Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск путей повышения эффективности противоопухолевых вакцин на основе модифицированных дендритных клеток

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Поиск путей повышения эффективности противоопухолевых вакцин на основе модифицированных дендритных клеток"

9 15-3/278

На правах рукописи

МАРКОВ ОЛЕГ ВЛАДИМИРОВИЧ

ПОИСК ПУТЕЙ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учйной степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

Миронова Надежда Львовна, к.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, в.н.с.

Официальные оппоненты:

Купраш Дмитрий Владимирович, д.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, заведующий лабораторией передачи внутриклеточных сигналов в норме и патологии

Попова Нэлли Александровна, к.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, с.н.с.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии

Защита состоится « о » ноября 2015 г. в 40' часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090 Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, а также на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан « 21) » 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ '

Актуальность проблемы. В настоящее время в терапии онкологических заболеваний выделяются методы, основанные на активации иммунной системы. Среди них особое место занимают подходы на основе дендритных клеток (ДК), способных запускать и поддерживать опухолеспецифический Т- и В-клеточный иммунные ответы. ДК являются профессиональными антиген-представляющими клетками (АПК), главная функция которых заключается в захвате чужеродных антигенов, их процессинге и презентации на клеточной поверхности в комплексах с молекулами МНС первого и второго типа наивным Т-клеткам. В результате такого взаимодействия происходит созревание и активация опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), способных проникать в места локализации опухоли, идентифицировать опухолевые клетки и уничтожать их. Помимо этого запускается Т-хелперный ответ первого и второго типа, стимулирующий Т- и В-клеточные звенья противоопухолевого иммунного ответа. Дополнительная стимуляция лимфоцитов цитокинами, секретируемыми ДК, способствует пролиферации клонов опухолеспецифических ЦТЛ. В настоящее время разработка вакцин на основе ДК, позволяющих эффективно лечить онкологические заболевания и преодолевать вызванный опухолью иммунодефицит, является крайне актуальной.

В экспериментах на мышиных опухолевых моделях in vivo было показано, что ДК, нагруженные опухолевыми антигенами (ОАГ) в виде белков, РНК, ДНК или вирусных конструкций, кодирующих ОАГ, способны вызывать активацию иммунной системы при их введении в организм-опухоленоситель. Были получены многообещающие результаты - уменьшение скорости роста опухоли, сокращение количества метастазов, увеличение выживаемости животных-опухоленосителей, запуск опухолеспецифического цитотоксического Т-клеточного иммунного ответа. Однако на сегодняшний день результаты клинических испытаний ДК и противоопухолевых вакцин на их основе являются менее впечатляющими по своей эффективности по сравнению с данными экспериментов in vivo. На сегодняшний день остались такие нерешенные проблемы при подготовке ДК вакцин, как недостаточная эффективность доставки ОАГ в ДК, а также адаптация протоколов лечения с помощью ДК опухолей различного гистологического типа.

Целью настоящей работы являлся поиск путей увеличения эффективности противоопухолевых вакцин на основе модифицированных дендритных клеток. В ходе исследования решались следующие задачи:

1) Поиск липосомальных композиций, обеспечивающих высокоэффективную доставку ОАГ в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые ДК мыши ex vivo и опосредующих высокий противоопухолевый потенциал ДК вакцин in vivo.

2) Поиск липосомальных композиций, адресованных к маннозным рецепторам на поверхности ДК, обеспечивающих эффективную избирательную доставку ОАГ в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые ДК мыши ех vivo и in vivo, опосредующих способность ДК эффективно презентировать ОАГ и генерировать клоны противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов.

3) Выбор схем лечения с помощью вакцин на основе модифицированных ДК опухолей различных гистологических типов, обеспечивающих запуск высокоэффективного противоопухолевого иммунного ответа.

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработаны противоопухолевые ДК вакцины на основе ДК, нагруженных суммарной опухолевой РНК в комплексах с катионными липосомами, состоящими из катионных липидов 2X3 (1,26-бис(холест-5-ен-ЗР-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид) или 2D3 (1,26-бис(1,2-ди-0-тетрадецил-гас-глицерин)-7,11,16,20-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид), содержащих в своей структуре два остатка холестерина или дитетрадецилглицерина, соединенных спермином, и липида-хелпера DOPE (1,2-диолеоил-5л-глицеро-3-фосфоэтаноламина), обладающих высоким

противоопухолевым и антиметастатическим действием.

Разработаны противоопухолевые ДК вакцины на основе ДК, нагруженных суммарной опухолевой РНК в комплексе с «адресными» липосомами, направленными к маннозным рецепторам ДК. Липосомы состояли из катионного липида 2X3, липида-хелпера DOPE и маннозилированного липоконъюгата 3-[6-(а-0-маннопиранозилокси)гексил]амино-4-{6-[шс-2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-илоксикарбамоил]гексил}аминоциклобуг-3-ен-1,2-дион. Такие ДК вакцины обладали высоким антиметастатическим потенциалом и стимулировали запуск опухолеспецифического ЦТЛ ответа in vivo.

Впервые показано, что профилактические противоопухолевые вакцины на основе ДК, нагруженных суммарной опухолевой РНК в комплексах с катионными липосомами, более эффективны в отношении метастазирующих опухолей, тогда как терапевтические ДК вакцины эффективны в отношении неметастазирующих опухолей.

Основные положения, выносимые на защиту.

1) Созданы противоопухолевые вакцины на основе ДК, нагруженных с помощью «адресных» катионных липосом РНК, кодирующей ОАГ, и показана их высокая противоопухолевая и антиметастатическая активности.

2) Профилактические ДК вакцины эффективны в отношении метастазирующих опухолей, терапевтические ДК вакцины эффективны в отношении неметастазирующих опухолей.

