Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полимерные гидроксамовые кислоты для выведения железа из организма

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Полимерные гидроксамовые кислоты для выведения железа из организма"

. . и ■<

На правах рукописи

и 1 СЕН 1939

Мешанов Александр Юрьевич

Полимерные гидроксамовые кислоты для выведения железа из организма

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискании ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1999

Работа выполнена в Государственном некоммерческом учреждении -"Гематологическом Научном Центре Российской Академии Медицинских Наук".

Научный руководитель: кандидат биологических наук В.Н.Бовенко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член корреспондент РАЕН Ю.М.Зарецкая доктор химических наук, профессор М.И.Штильман

Ведущее учреждение: ! \-

\

Научно-исследовательский Институт Детской Гематологии РФ.

Защита состоится "_"_1999 г. в_час.

на заседании диссертационного совета Д 001.45.02. в Государственном некоммерческом учреждении -"Гематологическом Научном Центре РАМН" (125167, Москва, Новозыковский проезд, 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного некоммерческого учреждения -'ТНЦ РАМН".

Автореферат разослан "_"_1999 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат биологических наук

В.Д.Реук

0 0 1;,

' V'' ¿> Г / I , ,

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Лечение заболеваний, сопровождающихся патологическим накоплени-м железа в организме (гемосидерозы - ГС, гемохроматозы - ГХ) продолжает ставаться актуальной задачей здравоохранения. Эти заболевания проявляются результате наследственных нарушений метаболизма железа (наследственный емохроматоз - НГХ), при болезнях, лечение которых сопровождается регуляр-ыми гемотрансфузиями (миелодиспластический синдром, талассемии, острая еремежающаяся порфирия и др.), при регулярном употреблении пищи с по-ышенным содержанием железа. Частота встречаемости больных с НГХ достает 3-5 случаев на 1000 человек [Акоев В.Р. и соавт. 1992 г.].

При лечении больных с указанными патологиями в клинике применяет-я десферриоксамин-В, метансульфонатная соль которого носит коммерческое азвание "десферал" (ДФ), выпускаемый швейцарской фирмой "СПэа-Ое1§у". 1,Ф представляет собой тригидроксамовую кислоту, и поэтому обладает высо-ой специфичностью к железу, он способен удалять избыточное железо у боль-ых ГХ и предотвращать накопление его в клетках.

В процессе клинического применения ДФ выявился ряд его недостат-ов: быстро выводится из организма (период полувыведения составляет 5-10 [ин. по СшкпеПе И..А. е! а1., 1978 г.), что обусловливает необходимость дли-ельного и многократного его применения для достижения терапевтического ффекта. Это в свою очередь может привести к возникновению аллергичеких и нафилактических реакций, нарушениям функций органов зрения, явиться при-иной сепсиса и др.

Поэтому во многих странах, в том числе в России ведется поиск новых редств коррекции метаболизма железа, имеющих эффективность подобную (Ф и свободных от его недостатков.

В результате скрининга сотен веществ было выявлено несколько перспективных классов соединений, к ним относятся: гидроксамовые кислоты, гидроксипиридоны, производные полиаминополикарбоновых кислот. Эти соединения могут избирательно образовывать устойчивые комплексы с железом и имеют низкую молекулярную массу, что приводит к их быстрому выведению из организма и как следствие к их малой эффективности. Увеличению вводимой дозы препятствовала существенная токсичность соединений. Решением проблемы явилась идея совместить высокую функциональную активность низкомолекулярных веществ со свойствами полимеров, имеющих низкую токсичность и способных длительно циркулировать в кровеносном русле. В результате были синтезированы полигидроксамовые кислоты на основе пропилена, несущие в боковых цепях функционально активные группы [Winston A., Varaprazad D.W.P.R.- 1986 г.]. Эти полимеры могли выводить железо из организма животных и имели значительно меньшую токсичность, чем ДФ [Winston A., McLaughlin G.R. - 1978 г.]. Существенным недостатком таких полимеров была их неспособность биодеградироваться в организме, что могло привести к аккумулированию их в клетках.

При получении такого рода соединений исследователи выработали к ним ряд требований. К таким требованиям относятся: высокая селективность по отношению к железу; низкая токсичность самих соединений и их комплексов с железом; отсутствие влияния на биосинтез тема; способность выведения железа го жизненноважных органов; отсутствие перераспределения железа в органы чувствительные к его интоксикации; способность предотвращения накопления железа в тканях; способность длительное время циркулировать в организме; отсутствие способности вещества и его комплекса с железом или другим биометаллом накапливаться в организме; способность при прекращении введения лекарства полностью элиминироваться из организма; низкая стоимость.

В наибольшей степени этим требованиям отвечают соединения на основе биодеградируемых полимеров (например: полимеры глюкозы, в частности -декстран, используемый для производства кровезаменителей.), несущие в боковых цепях функционально активные группы. В процессе получения и изучения таких веществ исследователи выработали ряд требований, предъявляемых к ним. К таким требованиям относятся: высокая селективность по отношению к железу; низкая токсичность соединений и их комплексов с железом; отсутствие влияния на биосинтез тема; способность выведения железа из жизненно важных органов; отсутствие возможности перераспределения железа в органы чувствительные к его интоксикации; способность предотвращения накопления железа в тканях; способность длительное время циркулировать в организме; отсутствие способности вещества и его комплекса с железом накапливаться в организме; способность при прекращении введения лекарства полностью элиминироваться из организма; низкая стоимость.

В существенной степени этим требованиям удовлетворяют полигидро-ксамовые кислоты на основе биодеградируемого полимера глюкозы - декстра-на, представляющие ковалентно присоединенную е-аминокапрогидроксамовую кислоту к декстрану, применяемого в отечественном кровезаменителе -"Реополиглюкин". Благодаря этому удалось совместить способность полисахаридов длительное время циркулировать в кровеносном русле с высокой специфичностью гидроксамовых кислот к железу. Что позволило получить новый ряд полигидроксамовых кислот, способных выводить избыточное железо из организма.

Цель работы: Получение полигидроксамовой кислоты как основы лекарственного средства для выведения железа из организма.

Задачи исследования:

1. Разработать способ получения полимерных биодеградируемых гидроксамовых кислот (ПГК).

2. Изучить физико-химические свойства ill К (характеристики ПГК как

химического соединения; способности взаимодействовать с железом в присутствии и в отсутствии других биометаллов - Ыа, К, Са, константы стабильности комплексов с железом.

3. Изучить биохимические свойства ПГК (биодеградируемость; способность взаимодействовать с железом железо-транспортных белков ферритина и трасферрина).

4. Изучить биологические свойства ПГК (токсикологические свойства; фармакокинетика; функциональная активность).

5. Определить характеристики полимерных гидроксамовых кислот как основы лекарственного средства для выведения железа из организма.

Научная новизна.

Впервые осуществлен синтез полимерных биодеградируемых водорастворимых гидроксамовых кислот на основе декстрана и е-аминокапрогидроксамовой кислоты, имеющих разное число гидроксамовых групп и различную молекулярную массу, способных выводить избыточное железо из организма животных.

Теоретическое и практическое значение.

Проведенные исследования позволили определить характеристики ПГК как основы первого отечественного препарата для выведения избыточного железа из организма. ПГК, подобно ДФ, могут быть использованы как антиоксиданты и ингибиторы процессов перекисного окисления липи-дов, при остром отравлении железосодержащими препаратами [На11а\уау Р.Е. е! а1. 1989 г.], при лечении интоксикации алюминием почечных больных и др. в качестве ингибитора катализа радикального окисления мембран эритроцитов при серповидноклеточной анемии, при ишемии печени, при неинсулинозависимом диабете, при гемолитическом кризе с дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, при лечении интоксикации алюминием почечных больных, при лечении железодефицитных анемий в качестве железо-транспортной основы и др.

Внедрение результатов исследования.

На основании проведенных исследований составлен проект лабораторного регламента на получение ПГК. Отработанные в процессе работы методики можно использовать для определения количества железа в разных биологиче-:ких жидкостях, для скрининга других соединений, способных взаимодейство-зать с железом. Материалы диссертации были использованы при публикации 10 печатных работ, в том числе в авторском свидетельстве.

Апробация диссертации.

Материалы доложены на:

1. 59 научной конференции ЦНИИГПК, Москва, 1987 г;

2. Заседании проблемной комиссии Гематологического Научного Центра, Москва, 1998.

Положения выносимые на защиту.

1. Способ получения ПГК;

2. Способность биодеградироваться; способность ПГК взаимодейство-¡ать с железом трансферрина и ферритина.

3. Функциональная активность ПГК.

4. Физико-химические характеристики ПГК как основы потенциального ipenapara для выведения железа из организма.

Структура и объем диссертации.

Диссертация на 115 страницах машинописного текста состоит из введе-1ия, литературного обзора, четырех глав собственных исследований (материалы i методы, получение ПГК, физико-химические и биохимические свойства ПГК, дологические свойства ПГК), выводов, заключения и приложения. Работа ил-юстрирована 15 рисунками и 8 таблицами. В ней использованы 53 литератур-1ых источника, опубликованные на русском языке, и 114 на иностранных зыках.

Работа выполнена на базе ГНЦ РАМН в лаборатории "Технологии го-овых лекарственных форм".

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались:

- клинический препарат "Реополиглюкин" (РПГ)- 10%-ный раствор декстрана со средней молекулярной массой 35 тыс. дапьтон в 0,9% растворе NaCl;

- йодная кислота (HI04H20), метапериодат калия (KIO4) и натрия ;

- Десферал - фирма "Ciba Geigy", Швейцария;

- свежевзятая печень крупного рогатого скота, взятая на Московском ПО "Мясо";

- трансферрин из сыворотки человека - фирма "Serva", ФРГ;

- ферритин тип 1 из селезенки лошади - фирма "Sigma" (США);

- раствор гепарина 50000 ед/мл;

- эритроцитная масса человека;

- соли, кислоты, основания и растворители категорий "ЧДА" и

"ХЧ";

- 440 белых беспородных мышей массой 18-25 г; 12 крыс линии "Wistar" массой 200-220 г; 12 морских свинок массой 250-300 г; 9 кроликов массой 2-2,5 кг;

Методы, применявшиеся при получении и изучении ПГК.

Получение и анализ ДАД.

Окисление декстрана осуществляли либо водорастворимыми йодной кислотой или метапериодатом натрия, либо метапериодатом калия. Полученный раствор диальдегиддекстрана (ДАД) фильтровали, очищали и выделяли.

Очистку ДАД при получении небольших количеств проводили при помощи гельпроникающей хроматографии. При наработке ДАД массой превышающей 10 г использовалась мембранная технология.

Выделение ДАД в сухом виде проводили по двум методикам: а) при исходной массе полимеров до 10 г раствор упаривали на роторном

испарителе. Затем полимер выделяли осаждением этанолом; б) при получении полимеров массой более 10 г сухой продукт получали лиофильной сушкой.

Определение числа альдегидных групп в ДАД проводили после реакции с гидрохлоридом гидроксиламина с последующим титрованием.

Получение и анализ ПГК.

Получение сульфата £ -аминокапрогидроксамовой кислоты (АКГКс) осуществляли взаимодействием капролактама и сульфата гидроксиламина с последующей кристаллизацией из метанола.

Получение ПГК: к водному раствору ДАД добавляли раствор АКГКс. Затем образовавшиеся шиффовы основания восстанавливали боргидридом натрия. Полученный раствор 111К фильтровали, фракционировали, очищали и сушили.

Фракционирование ПГК проводили с помощью мембранной технологии с использованием мембран с различным диаметром пор. Получали две фракции ПГК со средней молекулярной массой 5 и 15 тыс. дальтон.

Изучение физико-химическихи биохимических с в о й с т ПГК.

ИК-спектры растворов АКГК и ПГК снимались в тяжелой воде (совместно с В.М.Нестеренко).

Определение средневесовой молекулярной массы ПГК проводили с помощью аналитической ультрацентрифуги (совместно с В.Э.Слуцким).

Содержание азота в образцах определяли методом Кьельдаля (совместно с В.А.Городковой).

Изучение способности ПГК образовывать комплексы с ионами Fe3+ в присутствии и отсутствии других катионов металлов (селективность по отношению к Fe3+) определяли спектрофотометрическим методом.

Определение констант стабильности Ре3+-комплексов ПГК и ДФ; исследование взаимодействия ПГК с ферритином и трансферрином проводили спектрофотометр ическим методом.

Относительную вязкость определяли обычным методом с помощью капиллярного вискозиметра Оствальда (совместно с В.А.Городковой).

Анализ фракционного состава ПГК осуществляли при помощи гельпроникающей колоночной хроматографии.

Изучение способности 111 К расщепляться ферментами определяли с помощью раствора, содержащего а-1,6-декстранглюкозидазу. Затем после взаимодействия с ПГК определяли содержание глюкозы в пробах (биодеградируемость).

Изучение биологических свойств ПГК.

Среднесмертельную дозу ПГК на мышах определяли по методике Миплера-Тейтнера (совместно с И.Л.Смирновой).

Аллергизирующую способность ПГК определяли на морских свинках (совместно с Т.М.Простаковой).

Реакцию гиперчувствительности замедленного типа определяли на белых беспородных мышах обоего пола (совместно с Т.М.Простаковой).

Время циркуляции в кровеносном русле определяли на кроликах (совместно с Л.Т.Мининой).

Модельная перегрузка железом у мышей и крыс создавалась введением специально приготовленных эритроцитов человека.

Определение способности ПГК выводить железо из организма животных осуществляли на мышах и крысах после определения содержания железа в суточной моче животных фотометрическим методом.

Гистохимические исследования проводили по Перлсу микроскопическим методом (совместно с Т.М.Простаковой и Н.А.Пикулиной).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение ПГК

Синтез ПГК состоит из трех стадий (рис. 1.): 1. первоначально синтезировалась АКГК по методике Зильберма-на E.H. с соавт. 1964 г.

]^МИЧЕСКАЯ Q.EMA ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИГИДЮКСАМОВОЙ КИСЛОТЫ СТАДИЯ 1

&Ы1РОЛА&ТАМ О

Г^™ (NH2OH)i H^SO, 's,___J t ioo°c

СУЛЬФАТ е-АМИНОКАПРОГИЯРрКСАМОВОЙ _ИСЛОТЫ

[NH2(CH2)5CONHOH] 2-H2S04 II

¿EKCTPAH

СТАДИЯ 2

10

ДИАЛЬДЕГИДДЕКСТРАН

он

но N|_у о

rv

II [NH2(CH2)5CONHOH]2-H2S04 NaBH 4, HCl

Л--

н о

pH 7,5-8,5 ГТАДИЯ 3 pH 7,5 w

ПОЛИГВДРОКСАМОВАЯ КИСЛОТА ^CHi

CHzOH

и

л-

СНгОН

/

CHjR,

У

CHJR2

R1 = OH, R 2 = NH(CH 2)5CONHOH ИЛИ R2 = ОН, R, = NH(CH 2)5CONHOH

2. при получении ДАД использовались водорастворимые метапе-риодат натрия (ЫаЮД йодная кислота (Ш04 2Н20) и ее малорастворимая калиевая соль (КЮ4).

3. процесс получения ПГК из ДАД и АКГК включает 2 реакции:

присоединение АКГК к ДАД с образованием оснований Шиффа и их восстановление. Аналогичная тактика была избрана [НаНа\уау Р.Е. е( а1,- 1989 г.] при получении декстрана, к которому присоединяли десферал.

При получении ПГК основное внимание было уделено отработке условий получения активированного декстрана на основе известной реакции окисления Сахаров периодат ионами до образования альдегидов и условий конденсации полученных альдегидов с аминогидроксамовой кислотой.

Результаты экспериментов показали возможность использования в качестве окислителя периодат ионов в форме кислоты или ее калиевой или натриевой соли при нейтральных рН, причем количество получавшихся альдегидных групп не зависело от вида окислителя, но зависело от соотношения периодат/декстран - рис. 2.

100 ' 90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

О 0,5 1

Мп/Мд

Рис. 2. Зависимость числа альдегидных (а) групп в диальдегид-декстране от мольного соотношения периодата (Мп) и декстрана (Мд) (1 -теоретическая кривая, 2 - экспериментальлная кривая.

Условия конденсации диальдегиддекстрана и аминокомпонента выбирали исходя из того, что при низких рН среды уменьшалось коли-

гство присоединяемых к полимеру гидроксамовых групп, а при высоких ди-иьдегиддекстран подвержен деструкции. Поэтому был выбран рН реакции в ределах 7,5-8,5 как наиболее отвечающий этим требованиям.

Восстановление образовавшихся иминов (оснований Шиффа) осущест-ляли боргидридом натрия до образования вторичных аминов. Использование оргидрида натрия позволило создать мягкие реакционные условия, что очень ажно при работе с декстраном - таблица 1.

Таблица 1.

Условия получения и некоторые основные характеристики ПГК.

1/п Шифр в-ва Исходные реагенты рН Выход ё * Мол.

ДАД АКГК реак- мас-

ции са М\у

Шифр Кол-во Кол-во при-

сое- тыс.

дине

-ния

г мэкв. альд. групп г ммоль г % дальтон

1 ПГК-1 ДАД-1 10 6,85 1,47 7,54 7,5 7,2 72 5 12

2 ПГК-2 ДАД-2 10 26,9 5,77 29,6 7,5 7,0 70 19 13

3 ПГК-3 ДАД-3 10 48,8 10,5 53,6 7,5 6,3 63 32 11

4 ПГК-4 ДАД-4 100 480 102 523 7,8 51 51 36 15

5 ПГК-4н ДАД-4 100 480 102 523 7,8 38 38 34 5

6 ПГК-5 ДАД-5 100 470 101 518 5,5 32 32 16 -

7 ПГК-6 ДАД-6 100 510 110 654 6,5 28 28 25 10

8 ПГК-7 ДАД-7 - - 78 400 8,0 33 33 38 11

Примечание: * - % - число гидроксамовых групп, приходящихся на 100

мономерных звеньев полимера.

Наличие в ПГК как полимерной, так и комплексообразующей составляющих обусловило круг физико-химических свойств ПГК, исследование которых характеризует их именно как высокомолекулярные хеланты.

Лиофильно высушенные ПГК представляют собой аморфный порошок от желтого до коричневого цвета в зависимости от количества гид-роксамовых групп. Наличие гидроксамовых групп в молекуле ПГК, было установлено ИК-спектрами, имеющими максимумы поглощения при 1620-1650 см"1, характерными для СО-ЫН связей,присутствующих в гид-роксамовой группе (-СО-ЫНОН). Количество гидроксамовых групп в ПГК составляло 5-36 гидроксамовых групп на 100 мономерных звеньев полимера.

При определении молекулярно-массового распределения ПГК в качестве эталонов использовали исходный декстран со средней м.м. 35 тыс. дальтон, декстраны Т-10 и Г-20. Результаты представлены на рис. 3. Для калибровки колонки в нее вносили смесь растворов реополиглюкина и Т-10 (кривая 2), а затем раствор Т-20 (кривая 3). Как видно из рисунка, хро-матограмма ПГК-3 (кривая 1) имеет узкий пик в районе 35 тыс., что соответствует исходному декстрану. Далее наблюдается постепенное понижение концентрации более низкомолекулярных компонентов, при одновременном отсутствии сколько-нибудь ярко выраженных индивидуальных фракций, что указывает на высокую полидисперсность исследуемого образца.

Рис. 3. Молекулярно-массовое распределение ПГК (ПГК, смесь декстранов Т-20 и Т-10, реополиглюкин - кривые 1,2,3 соответственно).

Относительная вязкость растворов ПГК при концентрации 7,5% не выше двух, что не превышает значение вязкости РПГ.

Растворимость ПГК - до 30%.

Влажность ПГК определялась гравиметрическим методом. Образцы ПГК, полученные после осаждения спиртом имели влажность 4-8%, после лио-фильной сушки 1-2%. Лиофильновысушенные ПГК обладали гигроскопичностью.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПГК

Изучение способности ПГК взаимодействовать с ионами Ге3\

Спектры водных растворов Ре3^-комплексов ПГК при наличии или в отсутствии ионов Ка+, К\ Са2+, Mg2+в физиологических условиях представлены на рис. 4. Для сравнения там же представлен и спектр Ре3+-комплекса ДФ.

Длина волны, нм

Рис. 4. Спектры водных растворов Ре34~-комплексов ПГК в присутствии и отсутствии катионов Na, К, Са, Mg (кривые 1 и 2), Ре34-комплексов ДФ (кривая 3).

Характерный максимум поглощения при 425-430 нм свидетельствует о способности ПГК образовывать сходные Ре3+-гидроксаматные комплексы (в которых на 1 атом Fe3+ приходится приблизительно 3 гидроксамовые группы)

как при наличии выше указанных ионов, так и при их отсутствии.

Для количественного определения числа гидроксамовых групп, приходящихся на 1 атом железа (п) в комплексах - были приготовлены растворы, содержащие ПГК, ДФ и Fe3+ в различных соотношениях, и измерены их оптические плотности при 430 нм. По результатам построены кривые насыщения для ПГК и ДФ. Для ДФ п равно 2,58, а для ПГК - 3,64, что близко по величине для п (3,13-3,45) полигидроксамовых кислот на основе полипропилена, полученных американскими учеными [Winston А,-1976 г.].

Константы стабильности Ре^-комплексов ПГК и ДФ.

ПГК являются - хелантами [Дятлова Н.М.- 1988 г.] (в иностранной литературе - "chelators"), способные образовывать хелаты (в иностранной литературе - "chelates") - гетероциклические специфические устойчивые комплексы с металлами, в частности с железом. Основной характеристикой хелатов являются константы устойчивости (К), определяемые из равновесия: L + М -> LM, тогда K=[LM1/[L]/[M], где [LM], [L], [М] равновесные концентрации хелата, хеланта и металла, соответственно. Величина lg К в литературе обозначается как "ß".

Определение численного значения констант стабильности Fe3+-комплексов ПГК и ДФ осуществлялось по методике "равновесных концентраций" [Winston А.- 1976 г.]. Найденные значения константы стабильности - ß для ПГК составляли от 28 - 28,9, а для ДФ - 29,6. Таким образом, ПГК и ДФ образуют Ге3+-комплексы, которые имеют близкие характеристики (спектры, ß), и по классификации, описанной Балабухой B.C. и Фрадкиным Г.Е. (1958 г.) относятся к соединениям, образующим комплексы чрезвычайно высокой прочности (ß > 25). Наличие высокой ß у ПГК необходимо т.к. железо-транспортные белки трансферрин и ферритин имеют константу стабильности этого же порядка.

Изучение способности ПГК взаимодействовать с железом ферритина трансферрина.

Важной характеристикой хелантов для выведения железа из организма вляется их способность элиминировать железо из ферритина (ФР) и трансфер-ина (ТФ), являющимися основными железо-транспортными белками. Изучение сновывалось на регистрации образования Ре3+-гидроксаматных комплексов ПК. Результаты опытов представлены на рисунках 5 и 6.

Полоса поглощения при 430-440 нм (кривая 1), отсутствующая у раство-а исходного ФР (кривая 2), соответствует поглощению 1:е3+-гидроксаматных омплексов, что свидетельствует об образовании Fe3+-комплекса ПГК, т.е. о пособности ПГК взаимодействовать с железом ФР.

Исследование взаимодействия ПГК и ДФ с железом ТФ проводили ана-югично работе [Weaver J., Pollack S - 1990 г.]. Спектр исходного раствора ТФ гредставлен на рис. 6. (кривая 1).

Рис.5. Спектр исходного водного раствора ферритина (кривая 1). И :пектр водного раствора ферритина после инкубирования с ПГК (кривая 2).

При взаимодействии ДФ и ПГК с железом ТФ появились области поглощения 420-430 нм (кривая 2) и 420-450 нм (кривая 3), соответствующие максимумам поглощения Ре3+-гидроксаматных комплексов ДФ и ПГК соответ-

ственно. Это указывает на способность ПГК аналогично ДФ взаимодействовать и элиминировать железо из ТФ.

390 440 490 Длина волны, нм

Рис. 6. Спектр водного раствора трансферрина (кривая 1), транс-феррина и десферала, снятого против трансферрина (кривая 2), трансферрина и ПГК, снят против ПГК (кривая 3).

Изучение биодеградируемости ПГК.

Поскольку полигидроксамовые кислоты представляют собой модифицированный декстран, то изучение их биодеградируемости проводили путем взаимодействия с имеющейся в печени и некоторых других органах [Розенфельд Е.Л., Лукомская И.С. 1956 г.] а-1,6-декстранглюкозидазой (декстраназа), способной расщеплять декстран по а-1-6 связям с выделением глюкозы. Результаты опытов представлены на рисунке 7., на котором изображена зависимость количества отщепляемой глюкозы (биодеградируемость) от числа гидроксамовых групп в ПГК. За 100% принята степень биодеградируемости исходного немодифицированного декстрана.

Из рисунка видно, что с увеличением § биодеградируемость падает, причем 50%-ной биодеградируемости соответствует £=32-36; совершенно очевидно, что дальнейшее увеличение § приведет к еще большему

уменьшению биодеградируемости. Поэтому эта величина g принята как предельная, больше которой уменьшение биодеградируемости становится непри-гмлемым с точки зрения биологических свойств.

