Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм и генетический контроль альфа-амилазы у пшеницы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм и генетический контроль альфа-амилазы у пшеницы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕШ1 НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ Ш. H.H.ВАВИЛОВА

На правах рукошеа УДК 633.112.1:631.52:575.17:575.86

ИЛЗЩЧЕВСЖШ Николай Нзколаевнч

полиазрфкза и гэжшческий контроль

а-ашяазу у щщщц.

03.00.15 - гедашса

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сопскапЕэ ученой стопзш кендадвта бсологотаскнх наук

Москва 19Э2

Работа выполнена в лаборатории популяционной генетики я лаборатории молэкулярвой генетика и генеииаской ишовнеряи растений Института обдай генетики ш. Н.И.Вавилова РАН.

Научный руководитель О^щпальаыэ ОШОНЗЕЕН:

чл.-корр. РАН профессор Ю.П. Алтухов.

доктор биологических наук

И.И. Суриков, кандидат бнологнчз ских паук Д.В. Полатов.

Вэдуцаэ учрзцдзшз Кафэдра генетики

биологического факультета Санкт-Па тербугского Университета.

Защкта диссертации состоится " " 199 года в

. .часов .. .минут на заседании специализированного Ученого овета Д ОШ.49.01 в институте Общей генетики ии а.И.Вавилова РАН по адресу: Москва, В-333, ул. Губкина 3.

С диссертащзй мовдо ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослав " " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТАБШ.

Актуальность проблемы. Как и во всяком генетическом исследовании, при помощи биохимических методов, в частности электрофореза, устанавливается полиморфизм по анализируемому признаку и исследуется его генетическая детерминация, количество генов, его определяющих, особенности действия отдельных генов, их взаимодействие, локализация и т.д.

С помощью электрофоретического анализа уточняется ряд сложных вопросов происхождения и систематики различных видов

(Mstakovsky e.v., et al., 1989), решаются зздэчи

популяционнсй генетики (Алтухов D.П.,1989). Установлены достоверные отличия в адаптивной ценности аллелей отдельных изоферментов, доказано существование в популяциях неслучайных ассоциаций аллельных вариантов генов (AXiard r.w. , et ai.,1972), Огромным количеством работ подтверждена ценность белков и ферментов как генетических маркеров (Созинов А.А.,1985). Полиморфизм белковых систем используется для идентификации сортов и изучения их генеалогии (Созинов A.A. и др.,1987).

Как известно, при изучении пшеницы наибольшие успехи были достигнуты при авйлизе запасных белков (Созинов А.А.,1985). Однако для получения более развернутых данных необходимо наличие маркеров го возможно большему количеству хромосом и их плеч. Одной из наиболее полтюрфвых известных систем пшеницы является система а-амилазы. Учитывая этот факт, а также то, что этот фермент принимает участие в процессах метаболизма веществ, определяющих технологические характеристики зерна (Дарканбаев Т.Б., 1987), возникла необходимость исследовать его генетическую детерминацию.

Рели и задачи работы. Основная цель настоящей работы состояла в изучении полиморфизма и характера наследования изозишв а-амилазы пшеницы, в идентификации аллелей и анализе возможностей использования компонентов спектра e-амилазы в качестве генетических маркеров при работе с пшеницей.

Шли поставлены и решены следу плие задачи: 1) Изучена хромосомная локализация и наследование генов,

кодирующих синтез изозидав а-амилазы, выявляемых при используемой методике электрофореза. ^

2) Проведан анализ внутри- и межсортового полиморфизма, частот встречаемости аллельных вариантов а-амилазэкодирувдих локусов, а также их сочетаний в коллекциях сортов отечественной селекции яровой и озимой мягкой и яровой твердой пшеницы.

3) Оценено соответствие Онотиттшго состава сортов генеалогическим данным.

4) Исследована возможная связь между изоферментным составом "с-амилаз и качеством зерна мягкой шеницы.'

Научная новизна работа состоит в том, что впервые описан внутрисортовой полиморфизм «-амилазы мягкой пшеницы и полиморфизм «-амилазы твердой пшеницы. Показано наличие двух локусов а-амилазы в длинном плече хромосомы 6в мягкой шеницы. Определена неравномерность частот распространения аллелей а-амилазы и их сочетан~й. Использован полиморфизм а-амилазхы для уточнения происхождения сортов. Исследована связь выявляемых аллельных вариантов а-амилазы с качеством зерна.

Практическая значимость. Выявленный полиморфизм по спектрам а-амилазн обеспечивает возможность быстрой и надежной идентификации сортов пшеницы при использовании простого и легковоспроизводамого метода электрофореза в полнакриламидном геле. Показана возможность использования изозимов а-амилазы в как генетических маркеров качества зерна мягкой шеницы. Представленные в работе данные могут быть использованы для определения чистоты и гомогенности сортового материала, для выяснения генеалогии сортов пшеницы, для уточнения хромосомных карт сцепления, а также цри селекции на улучшение качества зерна мягкой шеницы.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алма-Ата, 1988г.), на конференции молодых ученых Института общей генетики в 1989 году, на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990г.) и межлабораторном семинаре "Генетические основы эволюции и селекции" Института Общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН в 1992 г.

публикация. По теме диссертации опубликовано пять работ, список которых приведен в. конца автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, трех глав, обсуждения, выводов и списка литература. Список цитируемой литературы включает 140 наименований, из них 61 на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Растительный материал. В работе использованы семена 91 сорта яровой и 64 сортов озимой мягкой пшеницы, полученные от селекционеров по официальным запросам. Нулли-тетрасомвые линии сорта chínese spring присланы доктором Э. Сирсом (США) и однократно репродуцированы. Исследованы зерна р2 десяти' гибридных комбинаций и зерна f3 двух комбинаций. Данные по качественным характеристикам сортов взяты из материалов, опубликованных Государственной комиссией по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур. В соответствии с этими данными. в исследованном материале выделено 45 сортов, даюдих зерно высокого качества, и 26 сортов с низким качеством зерна.

В группу высококачественных включены сорта, входящие в список сильных пшениц и, по определению, имевдие высокий потенциал отличного качества при оптимальных условиях выращивания. В группу низкокачественных включены сорта, имеющие неудовлетворительные оценки по каким-либо параметрам, связанным с качеством зерна и муки {% белка, % клейковины, сила муки, показатель седиментации, хлебопекарные показатели).

В каздом сорте исследовали от 15 до 70 индивидуальных зерновок. .Были выявлены . как гомогенные сорта (все исследованные зерна сорта имели одинаковый спектр а-амилазы), так и гетерогенные (сорт содержал зерна с разным спектром). Всего в ходе изучения полиморфизма исследовано около 6 тыс. зерен. При анализе а-амилазы в гибридных комбинациях изучено от 36 до 238 зерен f2 на одно скрещивание или от 4 до 25 зерен f3 с каждого растения f2> При анализе спектра глиадина изучено от 4 до 10 зерен f3 с кавдого растения f_. Всего в ходе гибридологического анализа

изучено около 5,5 тыс. зерен.

Инструментальные метода. Электрофоретический анализ ' а-амилазы проводили по методу, описанному ранее (Дарканбавв Т.Б. и др., 1979), с модификациями. Предварительный анализ электрофоретиче ских спектров а амилазы прорастающих зерновок в возрасте от двух до восьми суток показал, что спектры 3-5-суточных проростков у гомогенных сортов идентичны. В работе использовались 4-5-суточные проростки, у которых наблюдалась наибольшая активность фермента. Для электрофоретического анализа зерновки в течение пяти суток проращивали на фильтрах, смоченных водой, в темноте, при 24°с. За это время длина проростка достигала в среднем 40 мм, длина корней - 80 мм. После удаления проростков и корней, остаток эндосперма каждой зерновки гомогенизировали стеклянной палочкой при 4°с в полипропиленовых пробирках (объемом 1,5 мл) в 0,2 мл смеси, содержащей 40% сахарозы и 0,22% сас12> и затем-инкубировали 12 часов при 40°с. сас12 ВВОДИЛИ ДЛЯ активации а-амилазы (ТкасЛик Й.* а!., 1974). ■ Электрофорез проводили в трис-глициновой системе при рН 8,4 на камерах, описанных ранее (Трувеллер К.А. и др., 1974). Использовали пластины 160x80x3 мм, включающие концентрирующий и разделяющий гели. Разделяющий гель полимериэовали из смеси раствора а (трис-(оксиметил) -аминометан фосфат 0,5 г, глицин 2,4 г, тетраметилендиамин 0,12 мл, бщщстиллированная вода до 50 мл; раствора в (акриламид 15 г, метиленбисакриламид - 0,4 г, мочевина 10 г, бидистиллированная вода до 50 мл) и раствора С (мочевина 50 г, надсернокислый аммоний 140 мг, бидистиллированная вода до 100 мл) в. соотношении 1:1:2. Концентрирующий гель полимериэовали из смеси раствора А, раствора и (акриламид 10 г, метиленбисакриамчд 0,8 г, мочевина 10 г, бидистиллированная вода до 50 мл) и раствора С в соотношении 1:1:2. Мо^виву р^одили для инактивации р-амилазы (Дарканбаев Т.Б. и др., 1982).'

. Электродный буфер содержал 0,12%-ный трис-(оксиметил)-аминометан фосфат и 0,5^-ный глицин, рН 8,4%. Белок (20 мкл) наносили на гель после предварительной двухминутной отгонки надсернокислого аммония. Электрофорез проводили от катода к аноду при 200мА, 8°С, около 1,5 часов.

Длительность электрофореза соответствовала времени цроховдешя трех фронтов метки бромфенолового синего через гель.

После электрофореза гель инкубировали 30 минут при 37°С в I&-hdm растворимом крахмале, приготовленном на 1,36%-ном ацетатном буфере рн 4,5. Затем гель помещали в 5%-ную трихлоруксусную кислоту, содержащую 0,5% ki и 0,26% i2. После сплошного окрашивания гель отмывали водой до появления прозрачных полос на синем поле в местах локализации а-амилазы. Непосредственно после отмывки гели фотографировали камерой "Зенит-EM" на фотопленку "Микрат-300".

Глиадин экстрагировали из размолотого .зерна 70% этанолом при 40°С в течение 20-40 минут. После центрифугирования (10 минут при 4000 об/мин) в супернатант добавляли краситель метиленовый зеленый, приготовленный на лактатном буфере рн 3,1, содержащем 80% сахарозы (Новосельская A.D. и др., 1983).

Электрофорез глиадинэ в полиакриламидном геле проводили

согласно принятой МеТОДИКе (Bushuk W. ît al., 1978), с

модификациями (Новосельская A.D. и др., 1983). для вертикальных пластин (i,8xisoxi5o мм). После окраски гели промывали проточной водой и фотографировали.

Математические методы. Цри работе с гибридными комбинациями, для определения соответствия фактически полученного расщепления типов электрофоре тических спектров по классам теоретически ожидаемому соотношению, использовали критерий лг2 (Шюхинский H.A., 1967).

Концентрацию доминирования оценивали цри помощи показателя с (Sistpson e.h., 1949). Для оценки выровненности распределения фенотипов а-амилазы использовали показатель е (Pielou Е.с., 1966).

Достоверность различия частот встречаемости аллеля (сочетаний аллелей) в выборках оценивали при помощи критерия Фишера (Шюхинский H.A., 1967).

На основании данных по частотам аллелей четырех полиморфных локусов оценивали параметры генетического сходства проанализированных групп (Животовский Л.А., 1983).

Дендрограмш генетического сходства строились щж

помощи метода вевзвешенных групповых средних (Дцран Б. и др., 1977).

Величину ^комбинации оценивали методом максимального правдоподобия ПРИ ПОМОЩИ ТабЛИЦ И формул (Aliará R.W.,

1956).

ИЗОЗИШ a-АМИЛАЗЫ, ИХ ХРОМОСОМНЫЙ КОНТРОЛЬ И НАСЛЕДОВАНИЕ.

Для того чтобы использовать e-амилазу как генетический маркер, необходимо было описать внутривидовой полиморфизм и изучить генетический контроль выявляемых, изозимов в используемых условиях электрофореза.

На рисунке i представлена схема суммарного спектра a-амилазы, на котором присутствуют все встреченные цри анализе всех сортов мягкой пшеницы компоненты. Компоненты пронумерованы от катода к аноду. Для того чтобы определить какие конкретные компоненты спектра контролируются отдельными хромосомами в используемой методике, были исследованы зимограммы нулли-тетрасомных линий сорта Chinese Spring (рис.1).

1 2- 3- 6D — 6В — ч

6- 6А —

7- 8 9- 10 " К 7D — 7А — 7B — CS I 2~ 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12

рис.1. Схема электрофоретических спектров нулли--тетрасомных линий сорта Chinese spring, с указанием хромосомной локализации генов, контролирующие синтез компонентов спектра. Компоненты пронумерованы от катода к аноду в соответствии с суммарным спектром.

к - суммарный спектр,

CS - ЭУПЛОИД Chinese Spring,

I - нулли 6п-тетра 6а, 2 - нулли 6о-тетра 6в, 3 - вдлли 6вгтетра 6а, 4 - нулли бв-тетра 6d, 5 - нулли бл-тетра 6в, 6 - нулли бд-тетра 6о, 7 - нулли 7в-тетра 7а, 8 - нулли 7в-тетра 7с, 9 - нулли 7о-тотра 7а, 10 - нулли ?А-тетра 7в, II - нулли 7о-тетра 7в, 12 - нулли 7д-тетра 7о

б

При анализе линий, в которых отсутствует определенная пара гомологичных хромосом, наблюдается редукция одного компонента спектра. Таким .образом, у сорта chinase spring компоненты I, 3 и 4 контролируются хромосомами 6d, 6в-и 6а соответственно, а компоненты 8,10 и II - хромосомами 7d, 7а и 7в. Компоненты 5, 6 и 7 не исчезали и не становились слабее по интенсивности при анализе любой из исследованных нулли-тетрасомных лилий. По-видимому, они объединяются из нескольким компонентов, имеющих различный генный контроль. Ввиду отсутствия у сорта Chinese Spring компонвтов 2 и 9 анализ нулли-тетрасомных линий ответа на вопрос об их генетическом контроле не дает.

ЭлектрофоретЕческий анализ зерен Fg из различных гибридных комбинаций позволил установить (табл.1), что Таблица i.

Распределение зерновок f? по фенотипическим классам у различных гибридов пшеницы.

н С N фактическое расщепление ' ожидаемое расщепление Р

1 3 72 55:17 з:1 0,06 > 0,50

2 * 38 32:6 з:1 1,73 > í ,20

3 1 3 1,3 1,3 41 41 41 41 33:8 31:10 23:10:8:0 23:10:8 з:1 з:1 9:з:з:1 2:1:1 2,52 0,24 3,37 0,63 > 0,05 > 0,50 > 0,20 > 0,50

4 9 36 27:9 3:1 0,00 1,00

5 2,4 2,4 176 176 74:54:48 74:54:48:0 2:1:1 э:з:з: з 3,60 35,11 > 0,05 < 0,005

6 2,4 9 2,4,9 123 123 123 6i:37:25 87:36 44:17:26:17:11:8 2:1:1 з:1 в:з:з:2:1:1 2,34 г, 13 3,66 > 0,20 > 0,20 > 0,50

7 3 2,4 3,2,4 79 79 79 6i:is 46:is:is 38:9:14:8:4:6 3:1 2:1:1 б:з:з:2:1:1 0,20 2,35 5,46 > 0,50 > 0,20 > 0,20

н - гибридные комбинации:

1 - Саратовская 55 х Саратовская 42,

2 - Саянская 55 х Харьковская 6,

3 - Пиротрнкс 28 х Башкирская 9,

4 - Саратовская 55 х Эрдтроспермук 841,

5 - Безостая I х Мироновская Юбилейная,

6 - Скороспелка Улучшенная х Казахстанская 3,

7 ~ БОЗОСТЭЯ I X Chinese Spring, с - анализируемые компоненты.

N - количество исследованных зерен.

I жпонент I наследуется по типу присутствия/отсутствия, так же наследуются компоненты 3 и 9. Компоненты 2 и 4 наследувтся по типу кодоминирования и контролируются аллельными генами. ёПоскольку в ходе анализа нулли-тетрасомных линий показано, что компонент 4 контролируется хромосомой 6а, следовательно, компонент 2 также контролируется этой хромосомой. В ходе анализа расщеплений мы выяснили, что компоненты 2 и 4 наследуются независимо от компонента 9 и независимо от компонента 3.

Таблица 2.

Распределение зерновок по фенотипическим классам у различных гибридов пшеницы.

н С N фактическое расщепление ожидаемое расщепл. 7?- Р »

8 3 125 99:26 3:1 1,18 > 0,20 -

9 125 95:30 3:1 0,07 > 0,50 -

3,9 125 95:0 :4 :26 9:3:3:1 90,60 < 0,001 • * 3,3621,55

9 1 238 180:58 3:1 0,05 > 0,80 -

3 238 179:59 3:1 0,01 > 0,95 -

9 238 178:60 3:1 0,05 > 0,80 -

1,3 238 135:45:44:14 9:3:3:1 0,07 > 0,99 -

1,9 238 134:46:44:14 9:3:3:1 0,10 > 0,95 -

3,9 1,3,9 238 238 173:5 :б :54 13}:3*:4£:4*: 2 :42:2 :12 9:3:3:1 27:9:9:9: 3:3:3:1 182,95 187,10 < 0,001 < 0,001 4,72±1,50

10 1 72 57:15 3:1 0,67 >0,20 —

3 72 59:13 3:1 1,85 >0,20 -

9 72 57:15 3:1 0,67 >0,20 -

1,3 72 46:11:13:2 9:3:3:1 2,62 >0,20 -

1,9 72 44:13:13:2 9:3:3:1 1,63 >0,50 -

3,9 1,3,9 72 72 57:2 :0 :13 * * 4^:0 :1^2 : 0 :11:0 :2 9:3:3:1 27:9:9:9: 3:3:3:1 46,08 49,8 <0,001 <0,001 3,0512,04

н - гибридные комбинации: ' 8 - Волжанка х Комета, 9 - Скороспелка Улучшенная х Амурская 75, 10 - Казахстанская 126 х Волжанка, с - анализируемые компоненты. N - количество исследованных зерен, и - величина рекомбинации {%). * - рекомбинантные классы.

Компонент I наследуется независимо от третьего и от девятого, а гены, контролирующие синтез компонентов 3 и 9, довольно тесно сцеплены (табл.1,2). Величина рекомбинации между ниш при объединении данных по трем скрещиваниям составила около 4,1% рекомбинации (табл.2).

Поскольку синтез компонента 3 контролируется у сорта chínese spring геном, располойенным в хромо сош бв, синтез компонента 9 также контролируется этой хромосомой. Такш образом подтверждено существование двух локусов а-амилазы в хромосома 6в.

Согласно международной номенклатуре, запись а-дау-вх обозначает, что локус серии и-диу-i локализован в хромосоглв 6в, запись а-Алу-вг, что локус локализован в хромосоме 7в. Аллели конкретных локусов обозначаются строчными латинскими буквами, например а-диу-вха. Буквой а обозначаются аллели, присутствующие у сорта Chinese Spring.

В нашей работе показано существование' не менее семи локусов а-аьшлазы, четыре из которых расположены в хромосомах шестой группы, и три локуса в хромосомах седьмой. По четырем локусам обнаружены аллельные варианты. При использовании разных систем разделения белков возникает . проблема соответствия полученныцх экспериментальных данных опубликованным ранее. Благодаря тому, что в нашей работе исследованы сорта chines^ spring и Безостая I, удалось провести сопоставление полученных данных с литературными. Таким образом для серии локусов a-ñmy-i выявлены аллельные варианты а-дшу-Aia, a-Amy-Bia и. а-Ашу-Dia, определяющие присутствие в спектре компонентов 4, з и г, вариант сг-Amy-Aib, определяищй присутствие компонента 2, а также a-Aray-Bie и а-Аиу-Dib, определяющие отсутствие компонентов 3 и I.

По группе локусов a-Amy-2 полиморфизма не обнаружено.

РАСПОЛОЖЕНИЕ ЛОКУСОВ а-АММАЗЫ В ХРОМОСОМЕ 6в.

В хромосоме 6В выявлено два локуса, контролирующих синтез а-амилазы, поэтому, в соответствии с общепринятой номенклатурой, второму из них присвоен символ а-Апу-з, или а-Аиу-вз, поскольку он обнаружен в хромосоме 6В. Этот локус имеет два аллельных состояния: а-Аиу-вза - нуль-аллель,

характерный ДЛЯ Chinese Spring И а-Апу-ВЗЬ - феноТИПИЧесКШ проявлением которого является наличие в спектре компонента 9.

Существование двух сцепленных локусов в длинном плече хромосомы 6В шдншает вопрос о порядке их расположения относительно центромеры. Этот вопрос можно решить, имея в . той ш хромосоме дополнительный маркерный ген с известной локализацией. Как известно, в коротком плече хромосомы 6В находится локус, контролирующий синтез высокополиморфного белка зерна - глиадшна. Мы предполагали что при одновременном тестировании гибридного материала по а-вмилазе и глиадину мояшо определить порядок расположения двух локусов а-амилазы относительно глиаданкодарувдего локуса.

Были проведены скрещивания мезду двумя параш родительских сортов (табл.3), имеющих ясные различия по

Таблица 3.

Распределение растений f? по генотипическим классам.

изучаемые локусы К классы з?2 M R

нереком-бинантныэ рекомбинантные

a-Amy-Bl И а-Ашу-ВЗ 1 2 3 АВ ab АВ АВ ab ab АВ АЬ АВ ав ЛЬ аВ ав ab Ab ab АЬ аВ 106 143 249 \ 1,44-0,62 1,76-0,63 1,62-0,45 26,26-3,70 16,78-2,40 20,07-2,02

22 27 55 34 33 71 56 60 126 0 0 1 0 1 0 1 2 1 10 0 12 2 110

a-Amy-Bl И GU-B2 1 2 3 АС ас АС АС ас ас АС Ас АС ас Ас аС ас ас Ас ас Ас аС 106 143 249

12 16 34 26 26 51 38 42 85 11 10 11 8 1 3 10 13 9 6 0 2 21 23 20 14 1 5

a-Amy-B3 И G11-B2 1 2 3 ВС Ьс ВС ВС Бс be ВС ВС ВС ЬС ВС ЬС Бс be Be be Be Б5 106 143 249 23,45-3,80 15,50-2]30 20,65-2,09

16 10 34 27 26 51 43 36 65 10 12 S 11 4 1 12 10 6 9 2 0 22 22 14 20 6 1

к - комбинации сортов:

1 - Ершовская 32 хРоссиянка,

2 - Ершовская 32 х Саратовская 39,

3 - объединенные данные по двум комбинациям. n - число исследованных растений f,.

r - величина рекомбинации (%). 2

абс - аллели сорта Ешовская 32.

аъс - аллели сортов Россиянка и Саратовская 39.

спектру глиадина, в частности, по блокам, контролируемым хромосомой ев. В каадой гибридной комбинации бнло проведено тестирование генотипов по зернам р3. Анализ зерен ?3 с индивидуальных растений г2 позволил выявить семьи, гетерозиготные по а-амилазэ. Это было бы невозможно при анализе зерен поскольку спектры гомозигот и гетэрозигот (по присутствию компонента в спектре) по локусам с-лку-вх и а-длу-вз идентичны. У двух растений в первом скрещивании и у пяти во втором выявлена рекомбинация ыевду локусала с-Апу-в1 и а-Аау-вз. Эти растения распределены со пяти из шести возможных рекоыбинантних классов. При изучении сцепления между локусом бИ-вз и довольно отдаленными от него локусами а-Алу-вг и а-Аиу»вз обнарулены вез возлюйеш рекшбинантные классы.

При объединении данных по двум комбинациям расчетная величина рекомбинации составила 1,62% для локусов а-дну-в1 и а-Аву-ВЗ, 20% ДЛЯ локусов «-Ату-В1 И вИ-ВЗ, 20,6% ДЛЯ а-Ашу-вз И с11-в2 (рис.2).

1,62%

рис.2 Локализация генов а-Аау-вз, а-дау-вг и с? :-32 в хромосома ев мягкой пшеница.

Таким образом, вероятным порядком расголоЕения исследованных локусов в хромосоме 6В является последовательность а-дву-вз - а-Аку-В! - ви-зг.

-20,65%-

3

ПОЛИМОРФИЗМ а-АЫЖАЗЫ У ОТЕЧЕСТВШНЫХ

СОРТОВ МЯГКОЙ ШЕНИШ. '

Всего среда 91 ярового и 64 озимых сортов мягких пшениц выявлено 15 вариантов зимограш (рис.3), по 13 вариантов как

1______ ____

з----—--—. — —

5 — •------------------

6 — --------—-------

7------------—---

в

9 — = — = =

** К I г 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 рис.З.

Схема вариантов зимограмм а-амилазы, обнаруженных в материале исследованных сортов мягкой пшеницы. Компоненты пронумерованы от катода к аноду.

К - суммарный спектр' а-амилазы, вклшащий все обнаруженные езозимы,

1-15 - обнаруженные фенотипы.

среда яровыг, так и среди озимых сортов. Варианты 9 и 10 не встречены у яровых, а 12 и 15 - у озимых сортов. Некоторые фенотипы" широко распространены, т.е. присутствуют у многих сортов; другие встречаются редко, лишь у некоторых сортов, или даже только как вариант внутри одного гетерогенного сорта.

Внутрисортовой полиморфизм по «-амилазе у шеницы ранее не исследовался. Обычно любой сорт рассматривается как гомогенный образец, хотя из него анализируется лишь одно зерно или небольшое их количество. Однако наши данные показывают,' что весомая часть сортов мягкой шеницы (54# исследованных) представлена несколькими биотипами, различающимися по набору изо-а-амилаз. Примерно половина гетерогенных сортов мягкой шеницы имели по два биотипа, а всего встречено до шести биотипов на сорт (как, например, у сорта Саратовская 52).

Электрофоретический анализ позволяет ответить на вопрос-, вызвана ли внутрисортовая гетерогенность естественными генетическими причинами или появилась случайно, как примесь, в конкретном исследованном образце пшеницы. Для -того, чтоба считать данный вариант биотипом, а не примесью, необходимо, по крайней мере, чтобы все его аллельные варианты были характерны для родительских форм. В исследованном материале был выбран ряд сортов, для которых оказались известны (или были, дополнительно специально исследованы) зимограьош родительских форм. Выяснилось, что некоторые сорта имеют аллели, не свойственные ни одному из родителей. Полученные результаты указывают на удобство анализа биохимических признаков при сортовом контроле.

Если допустить, что аллельные варианты локусов, кодирующих синтез а-амилазы (или тесно сцепленные с ниш гены), не подвержены воздействию естественного и искусственного отбора (т.е. селективно нейтральны), то можно было ожидать относительно одинаковой частоты встречаемости аллелей. Однако обнаружены значимые различия в частотах встречаемости аллелей • одного и того ш локуса. Так среда яровых сортов по локусу а-Ашу-А1 частота встречаемости аллельного варианта а-Ату-А1а составила 92% (против 88 у аллеля с-дву-Ааь). У озимых сортов вариант а-Ату-01а встречался с частотой 91%. Проведенный кластерный анализ показывает также, что и частоты встречаемости сочетаний аллелей а-амилазы распределены по сортам неравномерно.

Яровые и озимые сорта отличаются по частоте встречаемости одних и тех же аллелей и их сочетаний (табл.4). Так, например, частота встречаемости аллеля а-Ашу-А1а на 38% выше среди яровых сортов. В кавдой груше сортов на три наиболее массовых фенотипа приходится более 50% исследованных зерновок, но только фенотип 2 входит в число этих трех как в группе яровых, гак ж озимых форм. Больше всего выборки различались по частоте встречаемости фенотипов I, 5, 6 и 12.

Несмотря на то, что в обеих выборках встречено одинаковое количество вариантов спектра а-амилазы, при оценке фенотипического разнообразия получены различия. Так, показатель выровненности распределения электрофоретических

вариантов имеет величину 0,80 для яровых и 0,72 для озимых сортов. Действительно, частоты встречаемости редких фенотипов у яровых сортов в целом несколько выше (табл.4).

Таблица 4.

Частоты встречаемости возможных сочетаний аллелей среда исследованных сортов {%).

н все яровые озимые Р р

сорта сорта сорта

1 22,41 31,01 10,38 10,32 0,005

2 22,76 16,92 30,92 4,13 0,05

3 7,73 11,52 2,43 5,45 0,05

'4 4,71 6,76 1,84 2,51 -

5 11,94 1,86 26,06 23,80 0,0005

б 7,00 1,45 14,78 И, 13 0,005

7 0,71 0,16 1,47 1,03 -

8 2,05 2,98 0,76 1,13 -

9 0,59 - 1,41 2,11 -

10 0,01 - 0,02 0,04 -

11 1,73 1,63 1,86 0,02 -

12 4,35 7,45 — 11,56 0,001

13 10,45 12,89 7,03 1,49 -

14 2,85 4,15 1,04 1,62 -

15 0,71 1,22 - 1,81 -

N - номер фенотипа (см.рис.З); V - критерий Фишера (для яровых и озимых сортов); р - уровень значимости.

Различия в частотах встречаемости аллельных вариантов а-ьмилазы и их сочетаний среди сортов пшеницы могут зависеть ст ряда причин. Возможно, что некоторые варианты более удачны при определенном типе развития. Возможно явление, аналогичное "эффекту основателя", т.е.'"внесению в генофонд группы сортов мягкой пшеницы наследственного материала, присущего наиболее часто употребляемым в селекции родительским формам. Также можно предположить, что некоторые аллели а-амилаз' имеют разную селекционную или' адаптивную ценность.

ПОЛИМОРФИЗМ «-АМИЛАЗЫ ЯРОВОЙ ТВЕРДОЙ ШЕШЩУ.

В связи с тем, что при анализе мягкой пшеницы обнаружен довольно высокий уровень полиморфизма а-амилазы,

представляло определенный интерес изучить варианты спектров «-амилазы у такой важной культуры, как тетраплоидаая твердая пшеница. В противоположность мягкой пшенице, у твердой обнаружен очень низкий уровень полиморфизма по исследованному ферменту: выявлено только три варианта зимограмм (рис.4); при этом 165 из 170 исследованных сортов твердой пшеницы оказались идентичными по зимограммам а-амилазы, 5 сортов имели другой тип спектра.

X I 3 4 5 - —

6 • 7 8 10 II + II II- || |1-= II 1 Иг '

рис.4.Схема электрофоретических спектров а-амилазы, обнаруженных при исследовании яровой твердой пшеницы.

■МП - спектр мягкой пшениил (сорт Саратовская 29),

а,б, в - варианты спектров твердой пшеницы. .

На рисунке 4 показаны полученные на одной пластине геля зимограммы а-амилазы мягкой и твердой пшениц. Видно, что два из трех типов спектра а-амилазы твердой пшеницы полностью состоят из изозимов, похожих на встреченные среди мягких пшениц. Один спектр твердой пшеницы (у одного сорта) включает дополнительный изозим в зоне низкой электрофоре-тической подвижности (компонент X, рис.4), не встречавшийся при анализе спектров мягких пшениц. Сравнение спектров также позволяет выявить совпадение подвижности изозимов, контролируемых хромосомами лир (компоненты 3,4,10 и II) геномов мягкой пшеницы с изозимами твердой пшеницы. Изозищ,

контролируемые у мягкой пшеницы геномом о (компоненты I и 8) отсутствуют на зимограммах твердой пшеницы.

Результаты, полученные при анализе полиморфизма твердых . пшениц, позволяют предположить идентичность изоферментов, контролируемых А и В геномами мягкой пшеницы с изоферментами той не подвижности у твердой, что является дополнительным подтвервдением филогенетической близости этих видов. Однако, учитывая существование варианта "в", нельзя говорить о полной идентичности самих геномов.

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЯЬНЫХ ВАРИАНТОВ а-АМИЛАЗЫ СРЕДИ СОРТОВ ШГКОИ ШПЕНИЩ, ДАЩИХ ЗЕРНО РАЗНОГО КАЧЕСТВА.

Биотипы, различающиеся по набору аллелей «-амилазы, могут различаться по ряду хозяйственных признаков, в том числе по качеству зерна.

С целью обнаружения связи между изо-а-амилаздами характеристиками сортов пшеницы и качеством зерна, которое имеют эти сорта, мы, опираясь на известные данные о качестве сортов в изученном материале, выделили группу сортов, дающих зерно высокого качества, и группу с низким качеством зерна. Обнаруяено, что аллельное состояние некоторых локусов связано с качественной характеристикой сорта.

Так, частота встречаемости аллеля <*-Ату-в1а достоверно выше у сортов с высоким качеством, а присутствие аллеля а-Ату-взь более характерно для сортов с низкими показателями качества (табл.5).

Не вызывает сомнения, что в формировании качества зерна участвуют не столько отдельные изо-в-ашлазы,• сколько а-амилазный комплекс Так, на долю фенотипов I и 2, наиболее распространенных среди высококачественных яровых сортов, приходится около 70% исследованных зерен, а три фенотипа (3,4 и 12) у низкокачественных сортов - 54«. Фенотип 2 встречается у 36$ высококачественных озимых сортов и лишь у 13$ низкокачественных (табл.6).

Учитывая гетерогенность многих исследованных сортов пшеницы по зикограмые а-ашлазы, можно предполагать, что соотношение биотипов определяет признаки и характеристики сорта как целого. Поэтому в перспективу исследований по

Таблица 5.

Частоты встречаемости аллельных вариантов «-амилазы среду сортов с разным качеством зерна (%).

частоты аллелей

аллель сорта с изким кач-вом сорта с высоким кач-вом Р | 5»

а-Аяу-А1а а-Апу-А1Ь 82,3 17*7 33.2 16.3 0,£Э1 -

а-Аву-В1а а-Аяу-В1е 35,« «4,4 39, 69,1 10,13, - !

а-Ашу-01а а-Апу-Б1Ь «1,7 38,3 33,8 11,2 3,025

а-Апу-ВЗа а-Апу-ВЗЬ 73,« 26,4 85,5 14,5 1, 55 -

г - критерий Фишера, р - уровень значимости.

Таблица 6.

Частоты встречаемости возможных сочетаний аллелей среда сортов с разным качеством зерна. Данные по выборкам сортов • разным типом развития.'

N яровые сорта озимые сорта

1 2 V Р 3 4 7 Р

I 11,5 44,25 6,44 0,025 19,89 4,92 1,22 -

2 13,47 25,66 1,07 - 12,78 35,78 1,61 -

3 26,71 6,06 3,82 - 0,33 0,15 0,01 -

4 13,53 4,03 1,36 - 10,78 0,23 1,75 -

5 0,12 1,09 0,22 - 33,00 38,39 0,07 -

6 - 1,00 0,44 - 0,56 10,61 1,40 -

7 0,35 0,28 0,002 - - - - -

8 5,88 - 2,67 - - 2,69 0,58 -

9 - - - - - 0,46 0,09 -

10 - - - - - - - -

II 2,83 - 1,26 - 0,10 0,02 -

12 12,41 0,09 4,83 0,05 - - - -

13 6,82 15,38 0,86 - 22,56 2,23 2,55 -

14 6,29 2,13 0,52 - - 4,54 0,97 -

15 - 0,03 0,01 - - - - -

1.3 - частоты встречаемости фенотипа среди сортов

с низким качеством зерна (%);

2.4 - частоты встречаемости фенотипа среда сортов

с высоким качеством зерна (%);

н - номер фенотипа (см. рис.3); г - критерий Фишера; р - уровень значилоста.

улучшению существующих сортов может войти отбор внутри сорта генотипов, имеющих оптимальный набор аллелей а-амихэзы, с их последующим размножением.

Ее должно вызывать удивления присутствие в списке сильных пшениц сортов, имещих фенотипы с неблагоприятными по нашим данным аллелями, а-Ашу-01Ь и а-дту-взь, (сорта Ершовская 32, Казахстанская 126, Обрий, Россиянка, Саратовская 38,42,44,54, Харьковская 81). Очевидно, что выявленные закономерности носят статистический характер и проявляются лишь при анализе груш сортов, поскольку качество зерна определяется не одним лишь а-амилазным комплексом. Поэтому для оптимизации создания сортов, имеющих высокое качество зерна, желательна как оценка фенотипов селекционных линий по ряду взаимосвязанных технологических показателей, так и анализ генотипов этих »иний с использованием различных генетических маркеров. Таким образом, для повышения эффективности селекционного процесса можно рекомендовать вести учет электрофоретических спектров «-амилазы (наряду с другими белками) и отдавать предпочтение линиям, несущим наиболее удачныо аллели и их сочетания.

Учет полиморфизма по ферментным локусам дает дополнительные возможности при паспортизации гетерогенных сортов. Так, при передаче в районирование сорта имеют определенное соотношение биотипов, однако частоты их встречаемости могут изменяться в процессе возделывания сорта в различных агроклиматических условиях [Метаковский В.В. и др. 1987]. В крайних случаях сорту может грозить полная утрата некоторых биотипов, и при этом он потеряет подлинность. В результата изменения соотношения биотипов может измениться ряд характеристик: сорта, и сорта, районированные, например, как сильные, через несколько лет могут полностью утратить биотипы, определяющие их высокое качество. Для исключения возможности потери ценных сортов необходимо создать такую систему семеноводства, которая позволила бы поддерживать исходное или оптимальное соотношение биотипов в сорте.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ.

1. Выявлен и описан полиморфизм по электрофоре тиче ским спектрам а-амилазы прорастащего зерна пшеницы. Среди 91

ЯРОВОГО И 64 ОЗИМЫХ СОРТОВ МЯГКОЙ ПШеНИЦЫ (Trlticum aestirura

l. ) встречено 15 вариантов зиыограмм. Восемьдесят три (54%) сорта имели более, чем один вариант зимограммы. Среда 170 сортов яровой твердой пшеницы (rriticum durum Dear. ) выявлено 3 варианта зимограмм, причем спектры 165 сортов оказались идентичными. -

2. При анализе нулли-та трасомных линий сорта Chinese spring, а также зерен f2 десяти межсортовых гибридных комбинаций мягкой пшеницы установлен хромосомный контроль 8 изозимов спектра а-амилазы и характер наследования 5 изозимов. По четырем из семи локусов,.контролирующих синтез а-амилазы, обнаружены аллельные варианты. Определено, что

локусы a-Any-В1, а-Amy-Dl И a-Amy-ВЗ КОНТРОЛИРУЮТ И303ИШ, наследуадиеся по принципу присутствия/отсутствия в спектре. Локус a—Amy—AI контролирует изозиш, наследущиеся по кодомянантному типу.

3. С помощью анализа зерен f2 трех гибридных комбинаций в длинном плече хромосомы бв выявлены два локуса а-амилазы (a-Amy-Bi и a-Amy-вз) на расстоянии около А% рекомбинации. Анализ растений f2 по-« зернам f3 двух гибридных комбинаций показал, что локусы a-Amy-Bi и .a-Аиу-вз расположены на расстоянии около 20% рекомбинации от локуса Gii-вг,. локализованного в коротком плече хромосомы ев, причем локус

a-Amy-Bl, ПО-ВИДИМОМУ, ра.СП0Л0Н8Н М6ЗДУ a-Ашу-ВЗ И

центромерой.

4. В результате сравнительного анализа 21 сортового образца и их родительских форм по фенотипам а-амилазы показано соответствие 18 генотипов из этих образцов генеалогическим данным. В трех случаях дочерние сорта имели аллели a-амилазы, не обнаруженные у родительских форм.

5. Обнаружены значимые различия в частотах встречаемости аллелей одного и того ез локуса внутри выборок сортов яровой и озимой пшеницы и в частотах одних и тех не аллелей меззду группами сортов с разным типом развития. Среди яровых сортов наибольшую частоту шел аллель а-Апу-дха (92% всех сортов),

среди озимых - a-Amy-Dia (91%). Выявлены также значимые различия в частотах втречаемости сочетаний аллелей. Среди яровых сортов наиболее распространен фенотип, имеющий аллели

a-Amy-Ala, a-Any-Bla, a-Aay-DIa И к-Аву-ВЗЬ (31%

исследованных зерен), а среди озимых - аллели а-д&у-лга,

а-Amy-Ble, a-Amy-Dla И а-Ату-ВЗЬ (31%). ОДИННаДЦЭТЬ ИЗ 15

обнаруженных фенотипов были общими для двух групп сортов.

6. Выявлена статистически достоверная взаимосвязь между аллельным состоянием локуса a-Amy-Di и качественной характеристикой сорта: аллель a-Amy-Dia чаще встречается среди сортов, имеющих высокое качество зерна. Присутствие аллеля а-шу-ьзъ более характерно для сортов с низкими показателями качества. Яровые и озимые формы мягкой пшеницы, имеющие высокое качество зерна, различаются по набору KSOSSÜOE «-амилазы.

Материалы диссертации опубликованы в работах.

1. Илличевский H.H., Кудрявцев А.М., Метаковский Б.В., 1990, Полиморфизм а-амилазы яровой твердой пшеницы. - Мат. vii всесозного симпозиума "Молек. мех. генет. процессов", М., с.145.

2. Илличевский H.H., Метаковский E.B., 1988 Полиморфизм а-амилазы у сортов яровых пшениц различных селекцентров СССР. - А.-Ата: Мат.Всесоюзн конференции по биотехнологии злаковых культур, с.29.

3. Илличевский H.H., Метаковский E.B., 1990, Полиморфизм а-амилазы яровых и озимых сортов мягкой пшеницы. - Мат. vii Всесозного симпозиума "Молек. мех. генет. процессов", М., с.144.

4. Илличевский H.H., Метаковский E.B., Созинов A.A., 1989, Полиморфизм и генетический контроль а-амилазы у отечественных сортов яровой мягкой пшеницы. - Генетика, т.xxv, #12, с.2176-2186.

5. Илличевский H.H., Упелниек В.П., Метаковский E.B., 1992, Аллели а-амилазакодирувдих локусов у различающихся качеству зерна отечественных сортов мягкой пшеницы. -Генетика, Ш, с.84-97.