Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Первичные физико-химические механизмы токсического действия меди на бактерии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Лебедев, Владимир Сергеевич, Москва

я

* V и' /

6

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ХИМИЧЕСКОЙ

ФИЗИКИ

3 Ж -?Р

На правах рукописи

Лебедев Владимир Сергеевич

Первичные физико-химические механизмы токсического действия меди на бактерии

Специальность 03.00. 02 — Биофизика

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва—1998 г.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ХИМИЧЕСКОЙ

ФИЗИКИ

На правах рукописи

Лебедев Владимир Сергеевич

Первичные физико-химические механизмы токсического действия меди на бактерии

Специальность 03. 00. 02 — Биофизика

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва —1998 г.

Работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики РАН.

Официальные оппоненты:

Доктор физ.-мат. наук, профессор Рууге Энно Кустович

Доктор биологических наук Пальмина Надежда Павловна

Доктор биологических наук Исмаилов Анвар Джураевнч

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится " "г-^/ 1998 г. в И часов на засе-

дании Диссертационного 0оветахД200.53.01 в Институте биохимической физики им. H.H. Эмануэля РАН по адресу:

117977, Москва, ул. Косыгина, А, Институт биохимической физики им. H.H. Эмануэля РАН.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Объединенного института химической физики РАН

Диссертация и виде научного доклада разослана "

1998 г. '

Ученый секретарь Диссертационного

совета, кандидат химических наук ^ ^ М.А. Смотряева

•.Ji-

- ' -у

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Устойчивый интерес к различным аспектам токсического действия тяжелых металлов на микроорганизмы сформировался уже к началу XX века и был связан прежде всего с поиском и созданием на их основе эффективных лекарственных препаратов против инфекционных заболеваний. Актуальность этого направления исследований в настоящее время не только не утрачена, но даже возросла в связи с обнаружением лекарственной устойчивости у микроорганизмов после длительного применения антибиотиков в медицинской практике.

Вместе с тем в последние десятилетия результаты деятельности человека характеризуются резким возрастанием в окружающей среде различных токсичных веществ и соединений, среди которых тяжелые металлы занимают одно из первых мест. В этой связи проблема прогнозирования отрицательных последствий антропогенного загрязнения тяжелыми металлами как индивидуально, так и в комбинации с другими воздействиями, приобретает особую актуальность.

Кроме того, в последнее время микроорганизмы широко применяются для очистки сточных вод от тяжелых металлов и в качестве тест-организмов для определения качества воды. Можно надеяться, что более глубокое понимание физико-химических механизмов взаимодействия клетки с металлами позволит эффективнее использоппть микроорганизмы для решения этих прикладных задач.

Среди группы наиболее токсичных металлов для различных организмов (А£, Си, Щ) медь привлекает в последнее время наиболее пристальное внимание исследователей. Во-первых, это связано с широкими масштабами загрязнения среды указанным металлом, источником поступления которого является не только промышленность и энергетика, но и сельское хозяйство, где медь широко используется в качестве фунгицидного препарата. Во- вторых, это единственный элемент из данной группы металлов, '•ущест-венно необходимый для жизнедеятельности многих организмов.

В настоящее время накоплена обширная литература по различным аспектам токсического действия меди на клетки и отдельные биологические структуры. Установлены первичные химические реакции, запускающие процессы повреждения различных биологических макромолекул. На целых клетках различных типов и органеллах показано ингибирование медью различных биохимических процессов, включая АТФазу, цикл трикарбоновых кислот, синтез белков и нуклеиновых кислот, глутатионредуктазы, дыхания, снижение общего уровня восстановленных тнолов и ввН в клетках. Установлено также нарушение барьерных свойств мембраны. Однако, несмотря на широкий круг проведенных исследований, цельная картина развития медь-индуцированных нарушений в клетках до сих пор отсутствует.

Основная проблема заключается в том, что при действии тяжелых металлов на клетки (ЗюЬв, Bagch¡, 1995), как и при других типах воздействия (Владимиров, 1975), многие из зарегистрированных функциональных нарушений могут иметь вторичное происхождение, тогда как локализация и механизмы повреждения первичных мишеней в клетке, определяющих специфику развития патологического процесса, оставались неизвестными.

ПсрПН'ШЫМ жшнмолсПетпиям моли о клеточной шшорхносгмо »ПОЛОМ II о нисншсй стороной цитоплазматической мембраны в частности, которые, по-видимому, и должны формировать направление развития процесса повреждения, до сих пор уделяли слишком мало внимания. В значительной степени это связано с получившей широкое распространение точкой зрения, согласно которой активный транспорт меди в микроорганизмы с помощью спсцяалюмроййнноП системы прсдетптмется необходимым уелоин-ем се токсического действия на клетки (Ховрычев, 1974; ОзЬшш й а), 1987).

В связи с вышеизложенным цель настоящей работы заключалась в изучении первичных механизмов действия меди ва структурно-функциональное состояние бактериальной мембраны (клеточной поверхности) и формировании на их основе концепции развития шшрежлемнй Оймфрнинмшй »метки шжелммн мяшшями пик индминдунныю, Iми и н комбинации с другими факторами внешней среды.

Задачи исследования.

1. Сравнительное исследование основных факторов токсического действия различных неорганических соединений металлов (ПДП, пшроксиди, соли).

2. Исследование мест связывания меди бактериями во взаимосвязи с профилем электрического потенциала на клеточных структурах и в зависимости от энергетического состояния клеток.

3. Изучение физико-химических механизмов мсдь-нпдуцироишиюИ проводимости мембраны и характеристика проводящих путей.

4. Обоснование наиболее общих принципов усиления активности тяжелых металлов в комбинации с другими факторами внешней среды.

Положения, преде: авлеиные к защите.

К защите представлены выдвинутые в работе положения, согласно которым первичные механизмы токсического действия различных неорганических соединений меди (в том числе и ВДП) включают в себя 2 этапа:

• Взаимодействие ионов с мишенями 1 типа (восстановленными тиолами, экспонированными на внешнюю сторону цитоплазматической мембраны) с образованием вонов Си*.

• Взаимодействие ионов Си* с мишенями 2 типа с последующей активацией динамических неселективных проводящих путей (каналов) в мембране с эффективным радиусом - 0,5 нм, проницаемых для самой меди и других гидрофильных ионов и молекул. При этом специфический профиль электрического потенциала на мембранных структурах бактерий обеспечивает преимущества для индуцированного транспорта в цитоплазму различных веществ катионной природы, в том числе и лекарственных препаратов.

В соответствии с развиваемыми представлениями мстолл-индуцированный транспорт и цитоплазму рассматривается как один из наиболее общих принципов развития патологического процесса при контакте бактерий с тяжелыми металлами и усиления активности антимикробных препаратов при комбинированном воздействии.

Научная новизна работы.

В результате проведенных исследований впервые установлено, что медь-индуцированные ионные утечки через цитоплазматическую мембрану — результат ее

модификации при двухстадийном взаимодействии ионов Си2* с тиолами на внешней стороне мембраны, а не следствие активного транспорта меди в цитоплазму.

Впрвые выявлено, что истинная причина энергетической зависимости накопления меди в клетках и ее токсичности заключается в энергозависимой активности восстанавливающих центров на внешней поверхности мембраны.

Впервые показано, что большая часть накопления бактериями меди в цитоплазме осуществляется в процессе автоиндуцированного транспорта катионов металла через индуцированные в мембране проводящие пути.

Впервые установлена динамическая природа медь-индуцированных проводящих путей в мембране и охарактеризованы их основные свойства (эффективный радиус ~ 0,5 нм, низкая ионная селективность). Показано,.что через эти пути может осуществляться транспорт в цитоплазму различных токсикантов, причем при прочих равных условиях вещество катионной природы транспортируется более эффективно в соответствии с градиентом электрического потенциала между внешней средой и цитоплазмой, обеспечивая элекгронейтральность цитоплазмы в процессе массивной потери клетками катионов К*. Отрицательный доннановский потенциал в периплазме способствует проявлению катионной селективности процесса накопления, эффективно концентрируя катионы из среды и обеспечивая их высокий начальный градиент на цнтоплазматическоА мембране.

На основании проведенных исследований впервые предложена и научно обоснована физико-химическая модель индукции проводимости мембраны бактерий, согласно которой редокс-процсссы ш> ее внешней стороне с учпетием меди н белкоп управляют проводимостью встроенных в нее каналов и в конечном итоге определяют развитие патологического процесса в цитоплазме в результате автоиндуцированного транспорта меди к чувствительным мишеням в этом отсеке бактериальной клетки.

Проведенные исследования привели к заключению о том, что в основе усиления активности антимикробных препаратов тяжелыми металлами прежде всего может лежать облегчение их транспорта к мишеням действия через металл-индуцированные проводящие пути в мембране.

Научно-практическое значение работы.

Вскрытые в работе первичные механизмы токсического действия меди на клетку открывают реальные перспективы для прогнозирования эффективности комбинированных воздействий с участием тяжелых металлов и могут быть использованы при прогнозировании последствий комплексного антропогенного загрязнения окружающей среды, фиксируя шшмлпио ия то* споПстлях дополнительных потлеПстпнП. которые могут окп-зать решающее влияние на эффективность суммарного действия с участием меди и, возможно, других тяжелых металлов.

Проведенные исследования открывают также подходы к направленному поиску эффективных металлсодержащих композиций для дезинфекции ран, санитарной обработки питьевой йоды, профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

Апробация работы.

Результаты исследований доложены на Украинской республиканской конференции "Применение радиоэлектроники и псслсдошшии сперхслмЛмх свечений биологических объектов"(Киев, 1978), Международной конференции "Вода и ионы в биологических системах" (Бухарест, 1980), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Рес-

публиканской конференции "Ферменты, металлы, металлоферменты в диагностике и лечении" (Ивано-Франковск, 1982), 16-й Международной конференции ФЕБО (Москва, 1984), I Советско-германском международном симпозиуме "Микроскопическая фотометрия и акустическая микроскопия в науке" (Москва, 1985), Всесоюзной конференции "Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве" (Ташкент, 1986), Республиканской конференции "Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней" (Харьков, 1987), Всесоюзном семинаре "Современные проблемы антибиотикорезистентности" (Москва, 1988), Международном симпозиуме по биофизической химии "Успехи биоэлектрохимии биополимеров и мембран" (Йена, 1988), Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" ((Пупшно, 1989), Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1990), 2 Международном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва, 1995).

Личный вклад автора. Все вошедшие в диссертацию результаты получены лично автором либо при его непосредственном участии. Рад теоретических расчетов и экспериментов осуществлен в творческом сотрудничестве с коллегами из ИХФ, которым автор выражает искреннюю признательность.

Объем работы. По представленным на защиту материалам автором опубликовано 46 печатных работ.

II, КРАТКОЙ СОДЕРЖАНИЙ ПРЕДСТАВЛЕННЫХ К ЗАЩИТЕ МАТЕРИАЛОВ

Глава 1. Сравнительная характеристика токсичности тяжелых металлов в ионной форме и в виде высокодисперсного порошка (ВДП). Основные факторы, определяющие токсичность ВДП меди для бактерий в водной среде [1-16,19,21-23,29].

Интерес к всестороннему изучению биологической активности ВДП металлов был связан с выдвижением в конце 70-х годов идеи использовать их для создания в организме животного искусственного депо металлов, способного после однократного введения длительное время обеспечивать поступление необходимого элемента с целью коррекции обмена веществ или ликвидации дефицита металла в организме, возникшего в связи с тем или иным заболеванием(Федоров и др., 1979). В ходе дальнейших исследований продемонстрирована пониженная токсичность металлов при такой форме их введения в организм животных и высокая биологическая активность как в норме, так и при некоторых экспериментальных заболеваниях. При этом обычно полагают частицы ВДП биологически инертными, способными проявлять активность исключительно путем генерации ионов металла в процессе саморастворения в биологической среде. Наличие такого пути проявления активности ВДП не вызывает сомнения. Вместе с тем далеко не очевидно, что этот путь единственный. Действительно, процесс саморастворения металлов может сопровождаться образованием активных форм кислорода (ОЬапс1еЬап е( а1., 1976), участие которых в патологических процессах на различных уровнях организация биологических систем надежно установлено, и изменять состав среды (рН и содержание Ог). Кроме того, малый размер частиц (~10 от) и высокая кривизна поверхности могут существенно повлиять на скорость и направление реакций, протекающих в

среде, при контактных взаимодействиях с ВДП (Морохов и др., 1977). Представленные ниже данные сравнительного изучения токсического действия ряда металлов в виде растворимых солей и ВДП на бактерии в значительной степени проясняют эту проблему.

1.1. Влияние металлов в виде солн и ВДП иа рост бактерий.

Анализ влияния на рост клеток представляет собой простой и удобный метод интегральной оценки биологической активности различных препаратов. В опытах использовали 18-ти часовую культуру бактерий Escherichia coli В, выращенную на синтетической глюкозоминеральной среде М9 в стационарных условиях при 37°С. ВДП металлов Ag, Си, Zn, AI с размером частиц -100 нм были получены в Институте химической физики АН СССР. Навески ВДП диспергировали ультразвуком в дистиллированной воде. П исходной суспензии концентрация металла составляла 1мг/мл. Для сравнения использовали растворы солей AgNO). CuCh, ZnClAICI3 и супернатанты исходных суспензий порошков.

Опыты с добавками металлов в ростовую среду показали, что алюминий не оказывал влияния на рост бактерий ни в виде соли, ни в виде ВДП даже при максимальной концентрации металла в среде. Влияние остальных металлов, вводимых в виде ноаов или ВДП, зависело от их концентрации в ростовой среде. При низких концентрациях часто наблюдалась стимуляция роста культуры. Сравнительную эффективность металлов характеризуют данные, представленные в таблице 1.1.

Та&чица 1.1

Эффективность подавления роста Е. coll В в среде М9 металлами в виде ВДП и солей.

Ингибированне роста бактерий, % Концентрация металла в солн я порошке, мкг/мл

AgNO, Ag CuCl, Си ZnCl, Zn

50 0,06 15 0.27 0,7 — —

25 — — — 22 40

Как видно из таблицы, эффективность подавления роста бахтерий ионами металлов снижалась в ряду А^*>Сиг*>2пг*>А13*, что находится в согласии с данными других исследователей. Активность ВДП металлов была ниже, чем соответствующих ионов из солей. В ряду убывания токсичности металлов Си>А%>2п>А1 в сравнении с аналогичным рядом для ионов медь и серебро поменялись местами.

Как показали специальные исследования, количество новов первоначально присутствующее в суспензиях ВДП было явно недостаточно для того, чтобы за счет них объяснить наблюдаемое бактериосгатическое действие порошков. Основной эффект, очевидно, обусловлен действием самих ВДП металлов. Растворимость ВДП меди в воде была выше, чем ВДП серебра. Возможно, именно поэтому ВДП меди обладал наибольшей активностью, хотя в ионной форме активность этого металла уступала серебру.

Таким образом, представленные здесь данные предполагают два необходимых условия биологической активности ВДП металлов:

1. ВДП металлов должны растворяться в среде инкубации клеток.

2. Ионы этих металлов должны обладать биологическ