О 10 20 30 40

Рис. 7. Зависимость биодеградируемости ПГК от количества гидроксамо-вых групп на 100 мономерных звеньев полимера (§).

Токсикологические исследования ПГК.

Острая токсичность ПГК.

Среднесмертельную дозу на мышах определяли у ПГК-4, т.к. предполагалось, что наибольшую токсичность будет иметь именно те ПГК, у которых наибольшее число гидроксамрвых групп. У ПГК-4 1ЛЭ2о составляла более чем 8 г/кг. ЬО50 не была достигнута вследствие невозможности введения слишком большого количества вещества. При сравнении с ЬВ» ДФ и Декстран-ДФ, которые составляли соответственно 0,8 г/кг и 4,0 г/кг [На11а№ау Р.Е. 1989] ПГК выгодно отличаются более низкой токсичностью.

При введении 20 мышам раствора ПГК-4 в дозе 6 г/кг четыре раза в неделю (на фоне модельной перегрузки железом) в течение всего периода введения и в последующие 3 дня после введения, гибель мышей не наблюдалась, что также подтверждает низкую токсичность ПГК.

ил

20

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПГК

Гистохимические исследования печени, селезенки, легких и сердца подопытных животных не выявили некроза клеток, не отмечено более выраженных дистрофических изменений внутренних органов по сравнению с изменениями в группе интактных животных после введения физиологического раствора.

Изучение аллергенных свойств ПГК.

Выявление аллергизирующего действия ПГК в эксперименте на животных является обязательным исследованием для новых синтезированных веществ.

Конъюктивальная проба - чувствительный тест, который способен выявить реакцию животных на аллерген при слабой аллергизации. Исследование проводили на морских свинках.

После введения раствора ПГК и физиологического раствора (контроль) шести животным, реакцию не наблюдали ни в контрольной, ни в опытной группах животных. Реакция отсутствовала через 15 мин и через 24 часа после введения. Таким образом: ПГК не обладает способностью вызывать аллергическую реакцию иммунологического происхождения.

Реакция гиперчувствительности "замедле иного типа" (ГЗТ).

Известно, что интенсивность реакции ГЗТ к химическим веществам зависит от сочетанного действия различных субпопуляций Т-супрессоров, подавляющих ГЗТ.

Исследования показали, что через 6 часов после введения разрешающей дозы не было достоверных различий между опытными группами, после введения физиологического раствора отека лап не наблюдалось. Таким образом можно сделать вывод об отсутствии гиперчувствительности замедленного действия на введение ПГК.

Цитотоксичность ПГК.

Зависимость цитотоксичности от молекулярной массы ПГК приведены в таблице 2, определяемой как ингибирование захвата тимидина клетками при их тролиферации.

Таблица 2.

№ Шифр вещества Молекулярная масса Степень

п/п г/моль торможения %

1 ДФ 657 12

2 ПГК-4н 5 тыс. 10

3 ПГК-4 15 тыс. 0

Отсутствие влияния на захват тимидина у ПГК-4 указывает на относительно низкую цитотоксичность более высокомолекулярной ПГК-4 по сравнению с ДФ и ПГК-4н. Поэтому ПГК с молекулярной массой 15 тыс. является более предпочтительной в качестве потенциального лекарства из-за меньшей цитотоксичности.

Фармакокинетика ПГК.

Одним из важных показателей ПГК является их способность более длительное, чем ДФ, время циркулировать в кровеносном русле (рис. 8).

Время циркуляции в кровеносном русле, час.

Рис. 8. Время циркуляции ПГК (м.м. 5 тыс. - кривая 2, м.м. 15 тыс. - кривая 3), ДФ (кривая -1).

В эксперименте на кроликах испытывались ДФ с м.м. 657, ПГК-4н с м.м. 5 тыс. и ПГК-4 с м.м. 15 тыс. дальтон.

Скорость всасывания ДФ и ПГК-4и выше, чем ПГК-4. Уменьшение концентрации у ДФ носило более быстрый характер, чем у 111 К, однако в

большей степени соответствовало ПГК-4н. Существенной разницы в профиле изменения концентрации у ДФ (кривая 1) и ПГК-4н (кривая 2) не отмечено, что, по-видимому, можно объяснить наличием у ПГК-4н высокой полидисперсности и относительно низкой молекулярной массы. Другая картина наблюдается у ПГК-4 (кривая 3), скорость уменьшения концентрации у ней была заметно ниже и к шестому часу после введения составляла около 10% от максимальной, в то время как концентрация ДФ падала до нуля.

Таким образом, изучение времени циркуляции хелантов позволило экспериментально показать разницу в сроке циркуляции ДФ и ПГК, причем у последнего он оказался заметно выше, что обусловлено относительно большей молекулярной массой полимера.

В численном выражении период полувыведения из кровеносного русла для ПГК-4, ПГК-4н и ДФ составлял соответственно 140, 100 и 70 мин. Это является еще одним аргументом в пользу ПГК с м.м. 15 тыс.

Изучение функциональной активности 111 "К.

Одним из основных показателей хеланта, характеризующий его как потенциальное лекарство для выведения избытка железа из организма является его способность элиминировать железо из организма.

Изучение способности ПГК выводить железо из организма проводили на животных двух видов (мыши, крысы), контролем служил ДФ. Критерием эффективности ПГК являлось количество железа, выводимое с мочей за одни сутки. Перед введением ПГК и ДФ у животных создавали перегрузку железа введением обработанных гетероэритроцитов [Pitt C.G.-1979 г.]. Гистохимические исследования органов животных после введе-

ия эритроцитной массы человека подтвердили развитие длительногогемосиде-оза особенно печени и селезенки. В печени отмечено появление сидерофагов, ереполненных синими гранулами и глыбками Перлс-положительного материа-а. В селезенке наблюдался сидероз красной пульпы. Единичные сидерофаги стречались в сердце, легких и в почках. Исследования показали адекватность [спользуемой модели создания перегрузки железом описанной в литературе.

Исследования на мышах включали изучение зависимости количества вы-одимого железа: а) от количества гидроксамовых групп в ПГК (¿) при неиз-1енной молекулярной массе, результаты представлены на рисунке 9.; б) от водимой дозы при неизменных § и молекулярной массе (таблица 4.); в) от мо-[екулярной массы при неизменном g и дозе (таблица 5.).

Исследования показали, что с увеличением числа гидроксамовых групп в 1ГК количество выводимого железа увеличивается, причем у ПГК с §=5 досто-юрных отличий в выведении железа по отношению к контролю не зафиксиро->ано (Р>0,1). Такую тенденцию можно объяснить увеличением удельной 1ктивности ПГК с увеличением количества гидроксамовых групп, заключаю-цейся в том, что на единицу массы полимера приходится разное количество функционально активных гидроксамовых групп, способных связывать железо. Эта зависимость представлена на рис. 9.

а и

Ь

I з

и и £

О

10

20

30

40 %

Рис. 10. Зависимость количества выводимого ПГК железа от числа гидроксамовых групп на 100 мономерных звеньев полимера - я.

Наибольшая активность преобладает у ПГК с g > 25. Поэтому с функциональной точки зрения для выведения железа из организма вводить ПГК с меньшими значениями g не оправдано из-за низкой удельной активности таких 111 К.

Результаты опытов по определению зависимости эффективности ПГК от вводимой дозы при неизменном количестве гидроксамовых групп и молекулярной массе представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Зависимость количества выводимого железа от вводимой дозы ПГК.

N Шифр Вводимая Количество Количество выведенного железа

п/п вещества доза (X ± SD)

мэкв.

гидрокса- животных/ мкг/мышь/ мкг/кг/сут %

мовых кол-во сут

групп/кг опытов

1 Физ. р-р. - 10/6 1,9 ±0,6 95 ±32 100

2 ПГК-3 0,68 7/7 3,4 ±2,0 170 ±100 178

3 ПГК-3 1,36 10/4 4,7 ± 0,2 234 ± 10 246

4 ПГК-3 8,17 10/8 10,2 ± 5,3 509 ± 267 536

5 ДФ 1,14 10/8 7,3 ± 1,0 367 ±49 386

6 ДФ 1,14 - 8,4 ± 1,4 * 420 ± 70 -

Примечание: * Указано количество выведенного железа, приведенного в работе Pitt (1979 г.).

Эффективность выведения железа повышается с увеличением вводимой дозы ПГК, что связано с повышением числа активных гидроксамовых групп принимающих участие во взаимодействиях с железом. Однако при введении большой дозы линейная зависимость увеличения выведения от дозы нарушается.

Изучение зависимости функциональной активности ПГК от молекулярной массы проводили на мышах при внутрибрюшинном введении ПГК в дозе 0,5 г/кг. Экспериментальные данные представлены в таблице 4. Результаты исследования показали, что обе ПГК обладают сходной функциональной активностью (Р>0,1). Поэтому, учитывая наличие у низко-

лолекулярной ПГК более высокой цитотоксичности, а также более сложное ее толучение по сравнению с высокомолекулярной, следует отдать предпочтение 1ГК со средней м.м. 15 тыс. дальтон.

Таблица 4.

Зависимость выводимого железа от молекулярной массы ПГК.

N Шифр Молеку- Вводимая Кол-во Количество выведенного

1/П в-ва лярная масса доза мэкв. железа (X ± БО)

тысяч гидрокса- животныхУ мкг/мышь/ мкг/кг/с %

дальтон мовых групп/кг кол-во опытов сут ут

1 Физ. р-р - - 7/5 0,9 ± 0,6 45 ±30 100

2 ПГК-4н 5 1,14 7/8 2,0 ± 0,7 100 ±35 222

3 ПГК-4 15 1,14 7/7 2,4 ± 1,0 120 ± 50 267

4 ДФ 0,657 1,14 7/8 3,3 ± 1,5 165 ±75 367

Другим видом животных, на котором испыгывались ПГК, являлись крысы. Результаты испытаний представлены в таблице 5.

Представленный материал показывает, что количество выводимого ПГК железа у крыс как и у мышей достоверно (Р<0,05) увеличивается в несколько раз. Наличие у ПГК функциональной активности в опытах на двух видах животных позволяет сделать вывод о перспективности ПГК в качестве потенциального препарата для выведения железа из организма.

Таблица 5.

Зависимость количества выводимого железа от дозы ПГК у крыс.

N Шифр Вводимая доза Кол-во Количество выведенного железа

1/П в-ва (X ± ББ)

г/кг мэкв/кг животных/ кол-во опытов мкг/крыса/ сут мкг/кг/сут %

1 Физ. р-р - - 3/5 8,8 ±6,3 35 ±27 100

2 ПГК-4 0,75 1,02 3/7 37,3 ± 12,0 149 ±48 425

3 ПГК-4 1,5 2,04 3/11 46,3+ 19,5 185 ±78 529

4 ДФ 0,1 0,46 3/3 16,0 ±3,3 64 ± 13 183

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ получения новых водорастворимых полимерных хелантов железа - полмгидроксамовых кислот на основе декстрана и е-аминокапрогидроксамовой кислоты, имеющих широкое молекулярно-массовое распределение. Получены полигидроксамовые кислоты с различным количеством гидроксамовых групп и разной молекулярной массой.

2. Показано, что полигидроксамовые кислоты при физиологических условиях, подобно десфералу, способны избирательно образовывать Ре3+-комплексы в присутствии физиологически активных катионов магния, кальция, натрия, калия. Установлено, что константы устойчивости Ре3+-комплексов полимерных гидроксамовых кислот (Р = 28-28,9) сравнимы с константой устойчивости Ре3+-комплекса десферала, имеющего величину 29,6.

3. Установлено, что полученные полигидроксамовые кислоты способны элиминировать железо ферритина и трансферрина и расщепляться декстраназой организма млекопитающих.

4. Установлено, что полигидроксамовые кислоты обладают низкой токсичностью ЬО20= 8,0 г/кг в сравнении с десфералом (1Л}50 = 0,8 г/кг), не вызывают аллергенную реакцию иммунологического происхождения.

5. Показано, что полигидроксамовая кислота со средней молекулярной массой 15 тысяч дальтон способна более длительное время циркулировать в кровеносном русле, чем десферал и обладает способностью выводить железо из организма животных.

6. Определены оптимальные характеристики полигидроксамовой кислоты как основы первого отечественного препарата для выведения железа из организма, составляющие'. 25-36 гидроксамовых групп на 100 мономерных звеньев полимера со средней молекулярной массой 15 тысяч дальтон.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

1. Бовенко В.Н., Мещанов А.Ю., Кольцова Г.Н., Минина Л.Т./К вопросу »здания отечественного препарата для лечения гемосидерозаУ/Тезисы докла-)в III Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов,- 1996.- С.П.- с. 5.

2. Козлов A.B., Мещанов А.Ю., Николаева И.Г. и др./Сравнительное изу-:ние антиокислительных свойств полигидроксамовых кислот, десферала и эугих хелаторов железа.//Биофизика,- 1993.- т. 38.- вып. 4.- сс. 708-713.

3. Кольцова Г.Н., Мещанов А.Ю., Смирнов И.В. и др. / Исследования в тытах in vitro и in vivo ряда полигидроксамовых кислот комплексонов железа. Тезисы докладов II Всеукраинского съезда гематологов и трансфузиологов.-иев,- 1986,- с.8.

4. Кольцова Г.Н., Крылова Н.К., Рыболовлев Ю.Р., , Мещанов А.Ю. и р./Получение комплексонов железа и изучение их физико-химических и био-эгических характеристик.//Материалы 59-ой научной конференции ¿ШИГПК,- М.- 1987.- сс. 39-41.

5. Кольцова Г.Н., Мещанов А.Ю., Смирнов И.В. и др./Производное дек-фана и е-аминокапрогидроксамовой кислоты, способное выводить железо из рганизма животных.// Авторское свидетельство N 1653309 СССР.- 01.02.91.

6. Кольцова Г.Н., Мещанов А.Ю./ Использование Десферала при анеми-х, миелолейкозе и других паталогиях.// Гематология и Трансфузиология,-992,-N9-10,- сс. 44-46.

7. Крылова Н.К., Рыболовлев Ю.Р., Смирнова И.Л., Кольцова Г.Н., Ме-[анов А.Ю. и др./ Полимерные комплексоны для выведения избытка железа из рганизма при гемохроматозах.// Актуальные проблемы производства кровеза-енителей, консервантов крови, гормональных и органотерапевтических прпа-атов,- Тезисы докладов III Всесоюзной научной конференции.- М.-1987.

8. Мещанов А.Ю., Смирнов И.В. /Изучение образования железогид-роксаматных комплексов новыми полимерными комплексонами. // Материалы 59 научной конференции ЦНИИГПК.-М.-1987.- сс. 127-128.

9. Мещанов А.Ю., Кольцова Г.Н., Романова М.Ж., Щербинина С.П./ Хеланты для выведения избытка железа из организма.// Гематология и Трансфузиология.- 1989.-N 3.- сс. 40-45.

10. Мещанов А.Ю., Кольцова Г.Н., Минина Л.Т. и др./Полимерные биодеградируемые гидроксамовые кислоты для выведения железа из орга-низма.//Химико-Фармацевтический Ж - 1994,- N 3.- сс. 31-34.