Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Плазмидный анализ Yersinia pseudotuberculosis и его применение для характеристики популяции микроба и микробиологического мониторинга

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Плазмидный анализ Yersinia pseudotuberculosis и его применение для характеристики популяции микроба и микробиологического мониторинга"

РГ6 од

пОДАРСТБЕНШИ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ «КДЕРАЦИИ - О ^¿¡1 '(¿¿л- по НАРОДНОЕ ОБРАЗОВАН®)

ШПИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

владивостокский государственный медицинский институт

На правах рукописи

КЙТАЕВ ВИКТОР МИХАЙЛОВИЧ

ПЛАЗНИЛНЫЙ АНАЛИЗ Ш5ША ЮШООТВЕШШВ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОПУЛЯЦИЙ МИКРОБА И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

03.00.07 - иякробнолотал

Автореферат

диссертация на соискание поной степени кандидата ыадицниышх наук

Вдадашосток 1993

Ра уга выполнена в Научно-исследовательской институте знадешологин а иикробиологш Сиамского отделения РАШ.

Научное руководители:

Академик РАДИ, доктор издицинсип. наук, профессор Г.П.Сошв. старший научный сотрудник, кандидат цедишшских наук О. II.(Дубин.

ащальтв оппоненты. Заслувенннй дед-гель науки, доктор иадащшскцх наук, профессор Н.С.Мотавкшга; кандидат медицинских наук с.Л.Колпаков.

Ведущая организация - Российская Иадшсшская Акадеция ш.И.и.Сеча-нова.

Защита состоится 1993 г.

в_часов на заседании Специализированного Совета К OS4.24.OI

во Владивостокской Государственной медицинской институте (690&00 г,Владивосток, ул.Остряюова, 2).

С дассартацЕйй шено озаакоштьса а библиотека Владивостокского Государственного иедацпяского института.

Автореферат разослан " № " ¿¿¿РслХ^ьД 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат изд. наук, доцен?

Р.Н.Диго

Актуальность проблемц. В' послоддао год! псо слоту бор'лулз ни --чинает приобретать все большую значимость в патологии человека, что в первую очередь связано с его широким распространением. История изучения псевдотуберкулеза берет свое начало с ¡30-х годов прошлого века, однако до 50-к. годов XX столетия в литература откав.шюь лишь единичные случаи болезни у лздой, что не позволяло получить достоверные данные об этиологическом агенте данной инфекции и произвести какие-либо эпидемиологические обобщения. Решающее значение в изучении псездогуберкулеза имело открытие в 1959 году К.И.Груншшм, Г.П.Сомовш и И.Ю.Залдавером (I960) нового ого кли-нико-эпидемического проявления у человека - дальневосточной сгсар-латаноподобной лихорадка (ДСЛ). Новые данные позволили в сравнительно короткие сроки разработать рациональную систем профилактических и прошвозпидемических мероприятий.

Однако в настоящее время не все вопроса, связанные с проблемой псевдотуберкулезной 'инфекции освещены в достаточной с.епеня. Известно, что природные птамш псевдотуборкулозного микроба сыровара I способны йести ряд экстрахромосомных, саморзилкнирущихся генетических .элементов (шгазмкд) с раз липой молекулярной кассой (А.В.Ракип, Л.К.Казачонка, 1984; Щубин и соавг., 1986, 1939, 1991) Начти все описанные платит псевдотуберкулеоного микроба (за исключением шгазмкды вирулентности pCaü и плззэддц рТМЗЗ}, остаются малоизучешшмя,. криптичэскнма плазмвдами. Недостаточно изученной остается и полирезисгентаость псевдотуберкулезного микроба к лекарственным препаратам, особенно роль плаз;.31д в во Формировании. Кроме того, значителыш. трудности вызывает внутривидовое титрование возбудаиля псевдогубэркулэза традиционными катодами, серологические и биохимические методы, определение чувствительности mm устойчивости миероба к антибиотикам, чувствительности к бактериофагам в силу спродплентш. причин на дают необюдямнго эЗФэкта при его ипшровагога.

Решение указанных вопросов явилось предметом исследования в дайной работа.

Цель исследования состояла в изучения свойств бактерий псевдотуберкулеза в зависимости от состава пласмяд и возможности использования гшзмвдного анализа {в комплексе с серотипироЕа'шем и рестрикшонши анализом отдельных плазмад) для Енутривидс&ого типирования возбудителя и микробиологического молекулярно-генетаческого мониторинга при псовдотуберкулезе.

Задачи исследования.

I. Выяснить влияние плззыад Y.pseijítoluberculo3le с различная

мо ¿окулярной массой .на морфологические» т;шктораалыш&, культуралыша и биохимические свойства микроба.

2. Изучить устойчивость и . чувствительность псевдотуборкулезного микроба к антибиотикам н вияснить значимость р.-1иззмид в формировании резистентности.

3. Исследовать стабильность наследования пдазмид в процессе лабораторного культивировала ц хранения ттаадов а вияскить возкокаость применения плазмвдюго анализа для внутривидового тигарования Y.pseudotufcerculoais.

4. Изучить структуру популящ!й бактерий псевдотуберкул&за в различию. регионах России . к получить дашшо о характеристике дастних популяций возбудителя.

5. Выяснить возмокаость использования штзмидного анализа в система микробиологического мошкулярш-гоиотического мдшториггга при псевдотуберкулезе.

Научная новизна.

Установлено, что шташа Y.pseudotuberculosis серовара I, има юциа; основное ззачешш в "патологии чшювека, характеризуются, вариабельным плазмядаш спектром, а йгашы микроба сероваров ИХ и IV несут только одну шшзмад вирулентности (pCad) молекулярной массой около 45 ВД).

Показано, что выявленные у асевдотубзркулозного . шкреча штзмиды не оказываит влияние на изученние свойства микроба.

Установлено» что отдельный штаты псевдотуберкулезного микроба могут характеризоваться шохессввнноа аитибиатакоразиствитшстъю, кодарувьюй впервые выпиленной нами коныогатишоа й-плазмздоя. Данная Н-щтмида • несет детерминанта устойчивости к тетрацикяинш, р-лактамкым, аодпюглккозидншл, и некоторым другим антибиотикам. Устойчивость бактерий . псевдотубаркулеза к эритромицину, лшгкомициау, ристошцьну, фузидану, олеандоьпжпну. метищшьшу и оксацашвшу из связана с плазмадаш, дэтерадннируется хромосомными генами и ш зависит от серологического варианта возбудителя.

Установлено, что плазмвдныа анализ в комплекса с серотшщрованиэм штаммов возбудителя псе вдотубетулвза н рестрикцисшшм анализом является эф&зктпвшы методом внутривидового типирования Y.püeutotubc-rculosls, который макет быть положен в основу ЫЕ .робиолох^ческого иолекулярно-геаеткчАского мониторинга.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования позволили, охарактеризовать популяции нсевдотуберкулезнаго микроба на нсслйдоЕанних территориях ctpaiiu и выделить по меньшей меро три.

- 3 -

отлпчаишася друг от друга популяции возбудителя.

На основе шшзмидного. анализа разработан метод внутривидового гшшрованля y.pseuûotuberoulosis, который исгюл:>золэн для проведения 'анализа а расшифровки встшкэк и групповых at ^олегш-мй псовдо-туберкулеза в Кемеровской, Магаданской областях, Приморском крае, дифференциации вспышек завозного или костного гцмксхокдокия, определения айективаости проведешшх прсфигагтиоскак и противоэпидемических мероприятий при возникновении заболеваемости псевдо--туберкулозом, обусловленной завозной популяцией возбудителя.

Полученные результаты использованы при соетавлснзи инструкции "Эпидемиология, лабораторная диагностика иврсаниозов, организация' и пропацата профалзктичэсках и пратамэшцюмичсских мэропркяягй" утвержденной ЬО СССР 30.10.1990 Г. J* 15-6/42.

Основные полотмтя. шюсуш$ на залягу.

1. Плазмшвшй. анализ, в комплексе' с со^тктфозапием и рестрикщюннш анализом отдельных плазмцд ' является, сиЗДоктианнк методом внутривидового типирования Y.pseudo tubercul ос Is.

2. Штаммы Y.pceudoîubercul .sis могут харглстеразоваться множественной .лекарственной устойчивостью, детерминируемой конъвгагашой П-плзз?здой.

3. Системе микробиологического мониторига» основанная на ■плазмидной анализе, позволяет осуществлять ¡эффективное сложения за возбудителем.

Апробация работы. Основные положения работа сбсуадолись на : 5-м Международном Симпозиума "Yersinia" (Япония ÏS9Q), II Всесоюзной научно-практической конфэронцдя "Изрсшшози" (Владивосток, 1589); XXII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней (Новосибирск, 1989); Республиканской'конференции "Вопроса региональной гигиены, .санитарии и эпидомаологгл" (Якутск, I9-S7); Региональной конференции "Инфекционная патология ь Приморское крае" (Владивосток, IS89); Итоговой 'сессии Института терапии СО АМН СССР "особенности заболеваний терапевтического профиля и их профплгдешеа среда жителей Ч}'котки "(¿надарь, I9S0).

Пз теме диссертации опубликовано 17 науцшх. работ в центральной и региональной печати.

Работа выполнена автором за 'период 1Э86-ГЭ52 годи в лабораторий молекулярной эпидемиологии НИК эпидемиологии и микробиологии СО ; РАМН. Работа по виделени» ктаумэв псэ вдотуберкулезного микроба проводила« ъ в котлоксе с Iferaponcmt и Магаданским областными , и Чукзтским окрухшд* центрами

санэпидшс.юра.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дгя исследования влазшщного спектра псовдотуберкулазного микроба получены из музея лаборатории молекулярной эпидемиологии ншгэм со PAJ»2t и выдоленн в Кемеровской области, на Крайнем Севера Дальнего Востока Российской Федерации во врзкя проведения плановых, работ и внеплановых в. .ездов на вспышки в период с 1936 по 1933 года.

В р .бочэ использованы бактериалышэ штаммы Y. pseudotuberculosis серологач&ских вариантов I, III и IV, изолированию от Сольных людей, ¡швотшх и объектов внешней среды <вода, почва, инвентарь и оборудование пищеблоков и овощехрашщ, продаст питания) в различных регионах. Российской Федерации - Кемеровской и Магаданской областях, Красноярском, Хабаровском, Приморском краях и г.Москве, Бактериальные штатам Escherichia coli, содержание илазмздц' известной молекулярной массы, получены из ВШИ биосинтеза белковых веществ от академика РАМН И.В.Домарадского и из НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалои РАМН от члена-корреспондента РАМН Г.Б.Смирнова.

Выделение штаммов Y.pseudotubercalosls из исследуемого материала проводили в соответствии с. методическими указаниями (й.П.Григорьян, и соавт., 1974; Л.П.Рожкова, Г.П.Сомов 1977) с пршенеш:ем щелочной обработки (C.Aullßlo et al., 1930; Алексеева Н.Т. и соавт., 190Я). Окончательную идентификацию шташов бактерий псевдотуберкулеза проводила да комплексу морфологических, культуралышх, биолвтесьаа и антигенных свойств (М.И.Григорьян и соавт., 1974; Г.Д.Серов 1974).

Определение Оа^-завиоктсти проводили по методу K.Higuchl и J.L.sralth (1961) на нагний-оксалатной среде. В качестве питательной основы среда использовали питательный агар Дагестанского НИИ питательных сред, на 200 мл которого добавляли 8 мл 0,5 Ы стерильного раствора хлорида магния и 16 мл 0,25 И раствора щавелевокислого натрия.

Выделенные штаммы Yersinia paeudotuMrculosls хранили на полу »садком агаре под слоем вазелинового шала при. температура 4°С. Еесплазмадные и плазмидосодержащие штамш E.coll для хранения выращивали на Xb-бульоне в течение суток при температуре 37°с, затек в пробирку добавляли равное количество 80% стерильного

нейтрального глицерина. После интенсивного шрегткпания пробирки с культурами помещали для- длительного хранения в морозильную камеру с температурой -12°С.

Изучение биохимической активности штаммов проводили по общепринятой, методике на средах Гнссз с глюкозой, рсмнозой, дульцитом, мелибвдзой, трогг-лозой, ксилозой, сахарозой, целлоСиоьоЛ. сомитом, инозитом, молкщигазоЯ, лактозой, маннитом, эскулпг.?м, иноиптои, салицином, арабинозой, рафанозой, мальтозой, г-.рпипяюм. ориатшом, лизином, мочевиной, малонатом На. Кроме того, определяли возмоа-ность , роста бактерий на нитратной среде Симмонса, наличие р-галактсзидазной активности, продукцию индола я ооропедорода (на среде Т31). Подвижность, р-эзкции Фогес-Проскауэра а ме гил-рот определяли при температурах 22 и 37°С. Определение доцитяназной, р-галоктозидазной активностей и способности исследуемых штаммов расщеплять й-тартрат и глицерин проводили в соответствии с руководством (И.В.Голубэпа и со-эвт., 1965),

Определение антибиотикорезистентности исследуемых атзгдмсв проводили с покошьв дисков методам даШзми а агара и методом серийных разведений в пробирках с ЬЬ-бульонсм а на чайках с плотной питательной средой в соответствии с ыетодкчоскккк указаниями "Методы определения ■ чувствительности микроорганизмов к антибиотикам" (Е.А.Ведььжна, И.В.Власова, Н.й.Гивентзль, 1979).

■ Выявление различных по морфологии колоний (Т* и Т~) проводили путем посева пссладуемых тташзв но питательный агар из.расчета 1-5 тысяч гажроо'шх тел из чажу (Шубин и соавт., 1525).

Вирулентность штаммов псевдотуберкулезного микроба определяли на нелинейных белых шагах о массой тела 10-12 грамм яря внутрибрюышшам заражении десятикратно Еозрзетззвдки дозами (от 102 до ХО8 микробных тел на мл). Ы?£0 рассчитывали по К><р5еру Ш.П.Адаарин, А.А.Воробьев, 1962). "

Выделение плазмижной ДНК для гельэлектофореза проводили мелочным методом со СЛ.Ка&з и З.Т.Ыи (1931). Экстракцию белсов проводили смесью'фонол- хлороформа в соотношении .1:1. • Для проведения электрофореза использовали 0,7-0,8% агарозный гель (агарэзу фирма типы I и II). Разделение шшзмкд проводили и 'Трис-Оорстноя буферной системе в точен® 2,5-3 часов при нопрахсша:. 5 7Визуализации плззмвднэй ДНН пссло проведения-фореза осуществлял", путем-окрзэивзнйя геля в течение 00 .минут бромистым этидяеи ь 'концентрации 0,5 мкг/мл и Фотографировав», м результатов здехтро *'-роза при немощи' установки 'ультргфюлотсього излучения в прчтмлилн :п~

свете фэт, лиаратэи "Зенит TTL",

Выделение очищенной шюзмщшой ДНК для рестршсцаонного анализа проводили. по модифицированной ыатодаке щелочной денатураши, описанной Н.С.Bimbo In и J.Doly (1979). Очистку ялазыиддой ДШС проводили зтанолом.

Обработку плазмидной ДНК проводили. эндонукдеазами рестрикции BsffiHl, HlndlH, EcoRI, Einfl, ИаеШ производства Института прикладной ензимологаи "Формантас". Реакцию рестрикции веди в ■точение часа при 37°С, используя 2-3 ЕД активности форманта на 1 ист исследуемой плазмидной ДНК. Разделение линейных фрагментов плазмидиой ДНК воли в 1-1,5% агарознои гело в трпс-боратной буферной системе в течение 3-5 часов при напрякеши 5 v/cm. Молекулярную массу линейных фрагментов определяла в сравнении с подвижность» стандартных линейных фрагментов, • входящих в набор фирмы Bio-Рай.

Конъюгативный перенос шшшщ нроводаги методом простого скрещивания в жидкой питательной среде по P.I.BorgJuat et al. (1982) В качество реципиента * использовали штайл Eeeherlchla coll СбОО, который имеет хромосомную дотермшанту резистентности к ргД'аьйшщшу, что использовалось .нами для контрселокции. Отдельные колонии донорного и реципиентного штамма засевали в ;í мл Lb-бульона при соотношении одна донорская клетка на; пять реципшнтшх. Культуры инкубировали при температура Э7°С в точение одного часа. После зтого готовила насколько десятикратных разведений и высевали на чаи:з1 с добавлением хпоралфеникола, тетрациклина, ампициллина, стрептомицина 'и р-:фагяшшна. Через 18-20 часов инкубирования при температуре 37°С на чашках получали; колонии трансконъюгантов (кглткн E.coli, содерадш плазнаду, детергаширувдуа множественную ангибдотикорегистеыгнясть).

Элилшйцшо R-плазмада из птамжш Y.paeudo tuberculosis осуществляли путем вдравдвания. щтшиов микроба на LS-бульоае при температуре 37°0 в тачопда 48 часмв о добавлением акридина оранжевого в концентрациях- от 6 до 128 шг/ыл среды.

. Стабильность наследования И-ялазмид при различных условиях культивирования исследовали путем последовательных пассажей на питательный агар, стерильную водопроводную воду, дистиллированную воду." Посевы инкубировали при температурах 37, ?.?. и 4°С. Высевы на питательный агар проводили екедшвно, используя десятикратные рззводегмя с целью получения на чашах от 100 до 300 изолированных колоний. Получению колонии иссл-э девает па чувствительность к

антибиотикам и определяли. состав плззмид методом голь электрофораза.

Дгл статистической. обработки полученных результатов использовались компьютерный программы, составленные автором на языке программирования "Бейсик". ©эруулн для статистической обработка результатов взяты из книги К.П.пжзрина и А.А.Воробьева "статистические методы в гатробиологических исследованиях" (1932).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЕСУШ1ШЕ

Для исследования иорфо лопгм ских, таккторизльвшс и культуральных свойств псевдотуберкулезного микроба ш использовали коллекцию» включающую в себя 3110 гагага.ш возбудителя псевдотуборкулеза, тэта различный плазмидшй спектр (всего Я9 вариантов микроба ) и изолированных из разных источнике.; и па разных территориях России.

Ранее было установлено (Ф.К.Шу&т я соавг., IS8S) что п.'.аз?.ида вирулентности йерсинип pCad способна оказывать влияние на розулр и внешний вид формируемых щгакмами " псевдотуберкулозвого мшфоба колоний при их культивировании при температуре 3?°С. Колонии, формируемые микробными клетками, содерзсавдми пдозмвду pCad, получили обозначение Г4а колоши. клэток не содержащих плэзмиду pcad, - т~ (Ф.н.гдуйш, ISS5).

Наиболее четко морфологические различия в структуре Tf- и Т~-колоний m наблвдали на чашках Петри с питательным агаром и средой Серова. При микроскопии а щоходяя&ы псскуствошом свете культур, выращенных при 37°С на питательном егаре, итоммы, несушке ялаз^лду вирулентности, формировали через супа мелщм, зернистые, непрозрачные (?еишго) кошки с ровным или слегка бахромчатым краем (отевда обозначение. Г+). Штагам же, не содетяшаиоплаэтэду pCad, формировали на. чашках с питательным агаром крупные, более плоские, неструктурные, почти прозрачные колонки с ровным краем. Следует отметить, что морфологические различия в структур.» формуемых Tf- и колония . выявляйся только при

культивировании ютаммов при тзвдяратурэ J7°C. Сшг.гошю температуры культивирования до 22-25°Q приводило к Полному ■исчезновении р:^личий мезду колониями.

Енгаешречислеяше ■ особенности штаммов псевдотуберку.'взнсго шифоба обусловлены наличием плазиады вирулентности иерсиний ¡/la-i и не зависят ov присутствия других плазюд, «бнарухогешх у стеков Y.pseudotuberculcnlí;,

Изучение морфологичаских н тинкториалышх свойств штаммов псеадотуберкулезыого микроба всех вариантов показало, что не зависимо от числа и состава, плазмиж, источника, места и года выделения во всех случаях в препаратах, окрашенных по Граму, выявлялись короткие с закругленными концами грамотрицательныо палочки. Есэ исследованные штаммы были одшшово подвкани при 22°С и ноподвщщц при 3?°С.

Таким образом, проведенные наш исследования морфологических, •лшкториальных и кулмуралышх свойств бактерий псевдотуборкулаза, тадащих различный состав алазмад 'показало, что все исслэдованшге штаммы не имеит принципиальных различий меад собой и не отличаются го такошм свойствам от бактериального вида У ,рзеийо1лЬегси1сз1а, описанного в современной литературе.

Известно, что ьозбудитель нсвьдотуйзрхулеза весьма активен в оиошляаском отношении и не смотря на различную серологическую прщадасшость обладает одинаковыми биохимическими свойствами, что делает невозможным выделение, биотипов (Г.П.Сомов, В.И.Покровский, Н.Н.Беседаова, 19ЭО).

В то ко время широко известно, что пржутсгхио в микробных клетках некоторых плазиид макет в значительной степени изменять отдельные биохимические свойства микроорганизмов, Поэтому мы сочли для себя • ваши провести изучение влияние пласг-вд Т.тйеийо Ш1|егси1оа 1з на биохимическую активность штамшв. Для определения биотической активности было отбрано 102 штамма бактерий пеевдотуберкулеза, имеющее разнообразный плазшщша профиль и изолированных в разных регионах Российской Федерации в разные года.

Установлено, что все исследованные штаммы паевдотуборкулезного микроба независимо от их плазмидаого состава, времени и моста выделения ферментироьалк в первые сутки рамнозу, маннозу, трагалозу, шчошну, ксилозу, глюкозу, машат, вскулин, аданит,, арабишзу, мальтозу; на вторыэ сутки - шлибшзу, инозит, салицин. Исслэдо-Еьнше штаммы 1й ферментировали дульцит, сахарозу, целлобиозу, сорбит, млпэдкозу', лактозу, рафкнозу, не утилизировали малонат натрия, не ферментировали Февдлалаикн, лизин, аргинин, оршпш, не росли на цктратной среда Симмапоа, не образовывали мдаиштал-, карбинол.., индола к сероводорода на среде Т51, ке давали положительной раакции с а-таргратау, отрицателен« в тесте на бульоне по Штерну л лбццтиназнуи активность. Давала положительную рыакцню с кюшюши краешэд, тест па р-галактозидазиую активность бал поло

жителей на первые сутки. Бактерии псевдотубвркулеза имеот слабую подвижность только при тошоратурэ 22°С.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать зуь':д. что несмотря на разнообразие в содержании плзскид msrxi Y. pseudottCberculoals по биохимической активности представляю: сс-5'. г; однородную группу и не икают кацих-пбо различия. Псоводсилл исследование показало, что все обнаруженные и сгиогтклу ii'jí.ii плазмиды (в том числе и шизмида вирулентности иерсит-Л pCstl) из оказнвают никакого влияния на биохимическую активность исследованных ртаммов.

Изучение плозмидного состава 3110 итакмэз Y. pseudotubérculosls, относящихся к I, III и IV саролспгасккт/ вариантам возбудителя, изолированных из различных источников ti на разных территориях страны, показало, что подавлпа-лее боль" шстзо из них содержат плазгшм с различной молекулярной массой. В результате анализа выявлено II разных пяазквд с мслекулпт-ыта массами 100; 82;-70; 43; 3,6; 5,5; 4,>4; 3,5; 2,7; 2,4; 2,3 MD, причем плазмида с молекулярной массой ICO Ш) была обнаружил только в одном иташо, изолированном в г.Москва в 1931 году.

. Таким образом, анализируя представленные дайке, моасга сдолать вывод, что птаммн поевдотуберк"лезного .микроба сероварз I могут содержать значительное количество плазмид в различных кокбккниях. Все обнаруженные плазмиды легко дифференцируются по молекуляркой массе. Исследованные' штаммы Y.pseuio tuberculosis сероваров III и IV содержали единственную плэзияду pCad 'кепывой, чем у штжтгав серовара I, молекулярной массой (около 45 MD). Отсюда слздубт, что спектр плззмид в штатах возбудителя псевдстуберкулэзз мокет бить успешно использован для внутривидового яширсвинкя микроба.

Логическим продолхением изучения илазмидного состава шта-уоз бактерий псевдстубсркулеза явилась дифференциация штаммов по составу плазмид, то есть выделение основных нлазмвдных вариантов дак--роба. Пр этом основам критерием для нас явлйлесь частота пиг:&м-нид плазмид. Наиболее часто встречалась плазмидз вирулентности jr*p-синий pCad. ЕЙ содержали 95,7 % всех исследованных итажов. Второй но частоте, обнаружения была плазмидз р7М22. Штаммы псоздохуС'.-т'.;-.:,'-д»ного микроба, вясувие эту шгазмиду в своем спзктро coct'tíhtz 68,2 % от ocswro' »отчества штаммов. На основаюз». эттго kvj-Mivi pCud и pWS2 № 'отнесли к разряду ссвзвних пл'азккд ыз'^гл-чн псевдстуоеркулеза. Остальные плазнами, 'обнаруженные ь г.л.

штаммах, были отнесены к разряду дсталнаетльгшх, так вггу.-чя

лисъ значительно реже к относятся к криптичоским. В соответствии с этим делением диазмид на основные и дополнительные ми разделили все исследованные ггаамыи на восемь плазмаднщ. варианта (плазмидоваров) (Табл. I).

Таблица I Плазмидовары Y.pseudotubercolobls. .

Ида^мидовар

I

II

III

IV

TI

vi

VII

VIII

__Наличие плазмид.

pVTJ32 } pCad | ДОП0Л--

Сировзры

I, III» IV

т

I, III. IV I I I I I

Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют сделать заключение, что . все обнаруженные у штаммов Y.pseu&otuberculosla плазмзды (за исключением штзмиды pCai, которая способна оказывать влияние на морфологил формируемых микробом колоний) не оказывают вдиявия на морфологические,

и

культуральные

свойства

бактерий

танкториельные

псевдотуберкулеза. Кроме этого установлено, что биохимическиt активность штаммов Y.pseuitotubei'culosls не зависит от состава штмид п серологической принадлежности возбудителя. Изучение плазмшшога состава ыта&мов псевдотуборкулезного микроба показало, что штаммы 'серовара I могут нести II плазмид с разной молекулярной массой ц в различных, комбинациях; серовара III и IV единственную плазмиду вирулентности pCal молекулярной массой около 45 MD. Полученные данные говорят о том, что плазмиды Y.pseudotuberculosis могут слукить эпидемиологическими маркерами, используемыми для внутривидового тишровашя псеьдотуберкулезпого макроса.

Антибиотикорезистентность ыташов Y.pseudotuterculosls.

В доступной нам литературе ш находили лииь отрывочные сведения об антибиотикорвзистентности бактерий цсевдотуберкулеза. В отдельных публикациях сообщаюсь, что Y-p^eudobuberculoala устойчивы к воздействию эритромицина, ристоашшша» полимиксиаов, умерено "стойчкш к рифагяшщшу и .чувствительны к шяшш^шну, хяорамфениколу, стрептомицину, тетрациклину, .геатамацнау, канамкцщу ( S.N.A.Lucia, Anita Т., 1983; Домирадский, 193?; O.Dorob&t et al., 1938; В.А.Гриднав и соазт., ISS3; '). Для билоо

- и -

детального изучения чувствительности к антибиотикам ттеимов бактерий псевдотуберкулезного микроба мы исследовали антибиотикорезистентность 667 штаммов I, III, и IV серологических вариантов, имеющих различный плизмидный состав, «¡золировагшг.'х из разных источников (больные люди, «шатано, осотах старлей среди) на, различных территориях Российской «Зодораиин. в результате установлено, что подавлявдее количество ксоледевгяшых. штаммов тгсевдотуберкулосшого микроба не кмеют сушесгьснних уазтчгЛ но чувствительности к антибиотикам.

Все птамш' независимо от состава пла-лшд, серологического варианта, источника и территории выделения о.саослпсь устойчивы к эрктроюиаоцг, лашсоккшшу, ристсиашну,. фузидину, о^инаомацкну, метнниллияу, оксацшшну; умеренно устойчивы к ■ полгляссину М; чувствительны к неошцину, рифакшцзгау, акгигаотшу бензилнениниллину, хлорамфонкколу (лево№ЗД!г.тау>, гонтамицину. тетрациклину, доксищшашу, кянаетшпу, стрзптокишшу карбенищшашу, монощщкну.

. Анализируя полученные результаты, можш сделать шатчоико, что описанные ранее плазмиды У.рзеШо^Ьегои1оо1г, но имеют детерминант аптибиотикорезистентности. Устойчипость бактерий ПССВДОТУбврКуЛРЗНОГО КИКроба к ЭрИТрОУЛЦИНУ. лчякомзтпну, ристсмицину, фузишшу, олешщомнцииу, метишилилу и окспциллкну обусловлена хрсмомсомой и не зависит от соролоптаского варианта возбудителя.

Среда 667 исследованиях итгммов У.рзеа^оШЬйгс^с^з, обнаружены 14, которые корешам образом отличались от осталышх ао своей чувствительности к антибиотикам. Зое 14 агзкмон относятся к серовару I возбудителя, изсл»рсваны от больных, лкдей в р-тапй года в период с 1985 по 1991 год в 'городах 'Кемеровской области. Ка остальной территории России. подобные по антибиотиорзаистоатиоста штаммы нами не выявлены. 12 из 14 ктатш (Т<абл. .2), в отличие от всех исследованных, дополнительно проявили.устойчивость к о;лпншл-лкну, бешзидпеницилшну. карбошшишшу, хлсрам^ениколу. . тагр-г»~ циклину, доксицаклину, хацамишну, стрептомицину, полгакксияу М. карбеншиишшу. Так кьк бепзклненищшжн, карбтаисъшш и амниши-лин относятся к одному классу антибиотиков - понждаамазм, .а кэда-кицин и стрептомицин к акиюгликогвдак, тетрациклин и дйксицжэт» к тетрациклина^ в дальнейшем будут .ушипэться •. только атшдаллви, бтрептсгазш.. хлора?л7.сжлол, .титрэюклч! И поли-икекн Ы. Етага К-1266, изолированный от больного в г.Псл-кшьздск? в 15*35 году, у:.-л

чался те*, что сохранил чувствительность к амшцшишу, а штама Н-3179 к хлорамС-заикоду и тетрациклину, оставаясь устойчивым к действия акшоыллина, стрептомицина и полмг«икс:ща Ы.

Как видно из табл. 2 кта:.аи, проявившие "уникальную" анти-сиотшсарезпстеытиость характеризуются тем, что все без исключения несут дополнительные, необычные для штамгов ¥.рзеиллгиЬегайоз 1н шпзипди молекулярной массой около за МО. Именно с присутствием в шхмпх. дополнительных гшзмид мы и связали их устойчивость к ви'дапвречаолашшм анти^лотикам.

Мшйкашш подавляющая концентрация, ашициллшш для всех , ¡тылов псевдстуберкудезного микробу составила 0,5 ккг/кл, а для штампов, несущих шазмаду молекулярной массой 38 № (рЗЗ), (за исключением К-1266), - более 8192 .ыкт/мл (продел титрования). Мштааалыш падаааянцая концентрация иорсмфоникола, тетрациклина и стршггомнцшт для всех исследованных штатов У.рзеи^ШЪегси1оз1о составила, соответственно, 4,0; 8,0 и 4,0 одсг/мл. Для штатов псавдотуС-зркулезпого (.микроба, , характеризующихся кншаствешой актибиотикорезлстонтиость», МЖ .хлорэмфеьякола, тетрациклина и стрептомицина составила 128 кот/мл (Сш, Тс) и более 8192 мкг/ил-(Эт).

Всс 1-е штадаов псавдотуберкулезного. микроба, отличающиеся по чувствительности к антибиотикам, кроме шшзшад, цепользуекцх паги для ьнутризэдового тшшроваши и описанных выше, наши еще одну дополнительную плаз?,иду.- Причем II штатов имели одну дополнительную щшзыаау молекулярной массой 33 ЬФ (р38), а два пдолт Н-1263 и к-1272 несли по дав дополнительные .плазмадо молекулярной массой 25 и 40 К©, в 34 н 38 МО, соответственно. Но с ашибиаикоразиотэнтностью аткх ахташов. были связаны , только два плазмиды - р35 у ттамка К-1266 и рЗЗ у иташа Н-1172. Штата псевдотуберкулезного микроба Н-3179 имел дополнительную плазмиду меньшей у.оле::уляршй массой (32. Щ)}. Представляет интерес тот факт, что штаммы, несущие дополнительные шюзмида молекулярной массой меншэ 38 Ш) (К-1236 и К-3172) отличаются и количеством детерминант антибиотшсорэзистентности (Габл. I),

Для анализа функциональной значимости вышеуказанных плазгш, плазизда рЗЗ была. »лимишрована ". из трех штаммов У.рзеМо1;иЪегс1йоа1а (Н-1266, Н-84 и Н-1172) при помощи акридина ороахэвого. Зсе три штамма вместе с утратой дополнительной ялзамияы ио горят устойчивость к гшпишшаад*, хлорл-фуьктлу,. тотрациклкау, отрэпкйкодну и полимнссину. При аоь?срисъ пс-решео альоыилл сгз а

о Til же штаммы их. превоначальная антибиотмкорозистентнсоть полностью восстанавливалась. ,

Таблица 2.

Характеристика штибиотикорезистентшх. штаммов Y.pGou.<!otuberca-1оз1з, изолированных от больных на территории Кемеровской области с 1935 по 1991 год.

Н штамма

Место и год выделения

Состав плазмзд

Дотесж'шнты резне гентпости

82:43:28: 2,3 Лр. Сл. Пл S.C, Sm, Рта

32:43:38: 2,3 Ар, Crj. Тс, SR, Рт

70:48:38: 2,3 С.-5, To. ». j Г-'t » Frn

48:38:4,4 AD, Cm, Тс. Sra, Ра

48:38:4,4 Ар, Git, Тс. 3.'!!, й".

48:33:4,4 Ао, i;n. То, Рт

32:48:33:2,7:2,3 Ар, Си, Тс, С Ги * Ря

82:48:33 "-г1. См, Тс, Г».

48,38:4,4 70: 33 АО. Cm, То. Ря

Аь, Cm, Тс. зк. hu

82:43:33 Лэ, С:П, Fa

32:43:40:35 - 0:C„ Тс. Fn

32:48:33:34 AU, v.'., 1 •1 » Гтс

82:48:32 Frft

Н-84 г.Белово, 1935 Н-335 г.Белово, 1937 H-I2I0 г.Белово, 1987 H-II6I г.кекэроводзаз H-IX70 г.Кемерово,1938 Н-2445 г.Комовово,1933 Н-3044 г.НоволузнэщсД&ЗО Н-2592 г.Киселевск, 1939 Н-2747 с.Дмитриевка, 1990

H-23C3 г.МездоеченскДЭЗО

Н-224 г «Новокузнецк,1937

H-I26S г.Прокопьевск,1935

. H-II72 г.к6моробод988

H-3I79 г.ЫоздуреченскДЭЭ!

Примечание: ко ' - швщашн, С» - jaopw.jvT£.Rv.n, Тс ..тетрациклин. So - стрептокишш, Рта - ьоякмкксул М.

Таким образом, прздеодшеишю я&шуз предположение, что мнокестьеиш антиСиотшссрепи^тситсосгь вгаг.г'оа Y.pseudotuberculosls азолировашшх на торркторгл к^мс-рсвскоа области детерминируется дсшшптебльшми плазгазоин молекулярной массой около 33 Ш).

Для решения вопроса о ксчъюгзтивцостд м£?м»у„ дотор'яткруюжх мнояеетвонную штибкотшюрезистецтиость, помп проведено сксягдавзнио всех 14 втаммов Y. pseudotuberculosis, ноо.\чта дополтяиельше плазмиды молекулярной массой около за ГЛ), со стж.пм й. coll СбОО, который характеризовался хромосомной устойчивость к р^'-'нтицшу. ■ Это свойство итаыма С600 использовалось нами для проведения , контрсолекцшг траскокгюгацтов.

После проведения скрещивания все полученные траксконъюгапты вместе с плазмидами получили множественную антибиотякорезистентыость и становились устойчивым! к том же адтибиотикам, что и доноргшэ штаммы псевдотуберкулезного микроба.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что все без исключения плазмиды, доторминирущие мнотяственную аптибиотикорезистентнооть штаммов Y.pseudotuberculosis.

- 14 - , . .

изолированных на территории Кемеровской области, являются коныогативными. . ■

Данньго рестрикиионяого анализа Н~шшзмид всех 14 итоммов поевдогуберкулесного микроба, хзрактеразутахся . множественной штибпотжорозиотоптиость», позьолакт сделать заключенно, что несмотря на раслнчия в рос-трикшюиаом црофал» й-шЬомлд нятк птаммов, все оаи имоют общие с остальными Н--плазмндзми линейные фрагменты ДНК, что спкдегальстзует об мх бдазком родстве. Обращает на себя вннмспше и то, что Н--плза.яш. наиболее отличающиеся от остальных но ростршшиогашу профилю, отличаются и .по количеству детерминант ан'лякотжорозастонтности (штамм Н-1265 имеет четыре детерминанты антиСиотшсорозпсгеитшсти (Ст, Тс, 8т, йа), о игакм Н-3179 только три догермкнанти (Ар.Зш, и Ри)). .

Исследование стабильности наследования Н-плззмид показало, что псевдотуберкулезный микроб довольно легко утрачивает Н-илазмиду при его культивированил при относительно низкой температуре - 4°С. Таким образом. мокко предположить, что, оказавшись со внелней среде, бактерии псеьдотуберкулеза ну способны сохранять Н-плазмиды длительное время.

Для определения влияния Н-ллазмкд на вирулентность штаммов У.рзенйогиййгси1оз1з мы провели сравнительное . исслэдование вирулентности 4 лолирезистентних к 4 чувствительных штаммов псевдотуберкулезного микроба, содержащих подобный спектр плазмид. Проведенные исследования показали, что вирулентность исследованных штаммов Имеет небольшие различия, которые могут укладываться в естественные колебания вирулентности штаммов.одного, бактериального вида. Вместе с тем окончательное решение 'этого вопроса требует дальнейшего более глубокого исследования.

Структура популяций У.раеыйо 1иЪегси1оа1з.

Для изучения структурной характеристики популяций возбудителя' первдотуберкулеза на территории страны нами проведено исследование плазмидного спектра 3110 штаммов' возбудителя, жолироЕзшшх от" больных людей, «квотных и объектов внешней срс-ды в различных-регионах России в период с 193£. по 1992 год.

Результаты серотипнрования и ользмидного анализа ктаммов асев-дотуСеркулезаого кжроба, изолароьелша на торриторах йом^ровской облаете, 'позволял? приЯти тс заклхчешав.. что сабол^па^-мссть населения Кемеровской области связана пр^акудесгвенко о сероваром I псеь-дотуберкулезнсго заяробз, а в.

ровскоа области характеризуется ьчеокой степень» гетврогеодегл!.

Всего за период наблюдения выделено 24 париалта микроба со значительным преобладанием трех вариантов ■возбудителя, относящихся к плазмидоварам V, IV и VI ц несуикх шюзмвд 82: 48 МД; 48: 4.4ВД; 82; 48: 2,7 !Я), соответственно. Всею на долю три/, основных вариантой за весь период наблюдения приалось 89,62 %. тогда как на долю дополнительных иди редких вариантов возбудителя - лиаь 10,33%.

' . Дашшэ полученные при анализе структурной характеристики популяции ¥\рзеийо£1&ег^Лоо1з а Кемеровской области, позволяют высказать ряд общих пологий. Проаде всего, наиболее важной характеристикой популяции псовдогуборкулззнаго микроба сороьзра I на • территории области является ее геторогишюсть. На всей территории области наиболее важноо, доминирующ значение идет три основных варианта микроба плазкидоварса IV, V и VI с нлаамидами молекулярной массой 82: 48 МБ. 48: 4.4 МВ И 02: 4^3: 2,7 1.Ю.

. Процентпа содержание различных, вариантов шзо'удителя (кок основных так и редких) непостоянно и изменяется во ир^моии. Рздкио варианты микроба изолируются от болышх значительнее рода, а некоторые из них выделяются не каждый год и не во имя.' населлшых пунктах области. Максимальное количество редких вариантов возбудителя зарегистрировано в городе. Прсжоаьоьог.и. Эти данные позволяют высказать предположение, что несмотря па озгик черты, характеризуксмэ популяции возбудителя в области, апидемичоский процесс при псеьдотубернулезо в каадсм отдельно взатом городе области 1Е.'х0ет свои специфические особенности.

Таким образом, анализ структурной орг-лгизашаг популяции псевдогубвркулеоного микроба по плазглндкому сосл-:ад, циркулирующей на территории Кемеровской области, аоааоляат прайга и слодугазгм заключениям. Данная популяция У.рзш1<ПиЬс-гса1с£Яй характеризуется, в первую очередь, гетерогенностью, которая проявляется в значительном количества вариантов зкоктра плазьад возбудителя. Следуювдй, не менао вашой характеристикой популяшш является ее стабильность, которая отражается в том, что а течешь ьсого срока наблюдения во всех рассмотренных населешшх пунктах области стабильно фиксируются три основных варианта микроба с плазмидами 82 : 43 МП; 43: 4,4 ЫБ и 82 : 48 : 2,7 Ш). Вместо с тем популяции V.рзеийогиЬсгси1оа1з свойственна и изменчивость, проявление которой заключается в том, что количество второстепенных, редких вариантов микроба подвержено значительным колебаниям во Бремени. В каждом отдельно взятом населенном пушстз области зафиксировано ¡.лаков количество редких. ьариоитов микроба. Кроме этого, измвнчашеть

парактерна и для основных вариантов микроба. На протяжении всего срока наблюдения в целок по салюта и в каздш отдельно взятом городе происходила смена домишотугосэго варианта возбудителя.

Ко' протя&еиш! всего периода наблюдения в г.Москве циркулировала популяция бактерий псевдотуберкулеза, продстаоленная шесть» ьарианатамк микроба. Кз всех вариантов микроба наиболее часто изолировались штакмы, несущие плазмяды с молекулярной массой С,2: 43: 3,5: 2,7 !.Ш. На долю <того варианта возбудителя гоишюсь 44,6 5 от есох выделенных• штаммов. Вторым по частоте'выделения был вариант микроба с плазгаизмя 82: 4В: 3,5 MD, на долю которого причлось 43,3 Все остальные варианты возбудителя изолировались гораздо peso и в сушо составила 12,1 % от общего числа выделенных в Москве штаммов.- Так-в I98S году было • изолировано два ыташа, весуыкх плазмэдц с молекулярной массой 32:. 3,5: 2,7 Ш), и учитывая обстоятельство, что плазкида молекулярной касоой 48 MD довольно легко олк-пширует при попадании. пт&миов во внешнюю среду, мошо пр&дпалсздть, что оба этих штамма относятся к варианту возбудителя с плзаки&аки 83: 48: 3,5 2,7 Ш). Бесплазмидный штамм псовдотуборкулэзного микроба был изолирован только однакды в 1933 году, тогда как штаммы, не суша единственную плазмиду молекулярной массой около 45 !,©, выделялись на протяжении трех лет. Учитывая вышеуказанную особенность плазшщы р45, мошо предположить, что беишзасузшй стамм является дериватом варианта микроба, несущего едшствегшую плазмипу жалыдайзавнсимостк молекулярной массой около 45 MD. Тадаш образом, популяция Y.pseulotuberculosis соровара в Коекш таете характеризуется гетерогенностью и представлена по меньше ¡¡¿оро четирьмя вариантами микроба...

Серологическая структура итакыоь неэвдотуберкулезного микроба, изолированных в Пряшрском крае, представлена значительно большим разнообразием, однако подаащшцее большинство выделенных культур относятся к серовару I и значительно реке выделяются штаммы сероваров III и IV.

Пдагглцщцй анализ втаммов Y.pseuSotuberculosis показал, что популяция, ссовдотуберкулезнога мжроба в Приморском крае также характеризуется гетерогенностью, ж> в меньшей / степени и средстамзаа тремя вариантами микроба с шшмидаки 82 : 48 MD cepc£ipa I; 45 № серсварэ III и бесплазадшшми атакмама, таюю отнзсгскюкя к сероsspy III.

Liai-vcisaifi анализ коллекш-л: культур псесдотуберкулоза,. изодгсюьакных на территорий Хабаровского края в I&36 - 15Э2 годах,

показал,что в крае циркулирует гетерогенная популяшт возбудителя псевдотуберкулеза серовара I. Етаммн псепдотуберкулозного t-ккроба серовара I в Хабаровском • крае представлены пятью варианта:.« возбудителя, два из которых не содержат швдмидн вирулентности молекулярной массой около 48 Щ). Однако учитывая, что ота плазмща при определенных условиях довольно ' лугко элиминирует, мочено утверэдать, что штаммы, несуаие единственную алззкиду массой 82 KD, являются дериватами штаммов со сп-жхром плазмид 82: 43 VU, а бесплазмщцшо штаммы образовались вследствие потери цдззмиды вирулентности и относятся к варианту микроба соровс.рз Г, несущего единственную плазмиду молекулярной массой около 45 41). Следовательно, популяция псевдотуберкулезного микроба еорстара I представлена как минимум тремя вариантами микроба с плозм:у:,ом;1 82: 48 (Л); 48: 4,4 ГЯ) и 45 Ш). Бактерии псевдотуберкулеза серовара III, как и на других территориях страш представлены ед/лстгзнным вариантом микроба с плазмидой вирулентности молекулярной массой около 45 MD.

Коллекция штаммов псевдотуберкулезного микроба, тоолпровишых на территории Магаданской области от вольных лкдей, грыз/нов и смывов с овевдой, представлены двумя серологическим:: вйршгезкз микроба (серовары I и III).

Результата исследования плагмидаой характеристики 265 атомчев, псевдотуберкулезного микроба показали, что популяция Y.pseHdotubercuIosi3,- циркулирующая на территории Магаданской области, отличается бользим разнообразием, чем в Приморском и Хабаровском краях. Популяция возбудителя птодстаюшна 12 вариантами микроба, то есть отличается высокой степень» retoporetmoc-Ki. Количество вариантов микроба в течение всего срока наблюдения варьирует в значительной степени. Так, в 1986 году популяция псевдотуберкулезного микроба в области представлена четырьмя, в 1987 году -- пятью вариантами микроба. Увеличение количества вариантов микроба в 1988 году вызвано завозем на территория области возбудителя псевдотуберкулеза с нэхараейрным для "местной популяции плазмкднш спектром - 82: 48: 7,5 MD к 82: 48: 7,6: 2,3 MD. Бактерии псевдотуберкулеза с этим составом плаэмкд оиаялшшсь только от больных ладей во врзма локальной вспишем, шошжмй в п.Дукат Омсукчанского района. В далънэЯяём, после нрекржения вопншки, штаммя с подобным плазиядаш составом болыдз не выдолчлись на территории области. В 18ЭЭ году количество вариантов возбудителя вновь снизи. эсъ и популяция ösiwep'-ift псевдотуборкудаза

- IS -

была представлена четырьмя варианта;«»! микроба. Степень значимости отдельных вариантов микроба неоднозначна. Наиболее часто выделялся вариант возбудителя с двр-.я плазг.гадзми РЯ: 43 MD. В течение четырех лот наблюдений с 198? по 1991 год ему принадлежит домишфущее ошчопие и на ого долю в средам пришлось '56,2 % от общего количества выделенных штаммов. Все остальные варианты возбудителя выделялись значительно реже и не кавдй год.

Таким образом. предсг.-отлаш данные о плазмидной характеристике популяшЛ Y.pseuclotuberculo3la на рассмотренных. выше территориях Россия подтверждают обобщения, сделанные при анализе популяции исовдотуберкулезного микроба в Кемеровской области. А клотю: всом популяциям свойственна гетерогенность по плазмидному споктру возбудим ля; популяции' одновременно характеризуются стабильность» и изменчивость». Стабильность популяций проявляется в, том, что в гсзздой из них ость основные варианты псеЕДотубаркулезного микроба, которые регистрируются каяашй год незеьисл.'о от количества выделешшх штаммов. Количество основных вариантов для каадой популяции монет быть различным. Изменчивость популяций Y.pseudotuberculosls ¿^сличается в том, что в кавдой из них ежегодно меняется количество вариантов микроба и их процентное соотношение. Кроме этого, полученные данные позволяют условно выделить "западно-сибирскую" популяции псевдотуберкулезного южроба, характеризующуюся наличием трех основных вариантов мшфоба с плазмидами 82: 48 îffl; 48: 4,4 Ш) и 82: 48: 2,7 MD; "московскую" с двумя основными взриантаим микроба с плазшадамн 82 : 48: 3,5 MD и 82: 48: 3,5: 2,7 Ш; "дальневосточную" характеризующуюся наличием такта двух основных, вариантов микроба с плазмидами 82: 48 МБ и. 45 Ш), причем последний вариант микроба относится к серовару III.

При анализе структурной характеристики популяций Y.pseudotuberculQ3is на различных территориях страны перед Haï,ai встал вопрос о клональной принадлежности основных вариантов микроба.

Как показала проведенные исследования, несмотря на, сунестаенные различия в плазмидном спектре- бактерий псепдотуберкулзза серовара I, изолированных в различных регионах страны, огшсл для в сох без исключения популяций является наличие мкхроба с шазмшш шлекулярной массой 82: 43.Ш).

А.Л.Гинцбург с соавторами (1983) провели рестрикшонкыЯ анализ Гл. глазг.'л pW.82, выделенных из пта?ков, которые были .изолированы от болыых в г.Ададырь в 1977 году, г.Ажяро-Суданске Кемеровской

области в 1975 году, в г.Санкт-Петербурге в IS73 году а г. Артеме Приморского крал в 1983 году. Авторы показали высокую степень родства всех исследованных масмид, независима от года и к-эста выделения щта»я.гав-хозяев.

При решении вопроса о клс-нульпости штаглгав псевдотуберкудезного микроба серсвара I, несущего плаьмнды молекулярной массой 82: 48: 3,5 MD, которые цирку лиру ¡от в городах Москва и Анадырь, использована данные, получешше • ФЛГ.кубглым (1991). Результата рестрикциощюго анализа показал!, что ЛНК плазмида с молекулярной массой 3,5 MD зсох. поело ¿ci.-aniiix плломпд образуют строго идентичные лилейные фрагменты. Таким образом, опираясь на полученные результаты, мохно утверждать, что вариант псовдотуберкулезного микроба серовара I с пласмадамн S2: за: 3.5 MD тагсэз имеют клональное происхоэдениэ.

Кроме того, по-видимому, клональное ароио^тдади'л r-v-j-w и шва/т со спектром шшамид 82: 40: 2,7 ш>. рестриздптгл witow, шлкощетшцши эндонуооазами рестрикции Hat I v HLní III íy-.H.UWmi ii соавт., 1990) пдазмид массой 2,7 HD, ыуь.-ллидис ;и итом-дов микроба, изолированшх в КекаровскоЛ сбдас-ак, п-ка-я-л пола г. их идентичность в двух исследоваяиа итакмах и -мии^и с^и-ли^ р^логоо в третьем.

С целью изучения вдолинчиосот шшамад м'.сот'л.илШ к-л-ссй md нами проводопо срашотолыюз исаадквакао ръто/аш ишах профилей плазмэд, выделенных из атаммов H-IQI, K-I53, R-I05 пзояиров лгмх от больных в г.Якутске в I-5C году, я о]4 - от бОЛЬПОГО В r.ItC-KOpOSO 3 I9R8 ГОДУ, Н-17« - о: в

г.Новокузнецке в 1988 году a H-T3S6 - о? бол^'лго ь г .Комор?lo в 1985 году. Рестрикционш! анализ по poctpcrc.sw» HitiiL покаиал, что все исследованные шюзмнднаэ ДНК, независимо о г моста и Ep-:¡,r;mi выделения итамцов-хозяев, образуют строго идентичные рострикционяыо профили, что говорит об их близком родст,..5. Подобные ризультати получены при обработке ЛНК плазвд массой 4,4 Ш) андонукло-ззой рестрикции Нае III.

Следовательно, полученные данные свидетельствуют о близком генетическом родстве тта?ялоа с плазшдным спектром 49: 4,4 MD, что позволяет отнести их к одному клону псевдотубергсулезного микроба.

Клональное происхождение, по-видимому, имеют и штампы с плэзмидагли 82: 48: 3,5: 2,7 MD, изолированные в г.Москве. Это положенно согласуется с длительной циркуляцией этих штаммов в городе при неизменном плазмидцок спектре (срок наблюдения 7 лет).

Таим образом. представленные даншэ позволяют сделать вывод о кыиедыюа структура популяций псеьдотуберкулезного микроба, щ:ркулирул;ь'-к ь расличнж регионах России. Причем, если клон с г(ласк-да,».а 82: 46 HD имеет повсеместное распространение по всем регионам строга, то 1слош с плазмидзки 82 : 48 : 3,5 MD, 82: 48: 2,7 MB, 48: 4.4 Lffl и 82: 48: 3.5: 2,7 ЬШ имеют- строго региональную приуроченность. Следовательно, при клональкой в целом структура популяции псеаз отуберхсулезаого микроба возможно формирование клонов, именачх региональную приуроченность.

Шткробиолопяесккй мониторинг при цсевдотуберкулезе.

Проведенные нами исследования позволяют заключить, что значимость м;нфоб:»логгческого ьшекулдрко-генеткческого мониторинга при псоадотуберкулеае заключается в той, что он позволяет осуществлять на только слежение за распространением .отдельных наиболее эшх-деиг-мски ааачнмьгх клонов микроба, но и слувить критерием эф^эктив-нести цроьодамах пропшоэпздомдчееккх мэрокряятий при возникновении "завознах" еспшок псевдэтуберкулезххой щфэкиии. 3 последнем случае отсутствие заболеваемости населения,' вызванной "завозным" клоном jcacpoOs, свидетельствует об эфЗЬэктивиости ранее проведенных профилактические и противоэпидемических мероприятий.

its всего ваигсказанного мокно прийти к заключению, что организация кикрооиологич&ского молекулярно- генетического мониторинга предполагает прежде всего динамическое наблюдение за популяциями-возбудителя псовдотубвркудеза. 0 свою очередь длительное, динамическое набл^еше осыоваххаоо на изучении спектра плазмид в комплекса с рветрикииошш анализом отдельных плазкид и серотипировапием, позволяет сформировать баша: дагшых о кленовой структуре возбудителя псовдотуберкулеза на раз;шх территориях страны, определить значение .нитрации возбудителя в заболеваемости. касо лихшя, проводить даКсронаиацик? клоков микроба, характеризушкхся раз«;чной эпидзиа-чкмостью, а тахке осуществлять ранее выявление шобычхшх эпидемических клснос возбудителя на определенных территориях., служить критерием эффективности проводишх противоэпидемических и профвдактй-.чесхих мероприятий ври купирования "завозных" вешшек.

БЫЗОДЫ

I. Установлено, что птамлы Y.pseuflotuuerculcsts могут нести II рзалгешх по молекулярной касс? сзмозтсякль/жх иласгаднах ре^ликоь'ОБ. ¡йсыш паездотуберкулазиого мтсроба . ргйких сероваров

отличаются ш спектру шшзмид. Бактерии псевдотуберкулеза сероваров III, IV, как правило, либо содержат единственную плазшш вирулентности (pCad) с молекулярной массой около 45 Ш), либо бесплазмидные, тогда как бактерии серовара I имею? взризболытП спектр шшзгщд,

2. Присутствие в штаммах Y.pseudotuberculosl3 серовара I плазмид с молекулярной массой 82: 70: 8,6: 5,5: 4,4: 2,5: 2,7: 2,4: 2,3 MD да отрекается на изученных, наш морфологических., тинктораалыш, кулътуралъшх. и биохимических свойствах микроба.

3. Бактерии псевдотуберкулеза различных сероваров независимо от присутствия выявленных.гшазмид не отличаются по чувствительности и устойчивости к различным антибиотикам, что позволяет предполагать хромосомную природу их устойчивости к эритромицину, олеаядомищшу, линшадину, кетищшшну, океацклдину, ристодацщу и фузидину.

4. Штагам псевдотуберкулезного микроба способны нести R-плазмиды. Плазмида антибиотикорезистентности, выявленная в "кемеровских" атаммах, икает молекулярную массу около 33 характеризуется конмгативкостью, несет дчтартшнты ропиотеятиости к агашоглнкозэдам (сгрепшлщину, кэномицин), {ЬлзктамоБым антибиотикам (ампивдшпш, бэнзиженицклгош, карбошадшкн), тетрациклина« (тетрациклин, доксишжлин), хпоржргит.слу и

ПОЛИМИКСИЛУ !.{.

5. Спектр плазмид в штаммах бактерий псэвдотуберкулеза не изменяется в процессе ах лабораторного культивирования и ггри хранешш на нолухидксм агаре, под вазелином.

6. Плазкишшй аналш бактерий псевдотуберкулеза, дополненный рэстрикцкояшм впдонуклеазшш анализом и данными серотштирования, является оф$ектившм - методом внутривидового типировэния Y.pseuöottiberculo3l3.

7. Популяции Y.paeu/dotuberctdosia на всех рассмотренных территориях страны характеризуются гетерогенность», относительной стабильностью, выражающейся в существовании определенного набора основных клонов микроба, а также изменчивостью, проявляющейся периодической смелой домшируицэго клона.

а. Популяциям Y.pseudotuberculoala свойственна региональная приуроченность. Установлено, что на территории России существует, по меньшей mре, три различных популяции возбудителя: московская, западно-сибирская и дальневосточная, отличающиеся между собой по набору основных клонов микроба.

9. Система шюробиологического мониторинга, основанная на

данных плазмидаого анализа и серотшшровашя позволяет осуществлять оад&ектишое слешние за возбудителем псевдотуберкулзза.

СПИСОК РАБОТ, ОГОЪШЮЗАШЯ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Некоторне- методачесгию приемы, используемые для изучения пдазмидного спектрз атаммов керсшнй //Науч.-практ. конф. "Вопросы региональной гигиены, санитарии и эпидемиологии". - Тез.докл. Якутск, 193? . - G .125-127 (go ем. с S3 .Т. Сибирце вам, Ф.К.Шубшши)

2. Клйнико-зпидешолотаяесшю особенности всшзки. псевдотуберкулеза, вызванной возбудителям III саровара//Так ке. - С.106-103 (сош. с В.Г.Кузнецовым, ВЛ.Багрянаевым, В.Г.Корчевским).

3. Структура популяции Salmonella enterltlclla в Приморском 1фае // Науч.-практ. конф. "Инфекционная патология в Приморском крае": Тез. докл. - Владивосток.-1939 .- C.II-I4 (совм.с Ф.Н.Шубиным, Л.е.Колесниксгой, Ы.В.Стецёнко и др.).

4. Структура популяции Yersinia pseudotuberculosis в Якутии// Там же.- I9S9. -.С.7-9 (согм. с Ф.Н.Щубиным, В.Ф.Чернявским, A.A. Рыбаковской, А.Ф.Тупицшюй).

б. Молекулярная ¡эпидемиология псевдотуберкулеза в Москве// Всесоюзн. науч.-практ, конф. "Кврснниозы": Тез. докл. Владивосток, 1989.- 4.1.- С .108-110 (ссвм. с Г.В.Ревиной, Т.й.Юестзперовой, Н.В.Степановой, Р.Я.КячановскоЙ).

6. Клоповая структура популяции Yersinia pseudotuberculosis в Кемеровской' области//Гам . ке. С, 126-128, (совм,. с Ф.Н.Шубгннм,Э.ИЛервяношм, Г.К.Нолесниковой и др.>.

7. Анализ плазмидаого состава штаммов Yersinia pseudotuberculosis и его применение для титрования возбудителя псевдотубэркудоза/Д!олекул. генетика. - 1939,- Н 6. - С.20-25. (совм.с А.Л.Гикцбургом. Н.В.Шшшевским, З.Г.Зенковой).

8. Выделение из природного материала штаммов Y.iiUeraedia с плазмидой молекулярной массой 82 М9Гадальтон//Тез. . докл. XII Всессюзн. конф го природной очаговости болезней. Новосибирск, 1939 .-C.9-9I. (совм. с В .Г. Кузнецовым, В.Н.БагрянцеЕШ, В.Н.Рыбачуком, А.Ф.Трацакко).

9.,0 возможности завоза возбудителя псевдотуборкулеза на территории Магаданской' области, и его эпидемиологические последствия /'/Регион, научн.-практ. копф. "Особенности заболевай',-Л терапевтического крэ<1аля а та профилактика ср^да кителей Чукотки": Тез. - докл. -Анадырь, 1990. - С.23-25. (совм. с Ф.Н.Оубинык, В.Р.Саухэт, Е.А.Ко-

лесниковойа др.)

10. О возможности существования эпидемиологической свпзн ивхду очагами псевдотуберкулеза в городах Анадыре и Москве//Там ко.- 0. 71-72 (совм. с Ф.Н.Шубшшм, Г.В.Ревиной и др.)

11. Инструкция " Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация' и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий".- М., МЗ СССР, 1ЭЭ0. - 48 с.<гр. авторов).

12. Виделодаэ штатов Yeralnla intermedia с штзмпдой молекулярной массой 82 могадальтон в природных популяциях иерсшшй //Дура. никробиол. зпидомксл. и иммунобиол. - I9SQ. - 1! П.- C.I2-15 (совм с В.Г.Кузнецова!, В.Н.Багрянцевш).

13. The Clone. Structure of Yersinia pseudotuberculosis Populations in the USSR //5th International Synpoalm on Yersinia. Japan, 1990. -P. 82. (together with F.N.Shubin).

v 14. Молекулярная эпидемиология псевдотуберкулеза //Сб. научн. трудов "Юбилейный сборник научно-исследовательского института зни-дешологик и микробиологии, посвяцеишй! 50-летни со дня' основания" Владивосток, 1991,- С.41-47 <совм. о ©Л!.Шубиным).

15. Молекулярно-генетические особенности пышреокохйикп« к антибиотикам штатов Yersinia pseudotuberculosis, изожровошшх в Кемеровской области// Сб.научнах работ молода учешх mt'.OM СО РАШ. - Новосибирск, 1992.- С.Б7-63.

16. Molecular Epidemiology oi Рaeudotuberouloa 1 a //Russian Acaleoy oi !&<ilcal Sciences of Siberian Branch Medical Research in 1992 (abstracts) - КотоаШгок. - 1933. - P.J24 (togettwr with P.H.SteLbln, G.y.Revlna).

17. Plasiald analysis In the syatera or microbiological monitoring of salmonellosis // Ibid. - P. 125. (together with F.N.Sicubin, C.V. Revlna).