Патогенез и диагностика некоторых медленных проиновых нейроинфекций

Ройхель, Виктор Моисеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Патогенез и диагностика некоторых медленных проиновых нейроинфекций
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Патогенез и диагностика некоторых медленных проиновых нейроинфекций"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ГОЛИОМИЕДИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ им.М.П.ЧУМАКОВА

ПАТОГЕНЕЗ II ДИАГНОСТИКА ЕЗХОТОЕЫХ МЕДЛЕННЫХ ЛРИОНОШХ НЕНРОЙЕФЕКЩ®

(03.00.06 - впрусологяя)

Диссертация э влдз научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинская науз

на правах рукописи УДК 578.833.26

РОЙХЕЛЬ Виктор Моисеевич

российская академия медицинских наук

ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ им.М.П.ЧУМАКОВА

на правах рукописи УДК 578.833.26

РОШЕЛЬ Виктор Моисеевич

ПАТОГЕНЕЗ И ДИАГНОСТИКА НЕКОТОРЫХ МЕДЛЕННЫХ ПРЙОЕОШХ ЕЕЙРОИНШЩШ

(03.00.06 - вирусология)

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук,

профессор, академик РАМН, В,А.Лашкевич

- доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, В.А.Зуев

- доктор медицинских наук, профессор,член-корреспондент РАЕН, А.Д.Алыптейн

Ведущая организация - Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского

РАМН

Защита диссертации состоится 1997г.

в I/O часов на заседании диссертационного совета Д001.27.01 цри Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чуиакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вщэусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН.

Диссертация в виде научного доклада разослана nl!t eg^WL^ 1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук 0, А.Медаедкина

Общая характеристика работы

Выделение медленных инфекций ЦНС как особой формы инфекционных заболеваний связано с работами исландского исследователя Сигурдсона, который в 1954г. сформулировал основные характерные черты этой формы инфекции. К ним он отнес большую длительность инкубационного периода (от нескольких месяцев до нескольких лет),неуклонное нарастание клинической симптоматики,приводящее к смерти или тяжелому расстройству, поражение одного органа или одной системы и наличие одного хозяина (,1954). Некоторые из этих положений были в дальнейшем пересмотрены,однако,и сегодня,когда медленные инфекции занимают определенное место среди других форм инфекционных заболеваний,в основу их определения кладутся принципы,сформулированные Сигурдсоном.

Группа медленных вирусннх нейроинфекций весьма обширна и неоднородна. К ним относятся заболевания,вызываемые обычными классическими вирусами (кори,простого герпеса,висна и др.). Механизм их развития определяется действием различных иммунологических и генетических факторов^ также дефектностью вируса (В.А.Зуев,1988). К ним относятся также заболевания ЦНС человека и животных,возбудителями которых является саморешшцирующиеся белковые частицы,названные пряонада (Ггиэ!-пег ,1982,1996). Исходя из патогенетических я клинических особенностей эти инфекции определяются как трансмиссивные губкообразные энцефалопатии (ТГЭ). Это заболевания,поражающие человека: болезнь Крейтц-[ельдт-Якоба (ЕКЯ),синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера (СГШШ),фа-гальная семейная бессонница,экзотическое заболевание куру; и поражавшие животных: скрепи,получившая печальную известность губкообразная энцефалопатия коров (ГЭК),трансмиссивная энцефалопатия норок,хрояиче-:кая изнуряющая болезнь находящихся в неволе оленей и лосей ( бадаи-;ек ,1996).

Б последнее время интерес к проблеме ТГЭ существенно возрос в вязи с сообщениями об эпидемии ГЭК в Англии и ряде других европейс-

ких стран и о возможной опасности заболеваний людей ЕКЯ при употреблении в пищу мяса заболевших животных,с чем связывается появление так называемого нового варианта ЕКЯ ( Tyrell et ai.,I992; Chazot et al.,I996; Will et &1.,I996;Co-usens ,1997). Значимость ТГЭ как медицинской и общебиологической проблемы бала подчеркнута присуждением Нобелевской премии по медицине в 1976г.выдающемуся американскому исследователю д-ру Гайдушеку за многолетние исследования медленных инфекций,вызываемых прионами.

В литературе обсуждается возможная принадлежность к группе ТГЭ некоторых хронических и дегенеративных заболеваний ЦНС человека невыясненной этиологии: болезни Альцгеймера (ЕА),Пика,Паркинсона,рассеянного склероза (PC),бокового амиотрофического склероза (БАС) и других невоспалительных заболеваний ЦНС (Gajduaek ,1985,1996). В 70-х годах В.И.Вотяковым с сотр.было описано своеобразное заболевание ЦНС человека,названное аииотрофическим лейкоспонгиозом и отнесенное к медленным прионовым инфекциям (В.И.Вотяков с соавт.,1990).

Актуальность настоящей работы вытекает из того,что многие стороны патогенеза ТГЗ не изучены. Так,неизвестны причины необычайной длительности инкубационного периода,достигающего десятков месяцев и лет; процессы,происходящие в органах-миленях на начальных этапах инфекции и другие существенные стороны патогенеза. Мевду тем,раскрытие механизмов и закономерностей патогенеза является необходимой предпосылкой для понимания особенностей течения этой уникальной формы летальных заболеваний человека и животных,для разработки способов воздействия на инфекционный процесс,а также методов диагностики и профилактики.

Цель и задачи. Целью работы являлось изучение закономерностей патогенеза црноновых заболеваний и изыскание возможностей для проведения их прижизненной диагностики. Исходя из поставленной цели в задачи работы входило:

1. Исследование ранних этапов патогенеза ТГЭ на модели скрепи на вирусологическом,морфологическом и биохимическом уровнях.

2. Выявление факторов .трансформирующих инфекционный процесс при модельной инфекции скрепи.

3. Исследование поведения агента скрепи в клеточных культурах соматических и глиальных клеток и реакции клеток на заражение.

4. Сравнительное изучение инфекционного процесса,вызванного различными возбудителями ira у одного вида животных.

5. Изыскание методических подходов к прижизненной диагностике ТГЭ. Научная новизна. Наиболее важным результатом проведенных исследований явились впервые обнаруженные нами изменения .происходящие на ранних этапах патогенеза ТГЭ. На модели инфекции скрепи выявлены время появления и последовательность изменений в нейронах функционально активных слоев коры и хвостатого ядра головного мозга шшей. Впервые выявлен феномен спленомегалии в инкубационном периоде экспериментальной инфекции скрепи. Впервые показано участие фермента аргиназы в патогенезе скрепи - увеличение активности аргиназы в клетках ЦНС мышей; определена динамика накопления агента, биохимических сдвигов и ультрамикроскопических изменений в клетках ЦНС - мишенях для действия агента. При использовании разработанной модели инфекции впервые показано стимулирующее влияние гипербарической оксигенащш и подавляющее действие ингибитора моноаминооксидазн аминазина на инфекционный процесс. В условиях длительной персистенции агента скрепи установлены различия в реакции двух типов клеточных культур: подавление роста клеток сомати-1еского происхождения и пралиферативный эффект - в глиальных клетках, Зпервне обнаружена интерференция агента скрепи с онкорнавирусами. фактическая ценность работы. На основе экспериментального изучения [зменений,наступающих в инфицированной агентом ыфепи перевиваемой ¡ультуре глиальных клеток впервые предложен методический подход к приязненной диагностике прионовых инфекций человека на модели БКЯ и син-

дрома Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, апробированный в клинической практике Института неврологии РАМН.

Апробация работа. Результаты работы были представлены на научных сессиях Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумако: РАМН (1981,1985),на заседаниях Всесоюзной проблемной комиссии "Хим® терапия и химиоцрофилактика вирусных инфекций.Особо опасные и медяе] ные инфекции"С1983,1985),на Ш съезде инфекционистов Белоруссии (199< 8-м Международном конгрессе вирусологии (1990),УП Всероссийском съе; де невропатологов (1995), 3-й конференции антивирусной ассоциации публики Беларусь (1996).

По материалам диссертации опубликована 31 научная работа.

Собственные исследования

В настоящей работе суммированы результаты 16-летних исследован: (1980-1996). Большая часть экспериментальных исследований выполнена при инфекции мышей ыфепи,которая считается модельной для всей груш ТГЭ (ШлЬег11п ,1976). Нами был использован агент скрепи,шташ С-5( выделенный из мозга заболевшей овцы в лаборатории д-ра Гайдушека (С! с последующим пассированием на мышах; агент получен от д-ра Гиббса (Институт национального здоровья,Бетезда,США). Опыты проводили на Л1 нейти мышах ВА1£/с и норках. Часть исследований выполнена на модел! трансмиссивной энцефалопатии норок; клинические работы выполняли щи использовании материалов,полученных от больных ЕКЯ.СГШШ.БАС и БА,РС. Гистологические и электронномикроскопические исследования проводили по общепринятым методикам. Активность аргиназы определяли по методу Хохлова с соавт.(1985).

Отдельные фрагменты работы выполнены в соавторстве с сотрудника ми Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАИ (Г.И.Фокиной, С „Г.Соболевым, В.М.Лисаком,М.Б.Королевым, Л.И.Равкиной.М. Фроловой,В.В.Погодиной); с сотрудниками Института высшей нервной дея тельности и нейрофизиологии РАН (В.Н.Мац),Института морфологии челов

ка РАМН (Л.И.Кондаковой),Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН (Г.Р.Михайловой и Ю.Н.Чередниченко).Института неврологии РАЫН (и.А.Завалишиным,Л.С.Адарчевой, А,С.Ниязбековой, А.Ф.Козловским); Московской медицинской академии ем.Сеченова (А.П.2охловым); НИИ пулшого звероводства и кролиководства им.В.А.Афанасьева министерства сельского хозяйства РФ (И.И.Дукур.В.И.Геллер,В. А.Чижовым). I. Патогенез ТГЭ.

Основное внимание было уделено изучению на ранних этапах инкубационного периода инфекции скрепи тех органов (головной мозг и селезенка)^ которых агент накапливается в клинической стадии заболевания и в которых развертывается основная картина патологического процесса. Важность изучения ранних изменений в органах-мишенях связана с отсутствием однозначных представлений о последовательности и взаип мосвязи фаз патогенеза скреш ( К1аЪег11п ,1976). I.I. Изменения в клетках ЦНС на начальных этапах инфекции.

Нами были изучены изменения нейронов разных отделов головного мозга в динамике инфекции мышей агентом скрепи с помощью цитометриче-ских методов. 2-3-недельных шшей ВАИЗ/с с массой 8-10 гр. заражали-в мозг агентом сг^епи в виде 10$ мозговой суспензии с исходным титром 5,71 ЛДзд в 0,03 мл. Контрольным мншам вводили в мозг 10% суспензию нормального мозга шшей; другим контролем являлась группа интакт-шх мышей. В использованных условиях опыта длительность инкубационного периода составляла 5 мес. Через 1,2,3 и 5 мес. после заражения в головном мозге животных каждой группа определяли накопление агента и зроводали гистологические и цитометрические исследования. Агент скре-и титровали путем внутримозгового заражения мышей BAIB/с; результаты щенивали по числу заболевших животных с характерной клинической кар-■иной и типичными гистологическими поражениями в ЩС. Титр агента выделяли по методу Heed a.Muench. (1938) .наблюдая животных в течение I месяцев. При цитометрических исследованиях определяли площадь тела

клетки,ядра и цитоплазмы пирамидных нейронов Ш и У слоев сенсомотор-ной коры и нейронов хвостатого ядра в интерференционном микроскопе МБИН-4,а также количество и концентрацию суммарного белка в ядре и цитоплазме (Бродский,1966; Мац с соавт. ,1979). В кавдом слое коры и хвостатом ядре просчитывали не менее 50 клеток; результаты обрабатывали статистически по критерию Стьюденга. Расчеты проводили на ЭВМ типа ЕС-1020.

В течение инкубационного периода зараженные и контрольные животные по поведению и внешнему виду не различались. Лишь после 5 мес. на чинали развиваться первые клинические симптомы (беспокойство,круговые движения). Вместе с тем,как видно из данных табл.1,уже через месяц после заражения агент наяашптался в головном мозге в достаточно высоком титре и его количество значительно возрастало в последующие сроки наблюдения,оставаясь примерно на одинаковом уровне. Обзорное гистологическое исследование головного мозга не выявило существенных различий между животными опытной и контрольных групп в течение 2 мес. инкубации. Через 3 мес.у зараженных животных отметили слабо выраженный спонгиоз серого вещества иицистрофичеокие-изменения в отдельных нейронах. Лишь в конце инкубационного периода,через 5 мес.,в головном мозге зараженных мышей имелся резко выраженный спонгиоз серого вещества .сопровождающийся резко выраженными дистрофическими изменениями нейронов (табл.1),что соответствует картине гистологических поражений Ц0С,характерной для клинической стадии ТГЭ (Веек а. 1>аай.е1 ,1965).

Результаты цитоаетрических исследований нейронов Ш и 7 слоев коры и хвостатого ядра в динамике инфекции отражены в рис.1,2,3. Как видно из рис.1,клетки Ш слоя коры уже через I мес.после заражения реагировали увеличением размеров тела клетки,ядра и цитоплазмы; при этоь увеличивалось количество ядерного белка. Было показано,что это увеличение размеров нейронов целиком обусловлено действием инфекционного компонента,а не влиянием нормального шпшного мозга. В последующие

Табл.Г.

Накопление агента скрепи и развитие гистологических поражений в ЦНС мышей ВА1В/с в динамике инфекции

Сроки после заражения (мес.) Г 2 3 5

Титр агента скреш в ЦНС (1р ЛДэд на гр. веса'головного мозга) 6,37 ^ 8,27 8,25 ? 9,12

Гистологические поражения ЦНС - + ++++

Симптомы заболевания 0 х/ тсутствуют'

- отсутствие поражений; + слабо выраженный спонгиоз серого вещества .дистрофические изменения в отдельных нейронах; ++++ резко выраженный спонгиоз серого вещества с выраженными дистрофическими изменениями в нейронах.

х/ симптомы заболевания развивается после 5 мес. инкубации.

интервалы времени .начиная со 2-го месяца, увеличение размеров нейронов сменилось уменьшением ряда учитываемых клеточных параметров .включая и количество ядерного белка. Цитометрические показатели изменения нейронов У слоя коры были иными (рис.2): в течение 2-х мес.размеры нейронов не изменялись. В отличие от клеток Ш слоя количество ядерного белка не изменялось через I мес. а резко падало через 2 мес.; в этот срок достоверно увеличивалось количество цитоппазменного белка и его концентрация. В последующе сроки эти показатели,как и размеры нейронов,уменьшались.

Поведение клеток хвостатого ядра в процессе инфекции напоминало реакцию клеток Ш слоя коры (рис.3). Через 2 мес.после заражения размер клеток возрастал,сначала только за счет ядра,а затем - и увеличения цитоплазмы. Однако,количество белка в ядре и цитоплазме достоверно не изменялось (I мес.),либо уменьшалось (в ядре - 2 ыес.). В после-

Рис.1. Изменения в клетках Ш слоя коры головного мозга мышей, 'зараженных агентом скрепи.

Рис.2. Изменения в клетках У слоя коры головного мозга мышей, зараженных агентом скрепи.

Рис.3. Изменения в клетках хвостатого ядра головного ыозга мышей, зараженных агентом скрепи.

Обозначения к рис.1,2,3: "

На оси абсцисс - 3 - площадь: Бт - тела клетки, Эя - ядра, Вц - цитоплазмы; Р - количество белка: Ря - в ядре, Рц - в цитоплазме; С - концентрация-белкам-Ся - в ядре, Сц - в .цитоплазме.

На оси ординат - отношение (в %) изученных клеточных параметров у зараженных мышей к таковым у мышей,инокулированных мозгом незараженных животных.

Статистически достоверные изменения после заражения: через I мес., 1чЧЧх через 2 мес.,

через 3 ыес., вда« через 5 мес.

■4—1 направление статистически недостоверных изменений.

"И

дующие сроки размеры клеток и содержание в них белка достоверно уменьшались. Таким образом.было показано,что начальный ответ клеток ЦНС на заражение агентом скрепи проявлялся,в большинстве случаев,в увеличении площади тела,ядра и цитоплазмы нейронов. Примечательно,что при изучении клеток головного мозга животных, зараженных агентом скрепи и далее культивируемых in vitro .также отмечали увеличение размеров ядра и рост количества многоядерннх клеток,пролиферацию нейроглин (Gustafson a.canitz ,1965). Известно,что латентная инфекция вируса гриппа в I клетках также приводила к увеличению площади клеток,а при заражении однослойных клеточных культур классическими вирусами увеличивается размер ядра (Тимаков,Зуев,1971; Хеснн,1967). Это говорит о том,что,несмотря на принципиальные различия в механизме репликации классических вирусов и агентов ТГЭ,имеются некоторые черты сходства в реакции клеток-мишеней.

Таким образом,была выявлена определенная закономерность изменений клеток ЦНС при инфекции возбудителем ТГЭ: начальная репликация агента в клетках приводит к увеличению их размера,а на дальнейших этапах - к уменьшению размеров клеток и количества белка в них и их деструкции. Некоторые исследователи указывают на отсутствие прямой зависимости между увеличением титра агента скрепи в ЦЙС и развитием патологических изменений ( Baringer et ai. ,1981,1983); существует и противоположная точка зрения ( Cole et ai. ,1985). Обсуждаемая в литературе гипотетическая схема причинных связей в патогенезе скрепи предусматривает определенный параллелизм в развитии биохимических из-менений.гнстологических поражении и появления клинической симптоматики С Kimberlin ,1976). Нами установлено,что в этой цепи событий изменение размеров нейронов и количества белка в них является самой первой реакцией клетки на размножение агента скрепи. Выявляемое методами световой микроскопии поражение клеток имеет место только в конце инкубационного периода.

Трудно судить,является ли обнаруженное нами повышение количества ядерного белка в клетках Ш слоя и цитоплазменного белка в клетках 7 слоя проявлением репликации агента или вторичной реакцией клетки. Известно,что при инфекции мышей агентом скрепи суммарный синтез белка в головном мозге не меняется (Hunter ,1974),хотя в мембранной фракции клеток ЦНС зараженных мышей был обнаружен дополнительный белковый шк (Somerville et al. ,1976),а в синаптосомальных мембранах отмечали некоторые структурные изменения белка ( viret et ai. ,1981). Различия в динамике изменений изученных параметров нейронов разных слоев коры могут указывать на разное участие клеток этих слоев в инфекционном процессе при ТГЭ.что соответствует данным об их различной функциональной значимости,а также о разном содержании белка,липидов, холестерола и активности рада ферментов (Bobina et ai. ,1956). В частности, более раннее вовлечение клеток Ш слоя в инфекционный процесс коррелирует с важной ролью клеток именно этого слоя в поддержании межнейрональных контактов (Поляков,1965). Активный ответ нейронов хвостатого ядра на репликацию агента скрепи,очевидно,связан с известной ролью хвостатого ядра как части неостриарной системы.принадлежащей к основным допаминэргическим системам мозга. Изменения в этой системе приводят к нарушению двигательных функций,в частности,к появлению круговых движений,что характерно для клинической симптоматики скрепи (Арушанян и др., 1966;Chandler ,1961). Следует отметить,что при исследовании ЦНС больного,погибшего с диагнозом БКЯ,наиболее выраженные гистологические изменения и падение активности окислительных ферментов также отмечали в глубоких слоях коры,особенно в Ш и 7 слоях ( Tinrperiey et al. ,1973).

Таким образом,выявленной наш общей закономерностью инфекционного процесса цри ТГЭ является развитие деструкции клеток во всех изученных отделах ЦНС,начальные проявления которой удалось обнаружить до появления гистологических изменений и развития симптомов заболевания.

По-видимому, большая растянутость во времени реакции клеток ДНС на внедрение агента отражает на клеточном уровне основную черту патогенеза ТГЭ - медленность развития патологического процесса. 1.2; Изменения в органах-мишенях на ранних этапах патогенеза,

выявляемые макроскопически и при электронной микроскопии.

Ранние изменения были изучены в органах-мишенях мышей (головном мозге и селезенке).которые являются местом преимущественного размножения агента скрепи С ЕИлшй et а1.,1965; 1970). При аранжировке опытов мы исходили из предположения Ггаеег а. ююылвоп (1961 о возможной модификации агента скрепи при его накоплении в головном ыозге и в селезенке. Для более полного проявления предполагаемого тканевого тропизма использовали суспензии селезенки и головного мозга как различные агентсодержащие субстраты,которые вводила в мозг или подкожно,моделируя условия игомалогичноетипя "гетерологичности". Через 40 дней после заражения при отсутствии клинических проявлений животных забивали; головкой мозг и селезенку использовали для вирусологического, гистологического и электроиномикроскопаческого изучения. Было выявлено статистически достоверное увеличение веса селезенки зараженных мышей. Этот эффект был проанализирован с учетом использования для инокуляции суспензии головного мозга шаг селезенки при введении их подкожно или в мозг. Из данных табл.2 видно,что статистически достоверное увеличение веса селезенки имелось лишь при внут-римозговом введении суспензии скрепи-содержащего головного мозга и подкожном введении скрепи-содержащей селезенки. Следовательно,по тесту увеличения веса селезенки как раннего ответа на введение агента, положительный результат был получен только при "гомологичности" агент-содержащего материала и пути введения.

Через 40 дней после заражения наличие агента выявляли путем параллельного внугримозгового или подкожного заражения одним и тем же субстратом.Как видно из данных табл.3,агент не обнаруживали в голов-

Табл.2.

Вес селезенки мышей через 40 дней после заражения агентом скрепи в зависимости от агент-содержащего субстрата и пути введения

Агент-содержащий Путь субстрат введения

Вес селезенки (мг)

Контроль Опыт + м + м

Статистическая достоверность различий

Головной мозг Головной мозг Селезенка Селезенка

в мозг 167 + 13 321 + 52 0,954£р<0,99

подкожно 227 + 31 217 + 21 р<:0,95

в мозг 202 + 21 234 + 36 р<0,95

подкожно 220 + 19 327 +29 р^-0,99

ном мозге мышей.которые при первичном заражении были инокулированы подкожно мозговой или селезеночной агент-содержащей суспензией. Во всех остальных вариантах опыта агент скрепи был обнаружен в исследуемых органах. Результаты определения агента в исследуемых через 40 дней после инфекции органах совпадали при заражении мышей суспензией одного и того же органа,вводимой разными путями. Средняя длительность инкубационного периода варкировала от 144 до 215 дней в различных группах. Таким образом,предположение о существований селезеночного и мозгового вариантов агента не подтвердилось при создании избирательных условий для проявления таких вариантов. Как видно из данных табл.3, ни по гибели зараженных мышей,ни по длительности инкубационного периода нельзя было сделать вывод о наличии органных вариантов агента.Это косвенно совпадает с данными Oatram (1976) об отсутствии различий в профиле поражений,вызываемых инокуляцией скрепи-содержащих суспензий головного мозга или селезенки. Вместе с тем,складывается впечатление о значииости "гомологии" агент-содержащего субстрата и пути введения для феномена увеличения веса селезенки. Наши данные также показали, что описанное ранее (Dickrnson a.Fraser, 1972) укорочение инкубационного периода при внутримозговом заражении по сравнению с периферлчес-

ким имеет место при использовании скрепи-содержащей суспензии не только головного мозга,но и селезенки.

Табл.3.

Индикация агента скрепи в головном мозге и селезенке мышей в зависимости от вида скрепи-содержащего субстрата и пути введения

Скрепи-содержащий субстрат

Цуть введения

Орган, исследуемый через 40 дней

после заражения

Цуть

введения суспензии органа при индикации агента

Гибель животных

Средняя длительность инкубацион периода удни)

Суспензия под- Головной мозг в мозг головного кожво подкожно

мозга

0/IÖ*/ н.и.

Селезенка

в мозг подкожно

12/12 У/9

148 185

Суспензия Головной мозг 3 М03Г 10/10 селезенки в М03Г _подкожно н.и.

175

Селезенка

в мозг подкожно

12/12 10/10

144

188

Суспензия под- Головной мозг в М03Г селезенки кожно_подкожно 0/13

Селезенка

в мозг подкожно

10/10 12/13

173 215

числитель - число погибших животных; знаменатель - общее число зараженных животных; н.и. - не исследовали.

Морфологическое изучение методом световой микроскопии головного мозга мышей,забитых через 40 дней после заражения,не показало различий между опытными и контрольными группами,что соответствовало дятми литературы ( Dubois-Daicq et al. ,1977). Описанную в качестве раннего признака гипертрофию астроцитов наблюдали на более поздних этапах инкубационного периода (Field ,1967; Pattison а.Jones ,1967$.

При электронномикроскопическом изучении головного мозга инфицированных мышей спустя 40 дней после заражения мы впервые выявили изменения, отсутствующие в соответствующих препаратах контрольных мышей.

Б мозжечке наблюдали выраженную деструкцию миелина,проявляющуюся очаговым набуханием миелиновнх оболочек аксонов и дезинтеграцией спиральных пластин миелина (рис.4). Имелась дегенерация синапсов (рис.5) .сопровождающаяся отеком пре статического окончания,уменьшением количества пресинаптических пузырьков и их слипанием. Иногда встречали набухание и округление постсияаптических окончаний,астро-цитарных отростков и просветление их цитоплазмы. Специфичность выявленных изменений показана в табл.4,из которой видно,что,в отличие от изменений в митохондриях.поражения в синапсах и дегенерация миелина были выражены только в опытных группах; у контрольных мышей они либо отсутствовали,либо имелись в единичных клетках.

Таким образом,при электронномнкроскопическом изучении ЦНС мышей на ранних стадиях инфекции было показано наличие определенных изменений, в то время как при световой микроскопии на этом этапе инфекции никаких поражений не выявляли.

Особый интерес представляют выявленные нами изменения в синапсах и пресинаптических пузырьках,содержащих,по современным представлениям ,химические медиаторы,опосредующие передачу возбуждения (Gray, 1967). Эти изменения,очевидно.являются морфологической основой для нарушений поведения и моторной деятельности зараженных скрепи мышей в течение инкубационного периода ( Cathaia et al., 1980; lie ygriana a.Hotchin, 1980 И др.).

При гистологическом изучении головного мозга мышей,у которых через 5-7 мес.развились клинические явления (истощение,круговые движения, сгорбленность, геморрагии в области хвоста),был выявлен спонгя-оз в коре больших полушарий,аммоновом роге и подкорковых ядрах,а также выпадение нейронов в коре больших полушарий и в подкорковых ядрах (рис.6). В этих очагах еде лас ь выраженная пролиферация астроцитов, с гипертрофией клеточных тел и отростков.В нейронах коры больших полушарий,ядрах мозжечка в в подкорковой области часто наблюдали выражен-

Табл.4.

Появление ранних морфологических поражений в ЦНС мышей через 40 дней после инокуляции суспензии нормальных или скрепи-содержащих органов

Материал Путь _ЦНС - поражения

использованный введе- Дегенерация Деструктивные Местные для инокуляции ния миелина поражения изменения в

в синапсах митохондриях

Нормальная селезенка в.м. - + +

п.к. - - -

Нормальный мозг в.м. + - +

—_и _ п.к. - - -

С1фе пи-содержащая селезенка в.м. п.к. +-Н- ++ ++ + +

Скрепи-содержащий мозг в.м. п.к. -н-++ ++ + + +

Нсинокулированные мыши - - -

в.м. - в мозг; п.к. - подкожно.

- нет поражений; + поражения в отдельных ЦНС-элементах; + поражены менее 50$ ЦНС-элементов ++ поражены около 50$ ЦНС-элементов +++ поражены более 50$ ЦНС-элементов.

ную вакуолизацию цитоплазмы. При злектронномикроскопическом изучении головного мозга мышей,забитых в клинической стадии заболевания,было установлено наличие в паренхиме разноразмерных вакуолеподобных образе ваний с характерными мембранными скоплениями. В клеточных элементах паренхимы часто выявляли вакуолизации цитоплазмы (рис.7).Изменения в миелинизированных аксонах были разнообразными - от дезинтеграция спи-

ральных пластин миелина-при сохранности ультраструктуры аксоплазмы до дегенерации аксоплазмы с вакуолизацией и появлением плеоморфных включений при сохранности миелиновой оболочки аксона. Изменения в синапсах соответствовали таковым,описанным в ЦНС мышей,забитых в инкубационном периоде,но были более выраженными.

Как и другие авторы,мы не обнаружили различий при световой к электронной микроскопии в селезенке зараженных и контрольных животных, хотя селезенка является местом раннего и постоянного размножения агента скрепи.

Полученные нами данные свидетельствуют о том,что при медленных инфекциях,вызываемых агентами ТГЭ,имеет место раннее появление и постепенное развитие морфологических изменений в ЦНС,выявляемых на. элек-тронномикроскопическом уровне и,очевидно,лежащих в основе функциональных нарушений,которые могут быть выявлены специальными инструментальными исследованиями С СаЛЪаНа. ей а1. 1980; Мс ТагХалй а.НорсЫм , 1980 и др.).

Рис.4. Набухание аксоплазмы ж разрыхление миелиновой оболочки. Ув.~ 30000 х

РИС.6. Status spongiosus. Ув.- 200 X

Рис.7. Вакуолизация цитоплазмы. Ув.- 8500 X

1.3. Биохимические сдвиги в организме мышей при экспериментальной

инфекции скрепи на различных этапах патогенеза и при БАС.

Одним из подходов к изучению патогенеза медленных црионовых инфекций является изучение биохимических изменений в ЦНС.Известно,что аминокислота аргинин играет важную роль в жизнедеятельности нервных клеток,входя в состав функциональных белков и участвуя в образовании рада биологически активных соединений.Недостаток аргинина приводит к поражению двигательных клеток спинного мозга (ЕешЪетае et а1. ,1960); выявлено также резкое снижение концентрации аргинина в биологических жидкостях больных БАС (Хондкариая с соавт.,1978). Концентрация аргиназы з ЦНС,по-видимому,является лимитирующим фактором, определяющим количество аргинина,так как последний не проникает через гематоэнце-фалический барьер (Давтян,1968; %галей с соавт.,1977). Исходя из этого,мы изучали ранние изменения активности аргиназы в клетках ЦНС при инфекции мышей агентом скрепи и возможную коррелятивную связь таких изменений с динамикой накопления агента и развитием ультрамикроскопических изменений в ЦНС. В литературе мы не налли указаний об изменении активности аргиназы в ЦНС животных,зараженных агентом скрепи или другими близкими агентами.

4-х недельных мышей с массой 12-14 гр. заражали в мозг агентом снреш в виде 10$ мозговой суспензии. Контрольным мышам вводили в мозг 10$ суспензию мозга незараженных мышей; другим контрлем служила группа интактннх животных. В инкубационном периоде (через 1,2,4,

5 и 6 мес.) в головном мозге мышей определяли уровень аргиназы,накопление агента скрепи,проводили электронномикроскопические исследования. Как показано в табл.5,уже через I мес.в головном мозге инфицированных мышей количество аргиназы статистически достоверно увеличивалось. В последующие сроки до 4-х мес.активность фермента возрастала,а к 5 и

6 мес.она снижалась,оставаясь,однако,и к 6 мес.,т.е. к началу появления клинической симптоматики,статистически достоверно более высокой

по сравнении с контролем. Изменение количества аргиназы в ЦНС не коррелировало с накоплением агента скрепи в ЦНС мышей,т.к.последний показатель нарастал в течение всего инкубационного периода (табл.5) и его пик приходился на период спада активности аргиназы. Мы проанализировали динамику морфологических изменений в ЦНС в те же сроки инфекции. При электронноашфоскопическом исследовании учитывали следующие показатели патологического процесса: развитие status spongiosus, дегенерацию синапсов,наличие многослойных мембран и наличие пятислой-ных мембран .Динамика их развития приведена в табл.6; Первые признаки status spongiosus были выявлены через I мес.после заражения; в дальнейшем их степень возрастала,достигая максимума на последних этапах инкубации. Дегенерация синапсов,выражавшаяся в отеке п набухании си-наптических окончаний,изменении величины,формы и характера распределения синаптических пузырьков выявлена через 2 мес.после заражения; степень ее развития возрастала к концу инкубационного периода. К этому сроку (около 5 мес.) начинали выявляться штислойные мембраны,прел ставлявшие собой шготно прилегающие друг к другу пограничные мембраны клеток или их отростков. Общая толщина таких мембран равнялась 17-19 нм; ширина белковых слоев,обращенных к цитоплазме,достигала 6 нм,центрального белкового слоя - около 3,5 нм,а липидннх бислоев -около 2,5 нм. Интенсивность их образования продолжала нарастать к концу инкубационного периода. Несколько другой характер носила динамика образования так называемых многослойных мембран, шевщих утолщенные (до 5 ны) белковые слои повышенной электронной плотности,количество которых в профиле одной мембраны иногда было более 10 (рис.8) .Начало появления многослойных мембран регистрировалось через 2 мес.после заражения; на этот период приходился их количественный пик.

Сопоставление динамики изменения активности аргиназы,накопления агента С1фепи и выраженности улы^амикроскопических изменений позволяет предположить,что изменение активности фермента,как и количество

многослойных мембран,отражает динамику развития реакции клеток ЦНС на воздействие инфекционного агента. Очевидно,к 5 месяцам инкубации происходит изменение реакции клеток,что выражается в уменьшении количества аргиназы и количества многослойных мембран на фоне возрастания

титра агента сгфепи в ЦНС.увеличения степени развития status spongio-sus .дегенерации синапсов и увеличении количества шстислойных мембран

По своей ультраструктуре последние очень похожи на щелевые контакты (Албертс с соавт.,1987). Мы полагаем,что появление таких контактов в паренхиме инфицированного мозга можно рассматривать как приспособительную реакцию,направленную на поддержание метаболической кооперации клеток,нарушенной вследствие ухудшения электрической и химической проводимости в поврежденных синапсах.

Вопрос о природе и происхождении многослойных мембран и их роли в патологии клеток является предметом дискуссии в литературе. Мы разделяем мнение Beck et ai. (1982) о том,что механизм происхождения этих мембран может быть связан с процессом их "запруживания" для прохождения микро- и макромолекул при их избыточном синтезе. Исходя из этого,можно предположить,что выявленное нат накопление аргиназы в нервных клетках во вреыя инкубационного периода скрепи может быть связано с нарушением оксошгазмотока и проницаемости мембран.

При обсуждений возможной роли аргиназы в патогенезе скрепи нужно принять во внимание тлеющееся мнение о том,что главной функцией аргиназы является регуляция синтеза гистонов (Давтян,1968). Между тем,предполагается,что нарушение ацетилирования гистонов является одним из ранних эффектов инфекции скрепи ( Caspary a.seweii Д968).

Интересно,что в случае болезни Крейгцфельдт-Якоба была продемонстрирована кривая активности нейроппецифической эяолазы в CMS больного, сходная с изменениями активности аргиназы при скрепи ( Wakayama et ai.,1987). Изменение активности аргиназы в клетках ЦНС при экспериментальной инфекции скрепи можно рассматривать как ранний признак,т.к.по-

вышение активности фермента цредшествует максимальному накоплению агента и развитию основных дегенеративных ультрамикроскопических поражений' Табл.5.

Изменение активности аргиназы и накопление агента свреш в ЦНС мышей,экспериментально зараженных агентом скрепи.

гр.

Группа

Срок после зараже: шее.

Кол-во Статистич. Тиар агента

аргиназы достоверность скрепи ед/мг белка различий (1а + Ы в

I. Интактные мыши

И. Инокулированные нормальным мозгом

Ш. Инокулированные I агентом скрепи

IV. 2

V. -"- 3-4

VI. 5 УЛ. б

0,146+0,004 0,110+0,005

0,228+0,35

0,297±0,033

0,521+0,054

0,260+0,046

0,152+0,042

1-П 9Э?р>95

П-Ш р>99

П-1У р>99

П-У р>99

П-У1 р>99

П-УП 99>р?95

5,0 7,0 7,5 8,0 8,0

Изучение биохимических аспектов патогенеза может быть одним из подходов к исследованию вопроса об общности механизмов развития патологического цроцесса при медленных нейроинфекциях, вызываемых приона-ми,и хронических инфекциях ЦНС человека неясной этиологии; к последним,в частности,относится боковой ашотрофЕческий склероз. Поэтому мы сопоставили изменение активности аргиназы в клетках ЦНС при экспериментальной инфекции скрепи'и при заболевании БА.С у людей. Было обследовано 100 больных с клиническим диагнозом БАС,госпитализированных в отделение нейроинфекций Института неврологии РАМН. Груша сравнениям включала 50 больных с различными поражениями ЦНС (шейные миело-патии.опинальные амиотрофии, опухоли спинного мозга,полинейропатш); контрольная группа - 100 здоровых лиц.

Табл.6.

Динамика ультраиикроскопических изменений в ЦЦС мышей,зараженных агентом скрепи

Срок после заражения (мес.) Дегенерация синапсов Пятислойнне мембраны Многослойнне мембраны

I X/ I + 0 0 0

2 4+ 1+ 0 3++ 3+++

3 4+ 2++ 0 0 1++- 5+

5 5+ Г-н- 1+ 2+ 1++ 1+

6 1+ 5++ 4+ 2++ 2+ 4-н- 0

указано число мышей с выявленными изменениями из 6 исследо-

ванных на кажднй срок.

Изменения встречаются: + менее чем в 20$ полей зрения; -н- менее чей в 30$ и +++ более чем в 50$ нолей зрения.

Результаты исследования уровня аргиназы в СМ! больных и контрольных лиц отражены в табл.7. Высокий уровень аргиназной активности был обнаружен у 98$ больных БАС. В группе сравнения аргиназная активность была выявлена всего у 12$ больных при более низком среднем уровне; в (Ж контрольных лиц аргиназная активность не была выявлена,; Активность аргшгазн зависела от степени поражения различных структур ЦНС. При злокачественном течении болезни с быстрой генерализацией процесса в течение года активность аргиназы была максимально высокой, при доброкачественном течении ж медленном развитии - наиболее низкой. Суммирование этих данных позволяет прийти к заключению,что црв БАС имело место 2-8 кратное нарастание активности аргшазн в СМЖ больных с различными формами при сопоставлении с группой сравнения.

Таким образом,в результате исследований нами была выявлена четкая динамика изменения активности аргиназы в клетках ЦНС при инфекции скрепи и показана высокая активность аргиназы в СМ! больных БАС.На основа-

Рис.8. Многослойные мембраны. Ув. 85000 х

Табл.7.

Частота регистрации и показателя активности аргиназы в (Ж больных БАС

Сравниваемые группы

I. Больные БАС

Число Частота Абсолютная Статистическая обсле- регистрации величина достоверность довакиых активности активности различий лиц аргиназы аргиназы Ф Сед/л)

100

3,70+1.20

1-П РР-39

П. Группа сравнения (больные с разными поражениями ЦНС)

12+5

1,10+0,13

Ш. Контрольная группа

100

шга этого можно полагать,что в развитии этих заболеваний определенную роль играет изменение активности аргиназы,что может указывать на некоторое сходство биохимических аспектов патогенеза заболеваний. 1.4. Влияние различных факторов на течение инфекционного процесса.

Несмотря на то,что в патогенезе ТГЭ многое остается неясным,мы предприняли попытку воздействовать на инфекционный процесс при модельной инфекции скрепи у мышей путем применения аминазина,ингибитора моноаминооксидазы (МАО) (Чиквадзе,1967). Как известно,биогенные моноамины (ЕМА) играют большую роль в патогенезе острых,хронических и латентных инфекций (Попенкова и Масленников,1977). Уровень ША понижен в головном мозге больных БКЯ ( Brun et al. ,1У71). Это явилось предпосылкой для использования аминазина с целью повысить активность ША. Мышей BAIB/c заражали агентом скрепи (титр 6,37 ЛД^) в мозг шга внутрибршинно; контрольной группе кивотных вводили суспензию нормального мышиного мозга. Все животные получали аминазин подкожно за 3 и I день до заражения и затем еженедельно раз в неделю в течение 5 мес. Течение инфекционного процесса оценивали по длительности инкубационного периода,уровню заболеваемости,накоплению агента в головном мозге животных через 6 мес.после заражения ж характеру гистологических поражений в ЦНС. Из табл.8 видно,что в данных условия опыта у 100% зараженных скрепи мышей развивалась клинически выраженная инфекция с длительностью инкубационного периода 150-210 дней в зависимости от пути заражения. Введение аминазина при внутрибрюшнном способе заражения приводило к удлинению инкубационного периода и некоторому снижению уровня заболеваемости. При этом различий в уровне накопления агента скрепи в головном мозге и в характере гистологических изменений в ЦНС не наблюдалось.

Анализ полученных результатов позволяет предположить,что взаимодействие агентов сщзепа с системой ЕЛА,на которую оказывает воздействие введенный аминазин, зависит от пути попадания агента в головной

мозг. Полученные данные могут свидетельствовать также об определенной роли ША в патогенезе скрепи. Это соответствует данным литературы об уменьшении уровня серотоюша при инфекции скрепи и БКЯ и об изменении клинической свмптоыатихи у скрепи-инфицированных животных,получивших серотонинэргичесхие препараты,а также данным о роли моно-аминаргической системы при экспериментальной инфекции куру С Вег-ь et а1. ,1977; 0ои4яа1-Ь еЪ а1. ,1981; ЕоЬдаег et а!. ,1981; НуЪоге еИ а1.,

1982). ' т ^ „

Табл.8.

Влияние аминазина прп инфекции скрепи

Материал Путь Амина- Число Инвубац. Заболева- Титр агента

для введения знн вашей период емость скрепи в ЦНС

инокуляции (дни) {%) ЫЫЕИЙ-Ig ЛДдо

Мозг яезара- в;и. — 20 0

женных иышзй В«|! • + 20 0

в.м. 30 150 100 9,07

Агент свдрепи

в.м. + 30 180 87 8,97

в.dp. - 30 210 100 н.и.

в:ф. + 24 210 100 н.и.

в.м. -в мозг; в.бр. -внутрибршшнно;

+ препарат вводили; - препарат не вводили; н.и. -не исследовали

Следует отметить,что ряд антивирусных препаратов.испытанных в опытах на мышах,заражениях агентами скрепи и БКЯ,оказались неэффективными: А-Э-р-Д-арабикофуранозиладешта .метасазон, фосфонуксусная кислота,виразол, аденин-арабинозид, тгамфекикол.рифамцицин.изоцринозкн С JEimberlin a.Walker ,1979; Tateislii ,1981). Некоторая эффективность была показана при применении минерального гетерополианиона НРА-23 и полиенового антибиотика амфитерицина ( Eimterlin a.Walker ,1986; PocoiarieZ£^I987; Adjoa et ai. ,1996). Учитывая эмпирический характер этих попыток,видный исследователь в области терапии ТГЭ Поль Браун

справедливо характеризовал их как "выстрелы в темноту" С Brown ,1984).

Основываясь на известных данных о влиянии концентрации кислорода на уровень клеточного метаболизма,особенной клетках ЦНС,и на наблюдениях Chino (1981) о сходстве ультраструктуры поражений ЦНС при БКЯ и гипоксии,мы исследовали влияние гипербарической оксигенации и гипоксии на инфекционный процесс при экспериментальной инфекции скрепи у мышей. Спустя месяц после заражения агентом скрепи или инокуляции нормального мышиного мозга этих и интактных мышей подвергали воздействию гипербарической оксигенации,помещая их в закрытую камеру с подачей кислорода под давлением 3 кг/см .период компрессии длился 7 минут, время экспозиции I час. Такие процедуры проводили 6-кратно в те^ чение 3 недель. Условия гипоксии (концентрация 02 -16-18^) создава-

проводилась однократно. Сразу после проведения гипоксия и курса гипербарической оксигенации часть животных забивали; их головной мозг исследовали гистологически и электронномикроскопически.а также определяли накопление агента скрепи в головном мозге и селезенке; аналогичные исследования проводили у животных на пике заболевания. Саш процедуры гипербарической оксигенации и гипоксии по всем учтенным параметрам не оказывали влияния на организм интактных животных. Показано,что гипербарическая оксигенация не влияла на длительность инкубационного периода и уровень заболеваемости,однако,степень проявления клинических признаков была большей у опытных животных по сравнению с зараженными контрольными,не подвергавшимися воздействию оксигенации. Накопление агента скрепа в головном мозге и селезенке было также вшяе у подопытных животных,чем у контрольных (7,09 и 6,50 Ig в сравнении с 5,14 и 4,90 ДДзд»соответственно). При гистологическом исследовании ЦНС никаких различий между сравниваемыми группами не выявлено. При электронной микроскопии поражения, специфичные для скрепя, ( status spoagiosus .образование мембран в вакуолях,набухание синап-

тических окончаний) б ЦЙС мышей,подвергнутых.гипербарической оксигенации, были более всажены,чем у мышей,находившихся в атмосфере с нормальным содержанием кислорода. Так,на пике заболевания у мышей,подвергнутых гипербарической оксигенации,наблюдали множественные изменения в отличие от таковых у зараженных мышей,находящихся в условиях нормальной концентрации кислорода.

Анализ влияния гипоксии на инфекционный процесс по всем учтенным наш параметрам не выявил различий между жшзотнше,инфицированными агентом скрепи и подвергнутыми или не подвергнутыми гипоксии. Отмеченное действие гипербарической оксигенации,стимулирующее инфекционный цроцесс цри скрепи,возможно связано с влиянием повышенной концентрации кислорода в окружающей среде на уровень некоторых трансмиттеров, играющих определенную роль в патогенезе скрепа,а таете на синапсы,являющиеся мишенями для действия агента скрепи 1Селивра,1974; wood , 1975; Bohtrer et al. ',1981; Goudsmit et ai. ,1981). Возможной причиной выявленного эффекта может быть и образование в условиях гипербарической оксигенации лвпидных пзроксидов и свободных радикалов, повышающих проницаемость клеточной мембраны I Wood. ,1975; Залвдш! е соавт. 1979). По нашему мнению, полученные данные о стимулирующем инфекционный процесс действия гипербарической окснгеиацки должны учитываться цри попытках применения этого широко распространенного метода для терапии большее ТГЭ.

1.5. Персйстекция агента окреш в различных типах перевиваемых руль-тур клеток.

Однш из общепривзтнх методов изучения патогенеза вирусных инфекций является исследование взаимоотношений возбудителя с чувствительными клетками культур тканей. Мк изучали становление персистенции агента скрепи в двух типах клеточных культур: соматических клетках и глиальных клетках. В качестве соматических клеток использовали гибридную линию клеток опухоли почки шза SAC я диплоидных кожно-шшечшх

фибробластвв человека (Мустафяна,Дашкевич,1983). Для заражения клеток применяли различные методические подходы: обработку агента скрепи лизолецитаяом,обработку клеток лидазой (Чередниченко с соавт., 1982) и заражение интактных клеток необработанный агентом скрепа.На различных пассажных уровнях определяли наличие агента в лизатах клеток при помоют биопробы на мышах; проводили цвтоаорфояогические и электронномикроскопические исследования. Наиболее длительно пассировали зараженные клетки при предварительной обработке агента лизолеци-тином (98 пассажей в течение 658 дней); при рутинном заражении необработанных клеток натиБным агентом удалось провести 34 пассажа в течении 317 дней. На всех изученных пассажных уровнях клеточные лизата были инфекционными. При исследовании биопроб начальных пассажей (до 10 пассажа) отмечен необычно длинный инкубационный период у зараженных соответствующими биопробами мышей,- до Г,5 лет,что могло указывать либо на изменение свойств агента в процессе псрсистенции.лгбо на накопление его в очень небольшом количестве Iтабл.9)

Табл;9.

йнфекционность соматических гибридных клеток,персистентно

зараженных агентом скрепи, для мышей ВА1В/с.

Число пассажей Длительность Гибель

клеточной инкубационного периода зараженных мышей

культуры (недели) (%)

2 58 100

7 50 100

9 62-66 Г00

19 28-35 100

25 28-35 Г00

29 66 ПЮ

52 28 100

65 28 100

91 31 100

на уровне II—18 пассажей было отмечено отставание роста зараженных клеток и снижение их ьштотической активности. При электроннодакрос-кошческоы исследовании на уровне 9,51 и 94 пассажей в клетках были обнаружены миелиноподобнне вяутрицитоплазматические слоистые мембранные структуры и крупные вакуоли,содержащие разноразмерные мембранные образования я дочерние вакуоли. Выявленные изменения напоминали поражения в головном мозге мышей,зараженных агентом скрепа. Описанные изменения отсутствовали в консольных культурах.

Учитывая известную роль глиальных клеток в патогенезе ТГЭ ( Heig а.С1ахке ,1971),мы исследовали персистенцию агента скрепи в перевиваемых глиальных клетках невриноьш гассерова узла крысы (Авцан с со-авт.,1989). При использований натявногонеобработанного агента и необработанных клеток удалось получить персистенцию агента скрепи на протяжении 121 пассажа в течение 2 лет. Высокий уровень инфекционное?и агента в клетках,определяемый биопробой на мышах.сохранялся до последних пассажей; длительность инкубационного периода не зависела от пассажного уровня и составляла 9-10 мес.в среднем. Характерной чертой персистенцш агента в глиальных клетках являлось развитие выраженного цролиферативного эффекта,характеризующегося возрастанием ьштотическо-го индекса,увеличением плотности клеточного моносяоя и трехкратным увеличением количества клеток. Превышение ыитотнческого индекса инфицированных клеток над соответствующим показателем контрольных неинфи-цнрованных пассированных клеток отмечали уже на 4 пассаже; оно наблюдалось до 99 пассажа; кратность возрастания митотического индекса ва-риировала от 1,7 (32 пассаж) до 4,8 (99 пассаж). Электронновдкроско-пически в зараженных клетках выявляли картины метаморфоза и патологии мембранных элементов. Существенной особенностью зараженных клеток была интенсивная вакуолизация (рис.9),что характерно для патологического процесса при ТГЭ в клетках головного мозга в системе in vivo . В зараженных клетках выявлялись многослойные мембраны,ранее обнаружен-

ные нами в клетках головного мозга мышей, инфицированных агентом скрепи. Их детальное описание приведено в разделе 1.3. Персистенция агента скрепи в глиалышх клетках приводила к интерференции с онкорнави-русами, снижая их накопление. С табл. 10). Можно предположить, что возможной причиной интерференции является конкуренция за мембранные структуры, обусловленная тесной ассоциацией прионов с клеточными мембрана-га.

Изложенные выше данные свидетельствуют о способности агента скрепи к длительной перснстенции как в соматических,так и в глиальных клеточных культурах. Очевидно,что реакция клеток зависит от типа клеток: это замедление клеточного роста в соматических клетках и проли-феративный эффект - в глиальных клетках. Наличие сходных ультраструк-турннх изменений в обоих типах клеток в системе in vitro и в клетках головного мозга в системе in vivo можно рассматривать как выражение специфики ультраструктурных повреждений,характерных для действия агента скрепи. Наши исследования подтвердили возможность длительной пер-•систенции агента скрепи в перевиваемых культурах глиальпого и соматического происхождения; проведенный- нами сравнительный анализ выявил отмеченные выше существенные различия в характере реакции клеток на персистирувщий агент.

Табл.10

Влияние персистендаи агента С1фепи на количество онкорнавирусных частиц в глиальных клетках,выявляемых при электронной микроскопии

Клетки Общее число срезов Число срезов без абс. онкорназирусов %

Интакткые 108 10 9

Инокулированные суспензией 124 2 1,6

нормального мозга

Инфицированные агентом 117 45 38

скрепи

РйО.9.

Вакуоли в цитоплазме перевиваемых глиальных клеток.

Ув. 16800 х

Рис.10.

Дочерние вакуоли в перевиваемых глиальных клетках.

Ув. 35000 х

1.6. Экспериментальная латентная инфекция скрепи.

Существование латеншш при 1ТЭ может иметь важное значение в связи с тем,что наличие латентных форм,могущих возникать либо вследствие заражения,не приводящего к клинически выраженному заболеванию, либо как результат выздоровления,может существенно влиять на эпидемический процесс. Проблема датенции при ТГЭ приобрела особое значение и актуальность в связи с разразившейся эпидемией губкообразной энцефалопатии коров в Англии и прогнозированием приобретающей эпидемический характер возможно связанной с ней болезни Крейтцфельдт-Якоба у людей.( Ссияепв еЪ а1. ,1997).

Представление об отсутствии латеиции цри ТГЭ было выдвинуто Си-гурдсоном, который,вводя понятие медленной инфекции,к числу определяющих ее признаков отнес 100$ заболеваемость и смертность ( 8оп,1954). По мере изучения ГГЭ накапливались факты,которые могли трактоваться в пользу существования латентных форм (Но-ьсЫп. а.Васк1еу 1977,; Иапи.е11й1в ег ей. ,1978).

Нами была предпринята попытка выявления латентных форм при инфекции скрепи у мышей. Для определения возможного наличия латенции использовали мышей,зараженных скрепи-содержащей мозговой суспензией и выживших после заражения в течение 12-14 мес.без проявления какой-либо клинической симптоматики. Головной мозг и селезенку этих животных использовали в виде 10% суспензии для проведения слепых пассажей путей внутримозгового заражения 2-3 недельных шшей. Зараженных мышей наблюдали в течение 6-11 иес. При заражении пулом исследованных органов ни у одной из 45 зараженных мышей клинические явления не развивались.

При гистологическом изучении головного мозга мышей,зараженных и выживших после заражения,было показано отсутствие у большинства из них каких-либо изменена! в ЦНС,характерных для патогястологической картины скрепи. Наряду с этим,у нескольких животных,зараженных агентом скрепи,был отмечен выраженный спонгиоз в сером веществе головного мозга, сопровождающийся слабо выражениям отеком белого вещества и дистрофией нейронов,что соответствует стандартной патогистологичесхой картине патоморфологии скрепи.

Дяя определения чувствительности подопытных мышей к суперинфекции было отобрано 60 животных,зараженных агентом схрепи и не заболевших в течение II мес., 28 мышей,инокулированшх суспензией нормального мышиного мозга и 45 интактных 2-3 недельных мышей. Для сопоставления чувствительности ранее инфицированных и янтактяых мышей животных заражала в мозг агентом скрепи а определяла их заболеваемость.длительность

инкубационного периода и титр агента,вычисляемый раздельно в обеих сравниваемых группах животных. Ддя заражения использовали больше дозы агента (от 10 до 100000 ЛД^О.ОЗ мл),заведомо приводящие к 100% гибели при заражении 2-3 недельных интактных мышей. Как видно из чабх II, Ii-месячные ранее зараженные мыши и интактные 2-3 недельные мыши обладали одинаковой чувствительностью к инфекции. Они заболевали в 1005? случаев с одинаковым инкубационным периодом (5 мес); титр ниоку-лярованного агента был одинаковым при использовании дли титрования как старых,ранее инфицированных,так и молодых интактных животных. Сле дует отметить,что первичная инокуляция нормальным мышиным мозгом таю не влияла на чувствительность мышей к последующей инфекции,не изменяя всех учитываемых показателей инфекционного процесса; в то же время имеются данные,что при попытке переноса адаптированного к хомякам are нта скрепи на мышей предварительное введение мншам гомогената нормаль ного хомячкового мозга задерживало перенос "хомячкового" сзфепи на мы шей ( Kimberlln et al. ,1975).

Возможность существования латентной форш ТГЭ,возникающей либо в результате выздоровления после заболевания,либо как результат неполно го инфицирования обсуздалась в литературе, причем указывалось на возмо жное влияние этого феномена на инфекционный процесс (üanueiidls et ai 1978; Sanders a.Dunn ,1973; Matthews ,1981). Если предположить,что не заболевшие после заражения мыши являются носителями латентной формы агента, требующей дая проявления своей инфекционности особах у слова то в таком случае результаты надвое опытов по суперинфекции могут свидетельствовать о том,что предполагаемое носительство агента не нзмзня ет чувствительности животных к повторной инфекции аналогично тому,как зараженные скрепи мыши,по нашим наблюдениям,не изменяют своей чувстви тельности к последующей инфекции вирусом клещевого энцефалита. Это на ходатся в соответствии с данными Hotchin a.Buckley £1977),получивяых аналогичные результата при инфекции агентом скрепи новорожденных мыие

с последующей суперинфекцией.

При обсуждении проблемы латенции ТГЭ нельзя не учитывать данные о наличии в тканях нормальных животных так называемого клеточного приона,обозначаемого как В?Рс,не вызывающего никаких морфологических изменений в отличие от инфекционной формы приона РеР8? Носительство РгРс можно рассматривать как своеобразную имитацию латенции,которая может быть активирована под действием различных неидентифицированных факторов,в том числе и заражением инфекционным агентом СБаПег еъ а1. 1994; Нога-ивЬ! вЪ а1. ,1995; Вгапйпег е* а1. Д996). Очевидно,что для окончательного решения вопроса о наличии латенции при ТГЭ необходимо дальнейшее накопление экспериментальных данных с использование« адекватных методов активации.

Табл.II.

Сравнительная чувствительность к инфекции агенте« скрепи шшей разного возраста при однократном и двукратном заражении

Возраст шшей Материал йто йнкубац, . Заболе-

при вторичном первичного вторичного скрепи период ваемость

заражении заражения заражения (19 ЛД^) (мес.) «)

12 мес. нормальный 0

мышиный мозг

нормальный агент 5,5 5 100

мышиный Ыфепи

мозг

агент скреш - 0

агент скрепи 5,5 5 100

2-3 агент 5>5 5 100

недели скрепи

- агент не выявляли.

2. Изучение инфекционного процесса,вызванного у одного вида животных разными возбудителями црионовых инфекций.

Существует гипотеза о тш.что заболевания,входящие в группу ТГЭ, вызываются либо возбудитеяямг с близкими свойствами,либо различными штаммами одного а того же возбудителя (Ga^dusek ,1977} . Аспект единства ш разнообразия возбудителей ТГЭ неожиданно приобрел первостепенное значение в связи с появлением в 1985-86гг. в Англии нового заболевания - губкообразной энцефалопатии коров СГЭК),которое было вызвано скрешшодобным агентом и обладало рядом свойств медленной инфекции. В 1990г. в Англии было зарегистрировано 19907 случаев ГЭК в 9413 хозяйствах со средним ежемесячным уровнем заболеваемости 460-470 случаев. К 1997г.общее количество случаев составило 165000 с вовлечением 34000 стад (Collee ,1990,1997; Wilesmith ,1990). В связи с этим заново подвергся ревизии давно обсуждаемый вопрос о путях передачи инфекции ТГЭ. Указывалось на возможность передачи инфекции от коров людям через употребление инфицированных продуктов, что цривело к запрещению использования в пищу ряда продуктов коровьего происхождения (Taylor ,1969; Matthews ,1990). Подчеркивалась значимость изучения возможности возбудителе! преодолевать видоспецифический барьер,что связано с оценкой потенциальной опасности возбудителей ТГЭ, поражающих животных,для человека.С Gittas ,1990; Taylor Д990).

Мы использовали один из возможных путей модельного изучения этого вопроса,-окределение основных характеристик инфекционного цроцес-са,вызванного различными агентами ТГЗ у одного вида животных,для которого они являются или не являются природным хозяином. Сравнительное клиническое,вжрусологическое.гистологическое и элвктронномикроскопи-ческое изучение инфекционного процесса было проведено у норок,зараженных агентом трансмиссивной энцефалопатии норок (ТЭЯ) (природный хозяин - норка) и агентом скрепи (природный хозяин - овца). Подопытных норок заражали в мозг 10% суспензией мозга больных ТЭЯ но-

- а? -

рок или мышиного мозга, содержащей агент скрепи; контрольных животных - суспензией мозга незараженных животных. Животных наблюдали 9 месяцев.

У зараженных агентом ТЭН норок инкубационный период составлял 5,6-6 мее.,а при заражении агентом скрепи - 6-8 мес. Клинические признаки заболевания практически не различались: они проявлялись вначале в угнетении,отказе от корма. В течение 2-3 недель состояние животных ухудшалось,угнетение резко усиливалось,отмечалось истощение,появлялись вращательные движения, сопровождающиеся судорогами конечностей. Головной мозг'животных, забитых в атональном состоянии,был использван для вирусологического,гистологического и электронномикроскопзческого изучения. Контрольные норки оставались здоровыми в течении всего периода наблюдения. Суспензией головного мозга зараженных агентом скрепи и заболевших норок были заражены в мозг мыши ВА1В/с,которых наблюдали в течение 14 месяцев. Начиная с 6 мес. после заражения мыши заболевали и гибли пропорционально инокулированной дозе. Титр агента, содержащийся в исходной суспензии мозга норок,был достаточно высок и составлял 5,43 ДЦ^/0,03 мл. При патологоанатомическом изучении заболевших норок выявлено резкое истощение; внутренние органы - без вменений,имели место анемия и отек головного мозга. Гистологически з головном мозге тлелись патологические изменения .характерные для СГЭ: спонгиоз серого вещества,дегенерация и выпадение нейронов,гипер-

и пролиферация астроцитов. Указанные поражения были выявлены I различных отделах головного мозга: мозжечке,затылочной и височной »бластях

коры больших полушарий, продолговатом мозге, среднем мозге и .ммояовом роге.варолиевом мосту,боковых желудочках. Спонгиоз носил чаговый характер,особенно в коре больших полушарий о более или ме-ее равномерным поражением всех отделов, Воспалительных изменений бнарукено не было. Электронномщфоскоотчески в головном мозге забо-евпшх норок выявлено црисутствие типичных для ТГЭ субмикроскопичес-

ких изменений. В паренхиме головного мозга норок, зараженных агентом скрепи.наблюдали явления status spongioses с характерным скопление мембранных образований в вакуолях. Сходную локализацию концентрическ расположенных мембран наблюдали в паренхиме головного мозга норок,за раженных агентом ТЭН. При заражении норок агентом скрепи имели место дегенеративные изменения в синапсах: набухание пре- и постсинаптичес-ких окончаний с просветлением цитоплазмы синаптаческих термшалей,изменение величины и формы синаптаческих пузырьков,иногда - слипание п< следних; подобные изменения регулярно выявлялись в синапсах головного мозга норок, зараженных агентом ТЭН. Общим для сравниваемых вариантов инфекционного процесса являлись дегенеративные изменения в аксонах, которые проявлялись в набухании и локальном разрыхлении миелино-вой оболочки аксонов и в деструктивных изменениях аксошазмы. Образование "дочерних" вакуолей, типичных для ультраструктурных поражений при ТГЭ.мы наблюдали в головном мозге норок,зараженных как агентом скрепи,так и агентом ТЭН; аналогичный тип поражений был отмечен в паренхиме головного мозга мышей,зараженных агентом скрепи.

Нами была сделана попытка инфицирования мышей агентом ТЭН. Мышей ВАЛВ/с (108) заражали в мозг суспензией головного мозга норок,инфицированных ТЭН; мышей наблюдали в течение 18 мес. В этот период мыши ос тавались здоровыми. После окончания срока наблюдения был проведен еле пой пассаж; в течение 12-месячного периода наблюдения гараженше животные также остались здоровыми.

Таким образом,приведенные результаты показали сходство (шш идентичность) инфекционного процесса .вызываемого у одного вида животных (норки) различными возбудителями прионовых заболеваний по трем параметрам: клиническому течению,гистологическим и электронномикроскопи-ческад изменениям в ЦНС. Можно полагать,что различные представители возбудителей ГГЭ способны преодолевать видовой барьер хозяев,существование которого связывается с различиями в аминокислотных последова-

тельностях приона 7 разных видов С Scott et ai. ,1989). В то же время, по-видимому, эта способность не является абсолютной,о чем свидетельствует отрицательный результат нашей попытки инфицировать мышей агентом ТЭН. Следует учитывать также данные Collenge et ai. ,(1995), показавших,что инфицирование трансгенных мышей с встроенным человеческим геном изолятом агента трансмиссивной энцефалопатии коров не приводит-к- развитию-заболевания-узтгог животных. ~

3. Прижизненная диагностика ТГЭ

Одним из необычных свойств возбудителей ТГЭ является их неспособность к индукции иммунного ответа,что значительно затрудняет прижизненную лабораторну® диагностику этих заболеваний. Известны 40 попыток с отрицательными результатами обнаружения антител к агенту скрепи при помощи набора стандартных серологических методик (вирус-нейтрализации, преципитации в агаре,РСК,ишунофяуоресценции,торможении пассивной гемагглоткнадии,пассивной анафилаксии,пассивного гемолиза, иммуноферментяого метода и др.) ( Albrecht ,1970; Kaspar et al.,I98l). Нами также было показано,что введение мощного активатора иммунных процессов полного стимулятора Фрейнда.не оказало влияния на длительность и выраженность инфекционного процесса при экспериментальной инфекции скрепи. Нами были получены отрицательные результаты и при использовании реакции преципитации в агаровом геле и реакции ингибиции миграции спленоцитов. С учетом публикаций (1980-1981гг.) об образовании в сыворотках больных куру и БКЯ аутоантнтел к элементам нервной клетки - нейрофидаментач,мы изучали образование аутоантнтел к нейро-фшшментаы (НФ). Нами было показано,что аутоантитела к НФ формировались уже в инкубационном периоде при инфекции скрепи; их удавалось вышить в сыворотках крови норок,зараженных агентом ТЭН.

Мы исследовали также наличие аутоангител к НФ в сыворотках крови 5ольных ЕРШ,боковым амиотрофическим склерозом,рассеянным склерозом, !олезнью Аяьцгеймера. Аутоантитела к НФ были выявлены у всех 6 иссле-

дованншс больных БКЯ и двух ЕА,а также у 68 из 100 больных БАС,особенно при так называемой высокой форме этого заболевания. Выявление аутоантител при БКЯ и при БАС сближает оба заболевания в патогенетическом плане,тем более,что эти формы БКЯ и БАС нередко сходны и по клиническим проявлениям.

Существует точка зрения,что в основе общего патогенетического механизма нейроинфекций,вызываемых црионами.и заболеваний ДНО человека, предположительно относящихся к ним,лежит нарушение аксонального транспорта нейрофиламентов,приводящее к их разрушению вплоть до образования миеловдных бляшек и лизиса нейронов. При этом высвобождается повышенное количество белков нейрофиламентов,индуцирующее образование аутоантител к ним. Высказывается предположение,что фактором, вызывающим нарушение аксонального транспорта нейрофиламентов,могут быть црионы { Gag'üusek ,1984; libexskx et al. ,1987). Исходя из этого,нам представляется целесообразным использовать реакцию выявления аутоантител к НФ в общем комплексе прижизненной кшшико-лабора-торной диагностики прионовых инфекций.

Учитывая полученные наш и известные из литературы (Коломиец,1986) данные о высокой частоте обнаружения аутоантител к НФ у больных БАС, мы провели сравнительное исследование частоты выявления аутоантител у больных БАС и их здоровых родственников. Было обследовано 100 больных БАС и их 67 здоровых родственников (37 кровных и 30 некровных). В разработку была включена группа сравнения (50 больных с различными неврологическими заболеваниями) и здоровые люда. Исследовали сыворотку крови и спшшо-мозгову» жидкость. Суммарные результаты приведены в табл.12. Статистически достоверными бядж различия в частоте выявления аутоантител Ср<0,05) цри сопоставлении результатов,полученных в труте больных БАС и в группе сравнения. Интересно,что аутоантите-ла к НФ выявлялись только у родственников тех больных,у которых также были обнаружены аутоантитела к НФ (табл. 13).

Табл.12.

Выявление аутоантител к нейрофияаментам в сыворотке и /или/ ликворе у обследованных различных групп.

Группы обследованных Число наблюдений Частота выявления аутоантител абс. %

Больные БАС 100 68 68

Родственники больных БАС 67 14 21

Лица с неврологическими 50 17 34

заболеваниями

Контроль 55 5 9

Табл;13.

Выявление аутоантител к нейрофшаментам в сыворотке крови у родственников больных БАС.

Больные БАС с положительной реакцией Больные БАС с отрицательной в сыворотке и/или ликворе (п=29) реакцией (п=14)

Число родственников Число родственников Число Число родственников с положительной с отрицательной родст- с отрицательной реакцией реакцией венников реакцией ~ ~ с полож. абс. % абс. %_реятгфтей абс' *

14 33 28 67 - 25 100

Разница в частоте выявления аутоантител У этой группы лиц по сравнению со здоровым контролем была статистически достоверной 1р< 0,01) в то время как разница между всем массивом родственников I здоровым контролем была несущественной. Различия в частоте выявле-шя аутоантител в сравнении со здоровым контролем были статистически состоверными для некровных родственников (р< 0,01) и кровных 0,01<р< 0,05). Наази данные в определенной степени коррелируют с

единичными сообщениями об обнаружении аутоантител к НФ у здоровых родственников больных ВКй С Ме^ег ^ а1. Д981; ЮЛжоуа а.Мауег, 1989). Полученные данные могут свидетельствовать о роли неопределенного фактора, индуцируодего образование аутоантител к НФ,в механизмах возникновения и развития БАС.

Учитывая показанную нами способность типичного представителя ТГЭ,-агента скрепи,длительно персистировать в перевиваемой культуре клеток невриномы Гассерова узла крысы с повышением ыитотического ин-днкса и образованием характерных элекгронномикроскопических поражений (.разд.1.5:),мы попытались разработать методический подход к прижизненной диагностике прионовых инфекций человека. Он заключается в инокуляции указанной перевиваемой культуры глиаяышх клеток исследуемыми материалами (сывороткой крови и сгустком крови больного) при условии проведения не менее 3-5 пассажей инокудированной культуры и изучения материала последнего пассажа о пдаощью морфологических и электронномикроскопических исследований.

'Нами были исследованы материалы от больной с синдромом Герстман-на-Щтреусслера-Шейнкера и больной болезнью Крейтцфельдт-Якоба. В последнем случае использовали также материал биопсии головного мозга. При отработке методики включали необходимые контроля,в том числе и положительный контроль - параллельное заражение культуры клеток агентом свфепи. Мы цровели также сравнительное изучение эффективности разных вариантов инокуляции культуры: на монослой клеток и в суспензию клеток. Клинически! диагноз СШП и ЕКЯ был поставлен в Институте неврологии РАМН на основании клкиико-шсгрумеятальных исследований. В случае СПИШ в инокулщюванной культуре отмечали повышение митотиче-ского индекса в 2,6 - 7,5 раза на разных сроках культивирования по сравнению с контрольным уровнем и повышение количества патологических митозов: в среднем в 1,4 раза,а при инокуляции сгустком крови -в 2,5 раза. Наиболее частой формой патологии деления было рассеива-

ние хромосом.

При инфицировании культуры глиалышх клеток материалами от больной БКЯ (суспензией биопсии головного мозга,сывороткой крови и сгустком крови) также отмечено повышение митотического индекса в 1,6 - 1,7 раза,не сопровождавшееся увеличением количества патологических митозов. Следует отметить,что вариации уровня возрастания митотического индекса при заражении исследуемыми материалами соответствовало показанному ранее размаху его изменений при длительной персистенции агента С1феш в этих же клетках,- от 1,7 раза на 32 пассаже до 4,8 раза на 99 пассаже (разд.1.5.). Можно полагать,что отаечеяные различия в динамике изменений митотического индекса и отсутствие индукции патологических митозов при инфицировании клеток БКЯ-содержащим материалом могут быть связаны либо с особенностями реакции клеток на инфицирование агентами СГШШ и БКЯ,либо с различным количеством агента. Элект-ронномикроскогаческл в инокулированных клетках было выявлено появление и увеличение количества так называемых многослойных мембран; уровень их образования при инокуляции сывороткой крови и сгустком крови был таким же,как и при инокуляции клеток агентом скрепи. Как было показано нами ранее,инокуляция животных агентом скреш приводила к закономерному возникновению в клетках ЦНС многослойных мембран,динамика появления которых была связана с накоплением в клетках агента скрепи. На образование многослойных мембран в головном мозге обезьян, зараженных агентом куру, указывали Веек еъ а1. (1982). Иногда в цитоплазме клеток,инокулированных исследуемыми материалами или агентом жрепи,обнаруживали формирование "дочерних вакуолей" и вакуолей,содержащих скопления мембран,напоминающих таковые .встречающиеся в клет-?ах головного мозга человека и животных при ТГЭ (рис.10,стр.32). Таким образом,появление и накопление в клетках больного количества яогослойных мембран может рассматриваться как свидетельство наличия [ накопления в клетках агента ТГЭ. Заслуживает внимания и то обстоя-

тельство.что реакция использованных глиальных клеток была практически одинаковой при инокулировании их как сывороткой и сгустком крови больной,так и суспензией биопсии головного мозга. Это позволяет использовать для диагностики такие доступные биологические материалы, как сгусток и сыворотка крови. Использование нами крови в качестве субстрата дош проведения диагностики ТГЭ соответствует данным литературы о существовании виремии при экспериментальной инфекции животных агентами ЕКЯ и скрепи,возможности воспроизведения инфекции при инокуляции сгустком крови и цризнании значимости гематогенного пути В патогенезе инфекции ( Мапие1±аАз et а1. ,1978; Вихойа еЪ а1. 1983; Щххп^ег ,1984). Суммирование приведенных данных,указывающих на применимость предлагаемого методического подхода дая диагностики двух клинических форм ТГЗ.-БКЯ и СШП,позволяет предположить возможность его более широкого применения с целью прижизненной диагностики различных клинических форм ТГЭ.

В процессе работы была создана и описана коллекция гистологических и злектронномшфоскопических препаратов,отражающих основные типы морфологических поражений при скрепи, куру, трансмассивной энцефалопатии норок и болезни Крейтцфельдт-Якоба.

ВЫВОДЫ

I. При изучении патогенеза црионовых заболеваний на модели экспериментальной инфекции скрепи у шеей впервые выявлены поражения в клетках ЦНС на ранних этапах инкубационного периода. В начальном этапе инкубационного периода обнаружено увеличение размера тела нейронов Ш слоя коры и хвостатого ядра,ядра и цитоплазмы,а также увеличение количества ядерного белка. В последующие сроки,вплоть до начала клинического периода,величины всех цктометрических показателей

уменьшались; такое же уменьшение,но без предшествующего увеличения происходило в нейронах 7 слоя коры. Эти изменения предшествовали гистологическим поражениям,выявляемым только в конце инкубационного периода.

2. На ранних этапах инкубационного периода (40 дней после заражения агентом скрепи) обнаружена статистически достоверная сплено-мегалия у мышей; ее развитие зависело от 'способа введения и агент-со-держащего субстрата (суспензии головного мозга или селезенки).

3. Через 40 дней после заражения электрояношщроскопически в клетках ЦДС зараженных скрепи мышей впервые выявлены изменения в синапсах, аналогичные наблюдаемым в клинической стадии заболевания. Прослежено образование многослойных мембран .характерных для ультраиорфо-логии ТГЭ,в зависимости от накопления инфекционного агента. В клинической стадии заболевания (5-6 мес.после заражения) описаны изменения в клетках ЦНС мышей и норок,зараженных агентами скрепи и трансмиссивной энцефалопатии норок. Охарактеризованы поражения клеток перевиваемой глиальной культуры,персистентно инфицированной агентами сщюш,болезни Крейтцфельдт-Якоба и синдрома Герстманна-Штреусслера--Шейнкера.

4. Впервые изучена активность фермента аргиназы в клетках ЦНС мышей цри экспериментальной инфекции скрепи и показано увеличение его активности в инкубационном периоде.Сопоставление динамики изменения активности аргиназы,накопления агента скрепи и выраженности ультрамикроскопических поражений позволяет рассматривать сдвиг активности аргиназы как раннее цроявление реакции клеток ЦЦС на инфекцию. Выявлена высокая активность аргиназы в (Ж больных боковым амиотрофа-ческим склерозом.

5. Показана возможность воздействия на инфекционный цроцесс при использовании ашназина - ингибитора моноашшооксидазн (удлиняет инкубационный период) и экспозиции зараяеншх Ифепи животных в уело-

виях гипербарической: оксигенации (утяжеляет инфекционный процесс и приводит к большей выраженности ультрамищюскопических поражений в ДНС). Оба фактора воздействия изучены впервые.

6. С помощью биопрооы на мышах и электроиноыикроскопически уста новлена способность агента скрепи длительно персистировать в перевиваемых культурах клеток. Выявлены существенные различия в характере реакции клеток различного происхождения на персистирующнй агент: рос клеток в культуре соматического происхождения замедлялся, в глиаль-ннх - имел место пролиферативннй эффект. Иерсистенция агента скрепи в глиальных клетках приводила к интерференции с онкорнавирусаыи, снижая их накопление.

7. Изучение восприимчивости норок к различным агентам ТГЭ показало, что у норок,инфицированных агентом трансмиссивной энцефалопатии норок (.природный, хозяин - норка) или агентом скрепи (природный хозяин - овца),проявления инфекционного процесса,изученные клинически, вирусологически,гистологически и электронномикроскошгчески, существенно не различались. В то же время н оказались не чувствительными к экспериментальному заражению агентом трансмиссивной энцефалопатии норок.

8. Показано наличие аутоантнтел к нейрофиламентаы,которые можно выявить в инкубационном периоде,в сыворотке крови мышей,инфицированных агентом скрепи,и у норок »инфицированных агентом трансмиссивной энцефалопатии норок. Аналогичные аутоантитела содержались в сыворотке крови больных болезнью Крейтцфельдт-Якоба.Альцгеймера и у больных некоторыми формами бокового амиотрофического склероза. Представляется целесообразным использовать индикацию аутоантнтел к нейрофиламентаы в общем комплексе прижизненной клинико—лабораторной диагностики ТГЭ.

9. Впервые показано,что в сыворотке 1фови здоровых родственников больных боковым амжотрофичесющ склерозом содержатся аутоантите-

ла к нейрофиламентам; такие аутоантитела обнаружены только у родственников аутоантител-содержащих больных. Полученные данные могут указывать на существование иеидентифицированного фактора,играющего роль в этиопатогенезе бокового амистрофического склероза.

10. На основании проведенного экспериментального изучения изменений в инфицированной агентом скрепа перевиваемой культуре глиаль-ных клеток предложен оригинальный методический подход к прижизненной диагностике прионовых инфекций человека при использовании сыворотки и сгустка крови больного,который апробирован в клинической практике Института неврологии РАМН при болезни Крейтцфельдт-Якоба и синдроме Герстманна-Штреусслера-Шейнкера.

11. Создана коллекция гистологических и электронномикроскопи-ческих препаратов,отражающая основные типа морфологических поражений ЦНС при скрепи,куру,трансмиссивной энцефалопатии норок и болезни Крейтцфельдт-Якоба »которая может быть использована в диагностических а учебных целях.

Список научннх работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Ройхель ВЖ, Погодина В .В., Фокина Г.И.,Соболев С.Г..Королев, М.Б., Равняла НИ. Экспериментальные подхода к изучению патогенеза медленных вирусных инфекций на модели скрепи. В кн.: Вирусы и вирусные инфекции человека. М.,1981,с.199-200.

2. Равкина 1.И..Фролова М.П.,Ройхель ВЖ,Погодина В.В. Основные типа морфологических изменений ЦНС при болезни Крейтцфельдт-Якоба, куру,скрепи и трансмиссивной энцефалопатии норок. Там же,с.207-208.

3. Чажсв В.П.,Дукур И. И., Гелл ер В.И:, Ройхель В.М.,Погодина В.В.,Фокина Г.И.,Соболев С.Г.,Королев М:Б. Изучение трансмиссивной энцефалопатии норок - представителя группы медленных вврусных инфекций

в СССР. Там же,с.206-207.

4. Boikhel V.M.,iokina G.I.,Sobolev S.G..Eorolev M.B.,Havkina L.I., Pogodina V.V. Study of early stages of the pathogenesis of scrapie

in experimentally infected nice. Acta virolog.,1983,27,p.14-7-153.

5. Eoikhel V. И.,Mats V.N.,Poking G.I.,Eavkina L.I,Pogodina V.V.Eeact on of mouse CHS cells to the scrapie agent in early stages of experimental infection. Acta virologica 1983»27»P-400-406.

6. Ройхель В.И.,Соболев С.Г..Королев Ы.Б.,Погодина В.В. Медленные вирусные инфекции,вызываемые агентами подострых трансмиссивных губкообразных эвдефалопатий. В кн: Ультраструктурная патология нейровирусных инфекций. Новосибирск,1984,с.55-64.

7. Boikbel V.Il.,Fokina G.I. .Sotolev S.G.,Korolev M.В..Pogodina V.V. Effect of hyperbaric oxygenation on ezperiaental scrapie in Bice. Acta virologica 1984,28,p.294-299-

8. Roikhel V.M..Fokina G.I.,Pogodina V.V.

Influence of aminasine on experimental scrapie in mice. Acta virologica 2984,28,p.321-324.

9. Ройхель B.M..Фокина Г.И.,Соболев С.Г,.Королев М.Б.,Погодина В.В., Геллер В.И.,Дукур И.И.,Чижов В.А. К вопросу о взаимосвязи возбуди телей медленных вирусных инфекций. В кн.: Химиотерапия и химиоцро филактика вирусных инфекций.Особо опасные и медленные инфекции. Минск,1985,с.134-Г38.

10. Ройхель В.М..Фокина Г.И..Погодина В.В.,ЗавалЕШИн И.А..Ниязбекова А.Г. Иммунологические возможности диагностики медленных вкусных инфекций. В кн.: Актуальные проблемы медицинской вирусологии.

М.,1985,с.93-94.

11. Дукур Й.И.,Геллер В.И.,Чижов В.А..Ройхель В.М.,Погодина В.В.,Фокина Г.й..Соболев С.Г.,Королев М.Б. Клинико-морфологическое изучена трансмиссивной энцефалопатии норок. Вопр.вирусологии 1986, й 2,

с.220-224.

12. Ройхель В.М.,Михайлова Г.Р.,Лисак В.М.,Соболев С.Г.,Королев М.Б., Погодина В.В.,Чередниченко Ю.Н. Изучение персистенцаи агента скрепи в гибридных клетках человека и мыши. В кн.: Антивирусные вещества при экспериментальной терапии вирусных инфекций. Минск,1986,с.127-132.

13. Соболев С.Г.,Ройхель В.М. Ультраструктурные изменения головного мозга при подострых трансмиссивных губкообразных энцефалопатиях. Там же, с.132-134.

14. Ройхель В.М.,Мац В.Н.,Фокина Г.И.,Погодина В.В. Реакция нейронов ЦНС на заражение мышей агентом скрепи в доклиническом периоде патогенеза экспериментальной инфекции. Вопр.вирус.1987,4,494-498.

15. Boikhel V.li.Fokina G.I.,Lisak V.M. .Kondakova L.X.,Korolev M.B., Pogodina V.V. Persistence of the scrapie agent in glial cells from rat gasserian ganglion. Acta virologica -1987.31,p.36-42.

16. Завалишин И.А..Погодина В.В..Ройхель В.M.,Фокина Г.И..Ниязбекова

A.С. Антитела к нейрофшшментам при медленных инфекциях нервной системы. Журн.невропатол.и психиатрии им.С.С.Корсакова,1988, 2. C.II-I6.

17. И.А.Завалишн,.Хохлов А.П..Лярский Э.Г.,Ройхель В.М..Фокина Г.И. Биохимические аспекты бокового амиотрофического склероза. Вестник АМН СССР 1988,12,с.49-55.

18. Ройхель В.М.,Фокина Г.И..Михайлова Г.Р.,1исак В.М.,Соболев С.Г., Королев М.Б.,Погодина В.В.,Чередниченко Ю.Н. Цитоморфологическое исследование линии гибридных соматических клеток,персистентно инфицированных агентом скрепи. -Цитология и генетика 1988,4,с.35-39.

19. Boikhel V.M..Fokina G.I.,Khokhlov A.P..Soholev S.G..Zavalishin I.A.. Когоlev L.B..Pogodina V.V. Alterations of arginase activity in scrapie-infected mice and in amyotrophic sclerosis.

Acta virologica 1990,34,p.54-5-553-

20. Коломиец H.Д..Жуковский В.Г.,Лучко В.П..Ройхель В.М..Дубойская Г.П Грачев D.A.,Коломиец А.Г..Савицкая Г.В.Дрищанович В.В. Молекуляр-но-эшдемиологические,иммунологические и морфологические доказательства этиопатогенетической общности подострых трансмиссивных спонгиоформных энцефалопатий человека и животных.

Тез.докл.Ш съезда инфекционистов Белоруссии,Минск, 1990,с.193-194.

21. Kolomietz N.D..Zukovsky V.G..Roikhel V.M..Kolomietz A.G..Grachev 1.А. Scrapie - naturally focal slow infection. Abstr.VIII Internet. Congress of Virology, Berlin,1990,p.59.

22. Завалшин И.А..Ройхель В.М..Фокина Г.И..Козловский А.Д.,Погодина

B.В. Антитела к структурным элементам нейрона у больных боковым амиотрофическим склерозом и их здоровых родственников. Журн.невропатол.и психиатрии км.С.С.Корсакова 1991,3,с.12-15.

23. Ройхель В.М.,Фокина Г.И..Соболев С.Г.»Королев М.Б..Погодина В.В., Геллер В.И.,Дукур И.И..Чижов В.А. О взаимосвязи возбудителей подострых трансмиссивных губкообразных энцефалопатий.

Воцр.вирусологии 1992, 3,с.149-153.

24. Завалшин И.А..Адарчева Л.С..Ройхель В.М.,Фокина Г.И..Кондакова Л.И..Соболев С.Г..Погодина В.В. Синдром Герстыанна-Штреусслера: новые возможности диагностики. Журн.невропатол.и психиатрии им.С.С.Корсакова 1995, I.e.58-63.

25. Ройхель В.Ы..Фокина Г.И..Кондакова Л.И.,Соболев С.Г..Погодина В.В. Новые возможности прижизненной диагностики синдрома Герст-манна-Штреусслера. Тез.докл.УП Всероссийского съезда невропатологов. Нижний Новгород,1995, № 661.

26. Ерман Б.А.,Конев В.П.,Ройхель В.М. Вирусные инфекции центральной нервной системы. Екатеринбург, 1996,изд."Уральский рабочий", - 73 стр.

27. Ройхель В.М. Медленные инфекции .вызываемые прионами (к вопросу о "коровьем бешенстве"). Врач,1996. 9,с.31-34.

28. Ройхель В.М.,Фокина Г.И. .Кондакова Л.И. .Соболев С.Г..Погодина В.В.,Ддиблздзе Д.Н.,Гнездицкий В.В..Кашина Е.М.,Переседов В.В., Сунгуров Е.Б.,Кугоев А.И..Чайковская Р.П.,Коновалова Е.В.,Шити-кова И.Е.,Завалишин И.А. Прижизненная диагностика прионовых губ-кообразных трансмиссивных энцефалопатий.

Вопр.вирусологии 1997, 5,с. 203-205.

29. Ройхель В.М..Фокина Г.И.,Погодина В.В. Экспериментальная латентная инфекция скрепи. Вопр.вирусологии 1997, 6.с.

30. Завашпин К .А., Ройхель В.М.,1ученко Т.Д.,Шитикова И.Е. Прионо-вые болезни человека. Журн.невропатол.и психиатрии им.С.С.Корсакова 1997, ,с.

■Н »Вт, Ройхель -В.М.. Жучен ко Т.Д. .Шитико-

ва И.Е. Прионовке болезни. Обзор литературы. Вестник РАМН 1997, ,с. 48-55.

Информация о работе

Ройхель, Виктор Моисеевич
доктора медицинских наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.06

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Патогенез и диагностика некоторых медленных проиновых нейроинфекций ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Патогенез и диагностика некоторых медленных проиновых нейроинфекций"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Патогенез и диагностика некоторых медленных проиновых нейроинфекций
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология