Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Открытая рамка считывания ybhE Escherichia coli кодирует ранее неизвестную 6-фосфоглюконолактоназу (Pgl)

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Открытая рамка считывания ybhE Escherichia coli кодирует ранее неизвестную 6-фосфоглюконолактоназу (Pgl)"

На правах рукописи

ЗИМЕНКОВ Данила Вадимович

Открытая рамка считывания ybhE Escherichia coli кодирует ранее неизвестную 6-фосфоглкжонолактоназу (Pgl)

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2005 г.

Работа выполнена в лаборатории №4 Закрытого Акционерного общества «Научно-исследовательского института Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор С.В. Машко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор P.C. Шакулов

доктор биологических наук, профессор Н.К. Янковский

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН.

Защита диссертации состоится 31 мая 2005 года в часов на заседании Диссертационного совета Д217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат разослан « 23» (XA^zA^ 2005 г,

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук В.И. Щербакова

Введение.

Актуальность проблемы.

Создание штаммов-продуцентов биологически активных веществ требует фундаментальных знаний о метаболических процессах происходящих в живой клетке наряду с обладанием молекулярно-биологическим инструментарием для модификации генетической информации штамма. Наиболее изученным молекулярно-биологическим объектом является бактерия Escherichia coli, поэтому неудивительно, что большинство промышленных продуцентов создано именно на ее основе. Несмотря на обширные знания о метаболизме и регуляции экспрессии генов в Е coli, приведшие к современным исследованиям в области метаболической инженерии, тем не менее, даже на карте центрального метаболизма этого организма остаются «белые пятна».

Хорошо известно, что метаболизм E.coli организован таким образом, чтобы быстро утилизировать глюкозу через гликолиз и путь трикарбоновых кислот. Альтернативой гликолизу служит окислительная ветвь пентозофосфатного пути и затем либо через неокислительную ветвь обратно в гликолиз, либо через путь Ентнера-Дудорфа. В окислительной ветке происходит восстановление энергии за счет синтеза NADPH, а образующиеся в реакциях пентозо-фосфатного пути (РРР) метаболиты используются в биосинтезе нуклеотидов, ароматических аминокислот и витаминов. Мутанты по окислительной ветке РРР практически не отличаются по ростовым характеристикам от штаммов дикого типа при стандартном культивировании, так как необходимые предшественники могут синтезироваться и через неокислительную ветку РРР.

Современные исследования распределения потоков углерода в центральном метаболизме, как и более ранние, показывают, что в окислительную ветку РРР поступает 15-20% углерода исходной глюкозы, а остальная, существенно большая часть - непосредственно в гликолиз. Однако даже поток в 15-20% для использования образующихся в РРР метаболических интермедиатов как доноров углерода в дальнейшем биосинтезе излишен, и часть структурного углерода возвращается в гликолиз через неокислительную ветку.

Окислительная ветвь представляет собой три последовательные реакции, первая и третья из которых катализируются хорошо известными ферментами. Хотя мутация по второй стадии РРР - Pgl~ была описана для E.coli более 30 лет назад, тем не менее рамка считывания, кодирующая 6-фосфоглкжонолактоназу (6PGL) не идентифицирована до сих пор, и соответствующий фермент не выделен. В то же время 6PGLs охарактеризованы для большого ряда организмов. Они принадлежат к одному довольно обширному семейству, и можно выделить консервативные области их аминокислотных последовательностей. Однако, в E.coli нет гомологов данного семейства белков, и так как известо, что вторая реакция может протекать спонтанно, то существование данного фермента в E.coli даже подвергалось сомнению рядом исследователей. __—-----—---»

р.;'.. •

Наш интерес к окислительной ветви РРР также был обусловлен значимостью возможности увеличения уровня синтеза метаболических предшественников при создании промышленных штамммов-продуцентов ароматических аминокислот. В отличие от большинства аминокислот, предшественниками которых являются метаболиты гликолиза и цикла трикарбоновых кислот, в синтез ароматических аминокислот структурно вовлечены соединения, образующиеся в РРР. Обычной стратегией усиления потока через какую-либо ветвь метаболизма, является увеличение экспрессии всех генов, кодирующих ферменты данного пути. Однако то, что гену pgl не сопоставлена открытая рамка считывания делает реализацию данной стратегии невозможной. Следует отметить, что в большинстве стран действует ограничения «self-cloning» на промышленные штаммы-продуценты. При этом ограничении никакой гетерологичной информации не должно содержаться в штамме, и, поэтому, ввести чужеродный ген pgl и оптимизировать его экспрессию не представляется возможным. В связи с этим, актуальным представлялась идентификация pgl E.coli.

Цель и задачи работы.

Диссертационная работа посвящена идентификации структурной части гена, кодирующего 6PGL E.coli - фермент окислительной ветви пентозо-фосфатного пути метаболизма, и практическому применению усиления экспрессии этого гена в клетке для создания штаммов продуцентов ароматических аминокислот.

В процессе работы решались следующие задачи:

• идентификация рамки считывания, кодирующей 6PGL E.coli.

• исследование влияния усиленной экспрессии идентифицированного гена на продукцию ароматических аминокислот модельными штаммами продуцентами.

Научная новизна и практическая значимость.

В ходе работы на хромосоме E.coli была идентифицирована открытая рамка считывания, кодирующая 6-фосфоглюконолактоназу. Доказательство, что данная рамка действительно кодирует 6PGL, было основано как на фенотипическом анализе делеционного мутанта и комплементации мутантного фенотипа введением охарактеризованной 6-фосфоглюконолактоназы из другого организма, так и очисткой соответствующего белкового продукта и определением его активности in vitro.

Обнаружение гомологичных белков в других организмах позволяет утверждать, что охарактеризованный фермент является первым членом нового семейства 6-фосфоглюконолактоназ.

Были созданы хромосомные модификации, связанные с введением перед идентифицированной рамкой считывания iac-подобных промоторов, приводящие к усилению транскрипции и увеличению активности 6-

фосфоппоконолактоназы в клетках модифицированных штаммов Е coli. Данные модификации при введении в модельные штаммы-продуценты фенилаланина и триптофана приводили к значимому увеличению накопления целевых аминокислот.

Апробация работы.

Диссертационная работа была апробирована на семинаре ЗАО «АГРИ» в июле 2004 г. и на семинаре Секции Учёного Совета «Молекулярная Биология» ФГУП ГосНИИгенетика в марте 2005 г.

Материалы диссертации были представлены на «The Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting» (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 20-25.08.2002); на «Conference for young scientists on molecular biology and genetics, dedicated to the 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine» (Ukraine, Kiev, 25-27.09.03).

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на страницах, включая 29 рисунков и 5" таблиц. Список цитируемой литературы содержит 2¿í источников, в том числе на русском языке.

Основное содержание работы.

1. Идентификация структурной части гена pgl Е. coli.

Локус pgl был картирован между маркерами attX и chlD (rnodC) на хромосоме Ecoli Купором и Френкелем более 30 лет назад [Kupor, 1969]. Позже, в одном из полученных ими штаммов мутация была более точно локализована в области 17,2 мин. карты E.coli [E.coli Genetic Stock Center, http://cpsc.biology.vale.edu/1. В этой области хромосомы находится несколько открытых рамок считывания, потенциально кодирующих белки с неизвестной функцией.

1.1. Штамм AybhE проявляет свойства pgl мутанта. С помощью метода Red-зависимой модификации хромосомы, впервые предложенного Даценко и Ваннером, было сконструировано три мутантных штамма, в которых открытые рамки считывания ybhA, ybhE и ybhD были замещены на маркер устойчивости к хлорамфениколу.

Для каждого из полученных мутантов был проверен Mal-blu фенотип, описанный ранее для pgl мутанта, заключающийся в накоплении мальтодекстринов, окрашиваемых в синий цвет йодным раствором, при росте клеток на мальтозе в качестве единственного источника углерода. Только

штамм содержащий AybhE проявлял данный фенотип. Mal-blu фенотипом обладал как исходно полученный на основе штаммма BW25113 штамм BW-AybhE, так и полученный на его основе MG1655-AybhE, в который делеция рамки считывания переносилась трансдукцией антибиотического маркера. Отметим, также, что именно координаты этой неизвестной рамки считывания наилучшим образом соответствовали ранее имевшимся генетическим указаниям о локализации гена pgl в районе 17,2 мин. карты Е coli, см. Рис. 1. Параллельно, делеции ybh рамок были введены трансдукцией в штамм

17,2 мин 17,3 мин 17,4 мин

modCybhAybhE ybhDybhH ybhl ybhJ ybhC ybhB bioA

МС-Ар§1, в котором структурная часть гена pgi была замещена на маркер устойчивости к канамицину. МО-Др^ был получен из штамма М01655 также Кед-зависимой хромосомной модификацией. В штамме утилизация глюкозы идет через окислительную ветку РРР. При введении второй мутации блокирующей окислительную ветвь - тм^ рост штамма на глюкозе в качестве единственного источника углерода невозможен. Однако, так как субстрат второй реакции окислительной ветви, фосфоглюконолактон, способен к спонтанному гидролизу, при совмещении в одном штамме мутаций и pgl, роста клеток на глюкозе сильно замедлен по сравнению с /^'-мутантом, но не блокируется полностью.

Как показал анализ скорости образования колоний на агаризованной среде, скорость роста на глюкозе двойных мутантов уЬЪЕ, pgi была резко снижена по сравнению с родительским pgi, в то время как скорость роста штаммов на глюконате не отличалась. В качестве контроля также использовался двойной мутант уЫгО, pgi. Его рост на разных источниках углерода не отличался от родительского pgi.

В клеточных экстрактах родительского М01655 и МС-ДуЬЬЕ измерялась активность 6РОЬ. Для этих целей использовались коммерческие препараты ферментов глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы 6-фосфоглюконат

дегидрогеназы (Сгпс!) и их субстраты. В реакционной смеси ферментативно синтезировался 6-фосфоглюконолактон из глюкозо-6-фосфата, затем в реакцию добавлялась проба клеточного экстракта и избыток (Зпс1. Активность 6РвЬ в пробе, таким образом, измерялась спектрофотометрически по накоплению КАБРН в реакции, катализируемой Ст(1.

Для исследуемых штаммов были показаны следующие уровни активностей: (7 ± 2) Ед./мг для экстрактов МС1655; (0.5 ± 0.2) Ед./мг - для

MG1655-AybhE. Как видно, 6PGL активность в экстрактах АybhE мутантов по меньшей мере на порядок ниже, чем в штамме дикого типа, и эта активность сходна со скоростью реакции в контроле без добавления экстракта. Эта низкая ненулевая активность, по-видимому, и отражает наличие спонтанного гидролиза 5-6-фосфоглюконолактона.

Таким образом, все ранее описанные свойства pgl мутанта были продемонстрированы для AybhE варианта штаммаE.coli MG1655.

1.2. pgl ген из Р.putida комплементирует Mal-Blu фенотип AybhEE.coli.

Mal-blu фенотип описанный ранее для pgl мутанта и показанный для AybhE штаммов обусловлен накоплением мальтодекстринов при росте на мальтозе. Потребление мальтозы сопровождается удлинением цепи мальтодекстринов, который в последующем утилизируются мальтодекстрин-фосфорилазой (продукт гена malP) и фосфоглюкомутазой (продукт гена pgm). Штаммы не имеющие одной из этих активностей аккумулируют мальтодекстрины и проявляют тем самым Mal-blu фенотип.

Купор и Френкель предложили механизм Mal-blu фенотипа в pgl мутанте. Они предположили, что отсутствие активности 6PGL в клетке приводит к накоплению 6-фосфоглюконолактонов, за счет недостаточности спонтанного гидролиза. Ими также было показано, что 6-фосфоглюконолактоны претерпевают дефосфорилирование (спонтанное или ферментативное), в то же время было известно, что по крайней мере, S-6-глюконолактон ингибирует мальтодекстрин-фосфорилазы различных организмов, включая MalP E.coli. Таким образом, снижение 6PGL активности может уменьшать эффективность деградации мальтодекстринов.

Mal-blu фенотип был показан для AybhE штамма в данной работе. Для подтверждения природы Mal-blu фенотипа мы ввели в AybhE вариант штамма E.coli MGI 655 хорошо охарактеризованный ген pgl из Pseudomonas putida, чей белковый продукт не имеет гомологии с YbhE.

В клетках псевдомонад, активно использующих две первые стадии окислитетельной ветви пентозо-фосфатного пути для утилизации глюкозы, активности Zwf и Pgl хорошо сбалансированы по данным измерения в клеточных экстрактах. Более того, структурная организация этих генов, входящих в состав одного оперона, с частичным перекрыванием области терминации трансляции проксимального гена - zwf и участка инициации трансляции следующего цистрона - pgl, позволяет предполагать строго скоординированную трансляцию соответствующих белковых продуктов в результате хорошо известного эффекта трансляционного сопряжения.

Экспрессия гена pgl P.putida в составе плазмиды.

Фрагмент ДНК, содержащий SD-последовательность и структурную часть гена pgl из P.putida, был амплифицирован с помощью ПЦР и клонирован

в плазмиду pMDV3-Piac-ideal-LCmR под контролем промотора Ptac-ideal. Структура вставки затем подтверждалась секвенированием.

Полученной плазмидой трансформировался штамм E.coli MG 1655-AybhE, и затем он тестировался на Mal-blu фенотип. В качестве контроля использовался тот же штамм, трансформированный исходным вектором pMDV3 -P/ac-ideal-LCmR. Как и следовало ожидать, бактерии с введенным геном pgl теряли Mal-blu фенотип, в то время как контрольный штамм окрашивался в синий цвет также как и клетки без векторной плазмиды.

Экспрессия гена pgl в составе интегрированной в хромосому кассеты.

Для исключения возможности влияния самой плазмиды на метаболизм бактерии, решено было продемонстрировать комплементацию фенотипа путем интеграции в хромосому гена pgl в составе экспрессионной кассеты

Системы для интеграции гомо- или гетерологичных целевых фрагментов ДНК в бактериальную хромосому, использующие для этого генетические элементы хорошо известного фага-транспозона Mu E.coli были разработаны в различных лабораториях и в настоящее время широко применяются при конструировании штаммов. В нашем Институте распространение получила система, включающая две совместимые рекомбинантные плазмиды с относительно нестабильными репликонами. Первая из них - Хелперная плазмида рМНЮ, сконструированная на основе коммерчески доступного вектора pACYC184, имеет в своем составе селективный генетический маркер (KmR), а также фрагмент Д НК бактериофага Ми с генами фаговых репрессоров - cts62 и пег, а также цистронами А и В, кодирующими транспозазу и кофактор транспозиции, соответственно. Эта плазмида обеспечивает возможность индуцировать синтез фаговой транспозазы повышением температуры культивирования плазмидсодержащих клеток с 28 до 42°С.

Вторым элементом системы Mu-зависимой интеграции является Интегративная плазмида, позволяющая осуществлять клонирование генетических элементов для последующей интеграции в бактериальную хромосому так, чтобы они оказались фланкированы специфическими участками Mu-attL и Ми-attR.

В присутствие функционально активной транспозазы происходит репликативная транспозиция расположенной на Интегративной плазмиде Кассеты, при этом, как и в случае других репликативно-транспозируемых генетических элементов, перемещающаяся структура удваивается, и одна ее копия остается в исходном месте (в нашем случае - на плазмиде), а вторая оказывается в новой локализации (в некотором участке бактериальной хромосомы). Дальнейшее излечивание клеток от Интегративной плазмиды приводит к утрате исходной Кассеты с сохранением ее хромосомальной копии, что фенотипически характеризуется как Интеграция. Однако при пролонгированном действии транспозазы уже интегрированная в хромосому Кассета, претерпевая очередную репликативную транспозицию, может «интегрировать» вторую копию в новый локус бактериального генома и т.д.

Элиминация плазмид культивацией без антибиотиков при 42°С в течении 3-5 дней

Отбор интегрантов

Набор интегрантов с одной или несколькими копиями интегрированной кассеты

Шёуяок ХГ&тПЮ&а

л,.

В нашем Институте проведено конструирование серии специализированных Интегративных плазмид, которые были использованы в качестве векторов для интеграции искусственных и природных генов и оперонов в хромосому E.coli. Эти Интегративные векторы были созданы на основе репликонов различной копийности и содержали различные прокариотические регуляторные элементы в составе Кассеты, чтобы обеспечить эффективную экспрессию клонированных в их составе генетических конструкций после их интеграции в хромосому.

В данной работе для последующей Mu-зависимой интеграции гена pgl P.putida в геном E.coli в качестве Интегративного вектора была использована плазмида pMDV3-Ptac-ideal-LCmR, содержащая репликон и селективный маркер (Арк) из плазмиды pUC9, а также имеющая в составе Кассеты полилинкерную последовательность и несколько р-независимых терминаторов транскрипции, наличие которых должно было с одной стороны - предотвратить возможную транскрипцию интегрированных генов с бактериальных промоторов, локализованных в геноме штамма-интегранта «upstream» от точки интеграции Кассеты, а с другой - исключить возможность транскрипции хромосомальных генов с промоторов, входящих в состав интегрированной Кассеты. В составе кассеты также присутствует селективный маркер устойчивости к хлорамфениколу для отбора интегрантов и последующего переноса Кассеты в другой штамм трансдукцией.

Типичная схема проведения Mu-зависимой интеграции Кассеты в бактериальную хромосому представлена на Рис. 2. На первом этапе в клетки штамма E.coli MGI 655 трансформируется Хелперная плазмида с отбором трансформантов на среде с канамицином. Полученный плазмидный штамм используется в качестве реципиента для введения созданных Интегративных плазмид. Кратковременное повышение температуры с 28 до 42°С после введения Интегративной плазмиды в клетки приводит к активации синтеза транспозазы и достаточно эффективной репликативной транспозиции Кассеты с плазмиды в бактериальную хромосому. Дальнейшая селекция трансформантов на среде, содержащей ампициллин, при культивировании клеток при 37°С, как правило, позволяет отобрать (Kms) бактерии, уже утратившие относительно нестабильную Хелперную плазмиду. Излечивание от исходной Интегративной плазмиды осуществляется в результате инкубации в течении нескольких суток отобранных на предыдущем этапе клеток в жидкой среде при 42°С без аэрации. Полученные в результате этого Ар8-варианты тестируются на наличие Кассеты, интегрированной в бактериальную хромосому. Это осуществляется либо генетическими методами, если в составе Кассеты присутствует селективный маркер (в нашем случае для этих целей использовался гены устойчивости к хлорамфениколу), либо методом PCR. В том случае, когда экспрессия интегрированных генов была нетоксична для клетки, эффективность интеграции составляла более 80%, и поиск целевых интегрантов не представлял серьезной проблемы даже в условиях отсутствия в составе Кассеты селективного маркера.

Именно этот метод Mu-зависимой интеграции и был использован в нашей работе. В качестве Интегративной плазмиды использовалась описанная выше рекомбинантная плазмида pMDV3-Ptae-ideal-LCmR с клонированным геном pgl P.putida. В результате интеграции была получена серия независимых клонов интегрантов, наличие в которых целевой Кассеты в составе бактериальной хромосомы было доказано с помощью ПЦР после излечивания клеток от Хелперной и Интегративной плазмид.

f —^

К-вКе И-вКе 1 /

2 /

« 1 Т^ /

.............С^*.....1...........

-с=

Выделение хромосомной ДНК

^ -*-*-с=?=

Рестрикция

\

Самокольцевание I фрагментов I

{ о О

ПЦР с праймерами 1 и 2

I

- сайт рестрикции 1,2 - праймеры

1С - Интегрированная Кассета с известной первичной последовательностью

_1_1-1-

Ооо

о-

<1

Секвенирование фрагмента и определение его локализации на хромосоме

ЙИСОУЯО* ' 7ЧЬИМ» .ь-*—-к—а-»»' дяааи -а

Так как интеграция Кассеты происходит случайным образом (специфичности в первичной последовательности сайта интеграции практически нет), то для целей переноса Кассеты в другой штамм необходимо определить точки интеграции. Трансдукцией с помощью фага Р1 переносится фрагмент ДНК длиной примерно 100 т.п.н, таким образом для переноса выбирается Кассета расположенная на достаточном расстоянии от мутантных локусов, во избежание замещения хромосомной ДНК штамма реципиента

донорной ДНК, фланкирующей Кассету.

Для определения точек Mu-зависимой интеграции созданных Кассет был использован метод, общая схема которого приведена на Рис.3. Следует отметить, что этот метод является модификацией известного подхода (получившего в литературе название inverse PCR), применяемого, в частности, для определения нуклеотидной последовательности области геномной ДНК, которая граничит с участком известной первичной структуры.

Как видно из Рис.3 определение точки интеграции осуществляется в несколько этапов:

• Из выращенных клеток штамма-интегранта выделяется хромосомальная ДНК и гидролизуется рестриктазой, один из сайтов узнавания которой расположен в известном месте интегрированной Кассеты.

• Полученная смесь фрагментов обрабатывается ДНК лигазой при низкой концентрации ДНК, чтобы обеспечить преимущественное образование мономерных кольцевых молекул, а не гетерополимеров, содержащих различные участки бактериального генома. В образованной таким образом смеси кольцевых молекул присутствуют и те, которые содержат фрагмент Кассеты (до сайта использованной при гидролизе рестриктазой) и участок, непосредственно примыкающий к ней в составе генома штамма-интегранта, причем стыкуются эти две последовательности с одной стороны по месту интеграции, а с другой - по сайту узнавания использованной рестриктазы.

• Кольцевые фрагменты ДНК, полученные на предыдущем этапе, используются в качестве матрицы для проведения PCR, при этом в качестве «праймеров» выбирают олигонуклеотиды, отжигающиеся на известную часть Кассеты и способные обеспечить амплификацию хромосомальной ДНК, фланкированную последовательностями Кассеты.

• Анализ нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента ДНК и установление местоположения конкретного хромосомального фрагмента на геноме Е coli позволяет определить точку интеграции Кассеты.

Хотя возможные размеры амплифицирующихся фрагментов определяются расстояниями между соседними сайтами рестрикции на хромосоме, и для генома E.coli MG1655 могут варьировать от нуля и до нескольких тысяч пар нуклеотидов, обычно, используя обработку ДНК штамма-интегранта двумя-тремя различными рестриктазами, нам удавалось обеспечить амплификацию фрагмента ДНК с длиной, не превышающей 1 кб, что было оптимально для дальнейшего анализа.

Этот разработанный нами метод определения точек Ми-зависимой интеграции экспрессионных Кассет неоднократно использовался в различных исследовательских проектах нашего Института, а в рамках данной работы был применен для установления точек интеграции гена pgl P.putida в хромосому нескольких независимо полученных интегрантов.

Для перенесения экспрессионной кассеты в штамм с AybhE была выбрана точка интеграции лежащая на достаточном удалении от природной локализации гена ybhE. Положение кассеты 3769327(81,2 мин), положение

гена - 797809^798804 (17,2мин)

Интегрированная копия гена pgl из P.putida была перенесена трансдукцией в штамм MG-AybhE. Как и следовало ожидать для штамма с 6PGL активностью, полученные трансдуктанты потеряли Mal-blu фенотип.

1.3. Очистка белка YbhE с His-Tag и определение его 6PGL активности.

В то время когда все результаты диссертации были получены, и была оформлена и принята патентная заявка (25 февраля 2004), была опубликована статья Thomason et al. (8 декабря 2004), в которой постулировалось, что ybhE кодирует 6-фосфоглюконолактоназу E.coli. Доказательная база статьи заключалась в фенотипических свойствах делеционного мутанта, выполненных примерно также, как и изложено выше, была основана на измерении активности в грубых клеточных экстрактах и на комплементации делеционного фенотипа введением экспрессирующейся копии гена ybhE E.coli на плазмидном векторе.

Принимая во внимание изложенные выше результаты и приведенные в статье Thomason et al. можно утверждать, что ген ybhE имеет отношение к проявлению 6PGL активности в E.coli. Однако нельзя было исключать возможность, что ген ybhE - не структурная часть гена 6-фосфоглюконолактоназы, а ген, кодирующий белок, который, в свою очередь, модулирует активность 6PGL в клетке. Таким модулятором мог бы выступать, например, позитивный регулятор транскрипции неизвестного гена pgl. Соответственно, окончательное заключение о природе гена ybhE можно было сделать только на основе прямого определения биологической активности его белкового продукта.

Ген ybhE был экспрессирован нами в системе на основе РНК полимеразы фага Т7 и узнаваемого ею фагового промотора, включающей в себя штамм Ecoli BL21(DE3), несущий ген Т7 РНК полимеразы в хромосоме под контролем лактозного промотора, и векторную плазмиду рЕТ-22Ь(+), обеспечивающую транскрипцию клонируемых в ее состав генов с позднего промотора фага Т7 и инициацию трансляции образующихся при этом мРНК с высокоэффективного сайта связывания рибосом гена 10 фага Т7. Таким образом, при использовании этой экспрессионной системы синтез целевого белка активируется добавлением индуктора лактозной системы ИПТГ в среду растущей бактериальной культуры.

Для удобства последующей очистки белка в последовательность клонируемого нами гена ybhE сразу за ATG кодоном было введено 6 дополнительных His кодонов.

ДНК, содержащая модифицированный ген, была амплифицирована с помощью ПЦР и клонирована в векторную плазмиду. Структура амплифицированного фрагмента была проверена секвенированием в составе полученной таким образом плазмиды.

Полученной рекомбинантной плазмидой был трансформирован штамм

Е.соИ ВЬ21(ОЕЗ). Через 2 часа после индукции экспрессии клонированного гена в логарифмической кулыуре и электрофоретического разделения клеточных белков можно было наблюдать накопление белкового продукта ожидаемой массой для ШsTag-YbhE (~37кОа). Белок накапливался, в основном, в растворимой фракции, до уровня примерно 15% от суммарных клеточных полипептидов (Рис.4). Накопление бежа сопровождалось значительным увеличением активности 6РвЬ в экстрактах рекомбинантного штамма по сравнению с экстрактами из неиндуцированных клеток и штамма дикого типа (данные не представлены).

.у..' .-(Vi» ■■-.1 2 3 4 5 6

116 kDa Чб.2 kDa ч45.0 Юа \5.0 kDa ч-25.0 kDa •>-18.4 kDa 14.4 kDa

KiVIrfHtW

aICUght Ч IJklll 11 l| % llklil I , Uli ЙН^ »Ita« , Ml • , k

ййяй&з* pfrteitf'niäl

(His)6-YbhE был очшцен на металл-хелатной Ni-NTA колонке. Как видно из рисунка Рис.4., чистота полученного препарата белка была больше 90%. Для него была измерена 6PGL активность, как описано выше. Интересно, что полученная активность для очищенного (His)e-YbhE - 780 Ед./мг сравнима с активностью полученной ранее человеческой 6PGL (710 Ед./мг), измеренной тем же способом [Collard,1999],

Таким образом, можно заключить, что открытая рамка считывания ybhE с координатами (797809-^798804) на геноме Е. coli MG1655 является геном pgl кодирующим 6-фосфоглкжонолактоназу.

1.4. Поиск белков гомологичных YbhE Е. coli в других организмах.

В результате поиска по базе данных NCBI с использованием программы

BLAST ihttp://ncbi.nih.gov/BLAST/) было найдено значительное количество белков гомологичных YbhE Е coli в различных организмах, таких как Shigella flexneri (белковый продукт гена ybhE - 93% идентичности и 94% гомологии), Salmonella typhmurium (YbhE - 87% и 90%, соответственно), Erwinia carotovora (59% и 72%), Yersinia pestis (3-карбоксимуконат циклаза - 56% and 69%), и т.д.

В целом, список гомологов YbhE Е coli с уровнем гомологии больше 50% включает в себя 8 прокариотических белков, аннотированных как «гипотетический белок YbhE». Также обнаружена гомология с 3-карбокси-муконат циклазами из различных организмов. Внутри аминокислотной последовательности YbhE с помощью программы «NCBI Conserved Domain Search» были найдены три перекрывающихся консервативных белковых домена. Два из них принадлежат семействам белков с неизвестной функцией, а один принадлежит 3-карбокси-муконат циклазному семейству COG2706.

Обнаружена также гомология с белком из Bacillus cereus аннотированным как 6PGL (28% идентичности с YbhE E.coli и 44% гомологии), однако ссылок на экспериментальное подтверждение функции этого белка нет.

С другой стороны, в результате поиска гомологов ранее описанного белка Pgl Pputida обнаружено, что среди организмов имеющих такие белки с гомологией больше 50%, нет организмов в которых есть какие-либо белки, гомологичные YbhE. В Е coli также не обнаружено гомологов Pgl P.putida.

Ранее также предпринимались попытки обнаружить в E.coli белки гомологичные охарактеризованным Pgl с использованием двух наиболее консервативных участков гомологии, предположительно, включающие в себя аминокислотные остатки активного центра 6PGL [Hager,2000].

Так как представленные экспериментальные данные позволяют утверждать, что белковый продукт гена ybhE E.coli обладает 6-фосфоглюконолактоназной активностью, и гомологи YbhE обнаружены в различных бактериях, можно заключить, что YbhE является первым описанным членом нового семейства 6-фосфоглюконолактоназ.

2. Увеличенная экспрессия YbhE приводит к увеличению синтеза ароматических аминокислот штаммами-продуцентами.

Усиленный поток через окислительную ветвь РРР может приводить к увеличенному уровню синтеза эритрозо-4-фосфата и фосфо-рибозил-пирофосфата - предшественников некоторых ароматических аминокислот.

Нами была предпринята попытка увеличения метаболического потока углерода в РРР за счет усиления экспрессии гена pgl. Положительным эффектом такой модификации могло быть также снижение в клетке уровня синтеза токсичных интермедиатов - фосфоглюконолактонов.

Были созданы штаммы, в которых нативная 5'-нетранслируемая область ybhE была заменена на два toe-подобных промотора, отличающихся нуклеотидной последовательностью района «-35» и имеющих поэтому

А.

Сш

Р<ас-10000

Р,

Гас-3900

тоёС

уЬЬА "] : уЬЬЕ

уЬЬР

уЬИН

Б.

г

Активность, Ед./мг.

□ w.t. уЬЬЕ В Р(ас-3900 уЬЬЕ Ш Р(ас-10000 -> уЬИЕ

Рисуяок 5. Усиление транскрипции гена рдг! Ш.&суИ.

различную силу. Модификация проводилась методом Яеё-зависимой интеграции фрагментов содержащих антибиотический маркер дотированный с промоторами. Модифицировать таким образом штамм Е.соН МС1655 дикого типа не удавалось. Данная модификация, по-видимому, несбалансированно увеличивая скорость второй реакции окислительной ветви РРР приводит к накоплению токсичных метаболитов в клетке. Тогда в качестве реципиента был выбран штамм, в котором отсутствует субстрат 6-фосфоглкжонолактоназы, Е.соН В\У25113 с делегированным геном гм/ (делеция затрагивала также и расположенные рядом с гц>/гены ес1с1, ес1а).

Для полученных штаммов с измененным промотором гена уЫгЕ (р%1) была измерена активность бРвЬ. Из Рис. 5 видно, что в экстрактах клеток, имевших в составе своей хромосомы более «слабый» 1ас-подобный промотор перед геном уЪЪЕ, уровень активности 6РвЬ несколько выше, чем в случае клеток дикого типа, и при этом этот уровень еще примерно в 2-3 раза выше в экстрактах клеток с более сильным промотором. Отметим при этом, что наблюдавшаяся разница в активности 6РвЬ в экстрактах клеток двух новых штаммов хорошо коррелировала с относительной эффективностью (3900 : 10000) двух использованных Гас-подобных промоторов, которая ранее оценивалась в работах нашей лаборатории при использовании гена 1ас2 в качестве репортера [Каташкина, 2003; Каташкина и др., 2005].

Для проверки влияния усиления уровня экспрессии гена уЬИЕ на продукцию ароматических аминокислот был выбран модельный штамм-

ТДВДЩ& 1. Накопление фвиияаланина -« культуральиой жиде?ос*и яоелв ферментвции штаммо» „аг

Штамм £ соИ ¡У * ' . . л ODm Количество фенилаланина, г/л

АЛ 2739 АЛ2739 ?шс.ъж-уЬЪЕ 18,2 ±0,1 16,3 ±0,2 0,65 + 0,4 1,3 ±0,1

продуцент фенилаланина, использующийся в нашей лаборатории.

Геномные локусы с усиленной экспрессией уЬНЕ были перенесены трансдукцией в хромосому штамма-продуцента. Следует отметить, что конструкцию Ргас-10000-^у6й£ перенести в штамм-продуцент фенилаланина не удалось, что, по-видимому, связано с токсичностью несбалансированно увеличенной активности бРСтЬ. (В эксперименте по введению из Р риййа также наблюдались токсические эффекты, когда ген присутствовал на мультикопийной плазмиде, данные не приведены).

После стандартной пробирочной ферментации количество фенилаланина в культуральной жидкости определялось денситометрическим методом после проведения тонкослойной жидкостной хроматографии. Результаты приведены в Таблице 1. Как видно из Таблицы, усиление экспрессии гена кодирующего 6-фосфоглюконолактоназу, действительно приводит к увеличению накопления фенилаланина штаммом-продуцентом.

Сходные результаты были получены также для модельного штамма-продуцента триптофана. В этом случае удалось ввести обе конструкции Р1ас-3900-ЪуЪкЕ и Р1ас-10000-ЬуЬИЕ. Накопление триптофана увеличивалось соответственно на 10% и 17%. Как видно, накопление целевой аминокислоты пропорционально «силе» использованного промотора.

Выводы:

1. В геноме E.coli открытая рамка считывания ybhE идентифицирована как структурная часть гена pgl, кодирующего 6-фосфоглюконолактоназу (6PGL). YbhE E.coli не имеет значимой гомологии с ранее охарактеризованными 6PGLs из других организмов. Этот вывод основывается на следующих результатах:

1.1. Делеция открытой рамки считывания ybhE приводит к проявлению у соответствующего штамма E.coli ранее описанного для /^/-мутанта Mal-Blu фенотипа.

1.2. Mal-Blu фенотип штамма с ДybhE связан именно с потерей клеткой активности 6PGL, т.к. данный фенотип комплементируется введением экспрессирующегося гена pgl из Pseudomonas putida как в составе рекомбинантной плазмиды, так и в результате интеграции этого гена в бактериальную хромосому.

1.3. По сравнению с мутантом Аpgi скорость роста двойных мутантов ДybhE, Apgi на глюкозе (но не на глюконате) в качестве единственного источника углерода значительно снижена, что обусловлено возможностью утилизации глюкозы двойным мутантом через окислительную ветку пентозо-фосфатного пути лишь за счет спонтанного гидролиза 6-фосфоглюконолактона на второй стадии этой метаболической цепочки реакций.

1.4. Активность 6PGL в штамме с АybhE по меньшей мере на порядок ниже, чем в штамме дикого типа, и эта остаточная активность обусловлена спонтанным гидролизом 6-фосфоглюконолактона.

1.5. Очищенный не менее чем до 90% белковый продукт тепа ybhE E.coli с введенным на N-конец (His)s-Tag участком аминокислотной последовательности обладает in vitro ферментативной активностью 6PGL, составляющей 780 ед/мг.

2. Организмы, в которых присутствуют гомологи YbhE E.coli, и организмы, в которых присутствуют либо описанные белки 6PGLs, либо их гомологи, составляют два непересекающихся множества. Это позволяет утверждать, что YbhE E.coli и его гомологи образуют новое семейство 6-фосфоглюконолактоназ.

3. Усиление транскрипции гена ybhE(pgT) за счет замены природного промотора на более сильные приводит к пропорциональному увеличению активности 6PGL в клетке и обеспечивает более эффективное накопление фенилаланина и триптофана модельными штаммами-продуцентами этих аминокислот.

Основное содержание диссертации отражено в следующих научных статьях и материалах научных конференций:

1. Машко С.В, Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., Мичурина Т.А., Гавриков А В., Беневоленский М.С., Киверо А.Д., Каташкина Ж.И., Дорошенко В.Г., Бирюкова ИВ, Дебабов В Г. «Использование метаболической регуляции для оптимизации экспрессии генов в бактериальных клетках - новое направление биотехнологии XXI-века.» // Биотехнология № 4 (2002) 3-14.

2. Скороходова А Ю., Зименков Д.В., Гавриков А.В., Киверо АД., Каташкина Ж. И., Дорошенко В. Г, Машко С. В. «Оптимизация экспрессии генов в бактериальных клетках в биотехнологических исследованиях XXI-века.» //В сб.: МИФИ, Москва, январь 2002,125-139.

3. Zimenkov D.V., Skorochodova A.Yu., Katashkina J.I., Biryukova I.V., Doroshenko V.G., Achverdyan V,Z, Mashko S.V. «The phage Ми-driven integration system provides the non-random distribution of the points of the integrated genes insertion along the circular map of the E.coli genome.» // In: Abstr. "The 2002 Molecular genetics of Bacteria and Phages Meeting", Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY, USA, August 20-25, (2002), p. 130.

4. Katashkina J I., Skorokhodova A.Yu., Zimenkov D.V., Gulevich A.Yu, Michurina T.A., Doroshenko V.G., Biryukova I. V., Mashko S.V. «Optimization of the expression level of the gene located in E.coli chromosome due to XRed-driven introducing of the randomized promoter in the upstream region.» // In: Abstr. «The 2003 Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting», Univ. of Wisconsin-Madison, USA, August 5-10, (2003), p. 118.

5. Zimenkov D.V., Skorokhodova A.Yu., Katashkina J.I., Biryukova I.V., Doroshenko V.G., Mashko S.V. «The phage Mu integration system provides the non-random distribution of the integration points along E.coli chromosome.» // Abstracts of «The conference for young scientists on molecular biology and genetics, dedicated to the 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine», Ukraine, Kiev, September 25-27, (2003), p. 233.

6. Зименков Д.В., Гулевич, А Ю, Скороходова А.Ю., Каташкина Ж.И., Киверо АД, Бирюкова И.В, Машко СВ. «6-Фосфоглюконолактоназа из Escherichia coli, фрагмент ДНК, бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-аминокислоты, и способ получения L-аминокислоты.» // Патентная заявка РФ № 2004105179 (25 февраля 2004).

7. Зименков Д.В., Скороходова А.Ю.,. Каташкина ЖИ, Минаева НИ., Саврасова ЕА , Бирюкова ИВ., Дорошенко В.Г., Ахвердян В.З., Машко

СВ. «Области хромосомы E.coli, предпочтительные для встраивания генов при использовании системы интеграции на основе фага-транспозона Ми.» // Биотехнология № 6 (2004) 3-18.

8. Zimenkov D.V., Gulevich A.Yu., Skorokhodova A.Yu., Biriukova I.V., Kozlov Y.I., Mashko S.V. «Escherichia coli ORF ybhE is pgl gene encoding 6-phosphogluconolactonase (EC 3.1.1.31) that has no homology with known 6PGLs from other organisms.» // FEMS Microbiol Lett. (2005) Mar 15;244(2):275-280.

9. Каташкина Ж.И, Скороходова АЮ., 3именное Д.В., Гулевич, АЮ, Минаева Н.И., Дорошенко В.Г, Бирюкова И.В., Машко С.В. «Направленное изменение уровня экспрессии генов, расположенных в бактериальной хромосоме» // Молекулярная биология №5 (2005) В печати.

t

ч

\

é

I

fi

Принято к исполнению 28/04/2005 Исполнено 29/04/2005

Заказ №814 Тираж' ЮОэкз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2005-4 45867

О 7 МАЙ 2005

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Зименков, Данила Вадимович

ВЫВОДЫ:

1. В геноме E.coli идентифицирована открытая рамка считывания ybhE, являющаяся структурной частью гена pgl, кодирующего 6-фосфоглюконолактоназу (6PGL). YbhE E.coli не имеет значимой гомологии с ранее охарактеризованными 6PGLs из других организмов. Этот вывод основывается на следующих результатах:

1.1.Делеция открытой рамки считывания ybhE приводит к проявлению у соответствующего штамма E.coli ранее описанного для д§7-мутанта Mal-Blu фенотипа.

1.2.Mal-B lu фенотип штамма с AybhE связан именно с потерей клеткой активности 6PGL, т.к. данный фенотип комплементируется введением экспрессирующегося гена pgl из Pseudomonas putida как в составе рекомбинантной плазмиды, так и в результате интеграции этого гена в бактериальную хромосому.

1.3.По сравнению с мутантом Apgi скорость роста двойных мутантов AybhE, hpgi на глюкозе (но не на глюконате) в качестве единственного источника углерода значительно снижена, что обусловлено возможностью утилизации глюкозы двойным мутантом через окислительную ветку пентозо-фосфатного пути лишь за счет спонтанного гидролиза 6-фосфоглюконолактона на второй стадии этой метаболической цепочки реакций.

1.4. Активность 6PGL в штамме с AybhE по меньшей мере на порядок ниже, чем в штамме дикого типа, и эта остаточная активность обусловлена спонтанным гидролизом 6-фосфоглюконолактона.

1.5.Очищенный до более 90% белковый продукт гена ybhE E.coli с введенным на N-конец (His)6-Tag участком аминокислотной последовательности обладает in vitro ферментативной активностью 6PGL, составляющей 780 ед/мг.

2. Организмы, в которых присутствуют гомологи YbhE E.coli, и организмы, в которых присутствуют либо описанные белки 6PGLs, либо их гомологи, составляют два непересекающихся множества. Это позволяет утверждать, что YbhE E.coli и его гомологи образуют новое семейство 6-фосфоглюконолактоназ.

3. Усиление транскрипции гена ybhE(pgF) за счет замены природного промотора на более сильные приводит к пропорциональному увеличению активности 6PGL в клетке и обеспечивает более эффективное накопление фенилаланина и триптофана модельными штаммами-продуцентами этих аминокислот.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зименков, Данила Вадимович, Москва

1. S. Adhya, M.Schwartz. Phosphoglucomutase mutants of Escherichia coli K-12, J. Bacteriol. 108 (1971) 621-626.

2. R.R.Ariza, Z.Li, N.Ringstad, B.Demple. Activation of multiple antibiotic resistance and binding of stress-inducible promoters by Escherichia coli Rob protein, J. Bacteriol. 177(1995) 1655-1661.

3. S.D.Barbour, H.Nagaishi, A.Templin, A.J.CLARK. Biochemical and genetic studies of recombination proficiency in Escherichia coli. II. Rec+ revertants caused by indirect suppression of rec- mutations, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 67 (1970) 128135.

4. A.Baudin, O.Ozier-Kalogeropoulos, A.Denouel, F.Lacroute, C.Cullin. A simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae, Nucleic Acids Res. 21 (1993) 3329-3330.

5. L.Benov, I.Fridovich. Why superoxide imposes an aromatic amino acid auxotrophy on Escherichia coli. The transketolase connection, J. Biol. Chem. 274 (1999) 42024206.

6. R.Benzinger, L.W.Enquist, A.Skalka. Transfection of Escherichia coli spheroplasts. V. Activity of recBC nuclease in rec+ and rec minus spheroplasts measured with different forms of bacteriophage DNA, J. Virol. 15 (1975) 861-871.

7. G.Blakely, G.May, R.McCulloch, L.K.Arciszewska, M.Burke, S.T.Lovett, D.J.Sherratt. Two related recombinases are required for site-specific recombination at dif and cer in E coli K12, Cell 75 (1993) 351-361.

8. B.R.Bochner, H.C.Huang, G.L.Schieven, B.N.Ames. Positive selection for loss of tetracycline resistance, J. Bacteriol. 143 (1980) 926-933.

9. D.E.Boehm, K.Vincent, O.R.Brown. Oxygen and toxicity inhibition of amino acid biosynthesis, Nature 262 (1976) 418-420.

10. B.Boonstra, C.E.French, I.Wainwright, N.C.Bruce. The udhA gene of Escherichia coli encodes a soluble pyridine nucleotide transhydrogenase, J. Bacteriol. 181 (1999) 1030-1034.

11. M.M.Bradford. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72:248-54. (1976) 248-254.

12. K.Brcic-Kostic, I.Stojiljkovic, E.Salaj-Smic, Z.Trgovcevic. The recB gene product is essential for exonuclease V-dependent DNA degradation in vivo, Mutat. Res. 227 (1989) 247-250.

13. H.Bremer, P.P.Dennis. Modulation of Chemical Composition and Other Parameters of the Cell by Growth Rate, in: F.C.Neidhart (Ed.), Escherichia coli and Salmonella, 1996, pp. 1553-1569.

14. L.Brownlie, J.R.Stephenson, J.A.Cole. Effect of growth rate on plasmid maintenance by Escherichia coli HB101(pAT153), J. Gen. Microbiol. 136 (1990) 2471-2480.

15. F.Canonaco, T.A.Hess, S.Heri, T.Wang, T.Szyperski, U.Sauer. Metabolic flux response to phosphoglucose isomerase knock-out in Escherichia coli and impact of overexpression of the soluble transhydrogenase UdhA, FEMS Microbiol. Lett. 204 (2001) 247-252.

16. F.N.Capaldo, S.D.Barbour. The role of the rec genes in the viability of Escherichia coli K12, Basic Life Sci. 5A (1975) 405-418.

17. A.Carlioz, D.Touati. Isolation of superoxide dismutase mutants in Escherichia coli: is superoxide dismutase necessary for aerobic life?, EMBO J. 5 (1986) 623-630.

18. E.Cassuto, T.Lash, K.S.Sriprakash, C.M.Radding. Role of exonuclease and protein of phage lambda in genetic recombination. V. Recombination of lambda DNA in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 68 (1971) 1639-1643.

19. B.A.Castilho, M.J.Casadaban. Specificity of mini-Mu bacteriophage insertions in a small plasmid, J. Bacteriol. 173 (1991) 1339-1343.

20. A.F.Chalker, D.R.Leach, R.G.Lloyd. Escherichia coli sbcC mutants permit stable propagation of DNA replicons containing a long palindrome, Gene 71 (1988) 201205.

21. P.P.Cherepanov, W.Wackernagel. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant, Gene 158 (1995) 9-14.

22. A.J.CLARK, rec genes and homologous recombination proteins in Escherichia coli, Biochimie 73 (1991) 523-532.

23. A.J.CLARK, A.D.MARGULIES. ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF RECOMBINATION-DEFICIENT MUTANTS OF ESCHERICHIA COLI K12, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 53:451-9. (1965) 451-459.

24. J.L.Clarke, D.A.Scopes, O.Sodeinde, P.J.Mason. Glucose-6-phosphate dehydrogenase-6-phosphogluconolactonase. A novel bifunctional enzyme in malaria parasites, Eur. J. Biochem. 268 (2001) 2013-2019.

25. A.Cohen, A.J.CLARK. Synthesis of linear plasmid multimers in Escherichia coli K-12, J. Bacteriol. 167 (1986) 327-335.

26. S.P.Cohen, H.Hachler, S.B.Levy. Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance (mar) locus in Escherichia coli, J. Bacteriol. 175 (1993) 14841492.

27. F.Collard, J.F.Collet, I.Gerin, M.Veiga-da-Cunha, S.E.Van. Identification of the cDNA encoding human 6-phosphogluconolactonase, the enzyme catalyzing the second step of the pentose phosphate pathway(l), FEBS Lett. 459 (1999) 223-226.

28. Court DL, J.A.Sawitzke, L.C.Thomason. Genetic engineering using homologous recombination, Annu. Rev. Genet. 36 (2002) 361-388.

29. G.A.Cromie, C.B.Millar, K.H.Schmidt, D.R.Leach. Palindromes as substrates for multiple pathways of recombination in Escherichia coli, Genetics 154 (2000) 513522.

30. P.Dabert, G.R.Smith. Gene replacement with linear DNA fragments in wild-type Escherichia coli: enhancement by Chi sites, Genetics 145 (1997) 877-889.

31. E.C.Dale, D.W.Ow. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 88 (1991) 10558-10562.

32. K.A.Datsenko, B.L.Wanner. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97 (2000) 6640-6645.

33. A.C.de Mello Filho, R.Meneghini. Protection of mammalian cells by o-phenanthroline from lethal and DNA-damaging effects produced by active oxygen species, Biochim. Biophys. Acta 847 (1985) 82-89.

34. M.S.Dillingham, M.Spies, S.C.Kowalczykowski. RecBCD enzyme is a bipolar DNA helicase, Nature %19;423 (2003) 893-897.

35. H.Ding, B.Demple. In vivo kinetics of a redox-regulated transcriptional switch, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94 (1997) 8445-8449.

36. H.Ding, E.Hidalgo, B.Demple. The redox state of the 2Fe-2S] clusters in SoxR protein regulates its activity as a transcription factor, J. Biol. Chem. 271 (1996) 33173-33175.

37. P.Drueckes, B.Boeck, D.Palm, R.Schinzel. Mutational analysis of the oligosaccharide recognition site at the active site of Escherichia coli maltodextrin phosphorylase, Biochemistry 35 (1996) 6727-6734.

38. Ж.И.Каташкина. Разработка и использование методов направленной модификации целевых генетических локусов хромосомы E.coli при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот. Автореферат.Москва. 2003.

39. Ref Type: Thesis/Dissertation

40. Ж.И.Каташкина, А.Ю.Скороходова, Д.В.Зименков, А.Ю.Гулевич, Н.И.Минаева, В.Г.Дорошенко, И.В.Бирюкова, С.В.Машко. Направленное изменение уровня экспрессии генов, расположенных в бактериальной хромосоме. Молекулярная биология 5. 2005.1. Ref Type: In Press

41. S.E.Egan, R.Fliege, S.Tong, A.Shibata, R.E.Wolf, Jr., T.Conway. Molecular characterization of the Entner-Doudoroff pathway in Escherichia coli: sequence analysis and localization of promoters for the edd-eda operon, J. Bacterio!. 174 (1992) 4638-4646.

42. K.M.E1, S.K.Amundsen, P.Dabert, A.Gruss. Gene replacement with linear DNA in electroporated wild-type Escherichia coli, Nucleic Acids Res. 27 (1999) 1296-1299.

43. P.T.Emmerson. Recombination deficient mutants of Escherichia coli K12 that map between thy A and argA, Genetics 60 (1968) 19-30.

44. M.Feiss, D.A.Siegele, C.F.Rudolph, S.Frackman. Cosmid DNA packaging in vivo, Gene 17(1982) 123-130.

45. J.Fiaux, Z.P.Cakar, M.Sonderegger, K.Wuthrich, T.Szyperski, U.Sauer. Metabolic-flux profiling of the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Pichia stipitis, Eukaryot. Cell 2 (2003) 170-180.

46. E.Fischer, U.Sauer. Metabolic flux profiling of Escherichia coli mutants in central carbon metabolism using GC-MS, Eur. J. Biochem. 270 (2003) 880-891.

47. S.Flores, R.de Anda-Herrera, G.Gosset, F.G.Bolivar. Growth-rate recovery of Escherichia coli cultures carrying a multicopy plasmid, by engineering of the pentosephosphate pathway, Biotechnol. Bioeng. %20;87 (2004) 485-494.

48. S.Flores, G.Gosset, N.Flores, A.A.de Graaf, F.Bolivar. Analysis of carbon metabolism in Escherichia coli strains with an inactive phosphotransferase system by (13)C labeling and NMR spectroscopy, Metab Eng 4 (2002) 124-137.

49. D.G.Fraenkel. Selection of Escherichia coli mutants lacking glucose-6-phosphate dehydrogenase or gluconate-6-phosphate dehydrogenase, J. Bacteriol. 95 (1968) 1267-1271.

50. D.G.Fraenkel. The accumulation of glucose 6-phosphate from glucose and its effect in an Escherichia coli mutant lacking phosphoglucose isomerase and glucose 6-phosphate dehydrogenase, J. Biol. Chem. 243 (1968) 6451-6457.

51. D.G.Fraenkel, S.Baneijee. A mutation increasing the amount of a constitutive enzyme in Escherichia coli, glucose 6-phosphate dehydrogenase, J. Mol. Biol. 56 (1971) 183194.

52. D.G.Fraenkel, S.Baneijee. Deletion mapping of zwf, the gene for a constitutive en2yme, glucose 6-phosphate dehydrogenase in Escherichia coli, Genetics 71 (1972) 481-489.

53. D.G.Fraenkel, S.R.Levisohn. Glucose and gluconate metabolism in an Escherichia coli mutant lacking phosphoglucose isomerase, J. Bacteriol. 93 (1967) 1571-1578.

54. S.A.Friedman, J.B.Hays. Selective inhibition of Escherichia coli recBC activities by plasmid-encoded GamS function of phage lambda, Gene 43 (1986) 255-263.

55. L.K.Fuhrman, A. Wanken, K.W.Nickerson, T.Conway. Rapid accumulation of intracellular 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate in an Entner-Doudoroff aldolase mutant results in bacteriostasis, FEMS Microbiol. Lett. 159 (1998) 261-266.

56. P.Gaudu, S.Dubrac, D.Touati. Activation of SoxR by overproduction of desulfoferrodoxin: multiple ways to induce the soxRS regulon, J. Bacteriol. 182 (2000) 1761-1763.

57. P.Gaudu, N.Moon, B.Weiss. Regulation of the soxRS oxidative stress regulon. Reversible oxidation of the Fe-S centers of SoxR in vivo, J. Biol. Chem. 272 (1997) 5082-5086.

58. P.Gaudu, B.Weiss. SoxR, a 2Fe-2S] transcription factor, is active only in its oxidized form, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 93 (1996) 10094-10098.

59. P.Gay, C.D.Le, M.Steinmetz, T.Berkelman, C.I.Kado. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria, J. Bacteriol. 164(1985)918-921.

60. F.P.Gibson, D.R.Leach, R.G.Lloyd. Identification of sbcD mutations as cosuppressors of recBC that allow propagation of DNA palindromes in Escherichia coli K-12, J. Bacteriol. 174 (1992) 1222-1228.

61. F.Gijsegem. Mu as a genetic tool, Phage Mu, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1987, pp. 215-250.

62. B.Gonzalez-Flecha, B.Demple. Homeostatic regulation of intracellular hydrogen peroxide concentration in aerobically growing Escherichia coli, J. Bacteriol. 179 (1997) 382-388.

63. M.M.Gottesman, M.E.Gottesman, S.Gottesman, M.Gellert. Characterization of bacteriophage lambda reverse as an Escherichia coli phage carrying a unique set of host-derived recombination functions, J. Mol. Biol. 88 (1974) 471-487.

64. J.T.Greenberg, B.Demple. A global response induced in Escherichia coli by redox-cycling agents overlaps with that induced by peroxide stress, J. Bacteriol. 171 (1989) 3933-3939.

65. J.T.Greenberg, P.Monach, J.H.Chou, P.D.Josephy, B.Demple. Positive control of a global antioxidant defense regulon activated by superoxide-generating agents in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 87 (1990) 6181-6185.

66. K.L.Griffith, S.M.Becker, E.Wolf. Characterization of TetD as a transcriptional activator of a subset of genes of the Escherichia coli SoxS/MarA/Rob regulon, Mol. Microbiol. 56 (2005) 1103-1117.

67. P.W.Hager, M.W.Calfee, P.V.Phibbs. The Pseudomonas aeruginosa devB/SOL homolog, pgl, is a member of the hex regulon and encodes 6-phosphogluconolactonase, J. Bacteriol. 182 (2000) 3934-3941.

68. S.D.Hall, M.F.Kane, R.D.Kolodner. Identification and characterization of the Escherichia coli RecT protein, a protein encoded by the recE region that promotes renaturation of homologous single-stranded DNA, J. Bacteriol. 175 (1993) 277-287.

69. S.D.Hall, R.D.Kolodner. Homologous pairing and strand exchange promoted by the Escherichia coli RecT protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91 (1994) 3205-3209.

70. B.Halliwell, J.M.Gutteridge. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview, Methods Enzymol. 186 (1990) 1-85.

71. R.L.Hanson, C.Rose. Effects of an insertion mutation in a locus affecting pyridine nucleotide transhydrogenase (pnt::Tn5) on the growth of Escherichia coli, J. Bacteriol. 141 (1980) 401-404.

72. E.Hidalgo, J.M.Bollinger, Jr., T.M.Bradley, C.T.Walsh, B.Demple. Binuclear 2Fe-2S] clusters in the Escherichia coli SoxR protein and role of the metal centers in transcription, J. Biol. Chem. 270 (1995) 20908-20914.

73. E.Hidalgo, B.Demple. An iron-sulfur center essential for transcriptional activation by the redox-sensing SoxR protein, EMBO J. 13 (1994) 138-146.

74. E.Hidalgo, B.Demple. Spacing of promoter elements regulates the basal expression of the soxS gene and converts SoxR from a transcriptional activator into a repressor, EMBO J. 16 (1997) 1056-1065.

75. E.Hidalgo, V.Leautaud, B.Demple. The redox-regulated SoxR protein acts from a single DNA site as a repressor and an allosteric activator, EMBO J. 17 (1998) 26292636.

76. R.H.Hoess, A.Wierzbicki, K.Abremski. The role of the loxP spacer region in PI site-specific recombination, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 2287-2300.

77. F.Hommais, E.Krin, J.Y.Coppee, C.Lacroix, E.Yeramian, A.Danchin, P.Bertin. GadE (YhiE): a novel activator involved in the response to acid environment in Escherichia coli, Microbiology 150 (2004) 61-72.

78. E.R.Hondorp, R.G.Matthews. Oxidative stress inactivates cobalamin-independent methionine synthase (MetE) in Escherichia coli, PLoS. Biol. 2 (2004) e336.

79. P.Howard-Flanders, L.Theriot. Mutants of Escherichia coli K-12 defective in DNA repair and in genetic recombination, Genetics 53 (1966) 1137-1150.

80. Q.Hua, C.Yang, T.Baba, H.Mori, K.Shimizu. Responses of the central metabolism in Escherichia coli to phosphoglucose isomerase and glucose-6-phosphate dehydrogenase knockouts, J. Bacterid. 185 (2003) 7053-7067.

81. J.A.Imlay. A metabolic enzyme that rapidly produces superoxide, fumarate reductase of Escherichia coli, J. Biol. Chem. 270 (1995) 19767-19777.

82. J.A.Imlay, S.M.Chin, S.Linn. Toxic DNA damage by hydrogen peroxide through the Fenton reaction in vivo and in vitro, Science 240 (1988) 640-642.

83. J.A.Imlay, I.Fridovich. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli, J. Biol. Chem. 266 (1991) 6957-6965.

84. J.A.Imlay, S.Linn. DNA damage and oxygen radical toxicity, Science 240 (1988) 1302-1309.

85. G.K.Jarori, P.K.Maitra. Nature of primary product(s) of D-glucose 6-phosphate dehydrogenase reaction. 13C and 31P NMR study, FEBS Lett. 278 (1991) 247-251.

86. H.E.Jasin, J.T.Dingle. Human mononuclear cell factors mediate cartilage matrix degradation through chondrocyte activation, J. Clin. Invest 68 (1981) 571-581.

87. J.W.Joseph, R.Kolodner. Exonuclease VIII of Escherichia coli. II. Mechanism of action, J. Biol. Chem. 258 (1983) 10418-10424.

88. J.W.Joseph, R.Kolodner. Exonuclease VIII of Escherichia coli. I. Purification and physical properties, J. Biol. Chem. 258 (1983) 10411-10417.

89. M.M.Kabir, K.Shimizu. Gene expression patterns for metabolic pathway in pgi knockout Escherichia coli with and without phb genes based on RT-PCR, J. Biotechnol. 105 (2003) 11-31.

90. K.Kaiser, N.E.Murray. Physical characterisation of the "Rac prophage" in E. coli K12, Mol. Gen. Genet. 175 (1979) 159-174.

91. G.Karakousis, N.Ye, Z.Li, S.K.Chiu, G.Reddy, C.M.Radding. The beta protein of phage lambda binds preferentially to an intermediate in DNA renaturation, J. Mol. Biol. 276(1998) 721-731.

92. P.Kast. pKSS~a second-generation general purpose cloning vector for efficient positive selection of recombinant clones, Gene 138 (1994) 109-114.

93. J.Katz, R.Rognstad. The labeling of pentose phosphate from glucose-14C and estimation of the rates of transaldolase, transketolase, the contribution of the pentose cycle, and ribose phosphate synthesis, Biochemistry 6 (1967) 2227-2247.

94. K.Keyer, J.A.Imlay. Superoxide accelerates DNA damage by elevating free-iron levels, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 93 (1996) 13635-13640.

95. M.S.K00, J.H.Lee, S.Y.Rah, W.S.Yeo, J.W.Lee, K.L.Lee, Y.S.Koh, S.O.Kang, J.H.Roe. A reducing system of the superoxide sensor SoxR in Escherichia coli, EMBO J. 22 (2003) 2614-2622.

96. A.R.Krapp, R.E.Rodriguez, H.O.Poli, D.H.Paladini, J.F.Palatnik, N.Carrillo. The flavoenzyme ferredoxin (flavodoxin)-NADP(H) reductase modulates NADP(H) homeostasis during the soxRS response of Escherichia coli, J. Bacteriol. 184 (2002) 1474-1480.

97. C.S.Kristensen, L.Eberl, J.M.Sanchez-Romero, M.Givskov, S.Molin, L.De, V. Site-specific deletions of chromosomally located DNA segments with the multimer resolution system of broad-host-range plasmid RP4, J. Bacteriol. 177 (1995) 52-58.

98. S.K.Kulkarni, F.W.Stahl. Interaction between the sbcC gene of Escherichia coli and the gam gene of phage lambda, Genetics 123 (1989) 249-253.

99. S.R.Kupor, D.G.Fraenkel. Glucose metabolism in 6 phosphogluconolactonase mutants of Escherichia coli, J. Biol. Chem. 247 (1972) 1904-1910.

100. S.R.Kupor, D.G.Fraenkel. 6-phosphogluconolactonase mutants of Escherichia coli and a maltose blue gene, J. Bacteriol. 100 (1969) 1296-1301.

101. K.Kusano, Y.Sunohara, N.Takahashi, H.Yoshikura, I.Kobayashi. DNA double-strand break repair: genetic determinants of flanking crossing-over, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91 (1994) 1173-1177.

102. S.R.Kushner, H.Nagaishi, A.J.CLARK. Indirect suppression of recB and recC mutations by exonuclease I deficiency, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 69 (1972) 1366-1370.

103. A.Kuzminov. Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage lambda, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63 (1999) 751 -813, table.

104. U.K.Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.

105. D.Lafontaine, D.Tollervey. One-step PCR mediated strategy for the construction of conditionally expressed and epitope tagged yeast proteins, Nucleic Acids Res. 24 (1996) 3469-3471.

106. A.T.Lee, A.Cerami. The formation of reactive intermediate(s) of glucose 6-phosphate and lysine capable of rapidly reacting with DNA, Mutat. Res. 179 (1987) 151-158.

107. A.T.Lee, A.Cerami. Elevated glucose 6-phosphate levels are associated with plasmid mutations in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84 (1987) 8311-8314.

108. B .Levi, M .J. Werman. Fructose triggers DNA modification and damage in an Escherichia coli plasmid, J. Nutr. Biochem. 12 (2001) 235-241.

109. Z.Li, B.Demple. Sequence specificity for DNA binding by Escherichia coli SoxS and Rob proteins, Mol. Microbiol. 20 (1996) 937-945.

110. Z.Li, G.Karakousis, S.K.Chiu, G.Reddy, C.M.Radding. The beta protein of phage lambda promotes strand exchange, J. Mol. Biol. 276 (1998) 733-744.

111. S.I.Liochev, I.Fridovich. Fumarase C, the stable fumarase of Escherichia coli, is controlled by the soxRS regulon, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89 (1992) 5892-5896.

112. R.G.Lloyd, C.Buckman. Identification and genetic analysis of sbcC mutations in commonly used recBC sbcB strains of Escherichia coli K-12, J. Bacteriol. 164 (1985) 836-844.

113. S.T.Lovett, R.D.Kolodner. Identification and purification of a single-stranded-DNA-specific exonuclease encoded by the recJ gene of Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86 (1989) 2627-2631.

114. S.T.Lovett, C.Luisi-DeLuca, R.D.Kolodner. The genetic dependence of recombination in recD mutants of Escherichia coli, Genetics 120 (1988) 37-45.

115. C.Luisi-DeLuca, R.D.Kolodner. Effect of terminal non-homology on intramolecular recombination of linear plasmid substrates in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 227 (1992) 72-80.

116. M.Manchado, C.Michan, C.Pueyo. Hydrogen peroxide activates the SoxRS regulon in vivo, J. Bacteriol. 182 (2000) 6842-6844.

117. M.G.Marinus, M.Carraway, A.Z.Frey, L.Brown, J.A.Arraj. Insertion mutations in the dam gene of Escherichia coli K-12, Mol. Gen. Genet. 192 (1983) 288-289.

118. N.Marsic, S.Roje, I.Stojiljkovic, E.Salaj-Smic, Z.Trgovcevic. In vivo studies on the interaction of RecBCD enzyme and lambda Gam protein, J. Bacteriol. 175 (1993) 4738-4743.

119. D.Mascarenhas, D J.Ashworth, C.S.Chen. Deletion of pgi alters tryptophan biosynthesis in a genetically engineered strain of Escherichia coli, Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 2995-2999.

120. R.McDaniel, P.Licari, C.Khosla. Process development and metabolic engineering for the overproduction of natural and unnatural polyketides, Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 73:31-52. (2001) 31-52.

121. K.R.Messner, J.A.Imlay. The identification of primary sites of superoxide and hydrogen peroxide formation in the aerobic respiratory chain and sulfite reductase complex of Escherichia coli, J. Biol. Chem. 274 (1999) 10119-10128.

122. K.R.Messner, J.A.Imlay. Mechanism of superoxide and hydrogen peroxide formation by fumarate reductase, succinate dehydrogenase, and aspartate oxidase, J. Biol. Chem. 277 (2002) 42563-42571.

123. E.Miclet, V.Stoven, P.A.Michels, F.R.Opperdoes, J. Y.Lallemand, F.Duffieux. NMR spectroscopic analysis of the first two steps of the pentose-phosphate pathway elucidates the role of 6-phosphogluconolactonase, J. Biol. Chem. 276 (2001) 3484034846.

124. T.Morita, W.El-Kazzaz, Y.Tanaka, T.Inada, H.Aiba. Accumulation of glucose 6-phosphate or fructose 6-phosphate is responsible for destabilization of glucose transporter mRNA in Escherichia coli, J. Biol. Chem. 278 (2003) 15608-15614.

125. K.Muniyappa, C.M.Radding. The homologous recombination system of phage lambda. Pairing activities of beta protein, J. Biol. Chem. 261 (1986) 7472-7478.

126. K.C.Murphy. Lambda Gam protein inhibits the helicase and chi-stimulated recombination activities of Escherichia coli RecBCD enzyme, J. Bacteriol. 173 (1991) 5808-5821.

127. K.C.Murphy. Use of bacteriophage lambda recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli, J. Bacteriol. 180 (1998) 2063-2071.

128. K.C.Murphy, K.G.Campellone. Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli, BMC. Mol. Biol. 4 (2003) 11.

129. E.L.Murray, T.Conway. Multiple regulators control expression of the Entner-Doudoroff aldolase (Eda) of Escherichia coli, J. Bacteriol. 187 (2005) 991-1000.

130. J.P.Muyrers, Y.Zhang, F.Buchholz, A.F.Stewart. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners, Genes Dev. 14 (2000) 1971-1982.

131. E.Mythili, K.A.Kumar, K.Muniyappa. Characterization of the DNA-binding domain of beta protein, a component of phage lambda red-pathway, by UV catalyzed cross-linking, Gene 182 (1996) 81-87.

132. T.Nunoshiba, E.Hidalgo, Z.Li, B.Demple. Negative autoregulation by the Escherichia coli SoxS protein: a dampening mechanism for the soxRS redox stress response, J. Bacteriol. 175 (1993) 7492-7494.

133. H.Ochman, A.S.Gerber, D.L.Hartl. Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction, Genetics 120 (1988) 621 -623.

134. M.K.Oh, J.C.Liao. Gene expression profiling by DNA microarrays and metabolic fluxes in Escherichia coli, Biotechnol. Prog. 16 (2000) 278-286.

135. A.Okado-Matsumoto, I.Fridovich. The role of alpha,beta -dicarbonyl compounds in the toxicity of short chain sugars, J. Biol. Chem. 275 (2000) 34853-34857.

136. C.A.Ouzounis, P.D.Karp. Global properties of the metabolic map of Escherichia coli, Genome Res. 10 (2000) 568-576.

137. I.Paskvan, E.Salaj-Smic, I.Ivancic-Bace, K.Zahradka, Z.Trgovcevic, K.Brcic-Kostic. The genetic dependence of RecBCD-Gam mediated double strand end repair in Escherichia coli, FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 299-303.

138. R.L.Patsey, M.F.Bruist. Characterization of the interaction between the lambda intasome and attB, J. Mol. Biol. 252 (1995) 47-58.

139. A.J.Pease, R.E.Wolf, Jr. Determination of the growth rate-regulated steps in expression of the Escherichia coli K-12 gnd gene, J. Bacteriol. 176 (1994) 115-122.

140. M. Y.Peredelchuk, G.N.Bennett. A method for construction of E. coli strains with multiple DNA insertions in the chromosome, Gene 187 (1997) 231-238.

141. L.Petruschka, K.Adolf, G.Burchhardt, J.Dernedde, J.Jurgensen, H.Herrmann. Analysis of the zwf-pgl-eda-operon in Pseudomonas putida strains H and KT2440, FEMS Microbiol. Lett. 215 (2002) 89-95.

142. G.Peyru, D.G.Fraenkel. Genetic mapping of loci for glucose-6-phosphate dehydrogenase, gluconate-6-phosphate dehydrogenase, and gluconate-6-phosphate dehydrase in Escherichia coli, J. Bacteriol. 95 (1968) 1272-1278.

143. E.Ponce, A.Martinez, F.Bolivar, F.Valle. Stimulation of glucose catabolism through the pentose pathway by the absence of the two pyruvate kinase isoenzymes in Escherichia coli, Biotechnol. Bioeng. 58 (1998) 292-295.

144. G.Posfai, V.Kolisnychenko, Z.Bereczki, F.R.Blattner. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome, Nucleic Acids Res. 27 (1999) 4409-4415.

145. A.R.Poteete, A.C.Fenton. Efficient double-strand break-stimulated recombination promoted by the general recombination systems of phages lambda and P22, Genetics 134(1993) 1013-1021.

146. A.R.Poteete, A.C.Fenton, K.C.Murphy. Modulation of Escherichia coli RecBCD activity by the bacteriophage lambda Gam and P22 Abe functions, J. Bacteriol. 170 (1988) 2012-2021.

147. D.L.Rowley, A.J.Pease, R.E.Wolf, Jr. Genetic and physical analyses of the growth rate-dependent regulation of Escherichia coli zwf expression, J. Bacteriol. 173 (1991) 4660-4667.

148. D.L.Rowley, R.E.Wolf, Jr. Molecular characterization of the Escherichia coli K-12 zwf gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase, J. Bacteriol. 173 (1991) 968977.

149. C.B.Russell, D.S.Thaler, F.W.Dahlquist. Chromosomal transformation of Escherichia coli recD strains with linearized plasmids, J. Bacteriol. 171 (1989) 2609-2613.

150. E.Salaj-Smic, D.Dermic, K.Brcic-Kostic, G.C.Cajo, E.Trgovcevic. In vivo studies of the Escherichia coli RecB polypeptide lacking its nuclease center, Res. Microbiol. 151 (2000) 769-776.

151. M.D.Sam, D.Cascio, R.C. Johnson, R.T.Clubb. Crystal structure of the excisionase-DNA complex from bacteriophage lambda, J. Mol. Biol. 338 (2004) 229-240.

152. B.D.Sanwal. Regulatory mechanisms involving nicotinamide adenine nucleotides as allosteric effectors. 3. Control of glucose 6-phosphate dehydrogenase, J. Biol. Chem. 245 (1970) 1626-1631.

153. U.Sauer. Evolutionary engineering of industrially important microbial phenotypes, Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 73 (2001) 129-169.

154. U.Sauer, F.Canonaco, S.Heri, A.Perrenoud, E.Fischer. The soluble and membrane-bound transhydrogenases UdhA and PntAB have divergent functions in NADPH metabolism of Escherichia coli, J. Biol. Chem. 279 (2004) 6613-6619.

155. T.J.Schmidt. Helenanolide-type sesquiterpene lactones—III. Rates and stereochemistry in the reaction of helenalin and related helenanolides with sulfhydryl containing biomolecules, Bioorg. Med. Chem. 5 (1997) 645-653.

156. L.C.Seaver, J.A.Imlay. Are respiratory enzymes the primary sources of intracellular hydrogen peroxide?, J. Biol. Chem. %19;279 (2004) 48742-48750.

157. L.C.Seaver, J.A.Imlay. Hydrogen peroxide fluxes and compartmentalization inside growing Escherichia coli, J. Bacteriol. 183 (2001) 7182-7189.

158. J.F.Senecoff, M.M.Cox. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing, J. Biol. Chem. 261 (1986) 73807386.

159. M.J.Shulman, L.M.Hallick, H.Echols, E.R.Signer. Properties of recombination-deficient mutants of bacteriophage lambda, J. Mol. Biol. 52 (1970) 501-520.

160. K.A.Siddiquee, M.J.rauzo-Bravo, K.Shimizu. Effect of a pyruvate kinase (pykF-gene) knockout mutation on the control of gene expression and metabolic fluxes in Escherichia coli, FEMS Microbiol. Lett. 235 (2004) 25-33.

161. Z.Silberstein, A.Cohen. Synthesis of linear multimers of OriC and pBR322 derivatives in Escherichia coli K-12: role of recombination and replication functions, J. Bacteriol. 169 (1987) 3131-3137.

162. Z.Silberstein, S.Maor, I.Berger, A.Cohen. Lambda Red-mediated synthesis of plasmid linear multimers in Escherichia coli K12, Mol. Gen. Genet. 223 (1990) 496507.

163. Z.Silberstein, Y.Tzfati, A.Cohen. Primary products of break-induced recombination by Escherichia coli RecE pathway, J. Bacteriol. 177 (1995) 1692-1698.

164. C.A.Snyder, S.J.Garte, A.R.Sellakumar, R.E.Albert. Relationships between the levels of binding to DNA and the carcinogenic potencies in rat nasal mucosa for three alkylating agents, Cancer Lett. 33 (1986) 175-181.

165. M.Spies, P.R.Bianco, M.S.Dillingham, N.Handa, RJ.Baskin, S.C.Kowalczykowski. A molecular throttle: the recombination hotspot chi controls DNA translocation by the RecBCD helicase, Cell 114 (2003) 647-654.

166. K.S.Sriprakash, N.Lundh, M.M.O.Huh, C.M.Radding. The specificity of lambda exonuclease. Interactions with single-atranded DNA, J. Biol. Chem. 250 (1975) 54385445.

167. M.M.Stahl, L.Thomason, A.R.Poteete, T.Tarkowski, A.Kuzminov, F.W.Stahl. Annealing vs. invasion in phage lambda recombination, Genetics 147 (1997) 961977.

168. F.W.Studier, B.A.Moffatt. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 189 (1986) 113-130.

169. F.W.Studier, A.H.Rosenberg, J.J.Dunn, J.W.Dubendorff. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185:60-89. (1990) 60-89.

170. B.M.Swalla, E.H.Cho, R.I.Gumport, J.F.Gardner. The molecular basis of co-operative DNA binding between lambda integrase and excisionase, Mol. Microbiol. 50 (2003) 89-99.

171. S.Swaminathan, H.M.Ellis, L.S.Waters, D.Yu, E.C.Lee, Court DL, S.K.Sharan. Rapid engineering of bacterial artificial chromosomes using oligonucleotides, Genesis. 29 (2001) 14-21.

172. T.Szyperski. Biosynthetically directed fractional 13C-labeling of proteinogenic amino acids. An efficient analytical tool to investigate intermediary metabolism, Eur. J. Biochem. 232 (1995) 433-448.

173. T.Szyperski. 13C-NMR, MS and metabolic flux balancing in biotechnology research, Q. Rev. Biophys. 31 (1998) 41-106.

174. N.K.Takahashi, K.Kusano, T.Yokochi, Y.Kitamura, H.Yoshikura, I.Kobayashi. Genetic analysis of double-strand break repair in Escherichia coli, J. Bacteriol. 175 (1993)5176-5185.

175. A.Taylor, G.R.Smith. Unwinding and rewinding of DNA by the RecBC enzyme, Cell 22(1980) 447-457.

176. A.F.Taylor, G.R.Smith. RecBCD enzyme is a DNA helicase with fast and slow motors of opposite polarity, Nature %19;423 (2003) 889-893.

177. D.S.Thaler, E.Sampson, I.Siddiqi, S.M.Rosenberg, L.C.Thomason, F.W.Stahl, M.M.Stahl. Recombination of bacteriophage lambda in recD mutants of Escherichia coli, Genome 31 (1989) 53-67.

178. L.C.Thomason, Court DL, A.R.Datta, R.Khanna, J.L.Rosner. Identification of the Escherichia coli K-12 ybhE gene as pgl, encoding 6-phosphogluconolactonase, J. Bacteriol. 186 (2004) 8248-8253.

179. Z.Trogovcevic, W.D.Rupp. Lambda bacteriophage gene produces and X-ray sensitivity of Escherichia coli: comparison of red-dependent and gam-dependent radioresistance, J. Bacteriol. 123 (1975) 212-221.

180. I.R.Tsaneva, B.Weiss. soxR, a locus governing a superoxide response regulon in Escherichia coli K-12, J. Bacteriol. 172 (1990) 4197-4205.

181. J.I.Tu, G.R Jacobson, DJ.Graves. Isotopic effects and inhibition of polysaccharide Phosphorylase by 1,5-gluconolactone. Relationship to the catalytic mechanism, Biochemistry 10 (1971) 1229-1236.

182. A.Varma, B.O.Palsson. Stoichiometric flux balance models quantitatively predict growth and metabolic by-product secretion in wild-type Escherichia coli W3110, Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994) 3724-3731.

183. G.Voordouw, d.van, V, A.P.Themmen. Why are two different types of pyridine nucleotide transhydrogenase found in living organisms?, Eur. J. Biochem. 131 (1983) 527-533.

184. B.L. Wanner, R.Kodaira, F.C.Neidhart. Physiological regulation of a decontrolled lac operon, J. Bacteriol. 130 (1977) 212-222.

185. S.Warming, N.Costantino, Court DL, N.A.Jenkins, N.G.Copeland. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection, Nucleic Acids Res. 33 (2005) e36.

186. W.Wiechert. 13C metabolic flux analysis, Metab Eng 3 (2001) 195-206.

187. N.S.Willetts, D.W.Mount. Genetic analysis of recombination-deficient mutants of Escherichia coli K-12 carrying rec mutations cotransducible with thy A, J. Bacteriol. 100(1969) 923-934.

188. C.Wittmann. Metabolic flux analysis using mass spectrometry, Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 74:39-64. (2002) 39-64.

189. R.E.Wolf, Jr., D.M.Prather, F.M.Shea. Growth-rate-dependent alteration of 6-phosphogluconate dehydrogenase and glucose 6-phosphate dehydrogenase levels in Escherichia coli K-12, J. Bacteriol. 139 (1979) 1093-1096.

190. A.N.Woodmansee, J.A.Imlay. A mechanism by which nitric oxide accelerates the rate of oxidative DNA damage in Escherichia coli, Mol. Microbiol. 49 (2003) 11-22.

191. J.Wu, B.Weiss. Two divergently transcribed genes, soxR and soxS, control a superoxide response regulon of Escherichia coli, J. Bacteriol. 173 (1991) 2864-2871.

192. D.Yu, H.M.Ellis, E.C.Lee, N.A.Jenkins, N.G.Copeland, Court DL. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 97 (2000) 5978-5983.

193. R.Zablotny, D.G.Fraenkel. Glucose and gluconate metabolism in a mutant of Escherichia coli lacking gluconate-6-phosphate dehydrase, J. Bacteriol. 93 (1967) 1579-1581.

194. J.Zhao, T.Baba, H.Mori, K.Shimizu. Effect of zwf gene knockout on the metabolism of Escherichia coli grown on glucose or acetate, Metab Eng 6 (2004) 164-174.

195. J.Zhao, T.Baba, H.Mori, K.Shimizu. Global metabolic response of Escherichia coli to gnd or zwf gene-knockout, based on 13C-labeling experiments and the measurement of enzyme activities, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64 (2004) 91-98.

196. M.Zheng, F.Aslund, G.Storz. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation, Science 279 (1998) 1718-1721.1. Благодарности