3) Противоопухолевая эффективность ДК вакцины определяется ее способностью запускать и регулировать цитотоксический Т-клеточный и Thl/Th2/Thl7 ответы, а также низким уровнем активации регуляторных Т-клеток.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 публикации в рецензируемых научных журналах. Результаты работы были представлены на конференциях: 11lh Young Scientist Forum "Biochemistry for Tomorrow's Medicine" (Турин, Италия 2011); 36lh FEBS Congress "Biochemistry for Tomorrow's Medicine" (Турин, Италия 2011); 31s' European School of Medicinal Chemistry (Урбино, Италия 2011); 38lh FEBS Congress "Mechanisms in Biology" (Санкт-Петербург, Россия 2013); Фундаментальные науки - медицине (Новосибирск, Россия 2013), "Science of the Future" (Санкт-Петербург, Россия 2014), Russian-British Seminar "Targeting the RNA World: The

Future of Nucleic Acid Therapeutics" (Санкт-Петербург, Россия 2015), 4th Meeting of the CNRS Laboratoire International Associe NUCPROT "Biogenesis, structure and reactivity of nucleic acids protein assembles important for health and desease" (Новосибирск, Россия 2015).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 156 страницах, содержит 36 рисунков и 4 таблицы. Библиография содержит 305 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

3.1. Приготовление ДК вакцины

В качестве модельных клеток использовали костно-мозговые предшественники ДК (преДК) и полученные из них незрелые ДК (¡тДК). ПреДК получали из клеток костного мозга мышей линии С57В1/6 с помощью центрифугирования на среде Histopaque-1083.1шДК получали культивированием преДК в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ в течение 6 дней. ДК вакцину получали нагрузкой ¡тДК ОАГ в виде опухолевого лизата (пассивным методом) или суммарной опухолевой РНК (в комплексах с катионными липосомами). В исследовании трансфекционного потенциала катионных липосом в качестве источника АГ для нагрузки ДК использовали плазмидную ДНК pEGFP-C2 (далее pEGFP) и суммарную РНК клеток BHK-IR780, эндогенно экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (далее PHK-EGFP).

3.2. Исследование трансфекционной активности поликатионных липосом

3.2.1. Поликатионные липиды илипосомы

Катионные липосомы состояли из поликатионных липидов на основе спермина и липида-хелпера DOPE (Рис. 1). Липиды были синтезированы и любезно предоставлены д.х.н. М. А. Масловым (МИТХТ им. М. В. Ломоносова, Москва).

Катионные липиды содержали один (липиды Х2, SI, S2 и S3) или два (2X3) остатка холестерина или дитетрадецилглицерина (2D3), связанных со спермином. Катионные липосомы состояли из поликатионных липидов и липида-хелпера DOPE ( 1,2-диолеоил-5л-глицеро-3-фософэтаноламин) в мол. отношении 1:1. Липоплексы, т.е. комплексы, состоящие из липосом и НК (ДНК или РНК), были приготовлены при разных соотношениях N/P (отношение количества аминогрупп катионных липидов к количеству фосфатных групп нуклеиновых кислот).

3.2.2. Доставка плазмидной ДНК pEGFP-C2 в преДК и тДК с помощью катионных липосом

Две липосомальные композиции из шести исследованных - 2X3-DOPE и 2D3-DOPE - обладали высокой эффективностью трансфекции преДК как с точки зрения числа трансфицированных клеток (ТЕ), так и интенсивности флуоресценции (MFI): TE/MFI для 2X3-DOPE и 2D3-DOPE составили 33% / 2RFU и 30% / 2.4 RFU при N/P 10/1, соответственно (Рис. 2А,Б). Липосомы X2-DOPE и S2-DOPE показали заметную эффективность доставки: 43% / 0.7 RFU

3

Y СП

Рис. 1. Структуры компонентов поликатионных липосом

и 27%/2 RFU при N/P 10/1, соответственно. Липосомы S1-DOPE и S2-DOPE были малоэффективны: 10%/0.7 RFU, однако даже их ТЕ в 2-3 раза превышала уровни трансфекции, наблюдаемые при доставке pEGFP с помощью коммерческого препарата Lipofectamine 2000 (LF) (5%/0.5 RFU) (Рис. 2А,Б). Показано, что с увеличением соотношения N/P наблюдался рост ТЕ для липосом 2X3-DOPE, 2D3-DOPE, X2-DOPE и S2-DOPE, тогда как липосомы S1-DOPE и S3-DOPE во всем интервале концентраций трансфицировали менее 10% преДК и обеспечивали уровень MF1 схожий с уровнем LF.

7ХЗООРЕ 7D3DOPE Х2-ООРЕ S3-DOPE SI-DOPE S7-DOPE

LF 7X3-DOPE 703-DOPE X7DOPE S? DOPE

7X3-OOPE 703-OOPE X7-DOPE S3 DOPE SI-DOPE S7-OOPE

i| 1,

an юн n nn «'1 t»! pi И LF 7X3-DOPE 7D3-OOPE X7-DOPE SÏ-DOPE

Рис. 2. Доставка pEGFP-C2 с помощью катионных липосом в преДК (А, Б) и ¡тДК (В, Г). Количество флуоресцентных клеток и интенсивность флуоресценции оценивали через 48 ч после трансфекции с помощью проточной цитометрии. Данные представлены как MEAN±S.E.M..

Наиболее эффективные липосомы 2X3-DOPE, 2D3-DOPE, X2-DOPE и S2-DOPE были выбраны для исследования эффективности трансфекции pEGFP в ¡шДК (Рис. 2В,Г). TE/MFI для липосом 2X3-DOPE составило 36%/ 1.8 RFU;

2D3-DOPE - 32-45%/1 RFU; S2-DOPE - 27-35%/1.4 RFU (Рис. 2В,Г). Трансфекция ¡гпДК X2-DOPE/pEGFP обеспечила довольно высокий процент EGFP+ шаДК (до 44%, N/P 10/1), но M FI оказалось минимальной (0.02 RFU), что, возможно, связано с недостаточным высвобождением pEGFP из эндосом или липоплексов. Все исследованные липосомы доставляли pEGFP в преДК и ¡тДК со значительно большей эффективностью по сравнению с LF.

3.2.3. Доставка PHK-EGFP в преДКи тДК с помощью катионных липосом

Как и в случае с ДНК, липосомы 2X3-DOPE, 2D3-DOPE, S2-DOPE и S3-DOPE эффективно доставляли PHK-EGFP в преДК: ТЕ / MFI для 2X3-DOPE, S3-DOPE и S2-DOPE составило 30%/3RFU; 32%/3 RFU и 30%/3.1 RFU, соответственно, а для 2D3-DOPE - 33%/5.9 RFU (Рис. ЗА,Б). Липосомы SI-DOPE были наименее эффективными. Для X2-DOPE ТЕ составила около 60%, однако MFI была крайне низкой 1 RFU. При увеличении N/P с 1/1 до 2/1 ТЕ значительно усиливалась для всех липосом, за исключением S1 -DOPE.

t/1 2/1 ' 1/1 2/1 ' 1/1 2/1 ' 1/1 2/1 ' 1/1 2/1 1/1 2/1 NIP 2BWE 2D3-OOPE X2-DOPE ЗЗ-ООРЕ 61-OOPE S2-DOPE

■ I .11

2ХМЮРЕ 2DJOOPC X2-OOPE S?-OOPE

Рис. 3. Доставка PHK-EGFP с помощью катионных липосом в преДК (А, Б) и ¡шДК (В, Г). Количество флуоресцентных клеток и интенсивность флуоресценции оценивали через 48 ч после трансфекции с помощью проточной цитометрии. Данные представлены как MEAN±S.E.M.

Липосомы 2X3-DOPE, 2D3-DOPE, X2-DOPE и S2-DOPE использовали для доставки PHK-EGFP в ¡тДК при N/P 2/1 (Рис. ЗВ,Г). ТЕ / MFI для липосом 2D3-DOPE и S2-DOPE - 43-47% / 3.1-3.5 RFU; липосомы 2X3-DOPE, в отличие от Х2-DOPE, трансфицировали меньшее количество клеток с более высоким уровнем экспрессии трансгена (ТЕ / MFI - 35% / 3 RFU), тогда как X2-DOPE доставлял PHK-EGFP в 57% клеток с MFI 1.2 RFU. Все исследуемые катионные липосомы значительно более эффективно доставляли PHK-EGFP в преДК и ¡шДК по сравнению с LF (10% / 0.5 RFU).

3.2.4. Исследование противоопухолевого потенциала ДК, трансфицированных опухолевой РНК с помощью катионных липосом ex vivo, на метастатической модели меланомы В1бмыши

Для нагрузки ¡шДК использовали суммарную РНК клеток меланомы В16 (РНК-В16). Метастатическую модель меланомы индуцировали введением клеток меланомы В16 (100 тыс. кл.) в хвостовую вену мышей С57В1/6. На 4-й день после трансплантации мышей делили на пять групп и в/в однократно вводили: (1), контроль - физиологический раствор, (2) - ДК, нагруженные липоплексами LF/PHK-B16, (3) - 2X3-DOPE/PHK-B16, (4) - 2D3-DOPE/PHK-B16 или (5) Х2-DOPE/PHK-B16.

Оказалось, что ДК вакцины, нагруженные 2X3-DOPE/PHK-B16 и 2D3-

X

* 100 2

Рис. 4.

Антиметастатический эффект ДК, нагруженных РНК-В16 в комплексах с катионными липосомами. Для определения уровня достоверности использовали (-тест критерия Стьюдента, различия при р<0.05 считали статистически

о ............о" достоверными

0 ____

Контроль LF 2X3-DOPE 2D3-DOPE X2-DOPE

DOPE/PHK-B16, вызывают значительное снижение количества легочных метастазов - в 3-5 раз по сравнению с контрольной группой (р=0.0003 и /3=0.00002) и в 1.9-2.8 раза по сравнению с группой животных, получавшей ДК, нагруженные LF/PHK-B16 (р=0.05, Рис. 4). Мыши, получавшие ДК, нагруженные X2-DOPE/PHK-B16, имели большое количество легочных метастазов, близкое к показателям контрольной группы.

Таким образом, показано, что подавление уровня развития метастазов коррелирует с числом трансфицированных ¡тДК и эффективностью экспрессии трансгена, что указывает на прямую зависимость между эффективностью трансфекции ДК, уровнями презентации антигена и интенсивностью иммунного противоопухолевого ответа.

3.2.5. Влияние липоплексов катионных липосом с РНК-В16 на иммуномодулирующие свойства ДК

Продукция ДК провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1а и ИЛ-6) и интерферонов (ИФН-а и ИФН-у) была оценена через 48 ч после нагрузки ДК РНК-В16 в комплексах с катионными липосомами in vitro. Показано, что все исследованные липосомы приводили к увеличению продукции ДК цитокинов -маркеров созревания: ИЛ-6 в 6-8 раз, ИФН-у в 1.6-2.3 раза и ФНО-а в 1.5-1.8 раза по сравнению с ДК без стимуляции. Кроме того, наблюдалось незначительное

повышение уровня ИЛ-la (до 1.6 раз) и ИФН-a (до 2-3 раза) по сравнению с ДК без стимуляции.

Уровни тех же цитокинов были определены в сыворотке крови животных с меланомой В16 после лечения ДК, нагруженными липоплексами. Введение ДК, нагруженных РНК-В16 в комплексах с 2X3-DOPE, 2D3-DOPE и X2-DOPE, приводило к увеличению уровня ИЛ-la в 1.7, 2.3 и 3 раза, соответственно, по сравнению с контрольной группой (р=0.023, />=0.018 и />=0.05), который в организме играет роль сигнала, способствующего миграции ДК из периферических тканей в лимфатические узлы. Статистически достоверное увеличение продукции про-воспалительных цитокинов ИЛ-6 и ФНО-а относительно контроля наблюдалось только в случае ДК, нагруженных Х2-DOPE/PHK-B16, что коррелировало с отсутствием антиметастатического эффекта в данной группе животных. Введение ДК, нагруженных липоплексами, не влияло на уровень интерферонов.

Таким образом, было показано, что как in vitro, так и in vivo наиболее эффективными оказались катионные липосомы 2X3-DOPE и 2D3-DOPE, содержащие катионные липиды на основе спермина и двух остатков холестерина или диглицерида, соответственно. Данные липосомы были выбраны для разработки на их основе систем селективной доставки в ДК.

3.3. Исследование маннозилированных катионных липосом, адресованных к маннозным рецепторы ДК

3.3.1. Состав маннозилированных липосом

В качестве основы для разработки таргетных маннозилированных липосом (МЛ), направленных на маннозные рецепторы ДК, были выбраны липосомы 2X3-DOPE. Структуры компонентов МЛ представлены на Рис. 5.

Липосомы 2X3-DOPE (далее контрольные липосомы), состояли из катионного липида 2X3 (1,26-Бис(холест-5-ен-3|}-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид) и цвиттер-ионного липида-

хелпера DOPE (1,2-диолеоил-.$и-глицеро-3-фософэтаноламин), взятых в мол. отношении 1:2. Таргетные MJI состояли из липидов 2X3 и DOPE (1:2 мол. отношение) с добавлением 2.5, 5 или 10% мол. маннозилированных липоконъюгатов 1 (липосомы Ml, М2, МЗ, соответственно) или 2 (липосомы М4, М5, Мб, соответственно).

Маннозилированные липоконъюгаты содержали остаток D-маннозы, соединенный с диалкилглицерином через сукцинильный (липоконъюгат 1) или скваратный (липоконъюгат 2) линкеры, значительно отличающиеся друг от друга гибкостью и пространственной структурой.

3.3.2. Физико-химические характеристики MJI и липоплексов

Были оценены гидродинамический диаметр (Рис. 6) и поверхностный заряд МЛ и липоплексов МЛ с плазмидной ДНК pEGFP-C2. Средний диаметр контрольных липосом 2X3-DOPE составлял 40 нм (Рис. 6, N/P=l/-). Липосомы Ml - Мб обладали большим размером по сравнению с 2X3-DOPE: самым большим размером (около 120 нм) обладали липосомы Ml - МЗ, содержащие липоконъюгат 1, причем количество липоконъюгата не влияло на размер липосом. Размер липосом М4 - Мб постепенно уменьшался со 100 нм до 54 нм с увеличением содержания липоконъюгата 2 в липосомах и был близок к диаметру 2X3-DOPE (Рис. 6, N/P=l/-).

s 20«

I „

Ml i \ ■ А М2 МЗ : А J \ I А : . 1 . \ J

М4 : ^"V* r М5 А J \ Мб

■

к- 1/2 1/1 1/1 4П 6/1 8/1 10/1 !/- 1/2 I/I VI 4/1 6/1 8/1 lft'1 1/. 1/2 1/1 1/1 4/1 6/1 8/1 10/1 N/P

Рис. 6 Гидродинамический диаметр липоплексов, сформированных из катионных маннозилированных липосом и pEGFP-C2. N/P=l/-: пустые липосомы.

1/- 1/2 1/1 2/1 4/1 6/1 8/1 |«/1 N/P

Средний размер липоплексов 2X3-DOPE/pEGFP постепенно уменьшался с увеличением соотношения N/P (до 57 нм при N/P 10/1, Рис. 6). Похожая тенденция наблюдалась для липоплексов Ml-M6/pEGFP. Однако при N/P 2/1 наблюдалось отчетливое увеличение размера липоплексов (до 8-9 раз). При N/P 2/1 МЛ формировали с pEGFP-C2 огромные липоплексы, чей размер снижался с

-925 нм до -600 нм (для Ml -МЗ) и с -370 до -219 нм (для М4-М6) при увеличении содержания маннозилированных липоконъюгатов в MJI (Рис. 6). Начиная с N/P 4/1 размеры и индексы полидисперсности липоплексов уменьшались, что указывает на образование более мелких и упорядоченных по размеру частиц. По-видимому, при N/P 2/1 липоконъюгат 1 (гораздо в большей степени, чем 2) существенно нарушает структуру сформированных липоплексов и не обеспечивает эффективную компактизацию ДНК. С увеличением содержания липоконъюгатов 1 и 2 в липосомах это нарушение исчезает, и образуются мелкие компактные частицы.

Липоплексы, сформированные при низких N/P 1/2 и 1/1, имели отрицательный поверхностный заряд, который становился положительным при увеличении N/P до 2/1. При высоких N/P (8/1 и 10/1) формировались очень компактные липоплексы с наиболее высокими положительными зарядами.

3.3.3. Исследование специфичности взаимодействия МЛ с конканавалином А

Конканавалин А (КонА) является растительным аналогом маннозного рецептора, имеющим четыре сайта связывания с D-маннозой. Агглютинация МЛ с КонА позволяет исследовать доступность остатков D-маннозы в составе МЛ для маннозных рецепторов ДК (Рис. 7).

-&-М4

Лшшсвмы

2X3 (8.7*0.2)* Ш'1

Mi (3.0*0.1)хМГ'

М2 (5.2±0.2>*i0J

МЗ (11.1±0.3)хЮ!

М4 (З.бхО.МхЮ'

М5 (68±0.1)х|0°

Мб

Рис. 7. А, Б. Кинетика формирования комплексов МЛ с КонА. В. Эффективные константы скорости формирования комплексов КонА-МЛ (к). Для расчета к использовали формулу: ОД = а + бе ", где к - эффективная константа скорости образования комплексов, (- время.

Все МЛ, а также контрольные липосомы, эффективно связывались с КонА (Рис. 7). С увеличением количества маннозилированных липоконъюгатов 1 или 2 в составе МЛ с 2.5% мол. до 10% мол. эффективная константа скорости к увеличивалась с З.ОхЮ"3 до 11.1x10" с"1 для М1-МЗ (сукцинильный линкер) и с 3.6><1 (Г3 до 7.4х10"3 с"1 для М4-М6 (скваратный линкер) (Рис. 7В). Контрольные липосомы 2ХЗ-ООРЕ обладали значительной аффинностью к КонА (¿=8.7хЮ 3 с" '), несмотря на отсутствие остатков маннозы в их составе. Это объясняется тем,

9

что КонА является кислым белком (изоэлектрическая точка КонА pH 4.5-5.5) и содержит большое количество отрицательно заряженных аминокислот, способных электростатически взаимодействовать с катионными липосомами.

Добавление избытка D-маннозы к комплексам 2X3-DOPE/KohA практически не влияло на связывание липосом с белком, что указывает на неспецифические взаимодействия между 2X3-DOPE и КонА (Рис. 7А,Б). MJI связывались с КонА более специфично: добавление избытка D-маннозы к MJI/КонА приводило к резкому падению мутности раствора. Величина падения мутности коррелировала с содержанием маннозилированных липоконъюгатов в составе МЛ (Рис. 7А,Б).

Таким образом, все исследуемые МЛ были способны специфично связываться с аналогом маннозного рецептора и могли быть использованы для рецептор-опосредуемой доставки НК в ДК.

3.3.4. Характеристика ДК

Показано, что экспрессия маннозных рецепторов (CD206) наблюдалась у 4% преДК, тогда как в процессе их созревания в ¡тДК количество клеток увеличивалось до 45%. Обработка ¡шДК как пустыми липосомами 2X3-DOPE и Мб, так и их липоплексами с РНК приводила к увеличению содержания маркеров созревания CD80, CD83, CD86 и МНС II на поверхности ДК, что является важной характеристикой их активации.

3.3.5. Доставка плазмидной ДНКpEGFP-C2 в преДКи ¡тДК с помощью MJJ

Все МЛ обладали значительно большей эффективностью трансфекции

pEGFP в преДК и ¡щЦК по сравнению с LF (TE/MFI = 5% / 0.1 RFU) (Рис. 8).

При N/P 1/1 заряды липоплексов являются отрицательными (от -22 мВ для МЗ до -10 мВ для М2), при N/P 2/1 становятся близки к нейтральным (-2.5 мВ) или умеренно положительным (от +37 мВ для М5 до +44 мВ для МЗ). При таких зарядах предположительно будет превалировать таргетная рецептор-опосредованная доставка. Действительно, MFI при доставке pEGFP в преДК с помощью Ml, М2, МЗ и Мб при N/P 1/1 и 2/1 в два раза выше по сравнению с контрольными липосомами 2X3-DOPE (Рис. 8Б). Однако наблюдаемая при этом MFI и, что более важно, количество EGFP" клеток слишком малы (0.7 RFU и 12%) для достижения необходимого уровня трансфекции ДК in vitro.

Липоплексы, сформированные при высоких N/P (от 4/1 до 10/1), имеют больший положительный заряд (до +66.3 мВ для Мб), поэтому доставка pEGFP в клетки происходит за счет электростатических взаимодействий с незначительным вкладом рецептор-опосредованного эндоцитоза. Действительно, при данных N/P разница в ТЕ между 2X3-DOPE и МЛ не превышала 10% (Рис. 8А). При увеличении N/P наблюдалось увеличение ТЕ и MFI. Три МЛ из шести исследованных - липосомы М4, М5 и Мб - в 1.2-1.4 раза более эффективно доставляли pEGFP в преДК при высоких N/P по сравнению с 2X3-DOPE и липосомами Ml - МЗ (Рис. 8Б), однако MFI не отличалась.

A so

ф

1 50

Е # 40 % *

|Е»

О 5 20 § 10 0

Б 2

1.»

1.» Э М

04

0.2 О

Рис. 8. Доставка pEGFP-C2 в преДК (А, Б) и ¡шДК (В, Г) с помощью МЛ. Количество флуоресцентных клеток и интенсивность флуоресценции оценивали через 48 ч после трансфекции с помощью проточной цитометрии. Данные представлены как MEANiS.E.M.

При доставке pEGFP с помощью MJI в ¡шДК с большим содержанием маннозных рецепторов было показано, что при N/P 4/1 MJI обладали одинаковыми или более низкими (для М2 и МЗ) уровнями трансфекции по сравнению с 2X3-DOPE: 23%/1.2 RFU (Рис. 8В,Г). При увеличении N/P наблюдалось усиление ТЕ для всех MJT: 30-36% /1.2-1.4 RFU, однако, результаты не отличались от 2X3-DOPE.

3.3.6. Доставка PHK-EGFP в преДК и тДК с помощью МЛ

Доставку PHK-EGFP в комплексах с MJI осуществляли при низких N/P 1/1 и 2/1. При данных N/P главным возможным механизмом трансфекции РНК является рецептор-опосредованный эндоцитоз. При N/P 1/1 МЗ наиболее эффективно доставляли PHK-EGFP в преДК по сравнению с другими MJI и 2X3-DOPE: TE/MFI 33%/3.5 RFU (Рис. 9А,Б). Другие липоплексы МЛ/PHK-EGFP при N/P 1/1 не отличались по ТЕ от 2X3-DOPE: 20% /1.6 RFU. Увеличение N/P привело к повышению ТЕ для всех исследованных МЛ, однако их ТЕ не превышала значения для контрольных липосом 2X3-DOPE (Рис. 9А.Б).

Доставка PHK-EGFP в ¡гпДК с помощью МЛ при N/P 2/1 показала, что липосомы Ml, М4-М6 обладали высоким уровнем ТЕ (40-45%), сравнимым с 2X3-DOPE (Рис. 9В,Г). Однако уровень MFI для клеток, трансфицированных 2X3-DOPE, был в 1.4 раза ниже. Липосомы МЗ, содержащие 10% мол. липоконъюгата 1 с сукцинильным линкером, оказались наименее эффективными для доставки РНК в ¡тДК.

Рис. 9. Доставка PHK-EGFP в преДК (А, Б) и ¡тДК (В, Г) с помощью МЛ. Данные представлены как MEAN±S.E.M.

3.3.7. Подавление роста метастазов на модели метастатической меланомы В16мыши с помощью ДК, нагруженных липоплексами MJI/PHK-B16 ex vivo

Клетки меланомы В16 (100 тыс кл.) трансплантировали мышам С57В1/6 в/в. На 4 день после трансплантации мышей делили на семь групп, которые получали однократные в/в инъекции: группа 1 (контроль, w/t) - PBS; группы 2-7 - ДК, нагруженные РНК-В16 в комплексах с липосомами 2X3-DOPE, Ml, М2, М4, М5 и Мб, соответственно. Липосомы МЗ не исследовали в эксперименте in vivo вследствие низкой ТЕ in vitro.

—¡-, Рис. 10. Антиметастати-

ческий эффект ДК, нагруженных РНК-В16 в комплексах с MJI, на модели меланомы В16. Для определения уровня достоверности использовали однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием наименьшей значимости Фишера (Fisher LSD).

I 140 5 120

i 20 I 0

5619 46124 О 31117 О

• • ^ О 2418

13*3 _о_ О О - 11±2 913

-ар- _ ч>\ о О

Иммунизация мышей ДК, нагруженными липоплексами 2ХЗ-ООРЕ/РНК-В16, М5/РНК-В16 и М6/РНК-В16, приводила к значительному снижению количества легочных метастазов - в 4.3, 5 и 6.3 раза по сравнению с контролем, соответственно 0=0.008, р=0.007 и />=0.005, Рис. 10). Количество метастазов у мышей, получавших инъекции ДК, нагруженных М4/РНК-В16, было в 2.3 раза ниже по сравнению с контролем 0=0.035, Рис. 10). В группе мышей, получавших ДК, нагруженные М1/РНК-В 16 или М2/РНК-В16, количество метастазов было высоким и приближалось к значению контрольной группы.

12

Такие ДК-вакцины не вызывали у животных изменения уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 р, ИЛ-6, ГМ-КСФ и ФНО-а), а также цитокинов, специфичных как для ТЫ (ИЛ-12, ИЛ-2, ИФН-у), так и для ТЬ2 (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-5) ответов.

3.3.8. Аллостимуляторная активность ДК, нагруженных липоплексами

ДК, нагруженные 2ХЗ-ООРЕ/РНК-В16 или М6/РНК-В16, ссаживали с аллогенными спленоцитами и через 24 ч оценивали пролиферацию спленоцитов. Данные ДК обладали высокой стимуляторной активностью и усиливали пролиферацию спленоцитов в 1.9-2 раза по сравнению с нестимулированными ДК (р=0.014 и р=0.02, Рис. 11) и с ЛПС ¿7=0.038 и р=0.05, Рис. 11). ДК, обработанные пустыми липосомами 2ХЗ-ООРЕ или Мб, также эффективно стимулировали пролиферацию спленоцитов, однако отличия были статистически недостоверными по сравнению с нестимулированными ДК и ДК, обработанными ЛПС. Таким образом, катионные липосомы имеют существенное значение для стимуляторной активности ДК. Добавление 10% мол. маннозилированных липоконъюгатов в состав 2ХЗ-ООРЕ (Мб липосомы) не влияло на стимуляторную активность ДК по сравнению с 2X3-БОРЕ.

Рис. 11. Индекс пролиферации (PI) спленоцитов после стимуляции ДК, нагруженными липоплексами. Уровень пролиферации (PI) спленоцитов в отсутствие стимуляторных ДК взят за 1 относительную единицу (о.е.). Уровень достоверности определяли с помощью t-теста Стьюдента.

in vivo под действием липоплексов МЛ/УНК-ШЬ

Липоплексы 2X3-DOPE/PHK-B16, М5/РНК-В16 и М6/РНК-В16 вводили в/в здоровым мышам С57В1/6. На 7 день после введения получали спленоциты, проводили их рестимуляцию с помощью лизата клеток меланомы В16 в присутствии ИЛ-2 в течение 4 дней и оценивали цитотоксичность против клеток меланомы В16 (Рис. 12).

Липоплексы М6/РНК-В16, содержащие 10% мол. маннозилированного липоконъюгата 2, индуцировали клон ЦТЛ с эффективность специфического лизиса клеток меланомы В16, который был в 2.2 и 1.7 раз выше по сравнению с нестимулированными спленоцитами и 2X3-DOPE, соответственно (соотношение эффекторные клетки / таргетные клетки = 20/1). Интенсивность ЦТЛ ответа в случае 2X3-DOPE и М5, содержащих 5% мол. маннозилированного липоконъюгата 2, значительно не отличалась от контрольного уровня.

4 ■

3.5 •

3 ■

2.5 •

2 ■

1.5 ■ 1

0.5

é\

р=0 02

**005

nh

wls ЛПС РНК 2ХМЮРЕ/ Мб/РНК 2X3-DOPE Мб РНК

3.3.9. Активация опухоль-специфических ЦТЛ

Рис. 12. Лизис клеток меланомы В16 специфически активированными спленоцитами. Базовая линия (пунктирная): неспецифический лизис клеток В16 спленоцитами, выделенными из контрольных животных, получавших инъекции Opti-MEM (контроль), уровень базовой линии не превышал 7-10%. Э/Т отношение - соотношение эффекторные клетки (спленоциты) / таргетные клетки (клетки В16).

3.4. Исследование эффективности профилактических и терапевтических ДК вакцин в лечении опухолей

3.4.1. Экспериментальные модели и схемы лечения опухолей с помощью ДК

Использовали три опухолевые модели: аденокарциному Кребс-2 (Кребс-2, неметастазирующая опухоль с первичным узлом), меланому В16 (опухоль без первичного опухолевого узла с метастазами в легких) и карциному легких Льюис (LLC, опухоль с первичным опухолевым узлом и метастазами в легких).

ДК вакцины получали из костно-мозговых преДК культивированием в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-4 с последующей нагрузкой ¡тДК ОАГ. Для нагрузки ДК использовали источники множества ОАГ, а именно лизат опухолевых клеток и суммарную опухолевую РНК. В качестве трансфектантов для доставки РНК в ДК использовали коммерческий препарат LF или катионные липосомы 2D3-DOPE (Рис. 1). Степень активации ДК после обработки липоплексами LF/PHK или 2D3-DOPE/PHK оценивали по увеличению экспрессии маркеров созревания CD80, CD83 и CD86.

В режиме профилактической вакцинации в моделях опухолей Кребс-2 и LLC мыши были однократно в/в иммунизированы ДК вакцинами за 7 дней до трансплантации опухоли. В модели меланомы В16 использовали одну или две ДК вакцинации с недельным интервалом между ними - первую вакцину вводили за 14 дней до трансплантации опухоли, ревакцинацию осуществляли за 7 дней до трансплантации опухоли.

В режиме терапевтической вакцинации животные-опухоленосители получали в/в инъекции ДК вакцин на 4 день после трансплантации опухоли, ревакцинацию мышей в модели меланомы В16 проводили на 11 день развития опухоли, через неделю после первой ДК вакцинации.

3.4.2. Сравнение противоопухолевой активности профилактической и терапевтической схем лечения ДК на различных опухолевых моделях

Эффективность противоопухолевого ответа при профилактической и терапевтической ДК вакцинации представлена на Рис. 13. Тип вакцины для моделей Кребс-2 и LLC приведен как С/Т/А - схема (1 - профилактическая, 2 -терапевтическая)/трансфектант/источник антигена, для модели меланомы В16 тип вакцины приведен как С-И/Т/А - схема (1 - профилактическая, 2 - терапевти-

1/1 5/1 10/1 20/1 1/1 5/1 10/1 20/1 1/1 5/110/1 20/1 Э/Т

мб

отношение

12 14 Дни

-O-W/t I

2/LF р=оюв -«-2/LF/PHK I -- 2/лизат

13 15

Дни

СГГ /А

w/t 1-1 1-2 2-1 2-2 СИ

/2D3/PHK /2D3/PHK /203/РНК /2D3/PHK 'Т/А

Рис. 13. Эффективность ДК вакцин. А и Б. Подавление скорости роста Кребс-2 под действием профилактических и терапевтических ДК вакцин, соответственно, w/t - контроль, животные с Кребс-2, получавшие инъекции PBS. В и Г. Подавление скорости роста и метастазирования LLC под действием ДК вакцин, w/t - контроль, животные с LLC, получавшие инъекции PBS. Тип ДК вакцины для А-Г представлен в виде С/Т/А - схема (1 - профилактическая, 2 -терапевтическая)/трансфектант/источник антигена. Д. Ингибирование метастазирования меланомы В16 под действием ДК вакцин. Тип ДК вакцины представлен в виде С-И/Т/А - схема (1 - профилактическая, 2 - терапевтическая) - количество иммунизаций/трансфектант/источник антигена, w/t - контроль, животные с меланомой В16, получавшие инъекции PBS.

ческая) - количество иммунизаций/трансфектант/источник антигена.

В модели Кребс-2 профилактические вакцины на основе как РНК, так и лизата были неэффективны и не влияли на рост опухоли (Рис 13А). Введение терапевтической ДК вакцины на основе РНК (2/LF/PHK) мышам с Кребс-2 приводило к заметному подавлению роста опухоли в 1.9 раз по сравнению с контрольной группой без лечения (w/t) {р=0.036), тогда как терапевтическая вакцина на основе лизата (2/лизат) была слабо иммуногенной (Рис. 13Б).

В модели LLC использовали ДК вакцины на основе РНК. В качестве трансфектантов использовали LF и катионные липосомы 2D3-DOPE. В группе животных, получавших профилактическую ДК вакцину 1/2D3/PHK, наблюдалось двукратное снижение скорости роста опухоли по сравнению с контролем (/>=0.009, Рис. 13В). В этой же группе животных наблюдался наиболее эффективный антиметастатический ответ - снижение количества легочных метастазов в 4.7 раз относительно контроля (р=0.0004, Рис. 13Г). Терапевтическая вакцинация мышей-опухоленосителей такой же вакциной (2/2D3/PHK) приводила к 2.3-кратному снижению количества метастазов по сравнению с контролем (р=0.003, Рис. 13Г), однако не вызывала подавления роста первичной опухоли (Рис. 13В). Лечение животных как профилактической, так и терапевтической ДК вакциной с использованием LF в качестве трансфектанта не приводило к достоверному снижению скорости роста опухоли, однако наблюдалось 1.5-кратное снижение количества метастазов по сравнению с контролем (р=0.02 и р=0.045 для 1/LF/PHK и 2/LF/PHK, соответственно, Рис.13Г).

В модели меланомы В16 ДК вакцины состояли из ДК, трансфицированных липоплексами 2D3-DOPE/PHK-B16. Однократная профилактическая вакцинация 1-1/2D3/PHK оказалась наиболее эффективной и приводила к снижению количества легочных метастазов в 10 раз по сравнению с контролем (р=0.018, Рис. 13Д). Двукратная профилактическая вакцина 1-2/2D3/PHK, обладала меньшим антиметастатическим потенциалом: наблюдалось ингибирование метастазирования в 1.5-2 раза (данные статистически не достоверны, Рис. 13Д). Следует отметить, что как в профилактической, так и в терапевтической схемах лечения двукратная иммунизация ДК была менее эффективной по сравнению с однократной ДК вакциной.

3.4.3. Иммунологические характеристики организма-опухоленосителя после лечения профилактическими и терапевтическими ДК вакцинами.

Было исследовано соотношение CD4+/CD8+ клеток в селезенках животных с Кребс-2, получавших профилактические и терапевтические ДК вакцины, отражающее баланс между Т-хелперным и ЦТЛ ответами (Рис. 14). Количество CD4+ и CD8+ клеток в точках -7 день (Рис. 14А-Г) и 0 день (Рис. 14Д-3) измеряли до введения ДК вакцин и трансплантации опухоли (здоровые животные), которое составило 18% и 19%, соответственно.

Количество CD41' клеток в контрольной группе профилактической схемы (животные с Кребс-2, получавшие инъекции PBS, 19 день развития опухоли) слабо изменялось в ходе развития опухоли (Рис. 14А). Все профилактические вакцины 1/LF, 1/LF/PHK, 1/лизат вызывали двукратное увеличение содержания CD4+ клеток на 7-ой день после введения ДК вакцин (день трансплантации опухоли) вне зависимости от источника антигена (Рис. 14Б,В,Г). К окончанию эксперимента (день 19) количество CD4" клеток снижалось до 18-22% (Рис. 14Б-Г). Количество CD8 клеток слабо снижалось с 19% (базовый уровень) до 13-17% на 19 день развития опухоли во всех экспериментальных группах, включая контроль (Рис. 14А-Г).

Количество CD4" клеток в контрольной группе терапевтической схемы (жи-

16

Рис. 14. Количество CD4+ и CD8+ клеток в селезенках животных с Кребс-2, получавших лечение профилактическими и терапевтическими ДК вакцинами. A. w/t, контроль, мыши с Кребс-2, получавшие инъекции PBS, 19 день развития опухоли.

Б, В и Г. Мыши, получавшие - профилактические ДК вакцины 1/LF, 1/LF/PHK и 1/лизат, соответственно. Д. w/t, контроль, мыши с Кребс-2, получавшие инъекции PBS, 11 день развития опухоли.

Е, Ж и 3. Мыши, получавшие терапевтические ДК вакцины 2/LF, 2/LF/PHK и 2/лизат, соответственно. Количество CD4 и CD8+ клеток в точке -7 день отражает содержание клеток в „" селезенках здоровых мышей

вотные с Кребс-2, получавшие инъекции PBS, 11 день развития опухоли) слабо увеличивалось с 17% (базовый уровень) до 21% в ходе развития опухоли (Рис. 14Д). ДК вакцины 2/LF и 2/LF/PHK не влияли не содержание CD4* клеток (Рис. 14Е,Ж). ДК вакцина 2/лизат снижала количество CD4 клеток до 13% к концу эксперимента (Рис. 143). Количество CD8+ клеток в контрольной группе терапевтической схемы значительно росло с 19% (базовый уровень) до 29% к 11-ому дню (Рис. 14Д). Все терапевтические ДК вакцины 2/LF, 2/LF/PHK и 2/лизат вызывали практически полное исчезновение CD8+ клеток в первый день после введения ДК вакцин (5 день после трансплантации опухоли) (Рис. 14Е-3). Тем не менее, на 7 день после введения ДК (11 день после трансплантации опухоли) количество CD8+ клеток возвратилось к контрольному уровню (22-29%).

Оценка Т-хелперных и провоспалительного ответов показала, что профилактическая ДК вакцина не приводит к статистически значимым изменениям уровня Thl-цитокинов. В случае терапевтической схемы лечения наблюдалось увеличение уровней ИЛ-2 и ИЛ-12 (р40/р70) в группах 2-1/2D3/PHK и 2-2/2D3/PHK, соответственно.

Однако профилактическая ДК вакцина приводила к падению уровня Th2-цитокинов: наблюдалось полное исчезновение ИЛ-4, значительное падение уровня ИЛ-10 и 1.6-кратное снижение концентрации ИЛ-5 в группе 1-1/2D3/PHK (отличия от контроля статистически недостоверны), а также полное исчезновение ИЛ-5 в группе 1-2/2D3/PHK (/7=0.009). Иммунизация животных терапевтическими ДК вакцинами 2-1/2D3/PHK и 2-2/2D3/PHK не приводила к изменениям уровня ТЬ2-цитокинов. Анализ провоспалительного ответа показал 1.3-кратное повышение уровня ИЛ-ip в группе 2-1/2D3/PHK и трехкратное повышение уровня ФНО-а в группе 1-1/2D3/PHK.

17

♦

Кребс-2

t

Кребс-2

3.4.4. Оценка экспрессии транскрипционных факторов Tbet, RORy, GATA3 и Foxp3

Экспрессию транскрипционных факторов Tbet (специфичен для Th 1 ответа), GATA3 (Th2 ответ), RORy (Thl7 ответ) и Foxp3 (Т регуляторные клетки) оценивали в спленоцитах мышей с метастатической меланомой В16, получавших ДК вакцины, с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Рис. 15).

Рис. 15. Уровни экспрессии Tbet, GATA3, RORy и Foxp3 в спленоцитах мышей после ДК вакцинации.

A. Профилактическая схема лечения: здоровые мыши получали ДК вакцины 1-1/2D3/PHK и 1-2/2D3/PHK (однократная и двукратная иммунизация, соответственно). Б. Мыши с метастатической меланомой получавшие инъекции PBS (контроль).

B. Терапевтическая схема лечения: мыши с метастатической меланомой получали ДК вакцины 2-1/2D3/PHK и 2-2/2D3/PHK (однократная и двукратная иммунизация, соответственно). Перечеркнутый квадрат на оси Y отражает уровень экспрессии генов в здоровых интактных мышах (базовая линия).

Показано, что как однократная, так и двукратная профилактические ДК вакцины не оказывали эффекта на уровень GATA3 (Рис. 15А). Увеличение количества профилактических ДК иммунизаций привело к исчезновению Tbet (р=0.0018) и двукратному увеличению уровня RORy (/>=0.04), с чем может быть связано отсутствие эффективности двукратной профилактической ДК вакцины, т.к. поляризация ТЫ7-ответа свидетельствует о развитии аутоиммунных и про-воспалительных реакций в организме. Уровня Foxp3 снижался в 3 раза по сравнению с базовой линией (здоровые животные) (отличия статистически недостоверны) (Рис. 15А).

Однократная терапевтическая иммунизация мышей-опухоленосителей ДК вакциной приводила к увеличению уровня экспрессии Tbet, GATA3 и RORy по сравнению с базовой линией и группой w/t (Рис. 15В,Б). Уровни Tbet и GATA3 увеличивались в 1.3 и 2 раза относительно группы w/t (данные статистически недостоверны). Уровень RORy увеличивался в 5 раз (/7=0.019) по сравнению с группой w/t. Таким образом, увеличение уровней экспрессии RORy и Tbet вместе с увеличенным содержанием некоторых Thl цитокинов в сыворотке крови мышей указывает на то, что одиночная терапевтическая вакцинация модифицированными ДК приводит к поляризации Thl/Thl7 ответа. Уровни экспрессии Tbet, GATA3 и RORy после второй терапевтической ДК иммунизации не отличались от уровней в группе w/t (Рис. 15В,Б). Уровень экспрессии Foxp3 снижался во всех группах животных (данные статистически недостоверны).

А Б В

выводы

1) Исследована трансфекционная активность шести поликатионных липосом, состоящих их катионных липидов на основе спермина и холестерина или диглицерида, и липида-хелпера DOPE, в отношении ДК и способность нагруженных таким образом ДК модулировать эффективный противоопухолевый иммунный ответ. Показано, что:

Липосомы на основе липидов 2X3 (1,26-бис(холест-5-ен-Зр-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид) и 2D3 (1,26-бис( 1,2-ди-0-тетрадецил-гас-глицерин)-7,11,16,20-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид) наиболее эффективно доставляют ДНК и РНК в предшественники ДК и незрелые ДК мыши.

- Вакцины, полученные путем трансфекции ДК суммарной опухолевой РНК в комплексах с данными липосомами, опосредуют запуск эффективного противоопухолевого ответа у мышей с метастатической меланомой В16, что выражается в 5-кратном снижении количества метастазов и отсутствии активации про-воспапительного ответа.

2) Исследована доставка в ДК плазмидной ДНК и РНК, кодирующей опухолевые антигены, с помощью «адресных» поликатионных липосом на основе липосом 2X3-DOPE, направленных к маннозным рецепторам на поверхности дендритных клеток. Показано, что:

- Добавление в состав липосом 2X3-DOPE 10% маннозилированных липоконъюгатов с диэтилскваратным линкером (липосомы Мб), приводит к повышению эффективности доставки РНК в незрелые ДК и усилению антиметастатического потенциала такой ДК вакцины на модели метастатической меланомы В16.

- При системном введении лабораторным животным комплексов суммарной опухолевой РНК клеток меланомы В16 с липосомами Мб наблюдалась в два раза более эффективная активация анти-В16 цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с контрольными липосомами 2X3-DOPE.

3) Исследована противоопухолевая эффективность ДК вакцин, содержащих в качестве источника антигена опухолевый лизат или РНК, при лечении по профилактической и терапевтической схемам. Показано, что:

- Наиболее эффективные ДК вакцины получены с использованием в качестве источника антигена опухолевой РНК;

- Профилактическая схема лечения ДК вакцинами наиболее эффективна в отношении высокоагрессивных метастазирующих опухолей (карцинома легких Льюис, меланома В16), тогда как терапевтическая схема ДК вакцинации была эффективна в отношении неметастазирующей опухоли (Кребс-2).

- При лечении по профилактической или по терапевтической схемам происходит поляризация Thl7 или ТЫ/ТЫ7 иммунных ответов, соответственно. При этом не наблюдается активации регуляторных Т-клеток.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1) Markov, О.V., Mironova, N.L., Maslov, М.А., Petukhov, I.A., Morozova, N.G., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A. Novel cationic liposomes provide highly efficient delivery of DNA and RNA into dendritic cell progenitors and their immature offsets // J. Control. Release. - 2012. - V. 160. - P. 200-210.

2) Markov, O.V., Mironova, N.L., Shmendel, E.V., Serikov, R.N., Morozova, N.G., Maslov, M.A., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A. Multicomponent mannose-containing liposomes efficiently deliver RNA in murine immature dendritic cells and provide productive anti-tumour response in murine melanoma model // J. Control. Release. - 2015. - V. 213. - P. 45-56.

3) Markov, O.V., Mironova, N.L., Sennikov, S.V., Vlassov, V.V., Zenkova, M.A. Prophylactic dendritic cell-based vaccines efficiently inhibit metastases in murine metastatic melanoma // PLoS ONE. - 2015. - V. 10. - P. e0136911. doi: 10.1371 /joumal.pone.0136911

2015671179

2015671179