Поиск и использование синтетических соединений гетероциклического ряда для сохранения стабильности популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов

Нечаева, Ольга Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск и использование синтетических соединений гетероциклического ряда для сохранения стабильности популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Поиск и использование синтетических соединений гетероциклического ряда для сохранения стабильности популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов"

На правах рукописи

Нечаева Ольга Викторовна

Поиск и использование синтетических соединений гетероциклического ряда для сохранения стабильности популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов

03.00.07 - микробиология 03.00.16 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов 2004

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского

Научные руководители: доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Плотников Олег Петрович кандидат биологических наук, доцент Тихомирова Елена Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич доктор биологических наук, Корженевич Вячеслав Исаевич

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится «Л/» /Ц "2004 года на засе-

дании диссертационного совета Д 220.061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335

Автореферат разослан « » им^ил^Ь^ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Л.В. Карпунина

¿00$ - 4

2ЛЯ9

57 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микроорганизмы являются одним из наиболее существенных компонентов биосферы. Создание и поддержание коллекций микроорганизмов как способы сохранения биоразнообразия является актуальной экологической проблемой. В настоящее время хранение микроорганизмов в жизнеспособном состоянии осуществляется в коллекциях культур, которые создаются в большинстве микробиологических лабораторий и на биотехнологических производствах и используются как в промышленных, так и в исследовательских целях. Главной задачей консервации микроорганизмов является обеспечение их долгосрочного хранения с подержанием высокой жизнеспособности и предупреждением мутационных изменений, то есть в состоянии максимально близком к естественному (Литвин, Гинцбург, 1998).

В основе всех методов консервации, предлагаемых на сегодняшний день, лежит перевод клеток в состояние анабиоза, что ведет к снижению или прекращению всех метаболических процессов (Сидякина, 1985). Основными методами длительного хранения микроорганизмов являются высушивание, лиофили-зация, Ь-высушивание, хранение при низких температурах, криоконсервация, хранение на носителях органической и неорганической природы. При консервации вышеизложенными методами клетки подвергаются действию экологических факторов абиотической природы. Так высушивание приводит к потере биологически активной воды, при криоконсервации и низкотемпературном замораживании клетки претерпевают действие замораживания - оттаивания. В процессе лиофилизации микроорганизмы подвергаются воздействию отрицательных температур и вакуума. В результате перечисленных процессов происходит гибель части клеточной популяции. Еще одной из причин гибели микроорганизмов является окислительный стресс, в результате которого образуются активные формы кислорода, которые оказывают губительное действие на клетки (Фатеева, 1983). Поэтому совершенствование методов консервации является

- ь

| лиМИОТйМ 4

* СПпщрёгрг I

{ I

актуальной проблемой в прикладной микробиологии (Осадчая, Кудрявцев, Сафронова, 2002).

Инактивация микроорганизмами активных форм кислорода достигается с помощью собственных антиокислительных систем, в результате чего содержание продуктов свободнорадикального окисления находится на крайне низком уровне (Куликов и др., 1995). Результаты исследований показали, что ферменты, обеспечивающие защиту клеток от окислительного стресса, локализуются преимущественно на наружной мембране, в цитоплазме микроорганизмов, а также обнаруживаются во фракции периплазмы (Дробков, Погорельский, Дар-мов, 1997; Брюханов, Тауэр, Нетрусов, 2002).

В последнее время появилось большое количество синтетических антиок-сидантов - веществ различной химической природы, обладающих антиокислительными свойствами. Одним из перспективных направлений использования этих соединений является применение их в составе сред стабилизации при консервации микроорганизмов, так как некоторые высокоэффективные синтетические антиоксиданты оказывают выраженное защитное действие и стабилизируют состав популяции (Плотников, Шведун, Гусева, 1995; Липатова, Сотников, Федотова, 1995).

Однако на настоящий момент механизмы взаимодействия антиоксидантов с бактериальной клеткой изучены недостаточно, в частности, нами не обнаружены в литературе данные о локализации синтетических антиоксидантов в бактериальных клетках. Практически отсутствуют сведения о компенсации синтетическими антиоксидантами собственных антиокислительных ферментов при стрессовом воздействии на микробные популяции абиотических экологических факторов.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в поиске и отборе синтезированных гетероциклических соединений и их предшественников с ан-тиоксидантной активностью и применении их для поддержания стабильности популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов на фоне действия абиотических экологических факторов.

Для реализации указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1 Изучить биологическую активность новых синтетических веществ группы гетероциклических соединений и их предшественников с целью отбора перспективных антиоксидантов.

2. Определить влияние отобранных синтетических антиоксидантов на стабилизацию свойств исследуемых популяций бактерий на фоне действия экологических факторов абиотической природы.

3. Выявить взаимоотношение синтетических антиоксидантов нового ряда с собственными антиокислительными ферментами бактериальных клеток.

4. Установить морфологические изменения в бактериальных клетках при действии различных экологических факторов абиотической природы в сравнительном аспекте с применением отобранных синтетических антиоксидантов.

5. Изучить влияние синтетических антиоксидантов нового ряда на электроповерхностные свойства бактерий и определить их локализацию.

Научная новизна. Впервые была изучена биологическая активность новых синтетических веществ группы гетероциклических соединений и их предшественников и отобраны перспективные ант иоксиданты для практического применения. Показана высокая эффективность применения синтетических антиоксидантов нового класса для стабилизации свойств популяции и увеличения сроков хранения бактерий в процессе консервации (лиофилизации), а также повышение жизнеспособности грамположительных и грамотрицательных бактерий на фоне действия других абиотических факторов (замораживание-оттаивание, ультрафиолетовое излучение). Установлены морфологические изменения в бактериальных клетках при действии различных экологических факторов абиотической природы и сохранение структуры бактерий при использовании отобранных синтетических антиоксидантов.

Впервые установлено влияние синтетических антиоксидантов на электроповерхностные свойства бактерий и отдельные структуры бактериальных клеюк

и показана локализация синтетических веществ на примере таллийорганиче-ских соединений, обладающих антиоксидантной активностью.

Полученные нами данные об изменениях, происходящих в процессе перевода микроорганизмов в состояние анабиоза, позволяют углубить знания о механизмах выживания бактериальных клеток в экстремальных условиях.

Практическая значимость. Изученные и отобранные нами синтетические антиоксиданты предложены как дополнительные компоненты сред защиты, и в дальнейшем могут быть использованы для поддержания стабильности популя-ционного состава бактерий и повышения их выживаемости в условиях стресса, вызванного действием различных абиотических факторов. Применение разработанного нами методического подхода позволит оптимизировать процедуру поддержания специализированных национальных коллекций, повысить эффективность, безопасность и экономичность их функционирования.

На основании полученных данных разработаны методические рекомендации для студентов, аспирантов и сотрудников микробиологических лабораторий «Методы отбора синтетических антиоксидантов для поддержания коллекционных культур микроорганизмов», утвержденные Ученым советом биологического факультета СГУ (протокол № 9 от 12.04.04 г.).

Полученные нами данные о влиянии синтетических антиоксидантов на собственные антиокислительные системы бактерий и электроповерхностные свойства клеток используются в учебном процессе при чтении общих курсов микробиологии и биотехнологии, а также в специальных курсах при подютовке специалистов-микробиологов в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского.

Основные положения, выносимые на защиту: 1 Синтезированные соединения нового ряда группы гетероциклических соединений и их предшественников, обладающие низкой антифаговой и высокой антиоксидантной активностью, могут быть успешно использованы для повышения жизнеспособности и стабилизации свойств популяций коллек-

ционных культур микроорганизмов на фоне стрессовых воздействий различных абиотических факторов.

2. Взаимодействие новых синтетических антиоксиданюв циклического ряда с бактериальными клетками ведет к изменению уровня собственных антиокислительных ферментов, отражающих стабильность состава популяции.

3. Синтетические антиоксиданты нового ряда из группы гетероциклических соединений и их предшественников, локализуясь на поверхности бактериальных клеток, влияют на их электроповерхностные свойства и повышают целостность мембранных и внутриклеточных структур при стрессовом действии различных абиотических факторов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на региональной научной конференции «Молодежь и наука на пороге XXI века» (Саратов, 1998 г), XXVI межвузовской научно-практической конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященная памяти академика Е.Н. Павловского (Санкт-Петербург, 1999), научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999) и симпозиуме «Свободные радикалы в биологии и медицине» (Лодзь, Польша, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, состоящей из 4 глав, заключения, выводов и списка 174 использованных литературных источников. Работа изложена на 143 страницах, включает 22 рисунка и 8 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В качестве экспериментальных моделей были использованы грамположи-тельные и грамотрицательные микроорганизмы: представители семейства Еп-terobacieriaceae - Yersinia pestis EV НИИЭГ, Escherichia coli В, Escherichia coli

58, семейства Micrococcaceae - Staphylococcus aureus 209-P, а также бактериофаг кишечной палочки Т4. Штаммы Ypestis EV НИИЭГ, Е co/i В и бактериофаг кишечной палочки Т4 получены из ГКПБ «Микроб», г.Саратов, штаммы Е coli 58 и S aureus 209-Р - из коллекции кафедры микробиологии и физиологии растений СГУ им. Н.Г. Чернышевского.

Исследуемые соединения, представленные кислородсодержащими гетеро-циклами, конденсированными дигидропиридинами и пиридинами, циклическими конденсированными пиранами и тиопиранами, кетонами, селеноргани-ческими и таллийорганическими соединения, конденсированными замещенными диазобицикло-нондиенами и комплексом меди с органическими лигандами, были синтезированы на кафедре органической и биоорганической химии и НИИ химии Саратовского государственного Университета, а также в Технологическом институте Саратовского Государственного Технического Университета (г. Энгельс).

Перед изложением материалов и методов по изучению влияния синтетических антиоксидантов (АО) на бактериальные клетки в работе представлены краткие и полные названия исследованных соединений.

Изучение биологической активности соединений проводили в два этапа: определение антифаговой и антиоксидантной активности.

Исследование антифаговой активности веществ проводили в системе бактериофага Т4 - штамм Escherichia coli В (Фонштейн, Сурайкина, Таль, 1975). Антиоксидантную активность синтезированных соединений определяли на хе-милюминометре в системе свободнорадикального окисления, инициированного перекисью водорода в растворе нормальной лошадиной сыворотки (Архипова, 1988).

Консервацию бактерий проводили методом лиофильного высушивания на коллекторном аппарате системы К.Е. Долинова (Инструкция по лиофильному высушиванию..., 1979). Определение продолжительности хранения лиофили-зированных препаратов бактерий проводили по методике ускоренного опреде-

ления сроков хранения вакцинного штамма чумного микроба (Методика определения термостабильности..., 1985).

Влияние синтетических антиоксидантов на выживаемость грамотрица-тельных и грамположительных микроорганизмов оценивали по % выживаемости клеток, подвергшихся воздействию стрессовых факторов.

Действие синтетических антиоксидантов на собственные антиокислительные ферменты бактериальных клеток исследовали в несколько этапов: а) белок в клетках определяли по методу Лоури (Lowry et at., 1951) в модификации Markwell et at. (1978); б) активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли в тесте изменения интенсивности окрашивания исследуемых образцов (Beyer, Fridovich, 1987); в) определение продуктов окисления липидов (гидроперекисей) проводили при помощи цветной реакции с тиоционатом аммония (Summer, 1943).

Подготовку материала для электронно-микроскопического исследования морфологических изменений бактериальных клеток в условиях стресса проводили по методике (Spurr, 1965; Reynolds, 1963) Ультратонкие срезы просматривали на электронных микроскопах JEM-7A (Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV и Hitachi HU-12A (Япония) при 75 kV.

Действие синтетических АО на клеточную поверхность бактериальных клеток оценивали по изменению электроповерхностных свойств методом электрофореза в свободном потоке (ЭФСП) (Малайцев, Богзакова, 1977).

Для определения локализации антиоксидантов на бактериальной клетке использовали таллийорганические соединения, обладающие антиоксидантной активностью. Просмотр негативно окрашенных препаратов осуществляли на электронном микроскопе JEM - 7А (Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV.

Результаты и обсуждение

На первом этапе работы нами Оыпа изучена биологическая активность 40 гетероциклических соединений и их предшественников, которая включала в себя изучение их антифаговой и АО -активности (Täöji. Полученные резуль-

тэты позволили нам разделить тестированные вещества по действию на бактериофаг Т4 на несколько групп: 1. оказывающие токсическое действие - выживаемость бактериофага ниже 0,1 %; 2. оказывающие инактивирующее действие - выживаемость от 0,1 до 10 %; 3. оказывающие ингибирующее действие в различной степени - умеренное: выживаемость от 10% до 30%, слабоингибирую-щее - от 30 до 90%; 4. индифферентные соединения - выживаемость от 90 до 100%. Перечисленные группы характеризовали уровень биологической агрессии (БА) различных соединений, который можно рассматривать как БА+ (выживаемость фага стремится к нулю) и БА" (выживаемость фага стремится к 100%).

Установлено, что наименьшей антифаговой активностью обладали диокси-кумарин, ацетамидокумарин, 6,7-диоксикумарин, тетрагидротио-хромен, ме-токсифенил-гексогидрохинолин, циклог ександион, диметилцикло-гександион, дифенил-тетрагидрохромен, оксотетрагидротиохромен, 13Г, а максимальной антиоксидантной активностью - ацетамидокумарин, окси-тиохромен, тетрагид-ротиохромен, ме гоксифенил-гексогидрохинолин, диметил-фенил-гексагидро-хинолин, диметилциклогександион, дифенил-гексагидрохинолин, диметил-дифенил-тетрагидрохинолин, 2Г, 13Г.

Нами была проанализирована взаимосвязь между биологической активностью исследуемых соединений и особенностями их химической структуры.

Анализ полученных данных показал, что антифаговая и антиоксидантная активность соединений определяется структурой не только основного кольца гетероцикла, но и боковых радикалов. Среди исследованных кислород-, азот- и серусодержащих гетероциклов большинство соединений относились к группам со слабоингибирующим или индифферентным действием на бактериофаг.

При введении в структуру основного кольца гетероцикла кислорода происходило усиление антифаговой активности синтезированных веществ: 75% кислородсодержащих и все исследованные азот- и серу- кислородсодержащие соединения проявили высокую антифаговую активность.

Таблица 1

Биологическая активность исследуемых соединений

N п/п ' Код вещества Выживание бактериофага, % (М±ш) Антиоксидантная активность, у.е. (М ±ш)

1 , 2 3 4

1. ; ir 37,0 ±0,5* 1,75 ±0,5*

2. j 2Г 3,0 ± 0,7* 2,2 ± 0,7*

3. зг 0,04 ± 0,006* 1,74 ±0,2*

4. 4Г 0,2 ±0,05* 1,69 ±0,1*

5. I 5Г 0,4 ± 0,03* 1,32 ±0,1*

6. 1 6Г 8,0 ± 0,6* 2,00 ± 0,2*

7. 7Г 44,0 ± 0,5* 1,27 ± 0,2*

8. 8Г 0,6 ± 0,05* 1,40 ±0,05*

9. 9Г <0,006 1,50 ±0,15*

10. ЮГ <0,005 1,60 ±0,2*

11. 11Г 0,02 ± 0,005 1,58 ±0,3*

12. 12Г 0,05 ± 0,004* 1,64 ±0,2*

13. 13Г 76,0 ± 1,5* 2,81 ±0,4*

14. 14Г 0,7 ±0,1* 1,35 ±0,1*

15. Метил кумарин 66,0 ± 3,4* 0,86 ± 0,03*

16. Диоксикумарин 82,0 ±3,8* 0,26 ± 0,04*

17. Карбокси-кумарин 0 НО

18. А цетам и до-кумарин 55,0 ± 1,2* 1,90 ±0,06*

19. 7-Оксикумарин 41,0± 1,9* НО

20. 7,8-Диокси-кумарин 59,0 ±3,9* НО

21. 6,7-Диокси-кумарин 108,0 ±5,04* 1,34 ±0,04*

22. 6-Оксикумарин 62,0 ±2,5* НО

23. Дифенил-тетра-гидрохромен 81,0 ±2,7* 1,95 ±0,05*

24. Тетрагидро-хромен 0,5 ±0,04* НО

25. Окситиохромен 61,0 ± 3,1 * 2,03 ±0,13*

26. Триметилтетра-гидротиохромен 63,0 ± 1,05* 2,15 ±0,08*

27. Гетрагидротио-хромен 72,0 ± 1,9* 2,30 ± 0,25*

28. Оксотетрагид-ротиохромен 78,0 + 2,1* 1,76 ±0,17*

1 2 3 4

29. Гексагидро-хинолин 71,0 ± 1,7* 1,20 ±0,05*

30. Нитрофенил- гексагидро- хинолин 37,0 ±0,5* 0,20 ± 0,03*

31. Метоксифенил- гексагидро- хинолин 77,0 ±2,3* 2,90 ±0,1*

32. Диметил-фенил- гексагидро- Хинолин 33,0 ± 1,2* 2,41 ± 0,03*

33. Дифенил-гекса-гидрохинолин 3,06 ±0,15* 2,83 ± 0,09*

34. Диметил-дифе-н ил-тетрагидро-хинолин 59 ± 1,3* 4,30 ±0,05*

35. Диметилцикло-гександион 104,0 ±2,9* 2,77 ± 0,08*

36. Циклогексан-дион 97 ± 2,4* 1,71 ±0,03*

37. Хлорцинкаг се-ленопириллия 0 НО

38. Диметил-нондиен 61 ± 1,03* но

39. Диметил-нитро-фенил-нондиен 58 ± 1,5* 1,64 ±0,1*

40. Комплекс меди 0 0,85 ± 0,04*

Примечание: НО - не определяли, * - наличие достоверности при уровне

значимости р < 0,05 по отношению к контролю.

Антиоксидантная активность этих соединений также зависела от их структуры. Токсичными для бактериофага Т4 явились селен- и медьсодержащие соединения. Слабыми АО оказались изученные классы талийорганических соединений.

При изучении влияния синтетических АО на собственные антиокислительные ферменты бактериальных клеток были исследованы основной фермент антиокислительной защиты - СОД, а также продукты окисления - гидроперекиси.

Были испытаны диметилциклогександион, дифенил-гексагидрохинолин и ди-метил-дифенил-тетрагидрохинолин - вещества, которые, характеризуясь различным действием на бактериофаг Т4, обладали высокой АО активностью.

При внесении синтетических АО в образец уровень основного фермента защиты бактериальных клеток от активных форм кислорода (АФК) - СОД- снижался в 1,5 ± 0,1 раза и не зависел от типа АО. Это свидетельствовало о компенсации синтетическими АО функции собственной системы защиты бактериальной клетки. Высокой оказалась разница в количестве гидроперекисей, определяющих уровень окисления липидов, которые являются основной мишенью бактериальной клетки при действии АФК. При внесении дифенил-гексагидрохинолина и диметипциклогександиона уровень гидроперекисей составил 1,0 ± 0,05, а для диметил-дифенил-тетрагидрохинолина 2,0 ± 0,1. Очевиден факт большой разницы уровня опытных образцов по сравнению с контролем (7,5 ±0,3): в 3,7-7 раз.

Полученные экспериментальные данные показали, что влияние синтетических АО заключается в их компенсаторном действии наряду с собственными антиокислительными системами, направленном на нейтрализацию АФК различного типа, которые присутствуют при стрессовой ситуации, вызванной действием абиотических факторов в процессе лиофилизации.

Для изучения роли синтетических антиоксидантов в защите грамположи-тельных и грамотрицательных бактериальных клеток при различных стрессовых воздействиях абиотических факторов использовали диметилциклогександион. В качестве стрессовых факторов были выбраны замораживание-оттаивание (действие температуры -18 °С в течение 1 часа и 1 суток) и действие УФ излучения (режимы облучения 1 и 5 минут).

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что циклогександион повышает жизнеспособность микроорганизмов в условиях стресса. Так в условиях действия УФ излучения обработка клеток АО приводила к повышению выживаемости Е coli 58 в 1,4 - 2,9 раз (в зависимости от длительности действия стрессового фактора), a S aureus 209 Р в 1,9 раз по сравнению с контролем. При

воздействии низких температур выживаемость Е. coli возрастала в 4,1 - 8,5 раз, а 5 aureus - в 4,4-6,8 раз (соответственно длительности действия) по сравнению с контролем (рис 1).

Следующим этапом выявления положительного влияния исслед) емых веществ на сохранение стабильности популяционного состава коллекционных культур бактерий, находящихся в условиях стресса, вызванного абиотическими факторами, проводилось лиофильное высушивание вакцинного штамма У pestis EV НИИЭГ. Нами было отобрано 3 соединения, относящихся к различным химическим классам: ацетамидокумарин, тетрагидротиохромен и метоксифе-нил-гексогидрохинолин, в которых сочетались низкая биологическая агрессия и высокая антиоксидантная активность. Результаты по влиянию сред стабилизации, содержащих новые классы АО, на сроки хранения вакцинного штамма У pestis EV НИИЭГ в лиофилизированном состоянии показали, что сроки хранения бактериальных клеток увеличивались в 1,1 - 3,9 раза по сравнению с контролем.

При изучении изменения ультраструктуры бактериальных клеток У. pestis EV НИИЭГ были изготовлены ультратонкие срезы контрольных и опытных образцов на каждом этапе лиофилизации.

Изучение исходной культуры У pestis EV НИИЭГ показало, что большинство клеток имело характерные для чумного микроба какморфологические (длина клетки 1,5-2,0 мкм, ширина 0,5 мкм), так и ультраструктурные образования: трехконтурную внешнюю мембрану толщиной 9 нм (два электронноп-лотных слоя, а между ними электроннопрозрачный). Содержимое цитоплазмы было представлено электронноплотным материалом с включенными рибосомами диаметром 20 нм и фибриллярными структурами, между которыми диффуз-но расположена электроннопрозрачная зона нуклеоида. В клетках, подвергшихся действию вакуума в условиях низкой температуры (-70 °С) в течение 2 часов, нуклеоид занимал центральную часть клетки, и в нем просматривалась сетка, состоящая из фибриллярных структур с электронноплотными включениями неправильной формы В некоторых клетках цитоплазма, окружающая нуклеоид,

имела высокую электронную плотность. Здесь же обнаруживались разрушенные клетки, у которых наблюдался выход цитоплазмы (рис. 2).

Рис. 1. Влияние ДМСО и диметилциклогександиона (АО) на выживаемость клеток Е coli 58 и 5 aureus 209 Р при стрессовом воздействии «замораживания - оттаивания»

При исследовании препаратов с добавлением метоксифенил-гексагидрохинолина было выявлено, что в опытных образцах, по сравнению с контролем, после лиофилизации наблюдалось большее число неповрежденных клеток, сохранение тонких структур (нуклеоида, рибосом и мембранного аппарата) (рис 3). Это свидетельствовало о преимуществе использования новых типов АО в составе сред защиты в процессе лиофилизации коллекционных штаммов микроорганизмов.

Воздействие веществ на клеточную поверхность бактерий определяли по изменению электроповерхностных свойств опытных клеток относительно элек-трофоретической подвижности (ЭФП) клеток, инкубированных с диметилсуль-фоксидом (ДМСО), с использованием ЭФСП.

Экспериментальные модели Я Контроль a S aureus + ДМСО nS aureus* АО

Экспериментальные модели

Ш Контроль □ Е соIi + ДМСО О Е coll + АО

Рис. 2 Электронная микрофотография клеток вакцинного штамма Y pestts EV НИИЭГ (ультратонкий срез) после 2 часов высушивания в углекислоте (х 70000)

Рис 3 Электронная микрофотография клеток вакцинного штамма ) ре.\Н\ ЕУ НИИЭГ (>льтратонкий срез), лиофилизированных с добавлением метоксифенилгексагид-рочинолина (* 70000). Р - рибосо-мальный аппарат. ЦМ - цитоплн !-матическая мембрана. Н - н\клсо-ид. ВМ - внешняя мембрана

На рис. 4 представлено электрофоретическое распределение чистой культуры УрезИв ЕУ НИИЭГ и клеток, обработанных ДМСО. Пик выхода клеток чистой культуры наблюдался в 42 фракции, а клеток, обработанных ДМСО - в 39 фракции, то есть они характеризовались более высокой ЭФП по сравнению с интактными. Следовательно, обработка клеток ДМСО приводила к уменьшению абсолютной величины суммарного отрицательного заряда клеточной поверхности, что свидетельствовало о локализации ДМСО на наружной мембране чумного микроба Возможно, что изменение ЭФП происходило за счет экранирования ионогенных групп клеточной поверхности или внесения собственного заряда молекулами ДМСО.

На рис. 5 представлено электрофоретическое распределение клеток Уреянз ЕУ НИИЭГ, обработанных ДМСО (контроль), а в качестве опытных образцов -обработанных тетрагидротиохроменом (АО 32) и диметил-нондиеном (АО 26). Пик выхода клеток, обработанных ДМСО, наблюдался в 39 фракции, клеток, обработанных тетрагидротиохроменом - в 41 фракции, а клеток, обработанных диметил-нондиеном - в 40 фракции. Следовательно, обработка этими вещест-

вами приводила к уменьшению ЭФП клеток относительно контроля, что свидетельствовало о локализации данных АО на клеточной поверхности бактерий.

N (номво фоакиии)

— EV+ДМСО

N (номео «Ьоакиии\ EV+26 — - EV+32

Рис. 4. Распределение по ЭФП чистой культуры клеток )' ре?/м ЕУ НИИЭГ и клеток )'резИз ЕУ НИИ-ЭГ, обработанных ДМСО

Рис. 5. Распределение по ЭФП клеток У pestis EV НИИЭГ, обработанных ДМСО, диметил-нондиеном (АО 26) и тетра-гидротиохроменом (АО 32)

Для определения локализации АО в бактериальных клетках использовали культуру вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ, выращенную на твердой питательной среде без АО (контроль) и с АО (опыт), в качес1ве которого использовали ди-(ацегил)-таллий трифторацетат. Изучение опытных образцов методами электронной микроскопии показало наличие в них таллийорганиче-ского соединения в виде полиморфных гранул округлой или вытянутой формы размером 1000-5000 нм (рис 6).

Гранулы адсорбировались на клетке, равномерно покрывая всю ее поверхность. В окружающем клетку пространстве наблюдалась обильная зернистость из аналогичных гранул. В контрольных образцах подобных изменений клеточной поверхности бактерий и в окружающем их пространстве не наблюдалось (рис.7).

Рис. 6. Клетки вакцинного штамма )' pestis EV НИИЭГ (х 7000), выращенные на агаре Хот-тингера (рН 7,2) с добавлением TOC. 1 - гранулы TOC, локализованные на поверхности бактериальной клетки 2 - гранулы TOC в окружающем клетку пространстве

Рис. 7. Клетки вакцинного штамма У pestis EV НИИЭГ (* 7000), выращенные на агаре Хоттингера (рН 7,2)

Таким образом, полученные нами результаты позволяют считать перспективным использование синтетических антиоксидантов для консервации широкого профиля биологических объектов; для сохранения морфологических и биохимических характеристик вакцинных штаммов и штаммов-продуцентов биологически активных веществ. Применение синтетических АО позволит повысить эффективность, безопасность и экономичность функционирования специализированных коллекций, т.к. эти соединения увеличивают продолжительность хранения лиофилизированных бактерий с сохранением исходных свойств, положительно влияют на стабильность популяционного состава микроорганизмов при стрессовых воздействиях. Локализуясь на клеточной поверхности бактерий, синтетические АО защищают их от различных воздействий абиотических факторов и компенсируют действие собственных антиокислительных систем клетки, инактивируя АФК.

Выводы

1. Впервые изучена биологическая активность 40 синтезированных веществ нового ряда группы гетероциклических соединений и их предшественников- кислородсодержащих гетероциклов, циклических конденсированных пиранов и тиопиранов, конденсированных дигидропиридинов и пириди-нов, кетонов, конденсированных замещенных диазобицикло-нондиенов и комплекса меди с органическим лигандом; а также селенорганического и таплийорганических соединений. Исследованные соединения классифицированы по уровню биологической агрессии и антиоксидантной активности.

2 Отобраны соединения с низким уровнем биологической агрессии и высокой антиоксидантной активностью: ацетамидокумарин, тетрагидротио-хромен и метоксифенил-гексагидрохинолин, введение которых в состав стандартных сред стабилизации увеличивает сроки хранения лиофилизи-рованных образцов бактерий по сравнению с контролем в 1,1 - 3,9 раза при сохранении исходных свойств исследуемых популяций.

3. Показано влияние диметилциклогександиона на стабилизацию популя-ционного состава бактерий при экологически неблагоприятных условиях. Выживаемость Е coli возрастала в 1,4 - 8,5 раз, a S aureus - в 1,9 - 6,8 раз в зависимости от времени стрессового воздействия по сравнению с контролем.

4 Впервые установлена корреляция между уровнем собственных антиокислительных ферментов клетки, отражающих стабильность состава популяции, и синтетическими антиоксидантами: введение последних в бактериальную клетку приводит к снижению уровня собственных ферментов, что свидетельствует о компенсаторной роли синтетических антиоксидантов при защите бактериальной клетки от повреждающего действия активных форм кислорода.

5. Установлено, что обработка клеток вакцинного штамма Ypestis EV НИИ-ЭГ синтетическими антиоксидантами различных классов и групп приводит к изменению электрофоретической подвижности бактерий, что свидетельствует об изменении электрического заряда клеточной поверхности.

6. Выявлены морфологические изменения в популяционном составе бактерий при действии различных абиотических факторов. Впервые методами электронной микроскопии показано, что синтетические антиоксиданты в составе сред стабилизации при лиофилизации бактерий значительно повышают число клеток с сохраненными поверхностными и внутренними структурами. Использование электронноконтрастных синтетических ан-тиоксидантов на основе теллурита калия доказало их локализацию на поверхностных структурах бактериальной клетки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Новикова О.В., Плотников О.П. Изучение антиоксидантных свойств циклических соединений и использование их в составе сред стабилизации при хранении бактерий в лиофилизированном состоянии / Проблемы общей биологии и прикладной экологии- Сб трудов молодых ученых. СГУ -Саратов, 1997,-Вып. 2/3.-С. 12-15.

2 Новикова О.В., Корсуков В.Н., Виноградова H.A., Попов Ю.А., Плотников О.П. Определение локализации синтетических антиоксидантов в клетках чумного микроба с использованием электрофореза в свободном потоке / Тез. докл. регион, науч. конф. «Молодежь и наука на пороге XXI века». СГУ - Саратов, 1998. - С. 90-91.

3. Корсуков В.Н., Гунькин И.Ф., Плотников О.П., Новикова О.В. Влияние таллийорганических соединений на электрофоретическую подвижность бактериальной клетки / Химия для медицины и ветеринарии: Сб. науч. трудов СГУ - Саратов, 1998. - С. 96-98.

4. Новикова O.B. Исследование ультраструктуры коллекционных штаммов рода Yersinia и I ibrio в процессе лиофилизации с применением новых ан-тиоксидантов / Матер. XXVI межвуз. науч.-практ. конф. по проблемам биологии и медицинской паразитологии, поев, памяти академика E.H. Павловского: - СПб, 1999. - С. 82-83.

5. Новикова О.В., Виноградова H.A., Плотников О.П. Би0л01ическая активность гетероциклических соединений /Матер. XXVI межвуз. науч.-практ. конф. по проблемам биологии и медицинской паразитологии, поев, памяти академика E.H. Павловского: - СПб, 1999. - С. 83-84.

6. Новикова О.В., Волков Ю.П., Плотников О.П., Коннов Н.П. Изучение ультраструктуры чумною микроба в процессе лиофилизации с применением новых типов антиоксидантов / Тез. науч. конф. учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты, Улан-Батор, Монголия, 1999. - С.265-267.

7. Плотников О П.. Новикова О.В. Роль синтетических антиоксидантов в защите бактериальной клетки в условиях стресса в процессе лиофилизации / Тез. науч. конф. учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты, Улан-Батор. Монюлия, 1999. - С. 269-270.

8. Plotníkov О.Р., Konnov N.P., Korsukov V.N., Gunrin I.F., Novikova O.V., Volkov U.P. Electron microscopy study of antioxidants interaction with bacterial cells // Proc. SPIE, 2000. - V. 4224 - P. 219-222.

9. Novikova O.V , Tichomirova E.I., Plotníkov O.P., Konnov N.P., Vinogradova N.A., Guseva I.V., Korsukov V.N. Study of interrelationship between synthetic antioxidants and the bacterial cells //Free radicals in Biology and Medicine / Releases of Symposium State Lodz, Poland, 2000. P. 236-241.

Ю.Новикова OB. Григорьев A.B., Виноградова H.A., Плотников О.П., Тихомирова Е.И., Коннов Н.П. Применение синтетических антиоксидантов циклического ряда при консервации бактериальных штаммов методом

лиофилизации. Известия СГУ. Сер. биологическая. СГУ - Саратов, 2001. -С.148- 154.

11. Korsukov V.N., Novikova O.V., Konnov N.P.. Piotnikov О.P., Popov Yu A , Gunrin I.F., Volkov Y P. The combination of the electrophoretic and electronic microscopy methods for determination of localization of the thallium-containing synthetic antioxidants on the surfase of the plague microbe cells // Saratov, Russia, October, 2001, SPEI Proc. V. 4707, P. 333-336.

12.Нечаева O.B., Тихомирова Е.И., Плотников О.П. Методы отбора синтетических антиоксидантов для поддержания коллекционных культур микроорганизмов (методические рекомендации). - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2004. - 24 с.

Выражаю глубокую благодарность доктору биологических наук, профессору Н.П. Коннову и кандидату технических наук Ю.П. Волкову за предоставленную возможность освоения методик и проведения электронномикроскопиче-ских исследований.

Подписано в печать 14.09.2004г. Формат60x84 1/16. Объем 1,5 печ.л. Тираж 100экз. ЗаказN»/4?

Типография Издательства Саратовского университета 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.

РЫБ Русский фонд

2006-4 23389

(

2 7 CEI^f

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нечаева, Ольга Викторовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Коллекции микроорганизмов как способ сохранения биоразнообразия.

1.2. Методы консервации микроорганизмов.

1.3. Характер и особенности повреждений микроорганизмов при консервации.

1.4.Экологические факторы, влияющие на сохранение жизнеспособности микроорганизмов при переводе их в анабиотическое состояние.

1.4.1. Биотические факторы.

1.4.2. Абиотические факторы.

1.5. Синтез и химические реакции активных форм кислорода.

1.6. Экологические аспекты действия антиоксидантов.

1.7. Методические подходы к оценке влияния антиоксидантов на микроорганизмы.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Экспериментальная модель.

2.2. Химические соединения, использованные в работе.

2.3. Изучение биологической активности соединений.

2.4. Определение роли синтетических антиоксидантов в защите бактериальных клеток в условиях стресса, вызванного действием абиотических факторов.

2.5. Определение влияния синтетических антиоксидантов на выживаемость грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов при стрессовом действии абиотических факторов.

2.6. Методы консервации микроорганизмов и определения продолжительности их хранения.

2.7. Изучение морфологических изменений бактериальных клеток на фоне действия абиотических факторов.

2.8. Оценка действия антиоксидантов на клеточную поверхность бактерий и определение их локализации.

2.9. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Изучение биологической активности синтезированных веществ, относящихся к различным видам гетероциклических соединений.

3.1. Определение антифаговой активности исследуемых соединений.

3.2. Определение антиоксидантной активности исследуемых соединений.

3.3. Зависимость биологической активности соединений от их химической структуры на примере ряда кумаринов.

3.4. Изучение влияния синтетических антиоксидантов на собственные антиокислительные системы бактериальных клеток.

Глава 4. Использование синтетических антиоксидантов для стабилизации популяционного состава бактерий на фоне действия различных абиотических факторов.

4.1. Роль синтетических антиоксидантов в повышении выживаемости различных групп микроорганизмов.

4.2. Испытание новых сред защиты для повышения выживаемости бактериальных клеток в условиях стресса, вызванного процессом лиофилизации.

4.3. Морфологические изменения в бактериальных клетках, находящихся в условиях стресса

Глава 5. Изучение взаимодействия антиоксидантов с поверхностными структурами бактериальных клеток.

5.1. Оценка влияния синтетических антиоксидантов на бактериальные клетки по изменению их электроповерхностных свойств.

5.2. Определение локализации синтетических антиоксидантов на бактериальных клетках с использованием электронноконтрастных веществ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и использование синтетических соединений гетероциклического ряда для сохранения стабильности популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов"

В основе всех методов консервации, предлагаемых на сегодняшний день, лежит перевод клеток в состояние анабиоза, что ведет к снижению или прекращению всех метаболических процессов (Сидякина, 1985). Основными методами длительного хранения микроорганизмов являются высушивание, лиофилизация, Ь-высушивание, хранение при низких температурах, криоконсервация, хранение на носителях органической и неорганической природы. При консервации вышеизложенными методами клетки подвергаются действию экологических факторов абиотической природы. Так высушивание приводит к потере биологически активной воды, при криоконсервации и низкотемпературном замораживании клетки претерпевают действие замораживания - оттаивания. В процессе лиофилизации микроорганизмы подвергаются воздействию отрицательных температур и вакуума. В результате перечисленных процессов происходит гибель части клеточной популяции. Еще одной из причин гибели микроорганизмов является окислительный стресс, в результате которого образуются активные формы кислорода, которые оказывают губительное действие на клетки (Фатеева, 1983). Поэтому совершенствование методов консервации является актуальной проблемой в прикладной микробиологии (Осадчая, Кудрявцев, Сафронова, 2002).

Инактивация микроорганизмами активных форм кислорода достигается с помощью собственных антиокислительных систем, в результате чего содержание продуктов свободнорадикального окисления находится на крайне низком уровне (Куликов и др., 1995). Результаты исследований показали, что ферменты, обеспечивающие защиту клеток от окислительного стресса, локализуются преимущественно на наружной мембране, в цитоплазме микроорганизмов, а также обнаруживаются во фракции периплазмы (Дробков, Погорельский, Дармов, 1997; Брюханов, Тауэр, Нетрусов, 2002).

В последнее время появилось большое количество синтетических антиоксидантов - веществ различной химической природы, обладающих антиокислительными свойствами. Одним из перспективных направлений использования этих соединений является применение их в составе сред стабилизации при консервации микроорганизмов, так как некоторые высокоэффективные синтетические антиоксиданты оказывают выраженное защитное действие и стабилизируют состав популяции (Плотников, Шведун, Гусева, 1995; Липатова, Сотников, Федотова, 1995).

Цель и задачи исследования. Цель работы заключается в поиске и отборе синтезированных гетероциклических соединений и их предшественников с антиоксидантной активностью и применении их для поддержания стабильности популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов на фоне действия абиотических экологических факторов.

Для реализации указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить биологическую активность новых синтетических веществ группы гетероциклических соединений и их предшественников с целью отбора перспективных антиоксидантов.

5. Изучить влияние синтетических антиоксидантов нового ряда на электроповерхностные свойства бактерий и определить их локализацию. Научная новизна. Впервые была изучена биологическая активность новых синтетических веществ группы гетероциклических соединений и их предшественников и отобраны перспективные антиоксиданты для практического применения. Показана высокая эффективность применения синтетических антиоксидантов нового класса для стабилизации свойств популяции и увеличения сроков хранения бактерий в процессе консервации (лиофилизации), а также повышение жизнеспособности грамположительных и грамотрицательных бактерий на фоне действия других абиотических факторов (замораживание-оттаивание, ультрафиолетовое излучение). Установлены морфологические изменения в бактериальных клетках при действии различных экологических факторов абиотической природы и сохранение структуры бактерий при использовании отобранных синтетических антиоксидантов.

Впервые установлено влияние синтетических антиоксидантов на электроповерхностные свойства бактерий и отдельные структуры бактериальных клеток и показана локализация синтетических веществ на примере таллийорганических соединений, обладающих антиоксидантной активностью.

Практическая значимость. Изученные и отобранные нами синтетические антиоксиданты предложены как дополнительные компоненты сред защиты, и в дальнейшем могут быть использованы для поддержания стабильности популяционного состава бактерий и повышения их выживаемости в условиях стресса, вызванного действием различных абиотических факторов. Применение разработанного нами методического подхода позволит оптимизировать процедуру поддержания специализированных национальных коллекций, повысить эффективность, безопасность и экономичность их функционирования.

Полученные нами данные о влиянии синтетических антиоксидантов на собственные антиокислительные системы бактерий и электроповерхностные свойства клеток используются в учебном процессе при чтении общих курсов микробиологии и биотехнологии, а также в специальных курсах при подготовке специалистов-микробиологов в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Синтезированные соединения нового ряда группы гетероциклических соединений и их предшественников, обладающие низкой антифаговой и высокой антиоксидантной активностью, могут быть успешно использованы для повышения жизнеспособности и стабилизации свойств популяций коллекционных культур микроорганизмов на фоне стрессовых воздействий различных абиотических факторов.

2. Взаимодействие новых синтетических антиоксидантов циклического ряда с бактериальными клетками ведет к изменению уровня собственных антиокислительных ферментов, отражающих стабильность состава популяции.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на региональной научной конференции «Молодежь и наука на пороге XXI века» (Саратов, 1998 г), XXVI межвузовской научно-практической конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященная памяти академика E.H. Павловского (Санкт-Петербург, 1999), научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999) и симпозиуме «Свободные радикалы в биологии и медицине» (Лодзь, Польша, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, состоящей из 4 глав,

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Нечаева, Ольга Викторовна

Выводы

1. Впервые изучена биологическая активность 40 синтезированных веществ нового ряда группы гетероциклических соединений и их предшественников: кислородсодержащих гетероциклов, циклических конденсированных пиранов и тиопиранов, конденсированных дигидропиридинов и пиридинов, кетонов, конденсированных замещенных диазобицикло-нондиенов и комплекса меди с органическим лигандом; а также селенорганического и таллийорганических соединений. Исследованные соединения классифицированы по уровню биологической агрессии и антиоксидантной активности.

2. Отобраны соединения с низким уровнем биологической агрессии и высокой антиоксидантной активностью: ацетамидокумарин, тетрагидротиохромен и метоксифенил-гексагидрохинолин, введение которых в состав стандартных сред стабилизации увеличивает сроки хранения лиофилизированных образцов бактерий по сравнению с контролем в 1,1 - 3,9 раза при сохранении исходных свойств исследуемых популяций.

3. Показано влияние диметилциклогександиона на стабилизацию популяционного состава бактерий при экологически неблагоприятных условиях. Выживаемость Е. coli возрастала в 1,4 - 8,5 раз, a S. aureus - в 1,9 - 6,8 раз в зависимости от времени стрессового воздействия по сравнению с контролем.

4. Впервые установлена корреляция между уровнем собственных антиокислительных ферментов клетки, отражающих стабильность состава популяции, и синтетическими антиоксидангами: введение последних в бактериальную клетку приводит к снижению уровня собственных ферментов, что свидетельствует о компенсаторной роли синтетических антиоксидантов при защите бактериальной клетки от повреждающего действия активных форм кислорода.

5. Установлено, что обработка клеток вакцинного штамма У.реБИБ ЕУ НИИЭГ синтетическими антиоксидантами различных классов и групп приводит к изменению электрофоретической подвижности бактерий, что свидетельствует об изменении электрического заряда клеточной поверхности.

6. Выявлены морфологические изменения в популяционном составе бактерий при действии различных абиотических факторов. Впервые методами электронной микроскопии показано, что синтетические антиоксиданты в составе сред стабилизации при лиофилизации бактерий значительно повышают число клеток с сохраненными поверхностными и внутренними структурами. Использование электронноконтрастных синтетических антиоксидантов на основе теллурита калия доказало их локализацию на поверхностных структурах бактериальной клетки.

Заключение

Сохранение исходных гено- и фенотипических свойств микроорганизмов необходимо не только для сбережения существующего биоразнообразия и генофонда нашей планеты, но и для развития микробиологии, генетики, биохимии, микробиологической промышленности, различных направлений биотехнологии и т.д. (Калакуцкий и др., 1996; АцшИаг, 1991). Совершенствование технологии консервации микроорганизмов и увеличение продолжительности их хранения с неизменными свойствами остается актуальной проблемой современной микробиологии.

В последние годы все более широкое применение при хранении микроорганизмов находят природные и синтетические антиоксиданты -вещества, способные подавлять процесс радикально-цепного окисления органических и высокомолекулярных соединений и, таким образом, восстанавливать нормальную жизнедеятельность клеток. Успешное решение задач по разработке новых компонентов сред защиты позволяют оптимизировать процедуру поддержания специализированных коллекций, повысить эффективность, безопасность и экономичность их функционирования. В то же время анализ изменений, происходящих в процессе перевода микроорганизмов в состояние анабиоза, позволяет углубить знания о механизмах выживания бактериальных клеток в экстремальных условиях.

Нами изучалась биологическая активность синтетических антиоксидантов с целью отбора их для дальнейшего применения при поддержании стабильности популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов и изучения механизмов взаимодействия с бактериальной клеткой. Отбор препаратов проводился поэтапно при изучении их антифаговой и антиоксидантной активности. Исследование биологической активности 40 синтезированных соединений и их предшественников, представленных кислородсодержащими гетероциклами, конденсированными дигидропиридинами и пиридинами, циклическими конденсированными пиранами и тиопиранами, кетонами, селенорганическими и таллийорганическими соединения, конденсированными замещенными диазобицикло-нондиенами и комплексом меди с органическими лигандами, показало, что биологическая активность определяется структурой не только основного кольца исследованных соединений, но и их боковыми радикалами.

По показателям антифаговой активности большинство азот- и серусодержащих гетероциклов были отнесены к группе слабоингибирующих или индифферентных веществ. Введение кислорода в основное кольцо приводило к тому, что серу- и кислородсодержащие гетероциклы приобретали свойства инактивирующих соединений. Кетоны были индифферентны по действию на бактериофаг, а диазобицикло-нондиены характеризовались слабоингирующими свойствами. Высоко токсичными для бактериофага оказались селенорганическое соединение и комплекс меди с органическими лигандами, которые вызывали его практически полную гибель. Также было установлено, что фенильные производные ТОС (соединения I типа) обладают большей антифаговой активностью, чем их замещенные производные (II тип).

Предварительная оценка биологической безвредности в тесте Е. coli В — бактериофаг Т4 и высокие показатели антиоксидантной активности, определяемой в системе свободно-радикального окисления по хемилюминесцентному ответу, дали возможность отобрать три соединения: ацетамидокумарин, тетрагидротиохромен и метоксифенил-гексагидрохинолин. Испытания в составе сред стабилизации при лиофилизации вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ позволили отнести их в разряд перспективных, так как они увеличивали продолжительность хранения лиофилизированных бактерий с сохранением исходных свойств в 1,1-3,9 раза по сравнению с контролем. Следовательно, эти вещества могут быть использованы при консервации других микроорганизмов.

Для преодоления окислительного стресса в процессе лиофилизации бактерий нами были подобраны в средах защиты оптимальные концентрации антиоксидантов (25 мкг/мл) при использовании различных растворителей (0,1 % ДМСО, 0,1 % этанол). Кроме того, в состав сред стабилизации были введены дополнительные защитные белковые компоненты (нормальная лошадиная сыворотка). Защитные свойства сред стабилизации усилил растворитель - ДМСО, который, экранируя SH-группы белковых структур клетки, защищал активные центры жизненноважных белковых комплексов. Стабилизирующий эффект при лиофилизации оказывали также нормальная лошадиная сыворотка и этанол.

При изучении влияния синтетических антиоксидантов на сохранение стабильности популяционного состава грамположительных и грамотрицательных бактерий при стрессовых воздействиях других абиотических факторов нами было отобрано и исследовано соединение, относящееся к ряду кетонов - диметил-циклогександион. Полученные результаты показали, что при воздействии на микроорганизмы различных режимов замораживания-оттаивания и УФ излучения, процент выживаемости клеток Е. coli возрастал в 1,4 - 8,5 раз, a S. aureus - в 1,9-6,8 раз по сравнению с контролем (в зависимости от длительности действия стрессора).

Изучение взаимодействия антиокислительных ферментных систем бактериальной клетки и исследуемых гетероциклических соединений подтвердило нашу гипотезу о том, что синтетические антиоксиданты компенсируют действие собственных антиокислительных систем клетки и инактивируют АФК. Электронно-микроскопическое исследование морфологии бактериальных клеток в процессе лиофилизации с применением синтетических антиоксидантов показало, что в опытных образцах лиофилизированного штамма чумного микроба содержалось большее количество клеток с целостной структурой не только поверхностного слоя (мембранный аппарат), но и рибосомального аппарата и нуклеоида. Это свидетельствовало о защитной роли примененных антиоксидантов при лиофилизации бактерий.

Определение взаимодействия исследуемых соединений с поверхностными структурами бактериальных клеток позволило установить их локализацию, которая была подтверждена в тесте по изменению электрофоретической подвижности бактерий с использованием электрофореза в свободном потоке. Проведенные эксперименты позволили установить, что обработка клеток как ДМСО и этанолом, так и различными синтетическими антиоксидантами приводила к изменению электрофоретической подвижности исследуемых бактерий, что свидетельствовало о локализации данных веществ на клеточной поверхности. Этот факт был подтвержден также с использованием методов электронной микроскопии. Нами были отобраны таллийорганические соединения на основании их принадлежности к группе тяжелых металлов, место локализации которых выявляются в виде электронноплотных образований. Полученные результаты показали, что гранулы таллийорганического соединения равномерно покрывали всю клеточную поверхность, а также находились в окружающем клетку пространстве, что является подтверждением защиты бактериальных клеток от различных стрессовых воздействий веществами, находящимися на клеточной поверхности.

Таким образом, испытанные препараты могут служить надежными средствами защиты клеток при различных стрессовых состояниях. Поэтому следует считать перспективными области применения синтетических антиоксидантов, где биологический объект находится в условиях стресса: использование для консервации широкого профиля биологических объектов микробиологического и не микробиологического профиля; разработки технологий по стабилизации вакцинных штаммов, штаммов-продуцентов биологически активных веществ; совершенствование биотехнологических линий.

124

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нечаева, Ольга Викторовна, Саратов

1. Аболина Т.А. Микроэлектрофорез как метод изучения поверхностной структуры бактериальных клеток // ЖМЭИ. 1980. - N 4. - С. 21-28.

2. Аболина Т.А. Сравнительное изучение электрокинетических свойств бактерий рода Brucella: Дис. .канд. мед. наук. Ставрополь. 1982. -151 с.

3. Автушенко С.С., Сорокин Е.М., Смирнова Л.Ф. Стабилизирующее действие модифицированных полиэтилениминов на клетки вакцинного штамма Yersinia pestis EVII Биотехнология. N 3. - 1992. - С. 39-43.

4. Аксенов С.И. О предельной продолжительности анабиоза у микроорганизмов // Микробиология. 1982. - Т. 51, N 5. -С. 877-879.

5. Актуальные проблемы криобиологии. / Под ред. Н.С. Пушкаря и A.M. Белоуса. Киев: Наукова Думка. 1981. - 234 с.

6. Арзуманян В.Г., Воронина H.A., Гейдебрехт О.В. Антагонистическое взаимодействие стрессорных факторов при росте микроорганизмов в условиях, имитирующих параметры их природных экотопов // Микробиология. 2002. - Т. 71, N 2. - С. 160-165.

7. Аркадьева З.А. Факторы, влияющие на жизнеспособность микроорганизмов при различных методах хранения. Научн. докл. высшей школы. Биол. науки. - 1983. - N 4. - С. 93-105.

8. Архипова О.Т. Определение хемилюминесценции в сыворотке крови // Методы исследования в профпатологии. М. - 1988. - 32 с.

9. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. -1986.-184 с.

10. Бакалова Р., Соколова Ц., Рибаров С., Каган В. Эффективность действия а-токоферола и его гомологов на люминолзависимуюхемилюминесценцию // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1991. -N5.-C. 482-485.

11. Бакуев М.М., Саидов М.З., Бутаков A.A. Особенности секреции миелопероксидазы и хемилюминесцентного ответа нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы //Иммунология. 1991.-N 1.-С. 15-17.

12. Балакирева С.Ю., Тучин C.B., Легконогих И.П. Электрокинетические свойства клеток золотистого стафилококка // ЖМЭИ. 1982. - N 4. -С. 22-25.

13. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. М.: Медицина. 2003. - 136 с.

14. Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп патогенности: Санитарные правила. М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России. 1994. - 17 с.

15. Бекер A.M., Рапопорт А.И., Калакуцкий Л.В. Торможение жизнедеятельности клеток. Рига: Зинатне. 1987. - 240 с.

16. Бекер М.Е. Обезвоживание как метод консервации. В кн.: Биотехнология микробного синтеза. Рига: Зинатне. 1980. -С. 231-234.

17. Бекер М.Е., Дамберг Б.Е., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. Рига: Зинатне. 1981. - 312 с.

18. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев: Наукова думка. -1982.-247 с.

19. Белоус A.M., Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П. Молекулярные механизмы криоповреждения биомембран // В сб.: Итоги науки и техники. Серия биофизика. 1978. - Т. 9. - С. 80-110.

20. Белоус A.M., Цветков И.Д. Научные основы сублимационного консервирования. Киев: Наукова думка. - 1985. - 207 с.

21. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М.: Медицина. 1989. - 368 с.

22. Бойцов А.Г. Характеристика электрокинетических свойств бактерий кишечной группы: Автореф. дис. канд. мед. наук. Л. — 1981. — 25 с.

23. Бронштейн B.JL, Розанов Л.Ф. Начальное переохлаждение как фактор повреждения при замораживании клеточных суспензий // Криобиология и криомедицина. 1977. - Вып. 3. - С. 26-29.

24. Брюханов A.JL, Тауэр Р.К., Нетрусов А.И. Каталаза и супероксиддисмутаза в клетках строго анаэробных микроорганизмов // Микробиология. 2002. - Т. 71, N 3. - С. 330-335.

25. Бурлакова Е.Б., Губарева А.Е., Архипова Г.В., Рогинский В.А. Модуляция перекисного окислениялипидов биогенными аминами в модельных системах // Вопр. мед. химии. 1992. - N 2. - С. 17-20.

26. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах // В сб.: Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. -1991.- Т. 29.-С. 1-249.

27. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М. 1972. - 251 с.

28. Вопросы криоконсервирования биологических объектов. / Под ред. Н.С. Пушкаря. Киев: Наукова думка. 1978. - 148 с.

29. Гааль Э., Медвеши Г., Верецкеи JI. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир. 1982. - 448 с.

30. Георгиева Н., Гаджаева В. Изоникотиноилгидразоновые аналоги изониазида: взаимосвязь между антиоксидантной активностью и бактериостатической активностью // Биохимия. 2002. - Т. 67, Вып. 5.-С. 705-710.

31. Герна Г. Хранение микроорганизмов. В кн.: Методы общей бактериологии. / Под ред. Ф. Герхарда. Т. 1. - М.: Мир. - 1983. -С. 12-536.

32. Голдовский A.M. Анабиоз. Л.: Наука. 1981. - 348 с.

33. Головлев E.JI. Реакция бактериальных клеток на холодовой шок на уровне динамики хромосомы, транскрипции и трансляции // Микробиология. 2003. - Т.72, N 1. - С. 5-13.

34. Горбатенкова Е.А., Владимиров Ю.А., Парамонов Н.В., Азизова O.A. Красный свет гелий-неонового лазера реактивирует супероксиддисмутазу // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1989. -N3.- С. 302-305.

35. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология: В 3-х т. Т. 1. М.: «Мир». -1993.-368 с.

36. Гузев B.C., Звягинцев Д.Г. Микроэлектрофорез клеток микроорганизмов // Вестн. МГУ. 1971. - Сер. VI, N 6. - С. 90-95.

37. Гузев B.C., Звягинцев Д.Г. Электрокинетические свойства клеток микроорганизмов и их систематика // Микробиология. 1973. — Т.42. -С. 708-712.

38. Гусев В.А., Брусов О.С., Панченко Л.Ф. Супероксиддисмутаза — радиобиологическое значение и возможности // Вопр. мед. химии. — 1980. -N 3. С.291-301.

39. Давиденкова Е.Ф., Шафран Н.Г. Атеросклероз и процесс перекисного окисления липидов // Вест. АМН СССР. 1989. - N 3. - С. 10-18.

40. Давыдова М.Н., Сабирова Р.З. Антиоксидантные ферменты сульфатредуцирующей бактерии Desulfovibrio desulfuricans: супероксиддисмутаза и пероксидазы // Биохимия. 2002. - Т. 67, Вып. 7.-С. 990-994.

41. Демина Н.С., Лысенко C.B. Действие дегидратации на микроорганизмы // Биол. науки. 1987. - N 8. - С. 50-62.

42. Дробков В.И., Погорельский И.П., Дармов И.В. Локализация супероксиддисмутаз в клетках чумного микроба // Матер, научно-практич. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сентября 1997 г.). Саратов. - 1997. - Т.2. -С.80-87.

43. Евтушенко А.Д. Применение электрофореза для концентрирования и типирования микроорганизмов при лабораторной диагностике бактериальных инфекций: Автореф. дис. . док. мед. наук. Челябинск. 1973. - 25 с.

44. Журавлев А.И. Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей // Биохемилюминесценция. М.: Наука. - 1983. - С. 3-30.

45. Зенков Н.К., Меныцикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи соврем, биологии. -1993. Т. 113, Вып. 3. - С. 286-296.

46. Игнатов С.Г., Красников В.А. Исследование функциональных и структурных изменений мембранного аппарата после низкотемпературного замораживания // Биохимия. 1981. - Т. 46, N 1. - С. 1996-2003.

47. Идельчик М.С., Черняева Л.И., Прокопенко H.A. Длительное хранение музейных культур микроорганизмов в виде желатиновых дисков // Научн. докл. высш. школы. Биол. науки. 1983. - N 2. -С. 97-100.

48. Имшенецкий A.A., Лысенко C.B., Писаренко Н.Ф. О некоторых особенностях микроорганизмов, подвергнутых воздействию вакуума // Микробиология. 1982. -Т.51, Вып. 1. - С. 107-110

49. Инструкция по лиофильному высушиванию возбудителей инфекционных заболеваний I-IV групп на коллектороном аппарате К.Е. Долинова. Саратов. 1979. - 22 с.

50. Иткин Ю.А., Бронштейн В.Л., Розанов Л.Ф. Изучение влияния структуры льда на процесс обезвоживания и внутриклеточную кристаллизацию при замораживании клеточной суспензии // Криобиология и криомедицина. — 1977. — Вып. 3. С. 35-41.

51. Кадетов В.В., Король В.В., Терентьев А.Н. Принципы лиофилизации вирусов // Вопросы вирусологии. N 3. - 1986. - С. 275-279.

52. Калакуцкий J1.B., Озерская С.М., Евтушенко Л.И., Мазанов А.Л. Российские коллекции микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т. 32, N 1. - С. 144-154.

53. Калакуцкий Л.В., Сидякина Т.М. Сохранение жизнеспособности микроорганизмами в природе и основные подходы к консервации коллекционных культур // Тез. докл. 2-й Всесоюзной конференции по анабиозу. Рига, 16-18 октября 1984. С. 19-20.

54. Калакуцкий Л.В., Сидякина Т.М. Анабиоз и консервация микроорганизмов // Криобиология. 1988. - N 4. - С.3-9.

55. Карупу В.Я. Электронная микроскопия. Киев: Вища школа. Головное изд-во. 1984. - 208 с.

56. Красновский А.А. Синглетный молекулярный кислород: механизмы образования и пути дезактивации в фотосинтетических системах // Биофизика. 1994. - Т. 39, Вып. 2. - С. 236-250.

57. Куликов О.А., Дробков В.И., Дармов И.В., Смирнов Е.В. Супероксиддисмутазы чумного микроба // Вестник РАМН. 1995. -N 5. - С.45—49.

58. Кузнецов В.Д., Филиппова С.И., Муравьева С.А. Прогнозирование выживаемости лиофилизированных спор Actinomyces parveellus, основанное на «методе ускоренного хранения» // Микробиология. — 1977. Т. 46, N2. - С. 427-431.

59. Кунтиков Е.И., Горленко В.М. Взаимосвязь гало- и термотолерантности у аноксигенных фототрофных бактерий // Микробиология. 1998. - Т.67, N 3. - С. 298-304.

60. Ларкий Э.Г. Методы определения и метаболизм металлобелковых комплексов // В сб.: Итоги науки и техники. Сер. Биологическая химия. 1990. - Т. 41. - С. 41-53.

61. Липатова Е.В., Сотников А.А., Федотова О.В. Синтез и реакционная способность биологически активных карбонилзамещенныхспирогидропиранов и их N-гетероаналогов // Журн. Органическая химия. Симп. по орг. химии. С-Петербург. - 1995. - С. 225-226.

62. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М. 1998. - 256 с.

63. Лукьянова Л.Д. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. М. 1982. - 225 с.

64. Малайцев В.В., Богзакова И.Н. Электрофоретическая и иммунологическая характеристика Fe+ и Fe" фракций клеток селезенок мышей СВА // Бюл. эксперим. и биол. медицины. 1977. -N 10.-С. 451-454.

65. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Адаптация фитопатогенного гриба Fusarium decemcellulare к окислительному стрессу // Микробиология. 2001. - Т.70, N 1. - С. 14-18.

66. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Дыхательная активность и образование нафтохиноновых пигментов у гриба Fusarium, decemcellulare в условиях окислительного стресса // Микробиология. 2002. - Т.71, N 2. - С. 176-182.

67. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Шергин С.М. Биохимия окислительного стресса. Оксиданты и антиоксиданты. Новосибирск. -1994.-203 с.

68. Мерзляк М.Н., Соболев A.C. Роль супероксидных анион-радикалов и синглетного кислорода в патологии мембран // Биофизика. 1975. — Т. 5.-С. 118-127.

69. Методика определения термостабильности живых сухих вакцин и прогнозирование их жизнеспособности в процессе хранения: Методические рекомендации. Ставрополь. — 1985. 10 с.

70. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания-высушивания биологических препаратов. М. 1981. - 34 с.

71. Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических структур. / Под ред. Н.С. Пушкаря и др. Киев: Наукова думка. 1977. -187 с.

72. Мирошников А.И., Фомченков В.М., Габуев И.С. Разделение клеточных суспензий. М.: Наука. 1977. - 168 с.

73. Мирошников А.И., Фомченков В.М., Иванов А.Ю. Электрофоретический анализ и разделение клеток. М.: Наука. 1986. -184 с.

74. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JT.A. Влияние некоторых факторов на криорезистентность и сохранение жизнеспособности при лиофилизации культур Bacillus subtilis // Биотехнология. 2002. -N3.-C. 45-54.

75. Панюшкин Ю.А., Панюшкина Н.В. Использование некоторых продуктов растительного происхождения как клеточных антиоксидантов // Тез. I Всесоюзной конф. «БиоАО». Черноголовка.- 1983. -Т. 1.-С. 12.

76. Победимский Д.Г., Винаров А.Ю., Решетник O.A. Влияние антиоксидантов на получение микробной биомассы // Acta Biotechnol.- 1988.-V. 8, N 1. -P. 55-69.

77. Поберезкина Н.Б., Лосинская Л.Ф. Биологическая роль супероксиддисмутазы // Укр. биохим. журн. 1989. - Т.61, N 2. -С. 14-27.

78. Потапович А.Ю., Костюк В.А. Сравнительное исследование антиоксидантных свойств и цитопротективной активности флавоноидов // Биохимия. 2003. - Т. 68, Вып. 5. - С. 632-638.

79. Пучков Е.О., Говорунов И.Г. Проблемы криоконсервации бактериальных структур. Серия «Консервация генетических ресурсов». Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1983. - 64 с.

80. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Актуальные проблемы криобиологии. Киев: Наукова думка. 1981. - 221 с.

81. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Низкотемпературная кристаллизация в биологических системах. Киев: Наукова думка. 1977. - 268 с.

82. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Цветков И.Д. Теория и практика криогенного и сублимационного консервирования. Киев.- Наукова думка. 1984.-261 с.

83. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов. Серия «Консервация генетических расурсов». Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1985. -63 с.

84. Сидякина Т.М. Методы консервации микроорганизмов. Серия «Консервация генетических расурсов». Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР.- 1988.-58 с.

85. Смирнова Г.В., Закирова О.Н., Октябрьский О.Н. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на холодовой стресс // Микробиология. 2001. - Т. 70, N 1. - С. 55-60.

86. Смирнова Е.Г., Любимов Ю.И., Малинина Т.Г. Ионол (ВНТ) продуцирует супероксид-анион // Биохимия. 2002. - Т. 67, Вып. 11. -С. 1539-1544.

87. Смирнова Н.С., Плотников О.П., Виноградова H.A. Синтез и биологическая активность 7-аза-8-(оксо-бицикло-4.3.0.-нонадиенов-6.9) // Химико-фармацевт. журн. 1995. - N 1. - С. 44-46.

88. Смирнов К.К. Исследования электроповерхностной гетерогенности популяций энтеробактерий: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов. 1985.- 19 с.

89. Степанов О.И., Ошмарин А.П., Ошмарин П.Г., Еремейшвили А.В. Микроскопическая техника: Учебное пособие. Ярославль. 1991. -96 с.

90. Суслова Т.В., Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. В кн.: Биологические мембраны. М.: Медицина. 1973. - С. 75-93.

91. Титов В.Ю., Петренко Ю.М. Взаимодействие нитрита с каталазой как важный элемент его токсичности // Биохимия. 2003. -Т. 68, Вып. 6.- С. 769-776.

92. Ткаченко А.Г., Пшеничнов М.Р., Нестерова Л.Ю. Путресцин как фактор защиты Escherichia coli от окислительного стресса // Микробиология. 2001. - Т. 70, N 4. - С. 487-494.

93. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов // Биохимия. 2002. - Т. 67, Вып. 3. - С. 339-352.

94. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: «Мир». -1975.-325 с.

95. Фатеева М.В. Коллекции микроорганизмов и методы длительного хранения коллекционных культур // Успехи микробиологии. 1983. -N 18. - С.193-215.

96. Федотов П.В., Синявский Ю.А., Айдарханов Б.Б. Антиоксидантные свойства некоторых овощных соков // Тез. I Всесоюзной конф. «БиоАО». Черноголовка. - 1983. - Т. 1. - С. 14.

97. Фонштейн Л.М., Сурайкина Т.И., Таль Е.К. Действие солей палладия и платины на бактериофаг Т4 и его изолированную ДНК // Генетика.- 1975.-Т. 11, N7.-С. 128-133.

98. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М.: Наука. 1985. - 472 с.

99. Цуцаева А.А., Сафонова Т.С. Влияние низких температур (-196°С) и криопротекторов на некоторые виды бактерий // Микробиология. -1978. Т. 47, N 3. - С. 446-450.

100. Цуцаева А.А., Сафонова Т.С. Влияние физиологического состояния клеток Е. coli на чувствительность к действию низких температур // Микробиология. 1980. - Т. 49, N 1. - С. 179-182.

101. American Type Culture Collection Methods. I. Laboratory manual on preservation. Freezing and freeze-drying as applied to algae, bacteria, fungi and protozoa. Ed. by H. Hatt, Rockville, Maryland: ATCC, 1980.

102. Aquillar A. New scientific challenges for microbial culture collections // World J. Microbiol. Biotechnol. 1991. - V. 7, N 3. - P. 289-291.

103. Arciola C.R., Baldassarri L., Montanaro L. Presence of icaA and icaD genes and slime production in a collection of Staphylococcal strains from catheter-associated infections // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39, N 6. — P. 2151-2156.

104. Ash wood-Smith M.J. Preservation of microorganisms by freezing, freeze-drying and desiccation. In: Low temperature preservation in medicine and biology. Ed. by M.J.Ashwood-Smith and J. Farrant. Pitman Press. — London. - 1980. - P. 219-252.

105. Babcock G.T., Varotsis C., Zhang Y. 02 activation in cytochrome oxidase and in other heme proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1992. - V. 1101, N 1. - P. 192-194

106. Bank H., Mazur P. Visualization of freezing damage // J. Cell. Biol. — 1973. V. 57, N 3. - P. 729-742.

107. Banno J., Sakane T. Viability of various bacteria after L-drying // I.F.O. Res. Commun. 1979. - V. 9. - P. 35-45.

108. Bast A., Haenen G.R.M.M., Doelman C.J.A. Oxidants and antioxidants: State of the art // Amer. J. Med. 1991. - V. 91, N 1 - Suppl. 3C. -P. 2S-13S.

109. Beyer W.F.J., Fridovich I. Assaying for superoxide dismutase activity: some large consequence of minor changes in conditions // Analit. Biochem. 1987. - V. 161, N 2 - P. 556-559

110. Billi D, Wright D.J., Richard F.,Helm R.F., Prickett T. Engineering desiccation tolerance in Escherichia coli II Appl. Environ. Microbiol. -2000. -V. 66, N 4. P. 1680-1684.

111. Brenot A., King K.Y., Janowiak B. Contribution of glutathione peroxidase to the virulence of Streptococcus pyogenes II J. Infect. Immun. 2004. -V. 72, N1.-P. 408-413.

112. Byczkowski J.Z., Gessner T. Biological role of superoxide ion-radical // Int. J. Biochem. 1983. - V. 20, N 2. - P. 569-580.

113. Calcott P.H., Lee S.K., Mac Leod R.A. The effect of cooling and warming rates on the survival of variety of bacteria // Canad. J. Microbiol. -1976. -V. 22, N1.-P. 106-109.

114. Calcott P.H., Rose A.H. Freeze-thaw and cold shock resistance of Saccharomyces cerevisiae as affected by plasma membrane lipid composition // J. Gen. Microbiol. 1982. - V. 128, N 2. - P. 117-120.

115. Cameron R.E. Morell F.A. Viable microorganisms from ancient Ross Island and Taylor Valley drill core // Antarctic J. U.S. 1974. - V. 9, N 4. -P. 113-116.

116. Cohen H.J. The use of diaminobensidine for spectrophotometric and acrylamide gel detection of sulfite oxidase and irs applicability to hydrogen peroxide-generating enzymes // Analit. Biochem. 1973. -V. 53, N1.-P. 208-222

117. Collinson L.P., Dawes I.W. Inducibility of the response of yeast cell to peroxide stress // J. Gen. Microbiol. 1992. - V. 138, N 2. - P. 329-335.

118. Cross A.R., Jones O.T.G. Ensymic mechanisms of superoxide production //Biochim. Biophys. Acta.- 1991.-V. 1057,N 1.-P. 281-298

119. Demple B., Amabile-Cuevas C.F. Redox redux: The control of oxidative stress responses // Cell. 1991. - V. 67, N 2. - P. 837-839.

120. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - V. 15, N 2. -P. 167-193.

121. Drancourt M., Bollet C., Carlioz A., Martelin R. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38, N 10. -P. 3623-3630.

122. Douglas K.T., Bunni M.A., Baindur S.R. Thallium in biochemistry // Int. J. Biochem. 1990. -V. 43, N 1. - P. 17-23.

123. Effect of low temperatures on biological membranes. Ed. by G. Morris and A. Clark. Acad. Press. -N.Y. 1981. - P. 335-339

124. Eisenberg W.C., Taylor K., Guerrero R.R. Cytogenetic effects of singlet oxygen //J. Photochem. Photobiol. 1992. - V. 16, N 1. - P. 381-384.

125. Farr S.B., Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium II Microbiol. Rev. 1991. - V. 55. - P. 561-585

126. Farrant J. Freeze-thaw injury in living cells // Int. J. Refrig. 1980. - V. 3, N4.-P. 191-195.

127. Farrant J., Walter C.A. Use of two-step cooling procedures to examine factors, influencing cell survival folloving freezing and thawing // Cryobiology. -1977. V. 14, N 3. - P. 273-286.

128. Fridovich I. Superoxide dismutases // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264, N 11.-P. 7761-7764.

129. Gregory E.M., Moore W.E.C., Holdeman L.V. Superoxide dismutase in anaerobes: survey // Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 35, N 5. -P. 988-991.

130. Hannig K. New aspects in preparative and analitical continuous free-flow cell electroforesis // Electroforesis. 1982. - V. 3, N 1. - P. 235-243.

131. Hannig R., Heidrich H.-G., Rnofat W., Pascher G., Sweiger A., Stakr R., Sciller K. Separation of cells and particles by continuous free-flow electrophoresis // Handbuch: Techniques of Diochemical and Biophysical Morphology. 1972.-V. l.-P. 191-232.

132. Heckly R. J. Preservation of microorganisms // Adv. Appl. Microbiol. -V. 24. Acad. Press. - N. Y. - 1978. - P. 1-53.

133. Horneck G. Microorganisms in Spase // Adv. Spase Res. 1981. - N 1. -P. 39-48.

134. Jamasato K., Okuno D., Ohtomo T. Preservation of bacteria by freezing at moderately low temperatures // Cryobiology. 1973. - V. 10, N 5. -P. 453-463.

135. Jamasato K., Okuno D., Ohtomo T., Unami E. Survival of bacteria frozen and stored at -53 °C for 92 months // Cryobiology. 1978. - V. 15, N 6. -P. 691-692.

136. Juozaitis A, Willeke K., Grinshpun S.A., Donnelly J. Impingement into a liquid for the collection and reco. Impaction onto a glass slide or agar versus very of airborne microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. -1994. V. 60, N 3. - P. 861-870.

137. Kirsop B.E., Snell J.J. Maitenance of microorganisms. In: A manual of laboratory methods. London: Eds. Acad. Press. 1984. - 207 p.

138. Klatser P.R., Kuijper S., van Ingen C.W., Kolk A.H.J. Stabilized, freeze-dried PCR mix for detection of Mycobacteria I I J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36,N 6. -P. 1798-1800.

139. Kobayashi T., Saito N., Takemori N. Ultrastructural localization of superoxide dismutase in human skin // Acta Derm. Venerol. 1993. - V. 73, N l.-P. 41-45.

140. Koerner J.E., Anderson B.A., Dage R.C. Protection against postischemic myocardial dysfunction in anesthetized rabbits with scavengers of oxygen-derived free radicals superoxide dismutase plus catalase,

141. N-2-mercaptopropionyl glycine and captopril // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1991.-V. 17.-P. 185-192.

142. Leenanon B., Drake M.A. Acid stress, starvation, and cold stress affect poststress behavior of Escherichia coli 0157:H7 and nonpathogenic Escherichia coli II J. Food Protect. 2001. - V. 64, N 7. - P. 970-974.

143. Lenaz G. Role of mitochondria in oxidative stress and ageing // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1366, N 1. - P. 53-67.

144. Leyer G.J., Johnson E.A. Acid adaptation induces protection against environmental stressed in Salmonella typhimurium II Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59, N 8. - P. 1824-1847.

145. Low temperature preservation in medicine and biology. Ed. by M.J.Ashwood-Smith and J. Farrant. Pitman Press. London. - 1980. -134 p.

146. Lowendorf H. Factors affecting survival of Rhizobium in soil // Adv. Microb. Ecol. 1980. -N4. -P.87-124.

147. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurment with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193, N 1. -P. 265-275

148. Marcwell M.A.K., Haas S.M., Bieber L.L., Folbert N.T. A modification of the Lowry procedure to simplity protein determination in membrane and lipoprotein simples // Inf. J. Biochem. 1978. - V. 12, N 1. - P. 206-210.

149. Mazur P. Limits to life at low temperatures and at reduced water contents and water activities // Origins of Life. 1980. - V. 10, N 2. - P. 137-159.

150. McCord J.M., Fridovich I. Superoxide dismutase. An enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein) // J. Biol. Chem. 1969. - V. 244, N 9. -P.6049-6055.

151. Mills G.C. Hemoglobin catabolism. I. Glutathione peroxidase, an erythrocyte enzyme which protects hemoglobin from oxidative breakdown //J. Biol. Chem.- 1957.-V. 229, N l.-P. 189-197

152. Munkres K.D. Selection and analysis of superoxide dismutase mutants of neurospora // Free Radical Biol. Med. 1992. - V. 13, N 2. - P. 305-318.

153. Nei T, Araki T., Matasusaka T. Freezing injury to aerated and non-aerated cultures of Escherichia coli. In: Freezing and drying of microorganisms. Ed. by T. Nei. Univ. Tokyo Press. - Tokyo. - 1969. - P. 3-15.

154. Nichols D.S., Olley J., Garda H., Brenner R.R., McMeekin T.A. Effect of temperature and salinity stress on growth and lipid composition of Shewanella gelidimarina II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66, N 10.-P. 2422-2429.

155. Percy M.E. Catalase: an old enzyme with a new role? A review // Can. J. Biochem. Cell. Biol. 1984. - V. 63, N 5. - P. 1006-1014.

156. Privalle C.T., Gregory E.M. Superoxide dismutase and 02 lethality in Bacteroidesfragilis II J. BzcterioL- 1979. -V. 138, N 1.-P. 139-145.

157. Puppo A., Riguad J. Superoxide dismutase: an essential role in the protection of nitrogen fixation process // FEBS Lett. 1986. - V. 201. -P. 187-189.

158. Reynolds E.S. The use of leadcitrate at hight pH as on electron microscopy // J. Cell Biol. 1963. - V. 17, N 1. - P. 208-211.

159. Rodionov D.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. Conservation of the biotin regulon and the BirA regulatory signal in Eubacteria and Archaea II Genome Res. 2002. - V. 12, N 10. - P. 1507-1516.

160. Roots R., Okada S. Estimation of life times and diffusion distances of radicals involed in X-ray-induced DNA strand breaks or killing mammalian cells // Radiat. Res. 1975. - V. 64. - P. 306-320.

161. Salin M.L., Lyon D.S. Iron containing superoxide dismutases in eucaryotes: Localization in chloroplasts from water lily, Nuphor luteum II Oxy Radicals and Their Scavenger Systems. V. 1. - N.Y.: Elsevier. -1983.-P. 344-347.

162. Sawa D. Long-term preservation of bacteria in liquid nitrogen // Microb. Lett.-1980.-V. 14, N55.-P. 113-116.

163. Scott M.D., Lubin B.H., Zuo L., Kuypers F.A. Erythrocyte defense against hydrogen peroxide: Preeminent importance of catalase // J. Lab. Clin. Med. 1991.-V. 118,N l.-P. 7-16.

164. Sharp R.J. The preservation of genetically unstable microorganisms and the cryopreservation of fermentation seed cultures. // Adv. Biotechnol. Processes. 1984. - N 3. - P. 81-109.

165. Sneath P.H.A. Longevity of microorganisms. // Nature. 1962. - V. 195, N4842.-P. 634-646.

166. Spurr A.R. Low-viscosity epoxyresin embedding medium for electron microscopy // J. Ultrastruct. 1965. - V. 26, N 1. - P. 31-43.

167. Summer R.L. Lipoid oxidase studies a method for the determination of lipooxidase activity II Ind. Eng. Chem. - 1943. - V. 15, N 1. - P. 14-15

168. Suzuki Y., Tauchiya M., Wassail S.R. Structural and dynamic membrane properties of a-tocopherol and a-tocopherol implication to the molecular mechanism of their antioxidant potency // Biochemistry. - 1993. - V. 32, N11.-P. 10692-10699.

169. Vanasbeck B.S. Involvement of oxygen radicals and blood cells in the pathogenesis of ARDS by endotoxin and hyperoxia // Appl. Cardiopulm. Pathophysiol. 1991. - V. 4, N 1. - P. 127-138.

170. Vassilyadi M., Archibald F. Catalase, superoxiddismutase, and the production of C>2-sensitive mutants of Bacillus coagulans II Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31, N 11. - P. 994-999.

Информация о работе

Нечаева, Ольга Викторовна
кандидата биологических наук
Саратов, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Поиск и использование синтетических соединений гетероциклического ряда для сохранения стабильности популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы