,31 0,021 0,7 (0,52-0,95)

ТТ 1 2

При сравнении частот аллелей и генотипов в опытной и контрольной выборках была обнаружена ассоциация с маркером С957Т (х2= 12,64, р = 0,0004), а также с гаплотипами. Этот результат согласуется с данными, полученными в других популяциях (Финляндия, Испания, Австралия). Мета-анализ подтвердил, что данный маркер ассоциирован с болезнью (%2~ 19,2, р = 0,00005).

Аналогично была показана ассоциация с маркерами ЭегЗ 1 1Суэ (х2= 7,25, р = 0,0071) и гз 1800498 (х2= 10,05, р = 0,0015) (см. табл. 1). Последний маркер был проанализирован на ассоциацию с шизофренией впервые.

Был проведён анализ ассоциации между /Ж02 и алкоголизмом. Опытная выборка насчитывала 181 человека, контрольная - 366 человек (табл. 2).

Таблица 2

Частота аллелей полиморфного маркера rsl 800498 гена DRD2

Алкоголизм («=181) Контроль (п = 366) 12 р-уровень (#= 1) OR (95% CI)

п % п %

СС 43 23,S 64 17,5 3,03 0,0819 1,47

ст 88 48,6 174 47,5 0,06 0,8123 1,04

тт 50 27,6 128 35,0 2,98 0,0844 0,71

с 174 48,1 302 41,3 4.57 0.0326 1,32

т 188 51,9 430 58,7

Была показана ассоциация с маркером rsl800498 (%2 ~ 4,57,р = 0,033). Эти результаты позволяют предположить, что определённые особенности функционирования дофаминергической системы, связанные с полиморфными маркерами гена DRD2, способны вызывать различные психические патологии, включая психозы и возникновение алкогольной зависимости.

Третий фенотип, для которого была продемонстрирована ассоциация с DRD2, - это альтруистическое поведение, оцениваемое с помощью лабораторной игры Диктатор. Альтруизм, как способность индивидуума действовать ради блага других людей и вопреки собственным интересам, представляет собой загадку с точки зрения экономических теорий, принимающих принцип максимальной прибыли. Однако альтруизм широко распространён в популяции, что может объясняться действием группового отбора.

Альтруистическое поведение может быть непосредственно измерено с помощью лабораторных игр, в которых участникам предлагается распределить реальные деньги между собой и партнёром, в частности, игры Диктатор, где степень альтруизма измеряется как количество денег, которые игрок безвозмездно предоставляет своему партнёру.

Был проведён анализ выборки из 172 семей, в которых дети были обследованы с помощью игры Диктатор, и у всех членов семьи были взяты образцы ДНК. Мы провели генотипирование четырёх полиморфных маркеров DRD2, и с помощью программы Unphased выполнили тест на неравновесную передач)' аллелей. Оказалось, что гаплотипы DRD2 ассоциированы с количеством денег, которое участник дарит своему партнёру (•/_?- = 5,75, р = 0,017).

Интересно, что гаплотип, ассоциированный с менее выраженным альтруистическим поведением (rsl800498-Ser31 lCys-C957T-TaqIA: Т-С-Т-Т), чаще встречается у здоровых людей, нежели у больных шизофренией. Согласно данным исследований in vitro, данный гаплотип может быть ассоциирован с пониженной экспрессией гена .и с меньшей стабильностью мРНК.

7. Ассоциация маркера G444A гена DBH с избирательным зрительным вниманием

Ген DBH кодирует дофамин-р-гидроксилазу - фермент, принимающий участие в синтезе норадреналина. DBH является одним из основных генов-кандидатов, предположительно связанных с синдромом дефицита внимания с гиперактивностыо. Известно несколько полиморфных маркеров данного гена, которые могут быть ассоциированы с активностью фермента в организме.

В нашей работе мы исследовали связь зрительного избирательного внимания с маркером DBH G444A у больных шизофренией и психически здоровых людей. Мы руководствовались данными о том, что метаболизм норадреналина связан с характеристиками зрительного внимания, а его нарушения у больных шизофренией коррелируют с когнитивным функционированием. Для оценки избирательности внимания использовали модифицированную в лаборатории психологии НЦПЗ РАМН методику X. Мюнстерберга. Генотипы были определены с помощью ПЦР-РВ.

С помощью дисперсионного анализа было показано, что полиморфный маркер G444A ассоциирован с избирательным вниманием в объединённой выборке больных шизофренией и психически здоровых людей (р = 0,021) (табл. 3).

Таблица 3

Средние значения числа найденных слов в группах носителей различных генотипов. Объединённая выборка (290 человек)

Выборки/Генотипы Средние значения (¿стандартное отклонение)

Число слов Число слов

в первой серии во второй серии

Здоровые (208 человек)

АА 17,5±0,6 19,1 ±0,5

Ав 17±0,4 17,3±0,4

вв 15,6±0,6 16,б±0,5

Больные (82 человека)

АА 15±0,9 13,3±0,7

АБ 12,5±0,7 13,9±0,6

вв 12,2±0,9 13,7±0,8

Объединённая выборка (290 человек)

АА 16,8±0,5 17,4±0,4

Ав 15,8±0,4 16,4±0,3

вв 14,7±0,5 15,7±0,5

Как было продемонстрировано в работе СиЬе1Ь е1 а), данный маркер ассоциирован с уровнем активности фермента в плазме крови и концентрацией его в спинномозговой жидкости. Поскольку количество дофамин-Р-гидрокси-лазы является основным фактором, определяющим его активность в плазме и спинномозговой жидкости, эти результаты можно интерпретировать как ас-

социацшо активности DBH с маркером G444A в обоих случаях. Аллель 444А соответствовал низкой активности, 444G - высокой. На основании данных об уровнях содержания дофамина, норадреналина и их продуктов метаболизма в плазме крове больных СДВГ предполагается, что низкая активность фермента может соответствовать пониженному вниманию, что не согласуется с нашими данными (см. табл. 3), показывающими лучшие характеристики избирательного внимания у носителей аллеля 444А.

Однако в литературе отсутствуют какие-либо сведения о функциональном значении маркера G444A. Данный маркер расположен в третьей позиции кодона и не приводит к изменениям аминокислотной последовательности белка. Теоретически полиморфизм может влиять на эффективность альтернативного сплайсинга, поскольку находится на границе между экзоном 2 и инт-роном 2 гена DBH, но экспериментальные подтверждения этому не найдены. Таким образом, можно утверждать, что при условии существования функциональных полиморфных маркеров гена DBH маркер G444A может быть ассоциирован с разными их вариантами в различных популяциях и, следовательно, ассоциация между данным маркером и когнитивными характеристиками, обусловленными активностью дофашш-р-гидроксилазы, может наблюдаться с различными его аллелями. В связи с этим перспективным представляется изучение других маркеров гена для поиска гаплотипов, ассоциированных с избирательным вниманием.

Дофамин-Р-гидроксилаза, присутствующая в основном в стволе головного мозга, может влиять на уровень норадреналинергической иннервации коры полушарий и таким образом модулировать ассоциированные с корой когнитивные функции. Вместе с тем, не исключено, что дофамин-р-гидроксилаза может присутствовать в дофаминергических нейронах и участвовать в регуляции уровня дофамина наряду с такими ферментами, как катехол-О-ме-тилтрансфераза и моноаминоксидаза А.

Для выяснения роли гена DBH в когнитивных функциях необходим анализ ассоциации G444A и других маркеров в различных популяциях, а также необходимы функциональные исследования, включая поиск маркёров, обусловливающих экспрессию гена.

ВЫВОДЫ

1. Проведено генотипирование 21 полиморфного маркера генов DRD2, СОМТ. HT2CR, NPY, DBH, DTNBP1, GABRA6, DAAO, 1NMT, HTR1B, DISCI, предположительно связанных с психологическими признаками и риском развития психических расстройств, в выборках психически здоровых людей и больных психическими заболеваниями из российской популяции.

2. Обнаружена ассоциация полиморфных маркеров гена рецептора дофамина D2 (rs 1800498, Ser311Cys, С939Т, С957Т, ТааДА) с шизофренией, идентифицированы аллели, генотипы и гаплотипы, связанные с риском развития этого заболевания.

3. Показано, что полиморфизм гена рецептора дофамина D2 rsl800498 ассоциирован с алкоголизмом.

4. Выявлены гаплотипы гена рецептора дофамина D2, связанные с альтруистическим поведением.

5. Показано, что полиморфный маркер G444A гена DBH ассоциирован с избирательным зрительным вниманием как у больных шизофренией, так и у здоровых людей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Монахов, М.В. Анализ ассоциации полиморфизма С939Т гена рецептора дофамина DRD2 с шизофренией [Текст] / М.В. Монахов, В.Е. Голимбет, К.В. Чубабрия, В.В. Зыков, АЛ. Ковтун, Карпов B.JI. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2007. - Т. 107, № 10. - С. 58-60.

2. Monakhov, М. Association study of three SNPs in the dopamine D2 receptor gene and schizophrenia in Russian population [Text] / M. Monakhov, V. Golimbet, L. Abramova, V. Kaleda, V.L. Karpov // Schizophrenia Research. - 2008. -Vol. 100, № 1-3. -P. 302-307.

3. Монахов, М.В. Полиморфный маркер G444A гена DBH ассоциирован с избирательным зрительным вниманием у больных шизофренией и психически здоровых людей [Текст] / М.В. Монахов, М.В. Алфимова, В.Е. Голимбет, К.В. Чубабрия, Т.К. Шемякина, П.Е. Юматова, В.Л. Карпов // Медицинская генетика. - 2008. - № 5. - С. 26-29.

Тезисы:

1. Monakhov, М. Association between the С939Т polymorphism of the dopamine receptor D2 gene and schizophrenia in Russian population [Text] / M. Monakhov, V. Golimbet, K. Chubabria, V. Karpov // 10-th Jubilee Multidisciplinaiy International Conference of Neuroscience and Biological Psychiatry «Stress and Behaviour». - St-Petersburg, Russia, May 16-20,2007.

2. Monakhov, M. Association study of working memory and variants of genes DTNBP1, COMT, DBH and HT2CR [Text] / M. Monakhov, V. Golimbet, M. Alfimova, S. Borozdina, O. Evdokimova, V. Karpov // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. - Kyiv, Ukraine, September 20-22,2007.

3. Monakhov, M. Schizophrenia and polymorphisms of the genes DRD2, COMT, DBH, DTNBP1: association with diagnosis and selective attention in Russian population [Text] / M. Monakhov, V. Golimbet, M. Alfimova, S. Borozdina, O. Evdokimova, V. Karpov // XV Congress on Psychiatric Genetics. -New York City, USA, October 7-11,2007.

4. Mikhail Monakhov. Association of DRD2 Ser311Cys polymorphism and DRD2 haplotypes with schizophrenia in Russians [Text] / Mikhail Monakhov, Vera Golimbet, K. Chubabria, D. Dmitriev, A. Barkhatova, N. Ivanova, Vadim Karpov // 1st Schizophrenia International Research Society Conference. - Venice, Italy, June 21-25,2008.

Монахов Михаил Владимирович

Специальности 03.00.03 - молекулярная биология; 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать .15.01.2009. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печатана ризографе. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №

Издательство ПГУАС. Отпечатано в полиграфическом центре ПГУАС. 440028. г. Пенза, ул. Г. Титова, 28. E-mail: postoaster@pgasa.penza.com.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Монахов, Михаил Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. МЕТОДЫ ПСИХИАТРИЧЕСКОЙ ГЕНЕТИКИ.

2. ГЕНЫ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОЛИМОРФИЗМЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ АНОРМАЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ.

2.1. СЕРОТОНИНОВАЯ СИСТЕМА.

2.2. ДОФАМИНОВАЯ СИСТЕМА.

2.3. ФЕРМЕНТЫ, ИНАКТИВИРУЮЩИЕ НЕЙРОМЕДИАТОРЫ.

2.4. ДРУГИЕ ГЕНЫ.

3. АЛКОГОЛИЗМ И ФЕРМЕНТЫ, УТИЛИЗИРУЮЩИЕ ЭТАНОЛ.

5. ГЕНЕТИКА ВНИМАНИЯ.

6. ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. ВЫБОРКА БОЛЬНЫХ ШИЗОФРЕНИЕЙ.

2. ВЫБОРКА, ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ПРИ ПОИСКЕ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ИЗБИРАТЕЛЬНЫМ ВНИМАНИЕМ.

3. ВЫБОРКА, ИССЛЕДОВАННАЯ С ПОМОЩЬЮ ЛАБОРАТОРНОЙ ИГРЫ «ДИКТАТОР». ОПИСАНИЕ ИГРЫ.

4. ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ КРОВИ.

5. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ НАБОРА «ДНК-СОРБ-А».!.

6. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ВОЛОСЯНЫХ ЛУКОВИЦ.

7. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ОБРАЗЦОВ КРОВИ ФЕНОЛ-ХЛОРОФОРМНЫМ МЕТОДОМ.

8. 5'-НУКЛЕАЗНЫЙ АНАЛИЗ.

8.1. ГЕПОТИПИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ 5'-НУКЛЕАЗНОГО АНАЛИЗА.

8.2. НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ И ПРАЙМЕРОВ.

9. АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПЦР.

9.1. ГЕНОТИПИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПЦР.

10. HRM.

10.HR M.

10.1. ГБНОТИПИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА HRM.

11. ПРОЦЕДУРА УДЛИНЕНИЯ ПРАЙМЕРОВ (PEP).

11.1. ГБНОТИПИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА PEP.

12. АНАЛИЗ МИКРОСАТЕЛЛИТОВ С ПОМОЩЬЮ ПЦР С

ФЛУОРЕСЦЕНТНО МЕЧЕНЫМИ ПРАЙМЕРАМИ С ПОСЛЕДУЮЩИМ КАПИЛЛЯРНЫМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ.

13. СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ОБЩИЙ ХОД РАБОТЫ.

2. РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДИК ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ.

2.1. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ГЕНОТИПИРОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ 5'-НУКЛЕАЗНОГО АНАЛИЗА. ПРОВЕРКА ТОЧНОСТИ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ ПРЯМОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК.

2.2. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ГЕНОТИПИРОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА HRM.

2.3. АНАЛИЗ ПОЛИМОРФНОГО МАРКЕРА C861G ГЕНА HTR1B С ПОМОЩЬЮ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПЦР.

2.4. АНАЛИЗ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ СОМГ, DRD4, IGF2, SNAP-25 С ПОМОЩЮ ПРОЦЕДУРЫ УДЛИНЕНИЯ ПРАЙМЕРОВ.

2.5. РЕЗУЛЬТАТЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ.

3. АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ И ГАПЛОТИПОВ

ГЕНА DRD2 С ШИЗОФРЕНИЕЙ, АЛКОГОЛИЗМОМ И АЛЬТРУИСТИЧЕСКИМ ПОВЕДЕНИЕМ.

4. АССОЦИАЦИЯ МАРКЕРА G444A ГЕНА DBH С ИЗБИРАТЕЛЬНЫМ ЗРИТЕЛЬНЫМ ВНИМАНИЕМ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфные маркеры генов, ассоциированные с психологическими признаками и риском развития психических расстройств"

Функционирование центральной нервной системы определяется взаимодействием большого числа различных белков и белковых комплексов, включая рецепторы нейромедиаторов и нейромодуляторов, ферменты, обеспечивающие синтез и распад этих веществ, трансмембранные переносчики, поддерживающие необходимые концентрации нейромедиаторов в клеточных компартментах и синаптических щелях, факторы роста нейронов и многие другие. Первоочередное значение имеет активность таких нейротрансмитте-ров, как моноамины (дофамин, серотонин, норадреналин, глутамат) и гамма-аминомасляной кислоты. Их воздействие на различные нейроны определяет выраженность всевозможных психических проявлений, включая особенности темперамента и когнитивные функции, а нарушения в работе моноами-ноергических систем являются причиной развития ряда психических заболеваний, например, аддиктивных, тревожных и личностных расстройств, а также эндогенных психозов (биполярного аффективного расстройства и шизофрении).

За последнее время появилось много работ, в которых были получены доказательства связи между генами моноаминоергических систем и психическими проявлениями. Были обнаружены конкретные полиморфные участки в этих генах, с которыми эти проявления ассоциированы. Так, показано, что полиморфизмы гена, кодирующего дофаминовый рецептор D4 вносят вклад в межиндивидуальные различия по чертам личности, связанным с экстраверсией и поиском новизны, а полиморфизм Vall58Met гена, кодирующего фермент катехол-0-метилтрансферазу, который принимает участие в распаде дофамина в передней коре, связан с функциями внимания и рабочей памяти, а также ассоциирован с шизофренией. Выявлены аллельные варианты генов серотонинергической системы, в том числе переносчика серотонина и рецепторов серогонина типа 2А и 2С, которые связаны с выраженностью признаков тревожного ряда, а также предрасположением к развитию клинической депрессии.

Следует отметить, что одни и те же полиморфизмы исследованных генов могут быть связаны с различными сферами психики и соответственно с нарушениями в функционировании этих сфер. Этот факт свидетельствует в пользу теорий единого механизма, лежащего в основе разных психических нарушений, которые выдвигаются в последнее время в психиатрии. Активно обсуждается проблема генетической общности эндогенных психозов, в том числе, шизофрении и биполярного аффективного расстройства.

Для анализа такого набора маркеров в больших выборках необходима надежная и воспроизводимая методика генотипирования. Современные методы молекулярной биологии, такие как ПЦР в режиме реального времени и другие технологии, основанные на ПЦР, позволяют с большой точностью различать аллельные варианты различных полиморфных сайтов.

Целью данной работы являлся генетический анализ полиморфных маркеров набора генов кандидатов, связанных с функционированием центральной нервной системы, в выборках психически здоровых людей, а также в выборках больных шизофренией, биполярным расстройством, алкоголизмом и лиц, совершивших самоубийство.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать полиморфные локусы, имеющие ключевое значение для функционирования нейрохимических систем, либо локусы, сцепленные с предполагаемыми функциональными вариантами.

2. Разработать методы определения генотипов данных полиморфных маркеров.

3. Провести генотипирование образцов ДНК и установить распределение частоты аллелей генетических вариантов в используемых выборках.

4. Провести статистический анализ полученных данных для выявления ассоциации между генетическими, вариантами и психическими нарушениями, а также для оценки вклада генетических вариантов в вариативность психологических признаков.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Наследуемость особенностей поведения и психических заболеваний давно не вызывает сомнений. Несмотря на то, что поведение формируется под влиянием различных факторов, в том числе воспитания и социального окружения, генетическая составляющая также вносит свой вклад, величина которого зависит от рассматриваемого признака.

Например, наследуемость шизофрении достигает 85%, СДВГ - 76% и т.д.

Однако мало известно о конкретных вариантах ДНК, вызывающих те или иные нарушения, несмотря на то, что в последние годы было проведено огромное количество исследований, пытающихся обнаружить такую взаимосвязь. В общем случае ставится задача найти гены, полиморфные маркеры которых ассоциированы с тем или иным нарушением поведения либо с определёнными психологическими признаками. Однако, психические расстройства и психологические признаки зависят от нарушения сложных функций нервной системы, а их формирование зависит от взаимодействия множества генов. Вместе с тем мутации генов нервной системы имеют сложный и плейотропный эффект. Они приводят к большой гетерогенности психических нарушений, начиная от слабо выраженных и заканчивая значительными, полностью дезорганизующими поведение.

Всё это резко затрудняет исследования. Результат зависит от применяемого метода обработки данных, от выбора групп пациентов, от используемых психологических тестов.

Во многих работах демонстрируется, что исследуемый ген так или иначе связан с определённым психическим расстройством, но как правило отсутствуют чёткие выводы, позволяющие прогнозировать болезнь по генетическим признакам.

Практически в случае каждого кандидатного гена, способного регулировать поведение, встречаются взаимно противоречащие выводы о влиянии определённого полиморфизма на психику. Чем дольше изучается тот или иной полиморфный локус, тем больше имеется работ, подтверждающих его ассоциацию с тем или иным заболеванием, и работ, эту ассоциацию опровергающих.

Даже если выводы положительны, редко можно утверждать, что один из аллелей гена вызывает определённое поведение. Скорее следует говорить о вероятности встретить нарушения среди носителей аллеля. Часто эта вероятность не очень велика по сравнению с вероятностью для контрольной выборки.

Если число работ, затрагивающих определённый полиморфизм, достаточно велико, появляется возможность провести мета-анализ, то есть статистическое исследование, охватывающее несколько выборок, проверенных ранее. Но зачастую даже результаты мета-анализа не позволяют подтвердить наличие ассоциации. Например, мета-анализ был проведён для генов сероти-нэргической системы в работе (Anguelova, Benkelfat et al. 2003) но ни в одном случае не выявил достоверной ассоциации. В чём причина этой неудачи? Вероятно, для выявления взаимосвязи между генотипом и поведенческим фенотипом необходимо учитывать полиморфизм не одного гена, а нескольких, а также эффекты взаимодействия между ними.

Логичным будет предположить, что человек, несущий одновременно мутации генов рецептора и транспортёра серотонина, будет обладать другим фенотипом, нежели носитель лишь одной мутации. Также можно предположить, что мутация одного гена компенсирует в некоторых случаях эффект мутации другого гена.

