Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка структуры сообществ хемолитотрофных микроорганизмов месторождения Шануч (Камчатка) с применением молекулярно-биологических подходов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оценка структуры сообществ хемолитотрофных микроорганизмов месторождения Шануч (Камчатка) с применением молекулярно-биологических подходов"

На правах рукописи

Рогатых Станислав Валентинович

ОЦЕНКА СТРУКТУРЫ СООБЩЕСТВ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ МЕСТОРОЖДЕНИЯ ШАНУЧ (КАМЧАТКА) С ПРИМЕНЕНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 П енв 2014

005544679

0боленск-2014

005544679

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Научно-исследовательском геотехнологическом центре Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научные руководители: доктор биологических наук кандидат биологических наук, доцент

Кофиади Илья Андреевич Мурадов Сергей Васильевич

Официальные оппоненты:

Вайнштейн Михаил Борисович - доктор биологических наук, профессор, Пущинский государственный естественно-научный институт, г. Пущино Московской обл., ректор Логинов Олег Николаевич - доктор биологических наук, профессор, Институт биологии Уфимского научного центра Российской академии наук, заведующий лабораторией биологически активных веществ

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского Российской академии наук

Защита диссертации состоится «28» февраля 2014 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюдясетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ) Роспотребнадзора

2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время применение микроорганизмов в целях извлечения металлов из руд широко используется в мировом масштабе (Кондратьева и др., 2012). В России использование биотехнологий при добыче полезных ископаемых также придается большое значение, что получило отражение в технических направлениях различных фондов содействия развитию предприятий, занимающихся решением данной проблемы (Черняк, 2002). Горнорудная промышленность относится к главным отраслям экономики Камчатского края. Согласно планам экономического развития Камчатки, в ближайшее время будут разрабатываться различные месторождения цветных металлов. Это приведет к увеличению негативной антропогенной нагрузки на окружающую природную среду, водные и рыбные ресурсы Камчатского края (Левенец и др., 2007). Поэтому необходимо разработать практические меры, направленные на охрану живой природы как на видовом, так и на экосистемном уровне, которые могут быть использованы при разработке месторождений цветных металлов. Известно, что экологическая безопасность предприятий по переработке руд цветных металлов может быть повышена за счет внедрения современных биотехнологий, например, биовыщелачивания (Минеев, 19 89; Заулочный, 2011). В данной работе получены достоверные данные о структуре сообщества хемоли-тотрофных микроорганизмов сульфидных руд месторождения Шануч. Использование этих результатов на практике будет способствовать внедрению современных биотехнологий в горнорудную отрасль народного хозяйства России.

Современное внедрение технологии биовыщелачивания невозможно без четких данных о структуре микробных сообществ или ассоциаций, вносимых в нарабатываемую культуру выщелачивающего раствора. Причем данные о качественном (видовом) составе микробной культуры и количественном соотношении микроорганизмов в ней необходимо узнавать перед внесением ее в выщелачивающий раствор (Rawlings, 2005). Это позволит интенсифицировать процессы биовыщелачивания не только путем проведения модельных экспериментов с различными микробными ассоциациями, но и оперативно контролировать и отслеживать процесс выщелачивания, вносить коррективы и управлять микробной популяцией при мониторинге процесса.

Мониторинг хемолитотрофных микроорганизмов в отработанных отвалах и хвостохранилищах также позволит избежать загрязнения водных объектов и почвенного покрова возле рудников и объектов горнорудной промышленности.

Одним из наиболее перспективных подходов к изучению видового разнообразия микроорганизмов является анализ последовательностей их ДНК.В настоящем исследовании реализована модификация метода полимеразной цепной реакции (основы большинства методов генодиагностики микроорганизмов), основанная на использовании флуоресцентной детекции продуктов реакции -ПЦР в реальном времени.

Актуальность настоящей работы заключается в необходимости определения качественного и количественного состава сообществ биовыщелачивающих

ацидофильных микроорганизмов, их генетического скрининга и мониторинга в культуральной среде, в создании технологии универсальной системы пробо-подготовки, позволяющей с одинаковой эффективностью очищать ДНК различных микроорганизмов.

Степень разработанности темы. Технология биометаллургии для извлечения металлов из руд в последнее время активно используется и развивается (Халезов, 2008; >-1огш е! а1., 2000). Исследователи многих стран изучают микробное разнообразие биовыщелачивающих растворов, используя в том числе и современные методы (Кондратьева и др., 2012). Однако в большинстве работ по интенсификации процесса биовыщелачивания не определяется структура микробной ассоциации, вносимой в выщелачивающий раствор, в ее качественной и количественной характеристике. В основном используют аборигенную микрофлору, находящуюся в исходной пульпе, подразумевая, что она адаптируется к условиям выщелачивающего раствора (Левенец, 2012). Настоящая работа дополняет и уточняет вопрос мониторинга микробных ассоциаций в ходе процесса биовыщелачивания, рекомендуя для определения видового и количественного состава ассоциаций использовать разработанную схему исследования.

Цель исследования — оценить структуру сообществ хемолитотрофных микроорганизмов, принимающих участие в технологии биовыщелачивания, в ее качественной и количественной характеристике.

В соответствии с поставленной целью определены основные задачи:

1) провести молекулярно-биологическое исследование смешанного сообщества биовыщелачивающих микроорганизмов, включающее анализ его структуры и технические средства диагностики;

2) провести оценку эффективности методик очистки, выбор и адаптацию метода выделения бактериальной ДНК из образцов накопительных культур хемолитотрофных микроорганизмов;

3) оценить видовой состав сообществ микроорганизмов сульфидных руд месторождения Шануч с помощью построения библиотеки клонов;

4) разработать комплекс ПЦР-тест-систем для выявления фрагментов генома основных представителей исследуемого сообщества;

5) определить количественный состав сообщества и целесообразность применения проведенного молекулярно-биологического исследования структуры сообщества в прикладных биотехнологических и микробиологических исследованиях.

Научная новизна. Впервые с помощью молекулярно-биологических методов охарактеризован видовой и количественный состав аборигенного сообщества биовыщелачивающих микроорганизмов месторождения Шануч. Таким образом, получены новые данные, вносящие вклад в развитие представлений об экологии характерной для данного региона микробной ассоциации, и получены новые данные о структуре сообщества, обладающей повышенной выщелачивающейся способностью.

Впервые в России сформирована методологическая и теоретическая база для осуществления мониторинга микробиологических параметров с помощью

молекулярно-биологических подходов. В том числе проведена оценка эффективности методов очистки бактериальной ДНК из субстратов соответствующих естественной среде обитания ацидофильных микроорганизмов, разработаны и адаптированы к использованию с отечественным детектирующим оборудованием тест-системы для анализа микробиологических сообществ, применен оригинальный подход к оценке количества представленных микроорганизмов. Примененное в работе молекулярно-биологическое исследование смешанных бактериальных сообществ легко адаптируется к решению аналогичных задач, поставленным в настоящем исследовании. Реализованный подход позволил повысить точность результатов анализа и расширить область применения полученных научных результатов.

Впервые использование разработанных методов в рутинной биотехнологической практике позволило повысить эффективность мероприятий по мониторингу изменений биогенного состава культур, используемых в биореакторах, и, кроме того, откроет новые возможности к их позитивной трансформации и установлению ассоциаций, характеризующихся наибольшим биовыщелачиваю-щим потенциалом.

Теоретическая и практическая значимость. Проведенное исследование с применением молекулярно-биологических методов может служить основой комплексного подхода к определению качественного и количественного составов смешанных сообществ микроорганизмов. Универсальность проведенного исследования определяет перспективность его использования в технологии промышленного биовыщелачивания для быстрого и точного анализа проб с руды, выщелачивающего раствора и инокулята.

Разработаны и внедрены в лабораториях НИГТЦ ДВО РАН в исследовательское испытание ПЦР-тест-системы для выявления микроорганизмов ЛейИ-МоЬасШш Моох1(1ат, АсШЫоЬасШш /е/тоохЬЛат, БиуЬЬасШия ?ЪегтоьиЩ-йаох'к1ат и Реггар1ахта ас'иИрЫ1ит, а также модификации и повышения эффективности промышленной технологии биовыщелачивания (учрежденческий уровень внедрения).

Результаты работы будут использованы при исследовании штаммового полиморфизма А. /еггоох1с1а№, идентификации микроорганизмов без выделения чистых культур, определения адаптации штаммов микроорганизмов к условиям биовыщелачивания, подбору сообщества, обладающего наибольшей продуктивностью в получении целевого продукта - ценных металлов.

Полученные результаты используются при разработке технологического процесса переработки низкообогащенных остатков и отвалов сульфидной руды рудника Шануч компанией, его разрабатывающего, - ЗАО «НПК Геотехнология» (региональный уровень внедрения).

Результаты исследования включены в образовательные программы для студентов биологических специальностей учреждений высшего профессионального образования (региональный уровень внедрения). Материалы диссертации используются в лекциях для аспирантов НИГТЦ ДВО РАН.

Методология п методы исследования. В работе использованы экспери-

ментальные методы исследования: микробиологические (культивирование микроорганизмов на жидких и твердых питательных средах), молекулярно-биологические (выделение и очистка нуклеиновых кислот хемолитотрофных ацидофильных микроорганизмов, очистка плазмидной ДНК, построение библиотеки клонированных фрагментов гена 16S рРНК, определение нуклеотидной последовательности выделенной ДНК, агарозный гель-электрофорез, полиме-разная цепная реакция, в том числе ПЦР в реальном времени).

Положения, выносимые на защиту:

1. Модифицированная методика очистки ДНК характеризуется высокой эффективностью в отношении исследованных микроорганизмов, позволяет очистить образцы накопительных культур от ингибиторов ПЦР, обладает повышенной экспрессностью и рекомендуется для выделения ДНК из аналогичного материала.

2. Оценка качественной и количественной структуры сообществ, основанная на ПЦР в реальном времени, эффективна при анализе смешанных сообществ микроорганизмов (в том числе биовыщелачивающих), обладает универсальностью и низкой себестоимостью.

Степень достоверности результатов. Результаты исследования получены с использованием современного поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных. Достоверность результатов исследований обосновывается корректной постановкой задач исследований, обоснованным использованием методов работы, значительным объемом качественно обработанных экспериментальных данных и учетом предшествующих работ. Достоверность результатов исследования также обеспечивается использованием современных, стандартных методов измерений, связанных с тематикой диссертации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: IV международной конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2007), III и VI международных молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007, 2010), V международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010), XI международной научной конференции «Сохранение биоразнообразия Камчатки и прилегающих морей» (Петропавловск-Камчатский, 2010), международном молодеж-пом научном форуме «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), III всероссийской научно-практической конференции «Природные ресурсы, их современное состояние, охрана, промысловое и техническое использование» (Петропавловск-Камчатский, 2012), научной конференции «Никеленосные провинции Дальнего Востока» (Петропавловск-Камчатский, 2012), I всероссийской научно-практической конференции «Экология Камчатки и устойчивое развитие региона» (Петропавловск-Камчатский, 2012); межлабораторных семинарах и Ученых советах НИГТЦ ДВО РАН в 2009-2013 гг.

Работа выполнена в лаборатории биогеохимии и экологии НИГТЦ ДВО РАН по теме НИР «Бактериально-химические и бактериально-автоклавные процессы и геотехнологии переработки сульфидных медно-никелевых руд», № госрегистрации 01200963715 (научный руководитель - д.г.-м.н. Ю.П. Трухин). Часть работы поддержана проектом РФФИ № 13-05-00585 (руководитель — д.б.н. Л.В. Захарихина), проектом ДВО РАН № 13-III-B-06-093 (руководитель — С.В. Рогатых).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 -в изданиях, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий» Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки России.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения и выводов, списка литературы, приложения, изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами, 19 рисунками. Список использованной литературы включает 118 источников, из них 44 отечественных и 74 зарубежных.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В последних российских работах по исследованию процессов биовыщелачивания (Минеев, 1989; Черняк, 2002; Кузякина и др., 2008; Заулочный, 2011; Вайнштейн и др., 2011; Левенец, 2012; Хайнасова, 2012 и др.) показано, что в России и мире широко используются бактериально-химические технологии переработки Ni, Со, Си, Zn, Аи и других металлов. Изучению процессов биовыщелачивания и роли в них хемолитотрофных микроорганизмов много внимания уделяют отечественные и зарубежные ученые (Konishi et al., 1998; Rawlings, 1998; Norris et al., 2000; Каравайко и др., 2006 и др.).

До недавнего времени видовое определение микроорганизмов в процессе выщелачивания проводили с помощью культуральных, микроскопических, биохимических методов. В настоящее время определение видового состава сообществ ведется, как правило, с использованием молекулярно-биологических методов, основанных на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов ДНК или гибридизационного ДНК-анализа in situ. Однако эти методы не позволяют проводить количественное определение состава сообществ, время пробоподго-товки занимает большое количество времени, они сложны и ресурсоемки.

В настоящей работе реализована модификация методики ПЦР, основанная на использовании флуоресцентной детекции продуктов реакции, которая подходит как для качественного, так и для количественного анализа. Данный метод превосходит классические культуральные и молекулярные методы. Он прост в применении и обладает рядом преимуществ, определяющих его максимальную приспособленность для нужд микробиологического мониторинга в культураль-ной среде бактериальных сообществ ацидофильных хемолитотрофов: это возможность выявления даже нескольких копий генома бактерий в образце и, как следствие, максимальная диагностическая мощность; чувствительность и специфичность, достигающие 100 %; высокая воспроизводимость; сжатые сроки

исследования; умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость. Аналоги данной методики реализованы при идентификации ацидофильных хемолито-трофов в процессах биовыщелачивания за рубежом, в частности в КНР (Во\\'е1 е1 а1., 2009).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использованы чистые культуры АМИМоЬасШш Моох1<кт$, Аа-¿'иЫоЬасШш ferrooxidans, БШ/оЬасШш 1кегтот1Ас1оох '1с1ат и Реггор1азта аа-сИрИИит, предоставленные лабораторией хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН, а также образцы смешанных культур автохтонных сообществ хемолитотрофных микроорганизмов, выделенных из окисленной и неокисленной руды кобальт-медно-никелевого месторождения Шануч (Камчатка), предоставленные лабораторией геохимии и геотехнологии НИГТЦ ДВО РАН.

Выделение микроорганизмов осуществляли классическими методами, выращивали на среде Сильвермана - Люндгрена 9К без железа и, в случае с желе-зоокисляющими бактериями, на той же среде с железом (Каравайко и др., 1989) в лабораторных реакторах. В сравнении принимали участие два типа проб: содержащие микроорганизмы, прикрепленные к частицам руды, и содержащие преимущественно свободные клетки. В общей сложности проанализировано около 170 проб. Общая схема исследования представлена на рис. 1.

Рисунок 1 - Общая схема исследования

Клонирование проводилось в ООО «Евроген» (Москва) с использованием вектора pGemTeasy. В качестве клонируемого фрагмента использован ПЦР-продукт, полученный при амплификации специфического участка гена 16S рРНК с помощью универсальных праймеров upr2-d и upr3-r. Для анализа библиотеки клонов было отобрано 100 колоний, содержащих вставку ПЦР-продукта, полученного с помощью данных праймеров.

Выделение ДНК осуществляли несколькими комбинированными протоколами очистки ДНК, основанными на различных типах (механическом, ферментативном, комбинированном и химическом) воздействия на клетки. Во всех случаях брали 500 мкл образца. Перед этапом лизиса пробы промывали фосфатным буфером.

Для мечения продуктов использовали один из комплементарных праймеров и набор меченых дидезоксирибонуклеотидтрифосфатов (BigDye Terminator Kit, Applied Biosystems, США). Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 94°С — 10 с, 56°С - 20 с, 72°С - 20 с в течение 40 циклов. Дальнейшая подготовка продукта для проведения реакции секвенирования включала химическую денатурацию матрицы с помощью денатурирующего буфера TSR (Template Suppression Reagent, Applied Biosystems, CILIA) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем.

Оптимальную температуру отжига праймеров определяли постановкой ПЦР с температурой отжига праймеров в диапазоне 60—72°С с последующей оценкой количества ПЦР-продукта методом агарозного гель-электрофореза.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Разработка универсальных праймеров

Результатом первого этапа работы стала разработка универсальных праймеров, позволяющих амплифицировать фрагмент генома всех бактерий и архей, входящих в состав микробного сообщества. Этот фрагмент содержит участки, которые используются в качестве маркеров при идентификации видов. При этом эффективность амплификации выбранного фрагмента в данном случае определяет аналитическую чувствительность метода ПЦР, поскольку предпочтительная амплификация основного типа последовательностей может привести к потере информации о слабо представленных микроорганизмах и искажению результатов анализа.

В сравнении принимали участие пары праймеров в восьми различных комбинациях: 1) uprl-d + upr2-r, 2) uprl-d + upr3-r , 3) bac2-d + upr2-r, 4) bac2-d + upr4-r, 5) bac2-d + 1427-r, 6) upr2-d + upr3-r, 7) upr2-d + upr4-r, 8) upr2-d + 1427-r (табл. 1). Универсальность праймеров была проверена более чем на 5000 последовательностях бактерий и архей. Для оценки наличия продуктов неспецифической амплификации и димеров праймеров, а также выбора праймеров, позволяющих получить более короткие продукты амплификации, проведен

электрофорез, результаты которого показаны на рис. 2. В качестве анализируемых образцов использовали ДНК, выделенную из реакторных проб, культивируемых в лаборатории геохимии и геотехиологии НИГТЦ ДВО РАН. Как видно из рис. 2 и по результатам обработки баз данных, наилучший результат дала пара праймеров ирг2-с! и иргЗ-г.

Таблица 1 - Последовательности универсальных праймеров, использованных в сравнительном исследовании (Рогатых и др., 2011)

Лг2 П/П Название Последовательность

1. ирг1-с1 ОТСССАОСНСтССССООТАЛ

2. ирг2-(1 ТСтСАТСОСУОТССТСЛССТССТ

3. ирг2-г АСОАОСТСАСОАСИОССАТОСА

4. иргЗ-г ТСАССООСООТСТОТКСААОО

5. ирг4-г ТООТТТОАСОЗаССтОТОТСТ

6. Ьас2-(1 АТТАСАТАСССВООТАСТСС

7. 1427-г ТАССТТСТТАСОАСТТМАССС

Для проверки выбранных праймеров ирг2-с1 и аргЗ-г была проведена ПЦР в реальном времени на ДНК, выделенной из чистых линий культур Л. ййоох\с1ат, А. /еггоох1с1апз, 5. 1Негто&и1^оох1йап$ и К аасИрИИит, результаты которой приведены на рис. 3. Как видно из этого рисунка, выбранные праймеры показали свою специфичность в отношении каждого представителя микроорганизмов. Приблизительно одинаковое значение ДО (15—17) для всех чистых культур (при равном количестве стартовой ДНК) свидетельствует о том, что выбранные нами универсальные праймеры обеспечивают сходную эффективность амплификации фрагмента гена 168 рРНК всех основных предполагаемых представителей хемолитотрофных микроорганизмов сообщества месторождения Шануч.

1 23456789

Рисунок 2 - Электрофореграмма ПЦР-продуктов, полученных при амплификации фрагмента гена 16Э рРНК, с использованием попарных комбинаций разработанных праймеров: 1 - ирг1 -а + ирг2-г (562 П.Н.), 2 - ирг1-£) + иргЗ-г (898 п.н.), 3 - Ьас2-(1 + ирг2-г (293 п.н.), 4 - Ьас2-а + ирг4-г (630 п.н.), 5 - Ьас2-с1 + 1427-г (724 п.н.), 6 - ирг2-с1 + иргЗ-г (358 п.н.), 7 - ирг2-с! + ирг4-г (363 п.н.), 8 - маркер, 9 - ирг2-с! + 1427-г (457 п.н.)

3.5. Применение разработанных тест-систем при микробиологическом исследовании микробного сообщества

Как видно из многих работ по изучению процессов биовыщелачивания (Foucher et al., 2003; Совмеи и др., 2007; Harvey, Bath, 2007) подбору микробной ассоциации для биогеотехнологических задач уделяется большое внимание, так как эффективность биовыщелачивания руды во многом зависит от видового состава сообщества и выщелачивающей активности микроорганизмов.

В качестве одного из вариантов решения этого вопроса и для практического применения результатов проведенного молекулярно-биологического исследования был поставлен эксперимент по выделению потенциально важных для биовыщелачивания автохтонных ассоциаций хемолитотрофных микроорганизмов из различных проб окисленной руды месторождения Шануч (две пробы из склада окисленных руд, пробы из карьера, штольни, хвостохранилища - контрольная проба) с изучением их минерального состава (Трухин и др., 2012).

Как показала Т.С. Хайнасова (2012), из исследуемых образцов руды в ме-зофильных ацидофильных условиях в течение полутора месяцев выделились морфологически однородные ассоциации микроорганизмов с характерным присутствием палочковидных грамотрицательных и грамположительных бактерий.

Разработанными ПЦР-тест-системами проводился мониторинг этой автохтонной микрофлоры, который подтвердил, что бактерии родов Acidithiobacil-las и Sulfobacillus принимают непосредственное участие в биогеохимических процессах на месторождении Шануч. Представители рода Ferroplasma в окисленной руде обнаружены не были.

По результатам мониторинга тест-системами видно, что зависимости видового разнообразия хемолитотрофных ацидофильных бактерий от минерального состава проб и содержания сульфидных минералов, отобранных для микробного выделения, не выявлено. Для показателя качественной микробной характеристики основное значение имеют, главным образом, не минеральные особенности субстрата, а условия залегания руды.

Также обнаружилось, что на месторождении и непосредственно в рудном теле по частоте выделения доминирующее участие обнаруживает бактерия A. ferrooxidans. Биоокислительные процессы в зонах дополнительного активного контакта с агентами выветривания (на поверхности рудника) происходят при участии ассоциаций микроорганизмов A. ferrooxidans и Sulfobacillus spp., предпочитающих использовать в своем метаболизме соединения железа. В лабораторных условиях проба руды из карьера, характеризующаяся наибольшим разнообразием первичных и вторичных минералов, оказалась эффективнее для получения биомассы железоокисляющих бактерий (Трухин и др., 2012; Хайнасова, 2012).

В результате работы из окисленной руды месторождения Шануч выделены перспективные для технологии биовыщелачивания ассоциации мезофильных и умеренно термофильных хемолитотрофных микроорганизмов родов Acidithi-

оЬасШт (А. /еггоохШат) и Би1/оЬасШш. Показано, что в качестве объекта для выделения биотехнологически перспективной автохтонной микрофлоры, в частности монокультуры бактерий А. _/еггоохШагя, рекомендуется использовать руду, отобранную непосредственно в рудном теле разрабатывающегося месторождения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении обобщены результаты проделанной работы и сформулированы следующие выводы.

1. Проведенным молекулярно-биологическим исследованием смешанных бактериальных сообществ, включающим оригинальные тест-системы, оценена их структура в видовой и количественной характеристике.

2. При проведении молекулярного анализа структуры сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов рекомендована модифицированная методика, основанная на лизирующей активности гуанидинизотиоцианата (лизис при 65°С) с последующей очисткой фенолом и хлороформом.

3. Установлено, что подавляющее большинство нуклеотидных последовательностей в составе библиотеки клонов исследуемого сообщества принадлежит представителям альфапротеобактерий рода Ас'кИМоЬасШш. Также было обнаружено наличие последовательностей семейства АсеюЬас(епасвае, бактерии АЫсИрМПит яр., архей Ткегтососсш зр.и Геггор1а$та Бр.

4. Разработаны ПЦР-тест-системы для специфической детекции микроорганизмов А. Шоох'кктя, А. /еггоох1с1ап5, 5. 1ЬегтозиЩ<1оох1с1аю, Е аасИрИИит, проведена качественная оценка и идентифицировано их присутствие в микробных сообществах, выделенных из реакторных установок и сульфидной руды месторождения Шануч.

5. Показано, что микроорганизмы видов А. /еггоох'к1ат, А. ¡Ыоох1с1ат, Е ас'кИркИит представлены в составе анализируемого сообщества в соотношении 62 % : 4 % : 0,14 % соответственно. Основным представителем микроорганизмов медно-никелевого месторождения Шануч на Камчатке является А. /ег-гоох1скик — одна из наиболее эффективных железоокисляющих бактерий. В составе смешанных культур присутствуют термофильные археи, которые при повышенных температурах обеспечивают более высокую скорость окисления сульфидов.

Разработанное исследование оценки структуры сообщества хемолитотрофных ацидофильных микроорганизмов показало свою состоятельность и целесообразность применения при идентификации микроорганизмов сульфидных руд в прикладных биотехнологических и микробиологических исследованиях, направленных на снижение негативных последствий металлургического производства на окружающую природную среду (тема НИР НИГТЦ ДВО РАН «Бактериально-химические и бактериально-автоклавные процессы и геотехнологии переработки сульфидных медно-никелевых руд», № госрегистрации 01200963715).

Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы

Результаты данной работы рекомендуют использование микробной ассоциации из A. ferrooxidans, A. thiooxldans, F. acidiphilum на обогатительной фабрике, которая впоследствии будет построена на руднике Шануч. Однако возможно включение в скрининг биовыщелачивагощих сообществ месторождения Шануч других бактерий, принимающих участие в выщелачивании и ранее обнаруженных на месторождении - A. caldus, A. ferrivorans, L. ferrooxidans, L. thermoferrooxidans, L. ferriphillum, Alicyclobacillus disulfidooxidans, S. acidophilus, F. cupricumulans (Кузякина и др., 2008). Примененная схема проведения молекулярно-биологического исследования структуры микробной ассоциации позволит изучать и получать другие ассоциации, обладающие более высокими окисляющими способностями. Такая схема позволит в дальнейшем достаточно легко решать такие задачи, как определение видового состава смешанной культуры микроорганизмов и количественного соотношения микроорганизмов в среде на разных стадиях процесса выщелачивания; исследование штаммового полиморфизма A. ferrooxidans и определения адаптации штаммов к условиям выщелачивания; идентификация микроорганизмов без выделения в чистые культуры (выделение исследуемых микроорганизмов в чистые культуры занимает времени от двух недель); подбор такой комбинации штаммов хе-молитотрофов, которая будет обладать наибольшей продуктивностью в получении целевого продукта - выщелачивающего металла (кобальт, никель, медь).

В ходе работы разработан и внедрен в исследовательский процесс проект методических рекомендаций проведения качественного и количественного молекулярно-биологического исследования смешанных бактериальных сообществ, используемых в реакторах при биовыщелачивании. Методические рекомендации являются универсальными для сообществ микроорганизмов, выщелачивающих сульфидные руды, и применяются для экспресс-анализа видового разнообразия хемолитотрофных микроорганизмов, в модельных экспериментах по определению эффективности выщелачивающих микробных сообществ и на производстве для быстрого и точного анализа взятых проб из руды, выщелачивающего раствора и инокулята.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ а) публикации в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Трухин, Ю. П. Эколого-экономические аспекты применения технологии биовыщелачивания ценных компонентов из сульфидных кобальт-медно-никелевых руд (Камчатка) /10. П. Трухин, Т. И. Кузякина, С. В. Мурадов, Т. С. Хайнасова, О. О. Левенец, А. А. Балыков, С. В. Рогатых // Проблемы региональной экологии. - 2010. - № 6. - С. 117-122.

2. Рогатых, С. В. Использование технологии ПЦР в реальном времени для оценки эффективности методов выделения ДНК из культур ацидофильных хе-молитотрофных микроорганизмов / С. В. Рогатых, А. А. Докшукина, Т. С. Хайнасова, С. В. Мурадов, И. А. Кофиади // Прикладная биохимия и микробиология. - 2011. - Том 47. - № 2. - С. 226-230.

3. Рогатых, С. В. Оценка качественного и количественного состава сообществ культивируемых ацидофильных микроорганизмов методами ПЦР-РВ и анализа библиотеки клонов / С. В. Рогатых, А. А. Докшукина, О. О. Левенец, С. В. Мурадов, И. А. Кофиади // Микробиология. - 2013. - Том 82. - № 2. - С. 212-217.

4. Хайнасова, Т. С. Окисленная руда как источник выделения ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов для биовыщелачивания сульфидных медно-никелевых руд / Т. С. Хайнасова, С. В. Рогатых. Т. И. Кузякина, Т. И. Корнилова // Горный информационно-аналитический бюллетень. - 2013. - № 10.-С. 127-134.

б) публикации в других изданиях и материалах конференций

5. Хайнасова, Т. С. Использование термоацидофильных микроорганизмов в процессах биовьпцелачивания сульфидных руд Дальнего Востока / Т. С. Хайнасова, О. О. Левенец, С. В. Рогатых // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование. Т. 11 : сборник трудов Четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». - СПб.: Изд-во Политехи. ун-та, 2007. - С. 420-421.

6. Хайнасова, Т. С. Перспективы использования термоацидофильных микроорганизмов в процессах биовыщелачивания сульфидных руд Дальнего Востока / Т. С. Хайнасова, О. О. Левенец, С. В. Рогатых // Актуальные аспекты современной микробиологии : материалы III международной молодежной школы-конференции. — М.: Макс Пресс, 2007. — С. 124-125.

7. Кузякина, Т. И. Развитие технологии биовыщелачивания в Камчатском крае / Т. И. Кузякина, С. В. Мурадов, Т. С. Хайнасова, О. О. Левенец, А. А. Балыков, С. В. Рогатых // Биотехнология: состояние и перспективы развития : материалы V Московского международного конгресса. — М. : ЗАО «Экспо-биохим-технологии», 2009. - С. 339-340.

8. Левенец, О. О. Повышение окислительной активности мезофильных ассоциаций хемолитотрофных микроорганизмов / О. О. Левенец, Т. С. Хайнасова, А. А. Балыков, С. В. Рогатых // Биотехнология: экология крупных городов : материалы Московской международной научно-практической конференции. -М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», 2010.-С. 138-139.

9. Рогатых, С. В. Использование технологии ПЦР в реальном времени для оценки эффективности методов выделения ДНК из культур хемолитотрофных микроорганизмов / С. В. Рогатых, И. А. Кофиади // Актуальные аспекты совре-

менной микробиологии : материалы VI молодежной школы-конференции с международным участием. - М.: Макс Пресс, 2010. - С. 114-116.

10. Кофиади, И. А. Разработка генодиагностических тест-систем для определения структуры аборигенного микробного сообщества месторождения Ша-нуч (Западная Камчатка) / И. А. Кофиади, С. В. Рогатых, С. В. Мурадов // Сохранение биоразнообразия Камчатки и прилегающих морей : материалы XI международной научной конференции. - Петропавловск-Камчатский : Камчат-пресс, 2010.-С. 96-99.

11. Дронин, А. В. Эффективность методов выделения ДНК то культур ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, выделенных из сульфидной руды медно-никелевого месторождения Шануч (Западная Камчатка) / А. В. Дронин, С. В. Рогатых // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2011» [Электронный ресурс]. - М.: Макс Пресс, 2011. - Секция Биология. С. 177. - 1 электрон, опт. диск (DVD-ROM).

12. Трухин, Ю. П. Выделение хемолитотрофных микроорганизмов из окисленной руды медно-никелевого месторождения Шануч (Камчатка) для биовыщелачивания сульфидных руд / Ю. П. Трухин, Т. С. Хайнасова, С. В. Рогатых // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2012. - № 1 (2). -С. 83-87.

13. Рогатых. С. В. Разработка тест-систем и анализ структуры сообщества ацидофильных микроорганизмов, используемых в биовыщелачивании сульфидных руд месторождения Шануч (Камчатка) / С. В. Рогатых, О. О. Левенец, Т. С. Хайнасова, И. А. Кофиади // Природные ресурсы, их современное состояние, охрана, промысловое и техническое использование : материалы III Всероссийской научно-практической конференции. - Петропавловск-Камчатский : КамчатГТУ, 2012. - С. 139-142.

14. Рогатых, С. В. Применение молекулярно-генетических методов в технологии биовыщелачивания сульфидных медно-никелевых руд месторождения Шануч (Камчатка) / С. В. Рогатых, С. В. Мурадов, И. А. Кофиади, А. А. Балыков, О. О. Левенец, Т. С. Хайнасова // Никеленосные провинции Дальнего Востока : материалы конференции с международным участием. - Петропавловск-Камчатский : НИГТЦ ДВО РАН, 2012. - С. 139-145.

15. Мурадов, С. В. Технология биовыщелачивания медно-никелевой руды месторождения Шануч (Западная Камчатка): молекулярно-генетические и биотехнологические подходы / С. В. Мурадов, А. А. Балыков, С. В. Рогатых // Экология Камчатки и устойчивое развитие региона : материалы I Всероссийской научно-практической конференции. - Петропавловск-Камчатский : КамГУ им. Витуса Беринга, 2013. - С. 223-229.

Благодарности

Выражаю сердечную благодарность своим научным руководителям к.б.н. C.B. Мурадову и д.б.н. И.А. Кофиади за всестороннюю поддержку и помощь в проведении данного исследования.

Особо признателен сотрудникам НИГТЦ ДВО РАН д.б.н., проф. Т.И. Кузякиной, К.Т.Н. О.О. Левенец, к.б.н. Т.С. Хайнасовой, А.А. Балыкову, А.И. Хоменко, Л.А. Муд-рановой за предоставление материалов для исследований, помощь в работе и ценные советы и консультации; д.б.н. Т.Ф. Кондратьевой (ИНМИ РАН) за предоставление материала для исследований, к.б.н. О.Ю. Бусаровой (ДВФУ) за рекомендации и методическую помощь при подготовке диссертационной работы.

Благодарю А.А. Докшукину и Д.С. Шведову за помощь при проведении экспериментов на разных этапах работы.

Благодарю директора ФБУН ГНЦ ПМБ чл.-корр. РАМН, д.м.н., профессора И.А. Дятлова за предоставленную возможность защитить диссертацию в диссертационном совете при ФБУН ГНЦ ПМБ, ученого секретаря диссертациоиного совета к.б.н. Н.К. Фурсову за организацию ее проведения, к.м.н. И.В. Абаева (ФБУН ГНЦ ПМБ) за рецензирование и корректировку диссертационной работы.

Глубоко признателен ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, вопросы и рекомендации.

Подписано в печать:

15.01.2014

Заказ № 9284 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru