Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск продуцентов мацерирующих ферментов и путей их экскреции иммобилизованными клетками микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Поиск продуцентов мацерирующих ферментов и путей их экскреции иммобилизованными клетками микроорганизмов"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДШИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 679:577.15ь57.083.

БЕЛХОДЖАЕВА АЛМАГУЛЬ АЛИМВЕКОВНА поиск продуцентов млцерируюцдих ФЕРМЕНТОВ

и путей их экскреции иммобилизованными

клетками микроорганизмов 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алматы 1995

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии HAH PK. Отдельные этапы работы проведены в Казахском НИИ онко-, догии и радиологии Минздрава PK, в Институте ботаники и фито-интродукции HAH PK.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - доктор биологических наук,

Р.К. Б8НЕВА

ОШЦШЬНЬЕ ОППОНЕЩЫ - доктор биологических наук,

профессор И. Г. САУШЮВА - кандидат биологических наук, доцент A.A. КУВАНОВА

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Институт пищевой промышленности

Казахской Академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится " " 1995г. в " " часов на

Заседании специализированного Совета Д 53.24.01 при Институте микробиологии и вирусологии HAH PK по адресу: 480100, Алматы, ул. Богенбай-батыра, 103.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии HAH PK.

Автореферат разослан " " 1995г.

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор биологических наук

Н. А.Айтхохина

ОБЯЗАН ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Астуаяьность проблемы. Синтез ферментов микроорганизмами основывается на испояьзавалили высокоактивных продуцентов и арименении новых эффективных биотехнологических процессов. В этих процессах широкое использование кашли различные микроорганизмы - продуценты разнообразных ферментов, в том числе ма-иеркрущих Ферментов (К№), ответственных за вымачивание лубо-волохнисткх культур (лька, кенафа, конопли), ва ускорение и пшшс uu' и таЬшэных масел, соков из фрук-

тоз :i оЕс^и. За ™"pr>,,r> wi'-iiiAj^iyu.^;:; ~;««пош» „„

для получения "жидких овощей и фруктов". В литературе инсятск сведения о наличии ферментов, которые обладают способность!!? не только разжижать ткани растений, но и мацерироватъ ее па отдельные клетки, у нескольких видов - Rhlzopus sp., Aspergillus japonlcus, Cortriclum praticola, Erwinia atroceptlca, Pemcillium digitatum (Harada, Toyama, 1966; Holl, Wood, 1974; Tshii. 19','6: Михайлова, 1S95).

способность расщеплять растительную ткань до отделыя« клеток используют для получения клонов, Полученные та;п:ы путем кяотки растений используют с последующей иммобилизацией в биотехнологии. Яокззало, что активность Ш находится в тесной овязк с летальность» микроорганизмов, вызывающих различите заболегшшя растений (Tartabe et л1 1984; Shnrma, iSCG; ¡ß'Vj.-.-.. KüK'.Wil-'hi, лОв1"') .

Отсутструет однозначная точка зрения относительно механизма мацерации растите л. ней ткани, природы цементов, 'сгвсча-кш: •. й.1 ->тот проищет.. У различны-: м^згсоргяямямов действующее иачз.:': игшерэцик могтет быть присущ? рпзкоо^раздмм нектинрло-¡цепляющим (TP) ферментам: пектатлиазе (ПКл), «екталлшэе (ПЛ), полигалактуроназе (ПГ) и т.д., одному из них или комплетззу ферментов (Tanabe, Kobayashl, 1987b; Schleiraer et al.„ 1987; Чернов и др., 1991, Шевчик и др. 1902). Только некоторые из микрорганизмов, продуцирующих ПР фермент^, способны к мацерации растительной ткани. В нашей республике отсутствует производство MS и существует значительная потребность в них в различных отраслях промышленности, связанных с переработкой растительного сырья. Поэтому поиск активного продуцента среди различных групп микрорганизмов представляет практический и

теоретический интерес.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в поиске и отборе высокоактивных продуцентов МФ, изучении их физиолого-биохимических характеристик, выявлении оптимальных условий культивирования продуцентов с использованием методов иммобилизации.

Были поставлены следующие задачи:

- проведение поиска и отбора высокопродуктивных продуцентов МФ среди разнообразных групп про- и эукариотов, выделенных ив природы и из музейных штаммов коллекции ИМВ HAH РК;

- иммобилизация продуцентов, изучение условий культивирования свободных (СК) и иммобилизованных (ИК) клеток;

- подбор среды для производственного получения МФ иммобилизованными клетками отобранной культуры;

- разработка оптимальных условий культивирования для увеличения биосинтеза, экскреции МФ и других ПР ферментов иммобилизованными клетками;

- испытание действия КЖ иммобилизованной культуры А. awamori 16 на корм домашней птицы.

