Оценка адгезивных свойств штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов

Ивонин, Алексей Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка адгезивных свойств штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оценка адгезивных свойств штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов"

На правах рукописи

ИВОНИН АЛЕКСЕЙ ГЕННАДЬЕВИЧ

ОЦЕНКА АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ ШТАММА YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ НА МОДЕЛИ ЭРИТРОЦИТОВ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 АПР 2919

Казань 2010

004600118

Работа выполнена на кафедре морфологии и микробиологии ФГОУ ВПО «Вятская государственная сельскохозяйственная академия»

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Романов Владимир Евдокимович

доктор медицинских наук, профессор Погорельский Иван Петрович

кандидат биологических наук, доцент Вершинина Валентина Ивановна

ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства Обороны РФ», г. Киров

Защита диссертации состоится «29» апреля 2010 г. в / часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке имени Н.И. Лобачевского при Казанском государственном университете.

Автореферат разослан «2^» 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Чума является зооантропонозным инфекционным заболеванием бактериальной природы, характеризующимся контагиозностью, тяжелым течением и высокой летальностью (Смирнова, Кутырев, 2006; Трухачев, Лебедев, 2006). Став в прошлом причиной гибели миллионов людей, упадка государств и цивилизаций, чума и на сегодняшний день сохраняет высокий эпидемический потенциал (Анисимов, 2002; Кутырев, 2008). Реальную угрозу появления вспышек болезни в современном мире создает активизация природных и антропургических очагов чумы, занимающих значительные территории, усиление миграционных процессов, а также возможность использования возбудителя (Yersinia pestis) биотеррористами (Lippi, Conti, 2002; Riedel, 2005; Попов с соавт., 2007).

В последние годы достигнуты значительные успехи в исследовании физиологических и биохимических особенностей чумного микроба, обуславливающих его патогенность. Достаточно полно охарактеризованы факторы агрессии Y. pestis, подавляющие защитные реакции хозяина и обеспечивающие выживание популяции в условиях макроорганизма (Viboud, Bliska, 2005; Knire! et al., 2006; Афанасьева с соавт., 2008). В то же время слабо освещенными остаются вопросы, касающиеся адгезивной способности чумных бактерий в отношении эукариотических клеток (Huang, Lindler, 2004; Liu et al., 2006).

По современным представлениям, адгезия возбудителя играет ключевую роль в развитии любого инфекционного процесса, во многом определяя его начало, характер и течение (Boyle, Finlay, 2003; Labbate et al., 2007). В микробной клетке функцию распознавания и связывания с клетками-мишенями выполняют поверхностные субстанции, так называемые адгезины, которые могут быть представлены белками наружной мембраны, а также специализированными органеллами - пилями (Сидоренко, 2001; Мавзютов с соавт., 2007). Структуры, подобные пилям ряда прокариот, выявлены и у чумных бактерий (Lindler, Tall, 1993). Установлено, что клетки Y. pestis обладают способностью прикрепляться к искусственным поверхностям (Дятлов с соавт., 1991) и культивируемым эпителиальным клеткам дыхательного тракта человека (Thomas, Brooks, 2004; Бахтеева, 2008). Однако эти сведения не позволяют оценивать адгезивный потенциал возбудителя чумы в полной мере.

Анализ литературы (Поспелова с соавт., 1998; Телесманич с соавт., 2004; Зайцева, Сомов, 2006) свидетельствует о том, что универсальной моделью для исследования адгезии бактерий являются эритроциты, что связано с присутствием на их поверхности гликофорина, идентичного гликокаликсу эпителиоцитов, на котором расположены рецепторы для микроорганизмов. Исходя из этого, изучение возможности применения эритроцитов при оценке адгезивных свойств чумного микроба является весьма актуальным. Кроме того, учитывая присутствие патогена в кровеносном русле на стадии бактериемии (Perry, Fetherson, 1997; Анисимов, 2002), определение характера

взаимодействия Y. pestis с эритроцитами как самыми многочисленными форменными элементами крови представляет самостоятельный интерес.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось определение адгезивных свойств штамма Yersinia pestis EV НЙИЭГ в тесте in vitro с использованием эритроцитов в качестве клеток-мишеней.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Определить возможность оценки адгезивной активности штамма Y. pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов человека традиционными методами.

2. Разработать метод оценки связывания клеток Y. pestis EV НИИЭГ с эритроцитами человека при помощи фотоколориметрии.

3. Определить влияние условий выращивания бактерий Y. pestis EV НИИЭГ и физиологического состояния микробных клеток на их адгезивные свойства.

4. Оценить адгезию бактерий Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам людей с различными группами крови по системам ABO и Rh, а также к эритроцитам разных видов лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных.

5. Исследовать влияние антибиотиков, а также плазмы и сыворотки крови на проявление клетками Г. pestis EV НИИЭГ адгезивной активности в отношении эритроцитов человека.

Научная новизна. Впервые для оценки адгезивного потенциала чумного микроба на модели эритроцитов предложен фотоколориметрический метод (патент РФ на изобретение №2360969 «Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов» от 06.11.2007 г.).

Впервые осуществлена комплексная оценка влияния режима культивирования и физиологического состояния клеток Y. pestis EV НИИЭГ на их способность прикрепляться к эритроцитам. Проведено сопоставление адгезивных, гидрофобных и гемагглютинирующих свойств культур чумного микроба, выращенных в различных условиях.

Выявлено, что уровень адгезии бактерий Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека не зависит от группы крови донора по системам ABO и Rh, но в то же время зависит от индивидуальных особенностей эритроцитов. Впервые установлены существенные различия в способности чумного микроба прикрепляться к эритроцитам разных видов млекопитающих.

Показано отсутствие влияния терапевтических и субтерапевтических концентраций антибиотиков (гентамицина, доксициклина, цефотаксима и ампициллина) на адгезию клеток Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека. В то же время обнаружено, что плазма и сыворотка крови человека, а также их отдельные белковые компоненты обладают выраженными антиадгезивными свойствами в отношении чумных бактерий.

Практическая значимость работы.

Полученные в работе результаты вносят значительный вклад в раскрытие феномена адгезивной активности чумного микроба, и как следствие, способствуют пониманию основ его патогенности.

Предложен информативный и доступный для практического применения метод определения адгезивной способности бактерий Y. pestis на модели эритроцитов при помощи фотоколориметрии. Метод может быть использован для изучения механизмов, участвующих в прикреплении патогена к клеткам хозяина, и поиска соединений, способных блокировать данный процесс. Кроме того, разработанный фотоколориметрический метод может найти применение при оценке адгезивных свойств других микроорганизмов бактериальной природы.

Декларация личного участия автора. Экспериментальные исследования выполнялись лично автором или при его непосредственном участии в составе научной группы, возглавляемой к.м.н., доцентом В.А. Обориным. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный фотоколориметрический метод регистрации прикрепления бактерий У. pestis к эритроцитам в условиях in vitro позволяет оценивать адгезивные свойства чумного микроба.

2. Экспрессия бактериями Y. pestis EV НИИЭГ факторов адгезии в значительной степени зависит от состава питательной среды и температуры выращивания микробной культуры. Оптимальная по составу питательная среда обеспечивает стабильность адгезивной активности микробных клеток как в ходе пассажей in vitro, так и после лиофильного высушивания.

3. Внутривидовые и межвидовые различия в устойчивости эритроцитов к прикреплению бактерий У. pestis EV НИИЭГ свидетельствуют о роли рецепторных структур клеток-мишеней в реализации чумным микробом адгезивной способности.

4. Сыворотка (плазма) крови человека, а также её отдельные компоненты препятствуют проявлению клетками Y. pestis EV НИИЭГ адгезивных свойств в отношении эритроцитов.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на научно-практической конференции и школе по инфекционной патологии (с международным участием) (Москва, 2007), международной конференции «Международное сотрудничество и развитие биотехнологии в Кировской области» (Киров, 2008), 8-й научной конференции аспирантов и соискателей «Науке нового века - знания молодых» (Киров 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Достижения ветеринарной науки и практики» (Киров, 2008), Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора П.Г. Петского «Современные научные тенденции в животноводстве» (Киров, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен ] патент РФ на изобретение.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н., профессору В.Е. Романову, к.м.н., доценту В.А. Оборину за формирование научной концепции работы и методические консультации при её выполнении, а также аспирантам кафедры микробиологии ГОУ ВПО «ВятГУ» О.В. Вылегжаниной и Ф.И. Лянгасовой за помощь при проведении экспериментальных исследований.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 221 источников, в том числе 112 зарубежных. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками и 12 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Основным объектом исследований являлся штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, выделенный из чумной живой сухой вакцины (ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ», г. Киров). Также в работе использовали штамм Escherichia coli M-17, выделенный из пробиотического препарата «Колибактерин» (ОАО «Микроген, г. Москва), штамм Bifidobacterium bifidum №1, выделенный из пробиотика «Бифидумбактерин» (ОАО «Микроген», г. Москва), производственный штамм Lactobacillus plantarum Р4, полученный в ОАО «Агровет» (г. Москва), клинические штаммы Escherichia coli серогрупп 086, 0112, 0124, 0142, 0144 и 0152, полученные из бактериологической лаборатории госпиталя в/ч 1407, а также музейные штаммы Е. coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Staphylococcus epidermidis, S. saprophyticus, Serratia marcescens и Klebsiella pneumoniae из коллекции кафедры морфологии и микробиологии ФГОУ ВПО Вятская ГСХА.

Для выращивания клеток Y. pestis EV НИИЭГ применяли плотную питательную среду на основе гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар) (рН 7,2), мясо-пептонный агар (МПА) (рН 7,2) и агар Хоттингера (АХ) (рН 7,2). В ряде экспериментов в питательные среды вносили дополнительные ингридиенты: сульфит натрия (1:30000) и генцианвиолет (ГВ) (1:100000). Микробную культуру выращивали при температуре (28±1)°С в течение 48 часов. Клинические и музейные штаммы культивировали на ГРМ-агаре (рН 7,2) при температуре (37±1)°С в течение 24 часов. Пробиотические штаммы (лиофилизированные культуры) использовали в работе без предварительного подращивания на питательной среде.

Материалом для получения эритроцитов служила венозная кровь клинически здоровых людей и животных. Пробы крови людей получали из ФГЛУ «Кировская областная станция переливания крови», пробы крови животных - из вивария ФГОУ ВПО Вятская ГСХА (белые мыши), питомника ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ» (белые крысы, морские свинки, золотистые хомячки), ФГУ «Кировская областная станция по борьбе с болезнями животных» (собаки, кошки), ветеринарной клиники и лаборатории коневодства

ФГОУ ВПО Вятская ГСХА (коровы, лошади), ОАО «Кировский мясокомбинат» (свиньи), хозяйств частного сектора Кировской области (бараны). В качестве антикоагулянтов использовали 3,8% раствор натрия цитрата (1:10) или гепарин (3,0 ЕД/мл крови). Не позднее 24 часов после взятия крови эритроциты трижды отмывали десятикратным объемом стерильного 0,9% раствора хлорида натрия (рН 7,2) путём центрифугирования при 300 % в течение 10 мин, после чего суспендировали в этом же растворе.

Танизированные эритроциты готовили по методике, описанной Бондаренко с соавторами (Бондаренко с соавт., 1987), формалинизированные эритроциты - по методике Колгановой (Колганова, 2003).

Для получения нативной человеческой сыворотки кровь от донора брали в стерильную пробирку без антикоагулянта. Пробирку с кровью выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С в течение 1 часа, а затем помещали в холодильник с температурой (4±2)°С на 24 часа. По истечению этого срока сгусток свернувшейся крови удаляли и центрифугировали первичную сыворотку при 300 g в течение 10 мин. Отобранную надосадочную жидкость (вторичную сыворотку) использовали в работе. Для получения человеческой плазмы гепаринизированную кровь, взятую в пробирку, центрифугировали при 300 § в течение 10 мин, после чего отбирали жидкость над осадком.

Адгезивную способность бактерий определяли при помощи методов Брилис с соавторами (Брилис с соавт., 1986) и Гизатулиной с соавторами (Гизатулина с соавт., 1991).

При оценке адгезии методом Брилис использовали суспензию бактерий в концентрации 1,0><109/мл в 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2) и суспензию эритроцитов человека 0(1) КЬ+ группы крови в концентрации 1,0х108/мл. В пробирках смешивали по 0,5 мл суспензий микробных клеток и эритроцитов. Смесь инкубировали на встряхивателе при температуре (37±1)°С в течение 30 минут. После на предметных стеклах готовили мазки, которые фиксировали смесью Никифорова, окрашивали по Граму и исследовали в иммерсионной системе микроскопа. Адгезивные свойства оценивали по индексу адгезивности микроорганизма (ИАМ) - среднему количеству бактерий на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците.

При использовании метода Гизатулиной на изолированные микробные колонии, выращенные на плотной питательной среде в чашках Петри, наносили суспензию эритроцитов человека 0(1) Ши- группы крови в концентрации 0,5* 108/мл. Через 3 мин чашки просматривали под малым увеличением микроскопа и подсчитывали колонии микроорганизмов, вокруг которых образовывался ореол из эритроцитов. Такие колонии считали адгезивно-активными, их количество выражали в процентах.

Гидрофобность бактерий определяли по степени их адсорбции на поверхности капель хлороформа (Серебрякова с соавт., 2002).

Определение гемагглютинирующей активности бактерий проводили по методике, изложенной Ломовым с соавторами (Ломов с соавт., 2007).

Для трипсинизации бактерий применяли метод, описанный Грабовской и Тотоляном (Грабовская, Тотолян, 1977).

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с помощью пакета программ «Excel 2003» и программы «Biostat» версии 4.03., вычисляя значение средней величины (М) и стандартную ошибку средней (т). Достоверность различий между группами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Исследование взаимосвязи между отдельными показателями проводили с применением корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка адгезивных свойств штамма Y. pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов традиционными методами

На первом этапе исследований нами было проведено определение адгезивной активности бактерий Y. pestis EV НИИЭГ методами Брилис и Гизатулиной. Согласно результатам оценки адгезии методом микробные клетки обладали выраженной способностью связываться с эритроцитами человека (ИАМ составлял 7,4±1,3). В то же время при использовании методики Гизатулиной колоний чумного микроба, обладающих адгезивной активностью, мы не выявили. Результаты определения адгезивных свойств клинических и музейных штаммов микроорганизмов подтверждали отсутствие сопоставимости между показателями, полученными при помощи данных методов.

Тем не менее, метод Брилис давал возможность оценивать микроскопическую картину прикрепления бактерий к эритроцитам (рис. 1 А), тогда как метод Гизатулиной позволял наблюдать лишь взаимодействие эритроцитов с микробными колониями, выращенными на плотной питательной среде (рис. 1 Б).

А Б

Рисунок 1. (А) - Взаимодействие бактерий У. реЕУ НИИЭГ с эритроцитами человека (увеличение * 1000); (Б) - Взаимодействие эритроцитов человека с колонией У. pestis ЕУ НИИЭГ (увеличение х 80)

Поэтому учитывали результаты, полученные только методом Брилис, согласно которым штамм У. резИя EV НИИЭГ характеризовался высокой

адгезивностью, превышающей аналогичную способность прочих исследованных штаммов в 2,0-4,8 раза. Однако и данный метод обладал существенными недостатками, к которым относилась трудоемкость подсчета адгезированных бактерий, а также сложность интерпретации картины адгезии в связи с невозможностью дифференцировать микробные клетки, прикрепившиеся к эритроцитам и расположенные на их фоне. Это свидетельствовало о необходимости разработки нового подхода для выявления адгезивных свойств бактерий в тесте с эритроцитами.

2. Разработка фотоколориметрического метода оценки адгезивных свойств штамма К рез& ЕУ НИИЭГ на модели эритроцитов человека

Для определения адгезивной способности клеток чумного микроба нами был предложен метод, базирующийся на фотоколориметрической оценке степени связывания бактерий с эритроцитами после их совместной инкубации и последующей седиментации эритроцитов путем центрифугирования.

При выявлении возможности регистрации адгезии предложенным методом использовали культуру У. ЕУ НИИЭГ I генерации, выращенную на ГРМ-агаре с ГВ. В качестве сравнения применяли музейный штамм 5. ер1с1етпсИ5 (неадгезивный микроорганизм). Микробные клетки суспендировали в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2). Конечная концентрация бактерий в суспензии соответствовала 1,0 единице оптической плотности (ОП) при длине волны проходящего света 540 нм и длине оптического пути кюветы 5 мм. Для соблюдения стандартных условий на данном этапе экспериментов применяли эритроциты только одного донора 0(1) Ш1+ группы крови.

В пробирки вносили по 2,5 мл суспензии микробных клеток и 1,0 мл суспензии эритроцитов в концентрации 0,1х109/мл. Контролем служили пробы, содержащие; 2,5 мл суспензии микробных клеток и 1,0 мл 0,9% раствора хлорида натрия (рН 7,2) (контрольная проба №1); 1,0 мл суспензии эритроцитов и 2,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия (рН 7,2) (контрольная проба №2). Опытные и контрольные пробы инкубировали при температуре (37±1)°С на вращающейся платформе в течение 30 мин, а затем центрифугировали при 80 § в течение 1,5 мин для осаждения эритроцитов. После этого из проб отбирали надосадочную жидкость в объёме 2,0 мл и измеряли её ОП.

Уровень адгезии рассчитывали по видоизмененной нами формуле определения гидрофобных свойств микробных клеток:

ПА = (Дк1 + Лз - Доп) / Дк1 х 100%,

где ПА - показатель адгезии, ДК1 - ОП надосадочной жидкости в контрольной пробе №1, Дй ~ ОП надосадочной жидкости в контрольной пробе №2, До„ - ОП надосадочной жидкости в опытной пробе.

Для штамма У. райи ЕУ НИИЭГ величина ПА составила 26,5±3,6%, что свидетельствовало о прикреплении к эритроцитам соответствующего процента микробных клеток. Близкое к нулю значение ПА штамма 5. ер1с1егт1сИ5 (1,2±1,1%) указывало на отсутствие у него адгезивной активности. Микроскопические

исследования осадка из опытных проб после центрифугирования подтверждали результаты фотоколориметрической оценки адгезии.

В ходе экспериментов установили, что увеличение концентрации эритроцитов в реакционной смеси приводило к существенному повышению ПА культуры У. реЕУ НИИЭГ и не влияло на регистрируемый уровень адгезии культуры 5. ер1с1егт1сИ8 (рис. 2). Вместе с тем при использовании суспензии эритроцитов в концентрации 2,0х109/мл величина ПА вакцинного штамма чумного микроба приближалась к 100%, что свидетельствовало о прикреплении к эритроцитам практически всех бактерий, находящихся в суспензии. Для проведения дальнейших исследований выбрали концентрацию эритроцитов 1,0х 109/мл. При этом ПА клеток У. реяШ ЕУ НИИЭГ был достаточно высоким -на уровне 80%, но в то же время в пробах оставались бактерии, не связанные с эритроцитами (около 20% от общего количества).

100 -I

£ 90

(Г 70 -;

60 ■

50 :

40 -

30 -

20 J

10 -I

о 4-

aire Щ

If J

л'; f]' '¿к /

0,1

0,25

0,5

Концентрация эритроцитов, хЮ /мл

□ Y.pestis EV НИИЭГ ■ S.epidermidis

Рисунок 2. Показатель адгезии бактерий Y. pestis EV НИИЭГ и Staph, epidermidis к эритроцитам человека в зависимости от концентрации эритроцитов

В дальнейшем при использовании культуры Y. pestis EV НИИЭГ, а также пробиотических, клинических и музейных культур микроорганизмов, нами была показана сопоставимость показателей адгезии, получаемых фотоколориметрическим методом и методом Брилис. Однако применение фотоколориметрии для исследования адгезивных свойств бактерий обладало значительным преимуществом. Предложенный нами метод являлся менее трудоемким, а также давал возможность определять процент микробных клеток, фиксированных к поверхности эритроцитов, одномоментно оценивая взаимодействие миллионов бактерий и клеток макроорганизма. Данные, получаемые с его помощью, отличались объективностью, так как основывались на показаниях прибора.

Следующий этап работы был посвящен выбору оптимальных и стандартных условий для оценки адгезивных свойств бактерий Y. pestis EV НИИЭГ фотоколориметрическим методом. При определении влияния

продолжительности инкубации проб на уровень адгезии установили, что ПА достигал максимального значения (около 80%) уже после 5-минутной экспозиции микробных клеток с эритроцитами. Варьирование температурой, а также использование для инкубации проб вращающейся платформы не влияло на интенсивность адгезивного процесса (рис. 3). Это свидетельствовало о достаточно высокой функциональной активности адгезинов чумного микроба, проявляемой в отношении рецепторов эритроцитов человека, и отсутствии влияния на неё температурного фактора в изученном диапазоне. Учитывая полученные результаты, в последующих экспериментах пробы инкубировали в статических условиях при температуре (20±1)°С в течение 5 мин.

НИ—3

- Статические условия, температура (20±1)°С

Статические условия, температура (37±1)°С

- Вращаюиряся платформа, температура (37±1)°С

10 20 30 40

Продолжительность инкубации, мин

Рисунок 3. Показатель адгезии бактерий У. рез-Ия ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека при различных условиях инкубации проб

При оценке влияния кислотности инкубационной среды на характер межклеточного взаимодействия выявили, что наибольшую адгезивную активность бактерии У. ЕУ НИИЭГ проявляли при значении рН, близком к нейтральному (рис. 4). Смещение величины рН среды инкубации как в кислую, так и в щелочную сторону приводило к снижению ПА.

юо -

80 -60

40 -I 20 ]

0 4-

4,2

5,2

Й-

* '

1рр

7 ¡ж*

ЙЙ

6,2 7,2

9,2

Рисунок 4. Показатель адгезии бактерий

У. реэШ ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека в зависимости от величины рН инкубационной средь/

рН среды инкубации

Оценка влияния хранения культуры У. ре.г/й ЕУ НИИЭГ на её адгезивные свойства показала, что бактерии, находящиеся в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2) при температуре (4±2)°С до 21 суток, сохраняли свою способность к адгезии. Вместе с тем при более длительном хранении микробной культуры регистрировали четырехкратное снижение адгезивной

активности штамма. Это связывали с образованием бактериями конгломератов, которые обнаруживались при световой микроскопии. По-видимому, агрегация микробных клеток уменьшала возможность отдельных бактерий прикрепляться к эритроцитам.

При исследовании зависимости уровня адгезии от срока хранения эритроцитов было установлено, что величина ПА бактерий У. резНэ ЕУ НИИЭГ в отношении эритроцитов, находившихся в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2) при температуре (4±2)°С до 5 суток, статистически значимо не отличался от таковой в отношении свежих эритроцитов. В то же время при инкубации бактерий с эритроцитами, хранившимися более длительный период, в пробах обнаруживался гемолиз, вследствие чего фотоколориметрическая оценка адгезии становилась невозможной. Применение для хранения эритроцитов 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2), 0,05 М трис-НС] буфера (рН 7,2) и гемоконсервантов - «Глюгицира» и СРОА-1, не имело преимуществ перед 0,9% раствором хлорида натрия (рН 7,2).

Учитывая короткий срок хранения нативных эритроцитов, изучили возможность использования в качестве субстрата адгезии эритроцитов, обработанных формалином и танином. Однако степень адгезии бактерий к формалинизированным эритроцитам снижалась в 14,7 раза, к танизираванньгм эритроцитам - в 2,1 раза, по сравнению с интактными клетками-мишенями. Исходя из этого, в дальнейших экспериментах обработку эритроцитов формалином и танином не проводили.

Для оценки воспроизводимости данных, получаемых фотоколориметрическим методом, определяли ПА клеток У. ре$йь ЕУ НИИЭГ по отношению к свежим эритроцитам одного и того же донора в серии опытов, проводимых с интервалами в 10 дней. Параллельно, пользуясь методом Бри лис, определяли величину ИАМ вакцинного штамма (табл. 1).

Таблица 1

Показатели адгезии бактерий У. реяШ ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека, полученные в опытах с интервалами в 10 дней (М±т; п=5)__

Показатели Значения показателей в опыте №...

1 2 3 4 5 6 7

ПА, % 75,6±4,5 77,6±2,3 73,2±5,3 82,6±2,6 70,8±6,7 79,3±4,1 75,0±1,6

ИАМ 6,6±1,4 3,0±0,5* 8,1±2,0 3,1±0,4* 11,8±1,6* 7,8±2,4 7,9±1,8

Примечание: *Р<0,05 - различия статистически достоверны по сравнению с аналогичным показателем в опыте №1.

Значения ПА в повторных опытах статистически значимо не отличались от ПА в опыте №1. В то же время величина ИАМ в опытах №№2 и 4 была достоверно ниже, а в опыте № 5 - достоверно выше, чем в опыте №1. Следовательно, разработанный нами метод позволял, в отличие от методики Брилис, получать воспроизводимые результаты.

Таким образом, нами были отработаны оптимальные и стандартные условия для определения адгезивной активности штамма У. ре.у/ду ЕУ НИИЭГ

на модели эритроцитов человека при помощи фотоколориметрии. Характеристика этих условий была следующей: а) применение суспензии бактерий в концентрации, соответствующей 1,0 единице ОП, в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2); б) применение суспензии нативных эритроцитов человека 0(1) Rh+ группы крови в концентрации 1,0х109/мл в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2); в) инкубация проб в статических условиях при температуре (20±1)°С в течение 5 мин. При проведении исследований допускалось хранение суспензии бактерий при температуре (4±2)°С до 21 суток, суспензии эритроцитов в аналогичных условиях - до 5 суток. В последующих экспериментах оценку адгезивных свойств штамма проводили, пользуясь разработанным нами методом.

Полученные результаты, свидетельствующие о выраженной способности чумного микроба прикрепляться к эритроцитам, позволяли предположить о присутствии феномена адгезии У. pestis к красным клеткам крови в условиях макроорганизма. Известно, что чумные бактерии способны проникать внутрь эритроцитов как in vitro, так и in vivo, и использовать НЬ в качестве универсального источника железа и порфиринов, необходимых для нормальной жизнедеятельности микробной клетки и синтеза ДНК (Федорова, Девдариани, 2007). На наш взгляд, адгезия может являться начальной стадией подобного межклеточного взаимодействия, предшествующей инвазии.

3. Исследование влияния условий культивирования бактерий Y. pestis EV НИИЭГ и физиологического состояния микробной культуры на адгезивные свойства штамма

Ранее было установлено, что продукция чумным микробом факторов адгезии зависит от целого ряда условий выращивания бактерий (Lindler et al., 1990; Liu et al., 2006). Это нашло подтверждение и в наших исследованиях. Проведенные эксперименты показали, что на степень связывания клеток Y. pestis EV НИИЭГ с эритроцитами человека значительное влияние оказывал состав питательной среды для культивирования бактерий (табл. 2).

Таблица 2

Показатель адгезии бактерий У. ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека в зависимости от состава питательной среды (М±гп; п=5)_

Дополнительные ингредиенты в составе среды ПА микробных клеток, выращенных на питательной среде...,%

МПА ГРМ-агар АХ

Отсутствуют 35,2±2,9 53,1±6,0* 58,8±4,8**

Na2S03 27,7±3,5 68,4±2,6***'* 74,6±1,8***/*

ГВ 32,9±3,0 78,8±4,2***'** 76,8±3,3***'*

Na2S03+rB 39,6±5,3 73,5±2,7***'* 75,0±2,3***'*

Примечание: *Р<0,05; **Р<0,01 *** Р<0,001 - различия статистически достоверны по сравнению с уровнем адгезии бактерий, выращенных на МПА с соответствующими дополнительными ингридиентами; *Р<0,05; **Р<0,01 -

различия статистически достоверны по сравнению с уровнем адгезии бактерий, выращенных на соответствующей питательной среде без дополнительных ингридиентов.

Показатель адгезии микробных культур, выращенных на ГРМ-агаре и АХ, в 1,51-2,47 раза превышал аналогичный показатель культур, выращенных на МПА. При этом включение в состав МПА сульфита натрия и ГВ не влияло на способность бактерий к адгезии, в то время как их добавление в ГРМ-агар и АХ приводило к повышению адгезивности штамма в 1,26-1,48 раза.

Поскольку при культивировании бактерий на АХ и ГРМ-агаре с ГВ и сульфитом натрия в равной мере наблюдался высокий уровень экспрессии адгезинов, эти среды были использованы нами для дальнейшего изучения способности бактерий к адгезии.

Помимо состава среды выращивания адгезивные свойства штамма У реэШ ЕУ НИИЭГ зависели от температуры выращивания бактерий и, в некоторой степени, от возраста микробной культуры (рис. 5).

□ (20±1)°С ■ (28±1)°С S (37±1 )°С

24 48 72

Возраст микробной культуры, час

Рисунок 5. Показатель адгезии штамма У. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека в зависимости от температуры выращивания бактерий и возраста микробной культуры

В наибольшей степени адгезивный потенциал штамма проявлялся при культивировании бактерий при температуре (28±1)°С. Для 24- и 48-часовой культур микроорганизмов, выращенных в данных условиях, ПА составлял 80,5% и 78,1% соответственно, а у 72-часовой культуры снижался до 66,2%. Для бактерий, выращенных при температуре (18±1)°С, значения ПА варьировали от 58,6% до 62,1%, при температуре (37±1)°С - от 13,5% до 18,1%, при этом возраст микробных культур не оказывал значительного влияния на их адгезивную активность. Потенциальный адгезин чумного микроба (белок PsaA) экспрессируется только в диапазоне температур 35...41°С и кислых условиях среды (Yang, Iseberg, 1997). Полученные нами результаты, показывающие высокую адгезивную активность клеток У. pestis EV НИИЭГ, выращенных при относительно низких температурах и нейтральном pH, позволяли предположить о наличии у чумных бактерий, вероятно, и других факторов адгезии.

Многократное пассирование микробной культуры на среде культивирования не влияло на способность микробных клеток связываться с эритроцитами (рис. 7), что свидетельствовало о сохранении адгезивных свойств у различных генераций чумного микроба при культивировании его в условиях, благоприятных для продукции адгезинов.

80 п

гЬ

-in

г£~1

Количество пассажей

Ffe

Рисунок 7. Показатель адгезии бактерий У. резИз ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека после различного количества пассажей микробной культуры на питательной среде

При сравнении уровня адгезии культуры бактерий У. pestis EV НИИЭГ, выращенной на питательной среде, и культуры, полученной в результате разведения чумной живой сухой вакцины 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,2), статистически значимых различий не выявили. Следовательно, лиофилизация микробных клеток, осуществляемая в процессе производства вакцины, не приводила к изменению адгезивной активности штамма.

4. Взаимосвязь адгезивной активности и гидрофобности бактерий К pestis EV НИИЭГ

Для выяснения механизмов, участвующих в адгезии, определяли гидрофобные свойства поверхности бактерий У. pestis EV НИИЭГ, выращенных в различных условиях. Считается, что уровень гидратации внешней мембраны клеточной стенки имеет немаловажное значение во взаимодействии микроорганизмов с эукариотическими клетками на их начальном этапе, а бактерии с выраженными гидрофобными свойствами способны проявлять высокую адгезивность (Pan et al., 2006; Дмитриева с соавт., 2007). Проведенные исследования показали, что гидрофобность микробных культур коррелировала с уровнем адгезии (г=0,87). Это позволило сделать предположение о значимости гидрофобных взаимодействий в процессе прикрепления чумного микроба к эритроцитам.

5. Сравнение адгезивных и гемагглютинирующих свойств бактерий

У. pestis EV НИИЭГ

Далее нами было проведено сравнение адгезивной и гемагглютннирующей активности бактерий исследуемого штамма. Известно, что для целого ряда микроорганизмов способность вызывать склеивание эритроцитов имеет прямую связь с адгезивной активностью (Макаренкова с соавт., 1999; Харсеева с соавт., 2009). В связи с этим реакция гемагглютинации (РГА) часто используется как полу количественный тест для обнаружения у бактерий факторов связывания с эукариотическими клетками. В наших экспериментах гемагглютинирующие свойства бактерий У pestis EV НИИЭГ

проявлялись независимо от их адгезивности, проявляемой в отношении эритроцитов человека (табл. 3).

Таблица 3

Показатели, характеризующие адгезивные (ПА, %) и гемагглюти-нирующие (средний титр РГА) свойства культур У. рауГы ЕУ НИИЭГ, выращенных при различной температуре (М±ш; п=5)__

Показатели Температура выращивания микробной культуры ..., °С

20±1 28±1 37±1

ПА, % 58,6±1,0 78,1±3,0 15,4±1,9

Средний титр РГА 1:89,6±23,5 1:224,0±85,9 1:243,2±76,8

Таким образом, РГА не позволяла раскрывать адгезивную способность клеток Y. pestis EV НИИЭГ. Очевидно, что в этом плане преимуществами обладала предложенная нами модель.

6. Оценка влияния трипсина и высокой температуры на адгезивную способность бактерий F. pestis EV НИИЭГ

По современным представлениям, адгезины являются поверхностными белками или гликопротеидами бактериальной клетки (Kiemm, Schembri, 2000; Dubreuil et al., 2002). Идентифицированные к настоящему времени факторы адгезии чумного микроба, опосредующие его прикрепление к эпителиоцитам, также представляют собой белки (Makoveichuk et al., 2003; Galvan et al, 2007). С целью установления природы компонентов клеток У. pestis EV НИИЭГ, ответственных за связывание с эритроцитами, проводили обработку микробной культуры трипсином, а также её прогревание при температуре (56±1)°С.

При обработке бактерий трипсином в течение 10-30 мин величина ПА снижалась в 2,4-4,5 раза, при прогревании микробной суспензии в течение 1-3 часов - в 1,3-1,9 раза, по сравнению с интактными бактериями (рис. 8). Полученные данные свидетельствовали о белковой природе структур микробных клеток, обеспечивающих реализацию адгезивной функции в отношении эритроцитов.

80 <60 40 -20 О

И н

Контроль 1 2 3

Продолжительность обработки, час

<60

40 20 0

1 * Ú

;§Й1

ШЯ

Контроль 10 20 30

Продолжительность прогревания, мин

Рисунок 8. Показатель адгезии бактерий У. резИэ ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека после обработки микробных клеток трипсином (А) и прогревания микробной суспензии при температуре (56±1)°С (Б)

Тем не менее, после ферментативной и температурной обработки штамм сохранял определенную долю адгезивной активности. Это подтверждало участие в прикреплении чумных бактерий к эритроцитам, помимо белковых субстанций, и других факторов. Таковыми, на наш взгляд, могут являться высокогидрофобные компоненты клеточной стенки Y. pestis липидной природы, в частности ЛПС.

7. Адгезивные свойства штамма Y. pestis EV НИИЭГ в отношении эритроцитов различных доноров

При проведении исследований значительный интерес представляло определение роли антигенных детерминант эритроцитов человека, обуславливающих его принадлежность к определенной группе крови, в рецепции адгезинов чумных бактерий. В ходе работы нами учитывались две важнейшие системы подобных детерминант - ABO и Rh (Воробьев, 2005).

Эксперименты показали, что значения ПА бактерий в отношении эритроцитов людей с различными группами крови по каждой из данных систем статистически значимо друг от друга не отличались (рис. 9). Следовательно, групповые изоантигены А и В, а также Rh-фактор не играли роли во взаимодействии клеток Y. pestis EV НИИЭГ с эритроцитами.

А Группа крови 5 Группа крови

Рисунок 9. Показатель адгезии бактерий Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам доноров с различными группами крови по системе ABO (А) и Rh (Б)

Вместе с тем уровень связывания бактерий эритроцитами отдельных доноров значительно варьировал. Минимальная величина ПА в эксперименте составила порядка 35,6%, максимальная - 90,6%. Разброс показателей связывали с влиянием на исход адгезии индивидуальных особенностей рецепторного аппарата эритроцитов, обусловленных различным составом биополимеров плазматической мембраны.

Таким образом, при определении адгезивной способности чумного микроба в качестве субстрата адгезии можно было применять эритроциты людей различных групп крови по системам ABO и Rh, но при этом обязательно учитывать влияние на получаемые результаты свойств клеток-мишеней. Для стандартизации экспериментов нами на протяжении каждой последующей серии опытов применялись эритроциты одного и того же донора.

8. Адгезивные свойства штамма У. ЕУ НИИЭГ в отношении

эритроцитов различных видов животных

Для адекватной оценки адгезивной активности штамма У. реяНь ЕУ НИИЭГ в отношении эритроцитов различных видов млекопитающих необходимо было выбрать оптимальный режим экспозиции бактерий с клетками-мишенями. С этой целью была проведена серия экспериментов, в которой варьировали температурой, условиями и продолжительностью инкубации смеси клеток. Эффективным для проявления бактериями адгезивных свойств в отношении эритроцитов животных оказалось инкубирование проб при температуре (37±1)°С на вращающейся платформе в течение 30 мин.

При применении данных условий экспозиции реакционной смеси наибольшие показатели адгезии клеток У. ЕУ НИИЭГ (70-84%)

регистрировали в отношении эритроцитов белой мыши, белой крысы и свиньи, средние (43-62%) - в отношении эритроцитов золотистого хомячка, морской свинки, собаки, барана и коровы, наименьшие (в пределах 22-31%) - в отношении эритроцитов кошки и лошади (табл. 4).

Таблица 4

Показатель адгезии бактерий У. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам различных видов животных____

Вид животного Количество животных ПА, % (М±ш)

Белая мышь 12 70,7±3,6

Белая крыса 8 84,0±5,0

Золотистый хомячок 10 47,1±4,4

Морская свинка 12 61,1±2,8

Кошка 6 22,1±5,5

Собака 6 57,1±3,9

Свинья 6 73,8±3,2

Лошадь 6 30,6±1,9

Баран 5 43,4±3,7

Корова 8 45,3±3,1

Выявленные нами значительные различия в способности чумного микроба прикрепляться к красным клеткам крови различных видов млекопитающих объясняли видовыми особенностями рецепторных структур эритроцитов, взаимодействующих с адгезинами бактерий.

9. Влияние антибиотиков на адгезию бактерий У. ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека

По данным литературы ("\Уи е! а1., 1995; Шубин с соавт., 2000), многие антибиотики, применяемые в субингибирующих концентрациях, способны снижать прикрепление патогенных микроорганизмов к клеткам и тканям

хозяина. Считается, что подобный эффект в сочетании с антибактериальным действием может усиливать химиотерапевтическую эффективность данных препаратов.

В связи с этим нами была проведена оценка действия ряда антибиотиков на адгезивную активность клеток Y. pestis EV НИИЭГ в отношении эритроцитов человека. В экспериментах использовали гентамицин, доксициклин, и цефатоксим - препараты, положительно себя зарекомендовавшие при лечении чумной инфекции (Романов с соавт., 200); Mwengee et al., 2006), а также ампициллин, к которому чумной микроб малочувствителен.

Антибиотики вносили в пробы непосредственно перед смешиванием микроорганизмов с эритроцитами человека, а кроме того применяли варианты опыта с предварительной 30-минутной обработкой при температуре (37±1)°С антибиотиками бактерий (эритроцитов) и последующей их инкубацией с необработанными эритроцитами (бактериями). Было обнаружено, что при всех модификациях эксперимента тестируемые препараты, используемые в терапевтических и субтерапевтических концентрациях (гентамицин и доксициклин - 3,0 и 6,0 мкг/мл, ампициллин - 10,0 и 20,0 мкг/мл, цефотаксим -40,0 и 100,0 мкг/мл соответственно) не оказывали влияния на связывание бактерий с эритроцитами.

10. Влияние плазмы, сыворотки крови и их отдельных компонентов на адгезию бактерий У. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека

На завершающей стадии исследований определяли влияние на адгезивные свойства штамма Y. pestis EV НИИЭГ нативной плазмы и сыворотки крови человека, а также коммерческих препаратов - альбумина и нормального иммуноглобулина человека.

Приготовление опытных проб проводили по следующей схеме. Суспензию отмытых эритроцитов человека в объеме 1,0 мл центрифугировали при 300 g в течение 5,0 мин. Супернатант в объеме 0,75 мл удаляли, а к осадку добавляли 0,75 мл тестируемого компонента и 2,5 мл суспензии бактерий.

Контрольные пробы готовили, смешивая: 2,5 мл суспензии бактерий и 1,0 мл 0,9% раствора хлорида натрия (рН 7,2) (контроль №1); 0,25 мл осадка эритроцитов, 0,75 мл исследуемого препарата и 2,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия (рН 7,2) (контроль №2). Уровень адгезии определяли фотоколориметрически после инкубации проб в статических условиях при температуре (20±1)°С в течение 5 мин.

Анализ экспериментов показал, что все тестируемые препараты оказывали выраженное ингибирующее действие на процесс прикрепления бактерий к эритроцитам при добавлении в пробы непосредственно перед смешиванием микробных клеток с эритроцитами (табл. 5). Наибольшей антиадгезивной активностью обладали плазма и сыворотка крови, которые при использовании в цельном виде снижали величину ПА в 15,9 и 7,8 раза

соответственно. Их ингибиторный эффект проявлялся вплоть до разведения 1:64 и исчезал при разведении 1:128. Альбумин и иммуноглобулин человека, применяемые цельными, снижали ПА в 2,5 и 2,0 раза соответственно. Антиадгезивное действие данных препаратов регистрировали до разведения 1:8. Более выраженную ингибиторную активность цельной плазмы по сравнению с цельной сывороткой мы связывали с антиадгезивными свойствами фибриногена, входящего в её состав. Полученные результаты свидетельствовали о наличии у плазмы (сыворотки) крови собственного защитного антимикробного действия, направленного на снижение прикрепления чумных бактерий к эритроцитам, и вовлечении целого ряда её компонентов в процесс взаимоотношений патогена с организмом хозяина.

Таблица 5

Показатель адгезии бактерий У. рея Из ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека в присутствии препаратов плазмы и сыворотки крови (М±т; п=5)____

Тестируемый ПА микробных клеток при использовании Конт-

препарат препарата в разведении ..., % роль

цельн. 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

Сыворотка 10,0 12,8 23,1 33,9 43,2 53,8 66,0 76,4

крови ± ± ± ± ± ± ± ±

человека } 4*** 2,4*** 2 у*** 3 д**# 4^7*** 4,6** 2,1** 3,0

Плазма крови 4,9 18,0 20,9 35,1 43,7 58,9 65,3 72,2

человека ± ± ± ± ± ± ± ± 77,6

2 з*** 3,6*** 2,8*** 2,7*** 3,1** 3,4* 4,8 ±

Альбумин 31,0 48,3 53,5 67,8 77,1 77,6 71,3 76,8 2,1

человеческий ± ± ± ± ± ± ± ±

2 2*** 3 7*** 1,8*** 2,9* 2,9 2,1 3,5 4,6

Иммуноглобу- 39,7 52,6 55,5 69,4 76,4 74,6 81,5 72,2

лин ± ± ± ± ± ± ± ±

нормальный 2,3*** 3,8*** 3 4*** 2,1* 3,0 2,3 2,6 5,4

Примечание: *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 различия статистически достоверны по сравнению с контролем.

В следующей серии экспериментов нами было установлено, что предварительная 30-минутная обработка при температуре (37±1)°С сывороткой крови, альбумином и иммуноглобулином, как бактерий, так и эритроцитов перед их соединением с необработанными клетками обеспечивала более значительное снижение ПА по сравнению с добавлением соответствующих компонентов в пробы непосредственно перед смешиванием микробов с эритроцитами (рис. 11). Следовательно, подавление адгезивной способности бактерий У. реьН.у ЕУ НИИЭГ тестируемыми препаратами могло объясняться блокированием как адгезинов микроорганизмов, так и рецепторов клеток-мишеней.

Контроль

Иммуноглобулин нормалььный

□ Добавление препарата в пробу непосредственно перед смешиванием бактерий с эритроцитами

■ Предварительная обработка препаратом эритроцитов

□ Предварительная обработка препаратом бактерий

Рисунок 11. Показатель адгезии бактерий У. рауги ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека при различных вариантах внесения сыворотки крови человека и её отдельных белковых фракций (разведение 1:4) в систему «микробные клетки- эритроциты»

Таким образом, разработанный нами метод оценки адгезии бактерий У. pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов оказался эффективным инструментом для изыскания препаратов, препятствующих проявлению чумными бактериями адгезивных свойств, и изучения механизма их действия, что позволяло значительно расширить область его применения.

ВЫВОДЫ

1. Традиционные методы оценки адгезии микроорганизмов к эритроцитам либо не позволяют выявлять адгезивные свойства клеток У. pestis EV НИИЭГ (метод С.С. Гизатулиной), либо обладают существенными недостатками (метод В.И. Брилис).

2. Разработан метод определения адгезивной активности штамма Y. pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов, основанный на фотоколориметрической регистрации связывания микробных клеток с эритроцитами, характеризующийся объективностью и информативностью, а также стандартностью и точностью получаемых данных.

3. Адгезивные свойства штамма Y. pestis EV НИИЭГ в отношении эритроцитов человека в значительной степени зависят от состава питательной среды и температуры выращивания бактерий и, в меньшей степени, от возраста культуры, но вместе с тем остаются стабильными при лиофильном высушивании микробных клеток и их пассажах на питательной среде.

4. Степень связывания бактерий Y. pestis EV НИИЭГ с эритроцитами человека не зависит от группы крови донора по системам ABO и Rh, но в то же время зависит от индивидуальных особенностей эритроцитов.

5. Уровень адгезии клеток У pestis EV НИИЭГ к эритроцитам разных видов млекопитающих имеет существенные различия. Наибольшую адгезивную активность бактерии данного штамма проявляют в отношении эритроцитов белой мыши, белой крысы, свиньи, среднюю - в отношении

эритроцитов морской свинки, золотистого хомячка, собаки, барана, коровы, наименьшую - в отношении эритроцитов кошки и лошади.

6. Гентамицин, доксициклин, цефотаксим и ампициллин, применяемые в терапевтических и субтерапевтических концентрациях, не влияют на адгезию бактерий Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека.

7. Нативная сыворотка и плазма крови, а также альбумин и нормальный иммуноглобулин обладают выраженным ингибирующим действием на процесс прикрепления клеток У. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека. Показано, что механизм действия данных препаратов связан с блокированием как адгезинов бактерий, так и рецепторных структур эритроцитов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ивонин, А.Г. Разработка и перспективы применения фотометрического метода определения бактериофиксирующей активности эритроцитов (БФАЭ) в ветеринарии / А.Г. Ивонин, В.А. Оборин // Известия ОГАУ. - 2008. - № 3. - С. 80-82.

2. Оборин, В.А. Изучение адгезии клеток вакцинного штамма EV Yersinia pestis к эритроцитам человека фотоколориметрическим методом / В.А. Оборин, А.Г. Ивонин, Е.В. Пименов, В.Е. Романов, Ф.И. Абашева, О.В. Вылегжанина // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. -2009. - Т. 7. - Вып. 3.

- С. 25-29.

3. Костяев, A.A. Влияние различных условий и сроков хранения эритроцитов на показатель их бактериофиксирующей активности /

A.A. Костяев, А.Г. Ивонин, В.А. Оборин // Гематология и трансфузиология. -2009. - № 6. - С. 45-47.

4. Оборин, В.А. Изучение адгезии бактерий вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам животных фотоколориметрическим методом /

B.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин // Проблемы особо опасных инфекций. -2010. -Вып. 103. - №1. -С. 48-50.

5. Романов, В.Е. Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов / В.Е. Романов, А.Г. Ивонин, A.J1. Бондаренко, В.А. Оборин, E.JI. Нехорошкина // Патент РФ на изобретение № 2360969; опубл. 10.07.2009.

- Бюл. №11.

6. Оборин, В.А. Фотометрический метод определения бактериофиксирующей активности эритроцитов в отношении возбудителей бактериальных инфекций / В.А. Оборин, А.Л. Бондаренко, В.Е. Романов, А.Г. Ивонин, Е.Л. Нехорошкина // Научно практическая конференция и школа по инфекционной патологии (с международным участием). Сборник научных трудов. - М.: МДВ, 2007. - С. 76.

7. Ивонин, А.Г. Методы изучения адгезивных свойств микроорганизмов / А.Г. Ивонин, В.А. Оборин // Науке нового века - знания молодых. Сборник статей 8-й научной конференции аспирантов и соискателей. - Киров: Вятская ГСХА, 2008. - С. 12-14.

8. Ивонин, А.Г. Фотометрический метод определения бактериофиксирующей активности эритроцитов / А.Г. Ивонин, В.Е. Романов, В.А. Оборин, Е.Л. Нехорошкина И Достижения ветеринарной науки и практики: Сборник статей Всероссийской научно-практической конференции. Киров: Вятская ГСХА, 2008. - С. 63-69.

9. Оборин, В.А. Изучение взаимодействия эритроцитов крови людей, имеющих различную групповую принадлежность, в отношении вакцинного штамма ЕВ чумного микроба / В.А. Оборин, И.В. Предеина, А.Г. Ивонин, Е.Л. Нехорошкина // Актуальные проблемы физической культуры и спорта и пути их решения. Сборник научно-методических статей. Киров: Изд-во ВятГГУ, 2008. - С. 59-62.

10. Оборин, В.А. Перспективы применения антиадгезивной терапии при инфекционных заболеваниях, обусловленных возбудителями чумы, сибирской язвы и сальмонеллеза / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин, В.Е. Романов // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России», 2008.-С. 99-103.

11. Оборин, В.А. Изучение адгезивных свойств вакцинного штамма EV чумного микроба с помощью различных методов / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин // Там же. - С. 198-202.

12. Оборин, В.А. Исследование бактериофиксирующей активности эритроцитов (БФАЭ) крови различных видов животных и человека в отношении вакцинного штамма EV чумного микроба / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин, В.Е. Романов // Там же. - С. 202-205.

13. Оборин, В.А. Роль эритроцитов в генерализации инфекционного процесса при бактериальных инфекциях 1 В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин, В.Е. Романов // Там же. - С. 205-209.

14. Оборин, В.А. Изучение механизмов взаимодействия микробов с эритроцитами / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин, О.В. Вылегжанина // Актуальные проблемы биологической защиты войск и населения. Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология. Микробиология. Биотехнология. Экология: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Екатеринбург, 2009. -С. 62-64.

15. Оборин, В.А. К вопросу о роли эритроцитов в инфекционной патологии / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин, В.Е. Романов, О.В. Вылегжанина // Там же. - С. 64-66.

16. Vylegzhanina, O.V. Research into mechanisms of bacteria interaction with erythrocytes / O.V. Vylegzhanina, A.G. Ivonin // Scientific and practical conference of post-graduates, candidacy applicants, graduates, undergraduates in modern languages «Ex professo». Transactions. - Kirov: Vyatka State University, 2009. -P. 39-40.

Подписано в печать 23.03.2010 г. Формат 60x84 '/,6. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 1032.

Издательство Вятского государственного гуманитарного университета, 610002, г. Киров, ул. Красноармейская, 26

Издательский центр Вятского государственного гуманитарного университета, 610002, г. Киров, ул. Ленина, 111, т. (8332) 673-674

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ивонин, Алексей Геннадьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления об адгезивной способности бактерий

1.2. Адгезивные свойства чумного микроба.

1.3. Методы изучения адгезии бактерий к клеткам макроорганизма.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1. Объекты исследований.

2.1.2. Основные реактивы, используемые в работе.

2.1.3. Оборудование и техника измерений.

2.1.4. Приготовление суспензии бактерий.

2.1.5. Приготовление суспензии эритроцитов.

2.1.6. Обработка эритроцитов формалином и танином.

2.1.7. Получение сыворотки и плазмы крови человека.

2.1.8. Оценка адгезивной способности бактерий на модели эритроцитов традиционными методами.

2.1.9. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток.

2.1.10. Оценка гемаггшотинирующей активности бактерий.

2.1.11. Обработка бактерий трипсином.:.

2.1.12. Обработка экспериментальных данных.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1. Оценка адгезивных свойств штамма У рейИБ ЕУ НИИЭГ на модели эритроцитов при помощи традиционных методов.

2.2.2. Разработка фотоколориметрического метода оценки адгезивных свойств штамма У реБШ ЕУ НИИЭГ на модели эритроцитов человека.

2.2.2.1. Выявление возможности регистрации адгезии бактерий к эритроцитам с помощью фотоколориметрии.

2.2.2.2. Выбор оптимальных и стандартных условий для оценки адгезивной активности штамма У реьйз ЕУ НИИЭГ.

2.2.3. Исследование влияния условий культивирования бактерий У. рехйБ ЕУ НИИЭГ и физиологического состояния микробной культуры на адгезивные свойства штамма.

2.2.4. Определение гидрофобных свойств бактерий У. ре^/я ЕУ НИИЭГ.

2.2.5. Сравнение адгезивности и гемагглютинирующей активности бактерий У. реБПз ЕУ НИИЭГ.

2.2.6. Оценка влияния трипсина и высокой температуры на адгезивную способность бактерий У. реБШ ЕУ НИИЭГ.

2.2.7. Адгезивные свойства штамма У. реяК'з ЕУ НИИЭГ в отношении эритроцитов различных доноров.

2.2.8. Адгезивные свойства штамма У. резйх ЕУ НИИЭГ в отношении эритроцитов различных видов животных.

2.2.9. Влияние антибиотиков па адгезию бактерий У. рсбИб ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека.

2.2.10. Влияние плазмы и сыворотки крови, а также их отдельных компонентов на адгезию бактерий У. рехИя ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека.

2.2.11. Исследование механизма действия сыворотки крови и её компонентов на адгезию бактерий У. резйБ ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка адгезивных свойств штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов"

Актуальность темы. Чума является зооантропонозным инфекционным заболеванием бактериальной природы, характеризующимся контагиозностыо, тяжелым течением и высокой летальностью (Смирнова, Кутырев, 2006; Трухачев, Лебедев, 2006). Став в прошлом причиной гибели миллионов людей, упадка государств и цивилизаций, чума и на сегодняшний день сохраняет высокий эпидемический потенциал (Анисимов, 2002; Кутырев, 2008). Реальную угрозу появления вспышек болезни в современном мире создает активизация природных и аптропургических очагов чумы, занимающих значительные территории, усиление миграционных процессов, а также возможность использования возбудителя (Yersinia pestis) биотеррористами (Lippi, Conti, 2002; Riedel, 2005; Попов с соавт., 2007).

В последние годы достигнуты значительные успехи в исследовании физиологических и биохимических особенностей чумного микроба, обуславливающих его патогенность. Достаточно полно охарактеризованы факторы агрессии Y. pestis, подавляющие защитные реакции хозяина и обеспечивающие выживание популяции в условиях макроорганизма (Viboud, Bliska, 2005; Knirel et al., 2006; Афанасьева с соавт., 2008). В то же время слабо освещенными остаются вопросы, касающиеся адгезивной способности чумных бактерий в отношении эукариотических клеток (Iiuang, Lindler, 2004; Liu et al., 2006).

По современным представлениям, адгезия возбудителя играет ключевую роль в развитии любого инфекционного процесса, во многом определяя его начало, характер и течение (Boyle, Finlay, 2003; Labbate et al., 2007). В микробной клетке функцию распознавания и связывания с клетками-мишенями выполняют поверхностные субстанции, так называемые адгезины, которые могут быть представлены белками наружной мембраны, а также специализированными органеллами - иилями (Сидоренко, 2001; Мавзютов с соавт., 2007). Структуры, подобные пилям ряда прокариот, выявлены и у чумных бактерий (Lindler, Tall, 1993). Установлено, что клетки Y. pestis обладают способностью прикрепляться к искусственным поверхностям (Дятлов с соавт., 1991) и культивируемым эпителиальным клеткам дыхательного тракта человека (Thomas, Brooks, 2004; Бахтеева, 2008). Однако эти сведения не позволяют оценивать адгезивный потенциал возбудителя чумы в полной мере.

Анализ литературы (Поспелова с соавт., 1998; Телесманич с соавт., 2004; Зайцева, Сомов, 2006) свидетельствует о том, что универсальной моделью для исследования адгезии бактерий являются эритроциты, что связано с присутствием на их поверхности гликофорипа, идентичного гликокаликсу эпителиоцитов, на котором расположены рецепторы для микроорганизмов. Исходя из этого, изучение возможности применения эритроцитов при оценке адгезивных свойств чумного микроба является весьма актуальным. Кроме того, учитывая присутствие патогена в кровеносном русле на стадии бактериемии (Perry, Felherson, 1997; Анисимов, 2002), определение характера взаимодействия Y. pestis с эритроцитами как самыми многочисленными форменными элементами крови представляет самостоятельный интерес.

Цель и задачи исследований. Целыо настоящей работы явилось определение адгезивных свойств штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ в тесте in vitro с использованием эритроцитов в качестве клеток-мишеней.

В соответствии с поставленной целыо решались следующие задачи:

1. Определить возможность оценки адгезивной активности штамма Y pestis EV НИИЭГ па модели эритроцитов человека традиционными методами.

5. Исследовать влияние антибиотиков, а также плазмы и сыворотки крови на проявление клетками Y. pestis EV НИИЭГ адгезивной активности в отношении эритроцитов человека.

Впервые осуществлена комплексная оценка влияния режима культивирования и физиологического состояния клеток Y. pestis EV НИИЭГ па их способность прикрепляться к эритроцитам. Проведено сопоставление адгезивных, гидрофобных и гемагглютинирующих свойств культур чумного микроба, выращенных в различных условиях.

Практическая значимость работы.

Предложен информативный и доступный для практического применения метод определения адгезивной способности бактерий Y pestis на модели эритроцитов при помощи фотоколориметрии. Метод может быть использован для изучения механизмов, участвующих в прикреплении патогена к клеткам хозяина, и поиска соединений, способных блокировать данный процесс. Кроме того, разработанный фотоколориметрический метод может найти применение при оценке адгезивных свойств других микроорганизмов бактериальной природы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный фотоколориметрический метод регистрации прикрепления бактерий Y. pestis к эритроцитам в условиях in vitro позволяет оценивать адгезивные свойства чумного микроба.

3. Внутривидовые и межвидовые различия в устойчивости эритроцитов к прикреплению бактерий Y. pestis EV НИИЭГ свидетельствуют о роли рецепторных структур клеток-мишеней в реализации чумным микробом адгезивной способности.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен 1 патент РФ на изобретение.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ивонин, Алексей Геннадьевич

4. ВЫВОДЫ

1. Традиционные методы оценки адгезии микроорганизмов к эритроцитам либо не позволяют выявлять адгезивные свойства клеток Y. pestis EV ЫИИЭГ (метод С.С. Гизатулиной), либо обладают существенными недостатками (метод В.И. Брилис).

5. Уровень адгезии клеток Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам разных видов млекопитающих имеет существенные различия. Наибольшую адгезивную активность бактерии данного штамма проявляют в отношении эритроцитов белой мыши, белой крысы, свиньи, среднюю - в отношении эритроцитов морской свинки, золотистого хомячка, собаки, барана, коровы, наименьшую - в отношении эритроцитов кошки и лошади.

6. Ген гамицин, доксициклин, цефотаксим и ампициллин, применяемые в терапевтических и субтерапевтических концентрациях, не влияют на адгезию бактерий Y. pestis ЕУ НИИЭГ к эритроцитам человека.

7. Нативная сыворотка и плазма крови, а также альбумин и нормальный иммуноглобулин обладают выраженным ингибирующим действием на процесс прикрепления клеток Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам человека. Показано, что механизм действия данных препаратов связан с блокированием как адгезинов бактерий, так и рецепторных структур эритроцитов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ивонин, Алексей Геннадьевич, Казань

1. Ананьева, Н.В. Оценка методов исследования взаимодействия бактерий с клетками животных / Н.В. Ананьева, В.И. Ганина, Е.М. Ленченко и др. // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. — 2007. — № 3. — С. 53-55.

2. Анисимов, А.Г1. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1 / А.П. Анисимов // Молекул, генетика. 2002. -№ 3. - С. 323.

3. Апарин, Г.П. Микробиология чумы. Руководство / Г.П. Апарин, Е.П. Голубинский. Иркутск: Изд-во Иркутского ун-та, 1989. - 92 с.

4. Арасланова, В.А. Характеристика гемолизинов Bacillus anthracis: автореф. дис. . канд. вст. наук / В.А. Арасланова Покров, 2009. - 22 с.

5. Арутюнов, Ю.И. Уроки эпидемии чумы в Индии / Ю.И. Арутюнов // Эпидемиол. и инфекц. бол. 2004. — № 1. - С. 12-17.

6. Афанасьева, Г.А. Эндотоксин Yersinia pestis: особенности структуры, рецепции и механизмов индукции цитопатогенных эффектов (обзор) / Г.А. Афанасьева, Н.П. Чеснокова, С.М. Дальвадянц и др. // Пробл. особо опасных инфекц. 2008. - Вып. 98, № 4 - С. 43-47.

7. Афиногенов, Г.Е. Исследование противомикробной активности и цитотоксичности антиинфекционных препаратов на модели культуры клеток человека / Г.Е. Афиногенов, Е.М. Еропкина, В.М. Бондаренко и др. | // Журн. микробиол. 1996. -№ 5. - С. 3-7.

8. Базеров, М.А. Адгезивные свойства и характеристика поверхности стрептококков, колонизирующих клетки буккального эпителия / М.А. Базеров, С.Е. Воскун, Л.Ф. Новикова // Журн. микробиол. 1993. - № 4. -С. 37-41.

9. Бахолдина, С.И. Влияние глюкозы и галактозы на морфологию и биологические свойства Yersinia pseudotuberculosis / С.И. Бахолдина, Т.Ф.

10. Соловьева, Ф.Н. Шубин и др. // Жури, микробиол. 2005. - № 5. - С. 610.

11. Ю.Бахтеева, И.В. Исследование функциональной активности pH 6 антигена Yersinia pestis с помощью наборов изогенных мутантов: автореф. дис. . канд. мед. наук / И.В. Бахтеева Москва, 2008. - 24 с.

12. Богданова, Е.А Адгезивные свойства лактобактерий и эшерихий в различных отделах желудочно-кишечного тракта человека в норме и патологии / Е.А. Богданова, Ю.В. Несвижский, A.A. Воробьев и др. // Вестник РАМН. 2006. - № 1. - С. 35-38.

13. Бопдаренко, В.М. Гемаггл юти пирующая и адгезивная способность штаммов клебсиелл и энтеробактер // В.М. Бондаренко, М.М. Баркус, В.И. Брилис и др. / Журн. микробиол. 1987. -№ 7. - С. 3-6.

14. Бондаренко, В.М. Адгезивная активность клиничеких штаммов клебсиелл / В.М. Бондаренко, W. Gang, М.М. Barcus // Журн. микробиол. 1996. -№ 2.-С. 104-109.

15. Бондаренко, В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса / В.М. Бондаренко // Журн. микробиол. 1999. -№ 5.-С. 34-39.

16. Бондаренко, В.М. «Острова» патогенности бактерий / В.М. Бондаренко // Журн. микробиол. 2001. - № 9. - С. 67-74.

17. Брилис, В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов./ В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер и др. // Лаб. дело. 1986,-№4.-С. 210-212.

18. Брилис, В.И. Некоторые аспекты влияния антибиотиков на адгезивные свойства микроорганизмов и доступная модель его изучения / В.И.

19. Брилис, Т.А. Брилепе, J1.A. Левков и др. // Антибиотики и химиотер. -1986.-№ 5.-С. 353-357.

20. Булатов, А.С. Изыскание штамма-антагониста в отношении сальмонелл. / А.С. Булатов // Ветеринария. 2003. - № 5. - С. 26-28.

21. Булгакова, Т.Н. Адгезия стрептококков группы В на клетках вагинального эпителия / Т.Н. Булгакова, К.Б. Грабовская, М. Риц и др. // Журн. микробиол. 1984. - № 12. - С. 27-32.

22. Бухарин, О.В. Бактерионосительство (медико-экологический аспект) / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов. Екатеринбург: УрО РАН, 1996. -203 с.

23. Бывалов, А. А. Роль плазмиды кальцийзависимости иерсиний в формировании иммунитета против чумы / А.А. Бывалов, И.В. Дармов, И.В. Маракулин и др. // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2005. - № 4. - С. 25-29.

24. Бывалов, А.А. Биологические и физико-химические свойства культур бактерий Yersinia pseudotuberculosis, несущих fra-оперон Yersinia pestis / А.А. Бывалов, К.Е. Гаврилов, В.В. Крупин и др. // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2008. - № 1.-С. 14-18

25. Вишнякова, Л.А. Адгезия Streptococcus pneumoniae на эксплантатах трахеи мышей и её ингибирование углеводными препаратами / Л.А. Вишнякова, Ю.В. Резцова//Журн. микробиол. 1999. — № 2. - С. 26-28.

26. Водопьянов, С.О. Пили адгезии чумного микроба / С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькип //Журн. микробиол. 1985. -№ 1. - С. 26-28.

27. Водопьянов, С.О. Оценка роли пилей адгезии чумных бактерий в прикреплении к клеточным поверхностям / С.О. Водопьянов, Г.Т. Атарова, И.П. Олейников и др. // Журн. микробиол. 1993. - №3. - С. 612.

28. Волох, О.А. Свойства клеточной поверхности чумного микроба, определяемые S-слоем / О.А. Волох, И.А. Дятлов // Пробл. особо опасных инфекц: Сб. научн. тр. / Под. ред. В.В. Кутырева. Саратов: ОГУП РИК «Полиграфия Поволжья», 2003. - Вып. 85. - С. 55-62.

29. Воробьев, A.A. Мир микробов / A.A. Воробьев, А.Л. Гинцбург, В.М. Бондаренко // Вестник РАМН. 2000. -№ 11. - С. 11-14.

30. Воробьев, A.A. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / A.A. Воробьев, Е.А. Лыкова // Журн. микробиол.- 1999. -№6. -С. 102-105.

31. Воробьев, А.И. Руководство по гематологии: в 3 т. / Под. ред А.И. Воробьева. -М.: Ныодиамед, 2005. -Т.З. -416 с.

32. ГГизатулина, С.С. Способ оценки состояния микрофлоры кишечника человека по количеству адгезивно-активных колоний и типу адгезинов / С.С. Гизатулина, М.О. Биргер, Л.И. Кулинич и др. // Журн. микробиол.- 1991. № 4. - С. 21-23.

33. Головко, А.Н. Антигенная вариабельность фимбриальных адгезинов Е. coli / А.Н. Головко // Ветеринария. 1997. - №8. - С.23-25.

34. Горская, Е.М. Адгезивные свойства неэнтеропатогенного штамма Escherichia coli в системах in vitro па изолированных эптероцитах крыс и in vivo / Е.М. Горская, В.М. Бондаренко, М.Г. Богатырёва и др. // Журн. микробиол, 1989.-№ 11.-С. 3-7.

35. Грабовская, К.Б. Взаимодействие стрептококков группы А с культурой клеток НЕр-2 / К.Б. Грабовская, А.А.Тотолян // Журн. микробиол. 1977.- № 2. С. 32-36.

36. Гришина, H.A. Влияние антибиотиков на адгезию микроорганизмов / H.A. Гришина, A.M. Далина, В.П. Яковлев // Антибиотики и химиотер. — Т. 35, №3,-С. 50-53.

37. Далин, М.В. Адгезины микроорганизмов / М.В. Далин, Н.Г. Фиш // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Микробиология. - 1985. - Т. 16. - 106 с.

38. Дентовская, C.B. Укорочение кора липополисахарида снижает вирулентность Yersinia pestis / C.B. Дентовская, М.Е. Платонов, Т.И. Комбарова и др.j // Пробл. особо опасных инфекц. 2009. - Вып. 99, №1С. 50-51.

39. Дмитриева, Н.Ф. Липотейхоевые и тейхоевые кислоты патогенных стрептококков: структура, функции, роль во взаимодействии возбудителя с макроорганизмом // Н.Ф. Дмитриева, Ю.М. Тимофеев, Н.И. Брико // Журн. микробиол. 2007. - № 6. - С. 100-107.

40. Дмитриева, Н.Ф. Персистенция Streptococcus pyogenes / Н.Ф. Дмитриева, Ю.М. Тимофеев, Н.И. Брико // Журн. микробиол. 2009. - № 3. - С. 104109.

41. Домарадский, И.В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы / И.В. Домарадский. Саратов: Саратовский медицинский институт, 1993. - 132 с.41 .Домарадский, И.В. Чума / И.В. Домарадский. М.: Медицина, 1998. — 176 с.

42. Дятлов, И.А. Исследование функциональной структуры поверхности штамма ЕВ чумного микроба / И.А. Дятлов, А.Ф. Филиппов, С.А. Терентьев / Тезисы докладов к Межведомственной научной конференции 26-26 марта 1991 года. Киров. С. 157-158.

43. Дятлов, И.А. Выявление и характеристика антигена Yersinia pestis, проявляющего свойства белков S-слоя / И.А. Дятлов, O.A. Антонова // Журн. микробиол. 1999. -№ 4. - С. 90-91.

44. Дятлов, И.А. Получение S-слоя чумного микроба и возможности его применения / И.А. Дятлов, O.A. Волох // Биотехнология. 2004. - № 1. — С. 20-25.

45. Евтеева, Н.И. Биоразнообразие энтеробактерий в природных местообитаниях Нижегородской области: автореф. дис. . канд. биол. наук / Н.И. Евтеева. Н. Новгород, 2009. - 25 с.

46. Езепчук, Ю.В. Патогенность как функция биомолекул / Ю.В. Езепчук. -М.: Медицина, 1985 240 с.

47. Еропкина, Е.М. Антиадгезивная активность белковых комплексов биологических жидкостей и секретов / Е.М. Еропкина, Г.Е. Афиногенов // Журн. микробиол. 1994.-№ 11. - С.110-116.

48. Еропкина, Е.М. Влияние отдельных сывороточных белков и нативной сыворотки крови на адгезию Staphylococcus aureus к клеткам in vitro / Е.М. Еропкина, Г.Е. Афиногенов, М.Ю. Еропкин // Журн. микробиол. -1995. -№ 5. -С. 19-23.

49. Зайцева, Е.А. Влияние температуры на адгезивные свойства листерий / Е.А. Зайцева, Г.П. Сомов // Жури, микробиол. 2006. - № 3. - С. 20-23.

50. Зайцева, Е.А Влияние ДНК из молок лососевых рыб на адгезивные свойства Listeria monocitogenes и выживаемость мышей при экспериментальном листериозе / Е.А. Зайцева, JI.H. Федянина, В.В. Потапова и др. // Журн. микробиол. 2006. - № 3. - С. 61-64.

51. Запорожец, Т.С. Лектиновая фракция митилана, биогликана из мидий, и его влияние на адгезию микробов к клеткам макроорганизма / Т.С. Запорожец, Н.Н. Беседнова, Р.Г. Оводова и др. // Журн. микробиол. -1994. -№ 3. С. 86-88.

52. Иванова, В.В. Закономерности взаимоотношений макроорганизма и возбудителей инфекционных болезней у детей / В.В. Иванова, Е.А. Корнева // Вестник РАМН. 2000. - №11. - С.35-40.

53. Кветная, А.С. Адгезия Streptococcus pneumoniae I А.С. Кветная, Н.Н. Костюкова, В.В. Иванова и др. / Журн. микробиол. 1995. - № 5. - С. 2326.

54. Коваленко, Н.К. Адгезия молочнокислых бактерий к эпителию кишечника сельскохозяйственных животных / Н.К. Коваленко, С.А. Касумова, Т.Н. Головач // Микробиол. журн. 1990. - Т. 3, № 3. - С. 7679.

55. Колганова, T.B. Влияние ферментов аспарагиназы и полифенолоксидазы на адгезивные свойства микроорганизмов / Т.В. Колганова, A.B. Ермолаев, Р.Дж. Дойл //Бюл. эксп. биол. и мед. -2002. -№ 1. С. 71-74.

56. Коннов, Н.Г1. Ультраструктурно-функциональный анализ чумного микроба / I I.П. Конов // Пробл. особо опасных инфекц. 1995. - Вып. 77, №1. - С.135-149.

57. Колганова, Т.В. Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе: дис. . канд. биол. наук / Т.В. Колганова. М., 2003. - 139 с.

58. Колякина, A.B. Лектиновые рецепторы холерных вибрионов: автореф. дис. . канд. мед. наук / A.B. Колякина. Ставрополь, 2009. - 18 с.

59. Костюкова, H.H. Начальный этап инфекционного процесса — колонизация и пути её прекращения / H.H. Костюкова // Журн. микробиол. 1989. - № 9. - С.103-110

60. Костюкова, H.H. Адгезия у Corynebacterium diphtheriae / H.H. Костюкова, H.A. Псреверзев // Журн. микробиол. 1987. - № 11. - С. 30-32.

61. Кравцов, А.Н. Повышение вирулентности бактерий Yersinia pestis при инкубации клеток в гемолизированпых эритроцитах крови человека / А.Н. Кравцов, В.И. Тынянова, В.П. Зюзина // Журн. микробиол. 1993. -№4.-С. 3-9.

62. Курилова, А.А. Неоднородность штаммов Bacillus anthracis по способности к адгезии / А.А. Курилова, В.А. Проскурина, В.Д. Майская // Журн. микробиол. -2004.-№. 3. -С. 81-83.

63. Кутырев, В.В. Актуальные проблемы особо опасных инфекционных болезней и санитарная охрана территорий в современных условиях / В.В. Кутырев // Журн. микробиол. 2008. - № 1. - С. 17-23.

64. Кушнарева, М.В. Влияние нетилмицина, амикацина, цефтазидима, и цефотаксима на адгезивные свойства микроорганизмов, выделенных у новорожденных детей / М.В. Кушнарева // Антибиотики и химиотер. -2000. Т. 45, № 7. - С. 17-21.

65. Литвинов, О.Б. Экстрацеллюлярная слизь и адгезивная активность штаммов Ps. aeruginosa / О.Б. Литвинов // Ветеринария. 1998. — № 1. — С. 21-23.

66. Ломов, Ю.М. Специфичность лектиновых рецепторов холерных вибрионов / Ю.М. Ломов, И.Р. Телесманич, А.В. Колякина / Журн. микробиол. 2007. - №6. - С.68-72.

67. Мавзютов, А.Р. Факторы патогенности оппортунистических энтеробактерий и их роль в развитии диареи / А.Р. Мавзютов, В.М. Бондаренко, Н.Ю. Жеребцова и др. // Журн. микробиол. 2007. -№ I. — С. 89-97.

68. Макаренкова, И. Д. Изучение возможности снижения адгезивной активности Corinebacterium diphtheria биополимерами природного происхождения./ И.Д. Макаренкова, Т.С. Запорожец, Н.Н. Беседнова и др. // Антибиотики и химиотер. 1999. - Т. 44, № 3. - С. 50-53.

69. Макаренкова, И.Д. Ингибирование адгезии патогенных микроорганизмов на эукариотических клетках / И.Д. Макаренкова, Г.Г. Компанец, Т.С. Запорожец // Журн. микробиол. 2006. - № 3. - С. 121 - 125.

70. Маянский, А. Н. Патогенетическая микробиология: руководство / А. Н. Маянский. Н. Новгород: НГМА, 2006. - 520 с.

71. Мерцалова, Ы.У. Адгезия Bordetella pertussis / Н.У. Мерцалова, O.A. Бандман // Журн. микробиол. 1987. - № 7. - С. 96-102

72. Мушкамбаров, H.H. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов / H.H. Мушкамбаров, С.Л.,Кузнецов. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2003. — 544 с.

73. Наумов, A.B. Иммунология чумы. Руководство / A.B. Наумов, М.Ю. Лсдванов, И.Г. Дроздов. Саратов: РосНИИПЧИ «Микроб», 1992. - 172 с.

74. Наумов, A.B. Биохимические аспекты патогенности возбудителя чумы / A.B. Наумов, И.А. Кузьмиченко, Т.М. Тараканенко и др. // Мед. паразитол. и паразитарн. бол. 1995. - № 4. - С. 17-22.

75. Новиков, 10.А. К истории изучения кардиоваскулярного сифилиса / Ю.А. Новиков // Клин, дерматол. и венерол. 2008. - № 5. - С.4-8.

76. Павлова, И.Г1. Электронно-микроскопическое исследование патогенных бактерий на объектах внешней среды / И.П. Павлова, Е.М. Ленченко // Журн. микробиол. 1998. - № 5. - С. 13-17.

77. Павлова, И.П. Электронно-микроскопическое исследование адгезивности бактерий / И.П. Павлова, Е.М. Ленченко // Журн. микробиол. 2002. -№ 1. - С. 3-6.

78. Петровская, В.Г. Перспективы получения усовершенствованных средств профилактики инфекционных заболеваний / В.Г. Петровская // Журн. микробиол. -1980. -№ 5. С. 61-69.

79. Петровская, В.Г. Адгезины кишечных палочек: роль в патогенезе диарей и генетический контроль / В.Г. Петровская, В.М. Бондаренко // Журн. микробиол. 1990. -№ 5. - С. 110-117.

80. Пивень, H.H. Патогенность Burkholderia pseudomallei как функция внеклеточных и поверхностных антигенов / H.H. Пивень, В.И. Илюхин // Журн. микробиол. 2000. - № 6. - С. 94-99.

81. Попов, Н.В. Современное состояние и прогноз эпизоотической активности природных очагов чумы Российской Федерации на 2007 год / Н.В. Попов, В.Е. Бессмертный, Н.Л. Новиков и др. // Пробл. особо опасных инфекц. -2007. Вып. 93, № 1. - С. 11-16.

82. Поспелова, C.B. Изучение адгезивных свойств микроорганизмов, выделенных от больных с патологией гепатобилиарной системы / C.B. Поспелова, Т.И. Карпунина, H.A. Зубарева // Пермский медицинский журнал, 1998.-Т. ХУ, № 3. - С. 22-25.

83. Романов, В.Е. Оценка эффективности антибактериальных препаратов при лечении экспериментальной бубонной чумы у обезьян / В.Е. Романов, В.И. Евстигнеев, Н.Т. Васильев и др. // Антибиотики и химиотер. — 2001. Том. 46, № 8. - С.6-8.

84. Румянцев, С.Н. Онтогенез клеточных рецепторов адгезии менингококков и вирусов гриппа / С.Н. Румянцев, М.Ф. Пясецкая, Н.М. Рогачёва // Журн. микробиол. 1995. -№ 5. - С. 30-32.

85. Салтыков, P.A. Опыт 30-летиего изучения стабильности свойств чумного вакцинного штамма ЕВ в СССР / P.A. Салтыков, М.М. Файбич // Журн. микробиол. 1975. - № 6. - С. 3-8.

86. Серебрякова, Е.В. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток на поверхности капель хлороформа / Е.В. Серебрякова, И.В. Дармов, Н.П. Медведев и др. // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 2. - С. 237-239.

87. России», Киров, ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России», 2008. С.213-, 216.

88. Сидоренко, C.B. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом / C.B. Сидоренко // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. — 2001. Т. 3, №. 4. - С. 301-315.

89. Симонова, Е.В. Роль нормальной микрофлоры в поддержании здоровья человека / Е.В. Симонова, O.A. Пономарева / Сибирский медицинский журнал. 2008. - № 8. - С. 20-25.

90. Смирнова, Т. А. Адгезивные свойства Bacillus thuringiensis / Т.А.Смирнова, M. H. По глазова, M.H. Никол аенко и др. // Биотехнология. 2000. - № 3. - С. 16-26.

91. Смирнова, Н.И. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей геномов и их эволюционных преобразований у возбудителей холеры, чумы и сибирской язвы / Н.И. Смирнова, В.В. Кутырев // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2006. - № 2. - С. 9-19.

92. Сомов, Г.П. Основные итоги изучения психрофильности патогенных бактерий / Г.П. Сомов, Н.Ф. Тимченко // Журн. микробиол. 1997. -№ 5. -С. 12-16.

93. Телесманич, Н.Р Адгезивные и некоторые другие свойства Vibrio cholerae ТСР+ СТХ", изолированных на объектах внешней среды Ростовской области в 2002 году / Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, И.Х. Бардых и др. // Журн. микробиол. 2004. - № 6. - С. 3-6.

94. Трухачев, А. Л. Способы диагностики и дифференциации возбудителя чумы: детекция атипичных штаммов Yersinia pestis молекулярно-биологическими методами (часть 1) / А.Л. Трухачев, С.А. Лебедева // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2006. - № 1. - С. 3-6.

95. Усвяцов, Б.Я. Взаимодействие бактерий и эритроцитов / Б.Я. Усвяцов, Е.А. Ханина, О.В. Бухарин // Журн. микробиол. 2005. — № 4. — С. 89-95.

96. Федорова, В.А. Внеклеточная резистентность возбудителя чумы к фагоцитозу / В.А. Федорова, А.Б. Голова // Вестник РАМН. — 2005. — № 10.-С. 19-25.

97. Федорова, В.А. Механизм взаимодействия Yersinia pestis с эритроцитами и его значение для патогенеза чумы / В.А. Федорова, З.Л. Девдариани / Вестник РАМН. 2007. - № 1. - С. 13-21.

98. Федорова, В.А. Влияние условий культивирования бактерий Yersinia pestis на индукцию специфического иммунитета при моделировании экспериментальной чумы у мышей / В.А. Федорова, А.Б. Голова, Ю.Ю. Елисеев // Иммунология. 2007. - № 6. - С. 371-374.

99. Харсеева, Г.Г. Влияние полиоксидония на адгезивные свойства Corinebacterium diphtheriae / Г.Г. Харсеева, Е.П. Москаленко, Э.Л. Алутина и др. // Журн. микробиол. 2009. - № 2. - С. 11-15.

100. Ценева, Г.Я. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний / Г.Я. Ценева, Н.Ю. Солодовникова, Е.А. Воскресенская // Клин микробиол. антимикроб, химиотер. 2002. - Т. 4. - № 3. - С. 248-266.

101. Шубин, Ф.Н. Влияние некоторых фторхинолонов на адгезивные свойства различных плазмидоваров Yersinia pseudotuberculosis / Ф.Н.

102. Шубин, Е.Ф. Зайцева, Н.Н. Беседнова // Антибиотики и химиотер. — 2000. -№ 5. С. 9-13.

103. Юринова, Г.В. Роль адгезии бактерий в колонизации слизистых оболочек организма (обзор) / Г.В. Юринова, В.И. Злобин, С.М. Попкова и др. // Бюл. СО РАМН. 2001. - № 3. - С.90-93.

104. Arne, P. Increase tracheal colonization in chicken without impairing pathogenic properties of avian pathogenic E. coli MT78 with fimH deletion / P. Arne, D. Marc // Avian Diseases. 2000. - Vol. 44, № 2. - P.343-355.

105. Arp L.H. Bacterial infection of mucosal surface: an overview of cellular an overview of cellular and molecular mechanisms / L.H. Arp // Virulence mechanisms of bacterial pathogens / J.A Roth (ed.). Washington D.C. 20006. - 1988.-P.3-27.

106. Ben-Efraim, S. New antigenic component of Pasteurella pestis formed under specific conditions of pH and temperature / S. Ben-Efraim, M. Aronson, L. Bichowsky-Slomnicki // J. Bacterid. 1961. - Vol. 81, № 1. - P. 704-714.

107. Bian, Z. Nucleator function of CsgB for the assembly of adhesive surface organelles in Escherichia coli / Z. Bian, S. Normark // EMBO J. -1997. Vol. 16. - P.5827-5836.

108. Bichowsky-Slomnicki, L. Biological activities in the extracts of Pasteurella pestis and their relationship to the "pH 6 antigen." / L. Bichowsky-Slomnicki, S. Ben-Efraim // J. Bacteriol. 1963. - Vol. 86, № 8. -P. 101-111.

109. Boyle, E.C. Bacterial pathogenesis: exploiting cellular adherence / E.C. Boyle, B.B. Finlay // Curr. Opin. Cell Biol. 2003. - Vol. 15, №. 2. - P. 633639.

110. Braga, P.C. Influence of enoxacin sub-MICs on the adherence of Staphylococcus aureus and Escherichia coli to human buccal and urinaryepithelial cells / P.C. Braga, G. Piatti // Chemotherapy. 1992. - Vol. 38, № 4. -P .261-266.

111. Brinton, C.C. The structure, function, synthesis, and genetic control of bacterial pili and a model for DNA and RNA transport in gram negative bacteria / C.C. Brinton // Trans. N. Y. Acad. Sci. 1965. - Vol. 27, № 8. - P. 1003-1065.

112. Bryan, R. The effects of aerosolized dextran in a mouse model of Psendomonas aeruginosa pulmonary infection / R. Bryan, M. Feldman, S.C. Jawetz etal.//J. Infect. Dis. 1999.-Vol. 179.-P. 1449-1458.

113. Bullitt, E. Structural polymorphism of bacterial adhesion pili / E. Bullitt, L. Makowski // Nature. 1995. - Vol. 373. - P. 164-167.

114. Carpentier, B. Biofilms and their consequences, with particular reference to hygiene in the food industry / B. Carpentier, O. Cerf // J. Appl. Bacteriol. -1993. Vol.75, №. 6-P. 499-511.

115. Chakraborty, S. Type IV pili in Francisella tularensis: roles of pilF and pilT in fiber assembly, host cell adherence, and virulence / S Chakraborty, M. Monfett, T.M. Maier et al. // Infect. Immun. 2008. - Vol. 76, №. 7. - P. 2852-2861.

116. China, B. The pYV plasmid of Yersinia encodes a lipoprotein YlpA, related to TraT / B. China, T. Michiels, G.R. Cornells // Mol. Microbiol. -1990. Vol.-P. 1585-1593.

117. Cornelis, G.R. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome / G.R. Cornelis, A. Boland, A.P. Boyd et al. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1998.-Vol. 62, №5.-P. 1315-1352.

118. Costerton, J.W. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections / J.W. Costerton, P.S. Stewart, E.P. Greenberg // Science. 1999. -. 284. -P. 1318-1322.

119. Costerton, J.W. The application of biofilm science to the study and control of bacterial infections / J.W. Costerton, R. Veeh, M. Shirtliff et al. // J.Clin. Invest.-2003.-Vol. 112,№ 10. P.1466-1477.

120. Cowan, C. Invasion of epithelial cells by Yersinia pestis: evidence for a Y. pestis-specific invasin / C. Cowan, H.A. Jones, Y.H. Kaya et al. // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, № 8. - P. 4523-4530.

121. Derewenda, U. The structure of Yersinia pestis V-antigen, an essential virulence factor and mediator of immunity against plague / U. Derewenda, A.Mateja, Y.Devedjiev et al. // Structure. (Camb). 2004. - Vol. 12, № 2. -P. 301-306.

122. Donlan, R.M. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms / R.M. Donlan, J.W. Costerton // Clin. Microbiol. Rev. — 2002. Vol. 15, № 2. - P. 167-193.

123. Donnenberg, M.S. Interactions between enteropathogenic Escherichia coli and host epithelial cells / M.S. Donnenberg, J.B. Kaper, B.B. Finlay / Trends Microbiol. 1997. - Vol. 5. - P. 109-114.

124. Du, Y. Role of fraction 1 antigen of Yersinia pestis in inhibition of phagocytosis / Y. Du, R. Rosqvist, A. Forsberg // Infect. Immun. 2001. -V. 70, №3.-P. 1453-1460.

125. Dubreuil, J.D. Helicobacter pylori interactions with host serum and extracellular matrix proteins: potential role in the infectious process / J.D. Dubreuil, G. Del Giudice, R. Rappuoli // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. -Vol. 66, №4-P.617-629.

126. Duguid, J.P. The fimbrial and non-fimbrial haemagglutinins of Escherichia coli / J.P. Duguid, S. Clegg M.I. Wilson // J. Med. Microbiol. — 1979. -Vol. 12, № 8. P. 213-228.

127. Dunne, W.M. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately? / W.M. Dunne//Clin. Microbiol. Rev.-2002.-Vol. 15, №. 2.-P. 155-166.

128. Elliot, S.J. The complete sequence of the locus of enterocyte effacement (LEE) from enteropathogenic Escherichia coli E2348/69 / S.J. Elliot, L. Wainwright // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 28, № 1. - P. 1-4.

129. Evans, D.J. Haemagglutination typing of Escherichia coli: definition of seven haemagglutination types / D.J. Evans, D.G. Evans, L.S.Young et al. 11 J.Clin. Microbiol. 1980. - Vol. 12. - P. 235-242.

130. Fields, K.A. Virulence role of V antigen of Yersinia pestis at the bacterial surface I K.A. Fields, M.L. Nilles, C. Cowan et al. // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, № 10. - P. 5395-5408.

131. Finlay, B. Common themes in microbial pathogenicity / B. Finlay, S. Falkow//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. - Vol.61, № 2. - P. 139-169.

132. Gal van, E.M. The Psa fimbriae of Yersinia pestis interact with phosphatidylcholine on alveolar epithelial cells and pulmonary surfactant / E.M. Galvan, H. Chen, D.M. Schifferli // Infect. Immun. Vol. 75, № 3. - P. 1272-1279.

133. Gophna, U. Curli fibers mediate internalization of Escherichia coli by eukaryotic cells / U. Gophna, M. Barlev, R. Seijffers et al. // Infect. Immun. — 2001. Vol. 69, № 4.- P. 2659-2665.

134. Graham, K.L. The Campylobacter fetus S-layer is not essential for initial interaction with FIEp-2 cells / K.L. Graham, L.L. MacDonalds // Can. J. Microbiol. 1998. - Vol. 44, № 3. - P. 244-250.

135. Flacker, J. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. / J. Hacker, G. Blum-Oehler, I. H. Tschape //Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 23, № 4. - P. 1089-1097.

136. Flambrook, J., The interaction of Pseudomonas aeruginosa PAK with human and animal respiratory tract cell lines / J. Hambrook, R. Titball, C. Lindsay // FEMS Microbiol. Lett. 2004. -Vol. 238, № 5. - P. 49-55.

137. Flladka, O.A. The effect of antibiotics on the adhesion of C. diphtheriae to buccal epithelial cells / O.A. Hladka, O.J. Motyka. 1998. - Mikrobiol. Z. -Vol. 60, № 2. - P. 60-64.

138. Fluang, X.-Z. The pH 6 antigen is an antiphagolitic factor produced by Yersinia pestis independent of Yersinia outer proteins and capsule antigen / X.

139. Z. Huang, L.E. Lindler // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72, № 12. - P. 72127219.

140. Hultgren, S.J. Pilus and nonpilus bacterial adhesins: assembly and function in cell recognition / S.J. Hultgren, S Abraham, M. Caparon // Cell. — 1993. Vol. 73. — P.887-901.

141. Humbert, J. Electron microscopic improvement in the study of diarrheagenic Escherichia coli / J. Humbert, M. Jouve, C. Le Bouguenec et al. // Microsc. Res. and Techn. 2000. - Vol. 49, № 4. - P.383-393.

142. Hyland, R.M. The bundlin pilin protein of enteropathogenic Escherichia coli is an N-acetyllactosamine-specific lectin / R.M. Hyland, J. Sun, T.P. Griener et al. / Cell. Microbiol. 2008. - Vol. 10, № 6. - P. 177-187.

143. Idanpaan-Heikkila, I. Oligosaccharides interfere with the establishment and progression of experimental pneumococcal pneumonia / I. Idanpaan-Heikkila, P.M. Simon, M. Zopf et al. // J. Infect. Dis. 1997. - Vol. 176. - P. 704-712.

144. Isberg, R.R. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permit invasion of cultured animal cells by Escherihia coli KK12 / R.R. Isberg, S. Falkow // Nature. 1985. - Vol. 317, № 9. - P. 262264.

145. Isberg, R.R. Identification of invasin: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells / R.R. Isberg, D. Voorhis, S. Falkow // Cel. 1987. - Vol. 50, № 7. - P. 769-778.

146. Johanson, W.G. Association of respiratory tract colonization with adherence of gram-negative bacilli to epithelial cells / W.G. Johanson, D.E. Woods, T. Chaudhuri // J. Infect. Dis. Vol. 139, № 3. - P. 667-673.

147. Jones, G.W. Proteinaceous bacterial adhesins and their receptors / G.W.Jones, R.E. Isaacson // Crit. Rev. Microbiol. 1983. - Vol.10. - P. 229260.

148. Jones, C.H. FimH adhesin of type 1 pili is assembled into a fibrillar tip structure in the Enterobacteriaceae / C.H. Jones, J.S. Pinkner, R. Roth et al. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1995. - Vol. 92. - P. 2081-2085.

149. Jones, R. Lactobacillus allograft pyelonrphritis and bacteriemia / R.Jones, M. Ellbogen, R. Dunlay // Nephron. 2000. - Vol. 86, № 4. - P. 502.

150. Khursigara, C. Enteropathogenic Escherichia coli virulence factor bundle-forming pilus has a binding specificity for phosphatidylethanolamine / C. Khursigara, M. Abul-Milh, B. Lau et al. // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, №6. -P. 6573-6579.

151. Klemm, P. Type I fimbriae of E. coli / P. Klemm, K. Krogfelt // Fimbriae, adhesion, genetics, biogenesis, and vaccines / P. Klemm (Ed.). -CRC Press Boca Ratoc. Fl., 1994. P. 9-29.

152. Klemm, P. Bacterial adhesins: function and structure / P. Klemm, M.A. Schembri. Int. J. Med. Microbiol. - 2000. - Vol. 290. - P. 27-35.

153. Knirel, Y.A. Structural features and structural variability of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis, the cause of plague / Y.A Knirel, S.V. Dentovskaya, S.N. Senchenkova et al. // J. Endotoxin. Res. 2006. - Vol. 12, № 1. - P. 3-9.

154. Konnov, N.P. Electron and scanning probe microscopy study of Slayers of plague microbe: Optical microscopy part of BIOS'98. Stockholm: Proceeding ofSPIE. - 1998.-Vol. 3568.-P.38.

155. Kwaga, J. Plasmid and outer membrane proteins of Yersinia enterocolitica and related species of swin origin / J. Kwaga, J.O. Iversen // Vet Microbiol. 1993.-№ 36.-P. 205-214.

156. Labbate, M. Quorum-sensing regulation of adhesion in Serratia marcescens MG1 is surface dependent / M. Labbate, H. Zhu, L. Thung et al. // J. Bact. 2007. - Vol. 189, № 7. - P. 2702-2711.

157. Lahteenmaki, K. Expression of plasminogen activator Pia of Yersinia pestis enhances bacterial attachment to the mammalian extracellular matrix / K. Lahteenmaki, R. Virkola, A. Saren et al. // Infect. Immun. 1998. -Vol. 66, № 11.-P. 5755-5762.

158. Lahteemaki, K. Bacterial plasminogen activators and receptors / K. Lahteemaki, P. Kuusela, T.K. Korhonen // FEMS Microbiol. Rev. 2001. -Vol. 25, №5.-P. 531-52.

159. Lahteenmaki, K. The Pia surface protease/adhesin of Yersinia pestis mediates bacterial invasion into human endothelial cells / K. Lahteenmaki, M. Kukkonen, T.K. Korhonen // FEBS Lett. 2001. -Vol. 504, № 7. -P. 69-72.

160. Lindler, L.E. Yersinia pestis pH 6 antigen forms fimbriae and is induced by intracellular association with macrophages / L.E. Lindler, B.D. Tall // Mol. Microbiol. 1993.-Vol. 8, № 5. - P. 311-324.

161. Lippi, D. Plague, policy, saints, and terrorists: a historical survey / D. Lippi, A. Conti // J. Infect. 2002. - Vol. 44, № 4. - P. 226-228.

162. Liu, F. The effects of Psa and Fl on the adhesive and invasive interactions of Yersinia pestis with human respiratory tract epithelial cells // F. Liu, H. Chen, E.M. Galvän et al. // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, № 10. -P. 5636-5644.

163. Makoveichulc, E. pH6 antigen of Yersinia pestis interacts with plasma lipoproteins and cell membranes / E. Makoveichuk, P. Cherepanov, S. Lundberg et al. / J. Lipid Res. 2003. - Vol. 44. - P. 320-330.

164. Mertz, P.M. Model for studying bacterial adherence to skin wounds / P.M. Mertz, J.M. Patti, J.J. Marcin et al. // J. Clin. Microbiol. 1987. -Vol. 25, №9.-P. 1601-1604.

165. Minlca, S. Isolation and chemical characterization of type R lipopolysaccharides of a hypovirulent strain of Yersinia pestis / M. Minka, S. Bruneteau // Can. J. Microbiol. 1998. - Vol. 44, № 5. - P. 477-481.

166. Mwengee, W. Treatment of plague with gentamicin or doxycycline in a randomized clinical trial in Tanzania / W. Mwengee, T. Butler, S. Mgema et al. // Clin. Infect. Dis. 2006. - Vol. 42, № 5. - P. 614-621.

167. Nealon, T.J. Role of cellular lipoteichoic acids in mediating adherence of serotype III of group B streptococci to human embryonic, fetal and adult epithelial cells / T.J. Nealon, S.J. Mattingly // Infect. Immun. 1984. Vol. 43, № 12.-P. 523-530.

168. Nougayrede, J.P. Adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to host cells / J.P. Nougayrede, P.J. Femandes, M.S. Donnenberg // Cell. Microbiol. -2003.-Vol. 5. P. 359-372.

169. Old, D.C. Relationships among broad-spectrum and narrow-spectrum mannose-resistant fimbrial hemagglutinins in different Yersinia species / D.C. Old, R.A. Adegbola // Microbiol. Immun. 1984. - Vol. 28, № 5. - P. 13031311.

170. Olsen, A. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli / A. Olsen, A. Jonsson, S. Normark // Nature.-1989.-Vol. 338.-P. 652-655.

171. Otterman, K.M. Roles for motility in bacterial-host interactions / K.M. Otterman, J.F. Miller // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24, № 6. - P. 11091117.

172. Owen, P. Discrimination between intracellular uptake and surface adhesion of bacterial pathogens / P. Owen // Biochem. Soc. Trans. — 1992. — Vol. 20, № l.-P. 1-6.

173. Paerregaard, A. Role of the Yersinia outer membrane protein YadA in adhesion to rabbit intestinal tissue and rabbit intestinal brush border membrane vesicles / A. Paerregaard, F. Espersen, M. Skumik // APMIS. 1991. - Vol. 99, № 5.-P. 226-232.

174. Pan, W.-H. The correlation between surface hydrophobicity and adherence of Bifidobacterium strains from centenarians' faces / W.-H. Pan, P.L. Li, Z.Liu//Anaerobe. Vol. 12, №3.-P. 148-152.

175. Payne, D. The pPI6 antigen of Yersinia pestis binds to ßl-linked galactosil residues in glicosphingolipids / D. Payne, D. Tatham, E.D. Williamson et al. // Infect. Immun. 1997. - Vol. 66. - P. 4545-4548.

176. Pederson, K.J. The ClpP protein, a subunit of the Clp protease, modulating ail gene expression in Yersinia enterocolitica / K.J. Pederson, S. Carlson, D.E. Pierson // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 26, № 9. - P. 99-107.

177. Perry, R.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague / R.D. Perry, J.D. Fetherston // Clin. Microbiol. Rev. - 1997. - Vol.10, №1. -P.35-66.

178. Pierson, D.E. The ail gene of Yersinia enterocolitica has a role in the ability of the organism to survive serum killing / D.E. Pierson, S. Falkow // Infect. Immun. 1993.-Vol. 61, №2.-P. 1846-1852.

179. Pultz, N.J. Adhesion of vancomycin-resistant Enterococcus to human intestinal mucus / N.J. Pultz, S. Vesterlund, A.C. Ouwehand et al. // Curr. Microbiol. 2006. - Vol. 52, № 3. - P. 221-224.

180. Riedel, S. Plague: from natural disease to bioterrorism // S. Riedel // Proc. (Bayl. Univ. Med. Cent). 2005. - Vol. 18, № 2. - P. 116-124.

181. Sahly, H. Capsule impedes adhesion to and invasion of epithelial cells by Klebsiella pneumoniae / H. Sahly, R. Podschun, T.A. Oelschlaeger et al. // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, №. 12. - P. 6744-6749.

182. Sara, M. S-layer proteins / M. Sara, U.B. Sleytr // J. Bacteriol. 2000. -Vol. 182, №4.-P. 859-868.

183. Savage, D.G. Overview of the association of microbes with epithelial surfaces / D.G. Savage // Microecol. Therapy. 1994. - Vol. 14. - P. 59-78.

184. Schoolnik, G.K. Molecular approaches for the study of uropathogens /

185. G.K. Schoolnik, D.L Lark, P.D. OTIanley // Infect. Immun. 1988. -Vol. 45. -P. 201-21 1.

186. Schulz-Koops, H. Outer membrane protein YadA of enteropathogenic Yersinia mediates specific binding to cellular but not plasma fibronectin /

187. H. Schulz-Koops, H. Burkhardt, J. Heesemann// Infect. Immun. 1993. - Vol. 61, № 12. - P. 2513-2519.

188. Shink, B. Prokaryotes in biosphere / B. Shink // Biology of the Prokaryotes / J. Lengeier, G. Drews, H. Schlegel (eds.). Wiley-Blackwell. 1998.-P. 723-762.

189. Soto, E.G. Bacterial adhesins: common themes and variations in architecture and assembly / G.E. Soto, S.J. Hultgren // J. Bacterid. 1999. -Vol. 181, №4.-P. 1059-1071.

190. Speziale, P. Fibronectin binding to a Streptococcus pyogenes strain / P. Speziale, M. Hook, L.M. Switalski et al. // J. Bacteriol. 1984. - Vol. 157, № 2. - P. 420-427.

191. Stephens, D.S. Loss of pili and decreased attachment to human cells by Neisseria meningitis and Neisseria gonorrhoaea to subingibitory concentrations of antibiotics / D.S. Stephens, J.W. Krebs, Z.A. McGee // Infect. Immun. Vol. 46, № 1. - P. 507-513.

192. Straley, S.C. Yops of Yersinia spp. pathogenic for humans / S.C. Straley, E. Skrzypek, G.V. Piano et al. // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61, № 8. -P. 3105-3110.

193. Striker, R. Structural requirements for the glycolipid receptor of human uropathogenic E. coli / R. Striker, U. Nilsson, A. Stonecipher et al. // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 16, № 7. - P. 1021-1029.

194. Swietnicki, W. Yersinia pestis Yop secretion protein F: purification, characterization, and protective efficacy against bubonic plague / W. Swietnicki, B.S. Powell, J. Goodin // Protein. Expr. Purif. 2005. - Vol. 42, № 1. - P. 166172.

195. Tan, L. Yersinia pestis is viable with endotoxin composed of only lipid A / L. Tan, C. Darby // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, № 18. - P. 6599-6600.

196. Testerman, T.L. Adherence and colonization / T.L.Testerman, D.J. McGee, FI.L.T. Mobley // Helicobacter pylori: physiology and genetics / H.L.T. Mobley, G.L. Mendz, S.L. Hazell (eds.). ASM Press, Washington, D.C. 2001. - p. 381-417.

197. Thomas, D.D. Interactions of Treponema pallidum with endothelial cell monolayers / D.D. Thomas, A.M. Fogelman, J.N. Miller et al. // Eur. J. Epidemiol. 1989. - Vol.5, №1. - P. 15—21.

198. Thomas, R. Common oligosaccharide moieties inhibit the adherence of typical and atypical respiratory pathogens // R. Thomas, T. Brooks // J. Med. Microbiol. 2004. - Vol.53. - P. 833-840.

199. Thomas, R. Attachment of Yersinia pestis to human respiratory cell lines is inhibited by certain oligosaccharides / R.Thomas, T. Brooks // J. Med. Microbiol. 2006. - Vol. 55. - P. 309-315.

200. Tobe, T. Complete DNA sequence and structural analysis of the enteropathogenic Escherichia coli adherence factor plasmid / T.Tobe, T. Tayashi, C.G. Han et al. // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, № 10. - P. 5455-5462.

201. Torruellas, J. The Yersinia pestis type III secretion needle plays a role in the regulation of Yop secretion / J. Torruellas, M.W. Jackson, J.W. Pennock et al. // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 57, № 6. - P. 1719-1733.

202. Viboud, G.I. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis / G.I. Viboud, J.B. Bliska // Annu. Rev. £ Microbiol. 2005. - Vol. 59, №7. - P. 69-89.

203. Vosbeck, K. Adhesiveness, hemagglutination and piliation of Escherichia coli grown in sub-MIC concentrations of antibiotics / K. Vosbeck, J. Bohn, U. Huber 11 Experientia. 1980. -Vol. 36. - P. 494.

204. Wadstrom T. Molecular aspects on pathogenesis of wound and foreing body infections due to staphylococci / T. Wadstrom // Zbl. Bacteriol. Hyg. Ser. A. -1987.-Bd. 266, H. -2. S. 191-211.

205. Walker, T.S. Rickettsial interactions with human endothelial cells in vitro: adherence and entry / T. S. Walker / Infect. Immun. 1984. - Vol. 44, № 12.-P. 205-210.

206. Watnick, P.I. A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor / P.I. Watnick, K.J. Fullner, R. Kolter / J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181, № 37. - P. 3606-3609.122 ^

207. Wu, Q. Subinhibitory concentrations of antibiotics affect cells surfaces properties of Streptococcus sorbinus / Q. Wu, Q. Wang, K.G. Tailor et al. // J. Bacteriol.- 1995,-Vol. 177, № 5. P.1399-1401.

208. Yang, Y. Transcriptional regulation of the Yersinia pseudotuberculosis pH6 antigen adhesin by two envelopeeassotiated components / Y. Yang, R.R. Isberg // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24, № 6. - P. 499-510.

209. Zaretsky, F.R. Sulfated polyanions block Chlamydia trachomatis infection of cervix-derived human epithelia / F.R. Zaretsky, R. Pearce-Pratt, D.M. Phillips // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, № 9. - P. 3520-3526.

210. Zhou, D. Molecular and physiological insights into plague transmission, virulence and etiology / D. Zhou, Y. Han, R. Yang // Microbes Infect. 2006. -Vol. 8, №1. - P. 273-284.

211. Zhou, D. Molecular Darwinian evolution of virulence in Yersinia pestis I D. Zhou, R.Yang // Infect. Immun. 2009. - Vol. 77, № 6. - P. 2242-2250.

Информация о работе

Ивонин, Алексей Геннадьевич
кандидата биологических наук
Казань, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Оценка адгезивных свойств штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы