Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм гетерохроматиновых районов акроцентрических хромосом свиней

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм гетерохроматиновых районов акроцентрических хромосом свиней"

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК , . ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА

Івашура Марина Миколаївна

УДК 636.4.082

ПОЛІМОРФІЗМ ГЕТЕРОХРОМАТИНОВИХ РАЙОНІВ АКРОЦЕНТРИЧНИХ ХРОМОСОМ СВИНЕЙ

03.00.15 - генетика

Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня . кандидата сільськогосподарських наук

Харків - 1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії генетики інституту

тваринництва УААН

Науковий керівник: кандидат сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник, Розсоха Володимир Іванович,

Інститут тваринництва УААН, завідувач лабораторією генетики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Шахбазов Валерій Гайович,

Харківській державний університет, завідувач кафедрою генетики

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник • Багацька Наталія Василівна

УНДІ охорони здоров’я дітел та підлітків, завідувач лабораторією гечетики

Провідна установа:

Інститут свинарства УААН, відділ розведення і генетики, м. Полтава

Захист відбудеться ’¡/£” 1998 року о 10 годині на

засіданні спеціалізованої рад^Й 65.356.01 при інституті тваринництва УААН за адресою: 312120, м. Харків, п/в Кулиничі.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці інституту тваринництва УААН, 312120, м. Харків, п/в Кулиничі

Автореферат розісланий “«¿£7“ 1998 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради атов А. І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

. Актуальність теми. Ефективність селекційної роботи у тваринництві гевною мірою обумовлюється генетичним потенціалом тварин, які викорис-овуються для відтворення стада. Контроль відтворювальної здатності тра-.иційними методами не дозволяє отримувати вичерпну інформацію про фак-ори, які впливають на запліднюваність та ембріональну життєздатність. Ін-енсивні цитогенетичні дослідження виявили ряд показників, пов’язаних з роявленнями репродуктивної функції у тварин. Використання методів ди-¡еренційного забарвлення хромосом обумовили важливі напрямки цитогене-;ічних досліджень. Специфічність неоднорідного забарвлення хромосомного атеріалу не тільки стала засобом надійної ідентифікації хромосомних пар, не й дозволила виявляти певні типи хромосомної організації: еухроматин та ‘терохроматин. Особливості молекулярного складу та структури цих райо-в хромосом, а також їх взаємодія на різних етапах клітинних процесів є :новою реалізації генетичної інформації. Райони структурного гетерохрома-ін характеризуються високою варіабельністю як в межах виду, так і в ме-ах одного геному У структурі гетерохроматинових районів фрагменти бага-повторюваних послідовностей ДНК тісно пов’язані з матрицями деяких іттєво важливих генів. За літературними даними, варіабельність гетерох-іматинових районів може впливати на експресію генів, зокрема, в ембріо-незі.

Тому дослідження поліморфних варіантів хромосом та пошук зв’язків • ж цитогенетичними показниками та репродуктивними якостями свиней має ачення як для теорії, так і для практики свинарства. Стабільність морфо-гічних типів хромосом викликає інтерес з точки зору існування природних омосомних маркерів. В зв’язку з цим, удосконалення існуючих методів сліджень та розробка нових підходів до цитогенетичного аналізу є важливі та необхідним етапом у вивченні поліморфізму хромосом.

Дослідження хромосом свиней, забарвлених як рутинним, так і дифе-іційним С-методом, надають важливу інформацію про стан геному, яка же використовуватись при вирішенні проблем практичної селекції.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є [адовою частиною науково-технічної комплексної програми родовольство-95” завдання П.04.02 “Розробити ефективну систему конт-ію, оцінки, спрямованої зміни та збереження генетичної структури та по-ціалу популяцій свиней на основі використання імуногенегичних та цито-етичних методів” на 1991-1995 рр. (№ держ. реєстрації 0196Ш1390 ).

Мета та задачі досліджень. Дослідження С-поліморфізму хромосом ней проводилось з метою визначення взаємозв’язку між варіабельністю :рохроматинових районів та репродуктивною функцією тварин та вивчен-можливостей використання цитогенетичних показників у практичній се-ції. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання:

1. Розробити модифікацію диференційного С-методу забарвлення хро

мосом свиней. .

2. Розробити критерії візуальної оцінки гетерохроматинових районії

на акроцентричних хромосомах свиней. . „

... 3. Вивчити можливість дослідження, диференційно забарвлених хро мосом з використанням комп’ютерної техніки.

4. Вивчити локалізацію та межі варіабельності гетерохроматиновш районів на хромосомах свиней порід велика біла та ландрас.

5. Вивчити взаємозв’язок С-поліморфізму хромосом з репродуктивнок функцією свиней.

6. Порівняти частоту та спектр спонтанних мутацій у носіїв поліморфних варіантів хромосом.

7. Вивчити вплив варіабельності прицентромірного гетерохроматину на реалізацію асоціацій акроцентричних хромосом.

8. Провести пошук маркерних хромосом та вивчити їх успадкування.

Наукова новизна одержаних результатів. Визначено оптимальні умови С-сегментації на хромосомах свиней. Розроблено критерії напівкількісної оцінки розмірів С-блоків на акроцентричних хромосомах за 5-бальною шкалою. На основі розробленого.методу досліджено межі варіабельності районів прицентромірного С-гетерохроматину та визначено частоту поліморфних варіантів хромосом 13-18 у свиней порід велика біла та ландрас. Розроблено спосіб та обладнання для візуалізації та комп’ютерної обробки мікрозобра-жень хромосом. Використання програмно-апаратного комплексу дозволяє каріотипувати хромосоми, забарвлені як рутинним, так і диференційними методами. Досліджено зв’язок між С-поліморфізмом хромосом та відтворю-вальними якостями свиней, а також вплив різних комбінацій поліморфних гомологів на хромосомну нестабільність у лейкоцитах крові.

Практичне значення отриманих результатів. Результати вивчення зв’язку С-поліморфізму хромосом з проявами репродуктивної функції свиней, а також з нестабільністю геному на клітинному рівні, є важливою частиною загального онтогенетичного тестування сільськогосподарських тварин, і можуть використовуватись при вирішенні певних селекційних задач. Розроблені критерії візуального аналізу дозволяють проводити експрес-оцінку поліморфних С-вариантів хромосом. Використання напівавтоматичної системи для обробки мікрозображень хромосом та каріотипувння є ефективним методом при проведенні масштабних досліджень стану геному сільськогосподарських тварин, а також є необхідною умовою створення банку даних племінних тварин. Розроблена модифікація С-методу дозволяє отримувати якісне С-забарвлення на хромосомах свиней без порушення морфології хромосом.

Особистий внесок здобувача. Дисертант переважну частину робіт виконав самостійно. Методологія та схема досліджень розроблені разом з науковим керівником. Із загальних наукових експериментів та публікацій дисертант використав за згодою співавторів тільки свою частину результатів.

‘о

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на Вченій раді інституту тваринництва УААН, науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Наукові розробки агропромислового комплексу” Нижні Ворота, 1993; першій науковій конференції молодих вчених та спеціалістів “Селекційно-біотехнологічні методи використання генетичного потенціалу сільськогосподарських тварин”, Київ, 1994р.; другій міжнародній конференції “Молекулярно-генетичні маркери”, Київ, 1996р.; конференціях молодих вчених та спеціалістів ( Харків, 1996р., Харків, 1998р).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено у 11 друкованих працях, у тому числі 3 статтях у фахових виданнях, затверджених ВАК України, та 8 тезах доповідей науково-практичних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 150 сторінках машинописного тексту, вміщує 18 таблиць та 18 рисунків. Список літератури складається з 243 джерел, у тому числі 162 на іноземних мовах.

МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводились у лабораторії генетики Інституту тваринництва УААН на племінному поголів’ї свиней д/г “Українка”, Будьонівського племзаводу та Дніпропетровського СГЦ у період з 1991 по 1995 р. Локалізацію С-блоків гетерохроматину проводили на хромосомах 25 кнурів, 27 свиноматок та 33 поросят (віком до 2 місяців) порід велика біла та ландрас. Забір крові, культивування лейкоцитів та виготовлення препаратів хромосом проводили за загальноприйнятими методиками. Для виявлення райо-гів структурного гетерохроматину на хромосомах свиней використовували С-іетод забарвлення у модифікації. Оцінку поліморфних С-варіантів акроцен-■ричних, хромосом проводили за результатами візуального каріотипування з (икористанням напівкількісного методу.

Облік спонтанних хромосомних аберацій проводили на препаратах :ромосом, забарвлених рутинним способом барвником Гімза, згідно методи-іних рекомендацій, розроблених у лабораторії генетики (Мет. рек., Харків, 990). Від кожної тварини аналізували по 50 метафаз. Анеуплоїдія (N±2) та юліплоїдія складали рівень геномних мутацій. Структурні аберації були ¡редставлені порушеннями хромосомного та хроматидного типу, а також исельною фрагментацією хромосом. Для вивчення взаємозв’язку С-оліморфізму хромосом з їх асоціативною здатністю проводили аналіз час-оти та спектру асоціацій акроцентричних хромосом (ААХ) у зв’язку з наяв-істю поліморфних хромосомних варіантів, а також їх комбінаціями. Аналіз репаратів хромосом проводили у системі світового мікроскопу "Jenaval” Zeiss, Німеччина) з масляною імерсією при збільшуванні 10x100. Мікро-йомка окремих метафазних платівок проводилась на мікроплівку “Мікрат-00”. Для візуалізації та комп’ютерної обробки мікрозображень хромосом икористовували розроблений у лабораторії генетики програмно-апаратний омгглекс для каріотипування хромосом сільськогосподарських тва-

рин.Цифровий матеріал обробляли методами варіаційної статистики при ви користанні пакету програм аналізу даних STADIA.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1.Дослідження етапів дифереиційного С-барвлення хромосом свиней

Дослідження хромосом з використанням методів дифереиційного забарвлен ня є важливою частиною цитогенетичного тестування. Вивчення взає мозв’язку С-поліморфізму хромосом з продуктивними якостями тварин, ; також можливість використання природних хромосомних маркерів, предста вллється актуальним напрямком дослідницької роботи. Проте, в зв’язку : складністю та низькою відтворюваністю результатів С-забарвлення, цей ме тод не отримав поширення у цитогенетиках дослідженнях сільськогоспо дарських тварин. Недоліком С-методики вважається значна денатурацій хромосомного матеріалу в результаті дії лужних та сольових розчинів. Дл* отримання якісного С-забарвлення та збереження морфології хромосом до водиться емпірично підбирати умови, змінюючи як хімічні, так і фізичні показники діючих агентів. Тому виникла необхідність проаналізувати основні етапи С-методу та визначити оптимальні умови С-забарвлення хромосом свиней. •

Найбільш ефективними виявилися послідовності обробок, які включали лужну передобробку препаратів. Проведення м’якої денатурації з використанням гідроксида барію дозволяло досягнути С-сегментації, уникаючи сильного порушення хромосом у порівнянні з результатами обробки гідроксидом натрію. При інкубації препаратів у стандартному сольовому розчині (SSC) переважне значення мав показник pH. Визначено, що зміна цього показника у лужну сторону (pH 8,5) виявилася оптимальною для отримання якісного С-забарвлення на хромосомах свиней. Для найкращої стабілізації хромосомного матеріалу запропоновано використання буферно-спиртової суміші. Інкубація препаратів у сольовому розчині з додаванням 5 мл 96%-ного етанолу на 100 мл 2xSSC при pH 8,5 дозволяє значно краще зберегти морфологію хромосом, навіть при необхідності збільшити час дії або температуру буферного розчину.

В результаті дослідження основних етапів С-методики визначено найбільш важливі фактори, які впливають на стан хроматину у період передоб-робки препаратів, та розроблено модифікацію цього метода для отримання якісного С-забарвлення на хромосомах свиней. Основними моментами запропонованої послідовності обробок є м’яка денатурація гідроксидом барію (5%-ний Ва(ОН)2, +50°С) та інкубація у буферно-спиртовому розчині 2xSSC при pH 8,5 (2-4 г., +65°С).

2. Аналіз С-поліморфізму хромосом свиней візуальним та комп’ютерним способом. У дослідженнях С-поліморфізму хромосом важливою проблемою залишається об’єктивна оцінка розмірів С-блоків гетерохроматину на хромосомах свиней. У практиці медичної генетики для аналізу варіабельних С-блоків гетерохроматину використовують напівкількісні методи

оцінки, яки дозволяють визначати відносні розміри С-блоків візуальним способом. На основі аналогічних методичних підходів були розроблені критерії напівкількісної оцінки С-блоків на акроцентричних хромосомах свиней., розміри С-блоку визначали візуально як відношення його довжини до довжини плеча і оцінювали за 5-бальною шкалою. Межі відносної довжини поліморфних С-блоків наведені у табл.1. Згідно з критеріями напівкількісного методу абсолютна довжина сегменту хромосоми, який відповідає одній умовній одиниці розміру (1 бал), становить 0,4-0,5 мкм при спіралізації хромосом середнього ступеня. Від кожної тварини аналізували по 11 метафаз, для оцінки розміру С-блоків у ряді спостережень визначали значення медіани (Ме). Така система аналізу дозволяє урахувати ступінь спіралізації хромосом та провести корекцію результатів візуальної оцінки.

Таблиця 1.

Критерії напівкількісної оцінки розмірів С-блоків на акроцентричних хромосомах свиней

Вимірювання морфометричних параметрів варіабельних районів С-гтерохроматину на хромосомах свиней проводилось комп’ютерним спосб-

бом. Мікрофотографії хромооом, забарвлених по С-методу, оброблювали допомогою планшетного сканера SCAN JET програмою DESK SCANER Розміри C-блоків визначали у вигляді коефіцієнтів, які показували відно шеїшя середнього діаметру С-блока до довжини реперної хромосоми 18. По рівняння результатів оцінки розмірів С-блоків у балах з розрахованими кое фіцієнтами не визначило статистично вірогідної різниці (Р<0,05) між ре зультатами двох методів, що свідчить про відносну адекватність оцінки по ліморфних С-блоків як комп’ютерним, так і візуальним способом. Проте певну різницю величини коефіцієнтів можна використовувати при детально му аналізі структурно-морфологічних параметрів гетерохроматинових райо нів. '

Експериментальні дослідження показали, що ефективністі комп'ютерної обробки мікрозображень хромосом, отриманих за допомогок планшетного сканеру, обмежена якістю мікрофотографії!. В зв’язку з трудо місткістю та складністю обробки фотографічного матеріалу актуальною є розробка методів, які дозволяють проводити візуалізацію зображень хромосом без фотографування мікрооб’єктів.

Для реалізації такого методу нами спільно з спільно з фірмою “Оптрон”(м.Київ) було розроблено та виготовлено програмно-апаратний комплекс для каріотипування хромосом сільськогосподарських тварин. Схема напіватоматичної системи візуалізації мікрооб’єктів наведена на рис. 1.

Рис.1. Блок-схема установки для напівавтоматичного каріотипування. 1- конденсор з освітлювачем, 2 - координатний столик мікроскопу, 3- препарат, 4- мікроскоп, 5 - відеокамера, 6- відеопорт, 7- персональний комп’ютер.

Система змонтована на базі мікроскопу “Люмам-И2”. Основною складовою частиною є відеокамера 5, яка за допомогою відеопорту б підключається до ПЕОМ 7. Використання цього обладнання дозволяє досліджувати хромосоми, забарвлені як рутинним, так і диференційним способом. Зображення хромосом за допомогою відеокамери транслюється з мікропрепарату до ПЕОМ та виводиться на екран монітору. Після обробки зображень формується файл початкових даних, в якому знаходяться графічні параметри мікрооб’єктів.

Важливим етапом цитогенетичних досліджень є каріотипування хромосомного набору. Для вирішення цієї задачі нами спільно з фірмою “Оптрон’Чм.Київ) було розроблено оригінальне програмне забезпечення. Розробка програми KARYOTYPE була принципово спрямована на інтерактивний режим роботи, що дозволяє оператору-досліднику контролювати та швидко проводити корекцію всіх етапів аналізу. Каріотипування хромосом проводиться у напівавтоматичному режимі. Передбачена можливість редагування каріограми: корекція положення центроміри, підбор гомологічних хромосом.

Використання комп’ютерної техніки у цитогенетичних дослідженнях сільськогосподарських тварин не тільки дозволяє значно підвищити ефективність методів мікродосліджень, але і є необхідним при створенні банку даних племінних тварин. Проте, розробка методів візуального аналізу, які можна використовувати не тільки у спеціалізованих лабораторіях з коштовним обладнанням, також представляється доцільною. Вважаємо, що експрес-оцінка С-поліморфізму хромосом

3. Варіабельність районів структурного гетерохроматинуна акроцен-трнчішх хромосомах свиней. Аналіз літературних даних показав, що поліморфізм С-блоків гетерохроматину на хромосомах свиней виявлено у багатьох дослідженнях. Проте, характеристика параметрів цієї мінливості обмежена, тоді як варіабельність районів С-гетерохроматину обумовлює структурну неоднорідність хромосомного матеріалу, що слід брати до уваги при вирішенні селекційних задач. Дослідження забарвлених по С-методу хромосом свиней показали, що найбільш великими та варіабельними є блоки С-гетерохроматину на акроцентричних хромосомах. Використовуючи критерії напівкількісного методу оцінки провели дослідження варіабельності районів структурного гетерохроматину на акроцентричних хромосомах свиней порід велика біла та ландрас. Частота поліморфних С-варіантів хромосом 13 - 18 наведена у табл. 2.

В результаті аналізу частоти морфологічних С-типів акроцентричних хромосом визначено, що найчастіше поліморфні блоки С-гетерохроматину локалізувалися на хромосомах 13, 15, 16 та 18. Найбільшою варіабельністю С-гетерохроматинового району характеризувалася хромосома 16, частота хромосомних варіантів з великими С-блоками ( 3-5 балів) складала 45,8%.

. Таблиця 2.

Частота (%) С-варіантів акроцентричних хромосом у свиней _______ (п=45, породи - велика біла та ландрас).________________

№ хромосоми Розміри С-блоку гегерохроматіну

1 бал 2 бали 3 бали 4 бали 5 балів

13 І 5.56 67.26 25.0 0 0

14 54.44 42.22 3.33 0 0

15 7.78 22.22 31.11 6.67 0

16 ! 13.19 40.28 34.03 10.42 1.39

17 І 85.56 12.22 2.22 0 0

18 67.78 14.44 7.78 5.56 0

Порішяння частоти поліморфних С-варіантів хромосом 13, 15, 16 та 18 у свиней порід велика біла (п = 48) та ландрас (п = 37) показало, що за варіабельністю С-гетерохроматину представники двох порід практично не відрізняються. Невелика різниця у частоті хромосомних варіантів 16 та 18 з маленькими С-блоками (1 бал ) може свідчити про початок накопичення певних хромосомних С-варіантів у досліджуваних породних групах тварин (Р<®,01). Дослідження розподілу морфологічних С-типів хромосом 13, 15, 16 та 18 у свиноматок та кнурів двох порід також не визначили помітної різниці по частоті поліморфних С-блоків між тваринами різної статі, щр дозволяє вважати функціональне значення варіабельних районів С-гете-рохроматину акроцентричних хромосом нейтральним у відношенні до статі свиней.

В результаті дослідженнь визначено, що варіації С-гетеро-хроматинової частини геному обумовлені переважно поліморфізмом хромосом 13, 15, 16 та 18. Відсутність значної різниці у розподілі поліморфних С-варіавтів хромосом між кнурами та свиноматками порід велика біла та ландрас дозволяє вважати варіабельність районів С-гетерохроматину нейтральною характеристикою як у відношенні до статі свиней, так і в породному аспекті.

4.Взаємозв’язок С-поліморфізму акроцентричних хромосом з репродуктивною функцією свиней. Поліморфізм районів структурного гетерохроматину спостерігається не тільки в межах одного виду, але й в межах одного геному. Гомологічні хромосоми, С-блоки яких відрізнялися за розмірами, вважаються гетероморфними, при цьому розрізнювали гетероморфізм слабкого (1 бал) та сильного ступеня (2-3 бали).

Проведено аналіз основних показників відтворювальної здатності свиней (п=48) порід у зв’язку з наявністю у геномі поліморфних С-варіантів хромосом 13, 15, 16 та 18, а також комбінаціями гетероморфних гомологів. Дослідження показало, що носії великого С-блоку (3-5 балів) на хромосомі 16 характеризувались вірогідно вищим (Р<0,05) показником багатопліддя (10,0+0,23) у порівнянні з носіями маленьких С-6локІ£

(9,0+0,61). Порівняння відтворювальної здатності свиней, що характеризувались гетероморфізмом гомологічних хромосом, виявило різницю за показниками кількості поросят у 2 місячному віці та збереженістю приплоду, пов’язану з С-гетероморфізмом гомологів 16-ої иари.(Р<0,05).

Дослідження репродуктивних якостей кнурів та свиноматок з різними комбінаціями гетероморфних гомологів виявили, що тварини з підвищеною варіабельністю структурного С-гетерохроматину характеризуються більш високою життєздатністю нащадків. Кількість поросят у 2 місяці була вірогідно вищою у свиноматок з вираженим С-гетероморфізмом хромосомних пар (табл.З), підвищення збереженості приплоду складало 15,8%.

Таблиця 3.

Основні показники репродуктивної функції свиноматок у зв’язку з С-гетероморфізмом акроцентричних хромосом

№ групи п, голів Ступінь гетероморфізму, бал. Багато-пліддя, голів У 2 місяці

кількість поросят, голів збереженість приплоду, %

1 18 0-1 9,4+0,54 7,2+0,40* 71,8+3,80**

2 9 2-3 10,4±0,41 8,8+0,47* 84,1±3,40* *

*- в цій та наступних таблицях однакові суперскрнпнти мають значення, що

відрізняються з вірогідністю не менш 95%.

Кнури, в геномі яких виявлені^ структурно неоднорідні гомологи, також характеризувались підвищенням збереженості приплоду (табл. 4), при цьому фертильність досягала рівня 82,4%.

Таблиця 4.

Основні показники репродуктивної функції кнурів у зв’язку з С-гетероморфізмом акроцентричних хромосом

№ групи п, голів Ступінь гетероморфізму, бал. Багато-пліддя, голів У 2 місяці

кількість поросят, голів збереженість приплоду, %

1 10 0-1 9,9+0,29 7,8±0,40 78,6+2,88*

2 11 2-3 9,6+0,41 8,4+0,28 86,5±1,84 *

В результаті аналізу рівня хромосомної нестабільності (РХН) у зв’язку з С-гетероморфізмом гомологів виявлено зміну співвідношення структурних та геномних аберацій як у кнурів, так і у свиноматок, (табл.

5, 6)Наявність у геномі хромосомних пар з вираженим структурним С-гетероморфізмом супроводжувалась зниженням частоти геномних мутацій (Р<0,05).

Цитогенетична характеристика свиноматок у зв’язку з

С-гетероморфізмом акроцентричних хромосом_______________

№ групи п, голі» Ступінь гетеро морфізму, бал. РХН, % Частота структур них абера-цііі, %- Частота геномних мутацій, % Загальним бал С-гетеро морфізму -

1 18 0-1 17,610,91 12,1+2,46 6,5+0,83* 2,2±0,20**

2 9 2-3 17,2±3,57 13,7+4,15 4,0±0,93* 4,1+0,53* *

Таблиця (;

Цитогенетична характеристика свиноматок у зв’язку з

С-гетероморфізмом акроцентричних хромосом_______________

№ груші п, голів Ступінь гетеро морфізму, бал. РХН, % Частота структур них аберацій, %- Частота геномних мутацііі, % Загальним бал С-гетеро морфізму -

1 10 0-1 16,0+2,56 4,3±0,88* 11,8±2,19** 1,9+0,32’**

2 11 2-3 16,2+3,19 11,8±2,90* 5,4±1,08** 3,5±0,35***

Аналіз спектру спонтанних мутацій показав пропорційне змінювання всіх типів хромосомних порушень, за винятком аберацій хроматидного типу, частота яких помітно не відрізнялася (рис. 2).

Рис. 2. Спектр спонтанних хромосомних мутацій свиней з С-гетероморфізмом хромосом. А- слабкий, Б - сильний. ИІ - парні фрагменти,

І . І - чисельні обміни хромосом, НІ- поліплоїдія, 1 1 - анеуплоїдія, ЁЁЯ -

одиночні фрагменти.

В результаті досліджень визначено, що кнури та свиноматки з С-гетероморфізмом гомологічних хромосом вище 2-ох балів характеризувались підвищенням збереженості приплоду. У свиней, які мали структурно неоднорідні гомологи акроцентричних пар, виявлено зниження рівня геномних мутацій, які негативно впливають на відтворювальні якості свиней. Отримані результати свідчать, що структурний поліморфізм по С-блоках гетерохроматину може бути одним з факторів, які обумовлюють високу життєздатність нащадків. Характеристика С-поліморфізму хромосом як складова частина

щтогенетичного тестування свиней може використовуватись при розробці іитогенетичшіх критеріїв репродуктивної здатності свиней.

5. Варіабельність С-гетерохроматинових районів хромосом та нестабільність геному в лейкоцитах крові свиней. Для вивчення зв’язку С-юліморфізму хромосом з нестабільністю геному свиней проведено аналіз ча-тоти та спектру спонтанних мутацій носіїв поліморфних С-варіантів хро-[осом 13, 15, 16 та 18.

При наявності у геномі варіанту хромосоми 13 з великим С-блоком постерігали зниження рівня геномних мутацій, яке відбувалося за рахунок ченшення числа поліплоїдних клітин. Підвищення кількості С-гтерохроматину на хромосомі 18 супроводжувалось підвищенням частоти груктурних аберацій, що може бути пов’язано з невипадковістю хромосомах порушень у С-гетерохроматині (Р<0,05). При структурній гетерогенно-гі гомологічних хромосом також виявили певні зміни спектру мутацій. Ви-ажений С-гетероморфізм гомологів 15-ої пари супроводжувався як зниженім рівня геномних мутацій, так і підвищенням рівня структурних аберацій, ¡умовленого фрагментацією хромосом (Р<0,05). Зниженою частотою гено-іих мутацій характеризувалися носії гетероморфних гомологів 16-ої пари, їді як структурна неоднорідність гомологів 18-ої пари підвищувала часто-■ порушень хромосомного матеріалу. Виявлені зміни співвідношення та іектру мутацій були вірогідними на рівні Р<0,05.

Підвищена варіабельність С-гетерохромтаинових районів хромосом 13, та 16 супроводжувалось зниженням рівня геномних мутацій, тоді як при руктурній гетерогенності хромосомних пар 15 та 18 підвищувалась частота руктурних аберацій. Визначені зміни спектру мутацій свідчать, що полі-ірфізм районів структурного гетерохроматину може, у певній мірі, вплива-на прояви спонтанних мутацій на клітинному рівні, при цьому певні типи ерацій можуть як підвищуватись, так і знижуватись.

6. Взаємозв’язок поліморфізму районів прнцентроміриого С-гетеро-оматину з асоціаціями акроцентричних хромосом у свиней. Для вивчення лі варіабельного С-гетерохроматину у формуванні асоціацій провели до-ідження асоціативної здатності акроцентричних хромосом у зв'язку з ло-чізацією поліморфних С-блоків гетерохроматину. В результаті аналізу ви-ічено, що кількість прицентромірного С-гетерохроматину практично не пивала на асоціативну поведінку хромосом, про що свідчить відсутність огідної різниці між носіями поліморфних С-варіантів хромосом за показ-:<ами частоти клітин з асоціаціями акроцентричних хромосом (ААХ), а так участі хромосомних пар у ААХ.

Виявлено підвищення частоти ААХ при наявності у геномі структурно ерогенних гомологів. Виражений С-гетероморфізм гомологів Іб-ої пари іроводжувався значним підвищенням показника частоти ААХ з 35,5% до 1% (Р<0,05), проте не виявлено переважної участі 16-ої хромосоми у X. У носіїв гетероморфної пари 15 визначено позитивні кореляції між за-ьним балом С-гетероморфізму та частотою ААХ (г, =0,37; Р<0,01), а та-

кож кількістю ААХ на клітину (г2=0,30; Р<0,05). Виявилося, що позити ний корелятивний зв’язок між загальним балом С-гетероморфізму гомолог та частотою ААХ є характерним також для всіх досліджених тварин (г=0,2! Р<0,01).

В результаті досліджень визначено, що структурна гетерогенність г мологічних хромосом супроводжується підвищенням рівня ААХ, тоді ^ кількість С-гетерохроматину не має прямого впливу на асоціативну здатніс: акроцентричних хромосом. Отримані дані свідчать про те, що варіабельній районів прицентромірного гетерохроматину пов’язана з формуванням А А) але вплив поліморфних С-блоків гетерохроматину відбувається на рівні тої ких взаємодій компонентів геному. Вивчення структурно-функціональні: зв’язків на клітинному рівні надає інформацію про діяльність геному, а т, кож створює основу для визначення ознак, які у подальшому можуть буї включені у процес спрямованої селекції.

7. Маркерні хромосоми та їх успадкування Вивчення поліморфізм гетерохроматинових районів представляє інтерес з точки зору існувань природних хромосомних маркерів. Присутність у геномі хромосом, маркір; ваних поліморфними С-блоками дозволяють контролювати походження хрі мосом. Маркерні С-блоки (4-5 балів) визначено у свиней порід велика би та ландрас на хромосомах 15, 16 та 18. Аналіз основних показників репрі дуктивної здатності носіїв маркерних С-варіантів хромосом не виявив латі генетичного зв’язку між підвищенням кількості С-гетерохроматину та репрі дуктивною функцією свиней.

Для вивчення характеру успадкування маркерних хромосом проведеї аналіз поліморфних С-варіантів хромосом у нащадків (п=22) кнурів та сві номаток, в геномі яких виявлено маркерні С-блоки гетерохроматину. Вия лено, що розподіл маркерних С-варіантів хромосом не відхилявся від свівв дношення 1:1. Таким чином, успадкування маркерних хромосом з великим С-блоками гетерохроматину відбувалося згідно загальногенетичному приї ципу. У одного з нащадків виявили великі С-блоки на обох гомологах 16-' пари, тоді як тільки кнур був носієм маркерного варіанту хромосоми її Припущення про походження цього нащадка від інших батьків підтверді імуногенетичний аналіз.

В результаті досліджень встановлено високу стабільність морфологі' них типів хромосом з маркерними С-блоками, а також можливість їх ідеї тифікації при візуальному каріотипуванні. Маркерні хромосоми можуть ві користовуватись як додатковий критерій при визначенні походження твариї

ВИСНОВКИ

1. Акроцентричні хромосоми свиней характеризуються високою варі бельністю районів структурного гетерохроматину. Поліморфізм районів пр: центромірного С-гетерохроматину хромосом 13, 15, 16 та 18 обумовлк структурну гетерогенність гомологічних хромосом.

2. Поліморфізм С-гетерохроматинових районів пов’язаний з функціями геному свиней як на клітинному рівні, так і на рівні діяльності організму. На клітинному рівні підвищена варіабельність С-гетерохроматина гомологічних хромосом характеризується зміною співвідношення структурних та ге-номних мутацій у лейкоцитах крові, тоді як зв'язок з функціями організму проявляється на рівні репродуктивної функції свиней. Структурна гетерогенність гомологів акроцентричних хромосом по С-гетерохроматину у кнурів та свиноматок пов’язана з підвищенням збереженості приплоду на 10-15%.

3. Поліморфізм районів структурного гетерохроматину взаємопов'язаний з проявами спонтанних хромосомних мутацій у лейкоцитах крові ;виней. Підвищена варіабельність С-гетерохроматину на хромосомах 13, 15 га 16 супроводжується зниженням рівня геномних мутацій, тоді як структу-эний поліморфізм хромосомних пар 15 та 18 пов’язаний з підвищенням частоти структурних аберацій.

4. Структурна гетерогенність гомологів акроцентричних хромосом по ^-блоках гетерохроматину сприяє формуванню асоціацій ААХ (г=0,29; 3<0,01). Виявлено зв’язок С-гетероморфізму 16-ої пари з підвищенням час-оти ААХ (Р<0,05), а також позитивну кореляцію загального бала С-етероморфізма з показниками асоціативної здатності хромосом (г,=0,37; ’<0,01; г2—0,30; Р<0,05) у носіїв гетероморфних гомологів 15-ої пари.

5. Свині порід велика біла та ландрас практично не відрізняються за астотою поліморфних варіантів хромосом 13, 15, 16 та 18, незначна різниця

частоті окремих С-типів хромосом 16 та 18 можуть свідчити про накопления певних хромосомних варіантів у селекціонованих групах тварин. Від-утність значної різниці у варіабельності районів структурного гетерохрома-яну між кнурами та свиноматками двох порід дозволяють вважати С-оліморфізм акроцентричних хромосом нейтральною характеристикою як у ідношенні до статі свиней, так і в породному аспекті.

6. Маркерні С-блоки гетерохроматину є стабільним структурно-орфологічним компонентом хромосоми, характер успадкування маркерних ромосом у свиней характеризується співвідношенням 1:1, що відповідає за-ільногенетичному принципу.

7. Візуальний аналіз С-поліморфізму хромосом свиней з використанім критеріїв напівкількісної оцінки дозволяє за 5-бальною шкалою визнали відносні розміри С-блоків гетерохроматину на акроцентричних хро-эсомах 13-18.

8. Удосконалено метод диференційного С-забарвлення хромосом сви-;й. Використання модифікації С-методу, основними етапами якої є обробка цроксидом барію (+50°С) та інкубація у буферно-спиртовому розчині ББС >и рН=8,5, доволяє отримувати С-забарвлення на хромосомах свиней без ачних порушень хромосомного матеріалу.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1. При візуальному аналізі С-поліморфізму хромосом свиней доцільне використовувати критерії напівкількісної оцінки поліморфних С-блоків гете рохроматину на акроцентричних хромосомах 13-18.

2. Ураховуючи високу ефективність та можливість’автоматизації, прі: проведенні цитогенетичного аналізу хромосом сільськогосподарських тварш пропонується використовувати програмно-апаратний комплекс для каріоти пування.

3.Для отримання якісного С-забарвлення на хромосомах свиней доцільно використовувати модифікацію С-методу, яка включає обробку препара тів гідроксидом барію та буферно-спиртовим розчином ББС при рН=8,5, ще забезпечує можливість проведення цитогенетичного аналізу у свинарстві.

4. Характеристика С-поліморфізму хромосом як складова частина цитогенетичного тестування свиней слід використовувати у контексті програм по удосконаленню відтворювальної здатності ліній та родин свиней.

СПИСОК НАУКОВИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Россоха В.И., Ивашура М.Н. Взаимосвязь С-полиморфизма хромосом і воспроизводительными качествами свиней //Научно-тех. бюл.. Институ животноводства УААН. - Харьков, 1996. - №72. - С. 39-43.

2. Івашура М.М. Варіабельність районів прицентромірного гетерохроматин; та спонтанні хромосомні мутації у лейкоцитах крові свиней//Научно-тех бюл.. Институт животноводства УААН. - Харьков, 1998. - №73. - С. 27-30.

3. Іващура М.М. Вивчення взаємозв’язку структурного поліморфізму хро мосом з репродуктивною функцією свиней// Вісник: Проблеми зооінжене рії та ветеринарної медицини. Науково-теор. журнал ХЗВИ - Харьков, 1998

- Вип.З(27).-С.50-52.

4. Воробйова М.М., Єфіменко Л.Й., Розсоха В.І. Вивчення хромосомноп поліморфізму у свиней//Тези допов. 1-ої Міжнар. науково-практ. конф «Селекційно-біотехнологічні методи використання генетичного потенціалу с. г. тварин»,- Київ: Інститут розведення та генетики тварин УААН. - 1994,- С 20.

5. Воробьева М.Н., Россоха В.И., Ефименко Л.Й. Полиморфизм С-6локо хромосом свиней/ / Тези допов. Міжнар. конф. ’’Шляхи підвищення вироб ництва та поліпшення якості свинини”. - Харків: ІТ УААН. - 1995. - С. 33.

6. Воробьева М.Н., Россоха В.И., Шигимага В.А. Применение телевизион ного комплекса при анализе изображений с препаратов хромосом // Тез допов. Міжнар. конф.’’Шляхи підвищення виробництва та поліпшення якосі свинини”. - Харків: ІТ УААН. - 1995. - С. 32.

7.Хватов А.И., Россоха В.И., Ефименко Л.Й. Воробьева М.Н., Россоха Л.Е Возможности использования цитогенетических методов в селекции свине при раннем выборе родоначальников заводских линий// Тези допов. Мі» нар. конф.’’Шляхи підвищення виробництва та поліпшення якості свинини’

- Харків: ІТ УААН. - 1995. - С. 17.

8. Івашура М.М.,Розсоха В.І. Використання диференційного С-мегоду для пофарбування хромосом свиней// Тезисы докл. II Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животных. Киев: Институт агроэкологии и биотехнологии УААН. — 1996. - С 82.

5. Івашура М.М.,Розсоха В.І., Безуглий М.Д., Шигимага В.О., Вивчення можливостей нових методичних підходів до оцінки С-поліморфізму хромосом :виней.// Тезисы докл. II Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животніх. Киев: Институт агроэкологии и биотехнологии УААН. -1996. - С 83.

0. Розсоха В.І., Єфіменко Л.Й., Івашура М.М. С-блоки гетерохроматину як гриродні хромосомні маркери// Тезисы докл. II Междунар. конф. по мо-іекулярно-генетическим маркерам животных. Киев: Институт агроэкологии и иотехнологии УААН. - 1996. - С 86.

1. Розсоха В.І., Івашура М.М., Єфіменко Л.Й., Віденко М.М. Взаємозв’язок С-етероморфізму гомологічних хромосом з відтворювальними якостями свиней// Те-исьі докл. II Междунар. конф. по молекулярно-генетическим маркерам животніх. иев: Институт агроэкологии и биотехнологии УААН. - 1996. - С 87.

АНОТАЦІЇ

тшура М.М. Поліморфізм гетерохроматинових районів акроцентричних ромосом свиней. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня індитата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15. - гететика. Інститут тваринництва УААН, Харків, 1998.

исертацію присвячено вивченню поліморфізма районів структурного гете-)хроматину на хромосомах свиней, а також зв’язку варіабельності С-терохроматину з репродуктивними функціями тварин. Визначено, що носії руктурно гетерогенних по С-гетерохроматину гомологічних хромосом, ха-ктеризувались підвищеною життєздатністю нащадків. На клітинному рівні явлено зв’язок структурного С-поліморфізму акроцентричних хромосом з стабільністю генома в лейкоцитах крові свиней. Підвищена варіабельність гетерохроматину пов’язана з реалізацією певних типів хромосомних порушь, а також з формуванням асоціацій хромосом. Розроблено метод та об-днання для дослідження хромосом комп'ютерним способом. Для візуаль-го аналіза С-поліморфізму акроцентричних хромосом свиней запропонова-критерії напівкількісної оцінки поліморфних С-блоків за 5-бальною шка-ю. Розроблено модифікацію С-методу, яка забезпечує стабілізацію хро-сомного материалу при С-забарвленні. Ключові слова: гетерохроматин, ге-юморфізм, хромосома, нестабільність геному, аберації, асоціації, відтво-вальна здатність свиней.

ашура М.Н. Полиморфизм гетерохроматиновых районов акроцентричес-к хромосом свиней. - Рукопись. Диссертация на соискание научной степе-кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.15. - гете-:а. - Институт животноводства УААН, Харьков , 1998. Диссертация по-

священа изучению полиморфизма районов структурного гетерохроматина к хромосомах свиней, а также взаимосвязи вариабельности С-гетерохроматик с репродуктивными функциями животных. Установлено, что носители струї турно гетерогенных по С-гетерохроматину- гомологичних хромосом, характі ризовались повышенной жизнеспособностью потомков. На клеточном уровн выявлена связь структурного С-полиморфизма акроцентрических хромосом нестабильностью генома в лейкоцитах крови свиней. Повышенная вариабелі ность С-гетерохроматина связана с реализацией определенных типов хрс мосомных нарушений, а также с формированием асоциаций хромосом. Ра; работай метод и оборудование для исследования хромосом компьютерны; способом. Для визуального анализа С-полиморфизма акроцентрических хрс мосом свиней рекомендуется использовать критерии полуколичественно оценки полиморфных С-блоков по 5-балльной шкале. Разработана модифи кация С-метода, обеспечивающая стабилизацию хромосомного материала пр: С-окрашивании. Ключевые слова: гетерохроматин, гетероморфизм, хромосс ма, нестабильность генома, аберрации, ассоциации, воспроизводительна способность свиней.

Ivashura M.N. Polymorphism of heterochromatin regions of the pig acrocentri chromosomes;- Manuscript. Dissertation for the degree Candidate Scienc (Agriculture) in speciality 03.00.15.-The Institute of Animaj Science of UAAS Kharkov, 1998. The dissertation deals with studying the polymorphism о structural heterochromatin regions on porcine chromosomes and С heterochromatin variability relationship with the animal reproductive functions It was established that carriers of the chromosomes structurally heterogeneou in C-heterochromatin were characterized by the progeny improved viability. Th< relatioship of the structural С-polymorphism of acrocentric chromosomes witl genome instability in porcine blood leucocytes was found at the cell level. Th< increased C-heterochromatin variability is connected to realization of certaii chromosome aberrations and formation of associations. A method and equipment are developed to investigate chromosomes using a computer. For visual analysi: of the С-polymorphism of porcine acrocentric chromosomes, criteria о semiquantitative evaluation of polymorphous С-blocks according to 5-poini scoring were proposed. The С-method was modified to provide chromosom« stabilization at C-staining. Key word: heterochromatin, heteromorphism chromosome, genome instability, aberration, association, reproductive ability o: pigs.