Научная новизна работы. В результате поиска продуцента К® среди прокариотных и эукариотных микроорганизмов, выделенных из природы, впервые были описаны в качестве продуцентов две культуры Aspergillus sparsus и Pénicillium chrysogenum.

Впервые для скрининга культур применен метод культивирования продуцентов в иммобилизованном состоянии. У Aspergillus awamori 16 выявлено новое свойство - образование ферментов, расщепляющих растительную ткань до отдельных клеток при рН 3 (Заявка N 940947.1), обладающих арабаназной (АР), арабинофура-ногидролазной (АФГ) и ПГ активностями, в отличие от ранее изученных у этой культуры ПР ферментов, неспособных к мацерации.

Установлены общие закономерности, различия в развитии свободного и иммобилизованного мицелия A. awamori 16 в процессе биосинтеза Ш, ПГ и выявлены преимущества культивирования ИК относительно СК.

Достигнута сверхэкскреция МФ и других ПР ферментов при периодической обработке мицелия при +4°С и -10°С, в условиях адсорбционной иммобилизации продуцента.

Практическая ценность работы. Предложена технологическая схема производственного получения МФ, включающая адсорбционную

- б -

иммобилизацию клеток A. awanori 16, культивирование на модифицированной среде, которая учитывает потребности ИК в источнике ;во?£ i; индукторе пектине количественно отлтающиеся от пот-ройносъеЛ СК. "'пособствует повшюшяо выхода К®.

Разработан новый метод длительного хранения культур (Д.с. N17?!?4?0) способствующий повышению активности ферментов, стабильности уровня их биосинтеза и сверхэкскреции ферментов в Г-1? prui 'ч3аяшса N940951.1).

Разработан ноьый способ (Пат N397) применения КЖ А. awamori 16 для обработки грубого корма домашней птииу, с целью i.^^z::::.- """"-т^. :* уа^твишп ппивеса пти-

цы на 19,3%, экономии расход« на лпимпе&ь»

неспособности цыплят и проявлению профилактического эффекта резистентности к колибактериозу.

На зааиту выносятся положения: - способность A. awamori 16 продуцировать МФ, расщепляющие растительную ткань до отдельных клеток при рН 3, в отличие от изученных ранее у этой культуры ПР ферментов, имеющих оптимум действия рН от 4,3 до 8,0 и неспособных к мацерации растительной ткани;

создание новых способов культивирования и хранения продуцентов ферментов, повышающих экскрецию МФ и других ПР ферментов ;

• разработка модифицированной среды, технологической схемы, которые предлагаются для производственного получения КО иммобилизованной культурой A. awamori 16 и использование активных фильтратов КЖ в кормопроизводстве для доматшей птицы, а также для получения отдельных растительных клеток, ттротоплас-

ITV-,п

Апробация диссертационной__работы. Материал» якев^ртагоя»

доложены па Кеедумародиок сшгсвиуме "Физиология иммобилизованных клеток" (Нидерланды, Вагенинген, 1989), на iV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент. 19П8).

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, получены 1 патент к 1 авторское свидетельство, поданы 2 заявки на патент.

Структура и обьем работ».___Диссертация состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, заключения, выводов, списка литературы и

% - е -

приложения; изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицу, 7 рисунков. Список литературы включает 245 источников, в том числе 159 на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами поиска и отбора активных продуцентов К® служили 118 культур, выделенных из поврежденных овощей и фруктов и 6 музейных культур (A. awamori 16; A. niger van Tieghem (ПТЭ-1); A. nlger 355; P. chrysogenum штаммы 39, 245, 246). Продуценты поддерживали на сусло-агаре и на морковном агаре (среде Ролле-на), хранили при 4°С.

Идентификацию микроорганизмов до вида проводили по определителям: Bull. Bur. Anltn. Ind. (1910), Берге (Berge, 1980), Manualand Atlas of the Penlcillla (Ra/nlres, 1982), Аспергиллы (Билай, Коваль, 1988).

При проведении экспериментов по изучению патогенности и токсичности выделенных продуцентов использовали общепринятые методики (Биргер и др.» 1932; Дудка, Вассер, 1982) предложенные сотрудниками института Региональных проблем питания HAH PK.