Вместе с тем, одни и те же психические расстройства (особенно такие полиморфные как шизофрения), вероятно, могут быть вызваны различными мутациями, что опять же делает предпочтительным анализ определённого набора полиморфизмов. мутациями, что опять же делает предпочтительным анализ определённого набора полиморфизмов.

Помимо того, надо учитывать, что в большинстве случаев анализируются полиморфизмы, изменяющие структуру белка. Однако, существуют данные, указывающие, что функциональное значение могут иметь и другие полиморфизмы, например, меняющие пространственную структуру мРНК, или расположенные в генах, кодирующие регуляторные нетранслируемые РЕК. Так показано, что полиморфизмы С957Т и С1101А гена DRD2 меняют стабильность и скорость трансляции мРНК DRD2 (Perkins, Jeffries et al. 2005).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Монахов, Михаил Владимирович

выводы

1. Проведено генотипирование 21 полиморфного маркера генов DRD2, СОМТ, HT2CR, NPY, DBH, DTNBP1, GABRA6, DAAO, INMT, HTR1B, DISCI, предположительно связанных с психологическими признаками и риском развития психических расстройств, в выборках психически здоровых людей и больных психическими заболеваниями из российской популяции.

2. Обнаружена ассоциация полиморфных маркеров гена рецептора дофамина D2 (rs 1800498, Ser311Cys, С939Т, С957Т, TaqlA) с шизофренией, идентифицированы аллели, генотипы и гаплотипы, связанные с риском развития этого заболевания.

3. Показано, что полиморфизм гена рецептора дофамина D2 rs 1800498 ассоциирован с алкоголизмом.

4. Выявлены гаплотипы гена рецептора дофамина D2, связанные с альтруистическим поведением.

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ п.о. - пара оснований ДНК

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СДВГ - синдром недостатка внимания с гиперактивностью (attention deficit/hyperactivity disorder) BD - bipolar disorder (биполярное расстройство, маниакально-депрессивный синдром)

СОМТ- ген катехол-О-метилтрансферазы DRD2 - ген дофаминового рецептора №2 DTNBPI — ген дистобревинсвязывающего белка 1

HRM - high resulution melt (распознавание фрагментов ДНК по температуре плавления)

HT2CR - ген серотонинового рецептора «2С»

HTR1B - ген серотонинового рецептора «1В»

MDD — major depresive disorder (общий депрессивный синдром)

NRG1 - ген нейрегулина 1

OR - odds ratio (соотношение шансов)

PEP - primer extension procedure (аллель-специфическое удлинение праймера на один нуклеотид)

R6G - 6-карбоксиродамин, флуоресцентный краситель SB - suicidal behavior (суицидальное поведение)

SNP - single nucleotide polymorphism (полиморфизм, выраженный в замене одного нуклеотида)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Были разработаны методы определения аллельных вариантов с помощью 5'-пуклеазного анализа, аллель-специфической ПЦР, ПЦР с распознаванием температур плавления ампликонов. Надёжность методов подтверждена с помощью прямого секвенирования и процедуры однонуклеотидного удлинения праймеров (PEP).

Впервые было проведено генотипирование ряда полиморфных локусов генов DRD2, DTNBP1, DBH, 2-HTCR, 2-HTRB, DISCI и других в выборках из российской популяции. Данные полиморфные маркеры были проанализированы в выборках больных шизофренией, алкоголизмом, биполярным расстройством, людей, совершивших самоубийство. Была проверена ассоциация между маркерами и различными характерными симптомами данных расстройств. Методами генетического анализа рассчитаны частоты гаплотипов и исследован характер сцепления между маркерами. Для нескольких маркеров была обнаружена ассоциация с риском развития шизофрении, алкоголизма, с различными когнитивными характеристиками.

Впервые был проведён анализ ассоциации ряда маркеров гена DRD2 с результатами экономической лабораторной игры «Диктатор». Выявлена ассоциация с гаплотипами.

Полученные результаты свидетельствую о корреляции между рядом генетических полиморфизмов и психическими заболеваниями. При подтверждении универсального характера данных корреляций в рамках определённой популяции результаты могут быть использованы при диагностике психических заболеваний, в генетическом консультировании, а также при медицинском обследовании лиц, профессиональная деятельность которых требует повышенной стрессоустойчивости.

Работа демонстрирует применимость методов 5'-нуклеазного анализа и HRM для генотипирования широкого спектра полиморфных маркеров типа SNP.

Работа апробирована на лабораторном семинаре в Лаборатории структуры и функции хромосом ИМБ РАН им. В.А.Энгельгардта. Результаты работы были представлены:

1) на 10-й Международной конференции «Стресс и поведение», Санкт-Петербург, Россия, 16-20 мая 2007 года;

3) на 15-м Всемирном конгрессе по психиатрической генетике, Нью-Йорк, США, 7-11 октября 2007 года;

4) на 1-й Конференции международного сообщества по исследованиям шизофрении, Венеция, Италия, 21-25 июня 2008 года.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

1. Монахов М.В., Голимбет В.Е., Чубабрия К.В., Зыков В.В., Ковтун А.Л., Карпов В.Л.Анализ ассоциации полиморфизма С939Т гена рецептора дофамина DRD2 с шизофренией. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова, 2007; 107: 10: 58-60.

2. Monakhov М, Golimbet V, Abramova L, Kaleda V, Karpov VL. Association study of three SNPs in the dopamine D2 receptor gene and schizophrenia in Russian population. Schizophrenia Research. 2008; 100 (1-3) 302307.

3. Монахов M.B., Алфимова M.B., Голимбет B.E., Чубабрия К.В., Шемякина Т.К., Юматова П.Е., Карпов В.Л. Полиморфный маркер G444A гена DBH ассоциирован с избирательным зрительным вниманием у больных шизофренией и психически здоровых людей. Медицинская генетика, 2008; 5: 26-29.

Также в сборниках материалов конференций были опубликованы следующие тезисы:

1. Monakhov М, Golimbet V, Chubabria К, Karpov V. Association between the C939T polymorphism of the dopamine receptor D2 gene and schizophrenia in Russian population. 10-th Jubilee Midtidisciplinary International Conference of Neuroscience and Biological Psychiatiy "Stress and Behaviour", St-Petersburg, Russia, May 16-20, 2007.

2. Monakhov M, Golimbet V, Alfimova M, Borozdina S, Evdokimova O, Karpov V. Association study of working memory and variants of genes DTNBP1, COMT, DBH and HT2CR. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Kyiv, Ukraine, September 20-22, 2007.

3. Monakhov M, Golimbet V, Alfimova M, Borozdina S, Evdokimova O, Karpov V. Schizophrenia and polymorphisms of the genes DRD2, COMT, DBH, DTNBP1: association with diagnosis and selective attention in Russian population. XV Congress on Psychiatric Genetics, New York City, USA, October 7-11, 2007.

4. Mikhail Monakhov, Vera Golimbet, K. Chubabria, D. Dmitriev, A. Barkha-tova, N. Ivanova, Vadim Karpov. Association of DRD2 Ser311Cys polymorphism and DRD2 haplotypes with schizophrenia in Russians. 1st Schizophrenia International Research Society Conference, Venice, Italy, June 21-25, 2008.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Монахов, Михаил Владимирович, Москва

1. Голимбет В.Е. (2004). "Геномика в психологии и психиатрии" Молекулярная биология 2004.-38.-№1.-165-170.

2. Aberg, К., P. Saetre, et al. (2006). "Human QKI, a potential regulator of mRNA expression of human oligodendrocyte-related genes involved in schizophrenia." Proc Natl Acad Sci U S A 103(19): 7482-7.

3. Abi-Dargham, A., J. Rodenhiser, et al. (2000). "Increased baseline occupancy of D2 receptors by dopamine in schizophrenia." Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 8104-8109.

4. Allen, N., S. Bagade, et al. The SchizophreniaGene Database. Schizophrenia Research Forum. Available at:http://www.schizophreniaforum.org/res/sczgene/default.asp. Accessed date of access.

5. Anguelova, M., C. Benkelfat, et al. (2003). "A systematic review of association studies investigating genes coding for serotonin receptors and the serotonin transporter: I. Affective disorders." Molecular Psychiatry 8: 574-591.

6. Aoyama, N., N. Takahashi, et al. (2006). "Association study between kynurenine 3-monooxygenase gene and schizophrenia in the Japanese population." Genes. Brain & Behavior 5(4): 364.

7. Apud, J., V. Mattay, et al. (2007). "Tolcapone improves cognition and cortical information processing in normal human subjects." Neuropsychophar-macobgy 32(5): 1011-20.

8. Arinami, Т., M. Gao, et al. (1997). "A functional polymorphism in the promoter region of the dopamine D2 receptor gene is associated with schizophrenia." Hum Mol Genet. 6(4): 577-82.

9. Bellivier, F., P. Chaste, et al. (2004). "Association Between the TPH Gene A218C Polymorphism and Suicidal Behavior: A Meta-Analysis." American Journal of Medical Genetics Part В (Neuropsychiatric Genetics) 124B: 8791.

10. Blasi, G., V. Mattay, et al. (2005). "Effect of catechol-O-methyltransferase vall58met genotype on attentional control." J Neurosci 25(20): 5038-45.

11. Bobb, A. J., A. M. Addington, et al. (2005). "Support for Association Between СДВГ and Two Candidate Genes: NET1 and DRD1." American Journal of Medical Genetics Part В (Neuropsychiatric Genetics) 134B(67-72).

12. Bogaert, A. V. D., J. Schumacher, et al. (2003). "The DTNBP1 (Dysbindin) Gene Contributes to Schizophrenia, Depending on Family History of the Disease." Am. J. Hum. Genet. 73: 1438-1443.

13. Bourgeron, T. and B. Giros Genetic Markers in Psychiatric Genetics. Methods in Molecular Medicine, vol. 77: Psychiatric Genetics: Methods and Reviews. M. Leboyer and F. Bellivier. Totowa, NJ, Humana Press Inc.

14. Breen, G., J. Brown, et al. (1999). "-141 С del/ins polymorphism of the dopamine receptor 2 gene is associated with schizophrenia in a British population." Am J Med Genet. 88(4): 407-10.

15. Brennan, M. and J. Condra (2005). "Transmission disequilibrium suggests a role for the sulfotransferase-4Al gene in schizophrenia." Am J Med Genet В Neuropsvchiatr Genet. 139(1): 69-72.

16. Brookes, K.-J., X. Xu, et al. (2005). "No evidence for the association of DRD4 with СДВГ in a Taiwanese population within-family study." BMC Medical Genetics 6: 31.

17. Burdick, К., T. Lencz, et al. (2006). "Genetic variation in DTNBP1 influences general cognitive ability." Hum Mol Genet. 15(10): 1563-8.

18. Caldu, X., P. Vendrell, et al. (2007). "Impact of the COMTV all08/158 Met and DAT genotypes on prefrontal function in healthy subjects." Neuroimage 37(4): 1437-44.

19. Callicott, J. H., R. E. Straub, et al. (2005). "Variation in DISCI affects hip-pocampal structure and function and increases risk for schizophrenia." PNAS 102(24): 8627-8632.

20. Chen, J., В. K. Lipska, et al. (2005). "Functional analysis of genetic variation in catechol-O-methyltransferase (COMT): effects on mRNA, protein, and enzyme activity in postmortem human brain." Am J Hum Genet 75(5): 807-21.

21. Collier, D. A. and T. Li (2003). "The genetics of schizophrenia: glutamate not dopamine?" European Journal of Pharmacology 480: 177- 184.

22. Courtet, P., F. Jollant, et al. (2005). "Suicidal Behavior: Relationship Between Phenotype and Serotonergic Genotype." American Journal of Medical Genetics Part С (Semin. Med. Genet.) 133C: 25-33.

23. Craddock, N., M. C. O'Donovan, et al. (2005). "The genetics of schizophrenia and bipolar disorder: dissecting psychosis." J Med Genet 42: 193-204.

24. Cubells, J., D. v. Kammen, et al. (1998). "Dopamine beta-hydroxylase: two polymorphisms in linkage disequilibrium at the structural gene DBH associate with biochemical phenotypic variation." Hum Genet 102(5): 533-40.

25. Cucherat, M., J. Boissel, et al. (1997). "EasyMA: a program for the metaanalysis of clinical trials." Computer Methods and Programs in Biomedecine 53: 187-190.

26. Damberg, M., С. Berggard, et al. (2003). "Transcription Factor AP-2? Genotype associated with Anxiety-Related Personality Traits in Women." Neuropsychobiology 48: 169-175.

27. Dong, E., R. C. Agis-Balboa, et al. (2005). "Reelin and glutamic acid decar-boxylase67 promoter remodeling in an epigenetic methionine-induced mouse model of schizophrenia." PNAS 102(35): 12578-12583.

28. Duan, J., M. S. Wainwright, et al. (2003). "Synonymous mutations in the human dopamine receptor D2 (DRDI) affect mRNA stability and synthesis о Г the receptor." Human Molecular Genetics 12(3): 205-216.

29. Dubeitret, C., L. Gouya, et al. (2004). "The 3' region of the DRD2 gene is involved in genetic susceptibility to schizophrenia." Schizophr Res 67(1): 75-85.

30. Dudbridge, F. (2008). "Likelihood-Based Association Analysis for Nuclear Families and Unrelated Subjects with Missing Genotype Data." Human Heredity 66: 87-98.

31. Erblich, J., C. Lerman, et al. (2004). "Stress-induced cigarette craving: effects of the DRD2 TaqI RFLP and SLC6A3 VNTR polymorphisms." The Pharmacogenomics Journal 4: 102-109.

32. Excoffier, L., G. Laval, et al. (2.005). "Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis." Evolutionary Bioin-formatics Online 1: 47-50.

33. Faraone, S. V., R. H. Perlis, et al. (2005). "Molecular Genetics of Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder." BIOL PSYCHIATRY 25(11): 1313-23.

34. Faul, Т., M. Gawlik, et al. (2005). "ZDHHC8 as a candidate gene for schizophrenia: analysis of a putative functional intronic marker in case-control and family-based association studies." BMC Psychiatry 5: 35.

35. Fehr, C., N. Grintschuk, et al. (2000). "The HTR1B 861G>C receptor polymorphism among patients suffering from alcoholism, major depression, anxiety disorders and narcolepsy." Psychiatry Research 97: 1-10.

36. Fehr, С., T. Sander, et al. (2006). "Confirmation of association of the GABRA2 gene with alcohol dependence by subtype-specific analysis." Psychiatric Genetics 16(1): 9-17.

37. Freedman, R. Electrophysiological Phenotypes. Methods in Molecular Medicine, vol. 77: Psychiatric Genetics: Methods and Reviews. M. Leboyer and F. Bellivier. Totowa, NJ, Humana Press Inc.

38. Funke, В., С. Т. Finn, et al. (2004). "Association of the DTNBP1 Locus with Schizophrenia in a U.S. Population." Am. J. Hum. Genet. 75: 891-898.

39. Gerra, G., L. Garofano, et al. (2005). "Serotonin transporter promoter polymorphism genotype is associated with temperament, personality traits and illegal drugs use among adolescents." J Neural Transm 112(10): 1397-410.

40. Glatt, S., S. Faraone, et al. (2004). "DRD2 -141C insertion/deletion polymorphism is not associated with schizophrenia: results of a meta-analysis." Am J Med Genet В Neuropsychiatr Genet. 128(1): 21-3.

41. Glatt, S. and E. Jonsson (2006). "The Cys allele of the DRD2 Ser31 ICys polymorphism has a dominant effect on risk for schizophrenia: evidence from fixed- and random-effects meta-analyses." Am J Med Genet В Neuropsychiatr Genet. 141(2): 149-54.

42. Golimbet, V., M. Aksenova, et al. (2001). "Dopamine receptor gene (.DRD2) polymorphism in patients with endogenous psychoses with regard to their clinical heterogeneity." Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova. 101(11): 503.

43. Golimbet, V., M. Aksenova, et al. (2003). "Analysis of the linkage of the Taql A and TaqlB loci of the dopamine D2 receptor gene with schizophrenia in patients and their siblings." Neurosci Behav Physiol 33(3): 223-5.

44. Gornick, M., A. Addington, et al. (2005). "Dysbindin (DTNBP1, 6p22.3) is Associated with Childhood-Onset Psychosis and Endophenotypes Measured by the Premorbid Adjustment Scale (PAS)." J Autism Dev Disord. 35(6): 831-8.

45. Hanninen, К., H. Katila, et al. (2006). "Association between the C957T polymorphism of the dopamine D2 receptor gene and schizophrenia." Neu-roscience Letters 407: 195-198.51 .Hashimoto, R., T. Numakawa, et al. (2006). "Impact of the DISCI

46. Ser704Cys polymorphism on risk for major depression, brain morphology, and ERK signaling." Hum Mol Genet.: Epub ahead of print.

47. Heils, A., A. Teufel, et al. (1996). "Allelic Variation of Human Serotonin Transporter

48. Gene Expression." J. Neurochem 66(6): 2621.

49. Heinrichs, R. (2004). "Meta-analysis and the science of schizophrenia: variant evidence or evidence of variants?" Neurosci Biobehav Rev 28(4): 37994.

50. Himei, A., J. Koh, et al. (2002). "The influence on the schizophrenic symptoms by the Z}KZ)2Ser/Cys311 and -141C Ins/Del polymorphisms." Psychiatry Clin Neurosci 56(1): 97-102.

51. Hinrichs, A., J. Wang, et al. (2006). "Functional variant in a bitter-taste receptor (hTAS2R16) influences risk of alcohol dependence." Am J Hum Genet 78(1): 103-11.

52. Hirvonen, J., T. v. Erp, et al. (2005). "Increased caudate dopamine D2 receptor availability as a genetic marker for schizophrenia." Arch Gen Psychiatry. 62(4): 371-8.

53. Hodgkinson, С. A., D. Goldman, et al. (2004). "Disrupted in Schizophrenia 1 (DISCI): Association with Schizophrenia, Schizoaffective Disorder, and Bipolar Disorder." Am. J. Hum. Genet. 75: 862-872.

54. Hoenicka, J., M. Aragues, et al. (2006). "C957T DRD2 polymorphism is associated with schizophrenia in Spanish patients." Acta Psychiatr Scand 114: 435-438.

55. Huang, Y.-y., S. P. Cate, et al. (2004). "An Association between a Functional Polymorphism in the Monoamine Oxidase A Gene Promoter, Impulsive Traits and Early Abuse Experiences." Neuropsychopharmacology 29: 1498-1505.

56. Huang, Y.-y., M. A. Oquendo, et al. (2003). "Substance Abuse Disorder and Major Depression are Associated with the Human 5-HT1B Receptor Gene

57. СHTR1B) G861C Polymorphism." Neuropsychopharmacology 28: 163-169.

58. Jonsson, E. G., A. Sille'n, et al. (2003). "Dopamine D2 Receptor Gene Ser31 ICys Variant and Schizophrenia: Association Study and Meta-Analysis." American Journal of Medical Genetics Part В (Neuropsychiatric Genetics) 119B: 28-34.

59. Katsu, Т., H. Ujike, et al. (2003). "The human frizzled-3 (FZD3) gene on chromosome 8p21, a receptor gene for Wnt ligands, is associated with the susceptibility to schizophrenia." Neuroscience Letters 353(1): 53-56.

60. Kieling, С., T. Roman, et al. (2006). "Association between DRD4 gene and performance of children with СДВГ in a test of sustained attention." Biol Psychiatry 60(10): 1163-5.

61. Kitahama, K., N. Sakamoto, et al. (1996). "Dopamine-beta-hydroxylase and tyrosine hydroxylase immunoreactive neurons in the human brainstem." J Chem Neuroanat 10(2): 137-46.

62. Kobayashi, K., Y. Kurosawa, et al. (1989). "Human dopamine beta-hydroxylase gene: two mRNA types having different З'-terminal regions are produced through alternative polyadenylation." Nucleic Acids Res 17(3): 1089-102.

63. Konradi, С., M. Eaton, et al. (2004). "Molecular Evidence for Mitochondrial Dysfunction in Bipolar Disorder." Arch Gen Psychiatry. 61: 300-308.

64. Kopeckova, M., I. Paclt, et al. (2006). "Polymorphisms of dopamine-beta-hydroxylase in СДВГ children." Folia Biol (Praha) 52(6): 194-201.

65. Kotler, M., P. Barak, et al. (1999). "Homicidal behavior in schizophrenia associated with a genetic polymorphism determining low catechol O-methyltransferase (COMT) activity." Am J Med Genet 88(6): 628-633.

66. Kukreti, R., S. Tripathi, et al. (2006). "Association of DRD2 gene variant with schizophrenia." Neuroscience Letters 392(1-2): 68-71.

67. Kunugi, H., R. Hashimoto, et al. (2006). "Possible association between non-synonymous polymorphisms of the anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene and schizophrenia in a Japanese population." J Neural Transm: Epub ahead of print.

68. Lawford, В., R. Young, et al. (2005). "The C/C genotype of the C957T polymorphism of the dopamine D2 receptor is associated with schizophrenia." MdzophrRes^73(1): 31-7.

69. Lencz, Т., D. Robinson, et al. (2006). "DRD2 promoter region variation as a predictor of sustained response to antipsychotic medication in first-episode schizophrenia patients." Am J Psychiatry 163(3): 529-31.

70. Lerer, В., F. Macciardi, et al. (2001). "Variability of 5-HT2C receptor cys23ser polymorphism among European populations and vulnerability to affective disorder." Molecular Psychiatry 6: 579-585.

71. Li, C., Y. Zheng, et al. (2006). "A family-based association study of kinesin heavy chain member 2 gene (KIF2) and schizophrenia." Neuroscience Letters Epub ahead of print.

72. Li, D., D. Collier, et al. (2006). "Meta-analysis shows strong positive association of the neuregulin 1 (NRG1) gene with schizophrenia." Hum Mol Genet. 15(12): 1995-2002.

73. Lindemann, L. and M. C. Hoener (2005). "A renaissance in trace amines inspired by a novel GPCR family." TRENDS in Pharmacological Sciences 26(5): 274-281.

74. Lo, W.-S., M. Harano, et al. (2006). "GABRB2 Association with Schizophrenia: Commonalities and Differences Between Ethnic Groups and Clinical Subtypes." Biological Psychiatry: Article in Press, Corrected Proof.

75. Lowe, N., A. Kirley, et al. (2004). "Joint Analysis of the DRD5 Marker Concludes Association with Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder Confined to the Predominantly Inattentive and Combined Subtypes." Am. J. Hum. Genet 74: 348-356.

76. MacDonald, A., C. Carter, et al. (2007). "COMT val 158Met and executive control: a test of the benefit of specific deficits to translational research." J Abnorm Psychol 116(2): 306-12.

77. Malhotra, A., L. Kestler, et al. (2002). "A functional polymorphism in the COiVIT gene and performance on a test of prefrontal cognition." Am J Psychiatry 159(4): 652-4.

78. Mannuzza, S., R. G. Klein, et al. (1998). "Adult Psychiatric Status of Hyperactive Boys Grown Up." Am J Psychiatry 155: 493-498.

79. Manuck, S. В., J. D. Flory, et al. (2000). "A regulatory polymorphism of the monoamine oxidase-A gene may be associated with variability in aggression, impulsivity, and central nervous system serotonergic responsivity." Psychiatry Research 95: 9-23.

80. Marino, C., L. Vanzin, et al. (2004). "An Assessment of Transmission Disequilibrium Between Quantitative Measures of Childhood Problem Behaviors and DRD2/Tac\i and DRD4/48bp-repeat Polymorphisms." Behavior Genetics 34(5): 495-502.

81. Massat, I., D. Soueiy, et al. (2004). "Association between COMT (Vall58Met) functional polymorphism and early onset in patients with major depressive disorder in a European multicenter genetic association study." Molecular Psychiatry 10(6): 598-605.

82. Massat, I., D. Soueiy, et al. (2002). "Excess of allelel for ?3 subunit GABA receptor gene (GABRA3) in bipolar patients: a multicentric association study." Molecular Psychiatry 7: 201-207.

83. Matsumoto, С., T. Shinkai, et al. (2005). "Association between three funcitional polymorphisms of the dopamine D2 receptor gene and polydipsia in schizophrenia." Int J Neuropsychopharmacol. 8(2): 245-53.

84. McGorry, P., C. Mihalopoulos, et al. (1995). "Spurious precision: procedural validity of diagnostic assessment in psychotic disorders." Am J Psychiatry. 152(2): 220-3.

85. Muhle, R., S. V. Trentacoste, et al. (2005). "The Genetics of Autism." Pediatrics 113: 472-486.

86. Munafo, M. R., L. Bowes, et al. (2005). "Lack of association of the COMT Vail 58/108 Met) gene and schizophrenia: a meta-analysis of case-control studies." Molecular Psychiatry advance online publication,: 1-6.

87. Munafo, M. R., E. C. Johnstone, et al. (2005). "Association between the DRD2 gene TaqlA (C32806T) polymorphism and alcohol consumption in social drinkers." Pharmacogenomics Journal 5: 96-101.

88. Mundo, E., M. A. Richter, et al. (2000). "Is the 5-HT1D? Receptor Gene Implicated in the Pathogenesis of Obsessive-Compulsive Disorder?" Am J Psychiatry 157: 1160-1161.

89. Nakamura, К., K. Yamada, et al. (2006). "Evidence that variation in the peripheral benzodiazepine receptor (PBR) gene influences susceptibility to panic disorder." Am J Med Genet В Neuropsychiatr Genet. 141(3): 222-6.

90. Nakazono, Y., H. Abe, et al. (2005). "Association between neuroleptic drug-induced extrapyramidal symptoms and dopamine D2-receptor polymorphisms in Japanese schizophrenic patients." Int J Clin Pharmacol Ther 43(4): 163-71.

91. New, A. S., J. G. Goodman, et al. (2001). "Suicide, Impulsive Aggression, and HTR1B Genotype." Biol Psychiatry 50: 62-65.

92. Noble, E. P. (2003). "D2 Dopamine Receptor Gene in Psychiatric and Neurologic Disorders and Its Phenotypes." Journal of Medical Genetics Part В (Neuropsychiatry Genetics) 116B: 103-125.

93. Oades, R., B. Ropcke, et'al. (2005). "Neuropsychological measures of attention and memory function in schizophrenia: relationships with symptom dimensions and serum monoamine activity." Behavioral and Brain Functions 1: 14.

94. Oh, K., D. Shin, et al. (2003). "Dopamine transporter genotype influences the attention deficit in Korean boys with СДВГ." Yonsei Med J 44(5): 787-92.

95. Ohara, К., M. Nagai, et al. (1998). "Functional polymorphism of -141С Ins/Del in the dopamine D2 receptor gene promoter and schizophrenia." Psychiatry Res. 81(2): 117-23.

96. Opgen-Rhein, C., A. Neuhaus, et al. (2008). "Executive Attention in Schizophrenic Males and the Impact of COMT Vail08/158Met Genotype on Performance on the Attention Network Test." Schizophr Bull article in press.

97. Parasuraman, R., P. Greenwood, et al. (2005). "Beyond heritability: neurotransmitter genes differentially modulate visuospatial attention and working memory." Psychol Sci 16(3): 200-7.

98. Payton, A., J. Holmes, et al. (2001). "Susceptibility genes for a trait measure of attention deficit hyperactivity disorder: a pilot study in a nonclinical sample of twins." Psychiatry Res. 105(3): 273-8.

99. Perkins, D. О., C. Jeffries, et al. (2005). "Expanding the 'central dogma': the regulatory role of nonprotein coding genes and implications for the genetic liability to schizophrenia." Molecular Psychiatry 10: 69-78.

100. Preisig, M., F. Bellivier, et al. (2000). "Association Between Bipolar Disorder and Monoamine Oxidase A Gene Polymorphisms: Results of a Multicenter Study." Am J Psychiatry 157: 948-955.

101. Riley, B. and K. S. Kendler (2006). "Molecular genetic studies of schizophrenia." European Journal of Human Genetics 14: 669-680.

102. Rodriguez-Jimenez, R., J. Hoenicka, et al. (2006). "Performance in the Wisconsin Card Sorting Test and the C957T polymorphism of the DRD2 gene in healthy volunteers." Neuropsychobiology 54(3): 166-70.

103. Sabol, S. Z., S. Hu, et al. (1998). "A functional polymorphism in the monoamine oxidase A gene promoter." Hum Genet 103: 273-279.

104. Sazci, A., E. Ergul, et al. (2003). "Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms in patients with schizophrenia." Molecular Brain Research 117: 104-107.

105. Scharfetter, J. (2004). "Pharmacogenetics of dopamine receptors and response to antipsychotic drugs in schizophrenia—an update." Pharmacogenomics. 5(6): 691-8.

106. Schmidt, L. G., H. Harms, et al. (1998). "Modification of Alcohol Withdrawal by the A9 Allele of the Dopamine Transporter Gene." Am J Psychiatry 155: 474-478.

107. Schwab, S. G., M. Knapp, et al. (2003). "Support for Association of Schizophrenia with Genetic Variation in the 6p22.3 Gene, Dysbindin, in Sib-Pair Families with Linkage and in an Additional Sample of Triad Families." Am. J. Hum. Genet. 72: 185-190.

108. Severinsen, J., T. Als, et al. (2006). "Association analyses suggest GPR24 as a shared susceptibility gene for bipolar affective disorder and schizophrenia." Am J Med Genet В Neuropsychiatr Genet. 141(5): 524-33.

109. Shimizu, H., Y. Iwayama, et al. (2006). "Genetic and expression analyses of the STOP (MAP6) gene in schizophrenia." Schizophrenia Research 84(2-3): 244-252.

110. Spurlock, G., J. Williams, et al. (1998). "European Multicentre Association Study of Schizophrenia: a study of the DRD2 Ser31 ICys and DRD3 Ser9Gly polymorphisms." Am J Med Genet. 81(1): 24-8.

111. Stefansson, H., J. Sarginson, et al. (2003). "Associationof-Neuregulin 1 withSchizophreniaConfirmedinaScottish Population." Am.J.Hum.Genet. 72: 83-87.

112. Stefansson, H., E. Sigurdsson, et al. (2002). "Neuregulinl andSuscep-tibilitytoSchizophrenia." Am.J.Hum.Genet. 71: 877-892.

113. Straub, R., В. Lipska, et al. (2007). "Allelic variation in GAD1 (GAD67) is associated with schizophrenia and influences cortical function and gene expression." Mol Psychiatry 12(9): 854-69.

114. Straub, R. E., Y. Jiang, et al. (2002). "Genetic Variation in the 6p22.3 Gene DTNBP1, the Human Ortholog of the Mouse Dysbindin Gene, Is Associated with Schizophrenia." Am. J. Hum. Genet. 71: 337-348.

115. Sullivan, P. F. (2005). "The Genetics of Schizophrenia." PLoS Medicine 2(7): 614-8.

116. Talkowski, M., H. Seltman, et al. (2006). "Evaluation of a susceptibility gene for schizophrenia: genotype based meta-analysis of RGS4 polymorphisms from thirteen independent samples." Biol Psychiatry 60(2): 15262.

117. Ucok, A., H. Alpsan, et al. (2007). "Association of a serotonin receptor 2A gene polymorphism with cognitive functions in patients with schizophrenia." Am J Med Genet В Neuropsychiatr Genet 144(5): 704-7.

118. Walss-Bass, C., W. Liu, et al. (2006). "A Novel Missense Mutation in the Transmembran Domain of Neuregulin 1 is Associated with Schizophrenia." BIOL PSYCHIATRY 60(6): 548-53.

119. Wang, E., Y.-C. Ding, et al. (2004). "The Genetic Architecture of Selection at the Human Dopamine Receptor D4 (DRD4) Gene Locus." Am. J. Hum. Genet. 74: 931-944.

120. Wang, Z., J. Wei, et al. (2006). "A review and re-evaluation of an association between the NOTCH4 locus and schizophrenia." Am J Med Genet В Neuropsychiatr Genet.: Epub ahead of print.

121. Webster, R. A. (2001). Schizophrenia. Neurotransmitters, Drugs and Brain Function. R. A. Webster. New York, John Wiley & Sons Ltd: 351374.

122. Woodward, N., K. Jayathilake, et al. (2007). " COMT vail 08/15 8met genotype, cognitive function, and cognitive improvement with clozapine in schizophrenia." Schizophr Res 90(1-3): 86-96.

123. Wu, S.-n., R. Gao, et al. (2006). "Association of DRD2 polymorphisms and chlorpromazine-induced extrapyramidal syndrome in Chinese schizophrenic patients." Acta Pharmacologica Sinica 27(8): 966.

124. Xu, H., C. Kellendonk, et al. (2007). "DRD2 C957T polymorphism interacts with the COMT Vail58Met polymorphism in human working memory ability." Schizophr Res 90(1-3): 104-7.

125. Yang, J., T. Si, et al. (2003). "Association study of the human FZD3 locus with schizophrenia." Biological Psychiatry 54(11): 1298-1301.

126. Yang, J. Z., Т. M. Si, et al. (2003). "Association study of neuregulin 1 gene with schizophrenia." Molecular Psychiatry 8(7): 706-709.

127. Zai, C., R. Hwang, et al. (2006). "Association study of tardive dyskinesia and twelve DRD2 polymorphisms in schizophrenia patients." Int J Neuropsychopharmacol. 10(5): 639-51.

128. Zhang, H., G. Ju, et al. (2006). "A combined effect of the KPNA3 and KPNB3 genes on susceptibility to schizophrenia." Neuroscience Letters 402(1-2): 173-175.

129. Zhao, J., E. Boerwinkle, et al. (2005). "An Entropy-Based Statistic for Genomewide Association Studies." Am. J. Hum. Genet. 77: 27-40.

130. Zhao, X., Y. Shi, et al. (2004). "A case control and family based association study of the neuregulinl gene and schizophrenia." J. Med. Genet. 41: 31-34.

131. Zhu, Q.-s., J. Grimsby, et al. (1992). "Promoter Organization and Activity of Human Monoamine Oxidase (MAO) A and В Genes." The Journal of Neuroscience 12(11): 4437-4446.1. БЛАГОДАРНОСТИ

132. Я хочу поблагодарить своих научных руководителей Вадима Львовича Карпова и Веру Евгеньевну Голимбет — за помощь и поддержку, которую они оказывали мне в течение нескольких лет работы.

133. Также я благодарен всем сотрудникам, аспирантам и студентам лаборатории Структуры и функции хроматина ИМБ РАН лаборатории Клинической генетики НЦПЗ РАМН за дружеское отношение и участие в обсуждении результатов.

134. Выражаю благодарность Анатолию Леонидовичу Ковтуну за неоценимую помощь в проведении работы.

135. Отдельное спасибо хотелось бы сказать Вере Николаевне Сенченко и Андрею Борисовичу Полтараусу, а также их студентам и аспирантам Екатерине Анедченко, Анне Кудрявцевой, Софье Малахо и другим - за помощь при генотипировании.

136. Спасибо всем участникам форума www.molbiol.rn, в частности Игорю Орловскому, которые оказывали мне помощь при работе с литературой.

137. Благодарю П.Л. Иванова за любезно предоставленную методику выделения ДНК из волосяных луковиц.

Информация о работе

Монахов, Михаил Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Полиморфные маркеры генов, ассоциированные с психологическими признаками и риском развития психических расстройств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы