Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм и генетический контроль амилазы у пшеницы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм и генетический контроль амилазы у пшеницы"

03

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ОНЦЕИ ГЕНЕТИКИ им. H.H.ВАВИЛОВА

На правах pyiconscs УДК 633.112.1:631.52:575.17:575.86

ИЛЛИЧЕВШШ Николай Николаевич

ПОШтаРФЕЗМ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ У ШЕНИИ.

ОЗ.OD.15 - гапеота

АВТОРЕФЕРАТ диссертацш на соговаявв ученой сгопзнн кащщвга биологических наук

Работа тполнана в лаборатории шпуляционшй генетики к лаборатории ползкуляреой генетики и генетической инженерии растений Института обаей гена тики им. Н.И.Вавшюва РАН.

Научный руководитель

flffii ниц тгт.трта ОШЮНвНТЦ«

чл.-корр. РАН црофзссор О.П.Алтухов.

доктор биологических наук

D.M. Суриков, кандидат Отологических наук Д.В. Политов.

Ведущее учреждение

Кафедре генетики Снодогического факультета Саакт-Петербугского Университета.

Защита диссертации состоится " " еЛ кАСЦгЬ 199-3 года в ..часов ...кинух на заседании специализированного Ученого овата Д 002.49.01 в г Институте Обдай генетики ш ¿.И.Вавилова РАН го адресу: Москва, В-333, ул. Губкина з.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан "

1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Г.Н.Шлухина

ОНШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблема. Как и во всяком генетическом исследовании, цри помощи биохимические методов, в частности электрофореза, устанавливается полиморфизм по анализируемому признаку и исследуется его генетическая детерминация, количество генов, его определяющих, особенности действия отдельных генов, их взаимодействие, локализация и т.д. •

С помощью электрофоре тического анализа уточняется ряд сложных вопросов происхождения и систематики различных видов

(MetaJcovsky E.V., et al., 1989), реШаЮТСЯ ЗЭДЭЧИ

популяцион» й генетики (Алтухов Ю.П. ,1989). Установлены" достоверные отличия в адаптивной ценности аллелей отдельных изоферментов, доказано существование в популяциях неслучайных ассоциаций аллельных вариантов генов (Aliara R.W., et ai.,1972). Огромным количеством работ подтверадена ценность белков и ферментов как генетических маркеров (Созинов А. А., 1985). йолиморфизм белковых систем используется для идентификации сортов и изучения их генеалогии (Созинов A.A. и др.,1987).

Как известно, при изучении пшеницы наибольшие успехи были достигнуты при анализе запасных белков (Созинов А.А., 1985). Однако для получения более развернутых данных необходимо .наличие маркеров по возможно большему количеству хромосом и их плеч. Одной из наиболее полиморфных известных систем пшеницы является система «-амилазы. Учитывая этот факт, а также то, что этот фермент принимает участив в цроцессах метаболизма веществ, определяющих технологические характеристики зерна (Дарканбаев Т.Е., 1987), возникла необходимость исследовать его генетическую детерминацию.

Дели и задачи работы. Основная цель настоящей работы состояла в изучении полиморфизма и характера наследования изозимов а-амилазы пшеницы, в идентификации аллелей и анализе возможностей использования компонентов спектра а-амилазы в качестве генетических маркеров при работе с пшеницей.

Были поставлены и решены следувдие задачи: i) Изучена хромосомная локализация и наследование генов,

кодирувдих синтез изозимов а-амалазы, выявляемых при используемой методике электрофореза. ^

2) Проведен анализ внутри- и межсортового полиморфизма, частот встречаемости аллельныг вариантов «-амилазакодар^идих локусов, а также их сочетаний в коллекциях сортов отечественной селекции яровой и озимой мягкой и яровой твердой пшеницы.

3) оценено соответствие биотшного состава сортов генеалогическим данным.

4) Исследована возможная связь между изоферментным составом «-амилаз и качеством зерна мягкой пшеницы.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые описан внутрисортовой полиморфизм а-амилазы мягкой пшеницы и полиморфизм а-амилазы твердой пшеницы. Показано наличие двух локусов а-амилазы в длинном плече хромосомы 6в мягкой пшеницы. Определена неравномерность частот распространения аллелей а-амилазы и их сочетан~й. Использован полиморфизм а-амилазхы для уточнения происхождения сортов. Исследована связь выявляемых вллельных вариантов а-амилазы с качеством зерна.

Практическая значимость. Выявленный полиморфизм по спектрам я-амилазы обеспечивает возможность быстрой и надежной идентификации сортов пшеницы при использовании простого и легковоспроизводамого метода электрофореза в полиакриламвдном геле. Показана возможность использования изозимов «-амилазы в как генетических маркеров качества зерна мягкой пшеницы. Представленные в работе данные могут быть использованы для определения. чистоты и гомогенности сортового материала, для выяснения генеалогии сортов пшеницы, для уточнения хромосомных карт сцепления, а также при селекции на улучшение качества зерна мягкой пшеницы.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алма-Ата, 1988г.), на конференции молодых ученых Института общей генетики в 1989 году, на ухх всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990г.) и межлабораторном семинаре "Генетические основы эволюции и селекции" Института Общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН в 1992 г.

Публикации. По теш диссертации опубликовано пять работ, список которых приведен в. конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140' страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, трех глав, обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 140 наименований, из них 61 на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Растительный материал. В работе использованы семена 91 сорта яровой и 64 сортов озимой мягкой пшеница, полученные от селекционеров по официальным запросам. Нулли-тетрассыные ЛИНИИ сорта Chinese Spring Присланы ДОКТОРОМ Э. СирсоМ (США) и однократно репродуцированы. Исследованы зерна г2 десяти гибридных комбинаций и зерна f3 двух комбинаций. Данные по качественным характеристикам сортов взяты из материалов, опубликованных Государственной комиссией по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур. В соответствии с этими данными в исследованном материале выделено 45 сортов, дакдих зерно высокого качества, и 26 сортов с низким качеством зерна.

В группу высококачественных включены сорта, входящие в список сильных пшениц и, по определению, шеище высокий потенциал отличного качества при оптимальных условиях выращивания. В группу низкокачественных включены сорта, имеющие неудовлетворительные оценки по каким-либо параметрам, связанным с качеством зерна и муки {% белка, % клейковины, сила муки/ показатель седиментации, хлебопекарные показатели).

В кавдом сорте исследовали от 15 до 70 индивидуальных зерновок. .Были выявлены как гомогенные сорта (все исследованные зерна сорта имели одинаковый спектр а-амилазы), так и гетерогенные (сорт содержал зерна с разным спектром). Всего в ходе изучения полиморфизма исслздовано около 6 тыс. зерен. При анализе а-амилазы, в гибридных комбинациях изучено от 36 до 238 зерен f2 на одно скрещивание или от 4 до 25 зерен f3 с кавдого растения f2. При анализе спектра глиадина изучено от 4 до 10 зерен f3 с кавдого растения г2. Всего в ходе гибридологического анализа

изучено около 5,5 тыс, зерен.

Инструментальные метолу. Электрофоретический анализ а-амилазы проводили по методу, описанному ранее (Дарканбаев Т.Б. и др., 1979), с модификациями. Предварительный анализ электрофоре тиче ских спектров а амилазы прорастающих зерновок в возрасте от двух до восьми суток показал, что спектры 3-5-суточных проростков у гомогенных сортов идентичны. В работе использовались 4-5-суточные проростки, у которых наблюдалась наибольшая активность фермента. Для электрофоретического анализа зерновки в течение пяти суток проращивали на фильтрах, смоченных водой, в темноте, при 24°с. За это время длина' проростка достигала в среднем 40 мм, длина корней - 80 мм. После удаления проростков и корней, остаток эндосперма каздой зерновки гомогенизировали стеклянной палочкой при 4°с в полипропиленовых пробирках (объемом 1,5 мл) в 0,2 мл смеси, содержащей 40% сахарозы и 0,22% сас12, и затем инкубировали 12 часов при 40°с. сас12 вводили для активации а-амилазы (ткасьик а1., 1974). •

Электрофорез проводили в трис-глициновой системе при рН 8,4 на' камерах, описанных ранее (Трувеллер К.А. и др., 1974). Использовали пластины 160x80x3 мм, включающие концентрирующий и разделяющий гели. Разделяющий гель полимеризовали из смеси раствора а (трис-(оксиметил) -аминометан фосфат 0,5 г, глицин 2,4 г, тетраметилендиамин 0,12 мл, бидистиллированная вода до 50 мл; раствора в (акриламид 15 г, метиленбисакриламид - 0,4 г, мочевина 10 г, бидистиллированная вода до 50 мл) и раствора С (мочевина 50 г, надсернокислый аммоний 140 мг, бидистиллированная вода до 100 мл) в. соотношении 1:1:2. Концентрирующий гель полимеризовали из смеси раствора А, раствора и (акриламид 10 г, метиленбисакриамчд 0,8 г, мочевина 10 г, бидистиллированная вода до 50 мл) и раствора С в соотношении 1:1:2. Мо"рвину Р20дили для инактивации /з-амилазы (Дарканбаев Т.Е. и др., 1982).'

. Электродный буфер содержал 0,12%-ный трис-(оксиметил)-аминометан фосфат и 0,5%-ный глицин, рК 8,4%. Балок (20 мкл) наносили на гель после предварительной двухыннутной отгонки надсернокислого аммония. Электрофорез проводили от катода к аноду при 200мА, 8°С, около 1,5 часов.

Длительность электрофореза соответствовала времени прохождения трех фронтов метки бромфенолового синего через гель.

После электрофореза гель инкубировали 30 минут при 37°С в I&-HOM растворимом крахмале, приготовленном на 1,36%-ном ацетатном буфере рн 4,5. Затем гель помещали в 5%-ную трихлоруксусную кислоту, содержащую 0,5% кх и 0.26& т2. После сплошного окрашивания гель отмывали водой до появления прозрачных полос на синем поле в местах локализации ог-яшшзы. " Непосредственно после отмывки гели фотографировали камерой "Зенит-EM" на фотопленку "Микрат-300".

Глиадии экстрагировали из размолотого зерна 70% этанолом при 40°С В течение 20-40 минут. После центрифугирования (10 минут при 4000 об/мин) в супернатант добавляли краситель метиленовый зеленый, приготовленный на лактатном буфере рн 3,1. содержащем 80$ сахарозы (Новосельская A.D. и др., 1983).

Электрофорез глиадина в полиакрилашдяом геле проводили согласно принятой методике (BushuX W. 3t al., 1978), с модификациями (Новосельская A.D. и др., 1983). для вертикальных пластин (i,8xi5oxiso мм). После окраски гели промывали проточной водой и фотографировали.

Математические методы. При работе с гибридными комбинациями, для определения соответствия фактически полученного расщепления типов электрофоретических спектров по классам теоретически ожидаемому соотношению, использовали критерий х2 (Плохинский H.A., 1967).

Концентрацию доминирования оценивали цри помощи показателя с (siapson e.h., 1949). Для оценки выровяенности распределения фенотипов «-амалазы использовали показатель е

(piolou B.C., 1966).

Достоверность различия частот встречаемости аллеля (сочетаний аллелей) в выборках оценивали цри помощи критерия Фишера (Плохинский H.A., 1967).

На основании данных по частотам аллелей четырех полиморфных локусов оценивали параметры генетического сходства проанализированных групп (Жйвотовский Л.А., 1983).

Дендрограымы генетического сходства строились при

по&ющи метода невзвешенных групповых средних (Дюран Б. и др., 1977).

Величину гзкомбинации оценивали методом максимального правдоподобия при помощи таблиц и формул (Allard r.w. ,

1956).

ИЗОЗИШ «-АМИЛАЗЫ, ИХ ХРОМОСОМНЫЙ КОНТРОЛЬ И НАСЛЕДОВАНИЕ.

Для того чтобы использовать а-амилазу как генетический маркер, необходимо было описать внутривидовой полиморфизм и изучить генетический контроль выявляемых. изозимов в используемых условиях электрофореза.

На рисунке i представлена схема суммарного спектра «-амилазы, на котором присутствуют все встреченные при анализе всех сортов мягкой пшеницы компоненты. Компоненты пронумерованы от катода к аноду. Для того чтобы определить какие конкретные компоненты спектра контролируются отдельными хромосомами в используемой методике, были исследованы зимограыш нулли-тетрасомных линий сорта Chinese Spring (рцс.1).

2= 60 — --—-------

5- —---------.,---

** К 7В OS Г 2 3~ 4~ 5~ 6~ 7 8 9~ 10 II 12

рис.1. Схема электрофоретических спектров нулли--те трасомных линий сорта Chinese spring, с указанием хромосомной локализации генов, контролирующих синтез компонентов спектра. Компоненты пронумерованы от катода к аноду в соответствии с суммарным спектром.

к - суммарный спектр,

CS - эушюид Chinese Spring,

I - нулли бо-тетра 6а, 2 - нулли 6D-TeTpa 6в, 3 - нулли бв-тетра 6а, 4 - нулли бв-тетра 6d, 5 - нулли бл-тетра 6в, 6 - нулли бл-тетра бо, 7 - нулли 7в-тетра 7а, 8 - нулли 7в-тетра 7d, Э - нулли 7о-тетрз 7а, 10 - нулли 7л-тетра 7в, II - нулли 7о-тетра 7в, 12 - нулли 7л-тетра 7и

б

\

При анализе линий, в которых отсутствует определенная пара гомологичных хромосом, наблюдается редукция одного компонента спектра. Таким образом, у сорта Chinese spring компоненты I, 3 и 4 контролируются хромосомами 6d, 6в-и 6а соответственно, а компоненты 8,10 и II - хромосомами ?d, 7а и 7в. Компоненты 5, 6 и 7 не исчезали и не становились слабее по интенсивности при анализе любой из исследованных нулли-твтрасомных лилий. По-видимому, они объединяются из нбсколыаг' компонентоз, имеющих различный генный контроль. Ввиду отсутствия У сорта Chinese Spring К0Ш0Н6Т0В 2й 9 анализ нулли-тетрасомных линий ответа на вопрос об их генетическом контроль не" дает.

Электрофоретьческий анализ зерен f2 из различных гибридных комбинаций позволил установить (табл.1), что Таблица i.

Распределение зерновок f? по фенотшшческиы классам у различных гибридов пшеница. .

н с n ' фактическое . расщепление ожидаемое расщепление р

x 3 72 55:17 з:1 0,06 > 0,50

2 i 38 32:6 з: i 1,73 > 0,20

3 1 3 1,3 1,3 41 41 41 41 33:8 31:10 23:10:8:0 23:10:8 з:1 з: i э:з:з:1 2:1:1 2,52 0,24 3,37 0,63 > 0,05 > 0,50 > 0,20 > 0,50

4 9 36 27:9 y: к 0,00 1,00

5 2,4 2,4 176 176 74:54:48 74:54:48:0 2:1:1 9: з: з: г 3,60 35,11 >0,05 < 0,005

б 2,4 9 2,4,9 123 123 123 61:37:25 &7.-36 44:17:26:17:11:8 2:1:1 3:1 б:з:з:2;i:i 2,34 1,13 3, 66 > 0,20 > 0,20 > 0,50

7 3 2,4 3,2,4 79 79 79 6i: is 46:i5:i8 38:9:14:8:4:6 3:1 2:1:1 б:з:з:2:1:1 0,20 2,35 5,46 > 0,50 > 0,20 > 0,20

н - гибридные комбинации:

1 - Саратовская 55 х Саратовская 42,

2 - Саянская 55 х Харьковская 6,

3 - Пиротрикс 28 х Банкирская 9,

4 - Саратовская 55 х Эритроспермум 841,

5 - Безостая I х Мироновская Юбилейная,

6 - Скороспелка Улучшенная х Казахстанская 3,

7 - БОЗОСТая I х Chinese Spring, с - анализируемые компоненты.

л - количество исследованных зерен.

гомпонент I наследуется по типу присутствия/отсутствия, так же наследуются компоненты 3 и 9. Компоненты 2 и 4 наследуются по типу кодоминирования и контролируются аллельными генами. бПоскольку в ходе анализа нулли-тетрасомных линий показано, что компонент 4 контролируется хромосомой 6а, следовательно, компонент 2 также контролируется этой хромосомой. В ходе анализа расщеплеинй мы выяснили, что компоненты 2 и 4 наследуются независимо от компонента 9 и независимо от компонента 3.

Таблица 2.

распределение зерновок ?? по фенотипическим классам у различных гибридов пшеницы.

н с n фактическое расщепление ожидаемое расщепл. я2 р к

8 3 125 99:26 3:1 1,18 > 0,20 -

9 125 95:30 3:1 0,07 > 0,50 -

3,9 125 95:0 :4 :26 9:3:3:1 90,60 < 0,001 • 3,36±1,55

9 1 238 180:58 3:1 0,05 > 0,80 -

3 238 179:59 3:1 0,01 > 0,95 -

9 238 178:60 3:1 0,05 > 0,80 -

1,3 238 135:45:44:14 9:3:3:1 0,07 > 0,99 -

1,9 238 134:46:44:14 9:3:3:1 0,10 > 0,95 -

3,9 1,3,9 238 238 173:5 :6 :54 13}:3*:45}:4*: 2 :42:2 :12 9:3:3:1 27:9:9:9: 3:3:3:1 182,95 187,10 < 0,001 < 0,001 4,72±1,50

10 1 72 57:15 3:1 0,67 >0,20 -

3 72 59:13 3:1 1,85 >0,20 -

9 72 57:15 3:1 0,67 >0,20 -

1,3 72 46:11:13:2 9:3:3:1 2,62 >0,20 -

1,9 72 44:13:13:2 9:3:3:1 1,63 >0,50 -

3,9 1,3,9 72 72 57:2 :0 :13 * * 4*:0 :1;2 : 0 :11:0 :2 9:3:3:1 27:9:9:9: 3:3:3:1 46,08 49,8 <0,001 <0,001 3,0512,04

н - гибридные комбинации: * 8 - Волжанка х Комета, 9 - Скороспелка Улучшенная х Амурская 75, 10 - Казахстанская 126 х Волжанка, с - анализируемые компоненты. N - количество исследованных зерен, и - величина рекомбинации (56). * - рекомбинантные.классы.

Компонент I наследуется независимо от третьего и от девятого, а гены, контролирующие синтез компонентов 3 и 9, довольно тесно сцеплены (табл. 1,2). Ее личина рекомбинации, мавду ни® при объединении данных по трем скрекдаваниям составила около 4,1% рекомбинации (табл.2).

Поскольку синтез компонента 3 контролируется у сорта Chinese spring геном, расположенным в хромосоме бв, синтез компонента 9 также контролируется этой хромосомой. Такт» образом подтверждено существование двух локусов я-змидазк в хромосома бв.

Согласно международной номенклатуре, запись а-Алу-вг обозначает,.что локус серии «-лду-г локализован в хромосома бв, запись а-Ашу-вг, что локус локализован в хромосоме 7в. Аллели конкретных локусов обозначаются строчными латинскими буквами, например a-Aire-Bia. Буквой а обозначаются аллели, присутствующие У сорта Chinese Spring.

В нашей работе показано существование' не менее семи локусов а-амилазы, четыре из- которых расположены в хромосомах шестой группы, и три локуса в хромосомах седьмой. По четырем локусам обнаружены аллельные варианты. При использовании разных систем разделения белков возникает проблема соответствия полученныцх экспериментальных данных опубликованным ранее. Благодаря тому, что в нашей работе исследованы сорта Chinese spring и Безостая I, удалось провести сопоставление полученных данных с литературными. Таким образом для серии локусов a-Amy-i выявлены аллельные варианты а-Айу-А1а, а-Ашу-В1а И . a-Amy-Dla, определяющие присутствие в спектре компонентов 4, з и i, вариант a-Amy-Aib, определяющий присутствие компонента 2, а также «-Amy-Bis и и—лиу-Dib, определяющие отсутствие компонентов 3 и I.

Пй группе локусов а-Ашу-2 полиморфизма не обнаружено.

РАСПОЛОЖЕНИЕ ЛОКУСОВ а-АМИЛАЗЫ В ХРОМОСОМЕ бв.

В хромосоме 6В выявлено два локуса, контролирующих синтез а-амилазы, поэтому, в соответствии с общепринятой номенклатурой, второму из них присвоен символ «-дму-з, или cc-Amy-вз, поскольку он обнаружен в хромосоме 6В. Этот локус имеет два аллельных состояния: а-лиу-вза - нуль-аллель,

характерный ДЛЯ Chinese Spring И a-tay-ВЗЬ - фенотишческим проявлением которого является наличие в спектре компонента 9.

Существование двух сцепленных локусов в длинном плече хромосомы 6В поднимает вопрос о порядке их расположения относительно центромеры. Этот вопрос можно решить, шея в . той же хромосоме дополнительный маркерный ген с известной локализацией. Как известно, в коротком плече хромосомы 63 находится локус, контролирующий синтез высокополиморфного белка зерна - глиадина. Мы предполагали что при одновременном тестировании гибридного материала по а-амщазе и глиадину можно определить порядок расположения деух локусов а-амилазы относительно глиадинкодирующего локуса.

Были проведены скрещивания между двумя параш родительских сортов (табл.3), имеющих ясные различия по

Таблица-3.

Распределение растений f2 по генотипическим классам.

изучаемые локусы

а-Ату-В1

И

а-Ату-ВЗ

а-Ату-В1

И

g11-b2

а-Лту-ВЗ

И

Gli-B2

классы ?2

к нереком-бинантныз рекомбинантные N R

ЛВ АВ аЬ ab АВ âb АВ ав АЬ аЬ ЛВ АЬ аВ ab АЬ АЬ ав ав

1 22 27 55 0 0 ' 1 0 1 0 106 1,44-0,

2 34 33 71 1 2 1 1 0 0 143 1,76-0,

3 56 60 126 1 2 2 1 1 0 249 1,62-0,

АС АС ас ас АС ас АС ас Ас ас АС Ас ас ас Ас Ас ас ас

1 12 16 34 11 10 11 8 1 3 106 26,26*3,

2 26 26 51 10 13 9 6 0 2 143 16,78-2

3 38 42 85 21 23 20 14 1 5 249 20,07-2

ВС ВС be be ВС Бс ВС Бс ВС Бс ВС Вс ЬС be вс 1с ЬС Бс

1 16 10 34 10 12 S 11 4 1 106 23,45-3

2 27 26 51 12 10 6 9 2 0 143 IS,20*2

3 43 36 65 22 22 14 20 6 1 245 20,65-2

К

- комбинации сортов:

1 - Ершовская 32 хРоссиянка,

2 - Ершовская 32 х Саратовская 39,

3 - объединенные данные по двум комбинациям. n - число исследованных растений f,.

r - величина рекомбинаций {%). 2

abc - аллели сорта Ершовская 32.

аьс - аллели сортов Россиянка и Саратовская 39,

спектру глиадина, в частности, по блокам, контролируем!».« хромосомой бв. В кавдой гибридной комбинации было проведено тестирование генотипов т2 по зернам р3. Анализ зерен с индивидуальных растений позволил ш явить секьн,

гетерозиготные по а-амилззе. Это было бы невозможно при анализе зерен поскольку спектры гомозигот и гетерозигот (по присутствию компонента в спектре) по лотеусш й-дау-зх и а-Аиу-вз идентичны. У двух растений р2 в первом скрещиванш и у пяти во втором выявлена рекомбинация тжду локусаш <х-Ашу-в1 и а-Ашу-вз. Эти растения распределены по пяззх аз шести воздетых рзкоибкнантшх классов. При ззученш сцепления между локусом ои-вг и довольно отдаленными от него локусаш «-йа.у~в1 и а-дюу-вз обнаруяены вса возможные рекомбинантные классы.

При объединении данных по двум комбинациям расчетная величша рекомбинации составила 1,62$ для локусов а-дшу-вг и а-Аву-ВЗ, 20% для локусов а-Ату-В1 И бИ-ВЗ, 20,655 ДЛЯ а-Апу-ВЗ И в11-В2 (рИС.2).

-20, <55%-20, 07»;-

а-ллу-йз-, ¡-а-а^у-з! ро

6В I. п

11-В2

3 Э

II

1,62%

рис.2 Локализация генов а-Ату-ВЗ, а-Лту-В1 И С,ТЛ-В2 в хромосоме ев мягкой пшеницы.

Таким образом, вероятным порядком расположения исследованных локусов в хромосоме 6В является последовательность а-лиу-вз - а-Аиу-вг - еи-вг.

ПОЛИМОРФИЗМ «-АШЛАЗЫ У ОТЕЧЕСТВЕННЫХ СОРТОВ МЯГКОЙ ШЕНИЦЫ. Всего среда 91 ярового и 64 озимых сортов мягких пшениц выявлено 15 вариантов зимограмм (рис.3), по 13 вариантов как

X___________

3--—----— — -

5 — ----------------

6-----—---— —---.--

7----------------

8

рис.3.

Схема вариантов зиыограмм «-амилазы, обнаруженных в материале исследованных сортов мягкой пшеницы. Компонента пронумерованы от катода к аноду.

К - суммарный спектр а-амилазы, включающий все обнаруженные изозимы,

1-15 - обнаруженные фенотипы.

среди яровыг, так и среди озимйх сортов. Варианты 9 и 10 не встречены у яровых, а 12 и 15 - у озимых, сортов. Некоторые фенотипы широко распространены, т.е. присутствуют у многих сортов; другие встречаются редко, лишь у некоторых сортов, или даже только как вариант внутри одного гетерогенного сорта.

Внутрисортовой полиморфизм по «-амилазе у гаеницы ранее не исследовался. Обычно любой сорт рассматривается как гомогенный образец, хотя из него анализируется лишь одно зерно или небольшое их количество. Однако наши данные показывают, что весомая часть сортов мягкой пшеницы (54# исследованных) представлена несколькими биотипами, различающимися по набору изо-а-амилаз. Примерно половина гетерогенных сортов мягкой пшеницы имели по два биотипа, а всего встречено до шести биотипов на сорт (как, например, у сорта Саратовская 52).

Электрофоретический анализ позволяет ответить на вопрос-, вызвана ли внутрисортовая гетерогенность естественными генетическими причинами или появилась случайно, как примесь, в конкретном исследованном образце пшеницы. Для того, чтоб» считать данный вариант биотипом, а не примесью, необходимо, по крайней мере, чтобы все его аллельные варианты были характерны для родительских форм. В исследованной материале был выбран ряд сортов, для которых оказались известны (или были дополнительно специально исследованы) здаэграмми родительских форы. Выяснилось, что некоторые сорта имеют аллели, не свойственные ни одному из родителей. Полученные результаты указывают на удобство анализа биохимических признаков при сортовом контроле.

Если допустить, что аллельные варианты локусов, кодирущих синтез а-амилазы (или тесно сцепленные с ними гены), не подвержена воздействию естественного а искусственного отбора (т.е. селективно нейтральны), то можно было ожидать относительно одинаковой частоты встречаемости аллелей. Однако обнаружены значимые различия в частотах встречаемости аллелей одного и того не локуса. Так среди яровых сортов по локусу а-Аюу-А1 частота встречаемости аллельного варианта а-Ату-м.а составила 92$ (против 8% у аллеля а-диу-АЛЬ). У озимых сортов вариант а-Ашу-та встречался с частотой 91%. Проведенный кластерный анализ показывает также, что и частоты встречаемости сочетаний аллелей а-амилазы распределены по сортам неравномерно.

Яровые и озимые сорта отличаются по частоте встречаемости одних и тех же аллелей и их сочетаний (табл.4). Так, например, частота встречаемости аллеля а-Ату-А1а на 38$ выше среди яровых сортов. В каждай груше сортов на три наиболее массовых фенотипа приходится более 50% исследованных зерновок, но только фенотип 2 входит в число этих трех как в группе яровых, так и озимых форм. Больше всего выборки различались по частоте встречаемости фенотипов I, 5, 6 и 12.

Несмотря на то, что в обеих выборках встречено одинаковое количество вариантов спектра а-амилазы, при оценке фенотипического разнообразия получены различия. Так, показатель выровненности распределения электрофоре тиче скшс

хз

вариантов имеет величину 0,80 для яровых и 0,72 для озимых сортов. Действительно, частоты встречаемости редких фенотипов у яровых сортов в целом несколько выше (табл.4)..

Таблица 4.

Частоты встречаемости возможных сочетаний аллелей среди исследованных сортов {%).

к все сорта яровые сорта озимые сорта V р

1 22,41 . 31,01 10,38 10,32 0,005

2 22,76 16,92 30,92 4,13 0,05

3 7,73 11,52 2,43 5,45 0,05

4 4,71 6,76 1,84 2,51 -

5 11,94 1,86 26,06 23,80 0,0005

6 7,00 1,45 14,78 11,13 0,005

7 0,71 0,16 1,47 1,03 -

8 2,05 2,98 0,76 1,13 -

9 о,59 - 1,41 2,11 -

10 0,01 - 0,02 0,04 -

11 1,73 1,63 1,86 0,02 -

12 4,35 7,45 - 11,56 0,001

13 10,45 12,89 7,03 1,49 -

14 2,85 4,15 1,04 1,62 -

15 0,71 1,22 ' - 1,81 -

N - номер фенотипа (см.рис.3); V - критерий Фишера (для яровых и озимых сортов); р - уровень значимости.

Различия в частотах встречаемости аллельных вариантов а-ьмилазы и их сочетаний среди сортов пшеницы могут зависеть ст ряда причин. Возможно, что некоторые варианты более удачны при определенном типе развития. Возможно явление, аналогичное "эффекту основателя", т.е. "внесению в генофонд группы сортов мягкой пшеницы наследственного материала,' присущего наиболее часто употребляемым в селекции родительским формам. Также можно предположить, что некоторые аллели а-амилаз имеют разную селекционную или адаптивную ценность.

ПОЛИМОРФИЗМ а-АМИЛАЗЫ ЯРОВОЙ ТВЕРДОЙ 1Ш1ЕНИВД.

В связи с тем, что при анализе мягкой пшеницы обнаружен довольно высокий уровень полиморфизма а-амилазы,

представляло определенный интерес изучить варианты спектров а-амилазы у такой важной культуры, как тетраплоидная твердая пшеница. В противоположность мягкой пшенице, у твердой обнаружен очень низкий уровень полиморфизма по исследованному ферменту: выявлено только три варианта зимограмм (рис.4); при этом 165 из 170 исследованных сортов твердой пшеницы оказались идентичными по зимограммам а-амилазы, 5 сортов имели другой тип спектра.

X

3

4

5

6 ' 7

8 10

II +

МП

б в

рис.4.Схема электрофоретических спектров а-амилазы, обнаруженных при исследовании яровой твердой пшеницы.

■МП - спектр мягкой пшеницы

(сорт Саратовская 29),

а,б,в - варианты спектров твердой _пшеницы._

На рисунке 4 показаны полученные на одной пластине геля зимограммы а-амилазы мягкой и твердой пшениц. Видно, что два из . трех типов спектра ■■ «-амилазы твердой пшеницы полностью состоят из изозимов, похожих на встреченные среди мягких пшениц. Один спектр твердой пшеницы (У одного сорта) включает дополнительный изозим в зоне низкой электрофоре-тической подвижности (компонент X, рис.4), не встречавшийся при анализе спектров мягких пшениц. Сравнение спектров также позволяет выявить совпадение подвижности изозимов, контролируемых хромосомами лир (компоненты 3,4,10 и II) геномов мягкой пшеница с изозимами твердой пшеницы. Изозимы,

I

а

контролируемые у мягкой пшеницы геномом о (компоненты I и 8) отсутствуют на зиыограммах твердой пшеницы.

Результаты, полученные при анализе полиморфизма твердых пшениц, позволяют предположить идентичность изоферментов, контролируемых А и В геномами мягкой пшеницы с изоферментами той же подвижности у твердой, что является дополнительным подтверждением филогенетической близости этих видов. Однако, учитывая существование варианта "в", нельзя говорить о полной идентичности самих геномов.

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕДЬНЫХ ВАРИАНТОВ а-АШЛАЗЫ СРЕДИ СОРТОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ, ДАПЦИХ ЗЕРНО РАЗНОГО КАЧЕСТВА.

Биотипы, различащиеся по набору аллелей «-амилазы, могут различаться по ряду хозяйственных признаков, в том числе по качеству зерна.

С целью обнаружения связи меаду изо-а-амилазными характеристиками сортов пшеницы и качеством зерна, которое имеют эти сорта, мы, опираясь на известные данные о качестве сортов в изученном материале, выделили группу сортов, дающих зерно высокого качества, и группу с низким качеством зерна. Обнаружено, что аллельное состояние некоторых локусов связано с качественной характеристикой сорта.

Так, частота встречаемости аллеля а-дву-та достоверно выше у сортов с высоким качеством, а присутствие аллеля а-Аму-взъ более характерно для сортов с низкими показателями качества (табл.5).

Не вызывает сомнения, что в формировании качества зерна участвуют не столько отдельные изо-а-амилазы, сколько а-амилазный комплекс Так, на долю фенотипов I и 2, наиболее распространенных среди высококачественных яровых сортов, приходится около 70$ исследованных зерен, а три фенотипа (3,4 и 12) у низкокачественных сортов - 54*. Фенотип 2 встречается у 36$ высококачвственных озимых сортов и лишь у 13* низкокачественных (табл.6).

Учитывая гетерогенность многих исследованных сортов пшеницы по зшограмме а-амилазы, можно предполагать, что соотношение биотипов определяет признаки и характеристики сорта как целого. Поэтому в перспективу исследований по

1б

Таблица 5.

Частоты встречаемости аллельных вариантов а-ашлазы среда-сортов с разным качеством зерна (%).

частоты аллелей

аллель сорта с изким кач-вом сорта с высоким кач-вом Г ! ' в»

ос-А»у-А1а в-|иу-»1Ь 32,3 1*7 *Т — - I* 83,2 , 1 ^ О 1 - .

с£-Аву-В1а д-Агау-В1о 35,5 64,4 39/9 60,1 ©,13, -

а-Лму-В1а в-Аюу-МЬ <1,7 11,2 6,93 а,огз

а-Апу-ВЗа а-Ашу-ВЗЬ 73, 6 26,4 85,5 14,5 1,«5 -

р - критерий Фишера, р - уровень значимости.

Таблица 6.

Частоты встречаемости возможных сочетаний аллелей среда сортов с разным качеством зерна. Данные ш выборкам сортов разным типом развития. ■

и яровые сорта озимые сорта

1 2 V Р 3 4 V Р

I 11,5 44,25 6,44 0,025 19,89 4,92 1,22 -

2 13,47 25,66 1,07 - 12,78 35,78 1,61 -

3 26,71 6,06 3,82 - 0,33 0,15 0,01 -

4 13,53 1,03 1,36 - 10,78 0,23 1,75 -

5 0,12 1,09 0,22 - 33,00 38,39 0, 07 -

6 - 1,00 0,44 - 0,56 10,61 1,40 -

7 0,35 0,28 0,002 - - - - -

8 5,88 - 2,67 - - 2,69 0,58 -

9 - - - - — 0,46 0,09 -

10 - - - - - - - -

II 2,83 - 1,26 - 0,10 - 0,02 -

12 12,41 0,09 4,83 0,05 — - - -

13 6,82 15,38 0,86 - 22,56 2,23 2,55 -

14 6,29 2,13 0,52 - - 4,54 0,97 -

15 - 0,03 0,01 - - - - -

1.3 - частоты встречаемости фенотипа среди сортов

с низким качеством зерна {%);

2.4 - частоты встречаемости фенотипа среди сортов

с высоким качеством зерна (%);

н - номер фенотипа (см. рис.3); к - критерий Фишера; р - уровень значимости.

улучшению существующих сортов может войти отбор внутри сорте генотипов, имеющих оптимальный набор аллелей а-амагэзы, с их последующим размножением.

Не долхно вызывать удивления присутствие в списке сильных пшениц сортов, шещих фенотипы с неблагоприятными по нашим данным аллелями «-Amy-Dib и а-диу-взь, (сорта Дроювская 32, Казахстанская 126, Обрий, Россиянка, Саратовская 38,42,44,54, Харьковская 81). Очевидно, что выявленные закономерности носят статистический характер и проявляются лишь при анализе групп сортов, поскольку качество зерна определяется не одним лишь а-амилазным комплексом. Поэтому для оптимизации создания сортов, имеющих высокое качество зерна, желательна как оценка фенотипов селекционных линий по ряду взаимосвязанных технологических показателей, так и анализ генотипов этих линий с использованием различных генетических маркеров. Таким образом, для повышения эффективности селекционного процесса можно рекомендовать вести учет электрофоретических спектров а-амилазы (наряду с другими белками) и отдавать предпочтение линиям, несущим наиболее удачные аллели и их сочетания.

Учет полиморфизма по ферментным локусам дает дополнительные возможности при паспортизации гетерогенных сортов. Так, при передаче- в районирование сорта имеют определенное соотношение биотипов, однако, частоты их встречаемости могут изменяться в процессе возделывания сорта в различных агроклиматических условиях [Метаковский 1.В. и др. 1987]. В крайних случаях сорту может грозить полная утрата некоторых биотипов, и при этом он потеряет подлинность. В результате изменения соотношения биотипов может измениться ряд характеристик, сорта, и сорта, районированные, например, как сильные, через несколько лет могут полностью утратить биотипы, определяющие их высокое качество. Для исключения возможности потери ценных сортов необходимо создать такую систему семеноводства, которая позволила бы поддерживать исходное или оптимальное соотношение биотипов в сорте.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ.

1. Выявлен и описан полиморфизм по электрофоре юте ским спектрам а-амилазы прорастащего зерна пшеница. Среди 91 ЯРОВОГО И 64 ОЗИМЫХ СОРТОВ МЯГКОЙ ПШеНИЦЫ (Triticum aestirum

l. ) встречено 15 вариантов зимограмм. Восемьдесят три (54%) сорта шали более, чем один вариант зимограммы. Среди 170 сортов ЯРОВОЙ Твердой пшеницы (Triticum durum Deaf. ) выявлено 3 варианта зимограмм, причем спектры 165 сортов оказались идентичными.

2. При анализа нулли-тетрасомных линий сорта Chinese spring, а также зерен ?2 десяти мзнсортовых гибридных комбинаций мягкой пшеницы установлен хромосомный контроль 8 изозимов спектра а-амилаз'ы и характер наследования 5 кзозимов. По четырем из семи локусов, контролирующих синтез а-амилазы, обнаружены аллельные варианты. Определено, что локусы а-Апу-В1, а-Ашу-Dl И а-Ашу-ВЗ КОНТРОЛИРУЮТ И303ИМЫ,

наследующиеся по принципу присутствия/отсутствия в спектре. Локус a-Amy-Ai контролирует изозшы, наследующиеся по ко доминантному типу.

3. С помощью анализа зерен f2 трех гибридных комбинаций в длинном плече хромосомы ев выявлены два локуса а-амилазы

(а-Апу-В1 И а-Лту-ВЗ) НЭ рЭССТОЯНИИ ОКОЛО 4% рвКОМбИНаЦИИ.

Анализ растений f2 по * зернам г3 двух гибридных комбинаций показал, что локусы а-Ашу-вг и a-Any-вз расположены на расстоянии около ZQ% рекомбинации от локуса gii-bz, локализованного в коротком плече хромосомы бв, причем локус

а-Аиу-В1, ПО-ВИДЕМОМу, рЭСПОЛОЕВН М6ЗДУ а-Аду-ВЗ И

центромерой.

4. В результате сравнительного анализа 21 сортового образца и их родительских форм по фэнотипам а-амилаза показано соответствие 18 генотипов из этих образцов генеалогическим данным. В трех случаях дочерние сорта имели аллели а-амилазы, не обнаруженные у родительских форы.

5. Обнаружены значимые различия в частотах встречаемости аллелей одного и того ш локуса внутри выборок сортов яровой и озимой пшеницы и в частотах одних и тех же аллелей между группами сортов с разным типом развития. Среди яровых сортов наибольшую частоту имел аллель a-Amy-Aia (9Z% всех сортов).

среди озимых - a-Aay-Dia (91Я). Выявлены такве значимые различия в частотах втречаемости сочетаний аллелей. Среда яровых сортов наиболее распространен фенотип, имеющий аллели

а-Ашу-А1а, a-Aay-Bla, - а-Алу-Ша и а-Аиу-ВЗЬ (3156 исследованных зерен), а среди озимых - аллели a-Amy-Aia, a-Amy-Ble, в-Аиу-Dla И а-Аиу-ВЗЬ (3IJÉ). Одиннадцать ИЗ 15

обнаруяенных фенотипов были общими для двух групп сортов.

6. Выявлена статистически достоверная взаимосвязь между аллельным состоянием локуса а-дхау-ш. и качественной характеристикой сорта: аллель a-Aay-oia чаще встречается среди сортов, имеющих высокое качество зерна. Присутствие аллеля «-Ашу-взь более характерно для сортов с низкими показателями качества. Яровые и озимые формы мягкой пшеницы, имепцие высокое качество зерна, различаются по набору изозимов а-амилазн.

J\ Материалы диссертации опубликованы в работах.

1. Илличевский H.H. . Кудрявцев A.M., Метаковский Е.В., 1990, Полиморфизм а-аиилазы яровой твердой пшеницы. - Мат. vil Всесозного симпозиума "Молек. мех. гене т. процессов", М., с.145. „

2. Илличевский H.H., Метаковский Е.В., 1988 Полиморфизм а-амилазы у сортов яровых пшениц различных селекцентров СССР. - А.-Ата: Мат.Всесоюзн конференции по биотехнологии злаковых культур, с.29.

3. Илличевский H.H., Метаковский Е.В., 1990, Полиморфизм а-амилазы яровых н озимых сортов мягкой пшеницы.

• - Мат. vil Всесозного симпозиума "Молвк. мех. генет. процессов", М., с.144.

4. Илличевский H.H., Метаковский Е.В., Созинов А.А», 1989, Полиморфизм и генетический контроль а-амилазы у отечественных сортов яровой мягкой пшеницы. - Генетика, т.XXV, »12, с.2176-2186.

5. Илличевский H.H., Упелниёк В.П., Метаковский Е.В., 1992, Аллели а-амилазакодирувдих локусов у различающихся качеству зерна отечественных сортов мягкой пшеницы. -Генетика, #11, с.84-97.