При поиске продуцентов Ш> первоначально использовали синтетическую среду следующего состава, (в %): (NH^)2SO4 - 0,7; MgS0<i - 0,05; KCl - 0,05; КН2РО4 - 0,1; FeS04 - следы, лактоза - 2,0; пектин - 2,0 (Блиева, 1967). При определении потребностей культур микроорганизмов в отдельных компонентах питательной среды были испытаны различные углеводы, а также смеси углеводов с пектином. В качестве индуктора и субстрата для М5 и других ПР ферментов использовали свекловичный, яблочный пектин, пектовую кислоту, свекловичный жом, картофель. Источниками азота служили неорганические вещества в концентрациях 0,15; 0,30; 0,50; 0,6% по N.

При отработке производственной среды для ИК за основу взяли среду Херсоновой рекомендованную для культивирования CK, имеющую следующий состав (в X): (№14)2204 - 0,6; MgSOí - 0,05; КК2РО4 - 0,1; свекловичный жом - 4,0; солодовые ростки - 1,0.

Культивирование продуцентов проводили в свободном и иммобилизованном состоянии в периодических и полунепрерывных условиях с использованием устройства (A.c. 1047954), на качалке, врашзющейся со скоростью 180-220 об/мин при 26-23°С. Посевным

каториалом и обоих методах культивирования служила водная суспензии ыюр частой культуры, вносимая в количестве ZZ к обьему м-;;,,.- 1700С0-100000 конилий в i мл. В качестве

гтпольаордли белм'инг \Г0СТ 322-53) ïf •■:иу: ~тгл (ГОСТ 1473-71). ilücic адсорбции спор на повлоя->> г-^с-шт. ли'.гп'ельнук! среду и культишропате па качалке.

R голльтурааьиок явдкссти и ферментных препаратах опреде-'V ii- »:.v,--tvpvra\> :.тх.о0но'.'.ть ферментов - качественным (Byrdue, f'iwidirib, i960/ и иолуколнчественным методами (Михайлова и др.,

Л: ПГ, АР - по вискозиметрическому методу Витакора г> моди-™»и.1И„ " чпкги • ПМЭ - по методу Kertesz

Z.J. (1955); ПТЗ - по s«rro/iy Albcr^T» f.. ¡Ulli" " "иг.*,'.. АФГ - по методу Шомодьи-Нельсона (Somogyi, 1952); pH ¡'¿г. с uir-мощыо рН-метра; содержание белка по Лоури (Lowry et al., 1951).

Для достижения сверхэкскреции ферментов использовали методы обработки мицелия, предложенные в разработанных нами способах (A.c. 1775470; Заявка N 940951.1). В первом случае иммобилизованный на подложке мицелий обрабатывали при 4°С в течение 1,5-3 месяца, с последующим культивированием на оптимальной питательной среде. Затем чередовали обработку мицелия с культивированием. Во втором случае иммобилизованный мицелий обрабатывали при -10°С в течение 3; 5; 8; 15 часов с последующим культивированием в течение 72 часов.

Для получения МФ использовали метод высаливания сульфатом аммония и осаждение ферментов из ЮН этиловым спиртом при соотношении (1:3), (1:4). Для обессоливания КЖ и идентификации ферментов применили колонку с сефадексом G-50 ("Pharmacia Fine Chemicals" Uppsala). Размер колонки 4,5-50 см. Элюирование проводили дистиллированной водой. Собирали фракций по 10 мл при скорости здюции ?0 мл/ч. В кавдой фракции определяли наличие МФ, АР, АФГ я ПР ферментов. Изучение влияния pH на активность MS проводили в пределах pH 2-8. Оптимум действия Ь№ выявляли при pH от 2,8 до 3,4. При этом использовали буфер Мак-Илвайна (Досон и др.. 1991). '

Для мацерации овощей и фруктов использовали 1% раствор Ферментов, полученных при осаждении спиртом. В качестве субстрата использовали морковь, томат, сливы, виноград, лук, картофель, груши, капусту.

Испытание действия КЖ A. awamori 16 проводили на 10-су-

точных цыплятах (100 голов). Культуральная жидкость задавалась подопытным птицам в смеси с кормом в дозе 18 единиц ПГ на голову (суточная доза корма 30-50г) с учетом роста цыплят.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ОБРАЗОВАНИЕ МАЦЕРИРУВДИХ ФЕРМЕНТОВ СВОБОДНЫМИ И ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Поиск продуцентов ферментов, ыацерирующих растительные ткани, был проведен среди 118 культур выделенных с пораженных поверхностей овощей. Из них наибольшей способностью, мацериро-вать растительную ткань обладали пять продуцентов представленные в табл. 1. Культура 118 уже через 48 часов проявляла максимальный уровень биосинтеза, расщепляя субстрат в течение 1,5 часов. Культуры 38, 52, 117 проявляли максимум активности на четвертые сутки, 59 - на третьи сутки. Наиболее высокую маце-рирующую способность проявляла культура 38. Две выделенные культуры впервые описаны 'нами, как продуценты МФ - культура под N38, идентифицированная как Aspergillus sparsus, и под N52 - как Pénicillium chrysogenum. В литературе отсутствуют сведения о наличии мацерирующей способности у ферментов, продуцируемых этими видами. Культура 117 причислена к роду Bacillus.

