Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка качества сухих биопрепаратов методом ЯМР-релаксации

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Оценка качества сухих биопрепаратов методом ЯМР-релаксации"

На правах рукописи

Федкжина Галина Николаевна

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СУХИХ БИОПРЕПАРАТОВ МЕТОДОМЯМР-РЕЛАКСАЦИИ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в лаборатории радиоспектроскопии Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр прикладной микробиологии» МЗ РФ

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Волков Владимир Яковлевич

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Строгое Семен Ефимович

кандидат химических наук, доцент Пшеничникова Анна Борисовна

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино Московской области

Защита состоится "_"_2004 г. в ._часов

на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская площадь, 9 в ауд._.

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева

Автореферат разослан "___"_2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета ДМ 212.204.13, кандидат технических наук

И.В. Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Наиболее совершенным методом стабилизации биологических препаратов является лиофилизация. Однако проблема контроля сухих биоматериалов остается актуальной до настоящего времени. Известные методы определения остаточной влажности и активности трудоемки и требуют больших затрат времени, при этом происходит разрушение и расходование биоматериала. При работе с живыми бактериальными вакцинами требуется также выполнение правил специальной техники безопасности.

В последние десятилетия широкое применение в медицине получили методы ЯМР. Однако в биотехнологии уникальные возможности этих методов используются очень слабо или не используются вообще. Уникальность методов ЯМР заключается в возможности их применения для контроля живых микроорганизмов в биотехнологическом цикле и конкретно для оценки качества готовой продукции и постадийного контроля полупродуктов.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в экспериментальном обосновании применимости метода ЯМР-релаксации для оценки качества сухих биопрепаратов на основе живых микроорганизмов. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. разработать способ определения остаточной влажности сухих биопрепаратов методом импульсного ЯМР;

2. найти критерий для максимального значения остаточной влажности сухих биопрепаратов методом ЯМР-релаксации;

3. выявить ЯМР-релаксационные критерии качества сухих биопрепаратов;

4. определить изменения параметров ЯМР и установить их взаимосвязь с биологической активностью сухих препаратов клеток микроорганизмов в процессе хранения;

5. выявить возможности метода ЯМР-релаксации для контроля технологического процесса приготовления сухих препаратов клеток.

Научная новизна. Методом ЯМР-релаксации впервые осуществлен одновременный контроль состояния остаточной влаги и состояния сухого вещества в биопрепаратах, которые содержат клетки микроорганизмов. Благодаря возможности регистрации сигнала ЯМР в нулевой момент времени найден способ определения остаточной влажности сухих биопрепаратов. На способ получено авторское свидетельство на изобретение. Впервые установлена взаимосвязь между остаточной влажностью и состоянием воды, а также сухого вещества в модельных системах и лиофильно высушенных препаратах кшхокЕзсЪепеЫа coli и вакцинного штамма Francisella tularensis. Впервые установлена взаимосвязь между числом жизнеспособных клеток в препаратах туляремийного микроба, Escherichia coli и временем спин-решеточной релаксации при хранении. Показана возможность определения

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ Г БИКЛКОТЕКА | СП О»

3 1

количества прочносвязанной воды в сухих препаратах клеток вакцинного штамма ГганахеНа tularensis методом ЯМР-релаксации. Впервые показано возрастание подвижности протонов в сухой биомассе клеток Francisella tularensis, 8асск. cerevisiae и модельных системах при влагосодержании выше мономолекулярного слоя, что является причиной ускорения деструктивных реакций в системе и ухудшения способности препаратов к сохранению. Экспериментально обнаружено увеличение влажности образцов, которые хранились в герметичных условиях при повышенной температуре.

Научно-практическое значение. Разработан способ определения остаточной влажности сухих препаратов импульсным методом ЯМР. Он дал практическую возможность получить принципиально новые данные о свойствах сухих биопрепаратов и установить практически значимые корреляции между характеристиками биоматериалов и параметрами, измеряемыми методом ЯМР-релаксации. Найденные в работе корреляции между ЯМР-релаксационными, физико-химическими и биологическими характеристиками сухих биоматериалов могут быть использованы для оптимизации и контроля производственных процессов получения бактериальных препаратов, например, живых вакцин, а также пекарских и кормовых дрожжей, лекарственных средств, стабилизированных сахарами, а также пищевых продуктов. Результаты настоящих исследований могут быть применены при подготовке к хранению и проверке сохраняемости музейных культур микроорганизмов без вскрытия ампул с лиофилизированным биоматериалом. Результаты работы рекомендуется использовать в микробиологической, фармацевтической, пищевой промышленности и других отраслях народного хозяйства.

Апробация работы. Результаты работы доложены на итоговых научных конференциях ВНИИ прикладной микробиологии (п. Оболенск, 1978, 1980), II Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (г. Звенигород, 1981), VI конференции по спектроскопии биополимеров (г. Харьков, 1988), Отраслевом совещании "Методы магнитной радиоспектроскопии в биотехнологии" (п. Оболенск, 1990), Европейско-Среднеазиатском Симпозиуме по биотехнологии (г. Анкара, 1995), Ш Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем" (г. Казань, 1996), IX конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии" (г. Звенигород, 1996), Юбилейной научной конференции ГНЦ ПМ "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии" (п. Оболенск, 1999), Международной научной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (п. Оболенск, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, выводов (6 пунктов) и списка использованной литературы. Работа изложена на 145 страницах. Список цитируемой литературы включает 119 наименований. Иллюстративный материал содержит 31 рисунок и 19 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовались лиофильно высушенные образцы бычьего сывороточного альбумина (БСА) и БСА в композиции с дисахаридами (сахароза, лактоза, трегалоза), а также клеток микроорганизмов Escherichia coli штамм К-12, Saccharomyces cerevisiae штамм 14, Francisella tularensis штамм 15/3 (вакцинный штамм Ганского).

Метод ЯМР-релаксации. ЯМР-релаксационные характеристики протонов сухих образцов определяли на частотах 90 МГц (SXP-100 "Braker", ФРГ) и 20 МГц на ЯМР-релаксометре-анализаторе "Протон-20", разработанном в ГНЦПМ совместно с ОКБА (г. Йошкар-Ола). Для измерения времен релаксации использовали стандартные методики. Время продольной (спин-решеточной) релаксации Ti определяли методом время поперечной

(спин-спиновой) релаксации Тг - по спаду свободной индукции (ССИ).

Статический гравиметрический метод был использован для получения изотерм адсорбции. Сухие образцы уравновешивали в эксикаторах над насыщенными растворами солей с разной активностью воды (а„г= p/ps)

Метод высушивания - лиофилизация на аппарате "Virtis" (США) при температуре конденсатора -58 °С и давлении в системе от 2 до 8 Па в течение 18-24 часов после предварительного замораживания при температуре -36 °С.

Жизнеспособность клеток в сухих препаратах определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ, на мг сухого веса) на чашках Петри с плотной питательной средой.

Влагосодержание образцов (W, % на сухой вес) контролировали методом досушивания до постоянного веса при температуре 105 °С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка способа определения остаточной влажности сухих биопрепаратов методом импульсного ЯМР. В основе подхода к определению влажности методом импульсного ЯМР лежит разница в подвижности молекул воды и молекул сухого вещества, что выражается в разнице времен релаксации. На рис. 1 представлено графическое изображение сигнала ССИ от протонов лиофильно высушенного образца после воздействия 90-градусного высокочастотного импульса.

Рис. 1. Графическое изображение зависимости ССИот времени: Н] - амплитуда медленной компоненты ССИв начальный момент времени, Н] -амплитуда быстрой компоненты ССИв начальный момент времени, О/, О2 - зоны аппроксимации компонент, Аи А2 - амплитуды компонент в момент времени t.

Форма сигнала является типичной для всех исследованных модельных систем и препаратов клеток. Использование быстродействующего аналого-цифрового преобразователя (АЦП 0,5 мкс/точку) позволило регистрировать медленную и быструю компоненты сигнала ССИ, а также одновременно при помощи специальных методик определять их амплитуды в нулевой момент времени и значения Сигнал состоит из двух компонент с разным временем релаксации Тг. Медленная компонента, убывающая по экспоненциальному закону, относится к протонам воды; ее амплитуда в начальный момент времени Н1 отражает количество протонов воды в пробе. Быстрая компонента, убывающая по гауссовому закону, относится к протонам сухого вещества, а ее амплитуда в начальный момент времени отражает количество протонов сухого остатка. Мы измеряли Н1/Н2 образцов с известной влажностью W и на основе полученных экспериментальных данных строили калибровочные графики.

Сначала были проведены исследования на модельных образцах БСА с разной влажностью. Было замечено, что сигналы ССИ от образцов БСА различались амплитудой медленной компоненты Ш, которая возрастала с ростом влажности. Поскольку амплитуда быстрой компоненты при этом практически не изменяется, т.к. количество сухого вещества остается постоянным, отношение Н1/Н2 также увеличивалось с увеличением влажности. В координатах Н1/Н2 - W была получена прямая линия с высоким коэффициентом корреляции 0,98 (рис. 2).

Затем были измерены сигналы ССИ от образцов модельной системы БСА- сахароза с разной влажностью (рис. 3). Как и в случае БСА, с ростом образцов происходило возрастание Ш и параметра Н1/Н2ЯМР. Однако Н2 при

этом оставалась постоянной только до некоторого значения W. Далее рост Hi происходил гораздо быстрее, чем если бы он был вызван только увеличением количества воды. Зависимость Н1/Н2 от W имела другой вид: в районе влажности, равной 12 %, резко изменялся наклон линейного графика. Аналогичную форму имели графики зависимости Н1/Н2 от W для сухих модельных систем БСА - лактоза и БСА - трегалоза При исследовании препаратов клеток вакцинного штамма (рис. 4) и Saccharomyces cerevisiae с разной влажностью мы получили такие же графики зависимости параметра Hi/H2 ЯМР OTW.

Из полученных данных видно, что для БСА во всем диапазоне исследованных уровней влажности, для систем БСА - дисахарид в области W от 0 до 12%, а для сухой биомассы от 0 до 7 % влажность лиофильно высушенных образцов и параметр H/Нг ЯМР связаны уравнением:

W=K • Hi/Hi • 100 (%), О)

где К - коэффициент пропорциональности, определяемый по калибровочным графикам. В табл. 1 представлены значения К для исследованных объектов.

Таблица 1. Значения Кдля определения влажности _методомЯМР-релаксации_

Состав препарата Значения К

БСА 0,44±0,01

БСА - сахароза 0,71±0,13

БСА - лактоза 0,72±0,12

БСА - трегалоза 0,77±0,03

Клетки Francisella tularensis 0,58±0,05

Для дрожжей зависимость Н1/Н2 от влажности в диапазоне W от 0 до 6 % описывается уравнением 2 (коэффициент корреляции 0,88):

IV = (1,27±0,14) -1Шг - (19,1±2,6) (2)

Таким образом, чтобы определить остаточную влажность лиофильно высушенного препарата методом импульсного ЯМР, необходимо измерить начальные амплитуды медленной и быстрой компонент ССИ, определить их соотношение Н1/Н2 и рассчитать влажность по формуле 1 или 2. Принципиальное отличие настоящего способа определения влажности от других, основанных на явлении ЯМР, заключается в возможности одновременного измерения быстрой и медленной компонент сигнала и определении с помощью быстродействующего АЦП их амплитуд в начальный момент времени. Использование относительного параметра Ш/И2 ЯМР позволяет значительно компенсировать ошибки измерения из-за неточностей установки ампулы в датчике и уровня фасовки образца. Описанным способом можно измерять остаточную влажность биопрепаратов, начиная со значения 2-3 % с относительной ошибкой, не превышающей 15 %.

Предложенный способ определения остаточной влажности методом импульсного ЯМР не требует предварительной подготовки образца, является быстрым и неразрушающим. Способ незаменим при работе с микроорганизмами, поскольку измерения можно проводить в тех же ампулах, в которых хранятся образцы, без их вскрытия. При этом биопрепараты полностью сохраняют биологические характеристики. Определение остаточной влажности методом ЯМР-релаксации является экспрессным (порядка 1 мин) и легко поддается автоматизации. Данный способ экономически целесообразен там, где необходимо большое количество определений этого параметра и контроля качества высушивания (в условиях производства лекарственных средств). Описанный способ применим там, где уничтожение образца недопустимо с точки зрения поставленной научной задачи или безопасности работающего персонала. На данный способ определения влажности получено авторское свидетельство на изобретение [6].

"Растворяющая" роль воды при малых значениях влажности. При разработке способа определения влажности было замечено, что линейная корреляция между параметром Н1/Н2 ЯМР и W, как для сухой модельной системы БСА - сахароза (рис. 3), так и для препаратов клеток (рис. 4), имеет точку перегиба. При влажности выше этой точки происходит резкое увеличение параметра Н1/Н2 ЯМР, превышающее вклад от протонов воды. Значит, дополнительный сигнал может быть отнесен к протонам сухого вещества, а именно, к протонам сахара, т.к. для чистого БСА такого явления не наблюдается (рис. 2). Молекулы сахара переходят в водную фазу, как бы "растворяясь" в ней. При этом внешний вид и консистенция препарата не

адсорбированной воды начинается заполнение первых слоев адсорбции.

меняются, т.е. образец остается твердым и на внешний вид сухим. Казалось бы, концентрация образующегося "раствора" должна быть равной концентрации насыщенного раствора. Однако, содержание влаги в модельной системе в точке перегиба равно 12 %, в то время, как в насыщенном растворе, например, сахарозы -32,7 %.

Чтобы прояснить ситуацию, были проведены исследования сорбционных свойств сухой биомассы. На рис. 5 представлена изотерма адсорбции паров воды на поверхности сухих клеток Fr. tularensis. Изотерма имеет характерную S-образную форму. Заметное увеличение количества при значении p/ps = 0,3, когда закончено

Рис. 5. Изотерма адсорбции паров воды на поверхности сухой биомассы вакцинного штамма Francisella tularensis.

Тогда же происходит и гораздо более значительное повышение времени спин-спиновой релаксации Тг и параметра Н1/Н2 (рис. 6), свидетельствующее о повышении подвижности молекул "жидкой" фазы.

Сорбционные кривые описываются уравнением БЭТ. Для определения содержания прочносвязанной воды ан (первого слоя) уравнение ЮТ преобразовывали в линейную форму и получили значение = 6,25 г на 100 г сухого веса. В точке перегиба при влажности 12 % в модельной системе БСА -

дисахарид на одну молекулу сахара приходится 7 молекул воды. По-видимому, молекулы адсорбированной воды образуют водородные связи с гид-роксильными группами сахара, но связь последнего с белком еще достаточно прочная. Амплитуда медленной компоненты ССИ растет пока, только благодаря молекулам сорбированной воды. Следует подчеркнуть, что содержание воды в точке перегиба одинаково как для плохо растворимой лактозы, так и для хорошо растворимой сахарозы. Значения К, характеризующего наклон 1-го участка зависимости также одинаковы (табл. 1). При дальнейшем повышении влажности медленная компонента ССИ растет гораздо сильнее, чем, если бы это было вызвано только увеличением количества воды в пробе. Причиной появления дополнительного сигнала ССИ при влажности выше 12 % может быть переход части молекул сахара в мобильное состояние. При этом значения

К для 2-го участка (характеризующего его наклон для разных систем

Дг

начинают сильно различаться (табл. 2).

Таблица 2. Результаты анализа зависимости Н]/Н2=/

Объект исследования Координаты точки перегиба Наклон 2-го Ау участка Количество сахара по формуле 2 п,т Количество мол. воды на 1 мол. сахара

БСА - сахароза \У=11,4 % Н,/Н2=14,3 % 10,3±0,7 10 2,1±0,2

БСА - лактоза №=12,8 % Н,/Н2=17,6 % 7,1±0,7 6,4 3,1±0,3

БСА - трегалоза \У=12,7 % Н,/Н2=19,1 % 5,8±0,2 4,9 4,3±0,3

Используя экспериментально полученные данные и учитывая относительную долю протонов в модельных композициях (рассчитанную на основе химических формул), мы вывели формулу расчета количества сахара, "растворившегося" в одном грамме воды при влажности в системе БСА -дисахарид выше 12 % (формула 3). Мы также определили количество молекул воды, которое необходимо для ослабления связи одной молекулы сахара с

Ю

поверхностью белка и перевода молекулы сахара в подвижное состояние (табл. 2) [5].

где: кс - доля протонов в сухом остатке, равная 0,0734;

^Н-р - доля протонов в молекуле воды, равная 0,111;

ксах - доля протонов в молекуле сахара, равная 0,064.

Из данных табл. 2 видно, что дополнительная подвижность в модельной системе при влагосодержании выше 12 % наблюдается тогда, когда на одну молекулу сахарозы приходится 2 молекулы воды, на одну молекулу лактозы -3 молекулы воды, а на одну молекулу трегалозы - 4 молекулы воды. Отсюда напрашивается вывод о более сильной связи в системе БСА - трегалоза, наименее слабой - в системе БСА - сахароза, а БСА - лактоза занимает промежуточное положение [11]. Такое отличие в силе связывания, по-видимому, можно объяснить различием стереохимического строения молекул дисахаридов. Сахароза является несимметричной молекулой. У лактозы симметричность нарушена благодаря гидроксильной группе у четвертого атома углерода. Трегалоза образует пространственную структуру, подобную тетраэдрической структуре воды, и поэтому является идеальным "заместителем" воды при дегидратации биологических объектов.

Таким образом, влагосодержание сухой биомассы клеток в точке перегиба (рис. 4), соответствует количеству прочносвязанной воды, рассчитанному по уравнению БЭТ. Рассмотренный в данной работе способ одновременного наблюдения за поведением медленной и быстрой компонент ССИ является инструментом для регистрации подвижности молекул сухого вещества. Способ позволяет определить верхнее критическое значение влажности, соответствующее резкому возрастанию подвижности в системе, что, по данным Дакуорта (1981), инициирует сахароаминные реакции в сухих пищевых продуктах. В качестве ксеропротекторов используются сахара, выбор которых часто бывает случайным. Исследование подвижности Сахаров в условиях низкой влажности поможет осознанно подходить к этому вопросу. Сравнивая поведение иследованных в работе дисахаридов, можно сделать вывод о явных преимуществах трегалозы и лактозы перед сахарозой в качестве ксеропротекторов.

Исследование состояния воды и сухого вещества в сухих биопрепаратах методом ЯМР-релаксации. Остаточная влажность является одной из главных характеристик сухих биоматериалов. Она определяет консистенцию и структуру биопрепарата, а ее взаимодействие с

присутствующими в образце химическими компонентами определяет устойчивость его при хранении. Степень взаимодействия воды с компонентами препарата зависит не только от влагосодержания, но и от ее термодинамического состояния. Состояние воды определяет форму и энергию связи влаги с материалом, т.е. ее активность, доступность для химических реакций. Содержание влаги в сухом образце измеряется многими известными способами, в том числе и описанным в диссертации методом ЯМР-релаксации. Однако состояние воды, а также состояние других веществ в биопрепарате можно определять только методом ЯМР. В табл. 3 представлены характеристики препаратов клеток Francisella tularensis и защитной среды (ЗС).

Таблица 3. Характеристики сухих препаратов клеток вакцинного штамма

Препарат Сухой остаток, % Остаточная влажность, % Ъ протонов ВОДЫ, МКС т, протонов С.В., МС

Концентрированная суспензия клеток 6,4±0,1 5,7±0,5 140±5 237±11

Суспензия клеток с защитной средой 13,5±0,2 2,8±0,4 77±3 446±9

Защитная среда 31,7±0Л 0 - 709±15

Микробиологические препараты содержат до 70 % по сухому весу ЗС, в то время как клетки микроорганизмов после лиофилизации имеют влажность около 6%. В одних и тех же условиях сушки ЗС высыхает практически полностью, медленная компонента ССИ при этом не регистрируется. Суспензия клеток после высушивания удерживает довольно много воды и характеризуется большим временем Т2 и небольшим временем Т1 Это свидетельствует о большей подвижности молекул воды в образцах без ЗС.

На рис. 7 представлена зависимость ^ и Т2 от W для модельной системы БСА - трегалоза, а на рис. 8 - для сухих препаратов клеток Fr. шО-ктЫ. Наиболее сухим образцам соответствуют минимальные значения Тг и максимальные значения Т1.

Величина остаточной влажности не всегда адекватно отражает качество биопрепарата. При контроле больших партий лиофилыю высушенных биопрепаратов бывает так, что их влажность не выходит за пределы нормы, однако по другим показателям (внешний вид, активность и др.) наблюдается несоответствие стандарту. В такой ситуации незаменимым становится оценка Т2 и Т1 Слишком большие значения Т2 и низкие значения ^ (по сравнению со средними статистическими) являются причиной отбраковки образцов. При этом совсем необязательно проверять препарат по остальным параметрам. Более того, один и тот же образец, измеренный с интервалом времени в несколько

часов, может иметь разные значения Т2. Его влажность, контролируемая по параметру ^/Н^ при этом остается постоянной. Уменьшение времени Т2 свидетельствует о снижении подвижности молекул воды, перераспределении влаги в образце и усилении связывания ее с сухим матриксом. Состояпие воды в том же образце становится другим, и, несмотря на оставшееся неизменным значение влажности, свойства препарата изменяются. В таком образце вода находится в более связанном состоянии, ее активность уменьшается, а, следовательно, меняется качество образца.

Таким образом, количественная характеристика влажности отражает свойства препарата не полностью. Параметры ^ и Т2 являются более тонким индикатором внутреннего состояния биоматериала, отражают малейшее движение молекул веществ, входящих в его состав. Их изменение свидетельствует о внутренних перестройках, происходящих в биопрепарате под влиянием самых разных причин. Наряду с остаточной влажностью критерием качества биоматериала следует рекомендовать состояние (подвижность молекул) воды и сухого вещества.

Контроль процесса хранения сухих препаратов метолом ЯМР-релаксации. Были проведены исследования ЯМР-релаксационных характеристик сухих препаратов клеток в процессе хранения. Одновременно в образцах определяли количество жизнеспособных клеток. Из экспериментальных результатов, представленных на рис. 9, видно, что в течение 120 дней при температуре 37 °С происходит довольно заметное снижение жизнеспособности клеток, ^ и некоторое возрастание T2. В препаратах без ЗС наблюдались более резкие изменения всех параметров. Влажность образцов с ЗС за 54 дня хранения в герметичных ампулах

повышалась с 2,5 до 3,8 %, а образцов без ЗС - с 4,4 до 8,1 %.

В ходе дальнейших исследований мы выяснили, что на степень изменения параметров ЯМР влияют температура хранения (табл. 4) и остаточная влажность образцов (табл. 5). Влияние повышенной температуры хранения заключается, согласно данным литературы, в ускорении сахароаминных реакций в сухих биопрепаратах, что приводит к образованию новых молекул воды. Об этом свидетельствует повышение подвижности и количества протонов воды в образцах, что выражается возрастанием параметров

Таблица 5. Влияние остаточной влажности препаратовFr. tularensisна

Остаточная влажность, % В начале хранения В конце хранения Относительное изменение, %

Тьме КОЕ, 106/мг Тьмс КОЕ, 106/мг т, КОЕ

2,5±0,3 444±12 2025±260 423±13 14241215 5 30

5,0±0,2 387±9 17761231 334±6 258132 15 85

7,5±0,3 326±7 1346±119 169±8 0,02 48

Наблюдая за изменением ЯМР-релаксационных характеристик в процессе хранения, мы заметили тенденцию к одновременному снижению жизнеспособности и Ti для исследуемых препаратов клеток. На рис. 10 представлена взаимосвязь Ti и lgKOE для препаратов клеток вакцинного штамма, а на рис. 11 - д ля препаратов Е. coll. Абсолютные величины значений T1 являются индивидуальными для каждой партии образцов, а характер взаимосвязи T1 и lg КОЕ типичен для разных партий.

Определение количества жизнеспособных клеток в бактериальных препаратах методом высева на плотные питательные среды требует больших затрат времени и сил. Не всегда высоким бывает и качество питательных сред. Существование линейной корреляции между ^ и числом жизнеспособных клеток значительно ускоряет биологический контроль образцов. Это особенно удобно при работе с опасным материалом, а также с коллекциями культур микроорганизмов. Периодически измеряя ^ хранящихся в музеях ампул с микроорганизмами, можно зафиксировать момент, когда произошло критическое снижение а затем произвести пересев культуры.

Контроль технологического процесса приготовления- сухих препаратов методом ЯМР-релаксации. При контроле технологического процесса приготовления препаратов клеток ¥г. шЬ-гвтю было исследовано влияние двух защитных сред, соотношения между количеством клеточной массы и количеством ЗС, отмывки клеток на параметры ЯМР сухих образцов. Параллельно определяли жизнеспособность клеток в препаратах.

Несмотря на одинаковую влажность препаратов, приготовленных с экспериментальной и регламентной ЗС (табл. 6), их ЯМР-релаксационные характеристики различаются. Введение полиэтиленгликоля (ПЭГ) в состав ЗС удлиняет медленную компоненту ССИ, по-видимому, за счет движения гидроксильных групп. Однако на стадии сушки экспериментальная ЗС защищает клетки бактерий не хуже, а при дальнейшем хранении - даже лучше, чем регламентная.

С увеличением массовой доли клеточной суспензии в составе препаратов (табл. 7) значения параметров ЯМР Н1/Н2 и Т2 сухих образцов возрастают, a ^ снижаются, т.к. клеточная биомасса удерживает больше воды, чем ЗС.

Оптимальным соотношением между количеством клеточной массы и количеством защитных веществ является 1:2.

Таблица б. Влияние состава защитной среды наЯМР-релаксационные характеристики сухих препаратов вакцинного штамма^ Егап^ейа Ш1агету$

Защитная среда Срок хранения, суг Н,/Н2, % Т2, мкс Т,,мс КОЕ, 107мг Остаточная влажность^

Регламентная (с полиглюкином) 0 5,8Ю,7 64±6 389±10 2140±267 4,6Ю,1

47 8,5±0,3 75±3 244±19 2,1±1

Экспериментальная (с ПЭГ) 0 12,7±0,1 120±5 335±4 26691364 4.9±0,2

47 14,410,2 125±2 261±5 377±42

Таблица 7. Влияние соотношениямежду количеством клеточной массы и количеством защитных веществ наЯМР-релаксационныехарактеристики

Соотношение Срок хранения, сут Н]/Н2, % Т2, мкс Т,,мс КОЕ, 107мг Остаточная влажность,%

1:3,5 0 7,710,1 10312 48817 22001156 2,610,3

17 9,7Ю,2 9312 43519 522167

1:2 0 6,4Ю,4 10014 527124 18751134 2,610,4

17 7,210.1 10111 50713 932142

1:1 0 9,1Ю,3 9012 38217 16171264 6,ЗЮ,4

17 9,810,4 8912 32519 14,613,7

1:0,5 0 20,412,3 10914 261111 9481108 9,210,3

17 2313 11218 154132 <0,1

Таблица 8. Влияние отмывки кл сухих препаратов вакц еток на ЯМР-релаксационные характеристики инного штамма ЕгапшеПа Ш1агет1з

Отмывка Срок хранения, суг н,/н2, % Т2,мкс Т), мс КОЕ, 107мг Остаточная влажность,%

- 0 4,610,5 8017 444112 19251171 2,5

60 5,810,5 7815 408114 20018

+ 0 4,910,3 8518 53415 20621167 2,7

60 5,210,2 8812 493112 26916

У препаратов, содержащих отмытую биомассу, значения ^ более высокие (табл. 8). Поскольку поверхность отмытых клеток более доступна для молекул лактозы, входящих в состав ЗС, это приводит к образованию гораздо большего числа связей сахар - биополимер и более высокой общей жесткости системы.

Таким образом, числовые значения параметров ЯМР сухих биопрепаратов являются отражением всей истории их получения, начиная со стадии приготовления жидких образцов, заканчивая фасовкой и хранением готового продукта. Можно с уверенностью сказать, что подготовленные к

использованию или закладке на хранение препараты, имеющие невысокие значения Ti и повышенные значения Н1/Н2 и Тг, имеют либо высокую влажность, либо не соответствующий регламенту состав. Образцы с регламентной ЗС, обладающие такими характеристиками, могут иметь хорошую исходную активность, однако они наверняка будут плохо храниться, поскольку в них присутствуют молекулы, имеющие высокую подвижность. Наличие таких молекул в биопрепаратах необходимо исключить. Система связей в биопрепарате должна быть жесткой, а клетки микроорганизмов должны быть прочно зафиксированы в защитном матриксе.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый способ определения остаточной влажности сухих биоматериалов методом импульсного ЯМР. Он состоит в регистрации сигнала ССИ, определении соотношения амплитуд медленной и быстрой компонент этого сигнала в нулевой момент времени и нахождении влажности по калибровочному графику. Способ применен для определения остаточной влажности сухих препаратов клеток Saccharomyces cerevisiae и Francisella tularensis.

2. Методом ЯМР-релаксации определено количество прочносвязанной воды в сухих препаратах клеток, которое характеризует критический верхний уровень влажности препаратов. При влажности выше этого уровня в сухом материале обнаружено возрастание подвижности молекул, которое коррелирует с ухудшением сохраняемости биопрепаратов.

3. Выявлены ЯМР-релаксационные критерии качества сухих препаратов клеток. Наряду с физико-химическими и биологическими показателями, параметры T1 и Т2 рекомендуется использовать для оценки качества и прогнозирования сохраняемости биопрепаратов.

4. Установлена корреляция между логарифмом числа жизнеспособных бактерий в сухих препаратах клеток Е. coli, Francisella tularensis и временем спин-решеточной релаксации в процессе хранения. В интервале T1 от 200 до 500 мс эта связь носит линейный характер.

5. Экспериментально обнаружено возрастание влажности при длительном хранении лиофилизированных образцов в герметичной упаковке в условиях повышенной температуры.

6. Показано, что ЯМР-релаксационные характеристики сухих препаратов клеток зависят от степени отмывки клеточной биомассы, состава защитной среды, соотношения между количеством клеточной суспензии и защитных веществ в препарате, а также от измельчения сухого материала. Параметры ЯМР рекомендуется использовать для оптимизации технологического процесса приготовления биопрепаратов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Салтыкова Г.Н., Береснева ГГ., Сахаров Б.В., Исангалин Ф.Ш. Изучение состояния воды в зависимости от влагосодержания в некоторый модельных и клеточных образцах // Тез. докл. 2-ой итог, научи, конф. ВНИИПМ. - Серпухов, 1978. - Архив ВНИИПМ. - Инв. № 4. - С. 29-30.

2. Кобелев B.C., Салтыкова Г.Н., Новиков И.А., Сахаров Б.В., Иванников А.И., Авдеева О.С., Кашуба АА, Волков ВЛ. Изучение механизмов гибели лиофилизированных клеток Е. coli при хранении // Тез. докл. 5-ой итог, научн. конф. ВНИИПМ. - Серпухов, 1980. - Архив ВНИИПМ - Инв. №67.-С. 90-92.

3. Сахаров Б.В., Салтыкова Г.Н., Кобелев B.C., Волков В.Я. Изучение состояния воды в лиофильно-высушенных клетках Е. coli К-12 методом ЯМР-релаксации // Магнитный резонанс в биологии и медицине. Тез. докл. П Всес. симп. - М, 1981. - С. 65.

4. Авдеева О.С., Салтыкова ГЛ., Кобелев B.C., Волков ВЛ. Изучение методом ЭПР природы повреждений, возникающих в клетках Е. coli K-12 в процессе лиофилизации и последующего хранения // Магнитный резонанс в биологии и медицине. Тез. докл. П Всес. симп.- М., 1981. - С. 68-69.

5. Федюкина Г.Н., Щепкин В.Д., Куракина А.А., Волков ВЛ. Свойства системы биополимер-дисахарид в условиях ограниченной влажности по данным ЯМР // Тез. докл. VI Всес. конф. по спектроскопии биополимеров. - Харьков: Изд-во ФТИНТ АН УССР, 1988. - С. 308.

6. Щепкин В.Д., Волков ВЛ., Руденко Ю Г., Федюкина Г.Н., Иванников А.И. Способ определения остаточной влажности в сухих веществах импульсным методом ядерного магнитного резонанса. Авторское свидетельство № 1497538. // Бюлл. Изобретений. 1989. - № 28. - С.196.

7. Щепкин В.Д., Волков ВЛ., Федюкина Г.Н. Особенности измерения влагосодержания в сухих биопрепаратах методом импульсного ЯМР // Методы магнитной радиоспектроскопии в биотехнологии: Тез. докл. отрасл. совещ. - Оболенск, 1990. - С. 6-7.

8. Волков ВЛ., Сахаров Б.В., Щепкин В.Д., Федюкина Г.Н., Кашуба А.А. О природе устойчивости клеток дрожжей к высушиванию // Микробиология. - 1992. - Т. 61. - № 2. - С. 214-222.

Volkov V.Ya., Sakharov B.V., Schepkin V.D., Fedyukina G.N., Kashuba A.A. On the nature of yeast cells resistance to drying // Microbiology. - 1992. - V. 61.-№2.-P. 137-144.

9. VI.Ya Volkov, Boris V. Sakharov, Lilija A Volkova, Galina N. Fedjukina, Baturalq R. Arslan, Selcen A. Arslan. Radiospectroscopy methods in biotechnology // Karadeniz TIP DERGISI. - 1995. - V. 8. - № 4. - P. 200.

10. Волков ВЛ., Сахаров Б.В., Федюкина Г.Н. Изучение структурных свойств водно-карбогидратных систем методом ЯМР-релаксации // Структура и динамика молекулярных систем: Тез. докл. Ш Всеросс. конф. - Казань, 1996.-С. 38.

11. Волков В Л., Сахаров Б.В., Федюкина ГЛ. Исследование молекулярной подвижности Сахаров с защитными свойствами методом ЯМР-релаксации // Магнитный резонанс в химии и биологии: Тез. докл. IX конф. - Москва, 1996.-С. 27.

12. Федюкина Г.Н., Волков В.Я. Свойства системы биополимер-дисахарид в условиях ограниченной влажности по данным ЯМР // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: Тез. докл. юбил. научн. конф. - Оболенск, 1999. - С. 264-265.

13. Федюкина Г.Н., Волков В.Я., Шепелин А.П. Изучение процесса гидратации системы белок - дисахарид методом ЯМР-релаксации // Проблемы биологической и экологической безопасности: Тез. докл. Междунар. научн. конф. - Оболенск, 2000. - С. 437-438.

Fedjukina G.N., Volkov V.Ya., Shepelin A.P. Study ofalbumen-disaccharide system hydration process by NMR-relaxation method // Problems of biological and ecological safety: Int. conf - Obolensk, 2000. - P. 438-439.

»16427

ЗаказР7._Объем 1.0 и. л._Тираж 100 экз.

Издательский центр РХТУ им. Д. И. Менделеева