Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Отдаленная гибридизация ячменя (генетические и биотехнологические аспекты)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Отдаленная гибридизация ячменя (генетические и биотехнологические аспекты)"

Р1 Ь им 2 5 СЕН 1395

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт цитологии и генетики

На правах рукописи УДК 575.222.73:581.143.6

ПЕРШИНА Лидия Александровна

ОТДАЛЕННАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ ЯЧМЕНЯ (ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ)

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

НОВОСИБИРСК - 1995

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Научный консультант:

академик РАН Шумный В.К.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Цильке P.A.,

Новосибирский государственной аграрный университет, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Тарасенко Н.Д.,

Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Войников В.К.,

Институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Ведущее учреждение: Саратовский Государственный

университет им. Чернышевского, г. Саратов

Защита диссертации состоится " ^ " СХмЛд^Я. 1995 р.

на _ заседании диссертационного совета по защите

диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.П.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " 995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Груздев А.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Отдаленная гибридизация язляется одним из факторов формообразования в эволюции {Вавилов, I960) и инструментом для создания новых форм растений, используемых как исходный материал в селекции и в качестве моделей для фундаментальных исследований (Карпеченко. 1971 : Цицин, 1978: Щапова, Кравцова, 1990; Гордей, 1992).

В этом отношении интерес представляет и род Hordeum L., насчитывающий более 30 видов (Лукьянова и др., 1990), полиморфных по разным признакам, в том числе и важным с практической точки зрения (Schooler et al.. 1982).

На основании изучения отдаленных гибридов детализируется классификация видов в роде Hordeum (Bothmer et al., 1991), выясняется характер взаимодействия геномов между видами ячменя (Jacobsen, Bothmer, 1992), устанавливается степень филогенетического родства Hordeum с другими родами Triticeae (Solomon et al., 1991; Fedak, 1982;. Sethi et al., 1986; Petersen, 1992). Межвидовые и межродовые гибриды ячменя включены в исследования по выявлению особенностей молекулярной организации ядерных и цитоплазматических геномов (Soliman et al., 1987; Timmerman et al., 1993; Svitashev et al., 1995). Примеры успешного использования отдаленных гибридов - создание новой злаковой культуры Tritordeum (Cubero et al., 1986) и сортов ячменя с признаками, интрогрессированными от дикорастущих видов ячменя и злимуса (Schooler, Franckowiak, 1S81). Практическое применение накел метод ускоренного получения гомозиготных рекомбинантных линий на основе гибридных комбинаций ячменя с элиминацией хромосом одного из родителей (Kasha, 1976; Лукьянш, Игнатова, 1980; De vaux, 1986).

Вместе с тем, ряд направлений, связанных с отдаленной гибридизацией ячменя, не получил должного развития, что обусловлено, прежде всего, проблемами сильно выраженной репродуктивной изоляции, характерной для всего рода. В связи с этим весьма актуальными представляются исследования особенностей проявления несовместимости на разных этапах отдаленных скрещиваний. Такие исследования способствуют поиску подходов к преодолению несовместимости и разрежению вопросов реконструкции геномов на основе межподтрибннх скрещиваний у

растений культивируемых видов Triticeae.

Цель и задачи исследования. Основная цель исследования -изучить эффекта взаимодействия геномов и закономерности в проявлении несовместимости при отдаленной гибридизации ячменя и разработать методы ее преодоления для создания новых форм растений.

В связи с этим были поставлены следующие основные задачи:

1) изучить факторы, влияющие на межвидовую и межродовую скрещиваемость, и оценить их роль при гибридизации растений с разным уровнем филогенетического родства;

2) разработать и усовершенствовать методы преодоления постгамЕой. несовместимости в зависимости от генотипа гибридных комбинаций;

3) исследовать закономерности образования гибридов Р1 и выявить механизмы, обуславливающие репродуктивную изоляцию на данном этапе гибридизации;

4) разработать биотехнологические методы вегетативного размножения, и восстановления фертильности гибридов; обосновать возможности этих методов для повышения эффективности отдаленной гибридизации.

5) изучить закономерности восстановления фертильности при межродовой гибридизации и выявить особенности ядерно-цитоплазматических взаимодействий на жизнеспособность и фертильность гибридных растений;

6) разработать метода и предложить схемы создания новых форм растений на основе межродовой гибридизации ячменя и методов in vitro.

Научная новизна результатов исследования. Впервые проведено комплексное экспериментальное исследование закономэрнос-тей несовместимости и эффекта взаимодействия геномов при отдаленной гибридизации на примере рода Hordeum. Это позволило показать увеличение эффективности традиционных методов отдаленной гибридизации при сочетании их с методами биотехнологии, продемонстрировать возможности повышения генетической изменчивости за счет межподтрибннх скрещиваний ячменя; с использованием разработанных методов создать уникальные формы растений, представляющие интерес для генетических исследований.

Сформулировано представление о роли факторов, влиявших на

скрещиваемость растений с разным уровнем филогенетического родства. При отдаленной гибридизации ячменя на скрещиваемость, оцененную по общей завязываемости зерновок и зерновок с зародышами, наряду с родительскими генотипами, существенное влияние оказывают экзогенные фитогормокы. Показано, что в разных гибридных комбинациях доля влияния таких факторов, как генотипическое разнообразие родительских форм, условий вегетации и экзогенных фитогормонов может быть неодинаковой, что приводит к заключению о наличии разных механизмов, контролирующих скрещиваемость, и о независимости таких признаков скрещиваемости, как общая завязываемость зерновок и завязываемость зерновок с зародышами.

Разработаны и усовершенствованы метода культивирования изолированных гибридных и гаплоидных зародышей, получивщих развитие в разных гибридных комбинациях. Экспериментально обоснована возможность значительного повышения репродукции растений, независимо от гибридных комбинаций, за счет трансплантации зародышей на незрелые эндоспермы культурного ячменя. Оптимизирован состав сред для культивирования слабо дифференцированных зародышей.

Получены новые экспериментальные модели, демонстрирующие существование иерархической зависимости менту видами ячменя по проявлению признака элиминации хромосом, роль лозового эффекта геномов и условий выращивания гибридных растений. Впервые сформулировано заключение о значении элиминации хромосом у отдаленных гибридов как механизма, контролирующего репродуктивную изоляцию.

На основании изучения особенностей несовместимости выявлены критические периоды при получении гибридных растений в результате скрещивания видов ячменя с рожью и пшеницей. Впервые выявлены генетические механизмы контроля репродуктивной изоляции между культурным ячменем и посевной рожью, ограничивающие широкое использование гибридов н.vulgare х s.cereaie. Установлено, что массовую летальность и стерильность гибридных растений вызывает действие генов гибридного некроза. Предложена гипотеза об образовании такого механизма межродовой несовместимости в процессе эволюции культурного ячменя и ржи. Показано, что сильно выраженный барьер несовместимости при скрещивании видов ячменя и пшеницы не лимитирует по-

лучение ячменно-гшеничных гибридов, способных к образованию жизнеспособных гамет.

Разработан эффективный метод вегетативного размножения гибридных растений злаков по циклу: молодые соцветия -каллусная ткань - растения - регенеранты.

Впервые для межродовых гибридов ячменя показана возможность использования метода культивирования in vitro для восстановления их фертильности. Выявлено, что среди регенерантов ячменно-пшеничных гибридов могут формироваться самофертильные растения и растения с более высокой, чем у растений-доноров, частотой завязцвания семян при беккроссировании. Предложен метод колхицишрования регенерирующих в каллусных культурах гибридных 'растений для восстановления самофертильности на ослове амфиплоидизации.

Существенным результатом является получение межвидовых и межродовых . гибридных растений, при изучении которых продемонстрированы: эффект гетерозиса по признаку регенерационной способности в культуре каллусов и наследование этого признака.

Разработаны и предложены схемы получения новых форм растений с использованием межродовой (межподтрибной), гибридизации ячменя и методов in vitro.

Впервые созданы серии аллоплазматических линий мягкой пшеницы на основе цитоплазмы культурного ячменя и дикорастущего H.geniси latum, изучение которых позволило выявить новые закономерности ядерно-цитоплазматических взаимодействий при восстановлении фертильности у гибридов и доказать возможность реконструкции ловых форм растений на основе мекподтрибных скрещиваний.

Предложена гипотеза, позволяющая объяснить механизм восстановления фертильности у мягкой пшеницы при наличии цитоплазмы культурного ячменя результатом реконструирования ядерного генома межсортовыми и межродовым замещениями в процессе беккроссировании.

Научно-практическая ценность работы. Разработан комплекс методов]! основанный ia сочетании методов биотехнологии и отдаленной гибридизации, которые могут быть использованы для получения новых форм растений.

Разработан и защищен авторским свидетельством способ соз-

дания самофертильных аллоплазматических линий мягкой пшеницы, которые характеризуются комплексом ценных признаков: раннеспелостью, низкорослостыо, хорошими технологическими качествами, высокой регенерационной способностью при андрогенезе и при культивировании соматических тканей в условиях in vitro.

Впервые продемонстрированные в работе результаты восстановления фертилъности у ячменно-пшеничных гибридов н.vulgare х т.aestivum опровергли сушествувдее представление о стерилизующем действии цитоплазмы культурного ячменя на гексаплоиднуго пшеницу.

Теоретическую и практическую ценность представляют новые экспериментальные модели, созданные на основе отдаленных скрещиваний. Эти модели использованы в исследованиях по выявлению особенностей молекулярной реорганизации геномов при отдаленной гибридизации (Вершинин, 1991; Свиташев и др, 1990, 1992; Svitashev et al., 1991, 1995), могут быть использованы для выяснения механизмов элиминации хромосом при отдаленной гибридизации, изучения ядерно-цитоплазматических взаимоотношений, особенностей интрогрессии генетического материала между подтрибами Trittсезе, изучения генотипических особенностей регенерации высших растений в условиях in vitro.

Документально подтверждена передача образцов семян линий, созданных на основе отдаленных скрещиваний между ячменем и пшеницей, ячменем и рожью, в другие научные учреждения, в тем числе и для-селекционного изучения.

Результаты диссертационной работы используются при чтении курса по биотехнологии растений в университетах: Новосибирском государственном и Новосибирском государственном аграрном, а также при проведении практических занятий (Методические указания к практическим занятиям по биотехнологии растений, Л.А.Першина, Новосибирск, НГУ. 1993, 26 е.). Разработанные методы и способы получения новых форм растений находят применение в Биотехнологическом, институте Хэйлудзянской сельскохозяйственной академии, Китай.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 3 Всесоюзной конференции по культуре клеток растений (Абовян, 1979), Сибирской региональной конференции "Актуальные вопросы генетики и селекции растений" (Барнаул, 1980); Первом Всесоюзном совещании "Генетика развития растений" (Ташкент, 1980);

Всесоюзном совещании по отдаленной гибридизации растений и животных (Москва, 1961); 4 Всесоюзной конференции "Культура клеток и биотехнология" (Кишинев, 1983); 5 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1983); Всесоюзном совещании "Роль отдаленной гибридизации в эволюции и селекции пшеницы" (Тбилиси, 1985); Первой Национальной конференции с международным участием по клеточным и тканевым культурам (София, Болгария, 1985); 3 Всесоюзном совещании по генетике соматических клеток (Звенигород, 1986); 5 съезде ВОГИС (Москва, 1987); Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алма-Ата, 1988); Первой Международной конференции по биотехнологии "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988); Международном симпозиуме " Генные и клеточные биотехнологии для злаковых культур" (Алма-Ата, 1989); Всесоюзной конференции "Цитогенетика зерновых культур" (Таллинн, 1989); Совещаниях по изогенным линиям в селекционных экспериментах (Новосибирск, 1990; 1993); 6 Международном симпозиуме по генетике ячменя (Хельсинборг, Швеция, 1991); Первом Международном симпозиуме по тписеае (Хельсиборг, Швеция, 1991); Международном семинаре по применению методов биотехнологии в генетике и селекции (Харбин, Китай, 1993); 2 Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология растений" (Алматы, 1993); Международной конференции "Биотехнология растений и генная инженерия" (Киев, 1994); Генетико- селекционной школе "Генетические ресурсы и эффективные метода создания нового селекционного материала сельскохозяйственных растений" (Новосибирск, 1994); I Российском съезде генетиков и селекционеров (Саратов, 1994).

Публикации. Материалы диссертации опубликоЕаш в виде 52 работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Объем и структура работы. Работа изложена на 470 страницах. Работа состоит из введения, общего обзора литературы, экспериментальной части (четыре главы), общего заключения, выводов. Работа иллюстрирована 66 таблицами и 58 рисунками. Список цитируемой литературы содержит 691 ссылку, в том числе 172 на русском языке.

Фактический материал диссертации включает в себя результаты изучения закономерностей несовместимости при

б

отдаленной гибридизации злаков и путей ее преодоления на разных этапах получения гибридов и восстановления их фертильности. Все результаты по получению и изучению отдаленных гибридов ячменя, представленные в экспериментальной части диссертации, получены автором.

Автор выражает благодарность своему научному консультанту академику РАН BJC.Шумному за инициацию данной работы и неоценимую поддержку при ее выполнении. Автор благодарит своих коллег Л.И.Белову и Э.П.Девяткину за сотрудничество при проведении экспериментов по гибридизации, О.М.Нумерову - при выполнении цитогенетического анализа. Автор выраяает признательность всем коллегам, предоставившим для работы образцы семян для их использования как исходный материал.

Работа выполнена в секторе отдаленной гибридизации .и культуры тканей Института цитологии и генетики СО РАН при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований {проект 93-04-20428) и за счет грантов Российской государственной научно-технической программ "Приоритетные направления генетики" (проекты N 5.90 и N 5.653).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исходным материалом при получении отдаленных гибридов служили образцы пяти видов ячменя: Н.vulgare ъ. (2п=1};2n-?8) (32 сортов и ЛИНИЙ); Я.geni си latum All. (=Н.marinun subsp. gussoneanum) (2n=28); H.Jubatum 1. {2n=28); H.brevisubúlatum aubsp. brevisubtilatum (Irin.) Link (2n=28); H.brevlsubulatun subsp. turkestanlcum (Mevski) Tzvelev (2n=28); H.bulbosun I. (2п=14,2n=28)! днух видов рки. включая ее пять подвидов: Sécalo cereale Ь.subsp. cereale (2n=14;2n=28) {23 сорта); S.cereale subsp. vavllovil Kobyl. (£n=14); S.cereale subsp. ancestrale Zhuk. (2n=14); S.montaпит subsp. anatollcum Tzvel. (2n=14)j S.montanum subsp. kuprljanovil (Grossh.) Tzvel. (2n=14); двух видов пшеницы: T.aestivum L. (2n=42) (15 сортов); T.tlmopheevíl Zhuk. (2n=28)í линия тритикале (2n=56) И две линии кукурузы Z.mays L. (2n=20).

Растения выращивали в гидропонной теплице и в поле. Эксперименты по гибридизации выполняли в 3-5 повторностях. Пыльцу через 2-3 дня после кастрации наносили на рыльце каждого цветка. Опыленные цветки обрабатывали фитогормонами

через go минут, 24 и 48 часов после опыления в зависимости от целей эксперимента. Скрещиваемость оценивали по общей частоте завязавшихся зерновок и частоте зерновок с зародышами. По степени развития гибридные зародыши классифицировали согласно описанию стадий развития зародышей у культурного ячменя (Cameron-Mills, Duifus, 1977).

При выполнении экспериментов по культивированию in vitro за основы были приняты методики, разработанные Бутенко (1964) и Крузе (Kruse,1974). Зародыши культивировали на средах: Норстога (Norstog,1973), MS (Murasige, Skoog. 1962), Крузе {Kruse, 1974) и.средах, модифицированных в процессе работы.

Для индукции каллуса гибридные зародыши и молодые соцветия культивировали на среде В-5 (Gamborg, Eveleigh,1968) с добавлением 2,4-Д. Для регенерации проростков каллус пассировали на среды: I) В-5 без фитогормонов, 2) ms с кннетином и ИУК, 3) MS с кинетином, ИУК и 2.4-Д. Часть каллуса продолжали культивировать на среде В-5 с 2.4-Д.

Проростки, развившиеся в культуре in vitro, на стадии 3-4 листьев высачивали в вермикулит. Подкормка растений раствором Кнопа. Колхицинирование гибридов, каллусных культур и растений-регенерантов проводили с использованием 0.5% раствора колхицина с добавлением 48 диметилсульфооксида при t=22°C. Для цитогенетического анализа использовали давленые препараты с окраской ацетокармином при предварительной обработке материала водной эмульсией <х-Вг-нафталина при 4°С и фиксацией в смеси этанола и уксусной кислоты (3:1).

У потомков гибридов изучено проявление количественных признаков.

Статистическая обработка данных проведена по Урбаху (1984), Рокицкому (1974), Лакину (1980).

Используемые сокращения: TKg - гибберелловая кислота, 2.4-Д -2.4-дихлорфеноксиуксусная кислота, ИУК - индолилуксусная кислота.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Факторы, влияющие на завязываемость гибридных зерновок при отдаленной гибридизации ячменя 1.1. Роль экзогенных фитогормонов

Анализ собственных результатов и данных литературы показывает, что методы преодоления несовместимости при

отдаленной гибридизации ячменя связаны с необходимостью использования экзогенных веществ, стимулирующих развитие гибридных зерновок. Наиболее эффективны в этом отношении -фитогормоны.

Установлено, что при оптимальном выборе условий обработки возможно не только стимулировать и поддергивать развитие гибридных зерновок, но и обеспечить условия для проявления особенностей скрещиваемости растений с разным уровнем филогенетического родства.

Показано, что частота завязываемости зерновок с зародышами находится в зависимости от генотипа родителей и от влияния применяемого фитогормона, что, по-видимому, определяется их взаимодействием с эндогенными фитогормонами материнских растений, регулирующих развитие зерновок. Так, в комбинациях Н.vulgare х H.bulbosum и Н.vulgare х Т.aestivum завязываемость зерновок с ззродышами в среднем одинакова и на фоне экзогенной ГКд, и на фоне 2.4-Д. В комбинации и.vulgare х s.cereaie это значение достоверно (Р<0.01) выше на фоне экзогенной ГКд.

При гибридизации Т.aestivum с Н.vulgare и Т.aestivum с z.mays развитие зерновок с зародышами преимущественно происходит на фоне 2.4-Д. Установлено, что, если эффективность развития зерновок с зародышами в комбинации г.aestivum х н.vulgare определяется и генотипом пшеницы» и примененном фитсгормоном, то в комбинации т.aestivum х Z.mays высоко достоверно (РС0.001) только влияние 2.4-Д. Такой результат приводит к заключению о существовании разных механизмов контроля за развитием зародышей при опылении гексаплоидной гшеницы культурным ячменем и кукурузой.

Практический интерес представляет показанное преимущество кукурузы по сравнению с H.bulbosum при их скрещивании с пшеницей, что дает основание для использования пшенично-кукурузных комбинаций при получении полигаплоидов у пшеницы и ее гибридов.

Выявлено, что под действием экзогенных фитогормонов, особенно 2.4-Д, может происходить разрастание завязей, приобретающих фенотип зерновок без зародышей. Это необходимо учитывать в исследованиях по изучению факторов, определяющих

реальную скрещиваемость.

1.2. Влияние генотипического разнообразия и условий вегетации ка изменчивость результата скрещиваемости н.vulgare (2п=14) с

S.cereale (2п=14)

Скрещиваемость при отдаленной гибридизации пшенициевых оценивают по общей завязнваемости зерновок и. кроме того, по их жизнеспособности.

При отдаленной гибридизации ячменя формируются нежизнеспособные зерновки, а анализ их общей завязнваемости на фоне экзогенных фитогормоков затруднен. Практический интерес представляют зерровки, содержащие зародыши. Более того, этот показатель дает основание более . строго оценивать характер репродуктивной изоляции на этапе чужеродных скрещиваний. Проведен анализ скрещиваемости на фоне ГКд по общей завязываемости зерновок и зерновок с зародышами для изучения сопряженности между этими признаками.

Показано, что скрещиваемость осуществляется между всеми использованными в работе генотипами культурного ячменя и ржи. Обнаружено варьирование частоты завязываемости зерновок как в зависимости от генотипов родителей, так и условий вегетации.

Выявлено, что при общей частоте завязываемости зерновок, составившей 12.6%, только около 30% содержат зародыши. По оценке всей выборки данных между показателями скрещиваемости прослеживается положительная корреляция (r=+o.56; rst=o.45 при Р=0.01), но для отдельных комбинаций такой зависимости нет.

На основании результатов двухфакторного дисперсионного анализа установлено, что общую завязываемость зерновок и зерновок с зародышами необходимо рассматривать как независимые признаки, что говорит о наличии разных механизмов, контролирующих эти признаки.

Так, доминирующее влияние на изменчивость результата общей завязываемости зерновок оказывают условия вегетации, а среди генотипических факторов установлено достоверное влияние генотипического разнообразия ячменя и комбинаций скрещивания (табл.2). Полученные результаты согласуются с данными по изучению влияния факторов на общую завязываеность зерен T.aestlvum х H.bulbosum (Sitch, Snape, 1987) И T.aestlvum х T.ttmopheevii (Козловская, Мусалитин, 1992), что указывает на

общность механизмов, контролирующих репродуктивную изоляцию на ее определенных этапах у пшенициевых.

Общая завязываемость зерновок отражает начальный этап в их развитии после оплодотворения. С начала формирования зародышей и в процессе всего эмбриогенеза на фоне экзогенной ГКд основное влияние происходит со стороны материнских и отцовских генотипов, что и показывают результаты дисперсионного анализа (табл.1). Достоверно влияние и гено-типического разнообразия комбинаций скрещивания и взаимодействия факторов "генотип ячменя х генотип рзси"

Таблица I

Результаты двухфакторного дисперсионного анализа данных об общей завязываемости зерновок (I) и зерновок с зародышами (2) при скрещивании И.vulgare L. (2n=14) х S.ceresle L. (2n=14)

Источник варьирования

г. Доля ф влияния

Источник варьирования

п Доля ф влияния

Комбинация скрещивания

Условия вегетации

Взаимодействие комбинации скрещивания х условия вегетации

1)

2)

1)

2)

1)

2)

6.26, 7.36

13.72* 1.80

0.61 0.29

0.27 0.60

0.67 0.08

0.01

0.05

Генотип ячменя

Генотип ржи

Взаимодействие генотип ячменя х генотип ржи

1) 3.6,,

2) 15.9

1)

2)

1.11, 7.11

1) 0.84„

2) 3.62

0.38 0.49

0.01 0.27

0.03 0.11

Достоверно при *'р<0.05. **'р<0.01

Тот факт, что не выявлено достоверного влияния условий вегетации на вариабилыюсть частоты развившихся зародышей, по-видимому, можно объяснить эффективным действием экзогенной ГКд на процесс формирования зародышей, которое может усреднять эффект других экзогенных факторов.

Таким образом, установлено, что скрещиваемость на фоне экзогенных фитогормонов необходимо оценивать по частоте зерновок с зародышами.

1.3. Влияние генотипического разнообразия и условий выращивания растений на завязываемость гибридных зерновок при

скрещивании Н.vulgare (2п=14)

T.aestivum (2n=42)

7.timopheevii Zhuk. (2n=28) Установлено, что при опылении культурного ячменя

пшеницами - мягкой и Т.ИторЬееуИ на фоне экзогенной ГКд проявляется более низкая, чем при опылении рожью, частота завязывания зерновок и зерновок с зародышами. При этом у ячменно-пшеничных комбинаций в среднем около 70Ж зерновок содержат зародыши, что более, чем в два раза выше, чем у ячменно-ржаных. Следовательно, в процессе эмбриогенеза у ячменно-пшеничных комбинаций уровень нарушений, приводящих к гибели зародышей, ниже, чем у ячменно-ржаных.

Все использованные в экспериментах генотипы культурного ячменя проявили скрещиваемость с каким-либо сортом мягкой пшеницы или с -Т'.аторЬееуц. Это оказалось одной из причин того, что не- удалось установить влияние генотипического разнообразия ячменя на изменчивость результатов скрещивания.

Статистический анализ показал, что на изменчивость результата завязывания всех зерновок и зерновок с зародышами достоверное влияние оказывают генотипическое разнообразие пшеницы (Р<0.05 и Р<0.01, соответственно) и условия вегетации (РС0.01 ).

Выделены сорта мягкой пшеницы с воспроизводимой скрещиваемостью с разными генотипами культурного ячменя. 2. Возможности повышения эффективности методов эмбриокультуры

Один из критических этапов при отдаленной гибридизации ячменя - эмбриогенез. На основании полученных результатов и данных литературы выявлено, что нарушения, связанные с формированием зародышей, приводят к их ранней гибели или аномальному развитию. Это обуславливает необходимость использования эмбриокультуры, способствущей репродукции гибридных растений. Установлено, что эффективность этого метода определяется многими факторами, что приводит к необходимости его разработки в зависимости от генотипов гибридных комбинаций.

В работе использованы основные принципы: своевременное вычленение зародышей, оптимизация состава питательной среды, использование способа трансплантации зародышей на незрелые эндоспермы культурного ячменя. Установлено, что выбор метода культивирования прежде всего определяется степенью развития зародышей и уровнем нарушений в их структуре, а это, в свою очередь, обусловлено генотипом гибридных комбинаций.

Проведен анализ и культивирование более 1700 зародышей, вычлененных через 9-20 суток после опыления, 22 комбинаций скрещивания. Для каждой гибридной комбинации установлены оптимальные сроки вычленения зародышей для культивирования в зависимости от условий выращивания. Обнаружено, что среди зародышей, изученных в работе, ячменно-ржаные (Н.vulgare х Seca¡е) характеризуются наиболее выраженными морфологическими аномалиями, отставанием или прекращением в развитии. Выявлена потребность таких зародышей в аминокислотах в культуральной среде.

При разработке метода культивирования зародышей, развившихся в результате межвидовых и межродовых скрещиваний с использованием дикорастущих видов ячменя, существенным оказался результат достоверного (Р<0.001) повышения частоты развития проростков за счет использования эндоспермов -"нянек" культурного ячменя.

Показано, что применение эндоспермов-"нянекм ускоряет развитие проростков при культивировании гибридных зародышей T.turgidum х S.cereale, Н.vulgare х H.bulbosum (2п=28), Н.vulgare х T.aestivum, N.vulgare х Т.timopheevti, полигаплоидных Т.aestivum х Z.mays.

3. особенности гибридных растений Fj

При изучении гибридных растений" полученных в 10 межвидовых и 12 межродовых комбинациях, выявлено типичное для отдаленной гибридизации ячменя явление образования, наряду с гибридными растениями, гаплоидных {полигаплоидных} (табл.2). Существенным результатом работы является получение новых гибридных комбинаций, которые могут быть предложены в качестве моделей для изучения механизмов элиминации хромосом при отдаленной гибридизации.

В этом отношении интерес представляют гибридные комбинации, полученные на основе дикорастущего вида ячменя H.genlculatum. При скрещивании Н.gen leu latum с И.vulgare и С H.bulbosum в результате элиминации хромосом культурного ячменя и, соответственно, луковичного происходит образование дигаплоидов H.genlculatum (2п=14). Используя терминологию Н.Сабрхманиама [Subrahmanyam, 1977], можно говорить, что H.genlculatum "по элиминационной силе" превосходит культурный

Таблица 2

Результаты отдаленных скрещиваний ячменя

Гибридные комбинации

Выявлены формы

Н.vulgare (2х) х S.cereale (2х)

H.vulgare H.vulgare H.vulgare H .vulgare tl .vulgare H.vulgare H.vulgare

H.vulgare

(2x) (2x) (2x> (2x) <2x) (2x) (2x)

ssp (2x) x ssp

S.cereale (4x) S.kupriJanovIi (2x) T.aestivurn (6x) T.timopheevi i (4x) H.bulbosum (2x) H.bulbosum (4x) H .bj-evusubu latum brevisubulatum (4x) H.brev isubulatum ,turkestanlcum (4x)

H.geniculatum (4x) x S.cereale (2x)

H.geniculatum (4x) x S.cereale (4x)

H.geniculatcm <4x) x T.aestivurn (6x)

H.geniculatum <4x) x Triticale <8x)

H.geniculatum (4x) X H.vulgare (2x) H.genículatum (4x) y¿ H.bulbosum (2x) H.geniculatum (4x) x H.brevisubulatum

ssp.turkestan i cum (4x) H.geniculatum (4x) x H.Jubatum (4x)

H.jubatum (4x) x S.cereale (2x)

H.jubatum (4x) x S.cereale (4x)

H.jubatum (4x) x S.kuprljanovl1 (2x)

H.Jubatum (4x) x H.vulgare (2x)

H.jubatum (4x) x H.geniculatum (4x)

—> гибриды 2х

—> гаплоиды X

—> гибриды Зх

—> гибриды 2х

—> гибриды 4х

—> гибрида Зх

—> гаплоиды X

—> гибрида Зх

—> гибриды Зх

—> гибриды Зх

—> гаплоиды X

—> гибриды Зх

—> гибриды 4Х

—> гибрида 5х

—> гибриды ЗХ

—> дигапл. 2х

—> дигапл. 2х

--> дигапл. 2х

—> гибриды 4х

—> гибриды 4х

—> дигапл. 2х

—> гибриды Зх

--> гибриды 4х

—> гибриды ЗХ

—> гибрида Зх

—> гибрида 4х

и луковичный ячмени. Таким образом, по "злиминаиионной силе" проявляется следующая иерархия взаимоотношений между этими видами ячменя: H.gsniculatum > Н.vulgare > H.bulbosum.

Гены, контролирующие элиминацию хромосом луковичного ячменя в гибридных комбинациях Н.vulgare (2х) х H.bulbosum (2х). локализованы у культурного ячменя. В перспективе было бы вавным установить роль этих генов в комбинациях скрещивания, где культурный ячмень является гаплопродюсером - видом, у которого элиминируют хромосомы.

Другой характер взаимоотношений геномов, обуславливаших .элиминацию хромосом одного из родителей у гибридов, можно проследить на примере следующих комбинаций: ячменно-ржаных (H.geniculatum х S.cereale), ячменно-пшеничных (Н.geniculatum

x T.aestivum), трехродозых (ii.geniculatum x Triticale),

Скрещивание H.genicuiatum с рожью и пшеницей приводит к образованию растений, сохраняющих гибридное число хромосом в течение всего онтогенеза. При гибридизации H.genicuiatum с тритикале формируются дигаплоиды H.genicuiatum - типа и 21-хромосомные растения типа ячменно-ржаных гибридов. Установлено, что в первом случае происходит полная элиминация генома тритикале, во втором - только генома пшеницы. Следовательно, существует определенный дозовый эффект, определяющий стабильность гибридного генома.

На примере комбинаций н.vulgare х H.buibosum показано влияние температуры на процесс элиминации хромосом в клетках гибридных зародышей (Pickering, 1985).

Другой моделью, демонстрирующей зависимость элиминации хромосом от условий-выращивания, являются полученные в нашей работе триплоиднне гибриды Н.vulgare х И.brev isubulatum ssp.turkestantcum, характеризующиеся многолетним циклом развития. При повышении температуры в весенний, период вегетации выше 27°с наблюдается массовое образование 7-хромосомннх колосящихся побегов типа и.vulgare. При снижении температуры вновь формируются 21-хромосомнне гибридные побеги.

Образование в одних гибридных комбинациях и дигаплоидов, .И гибридов (например, H.genicuiatum х H.jubatum), ПО-ВИДИМОМу, связано с полиморфизмом по генам,-контролирующим элиминацию.

Учитывая широкое распространение явления элиминации хромосом одного из родительских геномов при отдаленной гибридизации ячменя, можно рассматривать его как один из механизмов, обеспечивающих репродуктивную изоляцию.

Установлено, что жизнеспособность гибридных растений определяется генотипом комбинации скрещивания. Гибридные растения всех комбинаций, полученные в настоящей работе, за исключением н.vulgare х Secaie, характеризуются нормальной жизнеспособностью в течение всего онтогенеза.

На массовую летальность гибридных растений н.vulgare х s.cereale, начиная с ранних стадий развития, указывали и другие авторы (Pedak, 1977; Wojciechowska, 1984), при этом не обсукдая причин этого явления.

Учитывая, что среди растений F1, наряду с гибридными идет

образование и гаплоидных (табл.2), был отработан тест, позволяющий их идентифицировать, независимо от цитогенети-ческого анализа. Выявлены маркерные признаки, которые гибридами наследуются от ржи. По их проявлению из 225 проростков, развившихся в культуре in vitro, 216 были отнесены к гибридным.

Установлено, что у таких проростков, в отличие от контрольных, летальность связана с остановкой развития в стадии 2-3 листьев с последующим их некрозом. По характеру фенотипического проявления, которое не зависит от состава культуральной . среды, или условий выращивания в грунте, этот признак был отнесен к гибридному некрозу. Только около 6% гибридных растений Н.vulgare х s.cereale достигали стадии кущения, а около 3$ - колошения.

При изучении ячменно-рваных гибридов 90 комбинаций, полученных при гибридизации сортов культурного ячменя и ржи разного происхождения, включая дикорастущие виды ржи, не обнаружено преимущества отдельных комбинаций по жизнеспособности гибридов. Следовательно, гены гибридного некроза, вызывающие летальность гибридных растений н.vulgare х Seeale и обуславливающие репродуктивную изоляцию между культурным ячменем и рожью, имеют широкое распространение среди сортов культурного ячменя, сортов и.видов ржи. Судя по образованию жизнеспособных ячменно-ржаных гибридов, полученных на основании дикорастущих видов ячменя, такой тип репродуктивной изоляции с рожью для них не характерен.

4. Культура in vitro молодых соцветий отдаленных гибридов

Как показали собственные результата и данные литературы, для растений Р1 отдаленных скрещиваний ячменя характерна полная стерилность и низкая эффективность их получения, что ограничивает дальнейшие исследования, в том числе и по восстановлению их фертильности.

Была поставлена задача, используя биотехнологические приемы, разработать методы вегетативного размножения и восстановления фертильности у отдаленных гибридов ячменя. Такой подход определялся тем, что.у злаков с однолетним циклом размножения ограничена способность к побегообразованию, что делает не эффективным их клонирование. За основной был выбран

принцип культивирования по циклу: эксплант - каллус -растения-регенеранты.

Установлено, что выбор эксплантов - наиболее существенный этап для успешной реализации культивирования. У злаков тотипотентность в условиях in vitro проявляют только меристематические клетки. Показано, что, несмотря на способность зародышей, развивающихся в результате отдаленных скрещиваний, к дедифференцировке, у образующегося каллуса регенерации побегов не происходит. Это объясняется аномалиями в развитии гибридных зародышей, особенно щитка - основного источника тстипотентных клеток.

На основании наших данных сделано заключение, что значительно эффективнее зародыши культивировать для прямого получения Р1 растений, а для культивирования через каллусогенез использовать меристематические ткани молодых соцветий, вычлененных из боковых побегов этих растений, что и положено в основу разработанного метода (рис.1).

Установлено, что одним из определяющих факторов образования каллусной ткани, способной к регенерации побегов, является онтогенетическое состояние эксплантов, связанное со степенью их дифференцировки. Показано, что с учетом этого фактора значительно возрастает воспроизводимость формирования такого каллуса у эксплантов разных гибридных комбинаций на средах одного состава и с незначительным варьированием по содержанию 2.4-Д, Как правило, каллус, способный к спонтанному или индуцированному побегообразованию, относится к одному типу - плотный и однородный, примерно с десятикратным увеличением в объеме в течение 40-45 дней с начала культивирования.

Установлено, что длительность культивирования на инициальной среде с 2.4-Д является достоверно (Р<0.01) определяющей формирование каллуса с определенным типом реге-нерационного потенциала. Это связано с процессами спонтанной, преимущественно однотипной, регенерации (корнеобразование или побегообразование), которая интенсифицируется при продолжении культивирования на инициальной среде без пассирования или регулируется на средах с кинетином и пониженным содержанием ауксинов.

Выявлено, что в каллусных культурах с регенерацией корней

Hordeum

Hordeum X Seca le

Tríticum

Колхи-

циниро-

вание

Беккрос-сирование

i J

Растения

1

Цигоге-нетичес-кий анализ

Культура' соцветий

Каллус

Опыленные цветки

I Культура зародышей

Регенерация растений

i

Амфиплоиды

Растекся ВС

-J--

Экзогенные фитогормоны

Спонтанный каллусогенез

Колхи-

циниро-

вание

Регенерация растений

Беккрос-сирование

Беккрос-сирование

Отбор растений по фертильности

РисЛ. Схема применения методов in vi tro для получения отдаленных гибридов ячменя и восстановления их фертильности

побегообразование не выражено или супрессировено.

Разработан способ длительного Культивирования с периодическим пассированием каллусных культур при параллельном каллусообразовании и регенерации побегов, что увеличивает общий выход растений-регенерантов до 340 на один зксплант.

Показана возможность сохранения регенерационной способности культур при пониженной температуре.

Установлено, что признак регенерационной способности in vitro находится под генетическим контролем. Выявлены гибридные комбинации с проявлением эффекта гетерозиса по признаку частоты образования каллусных клонов, способных к регенерации растений (рис.2А). Выделены виды ячменя с высокой

регенерациокной способностью в культуре in vitro и доказано наследование этого признака у гибридов (рис.гБ). Показано, что признак высокой регенерационной способности проявляется и у регенерантов гибридных растений. Установлено отсутствие прямой зависимости между способностью исходных растений к вегетативному размножению и частотой образования каллусннх клонов с регенерацией проростков.

Показано, что способность к регенерации не зависит от уровня цитогенетичесхой нестабильности в каллусных клетках. Среди каллусных клеток, имеадих цитогенетические нарушения, больше всего формируется анеуплоидных или клеток с потерей целых геномов одного из родительских видов.

Получено и изучено большое число растений-регенерантов у гибридов разшх комбинаций. Выявлено, что при регенерации селективное преимущество получают растения с числом хромосом, характерным для рзотений-доноров.

Экспериментально установлено, что принципиальной особенностью разработанного метода размножения гибридов с использованием культуры in vitro является возможность получения среди регенерировавших растений сомаклонов с уровнем формирования жизнеспособных гамет, превышашим это значение у гибридов-доноров. Предполагается, что у регенерантов увеличе-ше частот-; образования жизнеспособных гамет, имепцих кередужированное число хромосом, происходит' под действием фитогор;-юнов культурзльной среды.

По/.аза'гга возможность использования метода культуры молодых сода-этий, наряду с культивированием незрелых зародышей, для получения сомаклонов у потомков гибридов, имеющих разный уровень фертильности.

Разработан метод колхицинирования регенерирующих в каллусных культурах проростков гибридов, что позволило впервые получить самофертильнне амфишкжда в гибридной комбинации

Н.geniculatum х Т.aestivum.

Таким образом, разработанный метод культивирования изолированных молодых соцветий по циклу: экспланты - каллус -регеяеранты дает возможность не только производить вегетативное размножение стерильных отдаленных гибридов, но и получать у регенерантов семенное поколение в результате

беккроссирования или самоопыления.

H.J. Н.д.

И.д. Н.д. H.J. *H.J. *Trit. S.с.'

H.J.

Jl.g. Н.д.

T .а.

Рис.2 А,Б.Частота (%) каллусных клонов с регенерацией проростков- ■ и корней - I I Обозначения: H.v.~Н.vulgare, S.с.-S.cereale, Т.а.-Т.aestivum,

T.t,-T.tlmopheevtl, H.b.-H.brevlsubulatum, H.J.-H.jubatum, H.g.-H.geniculatum, Trlt,-Triticale

б. Проблемы и возможности создания новых фор« растений на

основе отдаленной гибридизации ячменя 5.1. Сравнение особенностей несовместимости у" межродовых гибридных комбинаций

У полученных межродовых гибридных комбинаций проведено сравнение показателей частоты: общей завязываемости зерновок; зерновок, содержащих зародыши; гибридных растений, достигших фазы кущения и фазы колошения; гибридных растений с женской фертильностьв. Выявлены критические периоды при гибридизации каждой из комбинаций, лимитирукщие получение гибридных растений или восстановление их фертильности {табл.3). Сделано заключение, что несовместимость на ранних этапах скрещивания не определяет весь характер несовместимости. Выделены перспективные гибридные комбинации, включенные в эксперименты по восстановлению фертильности.

Таблица 3

Обобщенные данные, характеризующие уровень совместимости у межродовых гибридов

Комбинации скрещивания

Частота (%)

зерновок

растений

всего завя-

с зародышами куще- колоше

достигших с женской.

фертиль-*»

* ния ния* ' ностью

н V . (2х) X S с. (2х) 72.6 29.6 6 3 0

и /. (2х) X S. с. (4х) 16.3 18.3 1.8 0 0

[1 V . (4х> х S. с - (2х) ю.з 34.3 16.6 16.6 0

я V (4х) X 5. с. (4х) 18.4 22.5 0 0 0

н V <2х) X S. а. в.б 25.7 6.4 0 0

ц V . <2х; X S. к. (2х) 18.8 32.6 4.1 50.0 0

н V' . (2х! X S. ■ (2х) 9.8 26.4 0 0 0

н V <2х) X (2х) 10.'8 18.9 4.8 0 0

н V (2х) X / (бх) 0.7 69.3 100 100 82.6

я V . (2х) Т. t . (4х) 1.0 62.5 100 100 100

и .</. (4х) X S. л _ (2х) 26.2 90.2 100 90.9 0

И а- (4х) X S. о . {4х) 17.0 78.2 66.4 47.6 80

н 9- (4Х) X S. а. (2х) 25.0 100 100. 0 0

к 9- (4х) X т. а (бх) 5.0 41 .6 60.0 '20.0 100

н J- (4х) X S. с (2х) 29.3 53.2 75.0 86.3 0

И J ■ (4х) X S с. (4х) 19.5 45.7 38.8 100 100

Обозначения: H.v. - Н .vulgare, Н.д - H.genlculatum, H.j. -H.Jubatum, S.c. - S.cereale, S.a. - S.ancestrale, S.k. -S.kuprljanovll, S.an. - S.anatolicum, S.v. - S.vavllovll, T.a. - T.aestivum, T.t. — T.tlmopbeevil

от числа полученных проростков in vitro; 'от числа растений, достигших колошения

Проведено изучение межродовых гибридов Р1 . и их регенерантов, в том числе и после колхицинирования, на способность завязывать зерновки в результате беккроссирования и самоопыления. По характеру восстановления фертилъности выявлено три группы гибридных комбинаций.

Ö.2. Ячменно-пшеничные гибриды Н.vulgare (2r>=14) Х Т.aestlvum

: (2п=42)

Установлено, что колхицинирование растений этой комбинации способствует образованию лишь частично самофертильных растений, утрачиващих эту особенность в следующем поколении. Однако в зависимости от генотипа пшеницы гибриды и.vulgare х T.aestivum могут характеризоваться частичной женской фертильностью и завязывать зерновки при опылении мягкой пшеницей. Выделены сорта пшеницы, которые при скрещивании с культурным ячменем дают гибрида, формирующие жизнеспособные гаметы и завязывающие зерновки от беккроссирования.

Согласно данным литературы, дальнейшее беккроссирование также безрезультатно, ввиду полной стерильности растений ВС3 (Islam-, Shepherd, 1990), которую авторы объясняют результатом негативного влияния цитоплазмы диплоидного ячменя на функционирование ядра гексаплоидной пшеницы.

Результаты нашей работы опровергли это заключение. Разработан метод восстановления фертилъности у гибридов с использованием беккроссирования (патентная заявка N 95100414). Метод основан на включении в беккроссирование, наряду с растениями г.,, растений, регенерировавших в культуре молодых соцветий,' и введении во второй и третий беккросс в качества реккурентных родителей разных сортов пшеницы - источников генов Rf- восстановителей фертилъности гексаплоидной пшеницы на цитоплазме культурного ячменя (рис.3).

Наряду со стабильно самофертильными аллоплазматическими линиями выделены линии с разной выраженностью проявления признаков цитоплазматической мужской стерильности, в том числе и зависимой от условий выращивания растений. Установлено, что уровень фертилъности у аллоплазматических линий не определяется числом беккроссов. Показано, что процесс стабилизации кариотипов у аллоплазматических линий пшеницы направлен на образование растений с типичным для эуплазматической пшеницы

H .vulgare (2n=14)

HH x \AADBDD

ГКд->|

Т. aestlvum (2n=42)

Культура зародышей

(2n=2ß)

HABD

Культура соцветий

! х Т.aestlvum

FiSCl

(2n=30; 47+t; 49)

x T.aestlvum |3f)

(2n=40 ; 42; 43; 44; 46; 48)

* T.aestlvum (Rf)

FfBCj (2n=40j42;43;44;46)

Отбор растений по фертильности

Рис.З. Схема создания аллоплазматических линий мягкой пшеницы на основе гибридизации Н.vulgare с Т.aestlvum

числом хромосом, равным 2п=42. У аллоплазматических линий гшклади с восстш;овлет:-гай самофертильностью выявлены признаки,-характерные для культурного ячменя, что говорит об интротрессии генетич-:-с:-ого материала ячменя в геном пшеницы.

предложена гипотеза, объясняющая восстановление ::амофертил1-::ости у аигаплазматических линий мягкой пшеницы результатом взаимодействия ядерного генома, реконструированного за счет межсортового и межродового замещения отдельных пар хромосом у пшеницы, с цитоплазмой ячменя. 5.3. Ячменно-пшеничхше гибриды H.genlculatum (2n=28) х

Т.aestlvum (2п=42) Разработан метод (рис.4) восстановления фертильности, основанный ка переводе гибридов на амфиплоидный уровень колхицинировашем в культуре молодых соцветий и в результате

Н.деп1си1агит

(2п=28)

ННН'Н•

ГК3

{2п=70)

'1-?1 |к//мвр|

I

ЛАВВОй

Т. аевНуит (2п=42)

Культура зародышей

(2п=Э5)

Лмфиплоиды

Культура меристем

Колхицин

I

х Т .аезИчит

^ВСЛ (2п=46-55)

Отбор линий

Ггвс1

(2п=44-55)

(2п=42;43;44;4б; 42+1;; 42+24)

Рис.4. Схема создания аллоплазматических и дополненных линий мягкой пшеницы на основе гибридизации Н.деп1си1а1ит с Т.аеаЦуит

беккроссирования гибридов и их регенерантов разными сортами пшеницы.

Установлено, что самофертильность гибридов Н.деп1си1а1ит х т.авБЦуит восстанавливается, начиная с ВС^ и сохраняется как в самоопыленных. так и последующих беккроссных поколениях, независимо от генотипов пшеницы - реккурентных родителей. Показано, что цитоплазма дикорастущего ячменя Н.деп1си1агит не стерилизует мягкую пшеницу. Самофертильность проявляется у растений - беккроссных потомков, имеющих разные числа хромосом. Это дает возможность поддерживать отбором

Н.деп1са 1а1ит Н.]иЬа1ит

(2п=28)

ИНИ'И'

¿555

5. сегеа1е (2п=28)

Культура зародышей

|л//'55| (2п=28)

I * 8.сегеа1е (2п=И4)

Г1ВС1 [ //55 | (2п=18;19;20;21;22;23;24)

1

Свободное переопыление или

х 5.сегеа1е (2п=14)

р1вс2 или

(2п=14-21)

цит Н/Бв (2п=14)

Популяции аллоплазматической ржи

Рис.5. Схема создания аллоплазматической ржи на основе гибридизации дикорастущих видов ячменя и посевной ржи

ш-г-ушкиднне линии. Формирование жизнеспособных гамет у гибридсз с разным числом хромосом обуславливает медленный темп формообразовательного процесса..

Для амф1?плоидоз ячменно-пшеничннх гибридов Н.деп1си1а1ит х т.зев4 VI/п характерна цитогенетическая нестабильность, связанная с деполиплоидизацией гибридного генома. Полиморфизм по $«нотипическга признакам и фертильности проявляется у самоопылеиных потомков восьми поколений.

Выделены многочисленные аллоплазматические линии, в том числе с дополненным числом хромосом.

5.4. Ячмешо-ржшые гибриды И^иЬаШт (2п=28) * $.сегеа1е (2п=28) и Н.деп1си1агит (2п=28! * З.сегеа1е ( 2п=28) Показано, что колхицппирование триплоидных ячменно-ржаных

гибридов Н.}иЬагит (2п=28) х Э.сегеа1е (2п=14) И Н.деп1си1аЬит (2п=28) * Я.сегеа1е (2п=14) приводит к образованию амфиплсидов без восстановления у них фертильности. Разработанный метод восстановления фертильности у растений, полученных на основе гибридизации дикорастущих ячменей н ^иЬаЩр и Н.деп1си1агит с рожью, основан на использовании в качестве родительских растений тетраплоидных форм ржи и последующем беккроссировании растений диплоидной рожью (рис.5).

Выявлено, что растения Г1 способны завязывать зерновки и от самоопыления, но растения, выращенные из таких зерновок стерильны. Установлено, что среди растений ВС1 преимущественно 21-хромосомные формируют и женские, и мужские жизнеспособные гаметы, что дает возможность получать зерновки при свободном переопылении этих растений или в результате их беккрос-сирования диплоидной рожью. Показано, что процесс стабилизации фертильных растений направлен на формирование аллоплаз-матических диплоидных форм ржи в результате замещения хромосом ячменя на ржаные.

ВЫВОДЫ

1. Основной результат исследований - это сформулированное представление об особенностях взаимодействия геномов и закономерностях несовместимости при отдаленной гибридизации, разработка и экспериментальная проверка комплекса методов для получения межродовых гибридов ячменя и восстановления их фертильности, создание новых форм растений на основе межродовых (межподтрибных) скрещиваний.

2. Скрещиваемость ячменя при отдаленной гибридизации обусловлена как генотипическими особенностями родительских форм, так и экзогенными факторами, наиболее важными из которых являются фитогормоны. поддерживающие развитие гибридных зерновок. В зависимости от генотипа гибридных комбинаций и направления скрещивания существенное влияние на уровень скрещиваемости, оцененной по общей завязываемости зерновок и зерновок с зародышами, могут оказывать генотипы родительских форм, условия вегетации, экзогенные фитогормоны. Неоднозначность проявления этих факторов указывает на наличие разных механизмов контролирования скрещиваемости. Общая завязывае-

мость зерновок и завязываемость зерновок с зародышами - признаки независимые, и на фоне экзогенных фитогормонов скрещиваемость необходимо оценивать по завязываемости зерновок, содержащих зародыши.

3. Яри отдаленной гибридизации ячменя, независимо от уровня скрещиваемости, сильно выражены нарушения в эмбриогенезе, приводящие к гибели зерновок, что и определяет необходимость применения методов эмбриокультуры. Основные факторы, влияющие на жизнеспособность зародышей в условиях in vitro -это степень дифференцированности зародышей, их возраст, условия культивирования, состав культуральной среды. Репродукция растений в змбриокультуре увеличивается при оптимальных для кандого генотипа сроках вычленения зародыией из зерновок, при предварительной трансплантации зародышей на незрелые эндоспермы культурного ячменя, при культивировании недифференцированных зародышей на средах с добавлением аминокислот,

л. Для отдаленной гибридизации ячменя характерно проявление селективной элиминации хромосом в гибридных клетках. Это может приводить, наряду с образованием гибридов и гаплоидов (полигаялоидов). Получены новые гибридные комбинации, изучение которых подтвердило существование иерархической зависимости между гидами Hordeum по проявлению элиминации хромосом, значение лозового эффекта геномов и условий выращивания гибридных растений. Учитывая широкое распространение хромосомной элиминации, ограничивающей получение гибридных организмов, целесообразно рассматривать это явление как один из механизмов, обуславливающих репродуктивную изоляцию.

5. Использование гибридов И. vulgare х S. cereale для оозданиа но;;ых ферм растений ограничено из-за сильно выраженного барьера репродуктивной изоляции между культурным ячменем и рожью на стадии развития гибридных растений Р1. Это связано с функционированием генов гибридного некроза, действие которых приводит к массовой летальности и стерильности гибридных растений. Такой механизм несовместимости мог сформироваться в процессе эволюции культурных видов ячменя и ржи в ареалах их совместного произрастания. В результате гибридизации дикорастущего ячменя с рожью можно получать гибридные растения, способные к восстановлению фертильности.

Сильно выраженная несовместимость на этапе скрещивания между видами ячменя и пшеницы не является лимитирующей для создания ячменно-пшеничных гибридов, формируших жизнеспособные гаматы.

6. В результате отдаленных скрещиваний ячменя происходит образование ограниченного числа стерильных гибридных растений. Разработан метод вегетативного размножения гибридов по циклу: молодые соцветия - каллус - растения-регенеранты. Принципиальной является возможность за счет подбора онтогенетической стадии эксплантов получения каллуса, способного к регенерации растений, независимо от наличия фитогормонов в регенерационной среде. Регулирование состава культуральной среды добавлением цитокининов и ауксинов приводит к параллельной индукции каллу-согенеза и регенерации растений, что значительно увеличивает продолжительность культивирования и выход регенерантов, включаемых в эксперименты по восстановлению фертильности.

7. Признак регенерационной способности в культивируемых тканях находится под генетически).) контролем. Высокая частота образования каллу сных клонов с регенерацией проростков, характерная для ячменных трав H.geniculatum и H.jubatum, проявляется у отдаленных гибридов, полученных на основе гибридизации этих видов, и воспроизводится у их регенерантов. Эффект гетерозиса по признаку частоты образования каллусных клонов с регенерацией растений проявляется у ячменно-пшеничных гибридов.

8. Метод культуры молодых соцветий может быть использован для восстановления фертильности у межродовых гибридов. В условиях культивирования у гибридных растений возрастает уровень формирования жизнеспособных гамет. Это увеличивает частоту завязывания зерновок при беккроссировании и самоопылении. Обработка колхицином регенерирующих в культуре каллусов проростков индуцирует развитие самофертильных амфиплоидов.

9. Экспериментально обоснована возможность восстановления фертильности ячменно-пшеничных гибридов н.vulgare (2n=14) х T.aestivum (2п=42). Использование при беккроссировании в качестве реккурентных родителей генетического разнообразия мягкой пшеницы приводит к образованию аллоплазматических линий

с разным уровнем самофертильности. Процесс стабилизации кариотипов при восстановлении самофертильности направлен на образование 42-хромосомных растений. Предложена гипотеза, объясняющая восстановление самофертильности аллоплазматических линий, имеющих цитоплазму культурного ячменя, эффектом взаимодействия цитоплазмы и ядра, реконструированного в результате межсортовых и межродового замещений.

10. У ЯЧМешю-пшеничных гибридов H.genlcuiatum х т.aestivum восстановление самофертильности происходит при переводе гибридов на амфиплоидный уровень или в результате первого беккросса. Цитоплазма H.genlcuiatum не вызывает стерилизации мягкой пшеницы. Жизнеспособность гамет с разным числом хромосом у самоопыленных потомков амфиплоидов и растений беккроссных поколений у гибридов H.genlcuiatum х т.aestivum замедляет процесс формообразования, но обеспечивает возможность поддерживать самофертильность аллоплазматических дополненных линий.

11. У тетраплоидных форм ячменно-ржаных гибридов Н.gcnlculatum х S.cereale и Н.jubatum х S.cereale образование фертильных аллоплазматических растений связано с замещением хромосом ячменя на хромосомы ржи и стабилизации на 14-хрсмосомном уровне,

12. Разработаны методы и предложены схемы создания новых ■форм растений, сочетающие традиционные приемы отдаленной гибридизации и способы культивирования in vitro. На основе межродовых (мевподтрибных) скрещиваний получены новые аллоплкзмат.меские .танин и аллоплазматические дополненные линии, представляющие интерес для генетических исследований.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шумный Б.К., Першина JI.A., Щапова А.И. Использование различных видов Hordeum в отдаленной гибридизации I. Получение межродовых ячменно-ржаных гибридов // Цитология и генетика. 1979. Т.13. N2. C.II0-II6.

2. Шумный В.К., Першина Л.А., Нумерова О.М., Колосова Л. Д. Использование различных видов Hordeum в отдаленной гибридизации II. Получение дигаплоидов и гибридов в результате межвидовой гибридизации // Цитология и генетика. 1979. Т.13. N 3. C.I8I-I86.

3. Шумный В.К., Першина Л.А., Щапова А.И. Получение межродовых ячменно-ржаных гибридов // Генетика. 1979. T.I5..N 5. С.936-937.

4. Шумный В.К., Першина Л.А. Получение ячменно-ржаных гибридов и их клонирование методом культивирования изолированных тканей // ДАН. 1979. Т.249. ы 1. С.218-220.

5. Шумный В.К., Першина Л. А. К итогам отдаленной гибридизации некоторых злаковых с использованием разных видов ячменя П Сельскохоз. биол. 1980. Т.15. N 2. С.290-296.

6. Schlegel R. , Numerova О.М., Pershina L.A. Confirmation of chiasmatic barley-rye chromosome pairing by means oi the Giemsa banding technique // Cereal Pes. Commun. 1980. V.8. N 3. P.509-514.

7. Исаева H.A., Шумный В.К., Першина Л.А. Изучение особенностей Коллусогенеза у различных видов ячменя // Изв.СО АН СССР. Сер.биол.наук. - 1980. - Вып.1. - С.70-74.

8. Shumny V.K., Pershina L.A., Belova L.I. Production oi barley x rye and barley x wheat hybrids // Cereal Res. Commun. • 1981. V.9. N 4. P.265-272.

9. Pershina L.A., Shumny V.K. A characterization of clonal propagation of barley x rye and barley x wheat hybrids by means oi tissue cultures // Cereal Pes. Common. 1981. У.9. P.273-279.

10. Першина Л.А., Исаева H.A. Каллусообразование и особенности органогенеза в культуре тканей межвидовых и межродовых гибридов ячменя // Физиология растений. 1982. Т.29. Вып.2. С.557-563.

11. Шумный В.К.. Першина Л.А., Белова Л.И. Получение, ячменно-ржаных и ячменно-пшеничных гибридов на основе культурных сортов ячменя // Цитология и генетика. 1982. T.I6. N 3. С.46-50.

12. Першина Л.А., Шумный В.К. Использование методов культуры зародышей и тканей при получении межвидовых и межродовых гибридов ячменя // Отдалечена хибридизация при растенията. София, 1982. С.397-406.

13. Исаева Н.А., Шумный В.К., Першина Л.А. Особенности органогенеза в каллусных тканях разных видов и межвидовых

гибридов ячменя // Известия СО АН СССР. Сер.биол.наук. 1983. N 5/1. С.76-81.

14. Shumny V.K.. Pershina L.A. Remote hybridization of barley // XV International Congress of Genetics, New Delhi, India, Abstracts of Contributed Papers, Part 11, Session C, V.G.1983, p.681.

15. Shurrny V.K., Pershina L.A. Clonal propagation of barley intergeneric hybrids by means of tissue cultures // Abstracts of Internat. Syrapos. on Genetic Manipulation in Crops, China, 1984, p.73.

16. Pershina L.A. Tissue culture for production and propagation of intergeneric barley hybrids // Plant Tissue and Cell Culture Application to Crop Improvement. Olomouc, Czechoslovakia, 1984. P.51.

17. Першина Л.А., Шумный В.К., Белова Л.П., Нумерова О.М. Межвидовая и межродовая гибридизация дикорастущего ячменя Hordeum genlculatum ¿11. // ЦИТОЛОГИЯ и генетика. 1985. Т. 19. N 6. С.428-433.

18. Першина Л.А., Шумный В.К., Белова Л.И., Нумерова О.М. Ячменно-ржаные гибриды И.geniculatum All. х S.cereale L. И ИХ потомство от первого возвратного скрещивания // Цитология и генетика. 1986. Т.20. Ы 2. С.125-130.

19. Pershina L.A., Shumny V.K., Belova L.I., Numerova О.''. Hordeum g&nlculstum All. x Secale cereale L. hybrids and their backcross generations with rye // Cereal Res. Commun. 1985- v.13. P. 141-147.

20. И17МННЙ B.K.. Першина Л.А.. Вершинин А.В. Методы получения и эналис-а межвидовых и межродовых гибридов ячменя // Молекулярные механизмы генетических процессов. М: Наука, 1985. С. _ -282.

21. Исаева Н.Л., Першина Л.А., Шумный В.К. Образование побегов и корнеобразных структур в каллусной ткани межвидовых гибридов ячменя и исходных сортов и видов // Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Наука, 1986. - C.I78-I8I.

22. Першина Л.А., Шумный В.К. Особенности каллусной ткани и растений-регенерантов ячменно-ржаных и ячменно-пшеничных гибридов // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С.176-178.

23. Pershina L.A., Shumny Т.К., Belova L.I., Numerova O.M. Progeny of barley x wheat hybrids H.vulgare L. x T.aestlvum L. from backcrosses to common wheat // Cereal.Res. Commun. 1986. V.14. P.371-378.

24. Першина Л.А., Шумный В.К. Реконструкция геномов злаков методом отдаленной гибридизации я культуры тканей // Генетика и селекция (Болгария). 1986. T.I9. N 5. С.407-408.

25. Hulgenhof Е. , Pershina L.A. The contribution of heterochrornatin variation in rye chromosomes to breeding research of hexaploid Triticale // Eucarpia (Meeting of the Cereal section on Triticale). Schwerin, GDH, 1987. P.47-48.

26. Першина Л.А., Шумный В.К., Нумерова O.M., Белова Л.И. Потомки ячменно-пшеничных гибридов H.vulgare L. x T.aestivum L. от возвратных скрещиваний с пшеницей // Цитология и генетика. 1987. т.21. N 4» С.274-277.

27. Pershina L.A., Numéro va O.M. The use of tissue culture techniques for production, propagation and somaclonal variation of cereal hybrids // From Biotechnics to Biotechnology. Szeget, Hungary. 1988. P.5-6.

28. Pershina L.A., Numerova O.M., Belova L.I., Devyatkina E.P., Shuinny V.K. fertility in barley and wheat hybrids H.genicuiatum All. x T.aestivum L. , their régénérants and hybrid progeny of backcrosses to T.aestivum L. // Cereal Res. Commun. 1988. V.16. P.157-163.

29. Першина Л.А., Нумерова O.M., Белова Л.И., Девяткина З.П. Культивирование каллусной ткани для размножения ячменно-пшеничных гибридов // Известия СО АН СССР, сер. биол.наук, 1989, вып.1, с.27-32.

30. Шумный В.К., Першина Л.А. Отдаленная гибридизация ячменя // Вавиловское наследие в современной биологии. М. : Наука, 1989. С.220-229.

31. Нумерова О.М., Першина Л.А. Цитогенетическая характеристика H.genicuiatum All., его дигаплоидов и межродовых гибридов // Цитогенетика сельскохоз. растений. Новосибирск, ИЦиГ, 1989. С.85-97.

32. Першина Л.А., Нумерова О.М., Белова Л.И., Девяткина З.П. Получение и характеристика гибридов н.vulgare t. к

г.timopheevi Zhuk и их потомков от чужеродных скрещиваний // Цитология и генетика. 1990. Т.24. N2. С.33-37.

33. Нумерова О.М.. Першина Л.А., Шумный В.К. Особенности мейоза ячменно-пшеничных гибридов Н.vulgare х Т.timopheevi1 Zhuk и их потомков от чужеродных скрещиваний // Цитология и генетика. 1990. Т.24. N 3. С.22-26.

34. Першина Л.А., Нумерова О.М., Белова Л.И., Девяткина Э.П., Солоненхо Л.П., Шумный В.К. Создание новых аллоплазматических линий мягкой пшеницы и посевной ржи с цитоплазмой ячменей // ДАН. 1990. Т.310. N 4. С. 993-996.

35. Нумерова О.М., Першина Л.А. Характер стабилизации кариотипа у ЯЧменно-р:каных гибридов Н.genlculatum All. (2n=28) х S.cereale L.(2n=28) при беккроссировании рожью S.cereale (2n=14) // Характеристика генома некоторых видов сельскохоз.растений. Новосибирск, ИЦиГ, 1990. C.I4I-I50.

36. Нумерова О.М., Першина Л.А. Цитогенетическая характеристика каллусной ткани и . растений-регенерантов межродовых гибридов ячменя // Цитогенетика зерновых культур. Таллинн, 1990. С.79-84.

37. Першина Л.А., Белова Л.И., Нумерова О.М., Девяткина Э.П., Зинченяо Е.В. Сомаклональная измейчивость у регенерантов и их потомков Т.timopheevi1 Zhuk и разных генотипов мягкой пшекщы // Гене гикп хозяйственно-ценных признаков растений. Новосибирск, ИЬ'дГ, 1990. С;6-20.

38. Першина Л.А., Белова Л.И., Девяткина Э.П. Особенности создания фертильных аллоплазматических линий млгкой пшеницы т.aestivum L. с цитоплазмой ячменей н.vulgare L. и н.geniculate ли.// В сб..: Использование изогеяных линий в селекшонно-генотических экспериментах, Новосибирск, ИЦиГ, 1990. с. 25-28.

39. Першина Л.А., Нумерова О.М., Белова Л.И., Девяткина Э.П., Зинченко Е.В. Результаты гибридизации дикорастущего ячменя Н.genlculatum All. (2п=28) с T.aestlvum L. (2n=42), Triticale (2n=56), H.turkestanicum Nevski <2n=28) И H.vulgare L. (2n=14) С H.brev1subulatum Link (2n=28) // Цитогенетические аспекты генетики и селекции растений. Новосибирск, ИЦиГ, 1991. С. 3S-47.

40. Першина Л.А., Шумный В.К. Проблемы использования

методов in vitro при отдаленной гибридизации злаков ft Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.:Наука, 1991. С.108-114.

41. Pershina L.A. , Belova L.I., Numerova О.М., Shurany V.K. In vitro techniques for production of intergeneric barley hybrids // Barley Genetics VI.1991a. P.214-216.

42. Pershina L.A., Numerova O.M., Belova L.I., Devyatkina E.P. Barley x wheat, barley x rye hybrids and their BC^-BCg progenies // Abstracts of First Internation. Tritíceas Sympos. Helsinborg (Sweden), 1991b. P.36.

43. Numerova O.M., Pershina L.A. Meiosis of barley -wheat hybrids and regenerants // Barley Genetics VI. 1991. P.85-87.

44. Numerova O.M., Pershina L.A. Cytological characteristics of alloplasmic forms of wheat and rye with cytoplasm of barley //Abstráete of First Internation. Triticeae Sympos. Helsinborg (Sweden), 1991. P.37.

45. Нумерова O.M., Першина JI. А., Белова Л.И., Девяткина Э.П. Возможности восстановления фертильности у ячменно-пшеничных гибридов // Особенности реконструкции генома и популяций высших растений. Новосибирск, ИЦиГ, 1993. с.63-73.

46. Першина Л.А., Нумерова О.М., Белова Л.И., Девяткшга Э.П., Шумный В.К. Действие ядерного и цитоплазматических геномов на жизнеспособность и фертильность BCj-BC5 потомков ячменно-гаиеничных гибридов H.vulgare х Т.aestivum и н.geni си latum х т.aestivum // Особенности реконструкции генома и популяций высших растений. Новосибирск, ИЦиГ, 1993. С.63-73.

47. Першина Л.А., Нумерова О.М., Белова Л.И., Девяткина Э.П., Шумный В.К. Особенности андрогенеза у мягкой пшеницы, межвидовых и межродовых гибридов // Сиб.биол. журнал. 1993. Вып.З. С.3-8.

48. Pershina Ь.А., Numerova O.M., Belova L.I., Devyatkina E.P. Production and characterization of barley-wheat alloplasmic and additional lines // Cereal Res. Commun. 1993. V.21. N 4. P.277-283.

49. Першина Л.А. Отдаленная гибридизация ячменя: особенности и возможности // Генетические ресурсы и эффективные методы создания нового материала

сельскохозяйственных растений. Новосибирск, 1994. С.59-60.

50. Першина Л.А., Белова Л.И., Девяткина Э.П. Генетические и биотехнологические аспекты отдаленной гибридизации Trltlceae (Hordeum, Secale, Trlticum, Zea mays l.i // Генетика. 1994. Т.30. C.II9-I20.

51. Pershina L.A. Genetic and Blotechnological aspects oi barley-rye, barley-wheat and wheat-maize hybridization // Triticeae (2 Intern.Symp.J.bogan, Uta, USA,1994. P.58.

52. Шумный В.К., Першина Л.А., Нумерова О.М., Калинина Н.П., Белова Л.И., Девяткина Э.П. Аллоплазматические замещенные линии мягкой пшеницы, полученные на основе ячменно-пшеничных гибридов H.vulgare L. (2n=14) х T.aestlvum L.

(2п=42). ДАН. 1995. Т.340, N б. С.847-849.

Подписано к печати 07.09.95

Объем 2.2 п.л. Тир.100.3ак.78__

Новосибирск,58,1усская,39,АООТ "ЮЗ ПГСиС"