Культуру A. sparsus выделили из разжиженного помидора. МФ КЖ были активными при pH от 2,8 до 4,0 и расщепляли субстрат до отдельных клеток за 0,5 ч. У остальных четырех продуцентов (табл. 1) такая способность расщеплять субстрат до отдельных клеток не проявлялась.

Культуру P. chrysogenum выделили из пораженной клубники. Ферменты КЖ были активны при pH от 3 до 4 и расщепляли диски моркови в течение 2 ч.

По результатам исследований A. sparsus и P. chrysogenum были отнесены к патогенным и вирулентным культурам, также как и 3 остальные. Поэтому у остальных не определяли родовую и видовую принадлежность. Правильность сделанных заключений о па-тогенности и вирулентности, была проверена и подтверждена снс института Региональных проблем питания к.б.н. Фадеевой Л.М.

Поиск продуцента МФ был продолжен и среди музейных культур pp. Aspergillus и Pénicillium (табл. 2). У ферментов КЖ

- э -

Таблица 1

Образование МФ у продуцентов выделенных из природы

N рН реакц. смеси Время протекания реакции (ч) Степень мацерации культуры (+)

38 2,97 0,5 +++++

59 2,67 1.5 ++++

118 3.25 1,5 ++++

52 2,73 2,0 ++++

ft по • Р..Г) ++++

++♦<• - мацвририеани« до ¡;лл:г::17 г ср*л» +++++ - полное мацерирование до отдельных клеток.

Таблица 2

Наличие мацерирующей способности у микромицетов pp. PenlcilHum и Aspergillus

pH КЖ CMC в % от потери сырого веса моркови

Штамм icy ль тур КЖ рН реакционной смеси

4 8

P.chrysogenum 39 7 16,21 18,18 20,17

P.chrysogenurn 245 5 10,38 17,9 0

P.chrysogenum 246 5 0 ' 0 0

A.awamori 16 3 44,0 - -

A.nlger ПТЭ-1 4 10,3 - -

A.niger 355 5 0 0 0.

Таблица 3

Влияние иммобилизации на CMC A. awanori 16 и A. nlger ПТЭ-1

Продуцент CMC в 7. от потери сырого веса

Возраст культуры, сутки

4 7 21

A. awamori 16 A. niger ПТЭ-1 46,28 54,92 71,37 44,16 33,88 49,18

Примечание: с 8 по 18 сутки культуры выдерживали при +4°С.

штамма P. chrysogenum 246 отсутствовала способность к мацерации растительной ткани в кислой и щелочной среде. Ферменты, образованные штаммом 245, проявляли максимум активности при рН 4, а P. chrysogenum штамма 39 при рН 8.

У микромицетов рода Aspergillus способность к биосинтезу М3> была исследована у A. niger 355, A. niger ПТЭ-1, A. awamori 16 (табл. 2). У ферментов КЖ, полученной при культивировании к. niger 355, отсутствовала способность мацерировать субстрат. Ферменты КЖ A. awamori 16 и A. niger ПТЭ-1 растворяли субстрат, причем A, awamori 16 в 4 раза активнее второй. В литературе отсутствуют сведения о наличии у A. awamori 16, A. niger ПТЭ-1 способности к продуцированию Ш>.

В связи с поставленной целью провели отбор продуцента, оптимально адсорбирующегося на бельтинге, пригодного для культивирования разработанным нами методом (А.с. N1775470). Для этого, используя данный способ, провели сравнительное изучение A. awamori 16 и A. niger ПТЭ-1. Культуры оценивали по качествам и свойствам проявленными при иммобилизации. Были использованы следующие критерии оценки :

- возможность иммобилизации на подложке;

- уровень биосинтеза ферментов;

- влияние низких температур на биосинтетическую способность продуцента при иммобилизации.

Обработка ИК A. awamori 16 при 4°С в течение 11 суток способствовала сохранению плотной структуры мицелия, степень мацерирующей способности (CMC) ферментов КЖ возрастала от 55 до 71%. В этих же условиях у A. niger ПТЭ-1 наблюдали лизис мицелия, а мацерирующая способность ферментов КЖ увеличивалась с 33 до 49% (табл. 3). Поскольку A. awamori 16 активно образует Ш (71% мацерации) и формирует на подложке плотную структуру иммобилизованного мицелия, менее подверженного лизису при 4°С в течение длительного времени, в качестве продуцента Ш для дальнейшей работы выбрали A. awamori 16.

Впервые установлено, что оптимальные питательные среды для СК и ИК A. awamori 16 не совпадают в количественном соотношении компонентов, а именно в потреблении индуктора - пектина и источника азота - сульфата аммония. Для культивирования СК необходима концентрация, пектина ZZ (табл. 4). Эта же концентрация у ИК приводила к ингибированию образования ПГ. Опти-

- и -

¡л-ч.;!Ы!ая концентрация пектина для ИК - 0,5%.

СК оптимальное содержание аэота 0,15%. У ИК содержа-.«у рг госрлгтазо пропорционально увеличению в среде количества аэота. для Ж одгимальное содержание аэота 0,5%.

Аналогичные исследования проводили при изучении Оиооинт>-оа Ш.\ При иммобилизации увеличивалось потребление азота. На •.•;п!т>-7ич«скс>й и индефинитной среде ИК образовывали наибольшее i;<.лич>г^тг.о Фермента при концентрации сульфата аммония от 0,5% до 0,6%, а СК - при 0,15?. (табл. 5). Оптимальной концентрацией иг—"'"=> п производственной среде для ИК принята -и, У» -^-"У?

С целью разработки недефицитнси для получения МФ испытывали среду Херсоновой, которая была предложена для промышленного получения ПР ферментов при культивировании СК. Непосредственное присутствие в среде твердых компонентов свекловичного жома 4% и солодовых ростков 1X обеспечивает оптимальную концентрацию индуктора при биосинтез МФ пк. Эти же условия ингибируют образование Ш ИК, снижая CMC до ?"Z. поэтому мы использовали вытяжку из жома и ростков. Максимальное образование фермента наблюдали при 4X концентрации жома и 4-ЙХ ростков в ВНТЯЖКЙ.

Исходя из полученных данных, мы предложили производственную op'»nv для ИК A. awamort 16. содержанию следующие компоненты (л Z):

1. штчжка ил свекловичного жома - 4,0;

у. пнтяжка из сололовнх ростков - 4,0;

3. сульфат аммония - 2,4;

4. -гс^фат кадия олпопам°п!»нннй - 0,1;

•„•VJ-b.fw Mr-« ния - 0,05,

Z. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АДСОРБЦИОННОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ НА ПРО-ЛЛШРП&АНИЕ МИКРСШЙТИЧЕСЮМ ГРИБАМИ. БАКТЕРИЯМИ

МАЦЕРИРУНЩЧ И ДРУГИХ ПЕКТИНРАСЩЕПЛЯЮШИХ ФЕРМЕНТОВ

Нами обработан новый метол длительного хранения микроорганизмов, способствующий повышению активности и экскреции ферментов в 10-17 раз (A.c. 1775470). На основании полученных данных построена диаграмма (рис. 1). интерпретирующая динамику

Таблица 4

Влияние концентрации пектина и азота на активность ПГ у ИК и СК A. awamori 16

Компоненты питательной среды Концентрация, % ПГ по вязкости, ед/мл

СК ИК

Пектин 0,5 0,114 7,9

2,0 0,15? 3,35

Сульфат аммония 0,10 0,174 5,63

- ' •• 0,15 0,175 7,8

0,50 0,162 12,55

Таблица 5

Влияние концентрации сульфата аммония в модифицированной и синтетическом средах на образование Ш> A. awamori 16

Концентрация.сульфата аммония (по азоту), % CMC в % от потери сырого веса

ИК СК

Среды

синтетич. модифициров.

Контроль - 0,15 53,05 84,88 48,23

0,50 59,61 93,47 -

0,60 60,94 97,51 -

0,70 54,72 85,32 -

/ Таблица 6

Влияние чередования обработки ИК при +4еС и культивирования на среде на CMC A. awamori 16

Срок культивирования, •сутки CMC в % по отношению к исходной величине

Исходная - 6 100

9 110,34

11 132,44

13 ■ 263,39

15 320»53

возрастания, стабилизации продуцирования и сверхзкскреции ПГ у ИК A. awanori 16 после спада уровня биосинтеза. В результате обработки иммобилизованного мицелия при 4°С активность ПГ поэтапно увенчивалась в 4,7; 15; 17 раз по сравнению с активностью до обработки (исходная величина на 8 сутки). Стабилизацию биосинтеза 1ГГ наблюдали в периоде от 160 до 360 суток. На 450 сутки активность ПГ относительно исходной была выше в 9 раз.

Выявлено, что для сверхэкскреции не только ПГ, но и МФ (Заявка N 940951.1) ИК необходимы следующие условия:

1. ««"плчнииянйп м

2. Обработка мицелия (.условия лимитируи^и-з рост);

3. Чередование обработки мицелия с культивированием на питательной среде.

Исследование показало, что однократная обработка мицелия при -10°С в течение 3; 5; 8 часов стимулировала увеличение CMC ферментов на 34-55Х. Выдерживание до 15 часов не способствоваг ло увеличению CMC фермента.

16 16 14 12 Ю О 6 4.

ПГ ед/мл

а.

4 8

16

74 121 Рисунок 1

180

280

360 450 СУТКИ

Динамика возрастания и стабилизации продуцирования ПГ ИК A. awamori 16

- 14 -

Для многократного получения целевого продукта рекомендуется чередование обработки мицелия при -10°С в течение 5-8 часов с 2-3-суточным культивированием на среде. В этих условиях, наименьшую экскрецию MS наблюдали у 9-дневной культуры при однократной обработке, наибольшую у 15-дневной при четырехкратной обработке - более чем в 3 раза (табл. 6).

Сверхэкскреция ПР ферментов была достигнута ранее (Блие-ва, 1991), при периодическом удалении мицелия с подложки с помощью специального устройства (А.с. 1047954). В этом способе нами также выявлены 3 условия, способствующие сверхэкскреции ферментов.

При интерпретации двух способов предложенных нами и способа Влиевой Р.К. было выявлено общее: уровень экскреции фермента увеличивался постепенно, от уровня достигнутого ранее, прямо пропорционально количеству процедур по чередованию обработки мицелия с культивированием в среде.

Исследовали пригодность бельтинга в качестве материала для подложки,- влияние обработки ИК на продуцирование МФ различными видами выделенных нами микроорганизмов (A. sparsus, Р. chrysogenum, Aspergillus sp., Bacillus sp.). Обработка мицелия способствовала значительному повышению активности Щ у всех продуцентов, хорошей иммобилизуемости мицелия на бельтин-ге.

Таким образом, применение адсорбционной иммобилизации на бельтинге, обработка мицелия, чередование обработки мицелия с культивированием на питательной среде способствует сверхэкскреции и увеличению активности ферментов КК в 2-17 раз, удлинению стационарной стадии активного ферментообразования, обеспечивает многократность использования ИК.

3. ПОЛУЧЕНИЕ НЕОЧИЩЕННЫХ МАЦЕРИРУЩ1Х ФЕРМЕНТОВ И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Для масштабирования процесса получения МФ ИК предложена технологическая схема предлагающая создание условий для сверхэкскреции ферментов при адсорбционной иммобилизации продуцента, обработке мицелия низкими или отрицательными температурами и чередовании обработки мицелия с культивированием на среде.

Нами впервые установлено, что A. awamori 16, наряду с пектинрасщепляющими ферментами гидролитического и лиазного

действия продуцирует ферменты, мацерирующие растительную ткань до отдельных клеток. Причем область действия МФ приходится на ;.¡í от "/5 до 4. По доступяш и известным нам литературным ис-;-.,ч>шкам способность разделять ткань до отдельных клеток выявлена только V нескольких видов - Rhizopus sp., A. japonicus, Coi trici'jm praticola, En», atroceptica, P. digitatum (Harado, Toyama. 1966; Ishii, 1976; Михайлова, 1995). Наиболее высокая мац*>риру*шя способность Л. awamori 16 была отмечена при рН 3 а I ЗГ~'С, Увеличение рН в сторону щелочной реакции приводило к инактивации ферментов.

СС^Д?!"""* ""мг.п.,>м ire,«^,,.,,^. ---.г,™™ плпученНЫЙ при соотношении КЯ и спирта i:о, и<»д«у,<и шсглсй мерилу««««* ou« собностью по отношению к моркови, томату, сливе, винограду, луку, картофелю. В результате действия мацерирующих ферментов в течение 3-4 часов в реакционной смеси образовывалась взвесь отдельных растительных клеток.

ME осаждали сульфатом аммония при 115% концентрации. Ма-церирующая способность ферментов КЖ до осаждения составляла ОУХ, з после осаждения к растворения осадка в буфере Мак-Ил-влйнл (рН 3) - 90%.

Длг! изучения ферментного состава КК, провели высаливание •ферментов сульфатом аммония при перенасыщении раствора и последующее обессоливание гель-фильтрацией через колонку с сефа-дексом G- с'0. На рисунке 2 представлен профиль элюши ПР фер-Mf'ríTon с сефапексом а-50. Фракции злюата с 14 по 24 содержали ферм'-ити активные в области рН от 4,6 до 0,6 - ПТЗ, ПГ, ШЭ. Во фракцииил djiiobïû с 52 по 64, обладающих мацерирующим дейс-оиапили арабаназную, арабинофураногидролазную и полига-лактур'С"'1с'11ук| активности.

Нами раэра&отаи л апробирован способ обработки корма домашней птицы КЖ A. awamori 16, содержащей МФ. Способ предназначен для расширения кормовой базы птицеводстза. Использование способа возможно позволит употребление различных низкокалорийных груш кормов для вскармливания домашней птицы. Обработка корма улучшает его усвоение, при зтсы повышается жизнеспособность цыплят, что приводит к увеличен!«) привеса птицы на 19,3%, экономил расхода корма на 22%, проявлению профилактического эффекта резистентности к колибактериозу (Пат. N397).

dj ßs as %

ю

8- ocs- -

Б- 04 ■ 0.06- -

1)3- 04

ч- ооь

■ огл о.г-

г- 0.02-

0.1- 0.1 -

IS 20 24 2S 32 36 SS 4« «<? 52 5S 60 St SC

Франции

Рис. 2 Сбессоливание мацерирующих и пектинрасщепляющих ферментов на колонке с сефадексом 6-50. Колонка 4,5-50 см, скорость юлюции - 20 мл/ч, обьем фракций - 10 мл. Обозначения:

ед/мл), рН - 4,3 ед/мл), рИ - 4,6 ед/мл), рН - 8,6 , мг/мл)

ед/мл). рН - 4.0 ед/мл), рН - 4,0

Культуральную жидкость А. аиатог1 16 использовали для получения отдельных клеток из каллуса люцерны. Кх образование происходило за 4 - 5 часов в присутствии среды, предназначенной для поддержания осмотического давления клеток, при рН 5,6. В то время как ранее применяемая смесь коммерческих препаратов Ме1се1азе 2Х, Масегогут 0,3% расщепляла субстрат в течение 16 часов.

1 - активность ПМЭ (А]у ,

2 - активность ПГ (Ац ,

3 - активность ПТЭ (Аш ,

4 - распределение белка (А

5 - активность АР (Ац ,

6 - активность АФГ (Аш >

ВЫВОДЫ

1. Проведен скрининг продуцентов КТО среди 118 культур прокариотов и эукариотов, выделенных из природы, из которых 5 отобраны как наиболее активные и по результатам исследования причислены к патогенным. Две иэ них впервые описаны как лроду-

ленты мацерирукак ферментов - Aspergillus sparsus и ?enicillIu.T; chrysogeniLn. При скрининге среди музейных культур о применением метода культивирования мнкрсрганизмов в иммоби-лпссв.'-нпом состоянии была отесана в ¡сачестве актового продуцента MS Aspergillus awamorl 16.

L. Установлено, что з результате применения адсорбционной иммобилизации клеток A. awamori 15 на бельтинге происходит «сияние еиятесз мадерируедих и других пегсгиирасиеплякдах Фермии ol. Пе-казакы возможности различных биотехнолсгическнх манипуляций по обработке иммобилизованных клеток, преимущества

"" " г-паипитглппоп

са образования ферментов ¡плетилизойомными и г-лст

ками.

3. Оптимальная для свободных клеток концентрация пектина ингибирует биосинтез ферментов у иммобилизованных меток. С иммобилизацией снижается порог чувствительности к индуктору и в 4 раза повышается потребление азота, объясняемые нами повышением проницаемости клеток.

4. Выявлены условия и разработана технологическая схема получения К№ на модифицированной среде для иммобилизованной культуры A. awamorl 16, позволяющие достигнуть сверхэкскреции мацериуукашх ферментов. Среда, предложенная для производства, учитывает выявленные особые потребности иммобилизованных клеток в источниках азота и индукторе пектине, отличающиеся от потребностей свободных клеток, на которой активность ферментов увеличивается в С 1? раз.

5. Выделены мацерируювд'.« ферменты A. awamorl 16, путем

сульфятлм аммония с последующей гельфильтрацией на ;еФа,;ексе г> 50. Во фракциях ядюзта. обладающих мацерирушим действием, выявлены йрабапо^пая, ораОлнофураногндролазная и полигалактуроназная активности.

6. Разработан и апробирован способ обработки корма домашней птицы кудьтуральной жидкостью Ж A. awamorl 16, содержащей м,'шерир\т>яц1е £*рмгнты, позволяющий улучшить качество и усвоение корма, повысить жизнеспособность цыплят, что приводит к увеличению привеса птицы на 19,3%, экономии расхода корма на

повышению резистентности к колибактериозу.

- 18 -

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ:

1. Bliyeva R.K., Belkhodjaeva A.A. A comparative study of the physiology of immobilized and free cells of. Asp. awamori 16 producing pectin-decomposing enzymes /Abstr. An international Symposium "Physiology of Immobilized Cells". Wageningen.

»The Netherlands, 1989.-P.70.

2. Блиева P.K., Белходжаева А. А. Применение пектинрасщеп-ляющих ферментов Asp. awamori 16 в рационах птиц для стимуляции их развития /В сб.:"Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста райтений и животных. Тезисы Всес. конф.-1989.-47с.

3. Bliyeva R.K., Belkhodjaeva A. A. A comparative study of the physiology of immobilized and free ceils of Asp. awamori 16 producing pectin-decomposing enzymes /Physiology of immobilized cells.-Elsevier:Amsterdam-Qxford-N.-Y.-Tokyo.-1990 P. 513-516.

4. Блиева P.K., Белходжаева А.А. Преимущества культивирования иммобилизованной культуры Asp. awamori 16 по сравнению со свободным мицелием /Биотехнология.-1991.-Т. 3.-С.62-65.

,5. Блиева Р.К., Белходжаева А.А. Способ хранения иммобилизованных микромицетов. А.с. N1775470, заявлено 23.04.90, опубликовано 15.11.92, Бюл. N12. 1994.

6. Блиева Р.К., Белходжаева А.А. Егизбаева Х.М., Кулукба-еваА.Р., Егизбаев Ж. А. Способ кормления цыплят. Патент РК N397, заявлено 23.04.90, Бюл. N1. 1995.

7. Белходжаева А.А., Блиева Р.К. Применение штамма Asp. awamori 16 для мацерироваиия растительной ткани до отдельных клеток. Заявка N940947.1 от 10.10.94.

8. Блиева Р.К., Белходжаева А.А. Способ культивирования микроорганизмов, усиливающий выделение экзометаболитов. Заявка N940951.1 ОТ 12.10.94.

Belkhodjaeva Almagul Alimbekovna "'Searching for producers of macerating enzymes and ways their excretion by immobilized cells of microorganisms"

A search for production of macerating enzymes has been

done. Of microorganisms isolates in nature and collection cultures the most active producer - Aspergillus awanori 15 tjas been selected. It has been found that the optimum action of macerating enzymes is at pH 3.

On the basis of the use of suggested two methods uf cultivation of immobilised cells and overexertion cf exoenzymes, the production of macerating enzymes by immobilized cells A. awamori 16. •

Eluate fraction obtained as a result of salting: out nf cultural liquid enzymes . r^IIiw^u-uy-

.tiltsuli«»»-*nrrf^~ Sspiwtiw? <J 50 aTorrj Tilth a macerating action possessed arabanasa, arabinofuranoghydrolasa and polygalacturonasa activities.

Иацирлеруш! ферме«ггге£д1ц продуцентами ц iafley жене клетка~ лардыи иммобнлизациялнк eslci арпмлы, одардьщ микрооргаипг!мда~ pin зкекрециялау жолдари.

Тзбигаттан белппп алынган жене музешйк культурлардыц .чраоынан м:щкрлеуш1 ферменттердщ продуцентерщ 1здеу нотиже- ' С1нде - мей!м1нше белеендх продуцент - Aspergillus aivamori 16 бел нпп ал.чнды.

Ку.'№7»Бирлеуд1 д цоынылган 2 sAiciH клеткалардьщ кммобили-злциясы х?не экзоферменттерд^ жогаргы экскрециясын к,олдаяудыц нетил>'С1нд'.- - on/iipicte асз гору рмес вдзегепц'орта тавдалынып алынгнм, Л. awamori 16-тыц иммобилизденген вдеткаяЕръшдагы цирлеупй ферменттррд! -тдер!ст1 алудыц схемасы усынылган.

Культ'/р.-^дык, ovtfei^ ортадагы ферментердь аммоний сульфатын-ла устам, '^даи соц сефадекс G-50 аркылы гельфильтрациялау (су-зу) нетияеетнде алынган элюат фракциясы мацирлеуш! ьсермён катар арабино.ча.тмк, арайинофураногидролаэалык ж« не полигалактуро-назаикк «'»¿"«ч.пШкке к<? бола злады.

Подписано к печати 17.0T.9S г. Заказ 107. Тира* юо ->кэ Ротапринт КааПМИЭО АПК, Алнаты, ул. акал.Свтпаева 30е.